Issuu

ním fyzikálně-chemickém výzkumu, ale jsou široce využívány také pro analytické účely. Dnes nachází uplatnění ve vývoji nových čidel (senzorů) a v miniaturizované laboratorní technice pracující jak ve stacionárním, tak i průtočném režimu. Od druhé poloviny 20. století byly elektrochemické přístupy aplikovány v biochemickém a biofyzikálním výzkumu, což vedlo ke vzniku

Jan Vacek | Veronika Ostatná

Elektrochemické metody hrají významnou roli nejenom v základ-

BIOELEKTROCHEMIE

nové samostatné disciplíny bioelektrochemie. ními elektrochemickými metodami, které jsou využívány pro výzkum biologicky aktivních látek. Pozornost je věnována jak nízkomolekulárním substancím, tak i makromolekulárním systémům. Kromě výzkumu cílícího na rozbor oxidačně-redukčních přeměn, reaktivity, resp. stability biomolekul jsou zde popsány dynamické procesy spojené s intermolekulárními interakcemi, transportními jevy a interakcemi molekul s pevnými povrchy a s imobilizovanými membránami. Pozornost je věnována elektroaktivitě biopolymerů (nukleových kyselin, proteinů/peptidů a polysacharidů) a část textu je zaměřena na elektrochemii vysoce komplexních buněčných systémů. Publikace se neomezuje pouze na elektrochemii in vitro, ale zahrnuje i in vivo aplikace. Stranou nezůstá

BIOELEKTROCHEMIE

Předkládaný text si klade za cíl seznámit čtenáře se základ

vají ani nové možnosti, které přináší využití elektrochemických zobrazovacích metod a značení cílových molekul elektrochemicky aktivními značkami.

Jan Vacek | Veronika Ostatná

BIOELEKTROCHEMIE

Jan Vacek | Veronika Ostatná

Oponenti: doc. RNDr. Mgr. Miroslav Gál, Ph.D. Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská technická univerzita v Bratislave (miroslav.gal@stuba.sk)

prof. RNDr. Jan Hrbáč, Ph.D. Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita v Brně a Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci (jan.hrbac@upol.cz)

prof. Dr. Ing. Tomáš Navrátil, Ph.D. Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, Praha, a Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova, Praha (tomas.navratil@jh-inst.cas.cz)

© Jan Vacek, Veronika Ostatná, 2020 © Univerzita Palackého v Olomouci, 2020 Neoprávněné užití tohoto díla je porušením autorských práv a může zakládat občanskoprávní, správněprávní, popř. trestněprávní odpovědnost.

ISBN 978-80-244-5763-5 (tisk) ISBN 978-80-244-5764-2 (online: PDF) VUP 2020-0176 (tisk) VUP 2020-0177 (online: PDF) doi: 10.5507/lf.20.24457635

Věnováno památce profesora Emila Palečka (1930–2018)

To, co pozorujeme, není příroda sama, ale příroda vystavená našim metodám, jimiž ji posuzujeme. W. K. Heisenberg

Nikdo přesně neví, co vlastně elektrický náboj je, ví se jen, že se vyskytuje ve dvou formách: jako záporný a kladný. Obyčejná hmota, která se skládá z atomů, nemá žádný úhrnný elektrický náboj. M. Chown

Obsah Seznam zkratek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Předmluva a poděkování . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

OBECNÁ ČÁST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.3

UVEDENÍ DO PROBLEMATIKY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Ohmův zákon a základní veličiny. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Pracovní elektrody a elektrodové uspořádání. . . . . . . . . . . . . . . . 21 Elektrody využívané v bioelektrochemii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Tištěné elektrody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 Vnitřně strukturované a flexibilní elektrodové materiály. . . . . . . . . . 28 Chemie elektrodových povrchů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Elektrolyty a stabilita vzorku. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

ELEKTROCHEMICKÉ METODY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 Cyklická voltametrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 Pulzní voltametrické techniky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 Galvanostatické techniky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 Adsorpce, AC voltametrie a impedanční metody . . . . . . . . . . . . . . 41 Zpět k polarografii. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3 3.1

INTERAKCE BIOMOLEKUL S POVRCHY ELEKTROD. . . . . . . . . . . 46 Akumulační (adsorpční) metoda. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

II.

