Ondřej Slabý a kolektiv
Lékařská biologie
Poděkování Za konzultace a cenné rady by chtěl hlavní autor poděkovat: • doc. MUDr. Josefu Srovnalovi, Ph.D. (Ústav molekulární a translační medicíny Lékařské fakulty Univerzity Palackého Olomouc; kap. 18), • prof. RNDr. Lence Zdražilové Dubské, Ph.D. (Oddělení klinické mikrobiologie a imunologie Ústavu laboratorní medicíny Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice Brno; kap. 23), • MUDr. Michalu Eidovi (Interní hematologická a onkologická klinika Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice Brno; kap. 24), • doc. Mgr. Janu Lochmanovi, Ph.D. (Ústav biochemie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity; kap. 25), • prof. RNDr. Jiřímu Doškařovi, CSc. (Ústav experimentální biologie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity; kap. 26), • Mgr. Kateřině Cetkovské, Ph.D., Ing. Lívii Eiselleové, Ph.D., a Mgr. Kateřině Strakové, Ph.D., z Biologického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity. Knihu věnuji své ženě Katce a dětem Jakubovi, Davidovi a Veronice.
Ondřej Slabý a kolektiv
Lékařská biologie
Masarykova univerzita Grada Publishing Brno – Praha 2025
Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno. Automatizovaná analýza textů nebo dat ve smyslu čl. 4 směrnice 2019/790/EU a použití této knihy k trénování AI jsou bez souhlasu nositele práv zakázány.
prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D., a kolektiv
Lékařská biologie
Hlavní autor a vedoucí autorského kolektivu: prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. Autorský kolektiv: prof. MUDr. Iva Slaninová, Ph.D.; doc. Mgr. Jiří Šána, Ph.D.; Mgr. Kateřina Cetkovská, Ph.D.; Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc.; Ing. Lívia Eiselleová, Ph.D.; Mgr. Lenka Bešše, Ph.D.; prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D.; Mgr. Vladimír Rotrekl, Ph.D.; RNDr. Pavel Krejčí, Ph.D.; Mgr. Juraj Bosák, Ph.D.; MUDr. Kateřina Slabá, Ph.D. (Pediatrická klinika Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice Brno); doc. RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D. (Ústav patologické fyziologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity) Není-li uvedeno jinak, působí autoři na Biologickém ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity. Recenzenti: Kapitoly 1–17: prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc. (Ústav experimentální biologie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity); prof. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D. (Masarykův onkologický ústav) Kapitoly 18–30: doc. MUDr. Leoš Křen, Ph.D. (Ústav patologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity a Fakultní nemocnice Brno); doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D. (Ústav molekulární a translační medicíny Lékařské fakulty Univerzity Palackého Olomouc) Ilustrátoři: Mgr. Jana Vachová (kap. 4), Ing. Natália Vadovičová (kap. 22), doc. Mgr. Jiří Šána, Ph.D. (kap. 25), Mgr. Andrej Bešše, Ph.D. (ostatní kapitoly) Ilustrace jsou buď původní, nebo upravené podle zdrojů uvedených v použité a doporučené literatuře. Při jejich přípravě byl použit software BioRender (biorender.com). Vydání odborné knihy schválila Vědecká redakce nakladatelství Grada Publishing, a.s. Monografie vychází z dvoudílné publikace autora prof. RNDr. Ondřeje Slabého, Ph.D., a kolektivu s názvem Lékařská biologie 1, Lékařská biologie 2, vydané v letech 2022 a 2023 Masarykovou univerzitou jako zaměstnanecké dílo. © Grada Publishing, a.s., 2025 © Masarykova univerzita, 2025 Cover Photo © depositphotos.com, 2025 (redakčně upraveno) Cover Design © Grada Publishing, a.s., 2025 Vydala Grada Publishing, a.s. U Průhonu 22, Praha 7 jako svou 10349. publikaci ve spolupráci s Masarykovou univerzitou, Žerotínovo nám. 617/9, 601 77 Brno Odpovědná redaktorka Mgr. Jitka Straková Sazba a zlom Antonín Plicka Počet stran 664 1. vydání, Praha 2025 Vytiskla tiskárna PBtisk a.s., Příbram Názvy produktů, firem apod. použité v této knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno. Postupy a příklady v knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky.
ISBN 978-80-271-8357-9 (pdf) ISBN 978-80-271-5446-3 (print)
Obsah Předmluva ����������������������������������������������������������������������������������������������������������� XV 1 1.1 1.2
Definice oboru a úvod do historie (Ondřej Slabý) ������������������������������������ 1 Organizace živých soustav a definice oboru ���������������������������������������������������� 1 Úvod do historie oboru �������������������������������������������������������������������������������������� 3
2 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6
Chemická podstata života (Lívia Eiselleová, Ondřej Slabý) ����������������������� 9 Atomy, molekuly a chemické vazby ������������������������������������������������������������������ 9 Základní typy chemických vazeb v biomolekulách �������������������������������������� 11 Biogenní prvky �������������������������������������������������������������������������������������������������� 14 Voda �������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 15 Hydrofilní a hydrofobní molekuly ������������������������������������������������������������������ 16 Biopolymery ������������������������������������������������������������������������������������������������������ 17 2.6.1 Sacharidy ��������������������������������������������������������������������������������������������� 17 2.6.2 Mastné kyseliny a lipidy �������������������������������������������������������������������� 20 2.6.3 Nukleové kyseliny ������������������������������������������������������������������������������ 21 2.6.4 Proteiny ����������������������������������������������������������������������������������������������� 21
3 3.1
Proteiny a jejich funkce (Lívia Eiselleová, Ondřej Slabý) ������������������������� 23 Struktura proteinů �������������������������������������������������������������������������������������������� 23 3.1.1 Aminokyseliny ������������������������������������������������������������������������������������ 23 3.1.2 Primární struktura proteinů a peptidová vazba ����������������������������� 25 3.1.3 Sekundární struktura proteinů ��������������������������������������������������������� 26 3.1.4 Terciární struktura proteinů ������������������������������������������������������������� 27 3.1.5 Kvarterní struktura proteinů ������������������������������������������������������������ 28 Funkce proteinů ������������������������������������������������������������������������������������������������ 30 3.2.1 Proteiny jako strukturní komponenty buňky a tkání �������������������� 30 3.2.2 Proteiny jako katalyzátory chemických reakcí – enzymy ������������� 30 3.2.3 Proteiny jako informační molekuly – receptory a signální mediátory �������������������������������������������������������������������������������������������� 33 3.2.4 Proteiny a jejich význam v imunitním systému ����������������������������� 33 3.2.5 Proteiny jako infekční agens – priony ��������������������������������������������� 35
3.2
4 4.1 4.2
4.3
Funkční anatomie eukaryotické buňky (Kateřina Cetkovská) ���������������� 37 Srovnání anatomie eukaryotické a prokaryotické buňky ���������������������������� 37 Membránový systém buňky ����������������������������������������������������������������������������� 41 4.2.1 Složení a vlastnosti membrán ����������������������������������������������������������� 41 4.2.2 Membránové proteiny ����������������������������������������������������������������������� 46 4.2.3 Přenos látek přes membrány ������������������������������������������������������������� 47 Architektura a funkce membránových organel �������������������������������������������� 51 4.3.1 Jádro ����������������������������������������������������������������������������������������������������� 51 4.3.2 Vnitrobuněčné oddíly a vezikulární transport – endoplazma tické retikulum, Golgiho aparát, lyzozomy, endozomy ����������������� 52
V
4.4
4.3.3 Mitochondrie �������������������������������������������������������������������������������������� 58 4.3.4 Organelová specifika různých buněčných typů ����������������������������� 60 Cytoskeletální systém buňky ��������������������������������������������������������������������������� 61 4.4.1 Střední (intermediární) filamenta ���������������������������������������������������� 62 4.4.2 Mikrotubuly ���������������������������������������������������������������������������������������� 64 4.4.3 Aktinová filamenta – mikrofilamenta ��������������������������������������������� 68
5 Struktura deoxyribonukleové kyseliny a organizace genomu (Jiří Šána, Ondřej Slabý) ��������������������������������������������������������������������������� 73 5.1 Primární struktura nukleových kyselin ��������������������������������������������������������� 75 5.2 Sekundární struktura DNA ����������������������������������������������������������������������������� 77 5.2.1 Konformace molekuly DNA ������������������������������������������������������������� 78 5.2.2 Další nekanonické struktury molekuly DNA ��������������������������������� 79 5.3 Terciární struktura DNA ���������������������������������������������������������������������������������� 81 5.4 Organizace prokaryotického genomu ������������������������������������������������������������ 82 5.5 Organizace eukaryotického genomu �������������������������������������������������������������� 84 5.5.1 Modifikace histonů a chromatin remodelující komplexy ������������� 85 5.5.2 Chromozomální teritoria a topologicky asociované domény ������ 91 5.5.3 Struktura metafázních chromozomů a lidský karyotyp ���������������� 92 6 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6
Replikace deoxyribonukleové kyseliny (Ondřej Slabý) ��������������������������� 95 Obecné aspekty replikace DNA ���������������������������������������������������������������������� 95 Funkce DNA-polymeráz ���������������������������������������������������������������������������������� 97 Asymetrie replikační vidličky �������������������������������������������������������������������������� 99 Replikační aparát ��������������������������������������������������������������������������������������������� 100 Specifika replikačního aparátu u prokaryot ������������������������������������������������ 103 Specifika replikačního aparátu u eukaryot �������������������������������������������������� 104
7 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9
Transkripce (Ondřej Slabý) �������������������������������������������������������������������� 109 Centrální dogma molekulární biologie �������������������������������������������������������� 109 Ribonukleová kyselina a její základní typy �������������������������������������������������� 110 Obecné principy transkripce ������������������������������������������������������������������������� 111 Transkripce u prokaryot ��������������������������������������������������������������������������������� 114 Transkripce u eukaryot ���������������������������������������������������������������������������������� 116 Sestřih heterogenní jaderné RNA ����������������������������������������������������������������� 120 Post-transkripční úpravy prekurzorové rRNA a prekurzorové tRNA �������� 125 Editace RNA ���������������������������������������������������������������������������������������������������� 126 Reverzní transkripce ��������������������������������������������������������������������������������������� 127
8 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7
Translace a genetický kód (Ondřej Slabý) ��������������������������������������������� 129 Genetický kód �������������������������������������������������������������������������������������������������� 129 Transferové RNA ��������������������������������������������������������������������������������������������� 132 Ribozomy ��������������������������������������������������������������������������������������������������������� 134 Průběh translace ���������������������������������������������������������������������������������������������� 136 Degradace proteinů ���������������������������������������������������������������������������������������� 139 Skládání proteinů �������������������������������������������������������������������������������������������� 141 Post-translační modifikace proteinů ������������������������������������������������������������ 144
VI
9 9.1 9.2 9.3
Regulace genové exprese (Ondřej Slabý) ����������������������������������������������� 147 Obecné aspekty regulace genové exprese ���������������������������������������������������� 147 Regulace genové exprese u prokaryot ���������������������������������������������������������� 149 Regulace genové exprese u eukaryot ������������������������������������������������������������ 151 9.3.1 Regulace exprese na úrovni transkripce ���������������������������������������� 152 9.3.2 Regulace exprese na post-transkripční úrovni ����������������������������� 158 9.3.3 Translační a post-translační regulace genové exprese ����������������� 163
10 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7
Lidský genom (Ondřej Slabý) ���������������������������������������������������������������� 165 Projekt lidského genomu ������������������������������������������������������������������������������� 165 Informační obsah lidského genomu ������������������������������������������������������������� 168 Organizace lidského genomu ������������������������������������������������������������������������ 169 Geny a genové rodiny ������������������������������������������������������������������������������������� 170 Tandemové repetitivní sekvence ������������������������������������������������������������������� 171 Rozptýlené repetitivní sekvence – mobilní genetické elementy ��������������� 173 Mitochondriální genom člověka ������������������������������������������������������������������� 179
11 Nestabilita genomu, poškození a opravy deoxyribonukleové kyseliny (Ondřej Slabý) ������������������������������������������������������������������������������������������ 181 11.1 Biologický význam genomové nestability a základní typy mutací ����������� 181 11.2 Genové mutace ������������������������������������������������������������������������������������������������ 182 11.3 Mutace vzniklé chybami při replikaci DNA ������������������������������������������������ 184 11.4 Spontánní mutace vzniklé modifikacemi bází �������������������������������������������� 185 11.5 Indukované mutace ���������������������������������������������������������������������������������������� 187 11.5.1 Chemické mutageny ������������������������������������������������������������������������ 187 11.5.2 Fyzikální mutageny �������������������������������������������������������������������������� 189 11.5.3 Biologické mutageny ������������������������������������������������������������������������ 191 11.6 Opravné systémy DNA ����������������������������������������������������������������������������������� 191 11.6.1 Přímá oprava ������������������������������������������������������������������������������������� 192 11.6.2 Oprava chybného párování bází ����������������������������������������������������� 192 11.6.3 Bázová excizní oprava ���������������������������������������������������������������������� 194 11.6.4 Nukleotidová excizní oprava ���������������������������������������������������������� 195 11.6.5 Oprava jednořetězcových zlomů DNA ����������������������������������������� 197 11.6.6 Oprava dvouřetězcových zlomů DNA ������������������������������������������� 199 11.6.7 Toleranční opravy DNA ������������������������������������������������������������������ 203 12 12.1 12.2 12.3
Buněčná komunikace (Ondřej Slabý) ���������������������������������������������������� 205 Obecné principy buněčné signalizace ���������������������������������������������������������� 205 Intracelulární receptory ��������������������������������������������������������������������������������� 209 Membránové receptory ���������������������������������������������������������������������������������� 210 12.3.1 Receptory spojené s iontovým kanálem ���������������������������������������� 211 12.3.2 Receptory spojené s G-proteiny ����������������������������������������������������� 213 12.3.3 Receptory s enzymovou aktivitou �������������������������������������������������� 218 12.3.4 Vzájemné interakce signálních drah – cross-talk ������������������������ 222
13 13.1
Buněčný cyklus (Stjepan Uldrijan) �������������������������������������������������������� 225 Fáze buněčného cyklu ������������������������������������������������������������������������������������ 225 VII
13.2 Komplexy cyklin-cyklin dependentní kináza ��������������������������������������������� 226 13.3 Regulace hladiny cyklinů v průběhu buněčného cyklu ����������������������������� 228 13.4 Kontrolní body buněčného cyklu ����������������������������������������������������������������� 229 13.5 Inhibitory cyklin dependentní kinázy ���������������������������������������������������������� 230 13.6 Protein Rb a regulace buněčného cyklu signály z vnějšího prostředí buňky ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 232 13.7 Protein p53 a regulace buněčného cyklu po poškození DNA ������������������� 234 13.8 Narušení regulace buněčného cyklu v nádorových buňkách ������������������� 235 14 14.1
14.2
Buněčné dělení (Iva Slaninová) ������������������������������������������������������������� 237 Mitóza ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 237 14.1.1 Příprava na mitózu ��������������������������������������������������������������������������� 237 14.1.2 Hlavní molekulární mechanismy řídící fázi M buněčného cyklu ��������������������������������������������������������������������������������������������������� 238 14.1.3 Průběh mitózy ���������������������������������������������������������������������������������� 240 14.1.4 Aurora kinázy ����������������������������������������������������������������������������������� 244 14.1.5 Poruchy mitózy ��������������������������������������������������������������������������������� 245 Meióza �������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 246 14.2.1 Průběh meiózy ���������������������������������������������������������������������������������� 246 14.2.2 Gametogeneze ���������������������������������������������������������������������������������� 250 14.2.3 Význam meiózy �������������������������������������������������������������������������������� 251 14.2.4 Poruchy meiózy �������������������������������������������������������������������������������� 253
15 15.1 15.2
Buněčná smrt (Iva Slaninová) ��������������������������������������������������������������� 261 Základní typy buněčné smrti ������������������������������������������������������������������������ 262 Programovaná buněčná smrt – apoptóza ���������������������������������������������������� 264 15.2.1 Apoptóza jako fyziologický proces ������������������������������������������������ 264 15.2.2 Průběh apoptózy ������������������������������������������������������������������������������ 265 15.2.3 Charakteristické znaky apoptózy ��������������������������������������������������� 266 15.2.4 Objev apoptózy ��������������������������������������������������������������������������������� 266 15.2.5 Signální dráhy apoptózy a jejich regulace ������������������������������������� 267 15.2.6 Regulace apoptózy proteiny rodiny Bcl-2 ������������������������������������� 271 15.2.7 Kaspázy – hlavní vykonavatelé apoptózy �������������������������������������� 274 15.2.8 Protein p53 a apoptóza �������������������������������������������������������������������� 275 15.2.9 Regulace apoptózy ���������������������������������������������������������������������������� 275
16 16.1
Buňky a tkáně (Kateřina Cetkovská) ������������������������������������������������������ 277 Pojivové tkáně a extracelulární matrix ��������������������������������������������������������� 278 16.1.1 Kolageny �������������������������������������������������������������������������������������������� 279 16.1.2 Elastiny ���������������������������������������������������������������������������������������������� 281 16.1.3 Proteoglykany a glykosaminoglykany ������������������������������������������� 282 16.1.4 Adhezivní glykoproteiny ����������������������������������������������������������������� 284 16.1.5 Bazální lamina ���������������������������������������������������������������������������������� 285 16.1.6 Tvorba a degradace mezibuněčné hmoty ������������������������������������� 288 Epitely a mezibuněčné spoje �������������������������������������������������������������������������� 289 16.2.1 Polarizace epitelů ������������������������������������������������������������������������������ 289 16.2.2 Těsné spoje ���������������������������������������������������������������������������������������� 291
16.2
VIII
16.3
17 17.1 17.2
17.3
17.4 17.5
16.2.3 Adhezní spoje ����������������������������������������������������������������������������������� 293 16.2.4 Desmozomy a hemidesmozomy ���������������������������������������������������� 293 16.2.5 Mezerové spoje ��������������������������������������������������������������������������������� 296 Adhezní molekuly buněk ������������������������������������������������������������������������������� 297 16.3.1 Kadheriny a formování epitelů ������������������������������������������������������� 297 16.3.2 Integriny a ukotvení buněk k matrix ��������������������������������������������� 300 16.3.3 Selektiny a přechodné mezibuněčné interakce ���������������������������� 300 16.3.4 Proteiny z nadrodiny imunoglobulinů ������������������������������������������ 301 Biologie virů (Lenka Bešše) ������������������������������������������������������������������� 303 Klasifikace virů ������������������������������������������������������������������������������������������������ 304 Struktura virů �������������������������������������������������������������������������������������������������� 307 17.2.1 Genom virů ��������������������������������������������������������������������������������������� 307 17.2.2 Virová kapsida ���������������������������������������������������������������������������������� 310 17.2.3 Virový obal ���������������������������������������������������������������������������������������� 310 Životní cyklus viru ������������������������������������������������������������������������������������������ 311 17.3.1 Adsorpce �������������������������������������������������������������������������������������������� 312 17.3.2 Vstup do buňky �������������������������������������������������������������������������������� 313 17.3.3 Replikace genomu a exprese genů ������������������������������������������������� 316 17.3.4 Sestavování a maturace virionu ������������������������������������������������������ 319 17.3.5 Uvolnění virionu z buňky ��������������������������������������������������������������� 320 17.3.6 Lytický a lyzogenní životní cyklus u virů �������������������������������������� 321 Interakce živočišných virů s hostitelem ������������������������������������������������������� 322 Význam virů v medicíně �������������������������������������������������������������������������������� 324
18 Mendelovská dědičnost a monogenně dědičná onemocnění (Ondřej Slabý, Kateřina Slabá) ���������������������������������������������������������������� 325 18.1 Historie ������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 325 18.1.1 Mendelovy experimenty s rostlinnými hybridy ��������������������������� 326 18.1.2 Znovuobjevení Mendela, zákony dědičnosti a počátky genetiky ��������������������������������������������������������������������������������������������� 329 18.2 Základní genetická terminologie ������������������������������������������������������������������ 330 18.3 Mendelovská dědičnost ���������������������������������������������������������������������������������� 331 18.3.1 Monohybridismus, první a druhý Mendelův zákon �������������������� 331 18.3.2 Alelické interakce ����������������������������������������������������������������������������� 333 18.3.3 Dihybridismus a třetí Mendelův zákon ����������������������������������������� 334 18.4 Odchylky od Mendelových zákonů �������������������������������������������������������������� 337 18.4.1 Dědičnost vázaná na pohlaví ���������������������������������������������������������� 337 18.4.2 Genové interakce ������������������������������������������������������������������������������ 338 18.4.3 Penetrance a expresivita ������������������������������������������������������������������ 341 18.4.4 Mitochondriální dědičnost ������������������������������������������������������������� 342 18.4.5 Genokopie a fenokopie �������������������������������������������������������������������� 343 18.4.6 Další faktory �������������������������������������������������������������������������������������� 344 18.5 Monogenně dědičná onemocnění a využití Mendelových zákonů v medicíně �������������������������������������������������������������������������������������������������������� 344 18.5.1 Genealogická analýza a sestavení rodokmenu ����������������������������� 346 18.5.2 Autozomálně dominantní onemocnění ���������������������������������������� 348 IX
