72 Chirurgická onkologie je membránový tyrozinkinázový receptor a u člověka je lokalizován na chromozomu 2p23. U malé skupiny nádorů byla zjištěna inverze tohoto chromozomu, v jejímž důsledku vzniká fúzní gen EML4-ALK s následnou expresí proteinu s určitou aktivitou, vyskytující se převážně u adenokarcinomů. Protein se skládá z 1620 aminokyselin a vykazuje tkáňově specifickou expresi, zejména v mozku, střevech, varlatech a plicích.
5.3.3 Nádory prsu Součástí molekulárně-patologického vyšetření karcinomu prsu je hodnocení onkoproteinu Her2/neu. Tento onkoprotein je produktem genu Her2/neu, který se nachází na dlouhém raménku chromozomu 17 v oblasti q11.2–q12. Jedná se o transmembránový receptor s tyrozinkinázovou aktivitou o hmotnosti 185 kDa. Onkoprotein Her2 patří do široké rodiny HER, homologů EGFR (epidermal growth factor receptor) a má význam pro buněčný růst a transdukci signálu v buňce. Za normálních podmínek je zastoupení těchto receptorů v jedné buňce prsní žlázy okolo 20 000 kopií. Při overexpresi může počet receptorů Her2 vzrůst až na několik milionů, což je ve většině případů přímý důsledek amplifikace genu Her2/neu. U pacientek s pozitivitou Her2 měl tento fakt v minulosti spíše negativní prognostický význam. Se zavedením Trastuzumabu (Herceptin®) do léčby se situace změnila. Trastuzumab je humanizovaná monoklonální protilátka proti receptoru Her2, a je tedy vhodná pro pacientky s agresivnějším Her2 pozitivním nádorem. Za pozitivní Her2 dnes považujeme dle doporučení American Society of Clinical Onkology a College of American Pathologists pacientky s podílem pozitivních buněk (3+) stanovených IHC v 30 % nádorové tkáně a poměrem HER2/CEP17 stanoveným in situ hybridizací (ISH). Overexpresi těchto receptorů obvykle detekujeme pomocí imunohistochemie (IHC). Cytogenetické metody stanovují amplifikaci příslušného genu Her2/neu, na jehož podkladě dochází k overexpresi proteinu HER2. Jednou z cytogenetických metod je hybridizace in situ (ISH), která může být prováděna s fluorescenčním značením FISH nebo značením chromogenem CISH či stříbrem SISH apod. [19]. Dalším molekulárním markerem sledovaným se stále zvyšujícím se zájmem u populace karcinomu prsu jsou geny BRCA, které jsou zodpovědné za hereditární výskyt tohoto nádorového onemocnění. V současné době jsou známy dva hlavní geny BRCA1 a BRCA2, které v mutovaném stavu korelují s predispozicí ke vzniku nádoru prsu. Ztrátové mutace v BRCA genech vykazu-
jí autozomálně dominantní dědičnost s odhadovaným kumulativním rizikem pro vznik nádoru prsu 84 % do věku 60–70 let. Geny BRCA1 a BRCA2 jsou sekvenčně nepříbuzné proteiny, které se nacházejí společně v multiproteinových komplexech významných pro udržení stability genomu. Proteiny BRCA1 a BRCA2 jsou součástí komplexů řídících homologní rekombinaci a reparační procesy indukované DNA poškozením, dále se podílejí též na aktivaci transkripce, remodelaci chromatinu a regulaci buněčného cyklu. Mutace genu vede k nestabilitě genomu a kumulaci řady genových alterací v buňce a může vyústit až v její maligní zvrat. Vyšetření se rutinně provádí z periferní krve metodou přímé sekvenace. Další geny, kreré lze u karcinomu prsu sledovat, jsou KRAS, MET, PIK3CA, PTEN, BRAF TOP2A, mTOR apod.
