Issuu

Klinická radiobiologie zesíťování DNA prostřednictvím křížových vazeb mezi nukleotidy (DNA cross-links). V některých případech může zastoupit i BER, je-li tato dráha nefunkční. Existují dvě rozdílné varianty NER, z nichž jedna je funkčně vázána na transkripci. Obecně ale NER probíhá obdobně jako BER s tím rozdílem, že během NER dochází k vyštěpení rozsáhlejších úseků (12–13 nt) poškozeného řetězce DNA. Oprava chybného párování bází (mismatch repair, MMR) se zaměřuje na nukleotidy, jež byly do DNA řetězce nesprávně zařazeny během replikace73 a unikly korekturní (proofreading) aktivitě samotné DNA polymerázy. Substrátem pro MMR jsou také tzv. IDL smyčky (insertion-deletion loops), příležitostně se tvořící v DNA následkem drobných inzercí nebo delecí po nepřesné replikaci. Protože špatně spárované nukleotidy nemusí být poškozeny, vyvstává zde zásadní problém, jak identifikovat řetězec s nezměněnou genetickou informací. Princip, na jakém buňka toto rozhodnutí činí, byl zatím spolehlivě popsán pouze u gramnegativních bakterií. E. coli využívá například skutečnosti, že nově syntetizovaný řetězec DNA ještě nestihl být metylován na adeninu v sekvencích GATC. Proteiny podílející se na MMR umějí tuto metylaci detekovat, a odstranit tak nepatřičný nukleotid ze správného řetězce. U člověka je nově syntetizovaný řetězec rozpoznán patrně podle přítomných jednořetězcových zlomů, které v něm vznikají během replikace. Aby mohlo dojít k nalezení nejbližší sekvence GATC nebo zlomu řetězce, musí MMR odseparovat a následně odstranit ještě delší (∼ 1000 nt) úseky DNA než NER. V některých případech vedou aktivity MMR k sekundární tvorbě dvouřetězcových zlomů, takže je pak nezbytné opravu DNA dokončit pomocí homologní rekombinace. Nejen tato skutečnost poukazuje na vzájemnou kooperaci a provázanost jednotlivých reparačních drah, jež v poslední době vyplouvá stále více na povrch. BER se může například spolupodílet na opravách zkřížených vazeb DNA a oxidovaných bází a také buněčné signalizaci po poškození DNA.

3.6.2 Opravy zlomů DNA Zatímco jednořetězcové zlomy DNA dokáže buňka jednoduše a rychle spojit, dvouřetězcové zlomy představují díky současnému přerušení obou řetězců v jednom místě molekuly DNA vůbec nejhůře opravitelné léze indukované ionizujícím zářením i obecně. Existují dva základní mechanizmy reparace DSB – nehomologní spojování konců (NHEJ z anglického non-homologous end-joining) a homologní rekombinace (HR) (obr. 3.8). Liší se zejména využitím homologního templátu, tj. sesterské chromatidy, k rekonstrukci původní genetické informace. Nehomologní spojování konců prostřednictvím komplexu DNA ligázy IV spočívá v prosté ligaci volných konců DNA, v případě radiačně indukovaných DSB většinou po jejich předchozím „začištění“74. Jinými slovy, opravné kroky na rozdíl od homologické rekombinace nezávisejí na přítomnosti nepoškozené chromatidy. To s sebou přináší řadu výhod i nevýhod. NHEJ vyniká především rychlostí a probíhá ve všech fázích buněčného cyklu. Patrně proto tento způsob opravy převažuje u vyšších eukaryot, jejichž genomy často dosahují velkých rozměrů. Lze totiž předpokládat, že i v takto velkých genomech stihne tento mechanizmus eliminovat rozsáhlá poškození v natolik 73 Např. adenin (A) byl namísto cytosinu (C) vložen oproti guaninu (G). 74 Na 3'-konci řetězce DNA musí být -OH skupina a na 5'-konci fosfátový zbytek.

Ukázka elektronické knihy, UID: KOS276459

Účinky ionizujícího záření…

DSB

rese

ců kon jení ce spo z resek be 1

kce v kon olných ců

d5 1

NHEJ

repetitivní sekvence/jiné mikrohomologie

SSA/MMEJ HR

Obr. 3.8 Reparace dvouřetězcových zlomů DNA (DSB): nehomologní spojování konců, homologní rekombinace a alternativní/záložní reparační mechanizmy SSA a MMEJ (podle Kass EM, Jasin M. FEBS Letters 2010; 584: 3703–3708)