18.5.3 18.5.4 18.5.5 18.5.6 18.5.7
Autozomálně recesivní onemocnění ��������������������������������������������� 352 Onemocnění s X-vázanou recesivní dědičností ��������������������������� 357 Onemocnění s X-vázanou dominantní dědičností ���������������������� 359 Molekulární podstata dominance a recesivity ������������������������������ 361 Problematika vzácných onemocnění ��������������������������������������������� 363
19 Multifaktoriální dědičnost – dědičnost komplexních (kvantitativních) znaků (Iva Slaninová) ������������������������������������������������ 365 19.1 Heritabilita – dědivost ������������������������������������������������������������������������������������ 365 19.2 Dvojčecí metoda ��������������������������������������������������������������������������������������������� 368 19.3 Polygenní dědičnost s prahovým efektem ��������������������������������������������������� 368 19.4 Genomové asociační studie ��������������������������������������������������������������������������� 369 20 Genová vazba (Iva Slaninová) ���������������������������������������������������������������� 371 20.1 Vazbová skupina, fáze vazby �������������������������������������������������������������������������� 371 20.2 Chromozomová mapa ������������������������������������������������������������������������������������ 374 20.3 Tříbodový test �������������������������������������������������������������������������������������������������� 374 20.4 Studium genové vazby a sestavování chromozomových map u člověka ��� 375 20.5 Využití genové vazby v medicíně ������������������������������������������������������������������ 376 21 21.1 21.2 21.3 21.4
Genetika populací (Iva Slaninová, Sabina Ševčíková) ���������������������������� 379 Hardyho-Weinbergův zákon ������������������������������������������������������������������������� 379 Podmínky genetické rovnováhy �������������������������������������������������������������������� 381 Faktory narušující genetickou rovnováhu ��������������������������������������������������� 381 Aplikace Hardyho-Weinbergova zákona ����������������������������������������������������� 386
22 22.1
Epigenetika (Stjepan Uldrijan) �������������������������������������������������������������� 389 Epigenetická regulace genové exprese ���������������������������������������������������������� 389 22.1.1 Metylace deoxyribonukleové kyseliny ������������������������������������������� 390 22.1.2 Modifikace histonů �������������������������������������������������������������������������� 391 Genomický imprinting a onemocnění vyvolaná jeho poruchami ����������� 393 Inaktivace chromozomu X ����������������������������������������������������������������������������� 397
22.2 22.3 23 23.1
23.2
23.3
X
Imunogenetika (Ondřej Slabý) �������������������������������������������������������������� 399 Úvod do fungování imunitního systému, základní pojmy ������������������������ 399 23.1.1 Buňky imunitního systému ������������������������������������������������������������� 401 23.1.2 Molekuly imunitního systému �������������������������������������������������������� 404 23.1.3 Vrozená (nespecifická) imunita ������������������������������������������������������ 404 23.1.4 Specifická (adaptivní) imunita ������������������������������������������������������� 407 Genetika imunoglobulinů a antigenních receptorů ����������������������������������� 413 23.2.1 Imunoglobuliny �������������������������������������������������������������������������������� 413 23.2.2 Receptory B-lymfocytů �������������������������������������������������������������������� 416 23.2.3 Receptory T-lymfocytů �������������������������������������������������������������������� 419 Genetika antigenů ������������������������������������������������������������������������������������������� 420 23.3.1 Hlavní histokompatibilní komplex a prezentace peptidových fragmentů ������������������������������������������������������������������������������������������ 420
23.4 23.5
23.3.2 Genetická determinace krevních skupin systému AB0 ��������������� 423 23.3.3 Genetická determinace Rh systému ���������������������������������������������� 426 Imunologická tolerance a genetika transplantací ��������������������������������������� 427 Genetika imunopatologií ������������������������������������������������������������������������������� 430
24 24.1 24.2
Nádorová biologie (Ondřej Slabý) ��������������������������������������������������������� 433 Kancerogeneze ������������������������������������������������������������������������������������������������� 433 Geny kritické pro vývoj nádoru �������������������������������������������������������������������� 436 24.2.1 Onkogeny ������������������������������������������������������������������������������������������ 436 24.2.2 Nádorové supresory ������������������������������������������������������������������������� 439 24.3 Typy genetických a epigenetických změn v průběhu kancerogeneze ������ 441 24.4 Znaky umožňující vznik maligního nádoru ������������������������������������������������ 444 24.4.1 Genomová nestabilita a mutace ����������������������������������������������������� 445 24.4.2 Nádorový zánět ��������������������������������������������������������������������������������� 446 24.5 Získané znaky maligního nádoru ����������������������������������������������������������������� 446 24.5.1 Soběstačnost v produkci růstových signálů ���������������������������������� 448 24.5.2 Poškozená regulace buněčného cyklu ������������������������������������������� 450 24.5.3 Neomezený replikační potenciál ���������������������������������������������������� 452 24.5.4 Poškozené mechanismy apoptózy �������������������������������������������������� 453 24.5.5 Posílení angiogeneze ������������������������������������������������������������������������ 454 24.5.6 Invazivita a metastazování �������������������������������������������������������������� 457 24.5.7 Deregulace buněčné energetiky ����������������������������������������������������� 460 24.5.8 Únik před imunitním systémem ���������������������������������������������������� 461 24.6 Nádorová tkáň a nádorové mikroprostředí ������������������������������������������������� 462 24.7 Personalizovaná léčba a koncept precizní onkologie ��������������������������������� 464 25 Základní techniky buněčné a molekulární biologie (Jiří Šána, Ondřej Slabý) ������������������������������������������������������������������������������������������ 473 25.1 Restrikční endonukleázy a gelová elektroforéza ����������������������������������������� 474 25.1.1 Restrikční endonukleázy ����������������������������������������������������������������� 474 25.1.2 Gelová elektroforéza nukleových kyselin �������������������������������������� 475 25.1.3 Restrikční mapy �������������������������������������������������������������������������������� 476 25.1.4 Polymorfismus délky restrikčních fragmentů ������������������������������ 477 25.2 Hybridizační metody studia nukleových kyselin ���������������������������������������� 479 25.2.1 Southernův přenos ��������������������������������������������������������������������������� 480 25.2.2 Fluorescenční in situ hybridizace ��������������������������������������������������� 480 25.2.3 Komparativní genomová hybridizace a array-CGH �������������������� 482 25.3 Polymerázová řetězová reakce ����������������������������������������������������������������������� 483 25.3.1 Polymerázová řetězová reakce v reálném čase ����������������������������� 485 25.3.2 Reverzní transkripce a studium genové exprese �������������������������� 489 25.4 Stanovení sekvence DNA ������������������������������������������������������������������������������� 490 25.4.1 Sangerovo sekvenování �������������������������������������������������������������������� 490 25.4.2 Sekvenování nové generace ������������������������������������������������������������ 491 25.4.3 Základní aplikace sekvenování nové generace ����������������������������� 493 25.5 Genetické inženýrství ������������������������������������������������������������������������������������� 494 25.5.1 Klonování DNA �������������������������������������������������������������������������������� 494 XI
25.5.2 Editace genomu – CRISPR/Cas9 ��������������������������������������������������� 497 25.5.3 Transgenní zvířata ���������������������������������������������������������������������������� 501 26 26.1 26.2 26.3
26.4 26.5 26.6
Genová terapie (Ondřej Slabý) ��������������������������������������������������������������� 505 Obecné principy genové terapie �������������������������������������������������������������������� 506 Nevirová genová terapie ��������������������������������������������������������������������������������� 508 Genová terapie s použitím virových vektorů ���������������������������������������������� 510 26.3.1 Retroviry �������������������������������������������������������������������������������������������� 511 26.3.2 Lentiviry �������������������������������������������������������������������������������������������� 514 26.3.3 Adeno-asociované viry �������������������������������������������������������������������� 516 26.3.4 Adenoviry ������������������������������������������������������������������������������������������ 517 26.3.5 Bezpečnost virové genové terapie �������������������������������������������������� 518 Utlumení genů pomocí oligonukleotidové terapie ������������������������������������� 519 Genová editace ������������������������������������������������������������������������������������������������ 520 Klinické testování přípravků genové terapie ����������������������������������������������� 522
27 27.1 27.2 27.3 27.4 27.5
Lidský mikrobiom (David Šmajs, Juraj Bosák) �������������������������������������� 523 Obecné funkce lidského mikrobiomu ���������������������������������������������������������� 523 Kožní mikrobiom �������������������������������������������������������������������������������������������� 524 Mikrobiom ústní dutiny ��������������������������������������������������������������������������������� 525 Gastrointestinální mikrobiom ����������������������������������������������������������������������� 527 Základní metody studia mikrobiomu ���������������������������������������������������������� 530
28 28.1
Kmenové buňky a tkáňové inženýrství (Vladimír Rotrekl) ������������������� 531 Kmenové buňky ���������������������������������������������������������������������������������������������� 531 28.1.1 Počátky poznání kmenových buněk ���������������������������������������������� 532 28.1.2 Definice a základní vlastnosti kmenových buněk ������������������������ 533 28.1.3 Schopnost proliferace ���������������������������������������������������������������������� 533 28.1.4 Schopnost diferenciace �������������������������������������������������������������������� 535 28.1.5 Progenitory a prekurzory ���������������������������������������������������������������� 536 28.2 Výskyt kmenových buněk a jejich diferenciace v průběhu ontogeneze ������������������������������������������������������������������������������������������������������� 536 28.2.1 Determinanty osudu kmenových buněk ��������������������������������������� 537 28.2.2 Morfogeny v řízení osudu kmenových buněk ������������������������������ 540 28.2.3 Syntetické matrice a umělé mikroprostředí ���������������������������������� 540 28.2.4 Mezibuněčné interakce v řízení osudu kmenových buněk �������� 542 28.3 Kmenové buňky v medicíně �������������������������������������������������������������������������� 542 28.3.1 Mezenchymální kmenové buňky v medicíně ������������������������������� 542 28.3.2 Pluripotentní kmenové buňky v medicíně ����������������������������������� 545 28.4 Organoidy �������������������������������������������������������������������������������������������������������� 550 28.5 Od buněk a organoidů k orgánům aneb cesta od 2D ke 3D tkáňovým kulturám ���������������������������������������������������������������������������������������� 551 28.6 Výroba orgánů v chimérních zvířatech �������������������������������������������������������� 552 29 29.1 29.2
XII
Úvod do ontogeneze člověka (Pavel Krejčí, Vladimír Rotrekl) ��������������� 555 Úvod do vývojové biologie ���������������������������������������������������������������������������� 555 Polarizace embrya ������������������������������������������������������������������������������������������� 557
29.3 29.4
30 30.1 30.2 30.3 30.4 30.5 30.6 30.7 30.8 30.9
29.2.1 Ustavení os embrya �������������������������������������������������������������������������� 558 29.2.2 Plasticita embrya ������������������������������������������������������������������������������ 560 Epigenetické mechanismy v časném vývoji ������������������������������������������������� 562 29.3.1 Aktivace embryonálního genomu �������������������������������������������������� 562 29.3.2 Inaktivace chromozomu X �������������������������������������������������������������� 563 Morfogeneze ���������������������������������������������������������������������������������������������������� 564 29.4.1 Buněčné mechanismy morfogeneze ���������������������������������������������� 565 29.4.2 Hlavní morfogenetické procesy ������������������������������������������������������ 568 29.4.3 Gastrulace ������������������������������������������������������������������������������������������ 569 29.4.4 Prvotní zvíře �������������������������������������������������������������������������������������� 571 29.4.5 Molekulární mechanismy morfogeneze ���������������������������������������� 571 29.4.6 Morfogeneze končetiny ������������������������������������������������������������������� 576 Evoluční biologie (Iva Slaninová) ���������������������������������������������������������� 581 Evoluční teorie ������������������������������������������������������������������������������������������������� 581 Vznik života na Zemi ������������������������������������������������������������������������������������� 582 Charles Darwin – darwinismus �������������������������������������������������������������������� 584 Význam fosilií �������������������������������������������������������������������������������������������������� 586 Evoluční mechanismy ������������������������������������������������������������������������������������� 587 Molekulární evoluce ��������������������������������������������������������������������������������������� 587 Vývoj člověka ��������������������������������������������������������������������������������������������������� 591 Evoluce primátů ���������������������������������������������������������������������������������������������� 592 Evoluce moderního člověka Homo sapiens ������������������������������������������������� 594
Použitá a doporučená literatura ������������������������������������������������������������������������ 597 Přehled použitých zkratek ���������������������������������������������������������������������������������� 603 Rejstřík ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 623 Souhrn ���������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 643 Summary ������������������������������������������������������������������������������������������������������������� 645
XIII
Za podporu vydání knihy děkujeme společnostem 3GENES distribution a.s. a GeneTiCA s.r.o. Vznik kapitol 23, 24 a 26 byl podpořen projektem Národního ústavu pro výzkum rakoviny (Program EXCELES, ID: LX22NPO5102) – Financováno Evropskou unií – Next Generation EU.
Předmluva Biologie, tedy věda o životě, zkoumá živé soustavy ve všech jejich podobách – od mole kulární úrovně až po složité ekosystémy. V rámci vzdělávání na lékařských fakultách však biologii vnímáme především jako základní teoretický obor, který umožňuje pochopení struktur a procesů na buněčné a molekulární úrovni, jež jsou klíčové pro porozumění lidskému zdraví i nemocem. Výuka biologie si zde historicky prošla významnou proměnou – od původního zaměření na botaniku a zoologii se postupně přesunula k buněčné a molekulární biologii a genetice. Tento vývoj odráží i proměnu samotné medicíny, která dnes stojí na principech molekulárního porozumění chorobám. V českém kontextu sehráli klíčovou roli při formování výuky biologie na lékařských fakultách profesoři Edward Babák a František K. Studnička, kteří v roce 1919 založili Biologický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity. Na jejich práci navázali další významné osobnosti tohoto ústavu, zejména profesor Jan Bělehrádek a později profesor Oldřich Nečas, jejichž učebnice Obecná biologie se dočkala řady vydání a sehrála významnou roli v didaktice tohoto oboru v naší zemi. Lékařská biologie dnes představuje široký obor integrující buněčnou a molekulární biologii, genetiku, epigenetiku, imunogenetiku, nádorovou biologii, biologii kmenových buněk i aplikace v oblasti genové terapie a tkáňového inženýrství. Klíčovými tématy jsou chemická podstata života, stavba a funkce buněk, replikace a opravy DNA, genová exprese a její regulace, buněčná signalizace, diferenciace, buněčné dělení a buněčná smrt, vývojová biologie i základy evoluční biologie. Bez znalosti těchto principů není možné porozumět patofyziologii chorob, mechanismům účinku léčiv ani moderním diagnostickým a terapeutickým přístupům. Proto je dnes lékařská biologie jedním ze základních stavebních kamenů teoretického vzdělávání na lékařských fakultách. Je zároveň vstupní branou k pochopení klinických disciplín, které dnes z poznatků molekulární biologie a genetiky významně čerpají – a zdaleka se již neomezují pouze na lékařskou genetiku, onkologii či medicínu vzácných onemocnění. Učebnice, kterou právě držíte v rukou, reflektuje současnou podobu lékařské biologie a její přesahy do jiných oblastí lékařských věd. Navazuje na historické tradice oboru a současně zdůrazňuje jeho moderní směřování. Obsahuje klinické poznámky, případové studie a schémata, které pomáhají propojit teoretické poznatky s reálnou medicínskou praxí. Věříme, že tato učebnice poskytne studentům pevný základ pro další studium i pro jejich budoucí klinickou činnost. Za autorský kolektiv prof. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D. v Brně dne 13. dubna 2025
XV
1
1
Definice oboru a úvod do historie Ondřej Slabý
1.1
Organizace živých soustav a definice oboru
Každé dítě dokáže vnímat, že pes a kočka jsou živé a kámen neživý, ovšem univerzální definice života, ať už ve vztahu k jednobuněčnému, či mnohobuněčnému organismu, není jednoduchá. Nicméně existují vlastnosti, které jsou pro stav, který označujeme jako být živý, typické. Patří mezi ně: ■ uspořádanost, ■ vnitřní metabolismus, přeměna látek a energie a schopnost výměny látek a energie s vnějším prostředím, ■ schopnost rozmnožovat se, růst a vyvíjet se, ■ homeostáza – schopnost udržovat stálost vnitřního prostředí, ■ schopnost reagovat na vnější stimuly, ■ schopnost evoluční adaptace. Výše zmíněná uspořádanost je typickým znakem živé hmoty a má hierarchický charakter. Nejnižší úroveň představují atomy, které jsou složeny do složitějších molekul a dále komplexních biopolymerů, jako jsou nukleové kyseliny, proteiny nebo polysacharidy. Biopolymery tvoří buněčné organely, organely tvoří jednotlivé buňky, buňka nebo buňky tvoří živé soustavy. Živé soustavy (organismy) lze dělit na nebuněčné a buněčné. Nebuněčné živé soustavy jsou schopny realizovat svůj „životní“ cyklus pouze v závislosti na hostitelské buňce, na které parazitují. Jsou to například viry, které nejsou schopny bez translačního aparátu hostitelské buňky produkovat proteiny kódované vlastním genomem, a nejsou tak samostatně schopny reprodukce. Kromě virů se k nim řadí také například priony a viroidy. Nebuněčné živé soustavy nejsou schopny samostatné reprodukce a metabolismu, a je proto otázkou, zda je z definičního hlediska vůbec považovat za „živé“. Buněčné živé soustavy mohou být jednobuněčné a mnoho buněčné a vyznačují se výše uvedenými vlastnostmi života. Mezi jednobuněčné organismy patří všechny prokaryotické organismy (např. bakterie, aktinomycety, sinice), z eukaryotických organismů potom někteří prvoci, řasy a houby. Nejjednodušší buňky jsou buňky mykoplazmat. Pro mnohobuněčné organismy (především rostliny a živočichy) je charakteristické, že mezi buňkami dochází k jejich funkční specializaci a tím i k jejich rozrůznění do funkčních celků různě diferencovaných buněk. Mnohobuněčné organismy se pak vyznačují dalším hierarchickým systémem organizace. Stejně specializované buňky tvoří tkáně, různé tkáně tvoří orgány, orgány jsou seskupeny do orgánových systémů, ze kterých je tvořen organismus. Například lidské tělo je tvořeno přibližně 50 až 75 biliony (1012) buněk, které jsou diferencované do více než 200 různých buněčných typů. Biologie (z řeckého bios jako život a logos jako věda – tedy životověda – věda zkoumající život) je v nejširším slova smyslu vědní obor zabývající se živými soustavami a vším, co s nimi souvisí – od chemických dějů v organismech probíhajících na úrovni atomů a molekul až po celé ekosystémy, přičemž ekosystém je funkční soustava živých 1
1
Lékařská biologie a neživých složek životního prostředí, jež jsou navzájem spojeny výměnou látek, tokem energie a předáváním informací a vzájemně se ovlivňují a vyvíjejí v určitém prostoru a čase. Biologii lze dělit na řadu různých podoborů. Kromě tradičních oborů biologie, jako je botanika, zoologie, vývojová biologie, ekologie apod., nabývá stále většího významu buněčná biologie, molekulární biologie a genetika. Ukazuje se, že z hlediska lékařských věd jsou tyto obory zcela zásadní. Pro koncept teoretických základů medicíny mají tyto obory klíčový význam. Z tohoto důvodu se historicky výuka biologie na lékařských fakultách postupně transformovala z botaniky, zoologie apod. právě na výuku buněčné a molekulární biologie a genetiky. Vzhledem k tomu, že tyto aspekty biologie jsou aplikovatelné na všechny živé soustavy, se pro tento koncept někdy užívalo také označení obecná biologie. V České republice stojí za touto novou koncepcí výuky biologie na lékařských fakultách především profesoři Edward Babák a František K. Studnička, kteří v roce 1919 společně založili Biologický ústav Lékařské fakulty Masarykovy univerzity. Na jejich dílo navázal profesor Jan Bělehrádek, který v době svého působení na Lékařské fakultě Masarykovy univerzity (1927–1935) vytvořil první učebnici Obecné biologie pro lékařské fakulty. Na jeho didaktické dílo navázal především jeden z dalších přednostů, významná osobnost české biologie, profesor Oldřich Nečas, jehož učebnice Obecné biologie pro lékařské fakulty byla velice populární a dočkala se řady reedicí. Lékařská biologie je teoretický obor, který vychází z obecné biologie a jehož obsahem je buněčná a molekulární biologie a genetika se speciálním zaměřením na aspekty, které mají význam v humánní medicíně. Náplň tohoto oboru je velice široká a zahrnuje témata, jako jsou chemická podstata života, funkční anatomie prokaryotické a eukaryotické buňky, biologie virů nebo základní buněčné děje na molekulární úrovni. Sem patří biologické procesy a témata, jako jsou replikace deoxyribonukleové kyseliny (deoxyribonucleic acid – DNA), poškození DNA a mechanismy oprav, exprese genů a regulace genové exprese, mezibuněčná komunikace, diferenciace buněk, buněčné dělení, buněčná smrt, princip tkáňového uspořádání buněk, základy genetiky, podstata genetických onemocnění, epigenetika, imunogenetika, biologie kmenových buněk, ontogeneze a nádorová biologie, ale i vybrané aplikace biologických principů do medicíny – genová terapie nebo tkáňové inženýrství. Tento přehled samozřejmě není vyčerpávající a může zahrnovat řadu dalších oblastí. V porozumění lidskému zdraví i nemocím jsme se v moderní medicíně dostali z úrovně orgánové, tkáňové a mikroskopické na úroveň buněčnou a molekulární. Také mechanismus účinku léčiv není založen na interakci léčiva s tkání či orgánem, ale na interakci s molekulární cílovou strukturou. Bez znalosti lékařské biologie proto není možné pochopit ani patofyziologii chorob, ani principy jejich léčby. V rámci studia všeobecného lékařství je potom znalost lékařské biologie základním kamenem nezbytným pro pochopení navazujících předmětů, jako jsou biochemie, fyziologie, patofyziologie, patologie a farmakologie, které tvoří společně s lékařskou biologií, anatomií a histologií teoretické základy medicíny. Lékařská biologie navíc představuje teoretickou znalostní bázi umožňující aplikaci poznatků a metod molekulární biologie a genetiky do klinické medicíny. Jen stěží dnes nalezneme oblast medicíny, která by nevyužívala poznatků nebo metod lékařské biologie. Počínaje lékařskou genetikou, zasahující do všech medicínských oborů, přes reprodukční medicínu, mikrobiologii, imunologii, onkologii, 2
Definice oboru a úvod do historie
1
medicínu vzácných onemocnění nebo léčivé přípravky moderních terapií, až po soudní lékařství. Obor zaměřený na aplikaci poznatků a metod lékařské biologie do klinické medicíny označujeme jako molekulární medicína.