5.3.4 Nádory žaludku Zhruba u 20 % adenokarcinomů žaludku je prokázána exprese receptoru Her2 korelující s horší prognózou. U těchto karcinomů bylo současně prokázáno signifikantní prodloužení celkové doby přežití při terapii trastuzumabem. Indikace léčby je podmíněna stanovením Her2 pozitivity tumoru, což se stanovuje IHC průkazem overexprese proteinu dle skórovacího systému pro karcinomy žaludku. Za pozitivitu lze považovat pouze membránovou imunopozitivitu. Zbarvení cytoplazmy hodnotíme jako artefakt. Skórovací systém pro karcinomy žaludku je odlišný od skórovacího systému pro karcinomy prsu. Jako pozitivní 3+ hodnotíme i tumory s inkompletní bazolaterální nebo laterální silnou expresí. Dále je nutné odlišit hodnocení endobiopsií a resekátů. U endobiopsií hodnotíme jako pozitivní výsledek při zastoupení 5 % imunopozitivních buněk, zatímco u resekátu od 10 % imunopozitivních buněk. U difuzních adenokarcinomů expresi IHC nestanovujeme u endobiopsií a i u resekátů může být interpretace sporná a je vhodnější využít průkazu amplifikace pomocí ISH.
5.3.5 Nádory kolorekta Účinnost terapie u kolorektálního karcinomu (CRC) se dnes odvíjí od diagnostiky prediktivních biomarkerů a molekulárních analýz. Molekulární analýza se u kolorektálního karcinomu v současné době zaměřuje na několik oblastí. První oblastí je testování signální dráhy EGFR/ERBB/HER, která je zásadní s ohledem na dostupnou cílenou léčbu anti-EGFR monoklonálními pro-
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS505474
Principy patomorfologické diagnostiky nádorů 73 tilátkami (cetuximab, panitimumab, trastuzumab) nebo inhibitory tyrozinkinázové domény receptorů EGFR/ ERBB/HER (gefitinib, erlotinib, lapatinib). Další oblast testování je status mikrosatelitové instability (MSI), která má význam prediktivní i prognostický. Dále lze detekovat zvýšenou expresi či mutace VEGF za současného zvýšení dalších růstových a proangiogenních faktorů, s ohledem na antiangiogenní terapii pomocí monoklonální protilátky proti receptoru VEGFR (bevacizumab). Zastoupení EGFR receptorů hodnocených IHC dnes nemá pro následnou léčbu prokazatelný význam a jako podstatná se jeví role mutačních změn genů Kras a Nras, které jsou součástí signální dráhy EGFR/ras/raf/MAPK. Aktivace EGFR vede k aktivaci „downstream“ signálních drah zahrnujících dráhu EGFR/ras/raf/MAPK, ale také např. PIK3-AKT-mTOR. Geny ras zprostředkovávají buněčnou odpověď na růstové faktory. Gen se nachází v chromozomálním regionu 12p12.1. Jeho produktem je protein s GTPázovou aktivitou. Mutace genu ras jsou zodpovědné za setrvání proteinu v aktivní formě s navázaným GTP, důsledkem je trvalá signalizace a nekontrolovaná buněčná proliferace. Ras je za normálních podmínek aktivovaný EGFR a je považovaný za jeden z nejčastějších onkogenů u kolorektálního karcinomu. Frekvence této onkogenní somatické mutace (převážně bodové mutace) některého z genů (NRAS, KRAS) se vyskytuje asi u 30 % nádorů [20, 21]. Tyto bodové mutace aktivující Ras se vyskytují v kodonech 12, 13 a v kodonu 61 (1 % všech mutací) a do budoucna by bylo optimální testování u KRAS exon 2 (kodony 12, 13), exon 3 (kodony 59, 61) a exon 4 (kodony 117, 146) a NRAS exon 2 (kodony 12, 13), exon 3 (kodony 59, 61) a exon 4 (kodony 117, 146). U genu BRAF je nejčastěji nalezena mutace V600E, ale je možný výskyt 5 dalších mutací zahrnujících V600G, K, R, M a V601E. Podle posledních studií však mutace genu BRAF zřejmě nemají prediktivní význam a léčbu anti-EGFR neovlivňují. Je zde však zaznamenán určitý prognostický význam mutace BRAF, který ve spojitosti se stavem MMR genů může znamenat horší prognózu a senzitivitu na terapii než nádory bez mutace [22].
