56
Laboratorní diagnostika
avšak koncentrace ADAMTS13 antigenů jsou kolísavé − od normálních po zvýšené. Prognostický význam stanovení koncentrace ADAMTS13 antigenů spočívá ve zjištění, že nízké koncentrace v akutní fázi onemocnění jsou spojené s vyšší mortalitou, a naopak u nemocných, kteří dosáhli klinického zlepšení v této fázi, významně stoupala i koncentrace ADAMTS13 antigenů. Vedle této získané (sporadické) formy TTP je i forma vrozená, kdy dochází k heterozygotní nebo homozygotní mutaci genu ADAMTS13.
nitní hemolýzy, mechanicky a fyzikálně poškozené erytrocyty. V hypotonickém roztoku krvinky zvětší svůj objem až o 70 % a potom lyzují. Při vyšetřování osmotické odolnosti jsou vzorky erytrocytů postupně vystaveny roztoku NaCl se zvyšující se hypotonií (0,55−0,30 % NaCl) a v každé porci je zjišťováno procento hemolyzujících krvinek. Normální hodnoty jsou uvedeny v tab. 4.20., hemolýza zdravých krvinek začíná při koncentraci kolem 0,45 % (0,42 až 0,46) a k rozpadu všech krvinek dochází při koncentraci 0,3 % (0,28–0,32).
OO Testy, které se při podezření na hemolytickou
Test autohemolýzy Test autohemolýzy se používá v diagnostice dědičné sférocytózy, kdy po inkubaci po dobu 24 nebo 48 hodin při teplotě 37 °C dojde k autohemolýze u 10–50 % sférocytů (jen u 4 % zdravých erytrocytů). Po přidání glukózy do jedné ze dvou testovacích zkumavek je hemolýza s glukózou (energetický substrát pro ATP) zpomalena, vidíme patrný sediment erytrocytů na dně první zkumavky proti homogennímu červenému zbarvení úplné hemolýzy ve druhé zkumavce bez glukózy. Podstata rozdílu spočívá v energetickém zajištění Na+ pumpy ve vzorku po přidání glukózy.
anémii rutinně nevyšetřují Níže uvádíme některé z testů, jež pro diagnostiku hemolytické anémie postupně ztrácejí (ztratily) význam (osmotická rezistence, test autohemolýzy). Buď je možné je nahradit moderními diagnostickými postupy, nebo by přinesly stejnou informaci jako jiné vyšetření (haptoglobin − hemopexin), anebo jsou nahrazeny jinými metodami (erytrokinetika; nově: cirkulující transferrinové receptory − cTfR). Hemopexin Hemopexin se rutinně nevyšetřuje, má prakticky stejný význam jako haptoglobin. Je to β-globulin, jednořetězcový polypeptid o molekulové hmotnosti 70 000, syntetizovaný v játrech, s denní obměnou 50 %, stejně jako haptoglobin. Nejde o bílkovinu akutní fáze, proto má jeho koncentrace v diagnostice hemolýzy vyšší výpovědní hodnotu než koncentrace haptoglobinu. S velkou afinitou se váže na volný hem v plazmě (jakéhokoli původu) a vzniklý komplex je pak metabolizován v hepatocytu. Po dobně jako u haptoglobinu jsou jeho koncentrace v plazmě nízké u novorozenců a malých dětí, po prvním roce života dosahují normálních hodnot mezi 500–1000 μg/ml plazmy. Snížené (až nulové) koncentrace jsou zjišťovány při masivní hemolýze (thalasémie) a po kardiochirurgických operacích (při průvodní mechanické hemolýze nízké hodnoty hemopexinu inverzně korelují s vysokou hodnotou hemosiderinu v moči a vysokým počtem mechanicky poškozených erytrocytů – schistocytů − v nátěru periferní krve). Vysoké plazmatické koncentrace hemopexinu nacházíme u diabetes mellitus, karcinomů, infekcí a revmatoidní artritidy. Osmotická rezistence erytrocytů Osmotická rezistence erytrocytů se rutinně nevyšetřuje. Jde o nespecifický test vyšetření kvality erytrocytární membrány, sodíkové pumpy a schopnosti krvinky tvořit ATP. Snížení osmotické rezistence (odolnosti) provází dědičnou sférocytózu, autoimu-
