TSCB, 62

organismes model en biologia TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 62, 2011 Sobrecob biologia 62.indd 1

Organismes model en biologia

Montserrat Corominas i Marc Valls editors Il·lustració de la sobrecoberta

treballs de la societat catalana de biologia VOLUM 62, 2011

L’eriçó de mar és un animal molt emprat com a model en estudis de vitel·logènesi, cicle cel·lular i interacció ou-esperma. L’exemplar de la imatge pertany a l’espècie Echinus melo, de la costa de l’Alguer. (© Marco Busdraghi, Wikimedia Commons)

28/10/2011 10:35:56

organismes model en biologia TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 62, 2011 Sobrecob biologia 62.indd 1

Organismes model en biologia

Montserrat Corominas i Marc Valls editors Il·lustració de la sobrecoberta

treballs de la societat catalana de biologia VOLUM 62, 2011

L’eriçó de mar és un animal molt emprat com a model en estudis de vitel·logènesi, cicle cel·lular i interacció ou-esperma. L’exemplar de la imatge pertany a l’espècie Echinus melo, de la costa de l’Alguer. (© Marco Busdraghi, Wikimedia Commons)

28/10/2011 10:35:56

VOLUM 62, 2011

ÍNDEX

Organismes model en biologia Presentació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Corominas i M. Valls

7

Virus como modelo en biología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Domingo

9

El bacteriòfag lambda, un model de decisió genètica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Muniesa

19

Escherichia coli, un petit gran organisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. Balsalobre

31

Els llevats com a organisme model de recerca en biologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Ariño

45

Dictyostelium discoideum, una ameba peculiar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Galardi-Castilla i L. Sastre

61

La planta model Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Monte

79

Caenorhabditis elegans: una història fascinant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D. Dalfó Drosophila melanogaster com a organisme model: una font d’informació en recerca biomèdica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. Serras i J. Casanova

VOLUM 62, 2011

93 107

Filial de l’Institut d’Estudis Catalans

123

El petit amfiox: el miratge de l’origen dels vertebrats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Garcia-Fernàndez i È. Benito-Gutiérrez

131

El peix zebra com a sistema model per a l’estudi de malalties humanes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Durán i H. López-Schier

141

El pollet com a sistema model: les noves possibilitats d’un model clàssic . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. Pujades

155

El ratolí com a sistema model en biologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Merlos-Suárez

165

Models animals per a l’estudi de la diabetis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N. Roglans, M. Alegret i J. C. Laguna

179

Cob biologia 62.indd 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Organismes model en biologia

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 62, 2011

La regeneració i l’homeòstasi en les planàries, un model clàssic de biologia del desenvolupament . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. Cebrià, T. Adell, J. F. Abril i E. Saló

Organismes model en biologia

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

BARCELONA 2011

28/10/2011 10:36:47

Interior 59 Soc Cat Bio

2/3/2009

14:19

Página 1

NORMES DE PUBLICACIÓ DE TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Abast. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publica: a) monografies i revisions sobre temes de ciències de la vida encarregades per la Societat, i b) comunicacions presentades a les sessions ordinàries i extraordinàries organitzades per la Societat o les seves seccions especialitzades. Els temes poden ser proposats pels membres del Consell Directiu o per socis que desitgin ocupar-se de la preparació d’un volum de la revista fent d’editors. El Consell Directiu decideix si un tema és apropiat per dedicar-hi un volum de Treb. Soc. Cat. Biol. Idioma. Els originals seran redactats en català, excepte en casos justificats per als quals el Consell Directiu pugui acceptar una altra llengua. Lliurament dels originals. La submissió implicarà que el material és original i que no ha estat enviat, acceptat o publicat en cap altre lloc. Els originals els lliurarà l’editor del volum per correu electrònic (scb@iecat.net), adreçat al president del Consell de Redacció. Cal enviar els següents arxius, preferentment empaquetats amb ZIP: — Un arxiu únic en format RTF o MS Word anomenat Text_TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el text del volum, incloent-hi, en aquest ordre: coberta, índex, presentació, els capítols en l’ordre desitjat i les seves taules, si n’hi ha. Les pàgines hauran d’anar numerades consecutivament començant per la núm. 1, que serà la de la coberta. Tot el text serà escrit íntegrament amb Times New Roman de cos 12 amb interlineat d’1,5. L’arxiu amb el text no podrà contenir figures ni objectes incrustats. — Un arxiu per cada figura anomenat Figura_[número de figura]_[cognom del primer autor]. Les figures, si no contenen text (a part del peu), es poden remetre en qualsevol dels formats gràfics habituals (PNG, JPEG, TIFF); si contenen text, s’han d’enviar en un format que permeti editar-lo (EPS, PDF, Powerpoint). — Cal enviar també una còpia impresa electrònica en format PDF de tot el volum, anomenada TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el contingut, incloent-hi les figures. Aquest arxiu es farà servir com a text imprès de referència durant el procés de tractament del text. Per aquest motiu, els autors i l’editor han de tenir cura personalment que en aquesta còpia hi hagi tot el contingut imprès correctament, incloent-hi sobretot els símbols o caràcters especials, equacions, etc. Cada article o, en un volum monogràfic, cada capítol, incloent-hi la bibliografia, taules i figures, hauria de tenir una extensió entre quinze i vint fulls DIN A4, escrits amb el tipus, mida i interlineat esmentats abans. Només es podrà ultrapassar aquest límit amb l’acord previ del Consell de Redacció de Treballs de la SCB. Els volums monogràfics haurien de contenir un mínim d’uns deu capítols. El Consell de Redacció consultarà especialistes, els quals recomanaran si un article pot publicar-se immediatament, necessita revisió, o bé és rebutjat. Els autors rebran notificació de la decisió. Si el treball requereix revisió, es facilitaran als autors els comentaris escrits dels especialistes que l’hagin revisat. Estructura dels originals. Els originals que no s’ajustin a aquestes instruccions seran retornats als autors perquè els modifiquin abans de la seva tramitació. Dintre de cada capítol o article se seguirà el següent ordre pel que fa als diferents components:

— Títol, escrit en majúscules i negreta. — Nom i primer cognom de l’autor. Si n’hi ha més d’un, els seus noms aniran separats amb una coma. L’autor per a la correspondència s’identificarà amb un asterisc posat al final del seu cognom. — Adreça postal completa de tots els autors. Telèfon, fax i correu electrònic de l’autor per a la correspondència — Resum en català, d’un màxim de dues-centes paraules. — Paraules clau en català, màxim de cinc. — Resum en anglès (que, òbviament, haurà d’ésser traducció fidel del resum en català i haurà d’anar precedit de la traducció del títol del manuscrit). — Paraules clau en anglès, màxim de cinc. — Text, que, si és una revisió, podrà estar dividit fins a dos nivells en els apartats (no numerats) que es creguin més oportuns. Si es tracta d’un article de recerca, el manuscrit haurà d’incloure Introducció, Materials i mètodes, Resultats i Discussió. No es podran fer servir notes a peu de pàgina ni text subratllat. — Agraïments, si escau. — Referències, segons el format indicat més endavant. — Taules. Portaran un títol descriptiu breu i aniran numerades correlativament amb números àrabs. Una taula per full. — Text de peus de figures. Il·lustracions. Les il·lustracions cal que siguin de bona qualitat i contrast, tenint en compte la possible reducció, ja que, a causa del format de la revista, un cop publicades poden ésser, com a màxim, de 14 cm d’ample per 19 cm d’alt. Totes les il·lustracions seran en blanc i negre, excepte en cas que el color sigui essencial per a comprendre’n el significat. Atès que la publicació de fotografies en color encareix molt el procés editorial, els autors que desitgin incloure alguna fotografia en color hauran de pagar les despeses extra. En cas que les taules o figures hagin estat publicades anteriorment, caldrà indicar-ne la procedència i, si escau, el copyright. Referències. Totes les referències, tant publicades com en premsa, citades al text, hauran d’ésser incloses a la llista de referències, ordenades alfabèticament. En el text s’indicaran els noms dels autors i l’any de publicació per ordre cronològic; en el cas que una referència tingui més de dos autors, se citarà el primer seguit d’et al. A continuació hi ha exemples de l’estil que s’ha de seguir per a citar articles, capítols o monografies. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Proves d’impremta i extrets. De tots els originals acceptats, l’autor de correspondència en rebrà unes proves d’impremta per a corregir-les, i aquestes proves hauran d’ésser retornades, per correu urgent, a: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/ Maria Aurèlia Capmany, 14-16, 08001 Barcelona (tel. 933 248 584; fax 932 701 180; a/e: scb@iec.cat) dins el termini màxim d’una setmana. En les proves no podran ésser introduïdes correccions d’estil, i només hi seran admeses les de caràcter ortogràfic i tècnic. Un cop publicat l’article, es lliuraran a l’autor vint extrets sense càrrec.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Scope. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publishes: a) monographs and reviews on life sciences topics commissioned by the Society; and b) lectures presented at both ordinary and extraordinary sessions organized by the Society or their specialized sections. Submission of originals. Submission implies that the material is original and that has not been submitted, accepted or published elsewhere. Originals will be submitted by the editor of the volume to the following e-mail address scb@iecat.net addressed to the President of the Publications Board. The following files will be provided, preferably ZIP-compressed: — A single file in format RTS or MS Word named Text_TSCB_ [editor’s last name], containing all the text of the volume, including, in this order, the following parts: cover page, table of contents, presentation, the chapters in the order that they should appear and their corresponding tables. Pages should be consecutively numbered, staring with page 1, which will be the cover page. All text should be written in Times New Roman, pt 12 with 1.5 spaces between lines. The text file cannot contain figures and incrustated objects. — One file for each figure named Figure_[figure number]_ [last name of the first author]. Figures that do not contain text characters can be submitted in standard graphic format (PNG, JPEG, and TIFF); figures that do contain text have to be submitted in an editable format (EPS, PDF, Powerpoint). — A single PDF file named TSCB_[editor’s last name] containing all text plus all figures. Authors and the editor are responsible that in this file, all contents appear correctly printed, in particular special symbols and equations. Each article or, in a monograph, each chapter, including text plus references, tables and figures, should be between fifteen and twenty DIN A4 sheets long, written with the font type and spaces between lines specified above. The maximum length can be surpassed only with prior approval from the Treballs de la SCB Publications Board. Monographs should have a minimum of 10 chapters. The Publications Board will contact specialists who will recommend immediate publication, acceptance after modifications or rejection of the submitted originals. Authors will be notified in due course. If revision is required, authors will receive the corresponding written comments for modifications. Structure of manuscripts. Manuscripts that do not conform to these instructions will be returned to the authors for modifications before their processing. Each chapter or manuscript should have the following structure: — Title, written in capitals and bold case. — Name and last name of author. If there is more than one author, their names will be separated with commas. The corresponding author will be identified with an asterisk placed after their last name.