1.2
Úvod do historie oboru
Znalost historie jakéhokoliv vědního oboru je základním předpokladem pro jeho porozumění, pro pochopení jeho současné podoby a měla by patřit k teoretické výbavě každého odborníka. Lékařská biologie, jak už vyplývá z její samotné definice, historicky kopírovala především pokroky na poli buněčné biologie, molekulární biologie a genetiky, a to jak na úrovni teoretické, tak technologické. V tomto učebním textu bohužel není možné poskytnout vyčerpávající popis všech klíčových historických momentů tohoto oboru. Pokud bychom chtěli definovat pět historických milníků lékařské biologie a možná biologie obecně, těch, které měly zásadní význam pro současnou podobu tohoto oboru, pak mezi ně patří: buněčná teorie, teorie o vzniku druhů přírodním výběrem, Mendelovy zákony dědičnosti, dvoušroubovicová struktura DNA a sekvence lid ského genomu. Na těchto pěti základních kamenech je vystavěn celý obor lékařské biologie, přičemž celá tato stavba netrvala ani 200 let, od roku 1839 do roku 2001. Díky obrovskému množství dalších objevů, pomyslných kamenů v této stavbě, se kontinuál ně zdokonalovalo také naše porozumění buněčné a molekulární biologii a též naše schopnost využívat tyto znalosti pro pochopení patogeneze lidských onemocnění, nové metody diagnostiky a léčebných postupů. Když v roce 1953 James Watson a Francis Crick publikovali dvoušroubovicovou strukturu DNA ve svém dvoustránkovém článku v časopise Nature (obr. 1.1), nikdo si nedokázal představit, jaký enormní dopad bude mít tento objev na biologii, medicínu a pro společnost. Za necelých 70 let od tohoto objevu známe více než 6000 geneticky podmíněných chorob a kauzální mutace DNA, které je způsobují. Pro některé z těchto chorob již máme schváleny první léčivé přípravky typu genové terapie, umožňující jejich léčbu. V tabulce 1.1 jsou jednotlivé objevy a pokroky zmíněny pouze heslovitě. Z kapacitních důvodů není věnován prostor popisu brilantních experimentů, pomocí kterých bylo klíčových poznatků dosaženo. Některé z nich jsou ovšem blíže popsány v následujících kapitolách, jiné lze snadno dohledat v doporučené literatuře.
3
1
Lékařská biologie
Obr. 1.1 Publikace Jamese Watsona a Francise Cricka popisující dvoušroubovicovou strukturu deoxyribonukleové kyseliny (časopis Nature, 1953) 4
Definice oboru a úvod do historie
1
Tab. 1.1 Časový přehled vývoje buněčné biologie, molekulární biologie a genetiky se zaměřením na události významné pro oblast lékařské biologie (události a experimenty označené hvězdičkou jsou detailněji popsány v uvedených kapitolách) Období objevu
Osobnost(i)/ organizace
Objev/událost
1839–1855
Jan E. Purkyně, Matthias Schleiden, Theodor Schwann, Rudolf Virchov
Buněčná teorie – Nejdříve v roce 1838 botanik Schleiden a následně v roce 1839 fyziolog Schwann publikovali své poznatky a prvně formulovali buněčnou teorii ve smyslu, že veškeré živé organismy jsou tvořeny z jedné nebo více buněk, a že buňka je základní stavební jednotkou všech organismů. Vycházeli přitom i z dřívější práce českého fyziologa Jana E. Purkyně. V roce 1855 doplnil německý patolog Rudolf Virchow tuto teorii o třetí princip – omnis cellula e cellula (buňky vznikají jen z buněk).
1859
Charles Darwin
Publikoval svoje zásadní dílo O vzniku druhů přírodním výběrem, čímž vytvořil základ moderní teorie evoluce. „Jedinci málo přizpůsobení životnímu prostředí nemají šanci na přežití a rozmnožování; jedinci více přizpůsobení životnímu prostředí mají větší šanci na přežití, rozmnožování a předání dědičných rysů budoucím generacím, které vytváří proces přirozeného výběru.“
1866
Johan Gregor Mendel
Publikoval Pokusy s rostlinnými hybridy (Versuche über Pflanzen-Hybriden), ve kterých popsal zákonitosti dědičnosti (Mendelovy pokusy, Mendelovy zákony dědičnosti). Mendel byl mnichem a později opatem augustiniánského kláštera v Brně.
1883
Francis Galton
Poprvé použil termín eugenika jako název pro vědu o tom, jak pomocí genetiky zlepšit kvalitu rasy.
1900
Hugo de Vries, Carl Correns, Erich von Tschermak
Znovuobjevení Mendelova díla.
1902
William Bateson
Zavedl termíny genetika, homozygot, heterozygot, epistáze, F1, F2 a alelomorfa (později zkráceno na alelu).
1908
Archibald Garrod
Vyslovil domněnku, že některé lidské choroby jsou způso beny „vrozenými chybami metabolismu“ jako výsledek ztráty určitého enzymu.
1908
Godfrey H. Hardy, Wilhelm Weinberg
Nezávisle na sobě zformulovali základní zákony populační genetiky (Hardyho-Weinbergova rovnováha).
1909
Thomas Hunt Morgan
Popsal lineární uspořádání genů na chromozomech a geno vou vazbu u drozofily – Morganovy zákony (1933 Nobelova cena).
*1928 (kap. 5)
Frederick Griffith
Popsal fenomén transformace u bakterií Streptococcus pneumoniae. Tento transformační experiment se stal základem pro následující experimenty, které vedly k objevu DNA jako nositelky genetické informace (viz Avery, MacLeod, McCary).
1933
V Německu byly ustanoveny nacistické eugenické zákony. Zákon o prevenci hereditárních defektů uzákonil povinnou sterilizaci v případě mentálních defektů, schizofrenie, manicko-depresivní psychózy, hereditární epilepsie a těžkého alkoholismu. Celkově bylo provedeno asi 350 000–400 000 sterilizací.
1938
Warren Weaver
Poprvé užil termín molekulární biologie.
5
1
Lékařská biologie Období objevu
Osobnost(i)/ organizace
Objev/událost
1937–1945
George W. Beadle, Edward L. Tatum
Popsali schopnosti genů regulovat určité chemické reakce regulací enzymové aktivity – 1 gen = 1 enzym (1958 Nobe lova cena).
*1944 (kap. 5)
Osvald Avery, Colin MacLeod, Maclyn McCarty
Svým výzkumem potvrdili, že genetická informace je uložena v DNA.
1948
Trofim D. Lysenko
Ve svém referátu O stavu současné biologie odmítl Mendelovy zákony dědičnosti, preferoval dědičnost získaných znaků a určující vliv zevního prostředí, popřel geny i chromozo my („chromozom je artefakt buržoazních pavědců“) apod. Lysenkisti používali vůči svým odpůrcům prostředky totalitní komunistické moci, někteří světově proslulí genetici pro své odlišné vědecké názory dokonce zahynuli ve Stalinových gu lazích (prof. Vavilov). Vliv lysenkismu významně poznamenal také vývoj genetiky v bývalém Československu. Tento směr otevřeně kritizoval především prof. Bohumil Sekla.
1949
Linus Pauling
Ve své zásadní práci v časopise Science popsal srpkovitou anemii jako molekulární onemocnění („molecular disease“) – počátek molekulární medicíny.
1940–1950
Barbara McClintock
Vytvořila genetickou mapu kukuřice, popsala úlohu centromer a telomer a následně popsala genetickou transpozici a mobilní sekvence DNA – transpozony (1983 Nobelova cena).
1950
Erwin Chargaff
Prokázal, že u všech molekul DNA je stejné množství molekul adeninu a tyminu a stejné množství guaninu a cytozinu – Chargaffova pravidla.
*1953 (kap. 5)
James D. Watson, Francis H. C. Crick
V časopise Nature publikovali strukturu DNA jako dvojité šroubovice s antiparalelní orientací obou řetězců – model sestavili na základě difraktogramů DNA z rentgenové struk turní analýzy poskytnuté Mauricem Wilkinsem a Rosalindou Franklinovou (1962 Nobelova cena).
1957
Arthur Kornberg
Při studiu bakterie Escherichia coli objevil DNA-polymerázu. Severo Ochoa a Arthur Kornberg obdrželi za objev mecha nismu biosyntézy RNA a DNA v roce 1959 Nobelovu cenu.
1957
Francis Crick, George Gamow
Definovali centrální dogma molekulární biologie – tok informace v biologických systémech – DNA-RNA-protein.
*1958 (kap. 6)
Matthew Meselson, Franklin Stahl
Provedli důkaz semikonzervativní replikace DNA – Mesel sonův-Stahlův experiment.
1958
Tsuneko Okazaki, Reiji Okazaki
Popsali syntézu opožďujícího se řetězce při procesu repli kace, Okazakiho fragmenty DNA.
*1959 (kap. 9)
François Jacob, Jacques Monod
Zveřejnili teorii vysvětlující mechanismus, jakým bakterie mění spektrum syntetizovaných enzymů v závislosti na dru hu živných látek, které má k dispozici – operonový model regulace bakteriálních genů (1968 Nobelova cena).
1959
Jérôme J. L. Marie Lejeune
Prokázali chromozomální podstatu Downova syndromu – trizomie chromozomu 21 – Downův syndrom.
1960
Byla identifikována trizomie chromozomů 13 a 18 (Patau et al. a Edwards et al.). Byla objevena funkce mediátorové RNA. Poprvé byla popsána cytogenetická abnormalita u nádorového onemocnění (Nowell a Hungerford – Filadelfský chromozom). První vydání Metabolické podstaty dědičných chorob.
6
Definice oboru a úvod do historie
1
Období objevu
Osobnost(i)/ organizace
Objev/událost
1963
Byl zaveden populační screening fenylketonurie u novorozenců.
*1966 (kap. 8)
Marshal W. Niren berg, Heinrich Mathaei, Gobind Khorana, Severo Ochoa
Rozluštili genetický kód a jeho roli při biosyntéze bílkovin (1968 Nobelova cena).
1970
David Baltimore, Renato Dulbecco, Howard M. Temin
Onkovirologie – byla popsána interakce retrovirů s genetic kým materiálem buňky, reverzní transkriptáza a reverzní transkripce (1975 Nobelova cena).
*1970 (kap. 13)
Leland H. Hartwell, Richard T. Hunt, Paul M. Nurse
Při studiu buněčného cyklu kvasinek (Saccharomyces cerevisiae) byly objeveny geny regulující buněčný cyklus a homologní geny u člověka – cykliny a cyklin dependentní kináza (2001 Nobelova cena).
1970–1980
John M. Bishop, Harold E. Varmus
Studovali vztahy retrovirů ke vzniku maligních nádorů, obje vili první onkogen c-src (1989 Nobelova cena).
1972
Paul Berg
Vytvořil první rekombinantní molekulu DNA spojením opičího viru SV40 a lambda viru (vektor). K přenosu do bak terie Escherichia coli však již nedošlo, protože autoři objevu si uvědomili, že zavedení DNA z potenciálně kancerogenního viru do bakterie, která je běžnou součástí lidské střevní flóry, by mohlo být velice nebezpečné.
1974
Paul Berg
V časopise Science navrhl dobrovolné moratorium na techniky rekombinantní DNA – počátek zákonů regulujících nakládání s geneticky modifikovanými organismy (GMO).
*1975 (kap. 15)
John F. R. Kerr, Sydney Brenner, H. Robert Horvitz, John E. Sulston
John Kerr poprvé popsal apoptózu – programovanou buněčnou smrt. Nobelova cena 2002 za objevy genetické regulace vývoje orgánů a apoptózy (Brenner, Horvitz, Sulston).
1975–1977
Frederik Sanger, Walter Gilbert, Paul Berg
Vyvinuli techniky sekvenování DNA (1980 Nobelova cena; Frederik Sanger získal již jednu Nobelovu cenu v roce 1958 za stanovení polypeptidového řetězce inzulinu).
1976
Harald zur Hausen
Objevil lidský papilomavirus (HPV), který je příčinou vzniku karcinomu děložního čípku (2008 Nobelova cena).
1977
Richard J. Roberts, Phillip A. Sharp
Nezávisle na sobě objevili členění genů eukaryotických buněk na úseky (introny a exony) a vystřižení intronů z mRNA (gene -splicing) (1993 Nobelova cena).
1982
Stanley B. Prusiner
Formuloval teorii o novém původci infekčních onemocnění nervového systému – objev prionů (1997 Nobelova cena).
1983
Francoise Barréová ‑Sinoussiová, Luc Montagnier
Objevili virus lidské imunodeficience (human immunodefi ciency virus – HIV) (2008 Nobelova cena).
*1983 (kap. 12)
Robert Weinberg
Popsal první lidský onkogen RAS.
1983
Kary Mullis
Vyvinul metodu polymerázové řetězové reakce (PCR), umožňující namnožit i z jediné molekuly DNA vybraný úsek dědičné informace v mnoha kopiích. Tuto metodu lze pova žovat za počátek molekulárně biologické diagnostiky (1993 Nobelova cena).
7
1
Lékařská biologie Období objevu
Osobnost(i)/ organizace
Objev/událost
1984
Elizabeth Black burnová, Carol W. Greiderová, Jack W. Szostak
Popsali telomery (repetitivní sekvence chránící konce lineár ních chromozomů) a enzym telomerázy (2009 Nobelova cena).
1984
Alec Jeffreys
Vytvořil metodu DNA fingerprinting. Komplexnost polymor fismu mini- a mikrosatelitů umožňuje vytvořit unikátní profil DNA jedince. V roce 1987 byl DNA fingerprinting poprvé uznán jako důkaz u soudu, což znamenalo počátek moleku lární diagnostiky ve forenzní medicíně.
*1990–2001 (kap. 10)
Projekt lidského genomu (Human Genome Project – HGP) – Sekvenování lidského genomu; Mezinárodní konsorcium Human Genome Project (20 laboratoří z USA, Velké Británie, Japonska, Francie, Německa a Číny, asi 2800 lidí, vedoucí: Francis Collins, NIH, přístup „clone by clone“, rozpočet 3 mld. USD) a americká soukromá společnost Celera Genomics (přístup „whole genome shot-gun“, Craig Venter, rozpočet 300 mil. USD). Draft sekvence lidského genomu byl publikován: 15. 2. 2001 – Human Genome Project – Nature 16. 2. 2001 – Celera Genomics – Science
1990
William F. Anderson
Poprvé provedl experimentální genovou terapii u čtyřleté holčičky Ashanthi DeSilva trpící závažným kombinovaným imunodeficitem způsobeným deficitem adenozindeaminázy (ADA-SCID).
1996
Ian Wilmut
Bylo uskutečněno první naklonování savce z jediné tělní buňky – ovce Dolly. Somatická buňka z mléčné žlázy dospě lé ovce byla sloučena s neoplodněným enukleovaným oocy tem jiné ovce. Ovce Dolly byla pojmenována po zpěvačce Dolly Parton. Vědci, kteří klonování prováděli, to považovali za trefné pojmenování, protože Dolly Parton je známá i díky svým výrazným proporcím.
1998
Andrew Z. Fire, Craig C. Mello
Popsali jev RNA interference, siRNA – systém post-transkripční kontroly aktivity některých genů (Nobelova cena 2006).
*2003 (kap. 9)
Victor Ambros, Gary Ruvkun
Objevili krátké nekódující RNA označované jako mikroRNA (Nobelova cena 2024).
2016
Lék Strimvelis – první registrovaná genová terapie v Evropě pro léčbu kombino vaného imunodeficitu způsobeného deficitem adenozindeaminázy (ADA-SCID); 26 let od první experimentální aplikace genové terapie pacientce s touto chorobou.
2020
Nové technologie založené na principu masivního paralelního sekvenování – sekvenování nové generace (next generation sequencing – NGS) jsou široce užíváno ve výzkumu i diagnostice. Sekvenování genomu trvá dva dny a náklady jsou méně než 1000 USD.
2022–
Definitivní dokončení sekvenace lidského genomu zásluhou konsorcia Telomere ‑to-Telomere (T2T). Díky moderním sekvenačním technologiím bylo dokončeno chybějících těžko sekvenovatelných 8 % lidského genomu.
ADA-SCID – závažný kombinovaný imunodeficit způsobený deficitem adenozindeaminázy (adenosine deaminase deficiency-severe combined immunodeficiency), c-src - buněčný homolog virového onkogenu Rousova sarkomu v-src, DNA – deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid), F1, F2 (generace) – první filiální generace, druhá filiální generace, GMO – geneticky modifikované organismy, HGP – Projekt lidského genomu (Human Genome Project), HIV – virus lidské imunodeficience (human immunodeficiency virus), HPV – lidský papilomavirus (human papilloma virus), mRNA – mesengerová RNA, NGS – sekvenování nové generace (next generation sequencing), NIH – National Institutes of Health, PCR – polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction), RNA – ribonukleová kyselina (ribonucleic acid), siRNA – malá interferující RNA (small interfering RNA)
8
Chemická podstata života
2
2
Chemická podstata života Lívia Eiselleová, Ondřej Slabý
Všechny živé organismy podléhají chemickým a fyzikálním zákonům. Vše živé je vystavěno z atomů, které pomocí chemických vazeb vytvářejí molekuly, molekuly tvoří makromolekuly, makromolekuly tvoří organely, organely tvoří buňky a buňka nebo buňky tvoří organismus. Chemie života se ovšem vyznačuje několika zvláštnostmi: ■ je založena hlavně na sloučeninách uhlíku, ■ spočívá téměř výlučně v chemických reakcích, které se odehrávají ve vodném roztoku a v poměrně úzkém rozmezí teplot obvyklých na Zemi, ■ je vysoce komplexní – i chemie nejjednodušší buňky je mnohem složitější než jakákoliv jiná známá chemická soustava, ■ je řízena obrovskými polymerními molekulami – biopolymery. Biopolymery, jako jsou polysacharidy, nukleové kyseliny, proteiny a lipidy, jsou základní stavební jednotky buňky.