5.3.6 Nádory kůže V bioptické diagnostice je velice důležité odlišení benigních melanocytárních lézí od maligního melanomu (MM). Využívá se cytogenetická analýza pomocí fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Díky této metodě můžeme sledovat zmnožení nebo ztráty specifických chromozomálních oblastí. Nejčastěji lze sledovat delece v regionech 6q, 8p, 9p, 10q. Dále jsou časté amplifi-
kace v regionech 1q, 6p, 8q, 17q, 20q. Udává se také zmnožení celého chromozomu 7. Dnes jsou k dispozici kombinované sondy RREB1/Myb/CCND1/CEP6, které lze použít k detekci numerických změn vyskytujících se u maligních melanomů a tím doplnit/potvrdit diagnózu. U maligního melanomu lze sledovat i řadu biomarkerů. Jeden z nejvýznamnějších je gen BRAF. Pro klinické využití se prováděly testace na exonech 1, 2 a 15. Aktivující mutace tohoto protoonkogenu byly detekovány u 70 % maligních melanomů. Onkogenické mutace genu BRAF mají u MM za následek aktivaci kinázy, což vede k aktivaci dráhy (MAPK) i při nepřítomnosti růstového faktoru. Tuto aktivitu lze u MM inhibovat novým inhibitorem (vemurafenib), který je cílený na mutaci BRAFV600E. Kontraindikaci léčby může navodit mutace genu KRAS, např. RASG12D. Aktivovaný RAS následně spouští kaskádu proteinových serin/threoninových kináz. Dalším diskutovaným biomarkerem, známým také jako CD66a, je gen CEACAM1. Tento gen je z rodiny genů patřících do podskupiny imunoglobulinů a je umístěn na dlouhém raménku chromozomu 17. Hraje klíčovou úlohu v imunologických procesech a byl původně identifikován jako tumorsupresorový gen. Dle studií významně koreluje s progresí tumoru a se špatným přežitím pacientů. O jeho významu jako biomarkeru pro volbu terapie se stále diskutuje. Z hereditárního hlediska se u maligních melanomů sledují také mutace genu CDKN2A (cyklin dependentní inhibitor kinázy 2A) s transkripčními variantami p16/ INK4a a p14/ARF. Tento gen je lokalizovaný na chromozomu 9 (9p21). Mutace narušují regulaci ústřední dráhy buněčného cyklu a lze je rutinně detekovat přímou sekvenací.
5
5.3.7 Hematologické malignity Diagnostika lymfomů je založena na histologickém a následném imunohistochemickém vyšetření, které je doplněno o cytogenetické vyšetření hybridizace in situ (ISH). Morfologicko-genetické vyšetření je současně rozšířeno o cytogenetické vyšetření z periferní krve a průtokovou cytometrii. Pro správnou diagnostiku lymfomů je nutný reprezentativní odběr tkáně a kvalitní fixace, která bývá častým důvodem pro znemožnění následných molekulárních analýz provedených před nasazením terapie. Velice komplikované jsou z tohoto důvodu trepanobiopsie, jejichž součástí při zpracování je odvápnění materiálu a časté poškození nukleových kyselin. V cytogenetické diagnostice lymfomů se používá celá škála lokus specifických (translokačních, zlomových) sond.
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS505474
74 Chirurgická onkologie
5.3.8 Sarkomy Sarkomy měkkých tkání jsou diagnostikovány jak u dětí, tak dospělých a z histologického hlediska se jedná o velice široké spektrum onemocnění. V některých případech pro diagnostiku postačuje klasické histopatologické vyšetření s použitím imunohistochemických metod, ale někdy je nutné doplnit toto spektrum o molekulární diagnostiku. Pomocí molekulárních metod je možné stanovení exprese některých proteinů či zjistit chromozomální aberace. Nejčastěji jsou využívána cytogenetická vyšetření u Ewingova sarkomu, který je v 85 % případů charakterizován specifickou reciproční chromozomální translokací t(11;22)(q24;q12) mající za následek fúzi genu EWS (chromozom 22) a genu FLI1 na chromozom 11 a u synoviálního sarkomu, který je v 95 % případů charakterizován translokací t(X;18)(q11;Xp11) mající za následek fúzi genu SYT (chromozom 18q11) a SSX1,SSX2 nebo SSX4 genu (chromozom Xp11).
Literatura 1. 2. 3.
4. 5.
6. 7. 8. 9.
10.