— Full postal address of all authors. Phone, fax and e-mail address of the corresponding author. — Abstract, maximum two hundred words. — Keywords, maximum five — Text of manuscript. In the case of review articles, a maximum of two (not numbered) subheadings will be accepted. In the case of research articles, the manuscript will include the following sections: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion. Footnotes or underlined text will not be accepted. — Acknowledgments, if appropriate — References (see format below) — Tables. They will be preceded with a brief, descriptive title and will be numbered with Arabian numerals. One table per page — Figure legends Figure. Figures should be of good quality and contrast, taking into account that they can be reduced in size, and that once published they can be at most 14 cm width x 19 cm height. All figures will be in black and white, unless the use of color is essential to understand their meaning. The authors will pay extra costs of publishing color figures. If tables or figures have been previously published elsewhere, the original source must be indicated and it will be the responsibility of authors to deal with possible copyrights. References. All references published and in press cited within the text will have to be included in the reference list arranged in alphabetical order by the last name of the first author. In the text, the name of the authors and the publication year should be used in chronological order. If there are more than two authors, only the name of the first author followed by «et al.» will be used. The following examples represent the appropriate manner in which to cite articles, book chapters and books, respectively. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Galleyproofs and reprints. Once a manuscript has been accepted, the corresponding author will receive the galleyproofs. Galleyproofs will be returned by courier to: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/Maria Aurèlia Capmany, 1416, 08001 Barcelona (tel. +34-933 248 584; fax +34-932 701 180; e-mail: scb@iec.cat) within one week. Style corrections cannot be accepted in galleyproofs. Only typographic and technical corrections will be accepted. Once published, authors will receive 20 reprints free of charge.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

VOLUM 62, 2011

BARCELONA 2011

treballs de la scb, revista anual de la SCB Direcció: Ricard Roca, vocal de Publicacions

COMITÈ DE PUBLICACIONS RICARD ROCA, president, vocal de Publicacions, SCB FRANCESC PIFERRER, vocal, Institut de Ciències del Mar RAMON BARTRONS, vocal, Universitat de Barcelona JOAN JOFRE, vocal, Universitat de Barcelona CÈLIA MARRASÉ, vocal, Institut de Ciències del Mar MERCÈ PIQUERAS, vocal, presidenta de l’ACCC

© dels autors dels articles Editat per la Societat Catalana de Biologia (filial de l’Institut d’Estudis Catalans) Carrer del Carme, 47. 08001 Barcelona Compost per Ricard Roca ricardroca@gmail.com Imprès a Limpergraf, SL Polígon industrial Can Salvatella, carrer de Mogoda, 29-31 Barberà del Vallès ISSN: 0212-3037 Dipòsit Legal: B.12164-1963

Organismes model en biologia Montserrat Corominas i Marc Valls editors

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 62, 2011

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 62, 2011

ÍNDEX Organismes model en biologia Presentació M. Corominas i M. Valls . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Virus como modelo en biología E. Domingo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 El bacteriòfag lambda, un model de decisió genètica M. Muniesa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Escherichia coli, un petit gran organisme C. Balsalobre. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Els llevats com a organisme model de recerca en biologia J. Ariño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 Dictyostelium discoideum, una ameba peculiar M. Galardi-Castilla i L. Sastre. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 La planta model Arabidopsis thaliana E. Monte. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 La regeneració i l’homeòstasi en les planàries, un model clàssic de biologia del desenvolupament F. Cebrià, T. Adell, J. F. Abril i E. Saló . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Caenorhabditis elegans: una història fascinant D. Dalfó. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 Drosophila melanogaster com a organisme model: una font d’informació en recerca biomèdica F. Serras i J. Casanova . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 El petit amfiox: el miratge de l’origen dels vertebrats J. Garcia-Fernàndez i È. Benito-Gutiérrez. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

El peix zebra com a sistema model per a l’estudi de malalties humanes A. Durán i H. López-Schier. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 El pollet com a sistema model: les noves possibilitats d’un model clàssic C. Pujades. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 El ratolí com a sistema model en biologia A. Merlos-Suárez . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Models animals per a l’estudi de la diabetis N. Roglans, M. Alegret i J. C. Laguna. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179

PRESENTACIÓ Montserrat Corominas i Marc Valls Si hom observa la natura queda fascinat per la gran diversitat de formes de vida a la Terra. La majoria de les més d’1.500.000 espècies no es poden estudiar de manera individual i, per tant, no se’n coneix el desenvolupament, fisiologia, comportament o història natural. Malgrat tot, coneixem la majoria de «principis bàsics» de la seva biologia, genètica o bioquímica gràcies a la recerca en organismes model. A partir d’aquests models experimentals es dedueixen els principis fonamentals, que són, generalment, extrapolables a la resta d’espècies. Un organisme model serà, doncs, una espècie que es considera representativa d’un grup d’organismes i que, per les característiques biològiques, es pot estudiar fàcilment. A continuació citem algunes d’aquestes característiques desitjables en els organismes per ser bons models: a) Simplicitat estructural, alhora que presenta els processos cel·lulars bàsics d’organismes més complexos. b) Accessibilitat per a l’experimentació i manipulació fàcils (organisme no patogen). c) Creixement i propagació fàcils, ràpids i econòmics en laboratori. d) Cicle biològic curt i producció d’un gran nombre de descendents. e) Facilitat per modificar-lo genèticament. f ) Genoma relativament petit i estable. L’elecció dels organismes model ha estat a vegades pensada d’una manera racional, però també és fruit de l’atzar i especialment de la història, ja que com més es conegui un organisme més bon model d’estudi serà. Així, l’interès industrial i tecnològic del llevat o els experiments cabdals

amb el bacteriòfag lambda, Escherichia coli o Drosophila van esperonar-ne un profund coneixement bioquímic i genètic que els ha fet excel·lents models per a la recerca. Malgrat això, aquestes espècies s’han imposat sobretot per haver estat ben escollides, com ho prova el fet que organismes pioners en estudis de biologia molecular com ara la llagosta Tenebrio mollitor o la ceba no han esdevingut models d’estudi. Els darrers temps, moltes espècies noves van esdevenint accessibles a l’experimentació i els impressionants avenços en genòmica o en biologia sintètica permeten l’anàlisi in silico de moltes altres. Ens podem demanar, doncs, si les espècies que tracta aquest llibre seguiran sent models clau de la recerca d’aquest segle xxi i, fins i tot, si caldran els organismes model. Aquestes són qüestions que no podem respondre, però és probable que, tot i conèixer bé un gran nombre de formes de vida, n’hi haurà sempre que presentin avantatges addicionals que en facin una referència d’estudi. Aquest llibre està adreçat a qui tingui interès a conèixer alguns dels organismes que s’utilitzen com a model en biologia, i de manera especial als alumnes i professors de secundària. L’estructura del llibre reflecteix un progressiu grau de complexitat dels organismes, començant pels virus i acabant amb diferents models de rata per a l’estudi d’una malaltia com és la diabetis. Voldríem agrair l’amabilitat i professionalitat dels autors dels diferents capítols per la seva disponibilitat i l’entusiasme que han mantingut d’ençà que els vam proposar aquesta tasca.

