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PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE GENÉTICA Y MEJORA GENÉTICA VEGETAL

Mariola Plazas, Pietro Gramazio, Jaime Prohens y Santiago Vilanova Instituto Universitario de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana Universitat Politècnica de València

apuntes

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PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE GENÉTICA Y MEJORA GENÉTICA VEGETAL

Mariola Plazas, Pietro Gramazio, Jaime Prohens y Santiago Vilanova Instituto Universitario de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana Universitat Politècnica de València

PRÓLOGO La Genética es una disciplina con múltiples aplicaciones en distintos campos (sanitario, agrícola, ambiental, etc.), y en la que se están produciendo enormes avances. Una de las aplicaciones más importantes de la Genética es la Mejora Genética Vegetal, cuyo objetivo final es el desarrollo de variedades de plantas cultivadas que respondan a las demandas sociales. A este respecto, la mejora de la productividad, de la calidad, y de la tolerancia a estreses bióticos y abióticos son objetivos de mejora de gran importancia, en particular teniendo en cuenta los retos impuestos por el cambio climático. La Genética y la Mejora Genética Vegetal tienen un componente práctico y de laboratorio muy grande, por lo que la familiarización con algunas de las principales técnicas de laboratorio es esencial para poner en práctica los conocimientos teóricos. En este manual de prácticas hemos recogido un total de 10 prácticas que recogen distintos aspectos de Genética y Mejora Genética Vegetal, y que pensamos son de interés en la formación específica en esta última materia. En la compilación de las prácticas no hemos tratado de ser exhaustivos ni formar un compendio de múltiples prácticas, sino seleccionar prácticas sencillas y que permitan una visión amplia de distintos aspectos prácticos en un curso básico de Genética y Mejora Genética Vegetal. Los autores somos investigadores y profesores en el campo de la Mejora Genética Vegetal en la Universidad Politécnica de Valencia, con amplia experiencia docente en asignaturas y en trabajos de investigación de esta materia. Finalmente, queremos agradecer a nuestros compañeros Isabel Andújar Pérez y Francisco Javier Herráiz García su ayuda en la elaboración de este manual.

Mariola Plazas Pietro Gramazio Jaime Prohens Santiago Vilanova

PRÁCTICA 1. CARACTERIZACIÓN DE GERMOPLASMA Para que los materiales almacenados en un Banco de Germoplasma sean de utilidad, es necesario que estén adecuadamente caracterizados, es decir, que se conozcan las características más importantes de cada entrada o muestra. Esta información es de gran utilidad para los usuarios. A cada muestra se le asignan tres tipos de datos: a. Datos de pasaporte. Sirven para identificar la procedencia de la muestra y se toman simultáneamente a la recolección de la muestra. Para ello, se utilizan los formatos recomendados por Bioversity International (http://www.bioversityinternational.org/elibrary/publications/categories/descriptors/). b. Datos de caracterización. Sirven para identificar la muestra mediante caracteres fácilmente observables, poco afectados por el ambiente (es decir, que presentan una alta heredabilidad) y de tipo taxonómico, o bien de alto valor agronómico. c. Datos de evaluación. Sirven para definir características específicas de utilidad en determinados programas de mejora: resistencia a enfermedades, respuesta a estrés ambiental, etc. La caracterización de los materiales se realiza utilizando un número representativo de plantas de cada accesión. En la caracterización, también se refleja la variación existente entre individuos de una misma entrada. Con objeto de homogeneizar los datos de caracterización, para los cultivos más importantes se dispone de descriptores estandarizados, que siguen las directrices recomendadas por organismos como Bioversity. Los descriptores son unidades de información que pueden hacer referencia a características intrínsecas de la planta u otros datos de interés para la colección.

1.1.