ELEKTROANALÝZA BIOMOLEKUL. . . . . . . . . . . . . 53

4 4.1

ELEKTROCHEMIE NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK A IONTŮ. . . . . . 54 Elementární a speciační analýza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

5 ELEKTROCHEMICKÁ ANALÝZA BIOPOLYMERŮ. . . . . . . . . . . . . 59 5.1 Nukleové kyseliny. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 5.1.1 Magnetoseparační techniky a imobilizace DNA. . . . . . . . . . . . . . . 63 Obsah

5.2 5.2.1 5.3 5.4

Proteiny. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 Membránové proteiny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 Peptidy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 Sacharidy a glykoproteiny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

6 6.1 6.2

SENZORY A ČIPY. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 Glukózové senzory. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76 MIPs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

MĚŘENÍ V PRŮTOKOVÝCH SYSTÉMECH. . . . . . . . . . . . . . . . . 80

NOVÁ TECHNICKÁ ŘEŠENÍ A MINIATURIZACE. . . . . . . . . . . . . . 83

III. SPECIÁLNÍ ČÁST. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 9 9.1

STRUČNĚ O SUPRAMOLEKULÁRNÍ ELEKTROCHEMII. . . . . . . . . . 88 Lipidy a samouspořádané (samoskladné) systémy. . . . . . . . . . . . . 89

TRANSPORT NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK A LIPIDOVÉ MEMBRÁNY. 94

FOTOBIOELEKTROCHEMIE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

ELEKTROCHEMILUMINISCENCE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

13 13.1

BIOELEKTROKATALÝZA A BIOPALIVOVÉ ČLÁNKY. . . . . . . . . . . 104 Hybridní biopalivové články . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

14 14.1 14.2

ELEKTROCHEMIE NA ROZHRANÍ DVOU NEMÍSITELNÝCH KAPALIN . 109 Princip měření a experimentální uspořádání. . . . . . . . . . . . . . . . 109 Využití v biochemickém výzkumu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

BIPOLÁRNÍ ELEKTRODY A JEJICH APLIKACE. . . . . . . . . . . . . . 114

IN VIVO APLIKACE A ELEKTROCHEMICKÁ MIKROSKOPIE . . . . . . .117

Souhrn a slovo závěrem. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .121 Literatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

IV.

DODATEK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

E. Paleček in memoriam. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161 Anotace. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Annotation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164

Obsah

Seznam zkratek ACV voltametrie se střídavou složkou napětí AdT technika adsorpční přenosová technika AFM mikroskopie atomárních sil ATP adenosintrifosfát BDDE borem dopovaná diamantová elektroda BDE vazebná disociační entalpie BPE bipolární elektrochemie BSA hovězí sérový albumin CPE uhlíková pastová elektroda CHER reakce katalytického vylučování vodíku CPSA chronopotenciometrická analýza konstantním proudem CV cyklická voltametrie Cys cystein DART přímá analýza v reálném čase DC stejnosměrný proud DES hluboce eutektické rozpouštědlo DET přímý přenos elektronů DFT teorie funkcionálu elektronové hustoty DMSO dimethylsulfoxid DPV diferenční pulzní voltametrie dsDNA dvouřetězcová kyselina deoxyribonukleová E potenciál, napětí EA potenciál akumulace CE kapilární elektroforéza EIS elektrochemická impedanční spektroskopie ECL elektrochemiluminiscence EPR elektronová paramagnetická rezonance ETE energie přenosu elektronů ET reakce reakce založená na přenosu elektronů

Seznam zkratek

EVLS FRET FSCV GCE GOx GST HMDE HOMO HSA I Ic If Ik IČ IT reakce ITO KABK ITIES L LC LUMO MD MS MET MIPs NADPH NK o fáze OCP PF-PEC PGE PNA PQQ PSI PSII Q QCM Rct SAM SAE SECM SEM