DOI: 10.2436/20.1501.02.100

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 9-18

VIRUS COMO MODELO EN BIOLOGÍA Esteban Domingo Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM) Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas Dirección para la correspondencia: Esteban Domingo. Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM). C/ Nicolás Cabrera, 1, Campus de Cantoblanco. 28049 Madrid. Tel.: 911 964 540. Correo electrónico: edomingo@cbm.uam.es. RESUM D’ençà de l’aparició de la biologia molecular a mitjan segle xx, els virus han estat molt emprats com a sistemes d’estudi i han permès establir gran part dels principis que regeixen aquesta disciplina. Els treballs en virologia han contribuït a establir no solament les bases moleculars de l’organització dels genomes, sinó també els programes d’expressió gènica que conformen les característiques fenotípiques dels organismes. En els darrers temps, els virus han esdevingut també models adequats per adreçar qüestions biològiques com l’evolució i la complexitat. En aquesta revisió es resumeixen les principals característiques que defineixen els virus com a entitats biològiques i es revisen les principals contribucions de l’estudi dels virus al coneixement biològic. Paraules clau: virus, virologia, bacteriòfag, genoma de RNA. VIRUSES AS A MODEL IN BIOLOGY SUMMARY Since the advent of molecular biology in the mid-twentieth century, viruses have been used as systems of study and contributed to the establishment of most principles governing the discipline. The work in virology has contributed not only to establish the molecular organization of genomes but also the gene expression programs that make up the phenotypic characteristics of organisms. Recently, viruses have also become suitable models to address issues such as biological evolution and complexity. This review summarizes the main characteristics that define viruses as biological entities and the main contributions of virology to biological knowledge. Key words: virus, virology, bacteriophage, RNA genome. Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

10 E. DOMINGO

LA NATURALEZA DE LOS VIRUS Y POR QUÉ ATRAJERON A LOS PIONEROS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Hasta mediados del siglo xix no se había hecho ninguna distinción entre las bacterias y otros agentes tóxicos, a pesar de que éstos se caracterizaban por no aumentar su concentración en los tejidos de las personas afectadas (virus significa ‘veneno’). Había una gran reticencia a considerar que los procesos infecciosos pudieran estar asociados a agentes infecciosos distintos de las bacterias (al igual que ocurrió durante el final del siglo xx con los priones). A finales del siglo xix se realizaron las primeras observaciones que sugerían que había enfermedades transmisibles que podrían relacionarse con agentes de tamaño inferior al de las bacterias. Fueron F. Loeffler y P. Frosch quienes identificaron el agente causal de la fiebre aftosa o glosopeda y M. W. Beijerinck quien identificó el agente del mosaico del trabajo, resultados que fueron publicados en 1889. En estos estudios pioneros sus autores demostraron que los agentes infecciosos pasaban a través de filtros que retenían a las bacterias y que su amplificación en los animales o plantas infectados era incompatible con la acción de una sustancia tóxica de concentración constante en función del tiempo. Hitos importantes que siguieron al descubrimiento de los virus como un nuevo tipo de agente infeccioso fueron desvelar el origen vírico de un tumor maligno en los pollos por P. Rous en 1911, el descubrimiento de los bacteriófagos (virus que infectan bacterias) de modo independiente por F. W. Twort en 1915 y F. d’Hérelle en 1917, la etiología vírica de un tipo de cáncer de mamífero por R. E. Shope en 1933, la cristalización del virus del mosaico del tabaco por W. M. Stanley en 1935 y el reco-

nocimiento de que éste y otros virus de plantas contenían tanto proteína como ácido nucleico, en publicaciones por F. C. Bawden y N. W. Pirie en 1937 y 1938. Tras estos primeros avances irrumpió en la escena M. Delbrück, que junto a otros científicos que eran físicos de formación, se sintió atraído por los virus como objeto de estudio. Su curiosidad residía en averiguar si los procesos de multiplicación inherentes a los sistemas vivos ocultaban algún mecanismo molecular distinto de los propuestos hasta entonces por la física y la química. Delbrück describió el ciclo replicativo de bacteriófagos en 1940 y A. D. Hershey y M. Chase propusieron en 1952 que la molécula infecciosa era el DNA y no la proteína de las partículas víricas. Este último experimento contribuyó a establecer definitivamente que el DNA era el material hereditario. El descubrimiento de la estructura en doble hélice del DNA sugirió un mecanismo de replicación del material genético e inmediatamente los bacteriófagos de DNA se convirtieron en objetos ideales para estudios básicos sobre multiplicación y expresión (que incluía transcripción y traducción) del material genético. Ello representó, a mediados del siglo xx, el nacimiento de lo que hoy conocemos como biología molecular. Los orígenes de la biología molecular y las grandes contribuciones de Delbrück y su equipo se describieron en un libro titulado Phage and the origins of molecular biology, editado por J. Cairns, G. S. Stent y J. D. Watson (Cold Spring Harbor Laboratory for Quantitative Biology, 1966), libro del cual se editó una versión ampliada en 1992 (Cairns et al., 1992). Este libro contiene artículos altamente informativos sobre la primera gran aportación de los virus como sistemas modelo para las ciencias biológicas en general: el origen de la biología molecular en la que se basan la biotecTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 9-18

VIRUS COMO MODELO EN BIOLOGÍA 11

nología y la medicina molecular practicadas actualmente. LOS VIRUS EN EL ORIGEN Y EL DESARROLLO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR En su capítulo introductorio del libro Phage and the origins of molecular biology, G. S. Stent relató el impacto que tuvo el libro ¿Qué es la vida? de E. Schrödinger, publicado en 1944. En esta obra concisa, Schrödinger planteaba la incapacidad mostrada por la física y química de aquel entonces para explicar cómo los seres vivos podían evitar la tendencia que tiene la materia a decaer hacia un equilibrio con aumento de desorden (entropía). Se preguntaba cuál podría ser la naturaleza de un material genético capaz de mantener su información durante eones. Propuso que los cromosomas debían estar formados por «cristales aperiódicos» compuestos por un número limitado de elementos isoméricos cuya sucesión representaba el código genético. Estas reflexiones llevaron al convencimiento de que mientras toda la materia debía regirse por las leyes de la física, no podía descartarse que la vida implicara otras leyes de la física a la sazón desconocidas. Años después, quedó claro que la perpetuación del material genético se basaba en el reconocimiento de nucleótidos mediante enlaces químicos bien caracterizados anteriormente (puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas), todo ello presidido por las mismas leyes de la física y de la química que rigen el comportamiento de todos los objetos que conocemos. Lo que diferencia lo «vivo» de lo «no vivo» son niveles de organización y de interacción entre sistemas organizados, pero no las bases físicas que determinan las interacciones entre átomos y moléculas, que son universales. No obsTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 9-18

tante, como explica Stent, la idea romántica de que el estudio de los genes podía desvelar otras leyes de la física fue la que fascinó a los físicos que contribuyeron al progreso de las ciencias biológicas. Los virus bacterianos estudiados por Delbrück y sus asociados, en particular A. D. Hershey y S. E. Luria, eran virus que contienen DNA como material genético. En las décadas siguientes estos virus de DNA permitieron desentrañar los procesos básicos de mantenimiento y expresión de la información genética. Estos procesos pueden dividirse en replicación del DNA, su transcripción a RNA y la traducción de éste a proteínas sobre las que se construye el entramado metabólico que conforma los rasgos fenotípicos de cada organismo. Por lo tanto, el flujo de información genética esquematizado como DNA → RNA → pro teínas y el principio de que un gen corresponde a una proteína fueron establecidos gracias al trabajo con bacteriófagos con DNA como material genético. Pero, como suele ocurrir frecuentemente en biología, ni el llamado dogma de la biología molecular, es decir, el flujo unidireccional DNA → RNA, ni la correspondencia un gen - una proteína son estrictamente universales. Los virus también jugaron un papel clave en desvelar las excepciones a esos «dogmas» y, con ello, abrieron nuevos campos en la biología del siglo xx. VIRUS CON RNA. RETROTRANSCRIPTASA Y EL NACIMIENTO DE LA INGENIERÍA GENÉTICA A final de la década de 1950, T. Loeb y N. D. Zinder buscaban en aguas residuales de los alcantarillados de la ciudad de Nueva York bacteriófagos específicos para Escherichia coli «masculinos», es decir, posee-

12 E. DOMINGO

dores del factor F. El segundo fago que obtuvieron, denominado f 2, resultó contener RNA como material genético (Loeb y Zinder, 1961). Este bacteriófago y otros que fueron aislados en años posteriores, como fueron los fagos MS2 y Qβ, resultaron clave para estudiar la replicación de RNA, la síntesis de proteínas a partir de RNA heteropoliméricos y el desarrollo de la mutagénesis dirigida como procedimiento de genética inversa. Las primeras investigaciones con bacteriófagos con RNA fueron recopiladas también en un libro editado por el laboratorio de Cold Spring Harbor (Zinder, 1975). En 1962, D. Nathans y su equipo demostraron la traducción (producción de proteínas) in vitro del RNA de bacteriófagos y en 1965 el grupo de S. Spielgelman pudo multiplicar (replicar) el RNA del bacteriófago Qβ in vitro con la enzima vírica purificada a partir de extractos de E. coli infectada (Spiegelman et al., 1965). Tras una virulenta controversia con el grupo de Spiegelman, C. Weissmann demostró que la replicación del bacteriófago Qβ tenía lugar a través de una cadena de RNA de polaridad complementaria a la polaridad del RNA contenido dentro de la partícula vírica. Al RNA de la partícula vírica que puede traducirse para dar proteínas se le denomina RNA de banda positiva y a su complementario RNA de banda negativa. De este modo, Weissmann demostró que el proceso de replicación de DNA y de RNA seguía la misma pauta, a través de cadenas de ácido nucleico de polaridad complementaria (Feix et al., 1968). La elucidación de la estrategia replicativa de los bacteriófagos con RNA como material genético hizo pensar que mecanismos parecidos podían presidir la replicación de los virus RNA que infectaban animales y plantas. Entre ellos, estaban patógenos tan importantes como los virus de la gripe, el sarampión o la poliomielitis y también al-