MATERIAL Y MÉTODOS

1.1.1. Material vegetal Se utilizarán distintas accesiones de material cultivado y silvestre de tomate y melón. Esto permitirá la comparación entre distintos genotipos de un mismo cultivo. Para ello, se utilizarán plantas adultas con flores y frutos. Partes de la planta y frutos serán llevadas al laboratorio, dónde se efectuará la caracterización. Para la caracterización de las semillas se utilizarán muestras de semilla seca de cada una de las entradas.

1.1.2. Reactivos y equipo Balanza Balanza de precisión Pie de rey Regla Refractómetro Descriptores de tomate y de melón

1.2.

PROCEDIMIENTO

1.2.1. Toma de muestras Las muestras se toman del invernadero, observándose bien las plantas de cada accesión para recoger la posible variación intraaccesión. Se recogen las partes necesarias de las plantas de cada accesión para llevar a cabo la caracterización. Las muestras se trasladan al laboratorio para la caracterización de ciertos caracteres que no se pueden tomar en campo con comodidad. Una muestra de semilla seca de cada una de las accesiones será suministrada al inicio de la sesión de prácticas. 1.2.2. Caracterización Para la caracterización se utilizarán algunos descriptores seleccionados y representativos entre los utilizados en el Banco de Germoplasma del Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana de la Universitat Politècnica de València. Estos descriptores siguen las recomendaciones de Bioversity International.

1. Porte de la hoja

2. Longitud de la hoja 3. Anchura de la hoja 4. Número de foliolos 5. Color de la hoja

Descriptores de tomate 3 Semierecto 5 Horizontal 7 Inclinado Medida en cm en hojas adultas Medida en cm en hojas adultas 3 Verde claro 5 Verde medio 7 Verde oscuro

6. Pigmentación antociánica de las nervaduras 7. Exerción del estigma 8. Tipo de inflorescencia

9. Fasciación de la primera flor

10. Peso medio del fruto 11. Forma de la sección transversal (la mayoría de los frutos presentan la sección: … ) 12. Forma de la sección longitudinal (la mayoría de los frutos presentan la sección: … )

13. Tipo de crecimiento 14. Color del fruto maduro

15. Color del fruto inmaduro

16. Hombros del fruto

17. Intensidad del color de los hombros

1 Ausente 9 Presente 1 No exerto 9 Exerto 1 Racimo simple 2 Racimo doble o bifurcado 3 Racimo compuesto o ramificado 1 Ausente 2 Presente. Cuando la mayoría de los racimos presentan la primera flor fasciada. Peso en g de una muestra de frutos maduros dividido por el número de frutos de la muestra 1 Redondeada 2 Irregular 1 Aplastada 2 Redondeada 3 Acorazonada 4 Alargada 5 Cuadrada 6 Aperada 1 Determinado 2 Indeterminado 1 Verde 2 Amarillo 3 Naranja 4 Rosa 5 Rojo 3 Verde claro 5 Verde medio 7 Verde intenso 1 Ausente 3 Ligero 5 Medianamente marcados 7 Fuertemente marcados 1 Sin hombros 3 Ligeramente marcados 5 Medianamente marcados 7 Fuertemente marcados

18. Acostillado del fruto

19. Forma del ápice del fruto

20. Cicatriz estilar del fruto

21. Número de lóculos 22. Contenido en sólidos solubles

1 Ausente 3 Ligero 5 Medio 7 Fuerte 1 Hundida 2 Plana 3 Ligeramente puntiaguda 7 Muy puntiaguda 3 Pequeña. Apenas se nota 5 Media. Se aprecia muy claramente 7 Grande. Deprecia el fruto Nº medio de lóculos en una muestra de frutos Medido con un refractómetro manual y expresado en ºBrix

