82
VYBRANÉ METODOLOGIE PRO PŘEDKLINICKÉ VÝZKUMNÉ FÁZE
blížením cívky do blízkosti rotujícího magnetického momentu se v ní indukuje napětí, které je následně měřeno. Tato metoda je schopna detekovat zastoupení stabilních izotopů v tkáních nebo kapalných vzorcích. Velkou výhodou této metody je možnost sledovat metabolické změny neinvazivně v živé tkáni (např. mozku). Rovněž analýza tělních tekutin (krevní plazmy, moče) se provádí bez jakékoliv přípravy vzorku. Nevýhodou metody je její nízká citlivost a dlouhé časy jednotlivých analýz, což vyžaduje mimo jiné relativně vysoké dávky tracerů značených stabilními izotopy s nepříznivým dopadem na náklady experimentu. Technika infračervené spektrometrie (NDIRS – NonDispersive Izotope-selective Infrared Spectroscopy) je v oblasti analytiky stabilních izotopů využívána pouze ke stanovení poměru 13CO2 /12CO2 ve vydechovaném vzduchu. Je to způsobeno relativně nízkou senzitivitou této metody projevující se potřebou velkého množství vzorku, což je v biomedicínském výzkumu možné pouze v případě vydechovaného vzduchu. Principem metody je mírně rozdílná vlnová délka absorpčních pásů 13CO2 a 12CO2 v blízké infračervené oblasti. Přístroje využívající tento princip vyžadují až stovky mililitrů vzorku vydechovaného vzduchu. Analyzátory tohoto typu jsou však jednodušší, menší, levnější. nevyžadují speciální obsluhy a jsou řazeny mezi POCT (Point Of Care Testing) typ přístrojů mající své místo u lůžka pacienta nebo v ordinaci lékaře. Hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry – MS) patří mezi klíčové analytické techniky ve výzkumu i v oblasti rutinních analýz a využívá se ve většině oblastí přírodních věd. V medicíně se používá pro identifikaci metabolických chorob, toxikologii a pro vyhodnocení některých funkčních testů, např. v gastroenterologii. Tato velmi citlivá analytická metoda slouží k převedení analyzovaných molekul na ionty („fragmenty“) a jejich separaci podle poměru hmotnosti a náboje (m/z). Tím odliší molekuly označené „tracerovými“ izotopy, které mají rozdílnou atomovou hmotnost proti majoritnímu izotopu. Relativní intenzity jednotlivých iontů jsou zaznamenány ve výsledné hmotnostním spektru. Je to záznam iontů, vzniklých z analyzované sloučeniny, uspořádaný podle vzrůstajícího poměru m/z, vynesený proti absolutnímu či relativnímu zastoupení jednotlivých iontů v čárové (centroidové) formě (obr. 7.2.). Nejvyšší m/z má tzv. molekulární pík M – naznačuje molekulovou hmotnost analytu a k němu přiléhající izotopické píky (M+1, M+2) odrážející přirozeně se vyskytující stabilní izotopy, především 13C.
[%] 329
100 129
50
73 57
368 Si
95
O
353
458
145
0 40
70
100
130
160
190
220
250
280
310
340
370
400
430
460
m/z
Obr. 7.2. Příklad hmotnostního spektra cholesterolu – trimethylsilylethercholesterolu
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS169776
Využití izotopů biogenních prvků v metabolickém výzkumu
83
Základními kroky jsou: ionizace molekuly analytu, akcelerace iontu elektrickým polem do hmotnostního analyzátoru, separace iontu hmotnostním analyzátorem (filtrem) a detekce iontu. Hmotnostní filtry využívají různé principy a konstrukční řešení, např. kvadrupól, iontová past, magnetický sektor nebo analyzátor doby průletu (tzv. TOF, Time Of Flight). Detailním popisem principů těchto přístrojů se zabývají učebnice analytické chemie. Hmotnostní spektrometry speciálně konstruované pro detekci izotopového zastoupení prvků v analytech po jejich destrukci pyrolýzou se nazývají IR-MS (isotope ratio mass spectrometry). Spojení hmotnostního spektrometru se separačními metodami, především plynovou chromatografií, kapalinovou chromatografií nebo kapilární elektroforézou, umožňuje provádět identifikaci komponent vzorku ve složité matrici a výrazně zvyšuje selektivitu.