gunos virus tumorales como el virus de la mieloblastosis aviar o el virus del sarcoma de Rous, productores de tumores. De nuevo, una posible generalización de un esquema de replicación de RNA no se pudo confirmar. Una transición extraordinariamente influyente en las ciencias biológicas tuvo lugar cuando en el año 1970 H. M. Temin y S. Mizutani, y de modo independiente D. Baltimore, demostraron la presencia en virus RNA tumorales de una enzima capaz de copiar RNA en DNA. A esta enzima se denominó transcriptasa inversa o retrotranscriptasa porque revertía el sentido que hasta entonces se consideraba universal para la transferencia de información genética (Baltimore, 1970; Temin y Mizutani, 1970). El descubrimiento de la retrotranscriptasa fue importante en varios aspectos: a) contradijo el dogma de la biología molecular de que la información genética debía transferirse siempre de DNA a RNA; b) permitió establecer un mecanismo de transformación celular (conversión de una célula normal en cancerosa) por inserción de material genético viral en el DNA celular, y c) abrió la posibilidad de copiar RNA celulares en DNA, una molécula más estable y susceptible de ser manipulada enzimáticamente. El DNA copiado mediante retrotranscripción, denominado cDNA, puede ser fragmentado mediante enzimas de restricción (que reconocen secuencias específicas de DNA) y ligado a otros DNA mediante enzimas denominadas DNA ligasas. El descubrimiento de la retrotranscriptasa permitió aplicar todo el potencial de la enzimología de alteración del DNA a moléculas que en la naturaleza se encontraban solo en forma de RNA. Esta nueva enzima hizo posible utilizar la ingeniería genética con cualquier tipo de ácido nucleico. La copia de RNA mensajeros codificantes de proteínas de interés biológico en Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 9-18

VIRUS COMO MODELO EN BIOLOGÍA 13

DNA y su ensamblaje en vectores de expresión (de tipo vírico o plasmídico) propició la aplicación industrial de la ingeniería genética. Sustancias como la hormona de crecimiento, varios tipos de interferón o la insulina pudieron ser expresados en grandes cantidades primero en células procarióticas y posteriormente también en células eucarióticas. Ello aumentó espectacularmente tanto el número de medicamentos como las cantidades disponibles para intervenciones terapéuticas. Actualmente el uso de las retrotranscriptasas víricas se ha convertido en una rutina tanto como herramienta de trabajo en genética molecular como para aplicaciones biotecnológicas de índole muy variada. El descubrimiento de las retrotranscriptasas víricas también alumbró una revolución conceptual en la que nos hallamos inmersos en la actualidad. Su inicio se podría situar en la formulación de la hipótesis del protovirus por H. M. Temin en 1971 (Temin, 1971). En ella Temin propuso un papel de la retrotranscripción en el desarrollo de los organismos y en carcinogénesis no inducida por virus. Resultados obtenidos en años posteriores confirmaron plenamente la existencia en la gran mayoría de células de elementos genéticos parecidos a los retrovirus, que constituyen uno de los mecanismos moleculares más extendidos de generación de diversidad celular. Los retroelementos son abundantes en el genoma de los vertebrados y de los invertebrados. Se considera que pueden ser los ancestros de los retrovirus actuales. Los análisis de la secuencia del genoma humano han permitido establecer la escalofriante conclusión de que el 40 % del genoma humano está compuesto o bien de elementos móviles (de tipo vírico o no vírico) o de sus reliquias. Los retroelementos celulares pueden enmarcarse dentro de una amplia categoría de elementos genéticos móviles Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 9-18

capaces de actuar como agentes mutadores y como promotores de transferencia horizontal de genes. A su vez, los descubrimientos sobre la actividad biológica de los elementos móviles deben situarse entre un conjunto de observaciones que se iniciaron hacia la segunda mitad del siglo xx y que se refieren a la inesperada diversidad de los sistemas biológicos, incluidos los virus. En la gran revolución sobre el reconocimiento de la diversidad biológica de la biosfera, los virus están teniendo un papel clave en dos aspectos: como sujetos de diversidad (véase más adelante) y como promotores de diversidad, básicamente como agentes de transferencia lateral de genes. La integración de material genético de virus en el de la célula no se restringe al caso de virus tumorales. Los bacteriófagos atemperados originan bacterias lisogénicas en cuyo cromosoma se inserta el DNA vírico. Relacionados con ellos, los bacteriófagos transductores pueden retener funciones del hospedador cuando se activan para formar partículas víricas. Ahora sabemos por estudios de genómica que la transducción es un fenómeno muy frecuente en ambientes naturales, y se ha estimado que unos 1031 virus bacterianos infectan 1024 bacterias ¡cada segundo! Este tipo de intercambio de genes parece ser tan abundante entre los procariotas como entre los eucariotas. GENES INTERRUMPIDOS: PROCESAMIENTO Y UNIÓN DE RNA En los eucariotas las zonas codificantes de proteína en el DNA son discontinuas y tras la síntesis del RNA se descartan regiones internas del RNA (denominadas intrones) y se unen las zonas de RNA llamadas exones para producir el RNA mensajero

14 E. DOMINGO

maduro. Al conjunto de modificaciones que sufre un transcrito primario hasta dar los RNA mensajeros activos se le denomina procesamiento del RNA. P. Sharp y R. Roberts demostraron que los RNA mensajeros tardíos de adenovirus (producidos tarde tras la infección) están codificados por cuatro secuencias distintas del DNA genómico del virus. Estas observaciones explicaron la organización del DNA codificante de proteínas en exones e intrones y abrieron el camino para estudiar el procesamiento de los RNA precursores, un fenómeno general para células eucarióticas (Berget et al., 1977; Chow et al., 1977). La mayoría de reacciones de procesamiento de RNA fueron descubiertas en sistemas víricos. Así, la presencia de un cap se documentó por primera vez con RNA mensajeros de reovirus y del virus de la vacuna (vaccinia virus) y la presencia de una secuencia de poliadenina en el extremo 3´ de RNA mensajeros se demostró por primera vez con el virus de la vacuna. La división de los genes en exones e intrones permite un procesamiento diferencial y la síntesis de distintas proteínas a partir de la misma secuencia de DNA cromosómico. Además, la separación del DNA y su correspondiente RNA en intrones y exones tiene muchas implicaciones para la evolución de los eucariotas y de sus virus. Los intrones aportan regiones en las que el DNA puede romperse y trasladarse a otro DNA receptor, sin afectar a la proteína codificada por los exones correspondientes. Esta organización favorece procesos de recombinación por los que se pueden juntar dominios de proteínas distintas y ampliar el repertorio de productos de expresión sobre los que puede actuar la selección. Asimismo, se piensa que la presencia de intrones ha podido facilitar la transferencia de información genética entre células y virus.

VIRUS COMO MODELO EN INMUNOLOGÍA La vacunación ha representado el método más eficaz para la prevención de enfermedades infecciosas. Aunque su origen fue totalmente empírico, el estudio de las bases de su efectividad permitió desarrollar conocimientos básicos en el campo de la inmunología. Las primeras vacunas se aplicaron a prevenir enfermedades víricas, como la vacuna frente a la viruela desarrollada por E. Jenner en 1796. Una campaña internacional de vacunación permitió declarar a todo el planeta libre de viruela en mayo de 1980. Asimismo, en 1885 L. Pasteur produjo la primera vacuna contra la rabia, una enfermedad vírica que sigue siendo endémica en zonas poco desarrolladas de nuestro planeta [como revisión del impacto de la vacunación en sus aspectos históricos, sociológicos y científicos, véase Bloom y Lambert, 2003]. Otras áreas de la inmunología han basado su progreso en el empleo de virus como modelo de interacción entre un patógeno y un organismo. Quizás uno de los virus más representativos es el virus de la coriomeningitis linfocitaria del ratón (LCMV). En su excelente monografía sobre arenavirus, M. B. A. Oldstone revisó varios hitos de la inmunología en los que el LCMV tuvo una participación decisiva, y se refirió al LCMV como la «piedra Rosetta» para desvelar fenómenos importantes en virología e inmunología. Entre ellos, destaca la primera descripción de enfermedad inmunopatológica asociada a virus, el papel del timo en la respuesta inmunitaria, o el descubrimiento de células T citotóxicas y la restricción con los complejos mayores de histocompatibilidad (MHC). Oldstone también cita la generación de células memoria del sistema inmunitario o el papel del LCMV en la caracterización de alteraTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 9-18