2.1
Atomy, molekuly a chemické vazby
Termín hmota vyjadřuje cokoli, co zabírá nějaký prostor a má nějakou hmotnost. Je to tedy „to, z čeho se skládá vesmír“. Všechna hmota je složena z různých druhů atomů. Atom (z řeckého ἄτομος, átomos – nedělitelný) je nejmenší částice běžné hmoty, částice, kterou už chemickou cestou nelze dále dělit (ovšem fyzikálně ano, např. jadernou reakcí). Atom je tvořen z kladně nabitého jádra, ve kterém se nacházejí kladně nabité protony a neutrální neutrony, a elektronového obalu, v němž se nacházejí negativně nabité elektrony (obr. 2.1). Počet protonů v jádře se označuje jako protonové nebo také atom uhlíku
jádro
e-
vrstva se 2e-
e-
ep+=6 e-
e-
e-
vrstva se 4e-
ep+
+
p+
p+
ee-
p+
eatom vodíku H
atom vodíku H
molekula vodíku H2
Obr. 2.1 Atom uhlíku, vodíku a molekula vodíku 9
2
Lékařská biologie atomové číslo. Počet neutronů v jádře atomů se stejným protonovým číslem se může lišit. Takové atomy se stejným počtem protonů a rozdílným počtem neutronů potom nazýváme izotopy a tyto atomy se liší tzv. nukleonovým číslem, tj. číslem udávajícím součet protonů a nukleonů (např. uhlík 12C obsahuje 6 protonů a 6 neutronů, uhlík 13C obsahuje 6 protonů a 7 neutronů). Atomy se pomocí chemických vazeb spojují za vzniku molekul. Chemicky čistá látka obsahuje atomy nebo molekuly jednoho druhu a dělí se na prvky a sloučeniny. Prvek je chemicky čistá látka složená z atomů o stejném protonovém čísle. Prvky se v přírodě většinou vyskytují jako směs různých izotopů. Například uhlík se vyskytuje jako směs majoritního izotopu 12C a dále izotopu 13C a 14C, proto je v tabulkách uváděna relativní atomová hmotnost uhlíku jako 12,011 a nikoli přesných 12,000, jak by odpovídalo izotopu 12C. Pokud bychom tedy v přírodě odebrali vzorek „průměrného uhlíku“, pak by jeho převážná část (98,892 % atomů) byla tvořena izotopem 12C, zbytek izotopem 13C a 14C. Stanovení poklesu počtu atomů radioaktivního izotopu uhlíku 14C je principem radiouhlíkové metody, používané ke stanovení stáří biologického materiálu (box 1). Sloučenina je chemicky čistá látka tvořená jedním druhem molekul, které obsahují více než jeden druh atomu, přičemž izotopy téhož prvku zde nejsou považovány za různé atomy. Všechny molekuly jsou tvořeny kombinacemi jednotlivých atomů. Vlastnosti molekul závisí na způsobu, jakým jsou atomy navzájem spojeny. Silové interakce, které poutají navzájem sloučené atomy a energeticky je stabilizují za vzniku molekuly, se nazývají chemické vazby. Předpokladem vzniku vazby je dostatečné přiblížení atomů a zejména jejich elektronů. Elektrony jsou v neustálém pohybu okolo jádra, ale existují zde pouze v nespojitých diskrétních stavech. Mohou se pohybovat jen po určitých drahách a v každé dráze může být vždy jen omezený počet elektronů. Tyto dráhy se nazývají elektronové slupky. Elektrony obsazují v atomu postupně první slupku, potom druhou až po slupku vnější, někdy označovanou také jako valenční (vaznost = valence), v závislosti na celkovém počtu elektronů daného atomu. Elektrony ve vnitřní první slupce jsou k jádru přitahovány nejsilněji. Uspořádání atomů je nejstálejší, pokud jsou zcela obsazeny všechny jeho elektronové slupky. Takový atom je pak chemicky nereaktivní nebo také inertní (např. helium, neon nebo argon). Oproti tomu prvky s neobsazenou BOX 1 RADIOUHLÍKOVÁ METODA DATOVÁNÍ K produkci radioaktivního uhlíku 14C dochází v horních vrstvách zemské atmosféry, převážně ve výšce kolem 15 kilometrů, v důsledku působení kosmického záření. Dále se tento izotop oxiduje na oxid uhličitý, jenž se poté promíchává se svou neaktivní formou tvořenou izotopy 12C a 13C, které nejsou radioaktivní. Tato směs je pak fotosyn tézou vstřebávána rostlinami a jejich prostřednictvím se dostává i do těl živočichů, ve kterých dochází k jeho rozpadu, a to i po jejich smrti. Radiouhlíková metoda datování (též uhlíková nebo radiokarbonová metoda) je chemicko-fyzikální metoda určená pro zjištění stáří biologického materiálu. Je založena na výpočtu stáří z poklesu počtu atomů radioaktivního izotopu uhlíku 14C v původně živých objektech. Změřením poměru jeho koncentrace k stabilnímu izotopu 12C je pak možné vypočítat dobu, kdy byl vzorek vyřazen z koloběhu v přírodě (to znamená, kdy organismus zemřel).
10
Chemická podstata života energetická hladina (slupka)
atomové číslo
Prvek 1
vodík
2
helium*
6
uhlík
7
dusík
8
kyslík
10
neon*
11
sodík
12
hořčík
15
fosfor
16
síra
17
chlor
18
argon*
19
draslík
20
vápník
I
II
III
IV
Obr. 2.2 Zaplnění elektronových slupek vybraných prvků (* valenční elektronové slupky jsou plně obsazené) vnější elektronovou slupkou jsou vysoce reaktivní a mají sklony interagovat s jiným atomy, aby ziskem nebo ztrátou potřebného počtu elektronů nabyly stabilního stavu se zaplněnou vnější slupkou. Toho atomy dosahují pomocí vytváření chemických vazeb. Nezaplněné vnější slupky atomů tak determinují jejich reaktivitu a vaznost, jak je uvedeno pro atomy prvků běžných v živých organismech (obr. 2.2). Například atomu uhlíku chybí k zaplnění vnější slupky čtyři elektrony, uhlík je proto čtyřvazný.
2.2
Základní typy chemických vazeb v biomolekulách
Chemické vazby vznikají stabilizací vnějších elektronových slupek atomů jejich vzájemnou interakcí. Existují dvě základní strategie, které atomy používají k získání nebo odevzdání elektronů potřebnému k zaplnění jejich vnější elektronové slupky. Buď dojde k přenosu elektronů z jednoho atomu na druhý, nebo ke sdílení elektronů dvěma atomy. V prvním případě hovoříme o iontové vazbě, ve druhém případě o vazbě kovalentní (obr. 2.3). Kovalentní vazba je vazba mezi atomy buď stejných, nebo různých prvků, vznikající překrytím jejich valenčních elektronových slupek a sdílením jednoho nebo více párů elektronů. Atomy účastnící se vazby si tímto způsobem zaplňují valenční vrstvu elektronového obalu. Nejjednodušší možnou molekulou je molekula vodíku H2. Oba atomy spolu sdílejí jeden elektron, čímž zaplňují svoje první a v tomto případě i poslední elektronové slupky. Pokud je pár elektronů sdílen nestejnoměrně a vykazuje 11
2
2
Lékařská biologie ep+
p+
p+
p+
e-
eatom
atom
eatom
atom
sdílení elektronů
přesun elektronů e-
p+
ee-
p+
p+
p+ e-
molekula kovalentní vazba
molekula iontová vazba
Obr. 2.3 Srovnání kovalentní a iontové vazby posun směrem k jednomu z atomů, označujeme takovou vazbu za polární kovalentní vazbu. Polarita kovalentní vazby je dána tzv. elektronegativitou interagujících atomů. Elektronegativita je vlastnost atomu vyjadřující jeho schopnost přitahovat vazebné elektrony a je ovlivněna jeho atomovým číslem a vzdáleností valenčních elektronů od nabitého jádra. Za nepolární vazbu považujeme takovou vazbu, která vzniká mezi atomy stejného prvku nebo mezi atomy s velmi malým rozdílem elektronegativit. Elektronová hustota je zde rovnoměrně rozdělena mezi oba partnery (např. H2, O2). Oproti tomu elektronová hustota polární vazby je mezi partnery rozdělena nerovnoměrně. Dochází tak k posunu vazebných elektronů k atomu s vyšší elektronegativitou, který se jeví jako parciálně (částečně) záporně nabitý (značíme δ–). „Nedostatek“ elektronů u druhého atomu způsobí, že je parciálně kladně nabitý (značíme δ+). Dochází ke vzniku tzv. dipólu. Například u polární molekuly vody H2O dochází ke vzniku parciál ního záporného náboje δ– u atomu kyslíku a dvou kladných parciálních nábojů δ+ u atomů vodíků. Polarita molekuly ovlivňuje její reaktivitu. Většina kovalentních vazeb je založena na sdílení dvou elektronů, z nichž každý byl poskytnut jedním z atomů. Takovou vazbu označujeme jako jednoduchou. V některých kovalentních vazbách však může být sdíleno více než jeden pár elektronů. Pokud jsou sdíleny dva páry, tedy celkem čtyři elektrony, mluvíme potom o vazbě dvojné, která má odlišné vlastnosti. Zatímco jednoduchá vazba umožňuje vzájemnou rotaci atomů tvořících vazbu, dvojná vazba je více rigidní a toto neumožňuje. Termín síla vazby je definován jako energie, která je potřebná k přerušení této vazby. Kovalentní vazba je z chemických vazeb nejsilnější. Mezi nekovalentní vazby potom patří vazba iontová, vodíková a van der Waalsova. Tyto vazby jsou mnohonásobně slabší než vazba kovalentní. V případě iontové vazby jeden z atomů daruje nadbytečný elektron jinému atomu, u kterého díky tomu dojde k zaplnění jeho valenční elektronové slupky. Z atomů tak vzniknou nabité ionty. Atom ztrácející elektron tak získá kladný náboj (kationt), atom přijímající elektron získá náboj záporný (aniont). Typickým příkladem iontové vazby je vazba mezi atomy Na a Cl tvořícími molekulu kuchyňské soli NaCl. Sodík má jeden nadbytečný elektron 12
Chemická podstata života ve valenční slupce a má tendenci se ho zbavit. Předá ho tedy atomu chloru, jemuž do plné valenční slupky jeden elektron chybí, za vzniku kationtu Na+ a aniontu Cl–, mezi kterými vznikne iontová vazba a molekula NaCl. Molekuly držící pohromadě iontovou vazbou obvykle označujeme jako soli. Většina solí je dobře rozpustných ve vodě, což bude vysvětleno dále. Prostorovou konfiguraci a tvar biopolymerů v buňce významně ovlivňují také neko valentní slabé interakce (někdy také nevazebné interakce) mezi různými částmi jejich molekul. Jedná se o vodíkové vazby a van der Waalsovy síly. Dostatečný počet těchto nekovalentních vazeb umožňuje vznik stálé konformace proteinů a nukleových kyselin. Vodíková vazba, známá také jako vodíkový můstek, je nejsilnější z nevazebných interakcí. Může se uplatnit intermolekulárně, ale i v rámci dvou částí jedné molekuly. Vodíková vazba vzniká obvykle tehdy, je-li atom vodíku vázaný silně elektronegativním atomem, např. O nebo N, a druhý atom (v biopolymerech obvykle také O nebo N) má volný elektronový pár. Vysoká elektronegativita prvního atomu způsobí posun elek tronů směrem k němu, takže na atomu H vzniká parciální kladný náboj δ+, který může být přitahován záporným nábojem volného elektronového páru druhého atomu. Tyto vazby se uplatňují například ve vodě a v různých organických sloučeninách. Najdeme je ale také v nukleových kyselinách mezi nukleotidy antiparalelních řetězců DNA nebo mezi aminokyselinami v polypeptidových řetězcích (obr. 2.4), kde umožňují sestavit Příklady vodíkových můstků
O
H
O
N
O
H
Příklady nacházíme v biopolymerech: aminokyseliny v polypeptidových řetězcích
R
R
C C
O
C
R H O
R
C
H
N
H
H
N
H
C
R
R
párování bází C a G v DNA
NH2
O
CH C N
HC
N C
HN
NH C
C C
O
C
CH NH
N
H2 N
Obr. 2.4 Příklady vodíkových můstků mezi aminokyselinami v polypeptidových řetězcích a mezi bázemi v DNA C – cytozin, G – guanin, R – postranní řetězec
13
2
2
Lékařská biologie tyto biopolymery do složitých prostorových struktur. Vodíkové vazby jsou asi desetkrát silnější než van der Waalsovy síly, které k sobě přitahují molekuly ve většině kapalin. Van der Waalsovy síly jsou přitažlivé síly mezi neutrálními molekulami. Jejich podstatou je vzájemné působení molekulových dipólů (které existují kvůli okamžitému krátkodobému nerovnoměrnému rozložení elektronů v molekule).
2.3
Biogenní prvky
Buňky živých systémů jsou složeny z relativně malého počtu různých druhů atomů, které nazýváme biogenní prvky. Podle podílu výskytu a důležitosti pro živý organis mus je můžeme rozdělit na makrobiogenní prvky – makroelementy a mikrobio genní (stopové) prvky – mikroelementy. Z makrobiogenních prvků lze ještě vyčlenit tzv. základní makrobiogenní prvky, což je následujících šest prvků – uhlík, vodík, kyslík, dusík, fosfor a síra. Tyto prvky mají nenahraditelné role v organismu, neboť jsou základními stavebními jednotkami molekul tvořících proteiny, nukleové kyseliny, polysacharidy a lipidy. Z hlediska množství se z devadesáti přirozeně se vyskytujících prvků na Zemi pouze dvanáct (C, H, O, N, P, S, Na, K, Ca, Mg, Fe, Cl) vyskytuje v živých systémech ve větším než stopovém množství (0,01 % nebo více), a představují tedy makrobiogenní prvky. Z těchto 12 prvků tvoří první čtyři (uhlík, vodík, kyslík a dusík) celkem 96,5 % hmotnosti lidského těla (obr. 2.5). Mikrobiogenní prvky, jako například Cu, Zn, Mn, Mo, Cr, B, Co, F, I, Se a Si, jsou v malém množství nezbytné pro enzymatické a katalytické děje a obecně správnou funkci řady biopolymerů, ve velkém množství jsou obvykle pro organismy toxické.
jiné dusík
3%
vodík
10 %
uhlík
18 %
kyslík
65 %
Prvky
Značka
Procento v těle
kyslík
O
65,0
uhlík
C
18,5
vodík
H
9,5
dusík
N
3,2
vápník
Ca
1,5
fosfor
P
1,0
draslík
K
0,4
síra
S
0,3
sodík
Na
0,2
chlor
Cl
0,2
hořčík
Mg
0,1
stopové prvky zahrnující bor (B), chrom (Cr), kobalt (Co), měď (Cu), fluor (F), jód (I), železo (Fe), mangan (Mn), molybden (Mo), selen (Se), křemík (Si), cín (Sn), vanad (V) a zinek (Zn)
Obr. 2.5 Procentuální zastoupení prvků v lidském těle 14
méně než 0,1
Chemická podstata života
6
C
12.0107
UHLÍK
c c c c c c c c c c c c c c c H H H H H
H
H H
c c c c c c c c c c c c H H H H H
H H H H
OH H HO
H OH H H
OH
OH
OH
O OH
Obr. 2.6 Díky čtyřem kovalentním vazbám může uhlík vytvářet tvarově rozmanité molekuly Kostra biomolekul, které se nacházejí v buňkách a ze kterých jsou buňky tvořeny, je vystavěna převážně z atomů uhlíku navázaných na jiné atomy uhlíku nebo na atomy kyslíku, dusíku, vodíku, síry a fosforu, tedy základních makrobiogenních prvků. Tato vazba je možná díky čtyřem kovalentním vazbám (obr. 2.6), které mohou čtyřvazné atomy uhlíku tvořit. Atomy uhlíku se mohou spojit i s jiným uhlíkovým atomem vysoce stabilní kovalentní vazbou C-C. Takto může uhlík vytvářet velké a rozvětvené molekuly bez omezení velikosti. Výsledkem jsou různé tvary těchto molekul: přímé řetězce, větvené řetězce nebo kruhy a závity. Takové sloučeniny uhlíku se nazývají organické molekuly a jejich studiem se zabývá obor organická chemie.
2.4
Voda
Voda pokrývá přibližně 71 % zemského povrchu a není bez zajímavosti, že představuje také 70 % hmotnosti buňky. Všechny chemické reakce uvnitř buňky probíhají ve vodném prostředí. Chemický vzorec vody (H2O) udává, že každá jeho molekula obsahuje jeden atom kyslíku a dva atomy vodíku, které jsou spojeny polární kovalentní vazbou. Atomy vodíku svírají s atomem kyslíku úhel 104,45°. Atom kyslíku má mnohem vyšší elektronegativitu (své elektrony drží pevněji než většina ostatních prvků), takže i v molekule vody si atom kyslíku zachovává parciální záporný náboj, zatímco atomy vodíku takto získávají parciální kladný náboj (viz výše). To dává molekule vody kovalentní vazba
O H
H
vodíkový můstek
O H
H
O H
H
Obr. 2.7 Molekuly vody 15
2
2
Lékařská biologie elektrický dipólový moment, a je proto klasifikována jako polární molekula. S jinými molekulami vody se váže prostřednictvím vodíkových můstků (obr. 2.7). Díky své polaritě může molekula vody v kapalném nebo pevném stavu vytvořit až čtyři vodíkové můstky se sousedními molekulami.
2.5
Hydrofilní a hydrofobní molekuly
Vzhledem k polární povaze svých molekul je voda dobré polární rozpouštědlo. Živé systémy jsou na polárních vlastnostech vody zcela závislé a v samotné buňce mají eminentní význam: ve vodě se rozpouští mnoho solí a hydrofilních organických molekul. Voda také rozpouští mnoho plynů, jako je kyslík nebo oxid uhličitý. Biopoly mery tvořící živé systémy – proteiny, DNA a polysacharidy – jsou ve vodě vzhledem ke svému náboji rozpustné. Látky, které se ve vodě dobře rozpouštějí, označujeme jako hydrofilní. Jsou složeny z iontů nebo polárních molekul, které přitahují molekuly vody vlivem elektrických nábojů. Molekuly vody tak obklopují ionty nebo polární molekuly a převádějí je do roztoku. Příkladem iontových sloučenin může být chlorid sodný, který je ve vodě rozpustný, protože molekuly vody jsou svými parciálními náboji přitahovány ke kladnému (Na+) nebo zápornému (Cl–) náboji iontů. Na druhou stranu polární látky, jako je třeba močovina, jsou ve vodě rozpustné ve spojitosti s tvorbou vodíkových můstků s okolními molekulami vody. Mnoho organických látek (např. tuky a oleje, uhlovodíky, které obsahují více vazeb obecně) je ve vodě nerozpustných, tj. hydrofobních. Hydrofobní molekuly obsahují převahu nepolárních vazeb, molekuly vody nejsou k takovým molekulám přitahovány. Nemají tendenci je obklopovat tak jako hydrofilní molekuly, nepřevádějí je do roztoku, a jsou proto ve vodě nerozpustné (obr. 2.8). Hydrofilní, resp. hydrofobní interakce mezi biopolymery nebo jejich částmi a molekulami vody určují do značné míry prostorové uspořádání proteinů nebo konformaci DNA. nepolární molekuly se ve vodě nerozpouštějí, vodíkové vazby vznikají pouze mezi molekulami vody
polární molekuly se ve vodě rozpouštějí, protože tvoří vodíkové vazby s molekulami vody
δ
+
voda je polární molekula
δ
+
δ+ δδ + δ -
δ
δ
δ
δ
-
-
-
δ
+
δ
+
+
+
vodíková vazba
hydrofilní molekuly
Obr. 2.8 Hydrofilní a hydrofobní molekuly 16
δ
hydrofobní molekuly
Chemická podstata života
2.6
Biopolymery
Všechny organické molekuly jsou v buňce syntetizovány ze souboru malých jednoduchých sloučenin, na které se zase zpětně odbourávají. Čtyři hlavní třídy těchto malých organických molekul jsou nukleotidy, aminokyseliny, sacharidy a mastné kyseliny. Biologické polymery neboli biopolymery jsou nukleové kyseliny, proteiny, sacharidy a lipidy, které se skládají z monomerů těchto malých organických molekul spojených dohromady. Monomerem v obecném slova smyslu jsou molekuly, které mohou reagovat s dalšími molekulami monomerů za vzniku většího polymerního řetězce v procesu zvaném polymerace (obr. 2.9). Polymerací tak z monosacharidů vznikají polysacharidy, aminokyseliny jsou stavebními jednotkami proteinů, nukleotidy tvoří nukleové kyseliny a mastné kyseliny tvoří lipidy/membrány. Biopolymery obecně vznikají tak, že k rostoucímu konci řetězce se v kondenzační reakci přidává další podjednotka monomeru za uvolnění jedné molekuly vody. Zpětná reakce (hydrolýza) vodu zase spotřebovává. Lipidy do tohoto jednoduchého klasického vztahu monomer-polymer nepatří, protože jsou tvořeny alkoholem a mastnými kyselinami (tab. 2.1). Jestliže 70 % hmotnosti buňky představuje voda, biopolymery zaujímají téměř celých zbývajících 30 %: proteiny přibližně 15 %, RNA 6 %, DNA 1 %, polysacharidy 2 % a fosfolipidy 2 %. Na malé molekuly a ionty zůstávají přibližně 4 % hmotnosti buňky.