23. Peso de 100 semillas 24. Producción por planta

1. Sexo

2. Peso medio del fruto 3. Color de la corteza

4. Color de la carne

Descriptores de melón 1 Monoica. Flores masculinas y femeninas en la misma planta 2 Andromonoica. Flores masculinas y hermafroditas en la misma planta 3 Ginomonoica. Flores femeninas y hermafroditas en la misma planta 4 Hermafrodita. Únicamente flores hermafroditas en la misma planta Peso en g de una muestra de frutos maduros dividido por el número de frutos de la muestra 1 Blanco 2 Verde 3 Amarillo 4 Gris 5 Otros (especificar) 1 Blanco 2 Blanco-verdoso 3 Verde 4 Amarillo

5 Naranja 6 Salmón 7 Otros (especificar) 0 Ausentes

5. Manchas de la corteza (se determinará la presencia o ausencia 1 Presentes de manchas de naturaleza varietal) 6. Tipos de manchas 1 Punteado 2 Manchas (tipo Piel de Sapo, por ejemplo) 3 Bandas meridianas 7. Tipo de fruto PS Piel de sapo A Amarillo AC Amarillo canario T Tendral O Otros (especificar) 8. Acostillado 0 Ausente (cuando la superficie del fruto presenta hendiduras o surcos simétricos, 1 Presente dispuestos como meridianos) 9. Escriturado 0 Ausente (todo tipo de dibujos en la corteza) 1 Escaso 2 Medio 3 Abundante 10. Forma de la sección longitudinal 1 Esférica 2 Achatada 3 Alargada 4 Elíptica 5 Piriforme 6 Ovalada 7 Otra (especificar) 11. Forma de las semillas P Piñonet NP No piñonet 12. Color de la semilla B Blanca NB No blanca 13. Contenido en sólidos solubles 14. Peso de 100 semillas 15. Producción por planta

Medido con un expresado en ºBrix

refractómetro

manual

1.3.

RESULTADOS

A cada una de las muestras se le asignará el estado del descriptor correspondiente, en el caso de caracteres medidos en una escala. Para caracteres cuantitativos se tomará la medida correspondiente. En caso de existir variación dentro de muestra, se hará constar y se asignarán los códigos correspondientes para cada uno de los descriptores. Para cada una de las muestras se rellenará la información correspondiente a cada uno de los descriptores.

1.4.

CUESTIONES 1. ¿Cuáles son los caracteres que muestran un mayor y un menor grado de variación? ¿Cuál crees que es la razón? 2. Describe las principales diferencias que has observado entre las especies silvestres y las cultivadas. 3. ¿Qué te sugiere la existencia de diferencias dentro de entrada no atribuibles a efectos ambientales? 4. ¿Cuáles son los caracteres que consideras más importantes a nivel taxonómico y a nivel agronómico? 5. Indica algunos caracteres que considerarías importante añadirá la lista de descriptores dentro de datos de evaluación en algún plan de mejora de tomate o melón.

PRÁCTICA 2. ANÁLISIS MENDELIANO La determinación de la herencia de los caracteres es de gran importancia para el mejorador. Dependiendo del tipo de herencia que presenten los caracteres se elegirán unos u otros métodos de mejora. Con respecto a su naturaleza, los caracteres se pueden dividir en cualitativos y cuantitativos. Caracteres cualitativos son aquellos en los cuales los individuos de las generaciones segregantes pueden ser adscritos a grupos sin ambigüedad. Un ejemplo serían los caracteres estudiados por Mendel (por eso a estos caracteres en ocasiones se les llama mendelianos). El color de la semilla de guisante es verde o amarillo y su superficie es lisa o rugosa. Caracteres cuantitativos son aquellos en los que existe una variación continua del carácter, no siendo posible la adscripción de individuos a grupos claramente diferenciados de forma no arbitraria. Un ejemplo sería la producción en una generación segregante. Generalmente la distribución de producción por planta sigue una distribución normal, con la mayoría de individuos presentando un valor cercano a la media. Tanto para el caso de caracteres cualitativos como cuantitativos el estudio de la herencia se basa en datos obtenidos a partir de generaciones segregantes. Es habitual utilizar lo que se denominan familias completas. Éstas consisten en dos parentales (P1 y P2) que difieren en el/los carácter/es bajo estudio y no segregan para el/los mismo/s, el híbrido entre los dos parentales (F1), la autofecundación del híbrido (F2) y los cruzamientos del híbrido con cada uno de los parentales (retrocruzamientos; BC1 y BC2). En el caso de caracteres cualitativos el estudio de la herencia se realiza contando el número de individuos de cada clase en cada una de las generaciones. En base a los resultados obtenidos se establece una hipótesis y en base a ésta se calcula el número teórico de individuos esperados en cada generación y se compara con el número de observados. Si no existen discrepancias importantes se acepta la hipótesis planteada. Pero, ¿hasta qué punto podemos admitir que no hay discrepancias?. Para responder a esta pregunta se utiliza una prueba estadística denominada chi-cuadrado (χ2). Para ello se calcula para cada generación segregante el estadístico χ2:

χ2 = ∑

(Observados − Esperados ) 2 Esperados

El valor obtenido se compara con el proporcionado en una tabla de la distribución de la (χ ) para los grados de libertad correspondientes. Si el valor obtenido es menor que el que nos proporciona la tabla aceptamos la hipótesis. Si es mayor no se acepta la hipótesis. 2

Normalmente se utiliza un valor de probabilidad de 0.05, lo cual quiere decir que valores de la χ2 superiores a los que aparecen en la tabla sólo se dan por azar 1 vez de cada 20, lo cual indica que es un suceso bastante improbable. En este tipo de estudios el número de grados de libertad viene dado por el número de clases existente en una generación menos 1. Así, si tenemos 2 clases tendremos un grado de libertad, si tenemos 3 clases tendremos 2 grados de libertad, etc. Los valores de la χ2 para una probabilidad del 0.05 son: Grados de libertad 1 2 3 4 5 6

2.1.

Valor de la χ2 3.841 5.991 7.815 9.488 11.070 12.592

MATERIAL Y MÉTODOS Utilizaremos mazorcas de maíz de distintos tipos.

En el maíz es posible estudiar la herencia de algunos caracteres directamente en la mazorca. Esto es debido a que algunos caracteres presentan un fenómeno denominado xenia. Así, en el grano, aun estando sobre la planta materna, no se expresa el fenotipo materno sino el del zigoto. Por tanto se expresa el genotipo del individuo diploide del zigoto. Dos de estos caracteres son el color del grano y su textura. En nuestro caso concreto, el color del grano puede ser morado o amarillo y su textura lisa o rugosa. La rugosidad viene determinada por el azúcar de reserva que se acumula en el grano: será lisa si es almidón y rugosa si es sacarosa (maíz dulce).

2.2.

PROCEDIMIENTO

La práctica consiste en investigar la herencia en dos cruzamientos del carácter/es en el/los que difieren los parentales: •

Cruzamiento 1. Se trata de determinar la herencia del color del grano de maíz a

partir del cruzamiento entre una línea pura de color amarillo y otra de color morado. Para ello se toma el color de las mazorcas de las generaciones no segregantes y se cuenta una muestra de granos (>300) de mazorcas de cada generación segregante.

Fenotipo del parental 1 (P1), híbrido F1 y del retrocruzamiento hacia el parental 1 (BC1) (arriba a la izquierda), del parental 2 (P2) (arriba a la derecha) y del retrocruzamiento hacia el parental 2 (BC2) (abajo). •

Cruzamiento 2. Se trata de determinar la herencia del color del grano y de su textura a partir del cruzamiento entre una línea pura de color morado y lisa y otra de color amarillo y rugosa. Al mismo tiempo se puede determinar si los dos caracteres son independientes o no.

Fenotipo del parental 1 (P1), híbrido (F1) y Retrocruzamiento hacia el parental 1 (BC1) (izquierda) y del parental 2 (P2) (derecha).

2.3.

