7.4 MOLEKULÁRNÍ CYTOGENETIKA FISH (fluorescenční in situ hybridizace) FISH je kombinací metod klasické cytogenetiky a molekulární genetiky. Používá fluorescenčně značené sondy (fragmenty DNA). Proces probíhá ve dvou krocích, nejprve je provedena tepelná denaturace DNA i sondy a poté následuje hybridizace. Krátké sondy se na principu komplementarity navazují k cílové sekvenci DNA (viz Molekulární genetika). Po odmytí nenavázané sondy následuje hodnocení pomocí fluorescenčního mikroskopu. Jednotlivé typy sond se navzájem liší tím, na jakou oblast chromosomu se navazují. Rozlišujeme centromerické, telomerické, lokus specifické a celochromosomové sondy. Některé typy sond můžeme použít jak na chromosomy v metafázi, tak na interfázní jádra. Příkladem jsou centromerické sondy a lokus specifické sondy. Celochromosomové sondy lze použít pouze na metafázní chromosomy. Centromerické sondy se vážou na repetitivní alfa-satelitní sekvence v oblasti centromer. Využívají se např. k rychlé detekci numerických aberací nebo k přesnějšímu vyčíslení numerické mozaiky. Lokus specifické sondy se vážou na konkrétní lokus na chromosomu. Lze je využít například k potvrzení mikrodelečních syndromů a v nádorové cytogenetice. Použití celochromosomových (malovacích) sond je omezeno pouze na metafázní chromosomy. Sondy jsou tvořeny směsí fragmentů DNA, které se na principu komplementarity vážou ke konkrétnímu chromosomu po celé jeho délce. Výsledkem je fluorescenční obarvení celého chromosomu. M-FISH – vícebarevná fluorescenční in situ hybridizace je obdobou této metody. Při M-FISH se obarví všechny chromosomy, každý jinou fluorescenční barvou. Malovací sondy se uplatňují především v nádorové cytogenetice.
7.4.1 Microarray aCGH (array comparative genomic hybridization) aCGH vychází z metody FISH s tím rozdílem, že DNA sondy jsou při aCGH umístěny na pevném nosiči – mikročipu. Metoda umožňuje detekci nebalancovaných chromosomových přestaveb tedy duplikací/delecí (tzv. CNVs – copy number variants) v celém genomu v jedné reakci. Citlivost metody je 100× vyšší než karyotypování. aCGH se využívá v prenatální diagnostice nebo v případech, kdy patologický fenotyp pacienta nekoreluje s nálezem v karyotypu. Nezastupitelnou roli má při vyšetřeních pacientů s podezřením na některý z mikrodelečních syndromů. Principem metody je porovnání počtu kopií vybraných lokusů zkoumaného vzorku DNA s referenční DNA (pocházející od zdravého jedince). Vzorky DNA jsou označeny fluorochromy odvozenými od cyaninu (CY). DNA pacienta je označena např. CY3 (zelená) a referenční vzorek CY5 (červená). DNA vzorku i referenční DNA (v poměru 1 : 1) hybridizují současně na mikročipu s 60 000 oligonulkeotidovými sondami. Mikročip je skleněná destička, na které jsou ukotveny sondy – fragmenty DNA z různých lokusů celého genomu. Vysoká hustota sond je především v klinicky důležitých oblastech. V průběhu hybridizace „vzájemně soutěží“ (kompetuje) DNA vzorku s referenční DNA o sekvenci sondy ukotvenou na čipu. Delece se jeví jako místa na čipu, kam se navázala převážně referenční DNA (červený signál), duplikace jako místa, kde převažuje DNA pacienta nad referenční DNA (zelený signál) a na místech bez kvantitativní změny 98
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS288732
bude navázaná DNA vzorku i referenční DNA (žlutý signál). Intenzita signálů na jednotlivých sondách se odečítá pomocí skeneru. Skener nasnímá jednotlivé body na mikročipu a podle poměru intenzity zeleného a červeného signálu speciální software vyhodnocuje jednotlivé CNVs. SNP-array (single nukleotide polymorphism-array) SNP-array umožňuje detekci jednonukleotidových polymorfismů (SNP) DNA. Princip metody je obdobou aCGH. Na rozdíl od aCGH dokáže odhalit např. uniparentální disomii (UPD, oba homologní chromosomy jsou zděděny od jednoho rodiče) nebo ztrátu heterozygozity (LOH).
7.5 CHROMOSOMOVÉ ABERACE Chromosomové aberace mohou být dvojího typu: numerické – odchylky v počtu chromosomů nebo strukturní – změny ve stavbě jednotlivých chromosomů. Chromosomové aberace jsou příčinou vzniku chromosomálně podmíněných syndromů. Syndrom je soubor příznaků, který charakterizuje určitý fenotyp (nemoc). Jedinci postižení stejným syndromem jsou si často navzájem podobní (mají stejný fenotyp).
