3
Klinická radiobiologie zesíťování DNA prostřednictvím křížových vazeb mezi nukleotidy (DNA cross-links). V některých případech může zastoupit i BER, je-li tato dráha nefunkční. Existují dvě rozdílné varianty NER, z nichž jedna je funkčně vázána na transkripci. Obecně ale NER probíhá obdobně jako BER s tím rozdílem, že během NER dochází k vyštěpení rozsáhlejších úseků (12–13 nt) poškozeného řetězce DNA. Oprava chybného párování bází (mismatch repair, MMR) se zaměřuje na nukleotidy, jež byly do DNA řetězce nesprávně zařazeny během replikace73 a unikly korekturní (proofreading) aktivitě samotné DNA polymerázy. Substrátem pro MMR jsou také tzv. IDL smyčky (insertion-deletion loops), příležitostně se tvořící v DNA následkem drobných inzercí nebo delecí po nepřesné replikaci. Protože špatně spárované nukleotidy nemusí být poškozeny, vyvstává zde zásadní problém, jak identifikovat řetězec s nezměněnou genetickou informací. Princip, na jakém buňka toto rozhodnutí činí, byl zatím spolehlivě popsán pouze u gramnegativních bakterií. E. coli využívá například skutečnosti, že nově syntetizovaný řetězec DNA ještě nestihl být metylován na adeninu v sekvencích GATC. Proteiny podílející se na MMR umějí tuto metylaci detekovat, a odstranit tak nepatřičný nukleotid ze správného řetězce. U člověka je nově syntetizovaný řetězec rozpoznán patrně podle přítomných jednořetězcových zlomů, které v něm vznikají během replikace. Aby mohlo dojít k nalezení nejbližší sekvence GATC nebo zlomu řetězce, musí MMR odseparovat a následně odstranit ještě delší (∼ 1000 nt) úseky DNA než NER. V některých případech vedou aktivity MMR k sekundární tvorbě dvouřetězcových zlomů, takže je pak nezbytné opravu DNA dokončit pomocí homologní rekombinace. Nejen tato skutečnost poukazuje na vzájemnou kooperaci a provázanost jednotlivých reparačních drah, jež v poslední době vyplouvá stále více na povrch. BER se může například spolupodílet na opravách zkřížených vazeb DNA a oxidovaných bází a také buněčné signalizaci po poškození DNA.
3.6.2 Opravy zlomů DNA Zatímco jednořetězcové zlomy DNA dokáže buňka jednoduše a rychle spojit, dvouřetězcové zlomy představují díky současnému přerušení obou řetězců v jednom místě molekuly DNA vůbec nejhůře opravitelné léze indukované ionizujícím zářením i obecně. Existují dva základní mechanizmy reparace DSB – nehomologní spojování konců (NHEJ z anglického non-homologous end-joining) a homologní rekombinace (HR) (obr. 3.8). Liší se zejména využitím homologního templátu, tj. sesterské chromatidy, k rekonstrukci původní genetické informace. Nehomologní spojování konců prostřednictvím komplexu DNA ligázy IV spočívá v prosté ligaci volných konců DNA, v případě radiačně indukovaných DSB většinou po jejich předchozím „začištění“74. Jinými slovy, opravné kroky na rozdíl od homologické rekombinace nezávisejí na přítomnosti nepoškozené chromatidy. To s sebou přináší řadu výhod i nevýhod. NHEJ vyniká především rychlostí a probíhá ve všech fázích buněčného cyklu. Patrně proto tento způsob opravy převažuje u vyšších eukaryot, jejichž genomy často dosahují velkých rozměrů. Lze totiž předpokládat, že i v takto velkých genomech stihne tento mechanizmus eliminovat rozsáhlá poškození v natolik 73 Např. adenin (A) byl namísto cytosinu (C) vložen oproti guaninu (G). 74 Na 3'-konci řetězce DNA musí být -OH skupina a na 5'-konci fosfátový zbytek.
98
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS276459