11. 12.
13.
14.
15. 16. 17.
POVÝŠIL, C.; ŠTEINER, I. et al. Speciální patologie. 2. vyd. Praha: Galén a Karolinum, 2007. ROSAI, J. Surgical Patology. 9. vyd. Edinburg: Mosby, 2004. TAVASSOLI, F. A.; DEVILEE, P. Pathology and gene‑ tics. Tumours of the breast and female genital organs. WHO classification of tumours. 1. vyd. Lyon: IARC Press, 2003, s. 9–112. DVOŘÁČEK, J.; BABJUK, M. et al. Onkourologie. 1. vyd. Praha: Galén a Karolinum, 2005. VAN KRIEKEN, J. H. J. M.; JUNG, A.; KIRCHNER, T. et al. KRAS mutation testing for predicting response to anti-EGFR therapy for colorectal carcinoma: proposal for an European duality assurance program. Virchows Arch, 2008, 453, s. 417–431. DABSS, D. Diagnostic immunohistochemistry. 2. vyd. Churchill Livingstone: Elsevier, 2006. ABRAHÁMOVÁ, J.; POVÝŠIL, C.; DUŠEK, L. a kol. Nádory varlat. 1. vyd. Praha: Grada, 2008. MIETTINEN, M. Diagnostic soft tissue pathology. 1. vyd. Churchill Livingstone: Elsevier, 2003. FRITZ, A.; PERCY, C.; JACK, A.; SHANMUGARATNAM, K.; SOBIN, L. H.; PARKIN, D. M.; WHELAN, S. (Eds.) Mezinárodní klasifikace nemocí pro onkologii
18.
19.
20.
21.
22.
(třetí vydání, česká verze). Praha: Ústav zdravotnických informací a statistiky ČR, 2004, s. 293. SOBIN, L. H.; GOSPODAROWICZ, M. K.; WITTE KIND, C. (Eds.) TNM klasifikace zhoubných novotvarů (sedmé vydání, česká verze). Praha: Ústav zdravotnických informací a statistiky ČR, 2011, s. 246. COLEMAN, W. B.; TSONGALIS, G. J. Molecular Pathology. Praha: Academic Press, 2009. STANĚK, L. Polymerase chain reaction: basic principles and applications in molecular pathology. Cesk. Patol, 2013, 49, 3, s. 119–121. MRHALOVA, M.; KODET, R. Fluorescenční in situ hybridizace na histologických řezech. Cesk. Patol, 2013, 49, 4, s. 114–122. LOUIS, D. N.; OHGAKI, H.; WIESTLER, O. D. et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervosus system. Acta Neuropathol, 2007, 114, 2, s. 97–109. ŠLAMPA, P. et al. Gliomy. 1. vydání. Praha: Maxdorf, 2013. SLABÝ, O.; SVOBODA, M. et al. MicroRNA v onko‑ logii. 1. vydání. Praha: Galén, 2013. STANĚK, L.; LÍSOVÁ, S.; POVÝŠIL, C. Úskalí diagnostiky karcinomu plic – jak patolog přispívá k výběru správné terapie. Postgraduální medicína, 2012, 4, s. 392–394. YOSHIDA, A.; TSUTA, K.; HARUMI, N. et al. Comprehensive histologic analysis of ALK-rearranged lung carcinomas. Am J Surg Pathol, 2011, 35, s. 1226–1234. TVRDÍK, D.; STANĚK, L.; SKÁLOVÁ, H.; DUNDR, P.; VELENSKÁ, Z.; POVÝŠIL, C. Comparison of the IHC, FISH, SISH and qPCR methods for the molecular diagnosis of breast cancer. Mol Med Rep, 2012, 6, 2, s. 439–443. LOUPAKIS, F.; RUZZO, A.; CREMOLINI, C. et al. KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer, 2009, 101, s. 715–721. DE ROOCK, W.; CLAES, B.; BERNASCONI, D. et al. Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol, 2010, 11, s. 753–762. OGINO, S.; NOSHO, K.; KIRKNER, G. J. et al. CpG island methylator phenotype, microsatellite instability, BRAF mutation and clinical outcome in colon cancer. Gut, 2009, 58, s. 90–96.
Ukázka elektronické knihy