7.5.1 Numerické chromosomové aberace Mezi numerické aberace řadíme polyploidie (zmnožení počtu celých chromosomových sad) a aneuploidie (změny počtu jednotlivých chromosomů). Polyploidie není u člověka slučitelná se životem. S polyploidní chromosomovou výbavou se můžeme setkat při vyšetření potracených plodů. Nejčastějším mechanismem vzniku triploidního (3n) zárodku je oplození oocytu dvěma spermiemi, vzácně oplození diploidního oocytu normální spermií nebo oplození normálního oocytu diploidní spermií. Tetraploidní zárodek (4n) může vzniknout např. endoreduplikací zygoty (replikace chromosomů, po které nenásleduje rozdělení buňky). Většina polyploidních zárodků je spontánně potracena v prvním trimestru těhotenství. Aneuploidie představuje odchylku v počtu jednotlivých chromosomů. Vzniká v důsledku nondisjunkce v I. nebo II. meiotickém dělení u jednoho z rodičů. Výsledkem je buď trisomie 2n+1 (jeden chromosom je v karyotypu zastoupen třemi kopiemi) nebo monosomie 2n-1 (z daného páru homologních chromosomů je přítomen pouze jeden). Riziko meiotické nondisjunkce se zvyšuje spolu s narůstajícím věkem matky (Graf 7.1). K nondisjunkci může dojít i po oplození. Potom se jedná o tzv. mitotickou nondisjunkci. Jejím důsledkem je mozaikový karyotyp – přítomnost dvou nebo více buněčných linií s rozdílným karyotypem. Trisomie autosomů, až na několik málo výjimek (trisomie chromosomu 13, 18, 21 a zcela ojediněle mozaikové formy trisomie dalších chromosomů), u živých jedinců nenacházíme. S navýšením počtu gonosomů se naproti tomu můžeme setkat poměrně často. Fenotypové projevy vyvolané změnami počtu gonosomů jsou ve srovnání se stejnými změnami na autosomech méně závažné. Monosomie autosomů a chromosomu Y jsou u člověka letální. Jedinou monosomií slučitelnou se životem je monosomie chromosomu X (viz Turnerův syndrom). 99
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS288732
chrom. aberace / 1000 narozených
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
věk matky (roky)
Downův syndrom
Chrom. aberace celkem
Graf 7.1 Závislost výskytu syndromů podmíněných aneuploidiemi na věku matky
7.5.1.1 Syndromy podmíněné numerickými chromosomovými aberacemi autosomů Downův syndrom – trisomie chromosomu 21 Downův syndrom je nejčastěji se vyskytující chromosomálně podmíněný syndrom. Vyskytuje se s četností 1/700 narozených dětí. Karyotyp postižených jedinců je 47,XY,+21 nebo 47,XX,+21, vzácněji nacházíme translokační formu (Robertsonova translokace mezi chromosomem 21 a dalším akrocentrickým chromosomem viz strukturní chromosomové aberace) nebo mozaikovou formu Downova syndromu (jen část buněk nese nadbytečný chromosom 21). Závažnost fenotypových projevů je u jednotlivých pacientů vysoce variabilní. Po narození bývá svalová hypotonie, dále růstová a mentální retardace. Dalšími znaky jsou plochá tvář, šikmé postavení očí s epikanty (kožní řasa ve vnitřním koutku), pootevřená ústa s velkým zbrázděným jazykem, anomálie uší, ploché záhlaví, krátké široké ruce s opičí rýhou v dlani, hypermobilita kloubů, vrozené vady srdce a dalších orgánů. Právě srdeční vady jsou častou příčinou předčasných úmrtí. Postižení jedinci jsou náchylní k infekcím, leukémiím (ALL i AML) a Alzheimerova choroba u nich nastupuje už okolo 40. roku. Dožívají se průměrně 50 let. Patauův syndrom – trisomie chromosomu 13 Karyotyp jedinců s Patauovým syndromem je 47,XX,+13 nebo 47,XY,+13 případně karyotyp s nebalancovanou translokací nadbytečného chromosomu 13 nebo mozaika. Incidence je 1 : 10000 narozených dětí. Postižení jedinci mají těžkou mentální retardaci, malformace CNS – holoprozencefalii (mozek není rozdělen na dvě hemisféry), mikrocefalii (malá hlava), mikroftalmii (malé oči) někdy kyklopii (jedno centrálně uložené oko), deformované ušní boltce, polydaktylii na 100
Ukázka elektronické knihy