OH
H
vazba + H 2O
monomer
monomer
dimer
Obr. 2.9 Tvorba polymerů z monomerů kondenzační reakcí Tab. 2.1 Monomery a polymery Biopolymery
Monomery
Polymery nebo větší molekuly
Typ vazby
sacharidy
monosacharidy
polysacharidy
glykosidická
lipidy
mastné kyseliny
triacylglyceridy
esterová
proteiny
aminokyseliny
polypeptidy
peptidová
nukleové kyseliny
nukleotidy
polynukleotidy
fosfodiesterová
2.6.1
Sacharidy
Sacharidy zastávají v živých organismech celou řadu důležitých funkcí. Jako polysacharidy slouží k ukládání energie (např. škrob a glykogen) nebo jsou strukturními složkami v buňce (např. celulóza u rostlin a chitin u členovců). Například pětiuhlíkatý 17
2
Lékařská biologie monosacharid ribóza je důležitou součástí koenzymů (látky nebílkovinné povahy, které tvoří součást složených enzymů) a jako součást ribonukleotidů tvoří také cukr-fosfátovou kostru ribonukleové kyseliny (RNA). Příbuzná deoxyribóza je součástí nukleotidů tvořících cukr-fosfátovou kostru dvoušroubovicové deoxyribonukleové kyseliny (DNA). Sacharidy a jejich deriváty zahrnují mnoho dalších důležitých biomolekul, které hrají klíčovou roli v imunitním systému, srážení krve, ontogenezi apod. Nejjednodušší sacharidy se nazývají monosacharidy a jsou složené z atomů uhlíku (C), vodíku (H) a kyslíku (O), obvykle s poměrem atomů vodíku a kyslíku 2 : 1 (jako ve vodě), a tedy s empirickým vzorcem (CH2O)n, kde n = 3–8. Navíc mohou monosacharidy existovat jako optické izomery ve formě D a L, které představují své zrcadlové obrazy. Většina monosacharidů je odvozena od D-řady. Pokud se v monosacharidech vyskytuje aldehydová skupina, nazývají se aldózy, pokud ketonová (oxo) skupina, jsou to ketózy. Ve vodném prostřední mají monosacharidy tendenci vytvářet cyklické struktury (obr. 2.10). Cyklické monosacharidy se šestičlenným kruhem, které jsou odvozené od pyranu, se označují jako pyranózy. Podobné sacharidy s pětičlenným kruhem jsou podle furanu označovány jako furanózy. Cyklické formy glukózy a ribózy jsou tedy glukopyra nóza a ribofuranóza. Při vzniku cyklické formy monosacharidů se stává uhlíkový atom karbonylové skupiny chirálním a na něm vzniklá hydroxylová skupina může vůči ostatním substituentům na kruhu zaujmout dvojí orientaci, označovanou jako alfa nebo beta. 2’-deoxy-beta-D-ribofuranóza je potom deoxyribóza, která je součástí nukleotidů, základních stavebních jednotek DNA. Biologicky významným monosacha ridem je určitě glukóza, která představuje pro buňku důležitý zdroj energie. Glukóza je metabolizována řadou chemických reakcí v procesu označovaném glykolýza. Této metabolické dráhy se účastní mnoho enzymů a vzniká řada významných metabolických tříuhlíkaté (triózy)
pětiuhlíkaté (pentózy)
šestiuhlíkaté (hexózy) H
ALDÓZY
H
H
C
O
C
O
C
O
H
C
OH
Ve vodném roztoku má aldehydová nebo ketonová skupina v molekule cukru tendenci reagovat s hydroxylovou skupinou téže molekuly, čímž se vytváří cyklická struktura.
OH
HO
C
H
HO
H
C
OH
H
C
OH
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
H
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H
H ribóza
H H H H
H
C OH
H
C
OH
OH
C
O
C
O
HO
C
H
C
OH
H
C
OH
C
O
H
C
OH
H
C
OH
C
OH
H
C
OH
H
C
OH
H dihydroxyaceton
H ribulóza
H fruktóza
Obr. 2.10 Přehled nejčastějších monosacharidů
H2C6
C
H
5C
C
OH
C
OH
C
H
2 3 4 5
6
H
cyklizace
C OH
C
H H H
C
OH
C
OH
C
OH
C
H
2 3 4 5
OH
O OH
H
H
C1
HO C3
C2
H
H
OH
glukóza
O
1
H
OH
4
OH
H
C
OH
C
H glukóza
H
O
C
1
C
H
18
H H
H
H glyceraldehyd
KETÓZY
2
HO
cyklizace
CH2
H
O
5
C
H
H
H
C
C2 OH
OH
OH
4
3
ribóza
C1
Chemická podstata života meziproduktů. Monosacharidy se díky kovalentním glykosidovým vazbám spojují za vzniku disacharidů, oligosacharidů a polysacharidů. Disacharidy jsou cukry, které vznikají spojením dvou monosacharidů glykosidovou vazbou. Stejně jako monosacharidy jsou disacharidy jednoduché cukry rozpustné ve vodě. Nejběžnějšími příklady jsou sacharóza (glukóza + fruktóza), laktóza (galaktóza + glukóza) a maltóza (glukóza + glukóza) (obr. 2.11). Oligosacharidy jsou krátké polymery obsahující malý počet (obvykle tři až deset) monosacharidových jednotek. Oligosacharidové řetězce jsou často spojeny s lipidy nebo s kompatibilními postranními řetězci aminokyselin pomocí N- nebo O-glykosidových vazeb v rámci post-translačních modifikací proteinů (viz kap. 8.7). Vzniklé molekuly označujeme jako glykolipidy a glykoproteiny. Tyto zajišťují mnoho důležitých buněčných funkcí včetně rozpoznávání buněk v imunitních reakcích nebo determinace krevních skupin systému AB0. Jednoduché polysacharidy tvořené řetězci monosacharidů jsou buňkou využívány jako dlouhodobé zásobárny energie. U živočichů plní tuto úlohu větvený polymer glukózy – glykogen, u rostlin je to škrob. Jedna molekula glykogenu se skládá z mnoha molekul glukózy (až 120 000 molekul glukózy), které jsou navzájem spojeny alfa-1,4 -glykosidovými vazbami. Vždy po 8–12 jednotkách se však ještě nachází větvení pomocí alfa-1,6-glykosidové vazby. Výsledkem je bohaté větvení molekul glykogenu. Průměrný člověk má v zásobě cca 250–400 g glykogenu (jednu třetinu v játrech, dvě třetiny ve svalech). Polysacharid celulóza se nachází v buněčných stěnách rostlin a je nejhojnější organickou sloučeninou na naší planetě. Jednotlivé glukózové jednotky jsou spojeny beta-1,4-glykosidovou vazbou a tvoří dlouhé nerozvětvené řetězce, které jsou zcela nerozpustné ve vodě. Většina živočichů včetně člověka nemá enzymy, které by dokázaly rozštěpit beta-1,4-glykosidové vazby mezi jednotlivými glukózovými H2C H
sacharóza
C OH
C H
HO C
OH
OH O H C
H
H
OH
glukóza H2C H
maltóza
C OH
C H
HO C H
laktóza
OH
C OH
C H C OH 2
OH
H
H
C
H
O
C OH
C H
C
OH
C H
C
C
H2C O H
H
glukóza
H2C
HO
fruktóza
C
HO
H
O
C O
C
H
CH2
OH
C
H C
C
H
H
OH
galaktóza
O
C
C
OH
OH
H
H
O H H
glukóza H2C
O
OH
C H
OH O H H
C
C
C
OH
H
OH
C OH
glukóza
Obr. 2.11 Přehled nejčastějších disacharidů 19
2
2
Lékařská biologie jednotkami. Proto je pro ně celulóza nestravitelná a v potravě tvoří vlákninu, která prochází nestrávená trávicím traktem. Polysacharid chitin tvoří strukturní složku koster hmyzu a hub.
2.6.2
Mastné kyseliny a lipidy
Mastnými kyselinami se obvykle rozumí vyšší monokarboxylové kyseliny. Obsahují osm a více atomů uhlíku, typicky se sudým počtem uhlíkových atomů. Nejčastější jsou kyseliny s délkou C16 (kyselina palmitová) a C18 (kyselina stearová). Mastné kyseliny dělíme na nasycené a nenasycené podle přítomnosti dvojné vazby/vazeb. Například nenasycená kyselina C18 s jednou dvojnou vazbou je kyselina olejová. Molekula mastné kyseliny se skládá ze dvou částí – hydrofobní a hydrofilní, nereaktivní a reaktivní, uhlovodíkového řetězce a karboxylové skupiny. Lipidy tvoří skupinu chemicky i funkčně heterogenních látek, které jsou nerozpustné ve vodě (hydrofobní) a rozpustné v nepolárních rozpouštědlech, typicky ve své molekule obsahují alkoholy a mastné kyseliny. Lipidy dělíme na jednoduché a složené. Jednoduché lipidy jsou například acylglyceroly (glyceridy). Acylglyceroly jsou estery vyšších mastných kyselin a glycerolu. Podle počtu navázaných molekul mastných kyselin je dělíme na mono-, di- a triacylglyceroly, přičemž největší biologický význam Fosfolipidy jsou hlavní složkou buněčných membrán. cholin O O
P
O-
hydrofilní skupina
O CH2
CH
O
O
C
C
CH2
obecná struktura fosfolipidu
hydrofobní konec mastné kyseliny
Ve fosfolipidech jsou dvě hydroxylové skupiny glycerolu esterifikovány mastnou kyselinou, třetí hydroxylová skupina je vázána na zbytek kyseliny fosforečné a vznikající fosfát je dále esterifikován různými malými polárními molekulami, často obsahujícími skupinu –OH.
Obr. 2.12 Struktura glycerolfosfolipidu 20
Chemická podstata života mají triacylglyceroly, ve kterých jsou mastné kyseliny uloženy jako energetická rezerva (tuhé tuky a kapalné oleje). Složené lipidy tvoří základní stavební prvek buněčných membrán (viz kap. 4.2). Řadíme mezi ně především fosfolipidy a glykolipidy. Složené lipidy obsahují kromě hydrofobní části i složku hydrofilní. Označují se proto jako polární lipidy, amfifilní nebo amfipatické molekuly a přirozeně mají ve vodném roztoku tendenci tvořit micely nebo dvojvrstvy v důsledku snahy o vytěsnění vody seskupením hydrofobních konců k sobě. Hydrofilní hlavičky směřují do roztoku. Fosfolipidy dělíme na glycerolfosfolipidy a sfingofosfolipidy. V glycerolfosfo lipidech, které jsou hlavní složkou buněčných membrán, jsou dvě hydroxylové skupiny glycerolu esterifikovány mastnými kyselinami a na třetí je navázán zbytek kyseliny fosforečné. Tento fosfát je esterifikován malými polárními molekulami (např. cholin, serin, etanolamin) (obr. 2.12). Tyto fosfolipidy potom označujeme jako fosfatidylcholin (nejčastější, označovaný také jako lecitin), fostatidylserin nebo fosfatidyletanolamin. Sfingofosfolipidy obsahují místo glycerolu alkohol sfingosin, na který se vážou další složky. Sfingosin s navázanou mastnou kyselinou se nazývá ceramid. Nejvýznamnější podskupinou jsou sfingomyeliny, tvořené ceramidem s navázaným zbytkem kyseliny fosforečné a cholinem. Sfingomyeliny se vyskytují například v nervové tkáni. Glykolipidy obsahují jeden nebo více monosacharidů. Tyto monosacharidy jsou glykosidovou vazbou napojené na molekuly mono- či diacylglycerolu nebo sfingosinu. Mezi glykolipidy řadíme cerebrosidy a gangliosidy. Cerebrosidy jsou tvořeny molekulou ceramidu s navázanou galaktózou. Vyskytují se zejména v bílé hmotě CNS. Gangliosidy jsou tvořeny ceramidem, na který je navázaný oligosacharid, obvykle galaktóza a glukóza. Vyskytují se v gangliích nervových buněk a šedé hmotě centrální nervové soustavy (CNS).
2.6.3
Nukleové kyseliny
Nukleové kyseliny jsou biopolymery, jejichž základními monomerními jednotkami jsou čtyři typy nukleotidů. Dvě hlavní třídy nukleových kyselin jsou deoxyribonuk leová kyselina (DNA) a ribonukleová kyselina (RNA). Detailní popis jejich struktury a vlastností je uveden v kapitole 5.
2.6.4
Proteiny
Proteiny jsou biopolymery, které vznikají spojením velkého počtu 20 typů malých chemicky podobných monomerních podjednotek, označovaných jako aminokyse liny, pomocí peptidové vazby. Struktuře a biologickým funkcím proteinů je věnována kapitola 3.
21
2
3
3
Proteiny a jejich funkce Lívia Eiselleová, Ondřej Slabý
3.1
Struktura proteinů
Proteiny tvoří většinu suché hmotnosti buňky, jsou jejími základními stavebními kameny a zajišťují také většinu jejích funkcí. Proteiny jsou biopolymery, jejichž základní stavební jednotkou jsou aminokyseliny. Liší se od sebe sekvencí aminokyselin, jejichž pořadí v proteinu je kódováno sekvencí nukleotidů v jejich genech. Lineární řetězec aminokyselin se nazývá polypeptid. Polypeptidové řetězce, které obsahují méně než 50 aminokyselin, se nazývají peptidy. Velikost většiny proteinů se pohybuje mezi 50 až 2000 aminokyselinových zbytků. Jednotlivé aminokyseliny jsou vzájemně spojeny peptidovými vazbami. Většina proteinů se v buňce vyskytuje v počtu 1000 až 10 000 kopií, přičemž koncentrace jednotlivých druhů proteinů (na rozdíl od jejich genů) se mění podle aktuálních potřeb buňky v závislosti na regulaci exprese příslušného kódujícího genu a degradaci tohoto proteinu. Počet různých typů proteinů je významně vyšší, než je počet genů. Tato diverzita proteinů je umožněna alternativním sestřihem (viz kap. 7.7). Z přibližně 20 000 genů může vzniknout až 200 000 různých transkriptů, ze kterých může díky post-translačním modifikacím vzniknout ještě významně vyšší počet proteinů (viz kap. 8.7). Tyto post-translační modifikace mohou měnit fyzikální a chemické vlastnosti proteinu, jeho stabilitu a aktivitu a determinovat tak jeho funkci. Proteiny často obsahují kromě řetězce aminokyselin, spojených peptidovými vazbami, i nebílkovinnou část, která jim umožňuje vykonávat určité specifické funkce (např. vázat kyslík a transportovat ho do tkání pomocí hemu v proteinu hemoglobinu). Podle typu neproteinové složky dělíme složené proteiny na: ■ glykoproteiny – obsahující glykosidicky vázaný sacharid, ■ metaloproteiny – obsahující iont kovu (Fe, Cu), například feritin nebo transferin, ■ chromoproteiny – obsahující jako prostetickou skupinu pigment, například hemoglobin, cytochromy či myoglobin, ■ nukleoproteiny – obsahující navázané nukleové kyseliny, ■ lipoproteiny – obsahující lipidy. Jednotlivé proteiny se mohou také dále spojovat do složitějších proteinových komplexů. Strukturu proteinů popisujeme na několika úrovních a její znalost je nezbytná pro pochopení jejich funkce.
3.1.1
Aminokyseliny
Základními stavebními jednotkami proteinů jsou aminokyseliny. Nejjednodušší aminokyselina se nazývá glycin. Byla pojmenována podle své sladké chuti (glyko – „cukr“) a zároveň patří k prvním aminokyselinám, které byly izolovány a popsány. Proteinogenních aminokyselin, tedy těch, které jsou kódovány genetickým kódem 23
3
Lékařská biologie a vyskytují se v proteinech, je pouze 20 (případně 22, počítáme-li selenocystein a pyrolyzin). Proteinogenní aminokyseliny se připojují k peptidovému řetězci v průběhu translace (viz kap. 8). Aminokyseliny jsou organické sloučeniny, které obsahují amino (-NH2) a karbo xylovou (-COOH) funkční skupinu. Každá aminokyselina obsahuje centrální atom uhlíku (C), nazývaný alfa-uhlík, na který je navázána aminoskupina a karboxylová skupina. Zbývající dvě vazby atomu α-uhlíku jsou zpravidla tvořeny atomem vodíku (H) NH2 a skupinou R (R = reziduum), která představuje postranní řetězec (obr. 3.1), jímž se od sebe jednotlivé aminokyseliny odlišují. H C COOH Protože alfa-uhlík je u aminokyselin asymetrický (jedinou výjimku tvoří glyR cin), jsou všechny aminokyseliny chirální Obr. 3.1 Obecný vzorec aminokyseliny molekuly. To znamená, že existují ve dvou R – postranní řetězec opticky aktivních asymetrických formách – tzv. enantiomerech, které jsou navzájem zrcadlovými obrazy (D-izomery a L-izo mery). Aminokyseliny obsažené v proteinech mají výlučně L-konfiguraci. Aminokyseliny můžeme dále klasifikovat podle chemických vlastností jejich postranního řetězce. Ten může být kyselý nebo zásaditý, polární nebo nepolární, pozitivně nebo negativně nabitý. Jedinečné vlastnosti aminokyselin jim propůjčují právě postranní řetězce a jsou tak základem všech rozmanitých funkcí a variability proteinů (obr. 3.2).
Aminokyselina
Postranní řetězec
Aminokyselina
Postranní řetězec
asparagová kys.
Asp
D
negativní
alanin
Ala
A
nepolární
glutamová kys.