Erytrokinetika – erytrocyty značené 51Cr (přežívání erytrocytů a lokalizace zániku) Izotop 51Cr označí všechny generace červených krvinek (naváže se na více než 90 % erytrocytů). Nultý vzorek periferní krve (výchozí 100% aktivita izotopu) odebíráme za 24 hodin a pak 3krát týdně po dobu čtyř týdnů. Čas, za který poklesne radioaktivita na 50 %, se označuje jako poločas přežívání erytrocytů. Normální hodnoty se pohybují mezi 23 až 32 dny. Zevním měřením nad orgány (játra, slezina, prekordium) se detekuje pokles radioaktivity. Orgán s maximální koncentrací radioaktivní látky je místem nejvyššího zániku erytrocytů. Využití je zejména u autoimunitních anémií a dědičné sférocytózy. OO Zvýšený počet erytrocytů Sekundární polycytémie vzniká následkem snížení parciálního tlaku kyslíku (pO2). Je obvykle spojena s onemocněním plic a srdce, se sníženou saturací Hb kyslíkem (pod 90 %). Koncentrace erytropoetinu bývá kompenzatorně zvýšená, nedochází ke zvyšování počtu leukocytů a trombocytů. Podobné nálezy mohou provázet i některá renální a maligní onemocnění. Primární polycytémie (polycythaemia vera, PV) je klonální onemocnění krvetvorby vznikající následkem mutace hematopoetické kmenové buňky. PV charakterizuje normální pO2, normální kyslíko-
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS233703
4. Laboratorní diagnostika v hematologii 57
vá saturace Hb, koncentrace endogenního erytropoetinu bývá snížená. Zjišťujeme kromě vysokých hodnot červeného krevního obrazu a zvýšeného indexu alkalické fosfatázy v neutrofilech (LAP) zejména absolutní zvýšení celkové erytrocytární masy (muži: > 36 ml/kg, ženy: > 32 ml/kg). Diagnózu podporuje vedle splenomegalie současná leukocytóza, trombocytémie, nález vyšší koncentrace vitaminu B12, koncentrace kyseliny močové v séru. Mezi speciální vyšetření patří proliferace erytroidních prekurzorů in vitro i v nepřítomnosti erytropoetinu v médiu. Moderní metodou je stanovení JAK-2 mutace, která je u PV až v 99 % (viz níže).
4.5.2. Bílá krevní řada Mezi buňky bílé krevní řady (viz tab. 4.2.) řadíme buňky řady myeloidní (granulocyty, monocyty) a lymfatické (lymfocyty, plazmatické buňky). Funkce neutrofilních leukocytů jako fagocytujících elementů spočívá v zajištění první obranné linie proti infekci; podobnou úlohu mají monocyty a makrofágy. K plnění fagocytárních funkcí je nutný jak dostatečný počet granulocytů, tak i jejich kvalitativní vybavení. Hraniční hodnoty absolutního počtu granulocytů k zajištění obrany jsou ještě kolem 1,0 · 109/l, při počtu pod 0,5 · 109/l je fagocytární ak tivita již významně oslabena a nemocný je ohrožen bakteriálními a mykotickými infekcemi. V souvislosti s tím je nutné zmínit pojem febrilní neutropenie, která je charakterizována počtem neutrofilních granulocytů pod 0,5 · 109/l a horečkou nad 38 °C naměřenou dvakrát v intervalu 12 hodin. Funkční zdatnost granulocytů znamená schopnost chemotaxe, degranulace azurofilních a spe cifických granul do fagosomu (vakuoly s fagocytovanou infekční partikulí) a správné enzymatické vybavení (lyzozym) těchto granul, které spolu s oxidativním mechanismem (oxidative burst – respirační výbuch) – tvorbou kyslíkových radikálů – zajišťují vlastní baktericidii. Enzymatické vybavení leukocytů se dříve hojně využívalo v diagnostice podtypů akutních leukémií. Cytochemická diagnostika (viz výše) je dnes vytlačována jinými metodami, zejména imunofenotypizací. Vzhledem k tomu, že některé laboratoře mohou cytochemická vyšetření stále provádět, uvádíme přehled nejvýznamnějších z nich (viz tab. 4.22.). Celkový počet neutrofilů podléhá fyziologickým změnám během dne, ke zvýšení dochází např. při námaze, při emočním vypětí, při změnách teploty, během trávení, v graviditě, ale také při křečích, po anestezii, po chirurgickém výkonu. Z těchto důvodů odebíráme krev na vyšetření KO vždy za standardních podmínek, tj. ráno nalačno a v klidu.