VIRUS COMO MODELO EN BIOLOGÍA 15

ciones funcionales de las células que pueden producir enfermedad en ausencia de destrucción citolítica de las células en los tejidos afectados (Oldstone, 2002). Varios de los conceptos surgidos de investigaciones con LCMV y otros virus han servido de base para la caracterización de fenómenos generales en inmunología (mecanismos moleculares de escape a anticuerpos y a células citotóxicas, enfermedad asociada a complejos inmunitarios, enfermedades hormonales y neurológicas, etc.). Asimismo, el LCMV fue uno de los primeros virus para los que se caracterizaron cambios biológicos importantes asociados a variantes surgidas in vivo. Ello se enmarca en el problema general de la rápida variación viral y su impacto médico, que se resume en la sección siguiente. LOS VIRUS COMO MODELOS EN EVOLUCIÓN: CUASIESPECIES Y DIVERSIDAD BIOLÓGICA Como se ha mencionado en una sección anterior, uno de los descubrimientos más espectaculares realizados durante la segunda mitad del siglo xx, y que en cierto modo sigue creciendo en impacto en el momento de escribir este artículo, es el de la gran diversidad genética y fenotípica de todos los organismos que constituyen la biosfera. Esta diversidad incluye diferencias entre individuos de una misma especie y se observa tanto entre organismos pluricelulares con distintos grados de diferenciación como en unicelulares y en sistemas genéticos subcelulares, incluidos los virus. También en este campo de la biología los virus están haciendo aportaciones clave para entender los orígenes y el mantenimiento de la diversidad biológica. Los virus con RNA como material genético que hicieron posible el sistema de reTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 9-18

plicación in vitro de RNA del bacteriófago Qβ (resumido más arriba) aportaron también evidencia experimental en apoyo de la teoría de cuasiespecies. Esta teoría de evolución molecular fue propuesta inicialmente por M. Eigen y P. Schuster para explicar la autoorganización y adaptabilidad de los replicones primitivos que muy probablemente ocuparon un «mundo de RNA» en las primeras fases de la evolución de la vida (Eigen, 1971; Eigen y Schuster, 1979). Trasladado a los virus RNA (que incluyen patógenos tan importantes como son el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la gripe o los virus de las hepatitis A y C), que coexisten actualmente con nuestra biosfera celular, el concepto de cuasiespecies se refleja en que cada aislado de un virus es distinto de otro y, más importante, que cada población vírica está formada por un espectro de mutantes en vez de un genoma con una secuencia nucleotídica definida. Un virus RNA puede definirse solamente de modo estadístico pero su composición es inherentemente indeterminada (Domingo et al., 2001, 1978). La principal fuerza que subyace a la dinámica de cuasiespecies (es decir, continua variación, competición y selección de variantes) es la alta mutabilidad del RNA durante su replicación. En términos más generales, la capacidad de variación de todos los sistemas genéticos (ya sea por mutación o por recombinación) es mucho mayor de lo que se había anticipado por las escuelas de genética de poblaciones dominantes durante la primera mitad del siglo xx. Sirvan como ejemplo las siguientes afirmaciones de S. Wright, uno de los fundadores de la genética poblacional moderna: «Las propiedades observadas de las mutaciones en genes ―fortuitas en origen, infrecuentes en su acontecer y deletéreas cuando no negligibles en su efecto― parecen tan desfavorables como es posible serlo para un

16 E. DOMINGO

proceso evolutivo. No obstante, bajo reproducción biparental, un número limitado de mutaciones, que no sean demasiado dañinas para ser portadas por la especie, proporciona un campo casi infinito de posibles variaciones a través de las cuales la especie puede abrirse camino bajo la selección natural [...]. Debe haber mutación de genes, pero una tasa excesiva origina un repertorio de monstruos aberrantes, no evolución [...]. Más específicamente, bajo reproducción biparental, una tasa muy baja de mutación, equilibrada por selección moderada, es suficiente para mantener un campo prácticamente infinito de posibilidades de combinaciones genómicas dentro de la especie» (Wright, 1932). No es de extrañar, por tanto, que las mayores reticencias sobre la estructura en cuasiespecies de los virus RNA, una de cuyas bases mecanísticas son las altas tasas de mutación, hayan provenido de algunos grupos (no todos) de escuelas clásicas de genética de poblaciones o de una minoría de virólogos adscritos a estas escuelas. Resulta altamente ilustrativo comparar el peso que J. Holland y su grupo dan a la mutación como fuerza evolutiva para los virus (Holland et al., 1982) con las citadas afirmaciones de S. Wright. No es el objetivo de este artículo resumir lo que las cuasiespecies han representado para entender los virus RNA y diseñar métodos para su control (para ello el lector puede consultar revisiones, como por ejemplo Domingo et al., 2001; Lauring y Andino, 2010; Mas et al., 2010), sino destacar que los virus han proporcionado sistemas modelo para abordar el estudio de la gran diversidad biológica típica de nuestra biosfera.

LOS VIRUS COMO MODELOS DE COMPLEJIDAD BIOLÓGICA. PERSPECTIVAS EN METAGENÓMICA El marco teórico proporcionado por el concepto de selección natural, junto con los principios mendelianos de la herencia y el reconocimiento de la diversidad entre individuos de una misma especie, permitieron la formulación de los principios de la evolución darwiniana que son ampliamente aceptados en la actualidad. Estos principios han sido demostrados analizando el comportamiento de sistemas replicativos rápidos, entre ellos los virus. Pueden expresarse de modo conciso diciendo que todo sistema replicativo está sometido a variación genética, competición entre formas variantes y selección de aquellos individuos (o conjunto de individuos) más aptos en las condiciones ambientales en las que tiene lugar la replicación. Estos principios se aplican a todos los organismos vivos, incluyendo microorganismos, virus y elementos subvíricos (como viroides o RNA satélites). Los principios darwinianos tienen varias formulaciones matemáticas, todas ellas relacionadas entre sí, incluyendo la ecuación matemática que describe la dinámica de cuasiespecies, aplicable a los casos caracterizados por una alta tasa de mutación (Page y Nowak, 2002). La interacción entre lo que J. Holland y su grupo denominaron «la biosfera de RNA» y los organismos basados en DNA (Holland et al., 1982) proporciona un prolífico campo de trabajo en el terreno de la «complejidad», un concepto originado en la física y que influye en muchísimos ámbitos de la ciencia, incluida la biología y el mundo de los virus en cuanto a la interacción con sus hospedadores. R. Solé y B. Goodwin definen complejidad como «el estudio de aquellos sistemas en los que no Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 9-18

VIRUS COMO MODELO EN BIOLOGÍA 17

hay una relación simple y predecible entre niveles, entre las propiedades de las partes que constituyen un conjunto y las del conjunto» (Solé y Goodwin, 2000). El comportamiento de los virus a escala poblacional y su interacción con los hospedadores a los que infectan incluyen varios niveles de complejidad, susceptibles de ser estudiados experimentalmente (Domingo, 2010). RESUMEN Y CONCLUSIONES Los virus manifiestan una de las principales propiedades que distinguen a la materia viva de la no viva: la capacidad de replicación y de expresión de un programa genético. Por ello, no es sorprendente que, una vez descubiertos a finales del siglo xix, los virus se convirtieran en sistemas motores para entender procesos básicos de replicación que alumbraron a la biología molecular como ciencia troncal del siglo xx. Asimismo, dado que la expresión del programa genético de los virus requiere inevitablemente la participación de una célula, los virus han servido como modelos para entender interacciones parásito-hospedador, incluyendo el funcionamiento del sistema inmunitario adaptativo de los organismos diferenciados. Finalmente, el pequeño tamaño molecular de los genomas víricos y su rápida multiplicación, en comparación con los organismos celulares hospedadores, proporcionan sistemas altamente acelerados para interrogar procesos darwinianos fundamentales (variación, competición y selección) que rigieron la aparición de la vida y rigen su evolución. Por todos los desarrollos científicos que estamos presenciando en este inicio del siglo xxi, parece probable que los virus van a seguir siendo modelos extraordinariamente útiles para desvelar los mecanismos de la vida. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 9-18

AGRADECIMIENTOS El trabajo en mi laboratorio ha sido subvencionado por el Ministerio de Ciencia e Innovación, la Fundación FIPSE, el CSIC y la Fundación R. Areces. El CIBERehd está financiado por el Instituto de Salud Carlos III. BIBLIOGRAFÍA Baltimore, D. (1970). «RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses». Nature, 226: 1209-1211. Berget, S. M.; Moore, C.; Sharp, P. A. (1977). «Spliced segments at the 5´ terminus of adenovirus 2 late mRNA». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 3171-3175. Bloom, B. R.; Lambert, P.-H. (2003). The Vaccine Book. San Diego: Academic Press, Elsevier. Cairns, J.; Stent, G. S.; Watson, J. D. (1992). Phage and the origins of molecular biology. Expanded edition. Nova York: Cold Spring Harbor Lab. Press. Chow, L. T.; Gelinas, R. E.; Broker, T. R.; Roberts, R. J. (1977). «An amazing sequence arrangement at the 5´ ends of adenovirus 2 messenger RNA». Cell, 12: 1-8. Domingo, E. (2010). «Mechanisms of viral emergence». Vet. Res., 38. DOI: 10.1051/vetres/2010010. Domingo, E.; Biebricher, C.; Eigen, M.; Holland, J. J. (2001). Quasispecies and RNA virus evolution: principles and consequences. Austin: Landes Bioscience. Domingo, E.; Sabo, D.; Taniguchi, T.; Weissmann, C. (1978). «Nucleotide sequence heterogeneity of an RNA phage population». Cell, 13: 735-744. Eigen, M. (1971). «Self-organization of matter and the evolution of biological macromolecules». Naturwissenschaften, 58: 465-523. Eigen, M.; Schuster, P. (1979). The hypercycle. A principle of natural self-organization. Berlín: Springer. Feix, G.; Pollet, R.; Weissmann, C. (1968). «Replication of viral RNA, XVI. Enzymatic synthesis of infectious virual RNA with noninfectious Q-beta minus strands as template». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 59: 145-152. Holland, J. J.; Spindler, K.; Horodyski, F.; Grabau, E.; Nichol, S.; Vandepol, S. (1982). «Rapid

18 E. DOMINGO evolution of RNA genomes». Science, 215: 15771585. Lauring, A. S.; Andino, R. (2010). «Quasispecies theory and the behavior of RNA viruses». PLoS Pathogens. [En prensa] Loeb, T.; Zinder, N. D. (1961). «A bacteriophage containing RNA». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 47: 282-289. Mas, A.; López-Galíndez, C.; Cacho, I.; Gómez, J.; Martinez, M. A. (2010). «Unfinished stories on viral quasispecies and Darwinian views of evolution». J. Mol. Biol. [En prensa] Oldstone, M. B. A. [ed.] (2002). Arenaviruses I and III. Current Topics in Microbiol. and Immunol., 262263. Berlín / Heidelberg: Springer-Verlag. Page, K. M.; Nowak, M. A. (2002). «Unifying evolutionary dynamics». J. Theor. Biol., 219: 93-98. Solé, R.; Goodwin, B. (2000). Signs of life. How complexity pervades biology. Nova York: Basic Books.