krátké době, aby se zabránilo masivní tvorbě chromozomálních aberací a smrti buňky. Nehomologní spojování konců navíc vykazuje značnou substrátovou robustnost a schopnost spojit i chemicky různě modifikované konce DNA. Za rychlost a univerzálnost však NHEJ platí výrazně nižší přesností reparace oproti HR. V případě endogenně indukovaných DSB se nejedná o příliš závažný problém, jelikož není před vlastním spojením konců vyžadováno jejich enzymatické opracování, a NHEJ tak funguje relativně spolehlivě. Ionizující záření ale indukuje strukturně problematičtější DSB, jejichž konce nejde většinou spojit bez předchozího „začištění“. Často navíc vznikají i výrazně komplexní léze75 a mnohočetné zlomy DNA, jež představují pro reparační mechanizmy opravdovou výzvu. V ozářených buňkách se proto nepřesnost NHEJ výrazně zvyšuje a v podstatě vždy dochází k drobným změnám (zejména krátkým delecím) genetického materiálu. Komplexita DSB klastrů a lokální fragmentace chromatinu roste s hodnotou LET záření. Totéž proto platí pro pravděpodobnost a rozsah permanentních poškození DNA. Naštěstí jen asi 1 % lidské jaderné DNA kóduje geny a ještě výrazně menší procento pak geny kritické z hlediska karcinogeneze. Shrneme-li všechna uvedená fakta, lze tvrdit, že NHEJ účinně chrání buňky (zejména organizmů s velkými genomy) před tvorbou chromozomálních aberací vedoucích k mitotické smrti buňky, při akceptovatelném riziku kontaminace genomu potenciálně nebezpečnými mutacemi. Principiálně odlišným procesem je homologní rekombinace, která využívá sekvence DNA nepoškozené sesterské chromatidy k přesné rekonstrukci chromatidy poškozené. Resekční enzymy nejprve z molekuly DNA odstraní dlouhý úsek 5'-řetězce v obou směrech od místa DSB. Na volných koncích DNA se tak vytvoří dlouhé jednořetězcové přesahy 3'-řetězců. Jeden z těchto přesahů se poté za pomoci příslušných 75 Komplexní léze v sobě kromě DSB spojují i další typy poškození DNA.

Ukázka elektronické knihy, UID: KOS276459

Klinická radiobiologie reparačních proteinů (zejména RAD51) vmezeří mezi DNA řetězce sesterské chromatidy, kde se na základě komplementarity bází k jednomu z nich přichytí. Tímto krokem mají polymerázy zajištěn templát pro syntézu chybějící části poškozeného řetězce a úplnou obnovu jeho původní genetické informace. Po proběhnuvší opravné syntéze se takto doplněný řetězec od sesterské chromatidy uvolní a znovu se spáruje s komplementárním úsekem původního partnerského řetězce v poškozené chromatidě. Již opravený řetězec tak nyní reprezentuje templát pro dosyntetizování chybějící části druhého (partnerského) poškozeného řetězce. Alternativně k tomuto účelu slouží i doposud nevyužitý řetězec DNA nepoškozené sesterské chromatidy. Ten byl ze své původní dvoušroubovice vytlačen prodlužujícím se prvním poškozeným řetězcem, a může se tudíž s druhým poškozeným řetězcem snadno párovat. Z uvedeného je zřejmé, že homologní rekombinace postupně konvertuje původně dvouřetězcový zlom76 na dva vzdálené izolované jednořetězcové zlomy, které již neohrožují integritu DNA a lze je snadno spojit. Homologní rekombinace probíhá mnohem složitěji a pomaleji než NHEJ, navíc vzhledem k potřebě sesterské chromatidy pouze v pozdní S a G2 fázi buněčného cyklu77. Zato se jedná, až na specifické situace, o mechanizmus neskutečně přesný. Předpokládá se, že vzhledem k těmto charakteristikám využívají HR ke své reparaci zejména aktivní geny, z nichž mnohé jsou z hlediska mutageneze a ohrožení buňky ionizujícím zářením kritickými cíli. Pro omezení HR na transkribované geny existuje ale i další důvod – neaktivní chromatin často obsahuje repetitivní sekvence, které významně snižují přesnost tohoto reparačního mechanizmu. Jak se však buňka rozhoduje pro NHEJ nebo HR v případě konkrétního dvouřetězcového zlomu zůstává jednou ze základních radiobiologických otázek. Zdá se, že vliv má patrně více faktorů než jen zmíněná fáze buněčného cyklu a genetická aktivita chromatinu. Svou roli hraje patrně i struktura chromatinu v okolí zlomu, komplexita zlomu a typ buněk. Specifický fenomén z hlediska reparace představují vysoce komplexní dvouřetězcové zlomy, respektive klastry dvouřetězcových zlomů a dalších typů lézí DNA, indukované hustě ionizujícím zářením. Nezdá se, že by pro tyto léze, i přes jejich existenciální nebezpečnost, existoval nějaký specifický reparační mechanizmus. Patrně tedy spolu kooperují všechny ostatní již popsané mechanizmy. Odpověď buňky na ozáření tak spíše než selektivní zapínání jednotlivých reparačních drah připomíná aktivaci jakési dynamické seberegulovatelné sítě provázaných reparačních mechanizmů, pružně se přizpůsobujících aktuální, velmi komplexní situaci. Ve skutečnosti totiž existují i určité hybridní (a v literatuře různě kategorizované) mechanizmy spojující různé aspekty NHEJ a HR (viz obr. 3.8), například tzv. jednořetězcová hybridizace (single strand annealing, SSA) nebo mikrohomologií zprostředkované spojování konců (microhomology-mediated end-joining, MMEJ). Tyto mechanizmy zahrnují jistou míru resekce zlomených konců DNA, podobně jako u HR, avšak probíhají i v G1 fázi buněčného cyklu a namísto skutečných homologií využívají jen krátké mikrohomologie (často poskytované například repetitivními sek76 DSB v podstatě odpovídá dvěma jednořetězcovým zlomům vyskytujícím se v komplementárních řetězcích DNA v navzájem si víceméně protilehlé poloze. 77 Nejnovější výsledky prezentované na kongresu ICRR 2019 v Manchesteru poukazují na možnost, že HR probíhá v případě transkripčně aktivních genů také v G1 fázi buněčného cyklu, kde jako templát pro opravnou syntézu DNA slouží vznikající RNA. Ty nejdůležitější části genomu by tak mohly být vždy preferenčně reparovány pomocí HR.

100

Ukázka elektronické knihy