OO Leukocytóza Leukocytóza znamená zvýšení počtu (obvykle) neutrofilů (neutrofilie). Je způsobena zvýšenou produkcí neutrofilních leukocytů, urychlením jejich výstupu z kostní dřeně do periferní krve, přesunem marginálního poolu do cirkulace, sníženým odsunem leukocytů z krve do tkání či různými kombinacemi těchto mechanismů. Leukocytóza, zpravidla spojená s posunem doleva (vzestup tyčí − poměr neutrofilních tyčí k neutrofilním segmentům má být 1 : 16, vyšší počet neutrofilních tyčí značí posun doleva), je nejčastěji (ve více než dvou třetinách případů) průvodním jevem infekcí bakteriálních a fungálních. Zpočátku infekce se obvykle objeví zvýšení absolutního počtu granulocytů, bez současné celkové leukocytózy, což je dáno mobilizací marginálního poolu granulocytů jako odpověď na vyplavení mediátorů zánětu a katecholaminů. Později dochází k leukocytóze z akcelerované novotvorby granulocytů. Většina bakte riálních infekcí s krátkodobým trváním dosáhne celkových hodnot leukocytů mezi 12–15 ∙ 109/l, avšak těžší a déle trvající systémové infekce často provází leukocytóza dosahující 15−30 ∙ 109/l. Pokud se v periferním KO objevují ještě mladší formy granulo cytů (myelocyty, metamyelocyty) a celkový počet leukocytů je významně vyšší, pak může jít o leukemoidní reakci (viz níže), event. vzniká naléhavé podezření na myeloproliferativní onemocnění – neo plázii (chronická myeloidní leukémie, Ph-negativní myeloproliferativní neoplázie – viz níže). Vyplave ní nejmladších forem granulocytů (promyelocytů, myeloblastů) do periferní krve jako reakce na infekční zánětlivý proces je vzácné, není však vyloučené, častěji ale charakterizuje počínající akutní hemoblastózu, resp. akceleraci nebo blastický zvrat chronické myeloidní leukémie. Na zvýšení počtu leukocytů se dále podílejí i neinfekční zánětlivé procesy (revmatoidní artritida), různé léky (kortikosteroidy), toxiny (endotoxin). Při trvalé a dlouhodobé stimulaci bílé krvetvorby je až trojnásobně zvýšena tvorba bílých krvinek a po počátečním zmnožení mitotického poolu krvinek (promyelocyty, myelocyty) dochází vzápětí k vypla vování postmitotické frakce granulocytů. V tomto případě, kdy je počet bílých krvinek zvýšen dlou hodobě, hovoříme o chronické leukocytóze (neu trofilii). OO Leukemoidní reakce Při leukocytóze je nutné odlišit leukemoidní reakci od počínající hemoblastózy. Jde o extrémní leuko cytózu v periferní krvi, která je reaktivní. Leuke
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS233703
58
moidní reakce je podle některých zdrojů definovaná jako vzestup granulocytů na více než 50 ∙ 109/l (extrémně až 150−200 ∙ 109/l např. u diseminované tbc) bez přítomnosti, nebo s přítomností nezralých forem (myelocyty, metamyelocyty), avšak s negativními nálezy vyšetření na akutní leukémii. OO Leukopenie Leukopenie (většinou je myšlena granulocytopenie) je definovaná snížením celkového počtu leukocytů pod 1,5 ∙ 109/l. Pojem agranulocytóza se používá při poklesu granulocytů pod 0,5 ∙ 109/l. K leukopenii (neutropenii, granulocytopenii) dochází při nedostatečné produkci leukocytů v kostní dřeni z různých příčin − často při chronickém vyčerpání a při nutričním deficitu, při zvýšené utilizaci granulocytů, při odsunu granulocytů z cirkulace do marginálního poolu, při infiltraci dřeně maligními buňkami, při fibróze dřeně a po chemoterapii či radioterapii. K neutropenii dochází také při různých infekcích, a to jak bakteriálních (salmonelóza, tularémie, tuberkulóza, tyfus), tak virových (spalničky, zarděnky, varicela, chřipka, virová hepatitida, parvovirus B19, HIV) a protozoárních (malárie). Také velké množství léků může způsobit idiosynkratickou neutro penii. Při abnormalitách počtu bílých krvinek, a zejména diferenciálního rozpočtu, které nelze vysvětlit »standardními« příčinami, jako jsou infekce nebo zánět, je indikováno podrobné hematologické vyšetření, které zahrnuje odběr kostní dřeně s celou paletou speciálních vyšetření (imunofenotypizace, cytogenetika, resp. molekulární biologie atd.) k vyloučení hemoblastózy, resp. myelodysplastického syndromu. Kromě kvantitativních změn bílé krevní řady dochází i ke kvalitativním poruchám, které lze diagnostikovat převážně funkčním vyšetřením a expre sí, resp. chyběním exprese některých diferenciač ních znaků (CD). Např. porucha adheze neutrofilů je spojena se změnami exprese CD11b u stimulovaných a nestimulovaných leukocytů a poruchou dalších imunologických parametrů (fagocytóza zprostředkovaná C3bi a další) včetně disproporce mezi významnou leukocytózou (až 100 ∙ 109/l) a minimální infiltrací leukocyty v histologickém vzorku zá nětlivé nebo infikované tkáně. OO Pancytopenie Pancytopenie znamená pokles všech krevních elementů v periferní krvi pod fyziologické hodnoty.
Laboratorní diagnostika
4.6. Algoritmus vyšetření u vybraných hematologických malignit Maligní krevní onemocnění a algoritmus diagnostického postupu patří do rukou hematologa na specializovaném pracovišti již od prvního záchytu. V praxi se však významné procento hematologických malignit zachytí »v terénu«, odkud jsou pak nemocní posíláni do hematologických center. Aby nedošlo k neadekvátnímu zpoždění v diagnostickém procesu, a naopak aby nebyli do center posíláni nemocní, kterým nebylo provedeno ani screeningové vyšetření (KO, FW, rtg S + P a další) a u nichž je zhoubné krevní onemocnění jen málo pravděpodobné, uvádíme vybrané nejčastější hematologické malignity s jejich základní charakteristikou a používané diagnostické algoritmy.
4.6.1. Lymfoproliferace Vyšetření orientujeme prvotně na stanovení vlastní histologické diagnózy a dále na určení rozsahu onemocnění, tj. stanovení klinického stadia choroby. Součástí prvního vyšetření je také posouzení celkového stavu nemocného (performance status), stavu orgánů, event. výskyt komorbidit a zhodnocení prognostických ukazatelů, které jsou u většiny malignit definovány a které s ostatními výsledky nakonec ovlivní rozhodování o léčebném postupu (agresivita chemoterapie, event. transplantace kmenových buněk krvetvorby). OO Diagnostický algoritmus u maligních lymfomů Maligní lymfomy jsou maligní lymfoproliferativní onemocnění, mezi která se řadí nehodgkinské lymfomy (NHL) vycházející převážně z B- (B-NHL) a méně často z T-lymfocytů (T-NHL), a dále Hodg kinův lymfom. NHL jsou velmi heterogenní skupinou onemocnění, kterou lze zhruba rozdělit na dvě, a to na NHL s vysokým stupněm malignity (high grade), které mají dynamický klinický průběh a vyžadují agresivní terapii, a na skupinu nízce maligních (indolentních, low grade) lymfomů, které probíhají pomalu a nemocní mohou být dlouhodobě pouze sledováni bez nutnosti okamžitého terapeutického zásahu. Tab. 4.9. uvádí příklady diferenciálnědiagnostických nálezů u maligních lymfoproliferací. Mezi T-buněčné lymfoproliferace patří několik klinicky odlišných nozologických jednotek, od kožních forem po systémové, diagnostický postup je principiálně identický.
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS233703