eliminační voltametrie s lineárním skenem Försterův rezonanční přenos energie cyklická voltametrie s vysokou rychlostí polarizace elektroda ze skelného uhlíku glukózaoxidasa glutathion-S transferasa rtuťová kapková visící elektroda nejvyšší obsazený molekulový orbital lidský sérový albumin elektrický proud kapacitní složka proudu faradaická složka proudu kinetická složka proudu infračervená spektroskopie reakce založená na přenosu iontů oxid inditý a cíničitý katalyticky aktivní biologická komponenta rozhraní mezi dvěma nemísitelnými elektrolyty ligand kapalinová chromatografie nejnižší neobsazený molekulový orbital molekulová dynamika hmotnostní spektrometrie zprostředkovaný přenos elektronů molekulově imprintované polymery nikotinamidadenindinukleotidfosfát (redukovaný) nukleová kyselina fáze tvořená organickým rozpouštědlem potenciál otevřeného elektrického obvodu proteinová filmová fotoelektrochemie pyrolytická grafitová elektroda peptidová nukleová kyselina pyrrolochinolin chinon fotosystém I fotosystém II náboj křemenné mikrováhy odpor systému vůči přenosu náboje samoskladná (samouspořádaná) vrstva pevná amalgámová elektroda skenovací elektrochemická mikroskopie skenovací elektronová mikroskopie

Seznam zkratek

SPE ssDNA SWV t TCEP Tyr Trp UV-Vis XPS w fáze

sítotisková elektroda jednořetězcová kyselina deoxyribonukleová voltametrie s vkládaným pravoúhlým napětím čas tris(2-karboxyethyl)fosfin tyrosin tryptofan spektroskopie v ultrafialové a viditelné oblasti rentgenová fotoelektronová spektroskopie vodná fáze

Seznam zkratek

Předmluva a poděkování Vážení čtenáři, ještě před samotným uvedením této knižní publikace nám autorům dovolte stručnou historickou poznámku. Ta je zároveň symbolem úcty k učitelům a mentorům, kteří nás naší odbornou činností provázeli či provázejí. Obor bioelektrochemie v českých zemích historicky navázal na velmi dobře etablované obory výzkumu organických sloučenin. Elektrochemické metody se staly integrální součástí nejenom biofyzikálního, ale také biochemického a molekulárně biologického výzkumu. Česká, resp. československá tradice vycházející ze školy laureáta Nobelovy ceny akademika J. Heyrovského byla dále rozvíjena jeho žáky, kteří mj. cílili na rozbor oxidačně-redukčních přeměn nízkomolekulárních látek s přesahem do analýzy léčiv a experimentální medicíny. Současně objevy prof. E. Palečka, jeho kolegů (zde připomínáme jméno prof. V. Vetterla) a žáků představují fundamentální základ pro elektrochemii biopolymerů, a to nejenom na tuzemském, ale taktéž na mezinárodním výzkumném poli. Uvedený přehled jmen je pouze skromným dokladem toho, že elektrochemická výzkumná práce představuje tradici, na kterou dnes navazuje celá řada českých i slovenských výzkumných skupin. V kontextu uvedeného je pro nás potěšením představit odborníkům a studentům tuto publikaci. Je vůbec jediným textem v českém jazyce posledních dekád, který shrnuje poznatky z oblasti elektrochemické analýzy biologicky aktivních sloučenin, výzkumu biopolymerů a biologicky relevantních supramolekulárních celků. Kniha navazuje na nedávno uveřejněnou práci J. Vacka a kol. (Chem. Listy 111, 430–438, 2017)1 a rozšiřuje ji. Inspirací pro sepsání této knihy byla také účast obou autorů na kongresech „XXIV. a XXV. International Symposium on 1

Kniha také částečně čerpá z již dříve uveřejněných textů a navazuje na ně: J. Vacek a kol.: Čs. Čas. Fyz. 56, 293–304 (2006), Klin. Biochem. Metab. 14, 25–30 (2006) a Chem. Listy 105, 15–26 (2011), dále J. Vacek, N. Cibiček a kol.: Principy a využití vybraných analytických metod v laboratorní medicíně. Univerzita Palackého v Olomouci (2013) a J. Vacek: Nové přístupy v elektrochemické analýze poškození, hybridizace a dalších interakcí DNA, disertační práce (2009), Masarykova univerzita v Brně. Předmluva a poděkování