RESULTADOS

Con los datos obtenidos en las distintas generaciones (parentales, híbridos y generaciones segregantes) se plantearán distintas hipótesis sobre la herencia del color y la textura del grano de maíz. Con estos datos y utilizando la prueba χ2 se comprobará la probabilidad de la/s hipótesis planteada/s. En base a ello se propondrá el modelo de herencia para los dos caracteres.

2.4.

CUESTIONES 1. ¿Cuál es el modo de herencia del color del grano de maíz? 2. ¿Cuál es el modo de herencia de la textura del grano de maíz? 3. ¿Segregan los dos caracteres (color y textura) del grano de maíz de forma independiente? 4. ¿Qué nos indica un valor de la χ2 inferior a 0.05? 5. ¿Qué puede ocurrir al plantear distintas hipótesis si se el tamaño de la muestra de granos de generaciones segregantes es bajo?

PRÁCTICA 3. VIABILIDAD DEL POLEN La realización de cruzamientos es fundamental en muchos programas de mejora. La determinación de la calidad funcional del polen es de gran ayuda para establecer la fertilidad del parental masculino, de la cual depende en gran medida el éxito del cruzamiento. Además, es útil en otros aspectos de la mejora, como en el ensayo de la viabilidad del polen almacenado, en la realización de estudios de interacción polen-estigma, sistemas de incompatibilidad, estudios de fertilidad de híbridos, etc. Existen muchas causas de esterilidad masculina, como factores genéticos (ya sean nucleares o citoplasmáticos), y ambientales (como temperaturas extremas, estreses bióticos y abióticos, productos químicos, etc.). La calidad del polen en términos de fertilidad, se podría definir como la potencialidad del microgametofito para fecundar al macrogametofito y producir el zigoto. Se considera que la mejor estima de la fertilidad masculina de una muestra es realizando pruebas de cruzamiento, utilizando como parentales femeninos a individuos compatibles y midiendo el número de semillas cuajadas. Sin embargo, esto es muy laborioso ya que hay que realizar los cruzamientos y hay que esperar hasta que sea posible contar el número de semillas cuajadas, lo cual puede suponer un retraso en el desarrollo de los programas de mejora, además de ser muy costoso. Para evitar estos problemas, existen otros métodos que permiten estimar la viabilidad del polen. Estos métodos se pueden agrupar en cuatro grandes categorías: 1. Tinciones morfológicas. Consisten en la tinción de los granos de polen con un colorante. La principal ventaja de este tipo de métodos es que son muy fáciles de realizar y las lecturas se pueden efectuar poco después de la tinción. El inconveniente es que sólo diferencian entre granos de polen abortados y no abortados, por lo que sobreestiman la viabilidad del polen, ya que entre los granos no abortados algunos no serán viables. Sin embargo, son muy utilizadas porque permiten evaluar gran número de muestras en poco tiempo. Los valores de correlación entre la viabilidad dada por este tipo de pruebas y la prueba de cuajado de semillas suele ser superior a 0.6, por lo que, a pesar de no ser un valor demasiado alto, son útiles para una primera determinación de la viabilidad. Para este tipo de tinciones se pueden utilizar muchos tipos de colorantes, como acetocarmín, azul algodón-lactofenol, rojo de rutenio, azul de resorcina, safranina, violeta genciana, yodo-yoduro potásico, mezcla de metilo-rosa de Bengala, azul de anilina, etc.

2. Pruebas enzimáticas. Este tipo de pruebas tratan de establecer una relación entre la fertilidad polínica y alguna característica enzimática o bioquímica presente en células vivas. La mayor parte de estas técnicas se basan en reacciones de oxidación-reducción que dan colorantes como producto. De esta forma, si la célula está viva y tiene actividad enzimática se producirá la formación de colorante. La correlación entre este tipo de pruebas y la de cuajado de semillas suele ser superior a la que se obtiene por tinción morfológica. No obstante, también se produce una cierta sobreestima de la vitalidad del polen, ya que una parte de los granos de polen con respuesta positiva puede que no sean capaces de germinar o de alcanzar el ovario. A pesar de que la mayoría son algo más laboriosas, la obtención de resultados se produce al poco tiempo, por lo que también son muy utilizadas. Entre las pruebas enzimáticas más comunes se encuentran la del tetrazolio, la de la benzidina, la reacción fluorocromática y la prueba X-Gal.

