98
Vy etøovací metody v imunologii
chorob urèité spektrum exprimovaných genù je typické pro urèitý druh nebo stadium nádoru. Vìt ina aplikací je ve fázi vývoje, ale v brzké dobì lze oèekávat ji rutinní aplikace.
2.3.5.3 Pøístrojové vybavení a ekonomická rozvaha Nákup zaøízení na pøípravu mikroèipu a na skener pro analýzu intenzity fluorescence se nyní pohybují kolem 300 000 korun. Cena bude zøejmì dále klesat tak, jak roste konkurence mezi výrobci. Pro odbìr a pøípravu materiálu platí stejná pravidla jako pro ostatní aplikace molekulární biologie, kde je potøeba izolovat mRNA a získat kvalitní cDNA. Samotné provedení pokusu je jednoduché a rychlé. Analýzu velkého poètu èipù, z nich ka dý obsahuje pøes 10 000 genù, je mo no provést bìhem jednoho dne (obr. 16). Pøíprava mikroarray
R
Pøíprava cDNA sondy normální tkánì
nádorové tkánì
RT/PCR znaèení fluorescenèním barvivem
výøez ekvivalentní mno ství hybridizace sond na mikroarray SCAN
Obr. 16 Princip metody mikroarray
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS181515
Metody pou ívané v laboratorní diagnostice imunopatologických stavù
99
2.3.6 Proteomika R. pí ek Bìhem posledních dvou desetiletí byly vyvinuty a zdokonaleny metody, které dovolují identifikaci a studium exprese proteinù na úrovni srovnatelné s metodami genetickými. Proto zaèalo být studium proteinù tìmito postupy oznaèováno jako proteomika.
2.3.6.1 Princip Cílem proteomiky je objasnìní organizace a dynamiky metabolických, signálních a regulaèních sítí, které øídí ivot buòky. Zároveò proteomika zkoumá, jak je funkce tìchto systémù naru ena v prùbìhu choroby a jak ji lze ovlivòovat pomocí lékù nebo genových manipulací. Výzkum velkého poètu proteinù, jejich exprese se mìní v prùbìhu biologických pochodù, byl doposud mo ný pouze na úrovni mRNA. Produkty transkripce nìkterých genù ov em prochází posttranslaèními modifikacemi a vzniká tak velké mno ství bílkovinných molekul s odli nými biologickými funkcemi. Prvním krokem ke studiu bílkovinných molekul obsa ených v proteinovém extraktu je jejich separace. K tomuto úèelu se nejèastìji pou ívá dvojrozmìrná polyakrylamidová gelová elektroforéza (2D PAGE). Jednotlivé proteiny jsou nejprve rozdìleny v pH gradientu podle svého izoelektrického bodu a následnì v kolmém smìru v elektrickém poli podle molekulové hmotnosti. Jednotlivé body odpovídající proteinùm jsou po probìhlé elektroforéze oznaèeny, dnes nejèastìji fluorescenènì. Specifické skupiny proteinù mohou být na gelu také ozøejmìny stejnými znaèícími technikami jako pøi westernblotu. Gel je tedy mo no obarvit tak, aby byly ozøejmìny proteiny fosforylované, glykosylované apod. Tento postup dovoluje rozli it a 10 000 proteinù. Proteiny je pak mo né z gelu vyøíznout, purifikovat a dále charakterizovat. Zatímco techniky na separaci proteinù byly vyvinuty ji døíve, nejvýznamnìj ím technologickým posunem je mo nost identifikovat velké mno ství proteinù pomocí hmotnostní spektrometrie a uchovávání tìchto dat v databázových systémech. Identifikaci proteinù vìt inou pøedchází proteolytické natrávení nejèastìji trypsinem. Pro analýzu je nutné smìs peptidù nejprve ionizovat. Pro tento úèel existují nyní dva systémy nazývané MALDI a ESI. Ionizované molekuly jsou pak urychleny v elektrickém poli a je zaznamenána doba jejich letu k detektoru. Doba letu k detektoru je pøímo úmìrná náboji molekuly a nepøímo úmìrná její molekulární hmotnosti. Pøesná molekulární hmotnost je vypoètena pomocí doby letu molekul standardu. Smìs peptidù po proteolytickém natrávení tedy poskytne profil molekulárních hmotností charakteristický pro ka dý jednotlivý protein. Získaná data je mo no pøímo porovnávat s veøejnì pøístupnou databází. Není-li nalezen odpovídající protein, je vìt inou dal ím krokem pøi analýze neznámého proteinu èásteèná sekvenace aminokyselinové sekvence zkoumaného proteinu. Jestli e ani tento postup nevede k jeho identifikaci a jedná se tedy o dosud neznámý protein, mù e být známá sekvence pou ita k vytvoøení oligonukleotidových sond. Sondy jsou posléze pou ity k identifikaci genu kódujícího nový protein.
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS181515
100
Vy etøovací metody v imunologii
2.3.6.2 Uplatnìní Proteomické pøístupy jsou nyní vyu ívány pøedev ím pro základní výzkum. Jeho cílem je identifikace nových proteinù, výzkum jejich funkce a charakterizace signálních a regulaèních sítí. Velký potenciál má proteomika v klinickém výzkumu. Nejvìt í zájem je o studium nádorových onemocnìní. Porozumìní zmìnám exprese proteinù v prùbìhu procesu nádorové transformace buòky jistì povede k roz íøení znalostí o tomto procesu. Detailní analýza exprimovaných proteinù povede k pøesnìj ímu roztøídìní nádorových onemocnìní a proteiny exprimované rozdílnì ve zdravé a nádorové tkáni budou testovány jako potenciální cíle protinádorové terapie. S touto oblastí souvisí pou ití proteomiky na poli toxikologie a farmakologie. Zmìny v expresi proteinù po pùsobení známých i novì vyvíjených lékù pomohou identifikovat biochemické dráhy zodpovìdné za úèinek tìchto látek. Porovnáním s úèinky ji známých látek bude mo no lépe odhadovat potenciální léèebný nebo toxický úèinek. Pøi souèasném tempu rozvoje technologií dvojrozmìrné elektroforézy, hmotnostní spektrometrie a organizaci databází, které obsahují data o expresi proteinù, se proteomika brzy doèká praktických aplikací.
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS181515