Spiegelman, S.; Haruna, I.; Holland, I. B.; Beaudreau, G.; Mills, D. (1965). «The synthesis of a self-propagating and infectious nucleic acid with a purified enzyme». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 54: 919-927. Temin, H. M. (1971). «The protovirus hypothesis: speculations on the significance of RNA-directed DNA synthesis for normal development and for carcinogenesis». J. Natl. Cancer. Inst., 46: 3-7. Temin, H. M.; Mizutani, S. (1970). «RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus». Nature, 226: 1211-1213. Wright, S. (1932). «The roles of mutation, inbreeding, crossbreading, and selection in evolution». Proc. of the VI International Congress of Genetics, 1: 356-366. Zinder, N. D. [ed.] (1975). RNA Phages. Cold Spring Harbor Monograph Series. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 9-18

DOI: 10.2436/20.1501.02.101

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 19-30

EL BACTERIÒFAG LAMBDA, UN MODEL DE DECISIÓ GENÈTICA Maite Muniesa Departament de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona Adreça per a la correspondència: Maite Muniesa. Departament de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Tel.: 934 039 386. Adreça electrònica: mmuniesa@ub.edu. RESUM El bacteriòfag lambda (fag λ) és un virus que, com indica el seu nom (bacteriòfag, ‘que menja bacteris’) infecta el bacteri intestinal Escherichia coli. El fag λ s’ha utilitzat històricament com a organisme model per a l’estudi de la multiplicació de virus i, sobretot, per comprendre la regulació gènica. Per regulació gènica entenem on i quan han de funcionar els gens, decisió cabdal que fa que, per exemple, les cèl·lules de la nostra sang siguin molt diferents de les de l’ull, tot i dur els mateixos gens: la diferència és quins es troben actius. El fag λ és, doncs, el paradigma per entendre la regulació gènica, ja que té dos cicles de vida diferents, anomenats cicles lític i lisogènic; per triar quin manarà s’utilitza un sistema senzill (i alhora complex) de regulació genètica. Si el fag tria el cicle lític, es multiplica dins del bacteri fins a lisar-lo i alliberar els fags descendents. Si, en canvi, tria el cicle liso gènic, el DNA del fag s’integra dins del DNA del bacteri i roman latent (profag), com un fragment més de genoma bacterià. Això no mata el bacteri, que continua dividint-se. El DNA del fag es replica juntament amb el DNA del bacteri, que expressa els seus gens i els del fag. La lisogènia pot mantenir-se estable o revertir envers el cicle lític si hi ha certs factors ambientals que afectin la viabilitat del bacteri. El fag λ s’ha utilitzat també com a eina en biologia molecular, entre altres aplicacions, per produir DNA recombinant, aprofitant les capacitats dels seus enzims d’integrar fragments de DNA dins del genoma bacterià. Paraules clau: bacteriòfag, transferència genètica, lisi, lisogènia, microbiologia.

Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011

20 M. MUNIESA

THE BACTERIOPHAGE LAMBDA SUMMARY The bacteriophage lambda (phage λ) is a virus that infects the intestinal bacteria Escherichia coli. Phage λ has been historically used as a model microorganism on the study of virus multiplication, and moreover for the genetic regulation of its multiplicative cycles. Phage λ has two different multiplicative pathways, called lytic and lysogenic cycles, and can choose among both cycles by a complex system of genetic regulation. If the lytic cycle is selected, λ multiplies within the bacteria generating new phages. The new phages release outside the bacteria by lysis, which causes the death of the cell. If the lysogenic cycle is selected, the phage DNA is integrated within the bacterial DNA and remains in a latent state (prophage) as a part of the bacterial genome. This cycle does not kill the bacterial cell, that can continue its replication together with the replication of the phage DNA. This allows the bacterium to express its own genes and those of the phage. Lysogeny can remain stable or revert towards the lytic cycle, if there are certain environmental factors that affect viability of the bacteria. Phage λ has also been applied as a tool for diverse molecular biology applications. Among others, the production of recombinant DNA, using the abilities of their enzymes to integrate DNA fragments within the bacterial genome. Key words: bacteriophage, genetic transfer, lysis, lysogeny, microbiology. El bacteriòfag o fag lambda, anomenat normalment amb la lletra grega λ, va ser descobert fa més de mig segle, el 1950, per la microbiòloga Esther M. Zimmer Lederberg (1922-2006) (Lederberg, 1950, 1951). Els bacteriòfags o fags són virus que tenen la capacitat d’infectar bacteris. La doctora Lederberg va aïllar el fag λ a partir de la infecció del bacteri d’origen intestinal Escherichia coli, soca K-12. Com tots els virus, l’estructura del fag λ és molt simple. Consisteix en un cap, que té la forma d’un prisma icosaèdric, fet de subunitats de proteïna, amb un diàmetre de 55 nm. A l’interior d’aquest cap hi ha el material genètic, DNA de doble cadena, que conté més de quaranta gens, amb la informació necessària per generar-ne l’estructura i per dur a terme la infecció. A més, el fag λ posseeix una cua de 150 nm, també composta per proteïnes, que li serveix per unir-se al bacteri i infec-

tar-lo (vegeu la figura 1) (Hendrix et al., 1983). La utilitat dels bacteriòfags es basa en la facilitat de creixement del seu hoste, per la qual cosa han esdevingut models per a l’estudi dels virus. El fag λ ha estat un dels bacteriòfags més ben estudiats i s’utilitza encara avui dia com a model de regulació genètica i d’infecció vírica. Facilita aquesta tasca el fet que λ no és cap virus patogen, que no necessita cultius cel·lulars complexos per propagar-se i que estudiar-lo no és excessivament car. El fet que el seu bacteri hoste sigui E. coli ha estat determinant, ja que aquest és un bacteri fàcil de manipular, molt estudiat i àmpliament utilitzat en el laboratori (vegeu el capítol sobre E. coli). Així doncs, λ és un virus model que infecta un bacteri model. Tanmateix, l’elecció del fag λ com a model es recolza en la complexa i interessant Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

EL BACTERIÒFAG LAMBDA, UN MODEL DE DECISIÓ GENÈTICA 21

regulació del seu circuit genètic. En efecte, els seus mecanismes de regulació gènica són dels més ben coneguts i estudiats (Little, 2006; Oppenheim et al., 2005) i moltes de les característiques generals de la regulació genètica que considerem evidents avui dia van tenir la seva descoberta en λ. El fag té un cicle vital molt més complex que la majoria d’altres virus bacterians, i això crea un ampli rang de comportaments i una regulació genètica molt interessant. Hi ha tres aspectes del comportament de λ que requereixen una atenció especial: primer, λ fa una tria, just després d’infectar la cèl·lula, entre dos cicles vitals diferents (cicle lític o lisogènic); segon, si segueix el cicle lisogènic, el DNA del fag s’integra en l’hoste i reprimeix el cicle lític; i tercer, un cop en l’estat lisogènic, pot canviar d’opinió i tornar un altre cop a l’estat lític. Tots aquests cicles els porta a terme mitjançant una acurada regulació dels seus gens, reprimint l’expressió d’alguns i promovent l’activació d’altres, en un delicat equilibri de decisions a escala molecular. A continuació veurem què ens ha ensenyat λ i coneixerem els seus cicles en detall.

receptors d’altres virus. Un cop unit a LamB, i a través de la cua, el fag injecta el seu DNA dins del bacteri (vegeu la figura 2). Aquest és el primer pas de la infecció de la majoria de bacteriòfags amb cua. La cadena lineal de DNA del fag travessa la paret del bacteri i arriba al seu interior, on immediatament es tanca sobre ell mateix formant una molècula de DNA circular. Aquesta circularització és possible gràcies a uns extrems cohesius en el seu DNA que s’uneixen per uns enzims del bacteri, les lligases. La circularització és necessària per evitar que certs enzims degradadors de DNA (endonucleases) del bacteri, que actuen generalment sobre DNA lineal, no tallin i degradin el DNA del fag (Heskowitz i Hagen, 1980). MODEL DE LISOGÈNIA Un cop injectat el seu DNA dins d’E. coli, el fag pot triar dues opcions a l’hora de replicar-se: el cicle lític i el lisogènic, i pren la decisió depenent de l’ambient i les circumstàncies en què es troba (Hersko-

MODEL D’INFECCIÓ VÍRICA La infecció del fag λ, com la d’altres fags, té lloc quan aquest troba el receptor d’una cèl·lula del seu bacteri hoste, en aquest cas E. coli. El fag λ utilitza la cua per unir-se a una proteïna de la superfície del bacteri, la proteïna LamB. LamB forma part de l’estructura proteica d’un porus que es forma a la paret d’E. coli i que fa servir el bacteri per captar un sucre, la maltosa. El model de λ i el seu receptor de la maltosa va generar elegants experiments que descrivien que l’expressió d’aquest receptor afavoria o inhibia la infecció del fag λ (Lederber, 1955) i han servit de base per estudiar els Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

Figura 1. Micrografia electrònica del bacteriòfag λ. Tinció negativa amb molibdat amònic.