Granos de polen de S. melongena con alta viabilidad (arriba), viabilidad intermedia (centro) y baja viabilidad abajo (abajo) teñidos con tetrazolio

3. Pruebas de germinación in vitro. Consisten en observar si el polen es capaz de germinar en un medio de cultivo artificial. Para ello es necesario desarrollar un medio de cultivo adecuado. Estos métodos permiten obtener una buena estima de la viabilidad del polen, ya que únicamente germinan los granos viables. Sin embargo, el inconveniente principal es que si la temperatura, tiempo de incubación o la composición del medio de cultivo no es la óptima, las estimaciones no serán buenas, lo cual nos llevará a conclusiones erróneas. Además, pueden existir distintos requerimientos entre distintos genotipos dentro de una misma especie. A pesar de estos inconvenientes este tipo de pruebas es muy adecuada cuando se han determinado las condiciones más adecuadas, lo cual suele ser común en las especies más importantes. 4. Pruebas de germinación in vivo. Este tipo de pruebas suele consistir en el conteo del número de tubos polínicos que se encuentran en el estilo después de realizar una polinización. El mayor problema de este tipo de técnicas es que son laboriosas y que no existen técnicas simples. El método considerado como más simple es el basado en la fluorescencia emitida por la calosa, la cual se encuentra en los tubos polínicos, cuando se tiñe con azul de anilina. Sin embargo, esta técnica requiere al menos tres días y en se necesita un microscopio de fluorescencia. Además, es necesario disponer de flores con estigma compatible para que actúen como parental femenino. Éstas se deben emascular antes de que las anteras estén maduras y embolsar para evitar la contaminación con otros pólenes. Debido a la complejidad y laboriosidad de este tipo de técnicas, sólo se utilizan en determinadas ocasiones. En la presente práctica se va a determinar la viabilidad del polen en varias especies de interés agrícola y especies silvestres relacionadas mediante los dos métodos más habituales utilizados en los programas de mejora: tinción morfológica y reacción enzimática. Para cada especie, se determinará el porcentaje de granos viables según los dos métodos, discutiéndose la adecuación de cada uno de ellos.

3.1.

MATERIAL Y MÉTODOS

3.1.1. Material vegetal Se utilizarán distintas especies de interés agrícola y especies silvestres relacionadas pertenecientes a varias familias botánicas. Se requieren plantas en floración, a ser posible cultivadas en diferentes condiciones ambientales. Se utilizarán flores en antesis, de forma que los granos de polen se encuentren ya maduros y la liberación de éstos pueda realizarse fácilmente.

3.1.2. Reactivos y equipo Acetocarmín al 1% Solución de tetrazolio Portaobjetos Cubreobjetos Pinzas de disección Microscopio óptico Placas Petri Papel de filtro Estufa

3.2.