Glu
E
negativní
glycin
Gly
G
nepolární
arginin
Arg
R
pozitivní
valin
Val
V
nepolární
lyzin
Lys
K
pozitivní
leucin
Leu
L
nepolární
histidin
His
H
pozitivní
izoleucin
Ile
I
nepolární
asparagin
Asn
N
polární bez náboje
prolin
Pro
P
nepolární
glutamin
Gln
Q
polární bez náboje
fenylalanin
Phe
F
nepolární
serin
Ser
S
polární bez náboje
methionin
Met
M
nepolární
treonin
Thr
T
polární bez náboje
tryptofan
Trp
W
nepolární
tyrozin
Tyr
Y
polární bez náboje
cystein
Cys
C
nepolární
selenocystein
Sec
U
nepolární
POLÁRNÍ AMINOKYSELINY
NEPOLÁRNÍ AMINOKYSELINY
Obr. 3.2 Rozdělení aminokyselin, které se nacházejí v proteinech eukaryot (jsou uvedeny třípísmenné i jednopísmenné symboly) 24
Proteiny a jejich funkce
3.1.2
Primární struktura proteinů a peptidová vazba
Primární strukturou proteinů se rozumí lineární posloupnost aminokyselin spojených peptidovou vazbou v polypeptidovém řetězci (obr. 3.3). Sekvence proteinu se dle konvence uvádí vždy ve směru od N-konce k C-konci. Každý typ proteinu se vyznačuje jedinečným pořadím aminokyselin v jeho polypeptidovém řetězci. Peptidová vazba (obr. 3.4) je kovalentní chemická vazba spojující dvě sousední aminokyseliny mezi C1 (uhlíkem číslo jedna) jedné a N2 (dusíkem číslo dvě) druhé aminokyseliny. Jedna aminokyselina ztrácí vodík a kyslík ze své karboxylové skupiny (COOH) a druhá ztrácí vodík ze své aminoskupiny (NH2). Výsledkem této reakce je uvolněná molekula vody (H2O) a dipeptid, tedy dvě aminokyseliny spojené peptidovou vazbou (-CO-NH-). Tato vazba se tvoří v procesu translace a je katalyzována velkou ribozomální podjednotkou (viz kap. 8.4).
aminokyseliny
Phe Leu Ser
amino skupina
NH2
H
C
Cys COOH karboxylová skupina
R
R-skupina, postranní řetězec
Obr. 3.3 Primární struktura proteinů – sekvence aminokyselin v polypeptidovém řetězci Cys – cystein, Leu – leucin, Phe – fenylalanin, Ser – serin; R – postranní řetězec
H H
H N
C
C
R1
R2
H
O +
N
OH H
první aminokyselina
C
O C
H druhá aminokyselina
OH
H2O
H H
N
H
O
C
C
R1
R2 N
C
H
H
O C OH
dipeptid
Obr. 3.4 Peptidová vazba R1, R2 – postranní řetězce
25
3
3
Lékařská biologie Při tvorbě peptidové vazby dochází ke spotřebě energie ve formě adenozintrifosfátu (ATP). Na druhou stranu lze peptidovou vazbu přerušit hydrolýzou (přidáním vody). V buňkách je tento proces obvykle katalyzován enzymy známými jako proteázy. Každý protein má svoje prostorové uspořádání (konformaci) určeno pořadím aminokyselin ve svém polypeptidovém řetězci a podílí se něm především slabé nevazebné interakce mezi jednotlivými částmi jeho molekuly. Kovalentní vazby v biopolymerech, včetně proteinů, totiž umožňují otáčení spojených atomů, a polymer je tak značně ohebný. Protein tak může nabývat neomezený počet konformací podle toho, jak se řetězec ohýbá vlivem tepelné energie. Tvar proteinů vymezují slabé nevazebné interakce, především vodíkové můstky, mezi různými částmi jeho molekuly. Dostatečný počet nekovalentních interakcí pak umožní vznik stálé konformace. Biologická aktivita (funkce) většiny proteinů spočívá v jejich jedinečné a stálé konformaci. Po změně konformace přerušením slabých nevazebných interakcí se ztrácí také funkce proteinu, tento proces označujeme jako denaturace a lze ho docílit pomocí některých rozpouštědel (např. močoviny) nebo zahřátím na dostatečně vysokou teplotu. Po odstranění rozpouštědla nebo ochlazením může protein opět renaturovat do své původní konformace. Správnému prostorovému skládání proteinů napomáhá skupina proteinů, které označujeme jako molekulární chaperony (viz kap. 8.6).
3.1.3
Sekundární struktura proteinů
Při srovnání trojrozměrných struktur řady různých proteinů lze, i přes jejich prostorovou jedinečnost, vypozorovat dva základní, neustále se opakující motivy uspořádání. Tyto strukturní motivy jsou tak časté, protože jsou dány vodíkovými můstky mezi skupi nami N-H a C=O v polypeptidové kostře a nezahrnují interakce postranních řetězců aminokyselin. Definují sekundární strukturu proteinů a lze je spolehlivě předpovědět z primární struktury proteinů. Dva základní motivy sekundární struktury proteinů jsou alfa-šroubovice (helix) a beta-skládaný list, pozorovat ale můžeme i méně obvyklé beta-závity a omega-smyčky. Prvky sekundární struktury se obvykle spontánně vytvářejí jako mezistupeň před složením proteinu do jeho plné trojrozměrné terciární struktury. Ve struktuře známé jako alfa-šroubovice (obr. 3.5) je řetězec proteinu stočen kolem sebe sama do pravotočivé spirály (helix) a vytváří rigidní válec. Vodíkový můstek vzniká mezi každou čtvrtou peptidovou vazbou a spojuje N-H jedné a C=O druhé peptidové vazby. Délka jednoho závitu šroubovice je rovna 3,6 aminokyselinových zbytků. Strukturu alfa-helixu nalezneme například u vláknitých proteinů (keratinů) vyskytujících se v kůži nebo v proteinech svalových buněk. Časté jsou také u membránových proteinů, kdy alfa-helixy s nepolárními postranními řetězci představují část proteinu procházející lipidovou dvojvrstvou. Některé páry alfa-helixů se ovíjejí okolo sebe navzájem a vytvářejí stabilní strukturu zvanou svinuté klubko. Ovíjení je způsobeno proužkem nepolárních hydrofobních aminokyselin na obou řetězcích, které spolu vzájemně interagují, aby byly odvráceny od kontaktu s vodným prostředím. Naproti tomu beta-skládaný list (obr. 3.6) představuje sousedící polypeptidové řetězce, které mohou být uspořádány paralelně (mají stejnou orientaci) nebo antiparalelně (každý úsek má vůči svým sousedům opačnou orientaci); uspořádané řetězce tak připomínají list papíru složený do harmoniky. Tento strukturní útvar je umožněn vodíkovými můstky mezi peptidovými vazbami sousedních řetězců. 26
Proteiny a jejich funkce alfa-šroubovice
postranní řetězec aminokyseliny
R
R R R R
uhlík
kyslík vodíkový můstek
0,54 nm
R vodík
R R
uhlík
dusík R
Obr. 3.5 Sekundární struktura proteinů – motiv alfa-šroubovice (upraveno podle Alberts B et al. Molecular Biology of the Cell, 2015) vodíkový můstek
beta-skládaný list R
vodík uhlík
R R
dusík
R
postranní řetězec aminokyseliny
R
0,7 nm
R
peptidová vazba
R R
R
kyslík R
R
R
R
R
R
Obr. 3.6 Sekundární struktura proteinů – motiv beta-skládaného listu (upraveno podle Alberts B et al. Molecular Biology of the Cell, 2015)
3.1.4
Terciární struktura proteinů
Terciární strukturu charakterizují především další intramolekulární slabé interakce (vodíkové můstky, iontové vazby a van der Waalsovy síly) mezi postranními řetězci amino kyselin, které určují trojrozměrné uspořádání celého peptidového řetězce. V rámci terciární struktury proteinů se střídají základní motivy sekundární struktury – alfa27
3
3
Lékařská biologie -šroubovice, beta-skládané listy a další atypické smyčky a motivy, které jsou mezi nimi. Terciární struktura může být dále stabilizována také kovalentními vazbami (např. vazbou S-S – tzv. disulfidovým můstkem) mezi postranními řetězci aminokyselin. Podle celkového prostorového uspořádání rozlišujeme dvě základní proteinové struktury. Jednak je to struktura globulární (sféroproteiny, např. albumin), která má tvar klubka a skládá se do kompaktního tvaru umožňujícího zabalení hydrofobních částí molekuly dovnitř její struktury. Postranní řetězce polárních aminokyselin se snaží zdržovat pohromadě na vnější straně proteinu, kde mohou interagovat s vodou. Taková struktura je proto rozpustná ve vodě. Příklady globulárních proteinů mohou být třeba enzymy. Druhým typem je struktura fibrilární (skleroproteiny, např. myozin), která má vláknitou podobu a je ve vodě nerozpustná. Příkladem fibrilárních proteinů jsou kolagen či keratin, vyskytující se v chlupech, kůži či nehtech. Jednotlivé části polypeptidového řetězce mohou navíc zaujímat svoji konformaci nezávisle na zbytku molekuly. Tyto oblasti v rámci struktury proteinu označujeme jako proteinové domény. Domény jsou obvykle 50 až 350 aminokyselin dlouhé a představují jakési modulární jednotky, z nichž jsou tvořeny větší proteiny.
3.1.5
Kvarterní struktura proteinů
O kvarterní struktuře hovoříme tehdy, je-li protein tvořen z více nezávislých polypeptidových řetězců. Ne všechny proteiny proto mají kvarterní strukturu. Prostorové uspořádání nezávislých polypeptidových řetězců umožňuje jejich vzájemné spojení nekovalentními interakcemi. Specifická oblast na povrchu proteinu, která interaguje s jinou molekulou prostřednictvím nekovalentních vazeb, se nazývá vazebné místo. Proteiny obsahují vazebná místa pro řadu velkých i malých molekul. V rámci proteinových komplexů se každý nezávislý polypeptidový řetězec označuje jako proteinová podjednotka. Kvarterní struktura proteinu je potom prostorové uspořádání těchto podjednotek. Rozdělení na proteinové podjednotky je evolučně výhodnější než existence jednoho dlouhého řetězce, protože umožňuje lepší adaptaci sestavováním existujících podjednotek v nové funkční celky. Proteiny se skládají z podjednotek buď odlišných (heteromery), nebo shodných (homomery). Interakce jednotlivých podjednotek zajišťují specifická vazebná místa na jejich povrchu cestou slabých nekovalentních interakcí, především vodíkových můstků. Příkladem proteinového komplexu je například transportní protein červených krvinek hemoglobin (obr. 3.7). Běžný hemoglobin dospělého člověka (adult hemoglobin – HbA) se skládá ze čtyř podjednotek – dvou alfa (α) a dvou beta (β). Každá podjednotka je tvořena bílkovinnou částí – globinem a prostetickou (nebílkovinnou) částí – hemem, a je schopna vázat jednu molekulu kyslíku. Naopak myoglobin, vyskytující se ve svalových buňkách, obsahuje pouze jednu hemovou skupinu a jeden globinový řetězec, a proto může transportovat jen jednu molekulu O2. Kvarterní strukturu myoglobin vůbec nemá. Jednotlivé úrovně struktury proteinů včetně základní charakterizace jsou shrnuty na obrázku 3.8. Jakmile se jednou vyvinul protein, který se složil do stálé konformace a měl užitečnou funkci, jeho struktura byla často v průběhu evoluce lehce pozměněna mutacemi v jeho genu a přizpůsobena novým funkcím. Takovéto skupiny proteinů, které mají 28
Proteiny a jejich funkce myoglobin
hemoglobin
monomer
heterotetramer (α2β2)
Obr. 3.7 Srovnání kvarterní struktury hemoglobinu a myoglobinu
primární struktura bílkovin sekvence řetězce aminokyselin aminokyseliny
sekundární struktura bílkovin je podmíněna vznikem vodíkových můstků mezi NH– a C=O skupinami peptidové vazby
beta-skládaný list
alfa-helix
alfa-helix
beta-skládaný list
terciární struktura bílkovin prostorové uspořádání molekuly podmíněné interakcemi mezi vedlejšími skupinami peptidového řetězce, je tvořena střídáním motivů sekundární struktury
kvarterní struktura bílkovin prostorové uspořádání podjednotek proteinů složených z více než jednoho peptidového řetězce
Obr. 3.8 Strukturní organizace proteinů – shrnutí 29
3
3
Lékařská biologie společný evoluční původ, se nazývají proteinové rodiny (např. serinové proteázy: chymotrypsin, trypsin a elastáza). Proteinové rodiny mají často příbuzné funkce, což je dáno podobností v jejich sekvenci nebo struktuře.
3.2
Funkce proteinů
Proteiny zajišťují téměř všechny biologické funkce buňky. Jsou strukturní složky, které tvoří cytoskelet a mechanicky se podílejí na zpevnění a udržení tvaru buňky. V případě tkání tvoří proteiny extracelulární matrix a definují jejich vlastnosti (viz kap. 4.4 a 16). Proteiny jako enzymy katalyzují biochemické reakce nutné pro vytváření a rušení chemických vazeb a následně také udržení homeostázy a buněčného metabolismu. Transportní proteiny zajišťují transport molekul a iontů (např. hemoglobin je nosičem kyslíku a transferin přenáší železo). Proteiny také zajišťují různé druhy pohybu. Myozin a aktin umožňují pohyb živočichů, kinezin a dynein zase interagují s mikrotubuly a aktinovými vlákny a zabezpečují tak pohyb velkých molekul a organel uvnitř buňky. Zásobní proteiny vážou malé molekuly a ionty a vytvářejí tak jejich zásoby (např. železo se ukládá v játrech vazbou na protein feritin). Zvlášť důležitou funkcí proteinů je jejich signální a komunikační funkce. Proteiny fungují jako signální molekuly (hormony, růstové faktory) i jako receptory přijímající signál. Na udržení integrity tkání se podílejí adhezivní proteiny. Na realizaci imunitní odpovědi se podílejí protilátky a cytokiny. Kromě těchto několika příkladů existuje obrovské množství proteinů, které se nedají funkčně zařadit a v různých organismech vykonávají různé unikátní funkce.
3.2.1
Proteiny jako strukturní komponenty buňky a tkání
Uvnitř buňky vytvářejí proteiny buněčný cytoskelet, podílejí se na mechanické podpoře buňky, udržování jejího tvaru a zajišťování buněčného pohybu. Všechny tyto různorodé funkce jsou vykonávány pomocí tří typů cytoskeletálních proteinových vláken: středních (intermediárních) filament, mikrotubulů a aktinových vláken. Každá z těchto tříd proteinů má trochu jiné vlastnosti i funkce, a proto se podílí i na rozdílných buněčných dějích (detailně viz kap. 4.4). Významnou roli plní strukturní proteiny také pro udržení integrity tkání. V rámci mezibuněčné tkáňové hmoty – extracelulární matrix se vyskytuje řada proteinů propůjčujících tkáním jejich specifické vlastnosti. Například kolagen je nejhojnějším proteinem mezibuněčné hmoty a u savců představuje čtvrtinu celkového množství všech proteinů v těle. Poskytuje pojivovým tkáním pevnost v tahu a odolnost vůči roztržení. Elastiny zase propůjčují tkáním, jako jsou kůže, cévy nebo plíce, pevnost a schopnost se napínat a zase smršťovat (podrobně viz kap. 16.1).
3.2.2
Proteiny jako katalyzátory chemických reakcí – enzymy
Proteiny, které fungují jako biologické katalyzátory a urychlují chemické reakce, nazýváme enzymy. Naprostá většina metabolických procesů v buňce vyžaduje enzymovou katalýzu a enzymy katalyzují více než 5000 typů biochemických reakcí. Samotné 30
Proteiny a jejich funkce navázání enzymu na jinou molekulu nestačí, je potřeba zprostředkovat reakci, která umožňuje vytvářet či rušit kovalentní vazby v substrátu (molekule, která do reakce vstupuje) za vzniku produktu (chemicky modifikovaný výstup reakce). Bez enzymatické katalýzy by tato proměna substrátu na produkt nikdy neproběhla nebo by proběhla za dlouhou dobu. Enzymy stejně jako všechny chemické katalyzátory snižují aktivační energii a tím reakci urychlují. Molekula enzymu se vlastní reakcí nemění, ačkoli jeho aktivita může být ovlivněna jinými molekulami: aktivátory (zvyšujícími aktivitu enzymů) a inhibitory (snižujícími aktivitu enzymů). I když jsou enzymy hlavními katalyzátory chemických reakcí v živých systémech, nejsou jediné. Existuje ještě malý počet biologických katalyzátorů na bázi RNA, známých jako ribozymy (např. při katalýze sestřihu RNA), které působí samostatně nebo v komplexu s proteiny. Enzymy se nejčastěji klasifikují do tříd podle typu reakce, kterou katalyzují (tab. 3.1). Název enzymu je potom odvozen od jeho substrátu nebo chemické reakce, kterou katalyzuje, přičemž vždy končí na -áza (laktáza, alkoholdehydrogenáza, DNA-polymeráza). Různé enzymy, které katalyzují stejnou chemickou reakci, se nazývají izoenzymy. Specificita enzymů k jejich substrátu vyplývá z jejich jedinečné trojrozměrné struktury. Obvykle jsou enzymy proteiny globulární struktury o mnohem větší velikosti, než jsou jejich substráty. Každý enzym má katalytické místo, kde probíhá katalytická reakce, a místo, kam se váže substrát. Katalytickou aktivitu enzymu určuje konkrétní sekvence aminokyselin, obvykle asi dvě až čtyři aminokyseliny. Toto katalytické místo se nachází vedle jednoho nebo více vazebných míst, na které se váže substrát. Katalytické místo a vazebné místo společně tvoří aktivní místo enzymu. Prvním krokem enzymatické katalýzy je navázaní substrátu. Při vazbě substrátu vzniká komplex enzym-substrát. Tab. 3.1 Rozdělení enzymů Klasifikace
Katalyzovaná reakce
Typ reakce
Enzymy
oxidoreduktázy
katalýza oxido/redukčních reakcí, přenos atomů H a O a elektronů z jedné molekuly na druhou
AH + B → A + BH (redukce) A + O → AO (oxidace)
dehydrogenáza, oxidáza
transferázy
přenos funkčních skupin (např. metyl-, acyl-, fosfo-) z jedné molekuly na druhou
AB + C → A + BC
transamináza, kináza
hydrolázy
hydrolýza molekuly za vzniku dvou produktů
AB + H2O → AOH + BH
lipáza, amyláza, peptidáza
lyázy
nehydrolytické přidání nebo RCOCOOH → RCOH + CO2 odstranění skupin ze substrátu nebo [X – A – B – Y] → štěpením vazeb C-C, C-N, C-O [A = B + X – Y] nebo C-S
izomerázy
intramolekulární přeskupení, např. izomerace
AB → BA
izomeráza, mutáza
ligázy
spojení dvou molekul pomocí vytvoření nových vazeb C-O, C-S, C-N nebo C-C za současného štěpení ATP
X + Y + ATP → XY + ADP + Pi
syntáza
dekarboxyláza
ADP – adenozindifosfát, ATP – adenozintrifosfát, Pi – volný fosfát
31
3
3
Lékařská biologie Specifičnost enzymů vysvětlil Emil Fisher v roce 1894 pomocí modelu „zámku a klíče“, kdy enzym i substrát do sebe zapadají díky komplementaritě svých prostorových uspořádání (obr. 3.9). Některé enzymy vyžadují ke své aktivitě navázání nebílkovinných molekul zvaných kofaktory. Kofaktory mohou být různé chemické povahy. Anorganické kofaktory jsou například ionty kovů (železo a měď) a slouží ke stabilizaci substrátu. Organické kofaktory (např. flavin a hem) mohou být buď koenzymy (během reakce se uvolňují z aktivního místa enzymu), nebo prostetické skupiny (jsou pevně vázány na enzym). Některé koenzymy jsou odvozeny od vitaminů a organismus je neumí syntetizovat de novo. Rychlost enzymových reakcí lze snížit jejich inhibicí a molekuly zodpovědné za tuto inhibici se nazývají inhibitory. Existuje několik typů inhibitorů. Kompetitivní inhibitor se strukturou podobá substrátu a soutěží (kompetují) se substrátem o aktivní místo enzymu. Kompetitivní inhibice se dá překonat vysokou koncentrací substrátu. Příkladem může být kompetitivní inhibice molekul etanolu a metanolu jako substrátů. Nekompetitivní inhibitor se váže na jiné místo enzymu než substrát. Substrát se tedy může vázat na enzym se svou obvyklou afinitou. Inhibitor však snižuje katalytickou účinnost enzymu. Na rozdíl od kompetitivní inhibice nelze nekompetitivní inhibici překonat vysokou koncentrací substrátu. Ireverzibilní inhibitor (také enzymový jed) trvale inaktivuje enzym tím, že ho chemicky modifikuje nebo se na něj kovalentně naváže. Příkladem takové inhibice je lék Aspirin, tj. kyselina acetylsalicylová a její vazba na cyklooxygenázu 1. Nemoci způsobené nefunkčností enzymů se nazývají enzymopatie, které se v případě řady enzymů projevují jako vrozené metabolické vady. Typickým příkladem takové choroby je fenylketonurie, jejíž příčinou je inaktivační mutace v genu pro fenylalaninhydroxylázu, která u zdravých jedinců metabolizuje fenylalanin na tyrozin.
enzym + substrát
enzym–substrát komplex
enzym + produkty
maltóza
glukóza glukóza
aktivní místo 1
Obr. 3.9 Model „zámku a klíče“ 32
2
3
Proteiny a jejich funkce
3.2.3
Proteiny jako informační molekuly – receptory a signální mediátory
Mezi klíčové funkce proteinů patří regulace buněčných procesů cestou vnitrobuněčné, a především mezibuněčné komunikace. Díky komunikaci získávají buňky informace ze svého okolí, což je v rámci mnohobuněčného organismu klíčové pro zabezpečení jeho integrity a homeostázy. Proteiny hrají v rámci buněčné signalizace obě role: mohou být signálními molekulami (např. hormony nebo růstové faktory), ale také molekulami signál přijímajícími, což jsou receptory (např. membránové nebo jaderné receptory). Principy buněčné komunikace je detailně popsány v kapitole 12.
