6
Hemochromatóza
protože vzniká hybridní molekula, jejíž jednotlivé řetězce pocházejí z různých zdrojů. Je-li jeden řetězec (klonovaný fragment) označen, může sloužit jako tzv. sonda k vyhledávání komplementárních úseků v komplexní směsi DNA. Takovou komplexní směsí může být např. kompletní lidská genomová DNA naštěpená restrikčním enzymem a rozdělená na gelové elektroforéze (kde lze hybridizací detekovat specifický fragment) nebo knihovna lidské DNA (v níž hybridizace umožňuje nalezení klonu nesoucího sekvenci komplementární k použité sondě). Jako sonda může být po označení použit i oligonukleotid připravený uměle organickou syntézou. Hybridizace může probíhat v roztoku nebo na pevném podkladě (nejčastěji na nitrocelulózové membráně). V druhém případě je jeden řetězec (např. analyzovaná DNA) vázán na hybridizační membráně a druhý řetězec (značená sonda) se nachází v roztoku obklopujícím membránu [121, 289]. Detekce mutací pomocí reverzní hybridizace využívá vazby na základě komplementarity mezi testovaným vzorkem a sondou. Při této metodě se často používají komerční kity. Po izolaci DNA je prvním krokem PCR amplifikace úseku, který má obsahovat mutaci a v dalším kroku následuje hybridizace se sondou imobilizovanou na membráně (proto reverzní – imobilizována je sonda, nikoliv DNA). Tato membrána je přelita amplifikačním produktem a v případě komplementarity dochází k vazbě mezi vzorkem a sondou. Kity jsou často postaveny tak, že na jedné membráně je na přesně definovaných místech naneseno více sond, a tak detekujeme více mutací najednou. Na membráně jsou umístěny sondy komplementární jak k mutované, tak k nemutované sekvenci, abychom jednoznačně určili, zda jde o homozygota pro danou mutaci, heterozygota nebo jedince bez mutace (obr. 6.3 a 6.4). Detekovány mohou být i mutace ve více genech, konkrétně u hemochromatózy jsou již k dispozici kity, které detekují kromě mutací v HFE genu i vybrané mutace v genu pro transferinový receptor 2 (hemochromatóza typu 3) a feroportin (hemochromatóza typu 4 – feroportinová choroba).
Alelická diskriminace využívající 5´-nukleázovou assay Alelická diskriminace (AD) je metodou detekující varianty sekvence DNA. Při této metodě lze opět využít PCR. Metoda je postavena na systému multiplexové reakce (více než jeden pár primer/sonda na reakci) a end-point (data jsou sbírána na konci PCR). Přítomnost dvou párů primer/sonda v každé reakci umožňuje genotypizaci dvou možných variant SNP (single nucleotid polymorfism) v cílové sekvenci. U této 98
Hemochromatóza.indd 98
26.3.2010 12:29:06 Ukázka elektronické knihy, UID: KOS180797
Diagnostika genetické hemochromatózy
6
kontrola M U T A C E
W I L D T Y P E
1
mutovaná sekvence
2
mutovaná sekvence
3
mutovaná sekvence
4
mutovaná sekvence
5
mutovaná sekvence
1
normální sekvence – wild type
2
normální sekvence – wild type
3
normální sekvence – wild type
4
normální sekvence – wild type
5
normální sekvence – wild type
Obr. 6.3 Schematický obrázek stripu (membrány) se zobrazeným umístěním nanesených sond. V horní části stripu jsou naneseny jednotlivé sondy pro mutované sekvence, v dolní části stripu pro odpovídající nemutované sekvence – wild type. Každé číslo odpovídá jiné, konkrétní mutaci. Při vyhodnocování vzorku je vždy nutné sledovat přítomnost/nepřítomnost proužku jak v oblasti mutace, tak v oblasi nemutované sekvence, čímž dojde k jednoznačnému určení, zda se jedná o homozygota (proužek pouze v oblasti mutace, oblast normální sekvence je bez signálu), heterozygota (proužek jak v oblasti mutace, tak normální sekvence) nebo jedince bez mutace (proužek pouze v oblasti normální sekvence, bez signálu v místě sondy pro mutaci). metody je do reakčního mixu kromě primerů přidávána i fluorescenčně značená sonda, která je komplementární k námi detekované sekvenci. Sonda je zkonstruována tak, že na jednom konci má tzv. reporter a na druhém zhášeč (quencher). V případě intaktnosti sondy je quencher blízko reporteru, quencher zháší reporter a sonda nevydává detekovatelné záření. V průběhu PCR se sonda, stejně jako primery, váže na základě komplementarity na příslušný úsek templátu. Taq polymeráza, která při PCR zprostředkovává syntézu nového řetězce, rozštěpí díky své 5´-nukleázové aktivitě sondu navázanou na templát a reporter se tak dostane mimo vliv quencheru. Reporter tedy již není zhášen a je 99
Hemochromatóza.indd 99
26.3.2010 12:29:06 Ukázka elektronické knihy, UID: KOS180797
6
Hemochromatóza
kontrola
M U T A C E
W I L D
kontrola
1
M U T A C E
2 3 4 5
W I L D
1 2
1
M U T A C E
2 3 4 5
W I L D
1 2
T Y P E
4 5
A
1 2 3 4 5
1 2 3
3
3 T Y P E
kontrola
T Y P E
4 5
B
4 5
C
Obr. 6.4 Příklady výsledků testu: A – přítomna mutace 1, dále přítomny nemutované sekvence (wild type) 2 až 5, pacient je tedy homozygotem pro mutaci 1; B – přítomna mutace 3, dále přítomny nemutované sekvence 1 až 5, pacient je tedy heterozygotem pro mutaci 3; C – přítomna mutace 1 a 3 , dále přítomny nemutované sekvence 1 až 5, pacient je tedy složený heterozygot pro mutace 1 a 3 detekováno zvýšení fluorescence. V průběhu PCR se zvyšuje množství amplifikačního produktu a rovněž tedy i fluorescence z rozštěpené sondy (obr. 6.5) [182]. Pro každý vzorek při AD assay je použit jedinečný pár detektorů fluorescenčních barev, např. jsou použity dvě sondy, které detekují jedno SNP místo. Jedna sonda s konkrétní fluorescenční barvou, která je komplementární k wild type alele (alela 1) a druhá značená jinou fluorescenční barvou, která je komplementární k mutované sekvenci (alela 2). Pomocí alelické diskriminace je pak analyzovaný vzorek určen jako homozygot (vzorek, který má pouze alelu 1 nebo pouze alelu 2) nebo heterozygot (vzorek obsahuje jak alelu 1, tak 2 – obr. 6.6).
Metody pro detekci neznámých mutací v DNA Dosud neznámé bodové mutace mohou být identifikovány některou z řady metod, které porovnávají sekvenci studovaného vzorku se sekvencí DNA normálního kontrolního vzorku a upozorňují na možné rozdíly mezi nimi. 100
Hemochromatóza.indd 100
26.3.2010 12:29:06 Ukázka elektronické knihy, UID: KOS180797