PROCEDIMIENTO

3.2.1. Preparación de reactivos Acetocarmín Se hierven suavemente 100 mL de una solución al 45% de ácido acético a los cuales se ha añadido 1 g de carmín en el momento de la ebullición. Se deja hervir hasta que el carmín se disuelva totalmente. Se utiliza un destilador de bolas para evitar que se escapen los vapores de ácido acético. Después se filtra y se guarda en lugar fresco y en oscuridad. Con el acetocarmín la tinción tiene lugar rápidamente y a los 2-3 minutos ya se puede observar la preparación. En ocasiones, en lugar de acetocarmín se utiliza carmín glicerinado, que consiste en una mezcla a partes iguales de acetocarmín y glicerina. Solución de tetrazolio Existen varios tipos de soluciones de tetrazolio. El fundamento de la reacción es que en los granos viables existe actividad enzimática deshidrogenasa, que reduce las sales de tetrazolio dando lugar a un compuesto coloreado insoluble de formazán reducido. De esta forma, los granos que presentan actividad deshidrogenasa quedan teñidos. La solución de tetrazolio más habitual consiste en una disolución de cloruro de tetrazolio en sacarosa. Sin embargo, con esta solución se requiere un periodo de incubación de varias horas, lo cual no es viable para una sesión de prácticas. Una alternativa es la utilización de una solución basada en azul de tiazilol (bromuro de dimetiltiazilol difeniltetrazolio; MTT). Para ello se prepara una solución acuosa de azul de tiazilol al 0.9% (p/v) y sacarosa al 54% (p/v). 3.2.2. Extracción del polen

Para la extracción del polen de las anteras, según el caso, se coge la flor, ramillete floral, panícula, capítulo, etc. con unas pinzas de disección y se golpea suavemente contra uno de los bordes del portaobjetos, de forma que el polen caiga sobre éste. Una vez ha caído una cantidad suficiente, se puede proceder con la tinción. 3.2.3. Tinción Carmín acético Sobre el polen se coloca una gota de carmín acético. A los 3-4 minutos se puede realizar la observación. Si se utiliza carmín glicerinado es necesario esperar un tiempo mayor (al menos veinte minutos) para que se puedan ver nítidamente los granos teñidos. Solución de tetrazolio Sobre el polen se coloca una gota de solución de tetrazolio. Para que se produzca la tinción y observar los resultados es suficiente con esperar 10-15 minutos. 3.2.4. Observación La observación se realiza con el microscopio óptico, utilizando el objetivo de 10 aumentos para el conteo de granos viables y no viables. Para cada conteo se deben observar como mínimo 5 campos y 150 granos por portaobjetos. • En la tinción con carmín, se consideran como granos viables aquellos que toman el colorante y presentan una morfología normal. Se consideran como no viables aquellos que no toman el colorante y con morfología anormal (arrugados). • En la tinción con tetrazolio se consideran viables los granos teñidos de morado. Los no teñidos o amarillentos son inviables. La observación con el objetivo de 40 aumentos permite una mejor observación de la morfología de los granos de polen de cada especie.

3.3.

RESULTADOS

3.3.1. Liberación del polen Se comparará la capacidad de liberación del polen entre flores en distintos estadíos dentro de un mismo material genético y entre materiales pertenecientes a especies cultivadas y silvestres relacionadas. Se compararán los valores obtenidos en una escala de 0 (liberación nula) hasta 4 (liberación alta).

3.3.2. Morfología y tamaño de los granos de polen La morfología del grano de polen difiere entre especies. Así, la morfología del polen es útil en la determinación de la especie. Se describirá y comparará la morfología de los granos fértiles de cada una de ellas. 3.3.3. Viabilidad Se realizará un conteo de los granos viables y no viables en distintas preparaciones.

3.4.

CUESTIONES 1. Calcular la viabilidad del polen de las distintas muestras con los dos métodos de tinción. ¿En cuál de ellas es mayor la viabilidad? ¿Por qué? 2. Calcular la correlación entre ambos métodos de estimación de la viabilidad. ¿Qué indican estos valores? Comentar las implicaciones de un valor alto (>0.8) y de un valor bajo (<0.6) de la correlación entre ambos métodos. 3. ¿Existe alguna relación entre la facilidad de liberación del polen y su fertilidad? 4. Para un mismo genotipo, ¿hay diferencias entre la facilidad de liberación del polen y su fertilidad entre distintos estadíos de desarrollo de la antera? ¿Existen diferencias entre la fertilidad del polen de las especies cultivadas y las especies silvestres relacionadas? 5. ¿Qué solución adoptarías si en un cruzamiento que deseas llevar a cabo, uno de los parentales tiene baja fertilidad del polen?