Issuu

Apoptóza

projevy kóduje protein huntingtin a obsahuje polymorfní repetitivní sekvence trinukleotidu CAG. U zdravých lidí nepřekračuje počet těchto repetic 20, zatímco gen pro huntingtin s více než 35 repeticemi představuje vysoké riziko pro rozvoj onemocnění. Na in vitro buněčných modelech se mutovaný huntingtin projevuje apoptózou provázenou poškozením a ztrátou neuritů, kondenzací chromatinu, pyknózou jádra a fragmentací chromatinu. Inhibitory apoptózy nebo neurotrofní faktory jsou do jisté míry schopny chránit neurony před působením mutovaného huntingtinu [369]. Roli apoptózy v patogenezi tohoto onemocnění také dokládají mozky pacientů, u nichž byla metodou TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelling) prokázána zvýšená aktivita kaspáz-1, -3, -6 a -8. U myší je pak možné efektům mutovaného huntingtinu předejít pomocí inhibitorů kaspáz, či současnou expresí BCL2 nebo BCL-XL [370].

Apoptóza a akutní mozková ischemie Akutní mozková ischemie byla dlouhou dobu považována za patologii asociovanou výhradně s nekrotickými typy buněčné smrti neuronů. Některé studie skutečně potvrdili nekrotickou smrt v jádru ischemie, avšak v obklopující tkáni zaznamenaly přetrvávající metabolickou aktivitu a v pozdějších fázích smrt apoptózou, která ještě prohloubila poškození a nefunkčnost tkáně. Různé experimenty také potvrdily zapojení proteinů rodiny BCL2 v ischemicko-reperfuzním poškození mozkové tkáně, kdy ischemii následuje štěpení BID indikující jeho aktivaci [371]. Tento jev potvrzují také modely s vyřazením funkce BID, u nichž je rozsah poškození mozkové tkáně v důsledku ischemie menší [372]. Vzhledem ke zvýšené citlivosti vyvíjejícího se mozku k apoptóze lze předpokládat, že je apoptóza zásadněji zapojena v ischemicko-reperfuzním poškození mozku mladých lidí (zejména v perinatálním období a v raném dětství) [197].

Modulace apoptózy Velké množství prací dokládajících roli apoptózy v patogenezi chorob umocnilo snahy o farmakologické ovlivnění apoptózy. Porozumění mechanizmům regulace apoptózy mělo za následek velkou snahu jak akademických, tak i průmyslových laboratoří, zaměřenou na vývoj činidel inhibujících funkce antiapoptotických proteinů ve snaze vyvolat apoptózu v buňkách nádoru či utlumit apoptózu u nemocí spojených s abnormálním zánikem buněk. Ovlivňování buněčné smrti může mít potenciálně značný vliv na léčbu mnoha lidských onemocnění, zejména těch nádorových. Časné studie zabývající se inhibicí apoptózy testovaly terapeutickou účinnost pankaspázových (inhibují více kaspáz) inhibitorů, např. Z-VAD-FMK, které jsou schopny blokovat klíčové exekuční kaspázy. Tyto inhibitory však působí v molekulární mašinerii až po permeabilizaci vnější mitochondriální membrány (MOMP) a nemohou již zvrátit rozsáhlé postižení mitochondriálních funkcí způsobené pórotvornými proteiny BAX a BAK. Farmakologická inhibice kaspáz je však schopna snížit jejich aktivaci během ischemie a úrazů v mozkové tkáni, což může zlepšit prognózu pacientů zejména tehdy, použijí-li se inhibitory kaspáz v kombinaci s antagonisty N-metyl-D-aspartátu (NMDA), které redukují excitotoxicitu (proces, kdy jsou buňky nervového 97

Ukázka elektronické knihy, UID: KOS291389

Buněčná smrt a její význam ve fyziologii a patologické fyziologii

BCL2

MN125

-77

BTS

UMI

A-13 3185 2 WEH I-539 A-12 1047 7 AMG 176 S63 845

A-11 5546 3

BCL 2-32

746 S55

S44 563

4320

BM1197

AZD

ABT -263

ABT -737

systému usmrceny nadměrným působením neurotransmiterů) [373]. Nadějné jsou také sloučeniny, u nichž byla prokázána silná BAX-inhibující aktivita.Tato činidla mají potenciál ochránit neurony před excitotoxickým poškozením a před ischemií [374, 375], i když pro uvedení těchto látek na klinickou úroveň testování je potřeba ještě další optimizace. Bez ohledu na fázi klinického testování je vývoj těchto látek (a látek doplňujících jejich účinek, např. modulátorů autofagie) příslibem nových možností, jak zvrátit rozvoj některých onemocnění způsobených nadměrnou apoptózou. Snad nejvýznamnějším pokrokem v aplikaci znalostí o apoptotické regulaci byl vývoj BH3 mimetik (obr. 26). BH3 mimetika jsou nová třída léčiv, která jsou schopna senzitizovat buňky na apoptózu blokováním aktivity antiapoptotických proteinů rodiny BCL2. Proapoptotické proteiny jsou pak schopny vykonávat svou primární funkci a aktivovat apoptózu. V roce 2016 schválil úřad FDA venetoclax (ABT-199), což je vysoce selektivní inhibitor BCL2 používaný pro perorální léčbu akutní myeloidní leukémie (AML) a chronické lymfocytární leukémie (CLL), a to na základě excelentních výsledků z klinické oblasti, kdy došlo ke zlepšení stavu dokonce i u pacientů s mutovaným p53 a s mnohonásobným relapsem onemocnění po předešlých terapiích [264]. V roce 2017 tento přípravek podmínečně schválila Evropská agentura pro léčiva (EMA). V různých stadiích klinických testů jsou také navitoclax (ABT-263), který brání anti apoptoticky působícím proteinům BCL2, BCL-XL a BCL-W ve vazbě na apoptotické efektory BAX a BAK a léčiva ovlivňující deaktivaci p53 pomocí MDM2 jako například RG7112, AMG232, RO5503781, SAR405838, Idasanutlin (RG-7388), DS-3032b, CGM-097 a HDM201 [376, 377]. V porovnání s hematologickými malignitami je využití těchto inhibitorů u solidních nádorů a nemaligních onemocnění značně problematické, zejména díky nedostatečnému pochopení různých závislostí apoptózy na dalších buněčných procesech a vzniku různých vedlejších účinků (např. trombocytopenie [378]), což narušuje bezpečnou a efektivní aplikaci těchto léčiv v klinické praxi. Soudě podle slibných výsledků preklinických studií mohou BH3-mimetika fungovat také jako účinná terapie autoimunitních chorob. Podání venetoclaxu u žen se

