Důkladnější normalizaci přes hodnoty ΔCt lze provést tak, že některý ze vzorků v sérii považujeme za vzorek referenční. Může jít o vzorek odebraný před nasazením léčby, vzorek z definované tkáně, pří padně o vzorek téže tkáně od zdravého jedince. V tomto případě se nejprve provede výpočet hodnot ΔCt ve všech vzorcích, a poté se vypočítá rozdíl hodnot ΔCt mezi klinickými vzorky a vzorkem referenčním (získáme hodnotu ΔΔCt). Pouhé porovnání rozdílů absolutních hodnot Ct pro vyšetřovaný gen bez po užití genu referenčního by nijak nezohlednilo ztráty RNA a ztráty, k nimž došlo při reverzní transkripci. ΔΔCt = ΔCt vyšetřovaného vzorku – ΔCt referenčního vzorku Platí, že pokud je exprese referenčního genu stálá ve všech studovaných tkáních, nejvyšší expresi má ta tkáň, kde byla zaznamenána nejvyšší záporná hodnota ΔΔCt. Je-li například v mozku (referenční tkáň) vypočítána ΔCt = 10 jako rozdíl mezi studovaným a referenčním genem, v ledvinách 7,5 a v játrech 5, vycházejí hodnoty ΔΔCt pro ledviny –2,5 a pro játra –5. V játrech je tedy vyšší exprese sledovaného genu než v ledvinách. Nakonec je třeba hodnoty ΔΔCt převést na smysluplné číselné hodnoty. K tomu se využívá norma lizovaná exprese R vztažená k referenční tkáni (v našem příkladu mozek), kdy: R = 2–ΔΔCt Pro mozek vychází Rm = 20 = 1, pro ledviny Rl = 22,5 = 5,6 a pro játra Rj = 25 = 32. Exprese v játrech je tedy 32x vyšší než v mozku a více než šestinásobná v porovnání s ledvinami. Jak již bylo zmíněno, jde o relativní kvantifikaci bez znalosti absolutní exprese v jakékoliv studované tkáni. Vztah platí za předpokladu, že účinnosti reakcí pro studovaný a referenční gen jsou podobné a hodnota ΔCt se nemění s rostoucí či klesající koncentrací templátu DNA. Tento fakt je nutné ověřit experimentálně.
13.5 COLD real-time PCR Real-time COLD-PCR je metoda, která vychází z principů amplifikace při nižší denaturační teplotě popsané v kapitole 12. I zde je používána denaturační teplota rozvolňující výhradně heteroduplexní dvouřetězce. Je-li součástí reakční směsi fluorescenční sonda, lze sledovat průběh amplifikace v reálném
100 F
0
standardní real-time PCR
0
100 F
0
10
20
30
Podíl 50% 25% minoritní alely 12%
40
real-time COLD-PCR 12% 6% 3% 0
10
20
30
40
Obr. 13.6 Porovnání amplifikačních křivek pro standardní real-time a real-time COLD-PCR. Podíl minoritní (mutované) alely je znázorněn v procentech, falešná pozitivita alely wild-type představuje přerušovaná křivka.
98 /
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS217071
čase. Preferenční amplifikace alelových variant v kombinaci s citlivostí a specifičností metody real-time PCR usnadňuje vyšetření somatických mutací u onkologických pacientů a umožňuje analýzu mutací v atypických biologických materiálech – v krevní plazmě, slinách, likvoru, apod. Na obr. 13.6 jsou znázorněny reakční křivky pro standardní real-time PCR, kde při analýze alelových variant nelze vyloučit falešnou pozitivitu wild-type alely, a specifičtější real-time analýzu provedenou v podmínkách COLD-PCR.