22 M. MUNIESA

witz i Hagen, 1980; Oppenheim et al., 2005). Primera alternativa: cicle lític Si λ segueix el seu cicle lític, aleshores el primer que es produeix és la replicació del seu DNA. Com tots els virus, el fag λ no té la maquinària necessària per replicar-se i ha de manllevar la de la cèl·lula bacteriana, com a perfectes paràsits que són (vegeu la figura 2). Quan el fag λ segueix el cicle lític es comporta com un virus virulent. Per tal d’aconseguir la replicació del seu DNA, el fag λ utilitza els enzims de replicació del DNA del bacteri i els fa treballar per a ell. El bacteri atura les seves funcions pròpies en haver de treballar per al fag. El DNA del fag es replica nombroses vegades a fi que es formin còpies de DNA per als nous fags que es formaran. Una sèrie de proteï-

nes primerenques produïdes pel fag mateix ajudaran en aquesta tasca. Un cop hi ha prou còpies del DNA del fag, aquest mateix DNA aporta la informació necessària per sintetitzar les proteïnes que han de conformar la càpsida i la cua dels futurs nous fags. Amb aquest sistema, nombroses proteïnes estructurals del fag, incloent-hi les de la cua, es formen i són encaixades. Finalment, cada còpia de DNA del fag es col·loca a dins de cada nova càpsida formada i es generen noves partícules completes de fag λ a l’interior del bacteri. Un darrer grup de proteïnes tardanes del fag, les lisines, causaran la lisi i mort de la cèl·lula bacteriana per tal de permetre l’alliberament dels nous fags a l’exterior. Però no és pel cicle lític pel qual λ és un organisme famós: la seva característica especial és la capacitat de seguir una segona alternativa, o de triar entre totes dues.

1

LamB

2

4

3

Injecció del DNA

Replicació del DNA i producció de proteïnes del fag

5

Assemblatge dels nous fags

Alliberament dels nous fags per lisi del bacteri

Figura 2. Mecanisme d’infecció del fag λ i desenvolupament del cicle lític. 1 i 2. Adsorció i injecció del DNA per la cua del fag i penetració a l’interior del bacteri. 3. Replicació del DNA del fag i síntesi de proteïnes fàgiques. 4. Assemblatge de les càpsides dels nous fags i introducció del DNA a dins les càpsides. 5. Alliberament dels nous fags per lisi del bacteri mitjançada per lisines. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

EL BACTERIÒFAG LAMBDA, UN MODEL DE DECISIÓ GENÈTICA 23

nisme va ser estudiat per un col·lega i amic d’Esther Lederberg, el microbiòleg Allan Campbell, el 1962. La integració del DNA del fag dins del bacteri té lloc gràcies a una proteïna del fag, la integrasa. Aquesta permet que el genoma del fag s’insereixi en un lloc concret del genoma del bacteri (vegeu la figura 3) (Heskowitz i Hagen, 1980; Willey et al., 2008). Un cop integrat el DNA del fag, el cicle lisogènic es manté gràcies a una acurada regulació a escala genètica, que és altament estable. En l’estat lisogènic, el DNA de λ s’anomena profag, i roman resident dintre del genoma del bacteri sense causar-li cap dany aparent. El fag capaç de seguir el cicle lisogènic, com λ, s’anome-

Segona alternativa: cicle lisogènic Algunes vegades el fag pot seguir el cicle lisogènic. És sobretot en aquest cicle en què el fag λ apareix com el principal model i és a partir dels estudis fets amb λ quan es va començar a entendre com es prenen les decisions de regulació genètica a escala molecular. No tots els fags són capaços de seguir aquesta segona alternativa, i això fa que λ sigui tan especial. A diferència del cicle lític, aquest cicle no causa la mort bacteriana. Per contra, el genoma del virus, un cop introduït dins del bacteri, s’integra en el cromosoma del bacteri hoste (vegeu la figura 3). Aquest meca-

DNA de λ circular xis int

fag λ attP

INTEGRACIÓ

Integrasa

Escissionasa

ESCISSIÓ

bacteri attB

DNA de λ integrat en el genoma bacterià Figura 3. Cicle lisogènic del fag λ. Esquema d’integració del DNA del fag en el cromosoma bacterià mitjançant la integrasa (int) i els llocs att. El pas contrari, l’escissió del DNA del fag en cas d’inducció del cicle lític, es produeix mitjançant l’escissionasa (xis). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

24 M. MUNIESA

briment dels gens que codifiquen aquestes proteïnes de decisió va ser tan rellevant que en els sistemes que s’han estudiat després de λ es té la tendència a cercar els gens homòlegs que facin les funcions de cro o cI. CRO i CI són proteïnes que funcionen unint-se a determinades regions promotores del DNA del fag. Tot i que el model mecànic d’aquesta regulació és força complex, de manera sintètica direm que en unir-se totes dues proteïnes estimulen o bloquegen la transcripció dels gens que provocaran un cicle o l’altre. La base d’aquesta decisió és, doncs, una lluita basada en la concentració de cada una d’aquestes proteïnes: quan la concentració d’una superi l’altra, es determina la decisió envers un cicle o l’altre. Permeteu-me una

na fag temperat, i el bacteri que té un fag temperat al seu interior, lisogen. La lisogènia estudiada en λ fa que aquest fag hagi servit també com a model de transferència genètica, tal com veurem més endavant. MODEL GENÈTIC DE DECISIÓ La decisió lisi-lisogènia no es pren de qualsevol manera, sinó que es basa en una regulació a escala molecular que ha estat molt ben caracteritzada. La base de la regulació recau en dues proteïnes: la proteïna CRO, que activa el cicle lític (la formació de nous fags) i la lisi cel·lular, i la proteïna CI, que manté el cicle lisogènic (manté el DNA del fag integrat en el genoma bacterià) (vegeu la figura 4). El desco-

Lisi

Lisogènia

Integració

cro

CI

CRO

Inducció

Lisogènia Integrasa

CI

cI

cro

CI CI CI

cI

CI CI

>

Factors ambientals - llum ultraviolada - antibiòtics - tòxics − ↓ cAMP

CRO

SOS

CRO

CI

Lisi

N

CRO

cI

cro CRO CRO

CI

CI

<

CRO CRO

CRO

Figura 4. Regulació del cicle liticolisogènic del fag λ. El producte del gen cro regula el cicle lític i el producte del gen cI regula la lisogènia. Si la concentració de CI és més gran que la de CRO, s’inhibeix CRO, s’estimula la síntesi de CI i s’estableix la lisogènia. Si, per contra, determinats factors ambientals causen l’activació de la resposta SOS, això produeix l’eliminació de CI, que baixa en concentració respecte a CRO. Aleshores s’estimula la síntesi de CRO i s’inhibeix la de CI. L’augment de CRO porta a la inducció del cicle lític de λ. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

EL BACTERIÒFAG LAMBDA, UN MODEL DE DECISIÓ GENÈTICA 25

aproximació simplificada al que té lloc en cada un dels supòsits: Progressió a cicle lític: en aquest cas hi ha més producció de proteïna CRO i menys de CI. En unir-se CRO, estimula la seva expressió pròpia i, a més, l’expressió dels gens implicats en la via lítica. A més, inhibeix la producció de CI, amb la qual cosa continua mantenint el nivell més alt de CRO i més baix de CI (Heskowitz i Hagen, 1980; Oppenheim et al., 2005). En expressar-se CRO, s’activen altres gens: gens encarregats de la síntesi de la càpsida i la cua del fag, de l’encaix i, finalment, de l’expressió dels gens de lisi. Progressió a cicle lisogènic: en aquest cas, els nivells de CI són superiors als de CRO. Els alts nivells de CI causen, en primer lloc, més expressió del CI mateix i, també, bloquegen l’expressió de CRO, reprimint els gens de la càpsida, els gens per a l’assemblatge i els de les proteïnes de lisi (Friedman i Court, 2001; Oppenheim et al., 2005). A més, la presència de CI activa l’expressió de la integrasa del fag, que, tal com s’ha comentat, permetrà la integració del DNA del fag dins del genoma bacterià (vegeu la figura 4). Així estant, l’estat lisogènic es mantindrà sempre que CI es mantingui a una concentració superior a CRO. L’estat lisogènic és afavorit quan hi ha molts virus, o si hi ha molts ions bivalents al medi (Adams, 1959). Tercera alternativa: tornar a activar el cicle lític El fag en estat lisogènic pot tornar a activar el cicle lític mitjançant un canvi que s’anomena inducció del fag. Aquesta alternativa implica que les decisions moleculars que poden semblar irreversibles poden tenir un nivell de complexitat superior que en permeti la reversió si canvien les condiTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