ABT -199

IND IND IND IND IND IND IND IND

BCL-W

IND IND

BCL-XL

IND IND IND IND IND

IND IND IND IND

BFL1 MCL1

IND IND IND IND

BAX

IND INH

BAK

INH inhibuje daný protein

IND = indukce apoptózy

indukuje daný protein

INH = inhibice apoptózy

Obr. 26 BH3-mimetika ve fázi testování. 98

Ukázka elektronické knihy, UID: KOS291389

Apoptóza systémovým lupus erythematodes bylo obecně dobře tolerováno, způsobilo snížení počtu B-lymfocytů v periferii a tlumilo fenotyp spojený s tímto onemocněním [379]. Jak bylo zmíněno výše, infekční patogeny často využívají potlačení apoptózy v buňkách hostitele jako součást své infekční strategie. V teoretické rovině by tak inhibice signalizace pro přežití buňky mohla umožnit normální průběh apoptózy a potenciálně zabránit expanzi infekčního agens v hostiteli. Tento efekt byl skutečně pozorován u BH3-mimetik během infekce bakterií Legionella pneumophila. Jediná dávka BH3‑mimetika zaměřeného na BCL-XL nebo delece BCL-XL výrazně omezila replikaci legionely a zabránila letálním plicním infekcím u myší [380]. Přestože použití BH3-mimetik cílících na rodinu BCL2 proteinů u savců může být za určitých podmínek účinné, vývoj látek, které blokují přímo funkci jejich analogů kódovaných patogeny by pravděpodobně značně rozšířil možnosti použitelné terapie. Ideálním prostředkem by v tomto případě byl vývoj malých molekul, které inhibují aktivitu antiapoptotických proteinů exprimovaných patogenem, nikoli však aktivitu jejich savčích protějšků.

Metody detekce apoptózy Během posledních dekád bylo vyvinuto značné množství různých metod pro detekci apoptózy. Detekce apoptózy zahrnuje biochemické metody týkající se změn v symetrii buněčné membrány, detekci změn chromatinu a fragmentace DNA a monitorování mitochondriálního poškození. Specifičtější přístupy pak zahrnují průtokovou cytometrii, western blot a imuno-cyto/histochemické testy (IHC) založené na konkrétním mechanizmu apoptózy. V poslední době je využívanou metodou také časosběrná mikroskopie [381]. Nicméně ani jedna z těchto metod, pokud je použita samostatně, není dostačující k prokázání apoptózy a její výsledky by vždy měly být ověřeny doplňující metodou, zaměřenou pokud možno na jiný typický parametr apoptózy. Některé apoptotické procesy totiž mohou být zapojeny i v jiných typech buněčné smrti nebo dokonce probíhají ve fyziologických procesech, které nekončí smrtí buňky [382]. Vzhledem k tomu, že některé běžně používané apoptotické markery lze detekovat i během jiných modalit buněčné smrti (kde však mají na buňku jiný efekt než během apoptózy), nemělo by se stanovení tohoto procesu provádět pouze v jednom časovém okamžiku (nevhodnost tzv. „end-point“ analýz) a na základě jediného markeru. Sledování průběhu apoptózy by tak mělo být při správné detekci samozřejmostí [4]. Tato kapitola byla zpracována na základě doporučení uvedených v pokynech pro použití a interpretaci testů pro sledování buněčné smrti u vyšších eukaryot [383].

Detekce apoptózy elektronovou, světelnou a fluorescenční mikroskopií Hlavní výhoda elektronové mikroskopie (EM) spočívá ve vysokém rozlišení, což umožňuje vizualizaci jemných ultrastrukturálních změn provázejících apoptózu, včetně perforací ve vnější mitochondriální membráně a časné fáze kondenzace chromatinu (světelnou mikroskopií je pozorovatelná až v pozdějších fázích). I přes to, že EM může poskytnout opravdu detailní informace o ultrastruktuře buňky, měla by být vždy doplněna robustním kvantitativním stanovením apoptózy v buněčné populaci. Je třeba si uvědomit, že ve sledovaném vzorku vidíme jen malou frakci populace, což může 99 Ukázka elektronické knihy