Doporučená literatura Li, J. L., Wang, L., Janne, P. A., Makrigiorgos, G. M.: Coamplification at Loir denaturation temperatu re-PCR increases mutation-detection selektivity of TaqMan-based real-time PCR. Clin. Chem., 55, 2009, s. 748–756. Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson, R., Gelfand, D. H.: Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5-3 exonuclease aktivity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991, s. 7276–7280. Logan, J., Edwards, K., Saunders, N.: Real-time PCR. Current technology and applications. 1. vydání. Norfolk, Caister Academic Press 2009.
99 /
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS217071
14. Digitální PCR Pravděpodobnost, že život vznikl náhodou, je srovnatelná s pravděpodobností, že dokonalý slovník je výsledkem exploze v tiskárně. Edwin Conklin Při standardní PCR i při real-time PCR dochází k tvorbě amplikonů z DNA templátu, který je v re akční směsi přítomen v množství od jednotek do statisíců molekul podle typu extraktu a podle účelu vyšetření. Typickým rysem obou zmíněných metod je, že k amplifikaci dochází v mnoha molekulách najednou. Tyto molekuly soutěží o reagencie přítomné ve směsi. Digitální PCR (dPCR) je novou amplifikační metodou, jež využívá podobné reakční principy jako real-time PCR. Probíhá však za specifických podmínek, které zaručí, že amplifikace každé molekuly DNA bude probíhat v odděleném prostoru (tzv. mikroreaktoru). Mikroreaktorem bývá jamka mikroti trační destičky, sektor kanálku (čipu) nebo kapka olejové emulze. Vzájemné oddělení molekul templátu skýtá oproti klasické PCR nebo real-time PCR několik vý hod. Jednou z nich je způsob hodnocení výsledku amplifikace, které se provádí pro každý mikroreaktor zvlášť. Počet mikroreaktorů v přístroji se liší podle typu zařízení od stovek do miliónů. Objem reakční směsi v jednom mikroreaktoru se pohybuje od několika pikolitrů do desítek nanolitrů. Při kvantitativní real-time PCR se množství templátové DNA hodnotí podle hodnoty Ct, která se pomocí kalibrační rovnice (nebo bez ní) přepočítá na počty kopií DNA v extraktu. U dPCR se hodno tí pozitivita nebo negativita výsledného signálu v konkrétním mikroreaktoru a výsledek se vyjadřuje kumulativně za všechny aktivní mikroreaktory. Konkrétně, pokud amplifikace v daném mikroreaktoru proběhla, je tento mikroreaktor v příslušném vyhodnocovacím programu označen číslicí 1. Mikroreak tory bez amplifikace (použité mikroreaktory bez templátu DNA) dávají na detektoru negativní signál, resp. signál pod nastavenou mezí detekce. Je jim přiřazena hodnota 0, viz obr. 14.1. Právě separovaný sběr dat a individuální hodnocení každého mikroreaktoru systémem „jedniček a nul“ dal této metodě název digitální PCR. Digitalizace přináší díky separaci mikroreaktorů novou filozofii hodnocení. Pozitivita je dána po čtem pozitivně zachycených fluorescenčních signálů, jež byly systémem označeny číslicí 1. Čím více templátové DNA vyšetřujeme, tím více roste počet pozitivních signálů. Jde tedy o metodu umožňující absolutní kvantifikaci bez nutnosti kalibračních křivek a určování hodnot Ct. Součet číslic 1 udává počet kopií v objemové jednotce. Na obr. 14.1 byly takto nalezeny 4 kopie templátu v objemu reakční směsi (např. 15 µl). Následně se počet kopií může snadno přepočítat na 1 µl směsi nebo extraktu. Instrumentálně lze metody dPCR dělit na standardní dPCR a real-time dPCR. Při technologii real-time dPCR se vyhodnocení provádí přímo v amplifikačních čipech pomocí speciálního hodnotícího zařízení. Celkový objem připravované PCR je zde 5–100 µl, a je tedy srovnatelný s objemy používanými u klasické PCR reakce. U droplet digital PCR probíhá příprava pro emulzní PCR v generátoru kapének. 100 /
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS217071