7.6. Bezpečnost stabilních izotopů Izotopy vodíku se liší ve svých fyzikálně chemických vlastnostech více, než je obvyklé u jiných izotopů. Příčinou je pravděpodobně vysoký relativní rozdíl atomových hmotností. Záhy po objevu deuteria bylo zjištěno, že eukaryotické buňky nejsou v prostředí, kde je protium nahrazeno deuteriem, schopny života. Letální relativní zastoupení deuteria se pohybuje v oblasti 30 až 50 %. Základním mechanismem této toxicity je změna aktivačních energií enzymových reakcí a porucha polymerace tubulů dělicího vřeténka. Práh toxicity byl v pokusech na zvířatech zjištěn okolo 10 % relativního zastoupení deuteria v organismu. Nejčasnějším vedlejším účinkem deuteriumoxidu je vertigo, které je pravděpodobně způsobeno změnami v hustotě tekutiny ve vnitřním uchu. Tento jev se objevuje u dospělých po aplikaci dávky mezi 70 až 140 g čistého deuteriumoxidu, což odpovídá obohacení 200 až 400 mg deuteria na kilogram tělesné hmotnosti. V metabolických studiích jsou proto používány dávky deuteriumoxidu, které vedou k obohacení tělesné vody deuteriem maximálně 0,3 %. Výše popsané efekty se však netýkají látek s většími molekulami (např. glukózy), kde je jeden nebo více vodíků nahrazen deuteriem. Jejich aplikace se považuje za zcela bezpečnou. Podobná situace je u stabilních izotopů uhlíku, kyslíku, dusíku a síry. Relativní rozdíl v atomových hmotnostech je malý a to vede k velmi podobným fyzikálně chemickým vlastnostem izotopů jednotlivých prvků. Vzhledem k relativně vysokému zastoupení izotopu uhlíku 13C (1,1 %) v organismu obsahuje živočišný organismus, včetně lidského, přibližně 2 g izotopu 13C na kilogram tělesné hmotnosti. V experimentech na zvířatech bylo dosaženo obohacení 60 % uhlíku 13C bez jakýchkoliv toxických nebo teratogenních jevů. Taktéž u dalších výše uvedených izotopů nebyly zjištěny žádné toxické účinky. Jejich aplikaci pacientům lze proto považovat za zcela bezpečnou.
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS169776
84
VYBRANÉ METODOLOGIE PRO PŘEDKLINICKÉ VÝZKUMNÉ FÁZE
7.7. Výpočty v tracerových studiích Výstupem analýzy vzorku obsahujícího tracer je zjednodušeně molární poměr různých atomových hmotností molekuly vybraného analytu. Je to dáno jednak přítomností přirozeně se vyskytujících minoritních stabilních izotopů, jednak přítomností traceru. Prvním krokem je tedy odečtení přirozené přítomnosti stabilních izotopů od obohacení analytu ve vzorcích s tracerem. Tento rozdíl se nazývá: Tracer/tracee ratio (TTR) = molární koncentrace traceru/molární koncentrace tracee Tento poměr se pro další kalkulace převádí na tzv. isotope excess (IE, někdy nazývaný procento obohacení APE – atom percent excess): IE = molární koncentrace traceru/molární koncentrace traceru a tracee IE = TTR/(1+TTR) IE je obvykle hodnotou, kterou laboratoř vydává po provedení analýzy jako výsledek zadavateli k další interpretaci. Při odhadu rychlosti syntézy určité látky tvořené in vivo (tzv. inkorporační experiment) je počítána tzv. frakční rychlost syntézy (FSR, fractional synthesis rate), která vyjadřuje zlomek obsahu látky v poolu, která byla za časový úsek nově nasyntetizována. Vynásobením FSR a obsahu látky v poolu (v hmotnostních nebo molárních jednotkách) dojde k získání číselné hodnoty absolutní velikosti syntézy dané látky taktéž v hmotnostních nebo molárních jednotkách (jejího přísunu do poolu cestou syntézy de novo, v odborném žargonu tzv. in-fluxu). Obdobou je frakční rychlost odbourávání makromolekuly (FBR, fractional breakdown rate) vyjadřující rychlost odsunu látky z poolu její metabolizací (hydrolýzou, hydroxylací atd.) a stejným postupem je možné tuto hodnotu převést na hmotnostní nebo molární množství látky opouštějící daný metabolický pool (tzv. out-flux).
7.8. Základní metodologické dělení tracerových studií Existuje několik základních přístupů k aplikaci tracerů v metabolickém výzkumu (obr. 7.3.): konstantní infúze – tracer je infundován dávkovačem konstantní rychlostí. Je to přístup jednoduchý, ale jeho základní nevýhodou je pomalé ustavení rovnováhy, které je nutné k provádění dalších výpočtů; „priming“ následovaný konstantní infúzí – je aplikace úvodního bolusu traceru, který zajistí co nejrychlejší obohacení daného poolu. Tato technika vyžaduje však přesnou znalost velikosti poolu a jeho chování; „flooding“ dávka – je aplikací jednoho bolusu traceru, který způsobí „zaplavení“ daného poolu. Tato technika je využívána nejčastěji při studiu rychlosti syntézy proteinů s použitím značených aminokyselin.
Ukázka elektronické knihy, UID: KOS169776