3.2.4
Proteiny a jejich význam v imunitním systému
Proteiny mají zcela zásadní význam také ve fungování imunitního systému. Kromě řady cytokinů, receptorů a regulačních molekul imunitní odpovědi jde především o proteiny, které mají charakter protilátek neboli imunoglobulinů (Ig) rozpoznávajících a vázajících antigen. Popis funkce a role protilátek v imunitním systému naleznete v kapitole 23, zde se proto zaměříme pouze na strukturní popis molekuly imunoglobulinu a významu jeho jednotlivých částí. Imunoglobuliny jsou velké proteiny se strukturou ve tvaru písmene Y (obr. 3.10), které jsou tvořeny B-lymfocyty a imunitní systém je používá k rozpoznání a neutralizaci vnějších a nebezpečných objektů, jako jsou patogenní bakterie nebo viry. Cíle, které protilátky rozpoznávají, jsou jedinečné molekuly odvozené z těchto patogenů a označujeme je jako antigeny. Variabilní oblasti molekuly imunoglobulinu představují tzv. paratop (obdoba zámku), který je specifický pro jeden konkrétní epitop vazba antigenu
Fab
-S-S-
-S-S-
lehký řetězec -S-S-S-S-
těžký řetězec
Fc variabilní oblast konstantní oblast
Obr. 3.10 Molekula imunoglobulinu Fab fragment – fragment vázající antigen (antigen-binding fragment), Fc fragment – krystalizující fragment (fragment crystallizable) – část imunoglobulinu, kterou interaguje s buňkami, které mají příslušné receptory
33
3
3
Lékařská biologie (obdoba klíče) neboli strukturní motiv antigenu, což umožňuje přesné a komplementární spojení těchto dvou struktur. Daný vazebný mechanismus využívají protilátky na označení patogenu nebo infikované buňky. Toto označení vede k jejich rozpoznání dalšími složkami imunitního systému, případně může dojít přímo k jejich neutralizaci (např. zablokováním části viru, která je nezbytná pro infekci hostitelské buňky). Kon stantní oblast v molekule protilátky obsahuje místa, která se podílejí na interakcích s dalšími složkami imunitního systému. Každá molekula imunoglobulinu je složena ze dvou identických lehkých a ze dvou těžkých řetězců, to znamená, že obě vazebná místa pro antigen jsou identická. V dnešní medicíně mají protilátky široké uplatnění, a to jak v diagnostice, tak v léčbě. Používají se například v klinické imunologii, v terapii onemocnění, jako jsou například nádorová onemocnění, revmatická onemocnění nebo autoimunitní choroby (tzv. imunoterapie či cílená léčba). Využívají se rovněž v diagnostických testech určených k průkazu původců infekčních onemocnění, hormonů či toxinů. V humánní medicíně jsou používány například v testech na virovou hepatitidu, syndrom získané imunodeficience (acquired immunodeficiency syndrome – AIDS) nebo v těhotenských testech na přítomnost lidského choriového gonadotropinu (human chorionic gonadotropin – hCG). Tento výčet představuje pouze několik vybraných příkladů. Protilátky se intenzivně využívají i v biomedicínském výzkumu. Základní metoda výroby monoklonálních protilátek je popsána v boxu 1. BOX 1 VÝROBA PROTILÁTEK Monoklonální protilátky (monoclonal antibodies – MAb) jsou chemicky identické imunoglobuliny, které pocházejí z jediného klonu B-lymfocytu a sdílejí schopnost specificky vázat konkrétní epitop. B-lymfocyty však mají omezenou životnost a se lhává u nich klasická kultivace in vitro, a tím i možnost kontinuální produkce uvol ňované protilátky. S řešením tohoto problému přišli Köhler a Milstein, kteří v roce 1975 zavedli do praxe hybridomovou technologii. Prvním krokem této metody je imunizace zvířete, kdy dochází ke kontaktu lymfocytů s antigenem, proti němuž mají být protilátky namířeny. Běžně je antigen opakovaně injektován do myši, dokud není dosaženo požadované imunitní odpovědi. Po úspěšné imunizaci je myš usmrcena a asepticky je jí odebrána slezina. Buňky sleziny jsou nejčastějším zdrojem B-lymfo cytů. Podstatou hybridomové technologie je následně vytvoření hybridní linie vzniklé fúzí nádorových myelomových buněk a B-lymfocytů produkujících protilátky. Vzniklý hybridom získává potřebné vlastnosti rodičovských buněk – disponuje neomezeným replikačním potenciálem nádorové buňky a produkuje monoklonální protilátky se shodnou specificitou, jakou měl původní B-lymfocyt. Po fúzi s myelomovou linií se v médiu nachází kromě hybridomových buněk i nefúzované buňky, které je třeba eli minovat pomocí selekčního kultivačního média HAT. Následně se získané hybridomy velmi rychle množí za vzniku velkého množství klonů. Část buněčné populace ovšem nemusí produkovat protilátky. Nyní je potřeba spolehlivá identifikace a selekce klonů produkujících protilátky pomocí některé z běžně používaných metod, např. enzy mové imunoanalýzy (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA). Screening se běžně provádí co nejdříve po fúzi, což umožní rychlé klonování hybridomů. K odlišení 34
Proteiny a jejich funkce a klonování jednotlivých hybridomů produkujících monoklonální protilátky se nej častěji používá metoda limitního ředění, kdy do mikrotitrační destičky naředíme sus penzi hybridomů tak, že na jednu jamku v destičce připadá pouze jedna hybridomová buňka, která je následně pomnožena. Tím je docíleno monoklonality produkovaných protilátek každým klonem. buňky myelomu
B-buňky imunizace laboratorního zvířete antigenem
antigen
screening
+ HAT selekce
fúze
hybridomová linie
monoklonální protilátky
hybridomové klony produkující protilátky
screening a selekce hybridomů
HAT – kultivační médium obsahující hypoxantin, aminopterin a tymin
3.2.5
Proteiny jako infekční agens – priony
Nervové buňky savců obsahují tzv. prionové proteiny (PrP, případně PrPC pro normální buněčný protein), které se podílejí na správné funkci a výkonnosti dlouhodobé paměti. Prion PrPSC (prionový protein spojený se scrapií) představuje vadnou formu tohoto normálního proteinu, od kterého se odlišuje rozdílnou konformací (prostorovým uspořádáním). Důsledkem této změny konformace je mimořádná odolnost vůči různým fyzikálním vlivům, prakticky absolutní odolnost proti štěpným enzymům odklízejícím vadné proteiny a především schopnost navazovat se na zdravé formy prionových proteinů a konvertovat je na svoji vadnou formu (obr. 3.11). Následkem je pak to, že se v buňce hromadí rostoucí shluky propojených vadných molekul prionových proteinů, kterých se buňka nedokáže zbavit, posléze je jimi zcela zaplněna a uhyne. Prionovou teorii formuloval profesor Stanley B. Prusiner v roce 1982. Ten také poprvé použil slovo prion (odvozeno ze slov proteinaceous a infectious). Prionovou teorii Prusiner formuloval v souvislosti s hledáním původce Creutzfeldtovy-Jakobovy choroby. Do objevu prionů bylo všeobecně akceptováno, že infekční nemoci může způsobovat pouze infekční organismus obsahující nukleovou kyselinu nesoucí genetickou informaci. Prion ovšem žádnou nukleovou kyselinu neobsahuje, je to protein, který se „rozmnožuje“ tím, že mění podobné proteiny v organismu. V roce 1997 dostal Stanley B. Prusiner za prionovou teorii Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu. 35
3
3
Lékařská biologie abnormální prionový protein
smrt neuronu
normální prionový protein
oligomerizace (infekční forma)
vláknitá forma
Obr. 3.11 Proměna proteinu na jeho infekční formu
36
Funkční anatomie eukaryotické buňky
4
Funkční anatomie eukaryotické buňky Kateřina Cetkovská
4.1
Srovnání anatomie eukaryotické a prokaryotické buňky
Buňka je považována za základní jednotku života schopnou se reprodukovat, získávat a využívat energii, reagovat na podněty a pohybovat se – což jsou společné vlastnosti všech živých organismů. Všechny buňky mají stejný funkční a anatomický základ. Dědičná informace, která definuje daný druh, je uložena v molekule DNA, která se u všech organismů replikuje stejným mechanismem – a stejným mechanismem jsou podle této informace tvořeny proteiny. Všechny buňky jsou také ohraničené cytoplazmatickou membránou, která musí být selektivně propustná a je klíčová pro komunikaci buňky s okolím a pro výdej a příjem látek. Většina organismů na Zemi je tvořena jednoduššími prokaryotickými buňkami (viz strom života – obr. 4.1). Jako prokaryota se původně označovaly bakterie obecně, dnes prokaryota dělíme na dvě říše – eubakterie (pravé bakterie) a archebakterie (archea). Většina medicínsky významných bakterií jsou eubakterie, proto se archebakteriemi zabývat nebudeme. Ty se obvykle nacházejí v prostředí nepříznivém pro ostatní buňky, často připomínajícím podmínky na Zemi v době, kdy se ještě před uvolněním kyslíku do atmosféry vyvinuly první živé organismy. Bakterie jsou typicky jednobuněčné organismy kulovitého, tyčinkovitého nebo spirálovitého tvaru žijící obvykle samostatně, ale mohou být i volně organizované do bacteria (pravé bakterie)
archaea (archebakterie) Sulfolobus
sinice
Thermofilum
Bacillus E. coli
eucarya (eukaryota)
organismy z hlubokých chladných moří Methanobacterium (hovězí bachor)
člověk kukuřice
Paramecium
Haloferax
organismy horkých pramenů
Dictyostelium
Methanococcus
Euglena
Thermomicrobium Aquiflex (horké prameny)
kvasinka
Trypanosoma společná prabuňka
Giardia Trichomonas
anaerobní, bez mitochondrií
Obr. 4.1 Strom života: Dendrogram znázorňuje strom života neboli evoluci biologických druhů na Zemi (fylogenezi). Tři hlavní domény života na Zemi jsou rozděleny na základě porovnání nukleotidové sekvence kódující ribozomální RNA (rRNA). Vzdálenost mezi vybranými druhy znázorněnými ve fylogenetickém stromu představuje počet změn v genech pro rRNA, které se udály v každé vývojové linii během evoluce. Eukaryotické organismy se oddělily jako vedlejší větev archebakterií, a ty jsou tedy bližší eukaryotické buňce než pravé bakterie. (upraveno podle Alberts B. Základy buněčné biologie: úvod do molekulární biologie buňky, 2004) 37
4
4
Lékařská biologie prokaryotická buňka (bakterie) ribozomy
eukaryotická buňka (živočišná)
nukleoid (bakteriální chromozom)
jádro drsné endoplazmatické retikulum
jaderný pór jaderný obal chromatin jadérko
centrioly centrozomy ribozomy
hladké endoplazmatické retikulum
pouzdro buněčná stěna
lyzozomy
cytosol
mitochondrie
plazmatická membrána
plazmatická membrána
cytoplazma
pili (řasinky)
cilium (řasinka) Golgiho aparát
transportní váček
Obr. 4.2 Srovnání obecné struktury prokaryotické a eukaryotické buňky (při dodržení jednotného měřítka by prokaryotická buňka byla velká přibližně jako mitochondrie) kolonií. Bakteriální buňka je menší než eukaryotická – měří jednotky µm (průměrná lidská buňka desítky µm) a má také mnohem jednodušší stavbu (obr. 4.2). Přestože bakterie jsou svým tvarem a strukturou poměrně omezené, představují po chemické stránce mnohem rozmanitější třídu buněk než eukaryota. Vyskytují se i v extrémních prostředích neobyvatelných pro jiné organismy, mohou být aerobní i anaerobní, jako zdroj energie jsou schopné využít prakticky veškerý organický materiál a existují dokonce i bakterie žijící pouze na anorganických látkách. Nejzásadnější rozdíl v porovnání s eukaryotickou buňkou spočívá v absenci vnitřních membránových struktur. V cytoplazmě volně plave bakteriální chromozom neboli nukleoid. Mohou být přítomny i malé kruhové molekuly DNA – plazmidy, které neobsahují životně důležité geny, ale mohou nést například geny zodpovědné za patogenitu bakterie nebo za její rezistenci k antibiotikům. Bakteriální genom je podrobněji popsán v kapitole 5.4. Dále se tam nacházejí inkluze (rezervní či odpadní látky), ribozomy a různé proteiny a enzymy. Ribozomy jsou menší než eukaryotické (sedimentační konstanta je 70S, zatímco u eukaryot 80S). Přestože enzymatické procesy, jako je například replikace DNA, transkripce genetické informace a translace, fungují na stejném principu jako u eukaryot, prokaryotické enzymy zprostředkovávající tyto procesy se liší od těch eukaryotických. Bakterie mají také vlastní „nepravý“ cytoskelet, který je tvořen proteiny podobnými těm, které tvoří eukaryotický cytoskelet. Je důležitý pro tvar buňky a dělení, ale i komunikaci s okolím. Většina bakterií má na povrchu buněčnou stěnu tvořenou peptidoglykanem. Na základě složení se buněčná stěna barví odlišně krystalovou violetí při tzv. Gramově barvení, pomocí kterého můžeme rozlišit bakterie na gram-pozitivní a gram-nega tivní. Buněčná stěna gram-pozitivních bakterií obsahuje tlustou vrstvu peptidoglykanu (20–80 nm), zatímco u bakterií gram-negativních je peptidoglykanová vrstva mnohem tenčí (5–10 nm) a nachází se nad ní ještě jedna lipidová dvojvrstva. Tato vnější 38
Funkční anatomie eukaryotické buňky gram-pozitivní bakterie buněčná stěna
zesíťovaný peptidoglykan
plazmatická membrána (lipidová dvojvrstva)
integrální protein
gram-negativní bakterie
lipopolysacharid lipid A
vnější membrána
porin lipoprotein
peptidoglykan periplazmatický prostor cytoplazmatická membrána
Obr. 4.3 Stavba buněčné stěny gram-pozitivních a gram-negativních bakterií membrána je bohatá na lipopolysacharidy, které se po rozpadu bakterie uvolňují jako tzv. endotoxiny a vyvolávají často silnou imunitní reakci. Srovnání stavby gram-pozitivních a gram-negativních bakterií je znázorněno na obrázku 4.3. Peptidoglykanová buněčná stěna se vyskytuje pouze u bakterií, je to tedy vhodný a častý cíl antibiotické léčby (box 1). BOX 1 INHIBITORY SYNTÉZY BUNĚČNÉ STĚNY Antibiotika jsou látky původně produkované některými mikroorganismy s cílem usmr tit nebo potlačit růst jiných mikroorganismů. Antibiotika tedy převážně působí jen na prokaryotické buňky (některá jsou účinná i proti houbám a parazitickým prvokům). Zasahují obvykle strukturu prokaryotických buněk (nejčastěji buněčnou stěnu) nebo jejich metabolismus (např. bakteriální RNA-polymerázu, DNA-gyrázu či ribozomální podjednotky, čímž znemožňují bakteriím se dělit nebo tvořit proteiny). Velká skupina antibiotik funguje jako inhibitory blokující syntézu buněčné stěny. Říká se jim beta-laktamová antibiotika v souvislosti s přítomností beta-laktamového kruhu v jejich struktuře. Patří mezi ně například peniciliny (první objevená skupina antibiotik) anebo cefalosporiny. Mechanismus účinku spočívá v inhibici enzymu PBP (penicilin-binding protein), který katalyzuje finální krok v syntéze peptidoglykanu. 39
4
4
Lékařská biologie Účinkují tedy především proti gram-pozitivním bakteriím, u kterých je peptidoglykan svrchní a primární složkou buněčné stěny. Některé bakterie nesou na svém chromozomu gen pro enzym beta-laktamázu, který beta-laktamový kruh rozkládá. Tyto kmeny jsou vůči beta-laktamovým antibio tikům přirozeně rezistentní. Během masivního rozvoje používání antibiotik se vlivem selekčního tlaku objevily kmeny, které rezistenci získaly s plazmidem nesoucím gen pro beta-laktamázu. Další kmeny si vyvinuly rezistenci změnou struktury proteinu PBP. Na změněný PBP se již beta-laktamová antibiotika nedokážou vázat, a tak neúčinkují. Mezi nejvýznamnější příklady patří meticilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA) a penicilin rezistentní Streptococcus pneumoniae. Dnes se většina antibiotik vyrábí syn teticky. Byla vyvinuta rovněž beta-laktamová antibiotika účinná proti gram-negativním bakteriím i taková, která jsou odolná vůči účinkům beta-laktamázy.
Mnoho bakterií má na povrchu ještě další ochrannou vrstvu z polysacharidů a glykoproteinů, tzv. kapsulu (pouzdro, bakteriální glykokalyx). Její funkcí je dále zpevňovat povrch bakterií a také se lépe přichytit k substrátu – bakterie s kapsulou jsou tedy obvykle více patogenní. Na povrchu bakterií se mohou vyskytovat také bičíky a řasinky (pili, rovněž zvané fimbrie). Bičíky jsou struktury ukotvené v membráně a slouží k pohybu. Stavbou se však zcela liší od bičíků eukaryot – ty jsou tvořeny mikrotubuly, jak uvidíme dále v této kapitole. Bakteriální bičík je tvořen proteinem flagelinem a pohybuje se rotačním pohybem. Pili (někdy rovněž zvané pilusy) jsou kratší a tužší než bičíky a bakterie je využívají k přichycení na podklad. Specializované sexuální pilusy (F pilusy) pak slouží k horizontálnímu přenosu DNA (mezi dvěma bakteriálními buňkami). Mechanismům přenosu DNA u bakterií je věnována kapitola 5.4. Eukaryotické buňky se na Zemi objevily zhruba před dvěma miliardami let. Předpokládá se, že postupnou invaginací cytoplazmatické membrány došlo k uzavření genetické informace do jádra a postupně vznikaly i další membránové organely. Podle endosymbiotické teorie některé organely vznikly pohlcením prokaryotické buňky schopné oxidační fosforylace primitivní buňkou eukaryotickou. Tato buňka pohlcený
plazmatická membrána DNA cytoplazma
mitochondrie
pohlcení aerobní heterotrofní prokaryotické buňky endoplazmatické retikulum jádro
ancestrální heterotrofní eukaryotická buňka
čas
čas
čas ancestrální prokaryotická buňka vchlipování plazmatické membrány
mitochondrie jaderný obal buňka s jádrem a vnitřním membránovým systémem
plastid (chloroplast) pohlcení ancestrální fotosyntetizující fotosyntetizující prokaryotické buňky eukraryotická buňka
Obr. 4.4 Pravděpodobný původ některých organel (upraveno podle Reece BJ et al. Camp bell Biology, 2010) 40
Funkční anatomie eukaryotické buňky prokaryotický organismus nestrávila, ale časem se ustavila tzv. endosymbióza, která byla výhodná pro obě buňky (obr. 4.4). Pohlcená prokaryotická buňka produkovala pro primitivní eukaryotickou buňku mnohem efektivněji energii za spotřeby kyslíku, což bylo se vzrůstající koncentrací kyslíku v atmosféře výhodné. Eukaryotická buňka zase poskytovala ochranu. Tato teorie vysvětluje původ mitochondrií a chloroplastů a nasvědčuje tomu i fakt, že obě organely mají vlastní genetickou informaci ve formě kruhové DNA, vlastní ribozomy podobné prokaryotickým a jsou semiautonomní, mohou tedy replikovat svoji genetickou informaci nezávisle na jaderné DNA a samy si také mohou tvořit vlastní proteiny. Kompartmentalizace buňky a membránou ohraničené organely umožňují eukaryotické buňce vykonávat složitější procesy – zajišťují totiž optimální prostředí pro různé biochemické reakce (mikroprostředí pro enzymy, kofaktory a substráty, koncentrace látek, pH apod.) a také umožňují separovat nebezpečné reakce (např. různé proteolytické nebo oxidační enzymy). Eukaryotické buňky se mohou výrazně lišit co do velikosti i struktury podle daného druhu organismu (rostliny, houby, živočichové, prvoci…), ale liší se i buňky různých tkání v rámci jednoho organismu. I v lidském těle najdeme mnoho typů různých buněk lišících se velikostí a strukturou.