Bioelectrochemistry and Bioenergetics of the Bioelectrochemical Society“, které proběhly v Lyonu (2017) a Limericku (2019). Rámcově jsou všechny oblasti zájmu diskutované na těchto kongresech zmíněny v knize, často včetně kritické diskuse nad jednotlivými tématy. Text je zpracován volně, nezávisle na jiných národních a cizojazyčných učebních textech či monografiích a je rozdělen do tří na sebe navazujících částí. Užitečnou pomůckou může být také dodatek, ve kterém čtenář může najít odkazy na další odborné zdroje, popřípadě konkrétní studijní literaturu a vybrané monografie a učebnice, které autoři považují za klíčové. Autoři doufají, že bude tento text prospěšný nejenom odborníkům, ale bude i vhodnou učební pomůckou pro pedagogy a studijním materiálem pro studenty biochemických, biofyzikálních, farmakologických a medicínských oborů. Závěrem nám dovolte poděkovat společnosti Metrohm ČR za finanční podporu, která významně napomohla vydání této knihy. V neposlední řadě patří veliký dík recenzentům knihy, kterými jsou M. Gál, J. Hrbáč a T. Navrátil. Jejich pečlivá práce bezesporu přispěla k vyšší kvalitě textu. Za asistenci s přípravou obrázkové dokumentace autoři děkují D. Novákovi (Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci). Taktéž patří dík P. Vanýskovi (Vysoké učení technické v Brně), S. Hasoňovi, M. Fojtovi a M. Trefulkovi (Biofyzikální ústav Akademie věd ČR v Brně) a J. Barkovi (Přírodovědecká fakulta Univerzity Karlovy, Praha) za kritické připomínky k vybraným kapitolám a dodatkové části publikace. V Olomouci, červen 2020 J. Vacek a V. Ostatná

Předmluva a poděkování

OBECNÁ ČÁST

1 Uvedení do problematiky

Elektrochemické metody jsou široce využívány v základním fyzikálně-chemickém výzkumu a také v analytické chemii, dnes především v podobě čidel (senzorů) a v miniaturizované laboratorní technice pracující jak ve stacionárním, tak i průtočném režimu. Metodami se měří elektrické veličiny (kap. 1.1) ve vztahu k chemickým vlastnostem analyzovaného vzorku. Na rozdíl od mnoha analytických metod zkoumajících analyt v homogenních roztocích probíhají elektrochemické procesy na (heterogenním) rozhraní elektroda|roztok. Od druhé poloviny 20. století byly elektrochemické přístupy aplikovány v plné šíři též v biochemickém a biofyzikálním výzkumu, což vedlo ke vzniku nové samostatné disciplíny „bioelektrochemie“ a v roce 1979 vyústilo v založení mezinárodní odborné společnosti „Bioelectrochemical Society“. Jejím zakladatelem byl G. Milazzo, H. Berg a další. Biologicky aktivní substance jsou v drtivé většině elektrochemicky nebo povrchově aktivní a je možné je studovat pomocí „rovnovážných“ nebo „dynamických“ elektrochemických metod. Rovnovážné metody studují látky za rovnovážných podmínek, řadíme mezi ně potenciometrické metody. Naopak pomocí dynamických metod se látky zkoumají za podmínek vzdálených od podmínek rovnováhy, a to buď při konstantním potenciálu (potenciostatické metody), nebo při konstantním proudu (galvanostatické metody). Oba typy měření vyžadují nejméně dvě elektrody a vodivý roztok (elektrolyt) obsahující zkoumanou látku, tzv. depolarizátor (analyt). Elektroda, na jejímž povrchu podléhá cílový analyt elektrochemické reakci, se nazývá pracovní (nebo také indikační) elektroda, angl. working electrode (více v kapitole 1.2). Druhá elektroda, označovaná jako referentní elektroda (angl. reference electrode), udržuje konstantní potenciál, se kterým se porovnává potenciál pracovní elektrody. U většiny experimentů se dnes používá tříelektrodový systém. Třetí elektroda, nazývaná pomocná elek troda nebo protielektroda (angl. auxiliary nebo counter electrode), je vyrobena z dobře vodivého materiálu (např. platina, grafit). Elektrický proud protéká v tříelektrodovém zapojení mezi pracovní a pomocnou elektrodou. Schéma základní tříelektrodové elektrochemické cely je ukázáno na obrázku 1. I. OBECNÁ ČÁST