4.2
Membránový systém buňky
Již bylo zmíněno, že jedním ze strukturních základů buněk je membrána. Buněčné membrány a jejich složky jsou klíčové nejen pro samotnou separaci buňky od okolního prostředí a separaci jednotlivých organel v cytoplazmě, ale podílí se i na regulaci příjmu a výdeje látek, detekci signálu z vnějšího okolí buňky a na buněčných adhe zích – soudržnosti buněk v jednotlivých tkáních (obr. 4.5).
4.2.1
Složení a vlastnosti membrán
Membrány všech buněk mají společnou základní strukturu – tenká vrstva lipidových a proteinových molekul držená pohromadě především nekovalentními vazbami. Membrána tak není pevnou ani rigidní strukturou – naopak, je to dynamická a fluidní (tekutá) struktura, ve které se jednotlivé molekuly pohybují a přeskupují (obr. 4.6). Základní stavební jednotkou membrán jsou molekuly lipidů tvořící dvojvrstvu. Jedná se o fosfolipidy, steroly a glykolipidy (obr. 4.7). Lipidy zaujímají zhruba 50 % hmoty membrány živočišných buněk, dalších 50 % je tvořeno proteiny. Membránové lipidy jsou amfipatické (amfifilní), což znamená, že obsahují jak hydrofilní (polární) část, tak i hydrofobní (nepolární) část. Nejčastějšími typy lipidů v membráně jsou fosfolipidy. Jejich hydrofobní část je tvořena dvěma řetězci mastných kyselin a hydrofilní část polární „hlavičkou“, která je spojena se zbytkem molekuly přes fosfátovou skupinu. Délka a nasycenost mastných kyselin, stejně tak jako složení polární hlavičky, ovlivňuje vlastnosti fosfolipidů. Na základě polární části rozlišujeme v savčích membránách čtyři hlavní typy fosfolipidů – fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylcholin a sfingomyelin. Dalšími lipidy v membráně jsou steroly. V membránách živočišných buněk je to cholesterol – rigidní molekula, která se vmezeřuje mezi molekuly fosfolipidů a přispívá 41
4
4
Lékařská biologie Na+ ohraničení buňky od okolí a selektivní propustnost
spojení a komunikace s ostatními buňkami a s okolím
ohraničení a organizace jednotlivých organel
jádro
Na+
K+
regulace výměny látek mezi buňkou a okolím živiny příjem signálu z okolí
Obr. 4.5 Funkce cytoplazmatické membrány hydrofilní hlavička fosfolipidů hydrofobní konce fosfolipidových molekul
molekula fosfolipidu
cukerný zbytek glykoprotein
extracelulární prostor
glykolipid
cholesterol
membránový protein membránový protein (transportní kanál)
povrchový protein cytoskeletální vlákna
Obr. 4.6 Obecná struktura cytoplazmatické membrány 42
transmembránový protein se strukturou alfa-helixu
cytoplazma
Funkční anatomie eukaryotické buňky NH3 H
C
serinfosfát
COO
CH2 P
O
galaktóza Gal
OH -OH skupina
CH
O
O
C
O C
uhlovodíkový konec
uhlovodíkový konec
O CH2
OH CH3
CH2
CH3 CH3 CH
O
CH2 CH2 CH2 CH CH3 CH3
fosfatidylserin (fosfolipid)
cholesterol (sterol)
O
CH
CH
CH
NH
CH
C uhlovodíkový konec
O
uhlovodíkový konec
O
CH2 O
galaktocerebrosid (glykolipid)
Obr. 4.7 Tři hlavní typy lipidů tvořící membrány živočišných buněk – polární (hydrofilní) část je vyznačena šedě OH
polární hlavička fosfolipidu
polární část CH3 CH3 CH
část zpevněná molekulou cholesterolu
rigidní steroidní část CH3
tekutější část
CH2 CH2 CH2 CH CH3
CH3
nepolární (hydrofobní) část
Obr. 4.8 Cholesterol v savčích membránách tak ke snížení fluidity membrány (obr. 4.8). Dále pak glykolipidy, které mají v místě polární hlavičky cukerný zbytek. Mezi hlavní glykolipidy živočišných membrán patří galaktocerebrosidy. Glykolipidy jsou společně s membránovými glykoproteiny velmi důležité při tvorbě ochranného pláště sacharidů obklopujícího většinu živočišných buněk. Tento plášť se nazývá glykokalyx. Glykolipidy mají také důležitou úlohu při buněčných adhezích. Tvar a amfipatická povaha fosfolipidů způsobuje, že se ve vodném prostředí spontánně skládají do dvojvrstvy – hydrofobními konci dovnitř a hydrofilními hlavičkami 43
4
4
Lékařská biologie
voda
micela
planární fosfolipidová dvojvrstva ve vodném prostředí
lipidová dvojvrstva
spontánní energeticky výhodné uspořádání do lipozomu
B
lipozom
laterální difuze
překlápění (flip-flop)
ohýbání
A
voda
rotace
C
Obr. 4.9 Chování amfipatických molekul fosfolipidů ve vodném prostředí: A – amfipatické molekuly se ve vodném prostředí spontánně organizují na základě svého tvaru do micel nebo do lipozomů B – schematické znázornění spontánního uzavírání fosfolipidové dvojvrstvy do váčku – lipozomu C – typy pohybů fosfolipidů v membráně ven směrem do vodného prostředí. Pokud by se fosfolipidová dvojvrstva nacházela ve formě listu, volná rozhraní by byla velmi energeticky nevýhodná, a proto se ve vodném prostředí automaticky formují v samozacelovací váčky – lipozomy (obr. 4.9A, B).
Tekutost membrán Vodné prostředí uvnitř a mimo buňky sice znemožňuje lipidům membránu opustit, ale nebrání ve volném pohybů lipidů v rámci membrány. Membrána se proto chová jako dvojrozměrná tekutina, kde se jednotlivé molekuly mohou různě přesouvat, což je velice důležité pro funkci membrány. Tato tekutost umožňuje rychlý přesun lipidů 44
Funkční anatomie eukaryotické buňky a proteinů v membráně z jednoho místa na jiné, rovnoměrné rozmístění membránových molekul mezi dceřiné buňky při dělení a také vzájemnou fúzi membrán například při oplození. Fúze membrán se také využívá ve farmakologii při doručení léčivého přípravku do buněk, kdy je léčivo zabaleno do lipozomů (např. vakcíny, genová terapie, ale i některé minerály a jiné). Možnost rychlé difuze a vzájemné interakce je rovněž velmi důležitá pro membránové proteiny při buněčné signalizaci (viz kap. 12). Některé druhy pohybu membránových molekul jsou poměrně vzácné, zatímco jiné probíhají velice často. Například k překlápění fosfolipidů z jedné vrstvy do druhé (tzv. flip-flop) dochází za fyziologických podmínek velmi zřídka, zatímco rotace lipidových molekul kolem své osy nebo přeskupování v rámci jedné vrstvy se děje často (obr. 4.9C). Stupeň tekutosti membrány, tedy to, jak snadno se mohou molekuly lipidů v rámci membrány při dané teplotě pohybovat, závisí na konkrétním složení, především na povaze uhlovodíkových řetězců tvořících hydrofobní část – čím delší a více nenasycený (tedy obsahující více dvojných vazeb) je řetězec, tím viskóznější a více tekutá je membrána. Nejčastější jsou řetězce s 18–20 atomy uhlíku, přičemž jeden z řetězců bývá zpravidla nasycený a druhý obsahuje 2–3 dvojné vazby. V buňkách, které se musí často přizpůsobovat měnícím se teplotním podmínkám (např. bakterie nebo kvasinky), se složení i délky řetězců neustále upravují, aby mohla být zachována stejná míra tekutosti. V živočišných buňkách je tekutost regulována především pomocí cholesterolu, který vyplňuje mezery mezi jednotlivými fosfolipidy a membránu zpevňuje a činí ji méně tekutou a propustnou.
Asymetrie membrán Složení jednotlivých vrstev membrány je velice rozdílné – v lipidové vrstvě orientované do buňky nebo do organely najdeme jiné molekuly než ve vrstvě orientované směrem do okolí (obr. 4.10). Tato asymetrie je velmi důležitá z hlediska funkce membrány, především pro buněčnou signalizaci – při přenosu signálu z vnějšku dovnitř buňky fosfatidylcholin
sfingomyelin
glykolipid
EXTRACELULÁRNÍ PROSTOR
cholesterol fosfatidylserin
CYTOSOL fosfatidylinositol
fosfatidyletanolamin
Obr. 4.10 Asymetrie membrán – na vnitřní a vnější straně membrány se nacházejí rozdílné fosfolipidy 45
4
4
Lékařská biologie (signální transdukce; více viz kap. 12). Záleží na orientaci membránových proteinů sloužících jako receptory signálu a také na tom, že je signál často předáván dalším proteinům v cytoplazmě, z nichž některé se vážou na konkrétní molekuly fosfolipidů na vnitřní straně membrány. Asymetrie membrány je důležitá rovněž pro odlišení živých a mrtvých buněk – při apoptóze (programované buněčné smrti; viz kap. 15) dochází k překlopení fosfatidylserinů, které se normálně nacházejí ve vnitřní vrstvě membrány, do vnější vrstvy. Takto exponované fosfatidylseriny slouží jako signál pro makrofágy, které fagocytují apoptotickou buňku. K asymetrii membrán přispívají také glykolipidy, které se nacházejí výhradně ve vnější vrstvě membrány orientované do okolí. Již jsme zmínili, že se glykolipidy společně s glykoproteiny podílejí na tvorbě glykokalyxu. Ten je důležitý například pro epiteliální buňky, kde tvoří ochranný plášť proti nepříznivým podmínkám, jako je nízké pH nebo vysoká koncentrace různých hydrolytických enzymů. Protože oligosacharidy a polysacharidy absorbují vodu, vytváří glykokalyx na buňce slizovitý povrch. Ten je významný i pro pohyblivé buňky, jako například bílé krvinky, protože usnadňuje proklouzávání úzkými mezerami, kupříkladu mezi endoteliálními buňkami.
4.2.2
Membránové proteiny
Přestože je základní struktura membrány tvořena lipidy, většinu specifických funkcí membrány plní membránové proteiny. Každý typ buněčných membrán obsahuje jinou sadu proteinů odrážejících specifickou funkci dané buňky. Více než čtvrtinu lidských genů zaujímají právě geny pro membránové proteiny – jsou tedy velice důležité pro vykonávání mnoha buněčných funkcí. Mezi hlavní funkce membránových proteinů patří transport specifických látek (živin, iontů, metabolitů…), ukotvení buňky ke svému okolí, zachycení signálu a jeho převod do buňky (receptory), enzymatické funkce nebo funkce důležité pro imunitní systém (obr. 4.11). Membránové proteiny se podílejí rovněž na formování specifického tvaru buňky a na jejích mechanických vlastnostech – už víme, že buněčná membrána je sama o sobě velmi křehká a nestabilní polotekutá struktura. Většina buněčných membrán je proto zesílena a podpírána
EXTRACELULÁRNÍ PROSTOR transportní proteiny a kanály
receptory
A
Obr. 4.11 Různé funkce membránových proteinů 46
ukotvující proteiny
enzymy
B
CYTOSOL
Funkční anatomie eukaryotické buňky vnitřní sítí proteinů připojených k membráně přes transmembránové proteiny. Tato síť se nazývá buněčný kortex a je tvořena cytoskeletálními proteiny. Stejně jako některé membránové lipidy, tak i membránové proteiny mohou mít z vnější vrstvy cytoplazmatické membrány kovalentně vázaný cukr. Již jsme zmínili glykoproteiny podílející se na tvorbě glykokalyxu. Glykoproteiny na povrchu buněk jsou velice důležité i z hlediska vzájemného rozpoznávání buněk a při buněčných adhezích. Například proteiny zvané lektiny rozpoznávají specifické oligosacharidy glykoproteinů a glykolipidů a vážou se na ně. Lektiny se exprimují například na povrchu endotelových buněk (buněk ve stěnách cév) v místě počínající bakteriální infekce, což umožní rozpoznání a adhezi neutrofilů ke stěně cévy a následný průnik do infikované tkáně.
4.2.3
Přenos látek přes membrány
Každá buňka potřebuje přijímat a vylučovat různé látky (živiny, metabolity, signální molekuly, upravovat koncentrace iontů atd.). Z chemických vlastností lipidové dvojvrstvy je patrné, že membránou mohou volně procházet jen určité molekuly, které jsou buď velmi malé, nebo mají hydrofobní charakter. Například kyslík nebo oxid uhličitý mohou membránou volně difundovat, stejně jako malé nenabité polární molekuly, například voda nebo etanol. Naopak větší polární molekuly anebo ionty membránou neprojdou, a proto jsou pro jejich přenos přes membránu potřeba zvláštní transportní proteiny (obr. 4.12).
malé hydrofobní molekuly
O2 CO2 N2 benzen
malé nenabité polární molekuly
H2O glycerol etanol
větší nenabité polární molekuly
aminokyseliny glukóza nukleotidy
ionty
H+, Na+ HCO3−, K+ Ca2+, Cl− Mg2+ lipidová dvojvrstva
Obr. 4.12 Relativní propustnost (semipermeabilita) buněčné membrány 47
4
4
Lékařská biologie
Pasivní a aktivní transport Látky tedy mohou membránou procházet buď úplně volně (což se nazývá prostá difuze), anebo za pomocí přenašeče. Transport prostřednictvím přenašeč může být aktivní nebo pasivní podle toho, zda je k přenosu potřeba energie (ve formě ATP) (obr. 4.13A). Pasivní transport je poháněn koncentračním gradientem (pohyb molekul z místa o vyšší koncentraci do místa s nižší koncentrací) nebo elektrickými silami. Naopak aktivní transport vždy přenáší rozpuštěné látky proti chemickému nebo elektrickému gradientu. Živočišné buňky uskutečňují aktivní transport dvěma hlavními způsoby (obr. 4.13B): pomocí spřažených přenašečů, jež přenášejí jeden solut proti koncentračnímu spádu zároveň s dalším solutem, který jde po směru gradientu, nebo pomocí pump poháněných hydrolýzou ATP. Některé bakterie a archea umějí přenášet látky i pomocí pump poháněných světlem. Některé přenašeče tedy transportují pouze jediný typ solutu – uniport, zatímco jiné mohou přenášet dva typy látek, a to buď ve stejném směru – symport, nebo v opačném směru – antiport (obr. 4.13C). Tento spřažený transport umožňuje využití energie z transportu jedné látky po elektrochemickém gradientu pro transport druhé látky proti gradientu. Častou ko-transportovanou molekulou bývá například sodíkový kationt Na+, jehož koncentrace je výrazně vyšší vně buňky. Při proudění Na+ zpět do buňky pak může být využit jeho elektrochemický gradient jako hnací síla pro transport druhé látky. Na tomto principu funguje například příjem glukózy buňkami střevního epitelu (obr. 4.14). Na apikální straně je glukóza pumpována do buněk proti koncentračnímu gradientu pomocí symportu se sodíkem. Na bazální straně střevní výstelky pak glukóza prochází dále pasivním transportem přes různé glukózové přenašeče. Separace těchto dvou typů glukózových transportérů na správné straně membrány buněk střevního epitelu je zajištěna těsnými spoji, které navíc brání průniku látek paracelulární cestou (mezerami mezi jednotlivými buňkami). Těsné spoje jsou podrobněji popsány v kapitole 16.2. Stejně důležité jsou i antiporty poháněné sodíkem, například antiport Na+/H+, který využívá elektrochemický gradient sodíku pro pumpování H+ ven z buňky a je jedním z hlavních nástrojů, kterými buňka reguluje pH ve svém cytosolu. Aby byla hladina Na+ výrazně vyšší vně buňky, musí být aktivně pumpován ven z buňky. To se děje pomocí sodno-draselné pumpy (Na+/K+ pumpa), která za spotřeby ATP přenáší 3 Na+ oproti 2 K+ (obr. 4.15). Sodno-draselná pumpa se vyskytuje v membránách prakticky všech živočišných buněk a má zásadní úlohu v udržování vyšší koncentrace sodíku vně buňky a stejně tak v udržování vyšší koncentrace draslíku uvnitř buňky. Pomáhá tak udržovat osmotickou rovnováhu v buňkách. Buňky jsou ve tkáních obklopeny kapalinou bohatou na soluty, zvláště Na+ a Cl–. To vyvažuje koncentraci organických a anorganických solutů uvnitř buňky. Osmotická rovnováha je však stále ohrožena, protože se vnější soluty na základě elektrochemického gradientu neustále snaží proniknout do buňky. Osmózou pak dochází k proudění vody přes membránu za účelem vyrovnání koncentrace solutů na obou stranách membrány. Voda může difundovat membránou volně, ale tato difuze je velmi pomalá a neefektivní. Prakticky všechny buňky lidského těla mají ve svých membránách tzv. aquaporiny – speciální kanálky umožňující rychlý průchod vody přes membránu. Při vysokých koncentracích solutů uvnitř buňky tak buňka rychle nabobtná a zvětšuje svůj objem – musí tedy nechtěné soluty neustále odčerpávat, aby udržela osmotickou 48
Funkční anatomie eukaryotické buňky A
EXTRACELULÁRNÍ PROSTOR lipidová dvojvrstva
pasivní transport
aktivní transport
koncentrační gradient
prostá difuze
kanálem zprostředkovaná difuze
B
přenašečem zprostředkovaná energie difuze CYTOSOL
EXTRACELULÁRNÍ PROSTOR světlo
elektrochemický gradient P spřažený transport
ADP
pumpa poháněná světlem
ATP pumpa poháněná ATP
C
transportovaná molekula
lipidová dvojvrstva
CYTOSOL
symportovaný iont
EXTRACELULÁRNÍ PROSTOR lipidová dvojvrstva
antiportovaný iont UNIPORT
SYMPORT
ANTIPORT
CYTOSOL
spřažený transport
Obr. 4.13 Různé formy membránového transportu (upraveno podle Alberts B. Základy buněčné biologie: úvod do molekulární biologie buňky, 2004): A – prostá difuze, pasivní transport (usnadněná difuze), aktivní transport B – hlavní způsoby uskutečňování aktivního transportu (pumpy poháněné světlem se nacházejí pouze v buňkách některých bakterií) C – uniport a spřažený transport ADP – adenozindifosfát, ATP – adenozintrifosfát
rovnováhu. Typická živočišná buňka tak věnuje téměř třetinu své energie na pohánění Na+/K+ pumpy. V elektricky aktivních nervových buňkách to bývá ještě více, protože zde se Na+/K+ pumpa podílí i na šíření nervového vzruchu. Membránový potenciál je však generován především pohybem iontů K+ přes specifické iontové kanály. 49
4
4
Lékařská biologie
Na+ apikální povrch symport glukózy a Na+ laterální povrch
nízká koncentrace glukózy
střevní lumen
glukóza
těsný spoj Na+
vysoká koncentrace glukózy
glukóza střevní epitel
pasivní uniport glukózy
bazální povrch
extracelulární kapalina
glukóza
nízká koncentrace glukózy
Obr. 4.14 Přenos glukózy přes buňky střevního epitelu (upraveno podle Alberts B. Základy buněčné biologie: úvod do molekulární biologie buňky, 2004) EXTRACELULÁRNÍ PROSTOR lipidová dvojvrstva
3 Na+
elektrochemický gradient Na+
elektrochemický gradient K+ 2 K+
P ATP
CYTOSOL ADP
Obr. 4.15 Sodno-draselná pumpa: Za spotřeby adenozintrifosfátu (ATP) je Na+ čerpán ven z buňky a K+ do buňky, v obou případech proti gradientu elektrochemického potenciálu ADP – adenozindifosfát, ATP – adenozintrifosfát
Na podobném principu jako Na+/K+ pumpa funguje i Ca2+ pumpa, která udržuje v cytosolu nižší koncentraci iontů Ca2+ než v extracelulární kapalině. Pohyb Ca2+ je velmi důležitý i proto, že se Ca2+ může pevně vázat k různým proteinům a měnit jejich aktivitu. Přítoku Ca2+ do cytosolu se využívá například v různých signálních drahách nebo při kontrakci srdečního svalu. Kardiomyocyty vyměňují antiportem Ca2+ za Na+. Většina iontů Ca2+, které do buňky vstoupily během svalového stahu, je takto odčerpána ven, což umožní opětovné uvolnění svalu. Látek, které blokují aktivitu Na+/K+ pumpy, se tedy dá využít pro léčbu v kardiologii, protože antiport Ca2+ proti Na+ je po podání léčiva méně účinný a ionty Ca2+ jsou tedy z buněk odčerpávány pomaleji, což vede k déle trvající kontrakci srdečního svalu. 50