cions ambientals. Aquesta senzilla observació en un petit fag té grans implicacions que han estat la base d’estudis genètics posteriors en altres organismes i han condicionat la nostra comprensió de les decisions a escala molecular. La decisió que dóna com a resultat l’inici del cicle lític a partir de la lisogènia involucra un sistema regulador que s’anomena resposta SOS. La resposta SOS és un conjunt de canvis que es produeixen en els bacteris com a resposta davant de certs factors ambientals que comporten estrès. Això activa el fag λ, cosa que molts autors interpreten com una resposta del fag, que se sent «amenaçat» per factors externs que podrien perjudicar-lo. Així es pren la decisió de «sortir» del bacteri. S’inicia aleshores un procés invers al descrit per a l’establiment del cicle lisogènic, i que té com a objectiu la creació i disseminació de nous fags. L’activació de la resposta SOS activa la proteïna RecA, que degrada CI i en redueix la concentració. Com a conseqüència, la concentració de CRO augmenta i s’indueix el cicle lític. Aleshores, es dóna l’escissió del DNA del fag des del cromosoma bacterià i el profag resultant (vegeu la figura 3) forma nous fags λ, que són alliberats fora del bacteri. MODEL EVOLUTIU DE TRANSFERÈNCIA GENÈTICA HORITZONTAL Tal com s’ha comentat més amunt, l’especial cicle vital de λ té d’altres implicacions. En integrar-se dins del genoma d’un bacteri, λ és capaç d’introduir-hi els seus gens. En l’estat lisogènic, el DNA de λ (o profag) roman resident dintre del genoma del bacteri. El bacteri que té un fag al seu interior (lisogen) es continua dividint i provoca la duplicació del DNA del fag en cada nova divisió. Els gens de λ integrats

26 M. MUNIESA

al cromosoma bacterià poden ser, per tant, expressats pel bacteri. Quan un bacteri integra un fag en un lloc concret del seu genoma i expressa els gens del fag, diem que aquests gens han estat transduïts. Aquest mecanisme és un dels tres mecanismes de transferència genètica horitzontal descrits en bacteris: conjugació, transformació i transducció. La transducció fàgica és el mecanisme pel qual els bacteris es transfereixen DNA transportat mitjançant un fag. La transducció pot ser generalitzada o especialitzada. El fag λ és el típic exemple de fag temperat que fa transducció especialitzada: el fag s’integra en un lloc específic del cromosoma bacterià. El model de λ ha permès també l’estudi d’altres fags que «s’assemblen» a λ. S’anomenen fags lambdoides, i tenen una estructura genètica força similar, malgrat que presenten certes diferències. Les seqüències completes del fag λ i d’altres fags lambdoides s’ha determinat en els darrers anys. La comparació d’aquestes seqüències ha donat una nova perspectiva a temes d’estudi tan rellevants com l’evolució dels virus i l’evolució dels bacteris (Canchaya et al., 2004). Evolució dels virus L’estructura genètica dels fags és com un mosaic, en què diferents fags comparteixen els mateixos gens o grups de gens. Això implica que els fags s’intercanvien aquests fragments entre si, probablement per recombinació. El tipus de recombinació de λ permet la recombinació de fragments molt petits, i aquesta activitat tan potent té un paper important en aquests fenòmens de recombinació entre fragments de DNA, tot i que no siguin idèntics. Imaginem diversos fags integrats com a profags dins del genoma d’una mateixa cèl·lula bacteriana.

Aquests diversos fags es poden (de fet ho fan) intercanviar fragments de DNA entre si entrecreuant-se els fragments entre zones homòlogues. Quan aquests fags activen posteriorment el seu cicle lític, els nous fags generats no són idèntics als seus progenitors, sinó que han incorporat o perdut fragments de DNA: han evolucionat. La recombinació entre fags, iniciada amb λ, continuada amb fags lambdoides, és extensible a virus de la mateixa família o entre fags molt diversos, que poden infectar bacteris diferents (E. coli o Streptomyces, per exemple). Aquest fet explica per què es troben fags filogenèticament molt distants entre si, però que per contra comparteixen regions de DNA exactament iguals. Dins de la seqüència de λ, hi ha fragments que no s’han identificat, trossos de DNA que no se sap per a què serveixen. S’han anomenat morons, i es creu que podrien ser fragments recentment transferits des d’un altre fag (Hendrix et al., 1999, 2000). No es coneix quin pot ser el benefici concret obtingut pels virus en incorporar (o perdre) nous fragments de DNA, però sens dubte, la incorporació de nous gens incrementa la variabilitat genètica dels organismes i aquesta sempre és benvinguda, atesos els avantatges selectius que pot proporcionar. Evolució dels bacteris La sospita del paper de λ i els fags lambdoides en l’evolució bacteriana s’inicia amb el descobriment de Freeman el 1951 en què es va descriure que els fags poden estar relacionats amb la virulència bacteriana. Freeman va provar que un fag de Corynebacterium portava el gen de la toxina diftèrica. Esther Lederberg, el 1956, va potenciar aquest paper en estudiar la transducció del fag λ en E. coli K-12 (Morse et al., 1956), Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

EL BACTERIÒFAG LAMBDA, UN MODEL DE DECISIÓ GENÈTICA 27

i va provar la importància d’aquest fet, no solament per explicar la transferència de resistència bacteriana, sinó també com un important mecanisme d’evolució bacteriana. Posteriorment es va veure que altres fags lambdoides també porten gens que codifiquen factors de virulència. L’exemple més significatiu és el dels fags Stx, que porten el gen de la toxina Shiga, una toxina molt similar a una toxina de Shigella, però produïda per E. coli (O’Brien et al., 1984; Muniesa et al., 2009). Aquestes toxines són importants en la virulència d’algunes soques d’E. coli, anomenades enterohemorràgiques, perquè causen diarrea amb sang i complicacions més greus. De la mateixa manera que els fags Stx, el fag λ mateix transporta gens relacionats amb la virulència bacteriana. El gen bor, que confereix al bacteri lisogenitzat per λ resistència al sèrum animal, i el gen lom, que s’expressa en la membrana externa del bacteri lisogenitzat i pot ajudar a la unió dels bacteris amb cèl·lules de mamífers (Barondess i Beckwith, 1990; Waldor et al., 2005). Els gens de virulència transportats per fags són els més estudiats, per raons obvies, però altres gens relacionats amb el metabolisme o l’adherència bacteriana també s’han observat en el genoma d’alguns fags (Canchaya et al., 2004). La conseqüència de tot això és que els fags que incorporen en el seu DNA gens bacterians i que després infecten bacteris poden transferir els gens a aquests bacteris (transducció), la qual cosa fa canviar el DNA del bacteri infectat. Aquest fet va ser àmpliament estudiat en el fag λ (Lederberg, 1956). A vegades aquests gens no perduren si el fag activa de nou el seu cicle lític, la qual cosa farà que el bacteri es lisi i es perdi el nou gen incorporat. Però de vegades observem coses curioses tot just abans de produir-se aquesta lisi. Per exemple, si considerem un fag que transporta i Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

transdueix el gen d’una toxina en un bacteri, el fet interessant és que, quan s’activa el cicle lític dels fags, augmenta dràsticament la producció de toxina d’aquestes soques. Això succeeix just abans que el bacteri es lisi per causa dels nous fags induïts. Aquests descobriments porten a la idea que el fag, més que ser un mer vehicle de transport de gens de virulència, té un paper important en la regulació mateixa de l’expressió de la toxina (Canchaya et al., 2004; Muniesa et al., 2009). A més, l’estudi d’aquest model genera una interessant paradoxa: per què una cèl·lula bacteriana augmenta la seva virulència tot just abans de ser lisada per un fag? Quin sentit té que es torni més virulenta si, al cap i a la fi, acabarà morint quan els fags en surtin? Tot i que encara no hi ha una resposta definitiva a aquesta pregunta, molts autors han proposat una solució molt elegant a aquesta paradoxa. Es pensa que potser dintre de la població d’E. coli, una subpoblació augmenta la seva virulència, i augmenta la producció de toxina i la generació de nous fags que la transporten, malgrat que això representa la mort d’aquesta subpoblació, una espècie de suïcidi altruista. Paral·lelament, una altra subpoblació roman intacta, sense activar la lisi del fag i sense generar fags nous. No es torna més virulenta, però continua existint. Amb aquest mecanisme, el global de la població d’E. coli pot perdurar i alhora ser més virulenta. A més, es generen nous fags alliberats a l’exterior que serien capaços de tornar a infectar altres bacteris i transferir-los el gen de la toxina per transducció fàgica (Wagner et al., 1999; Canchaya et al., 2004; Serra-Moreno et al., 2008). Encara hi ha més observacions interessants que expliquen el paper de fags en l’evolució bacteriana. De vegades, després de moltes divisions bacterianes, el fag (o, més correctament, el profag) perd la seva capa-

28 M. MUNIESA

citat de revertir el seu estat lisogènic i d’activar el cicle lític. Això s’ha observat amb λ i amb altres fags. El fag es queda literalment atrapat en la seva forma de DNA dins del genoma del bacteri i deixa de ser un profag, per passar a ser el que s’anomena un fag defectiu. D’aquests se’n localitzen en gran quantitat dins els genomes bacterians que s’han anat seqüenciant (Canchaya et al., 2004). Alguns fags defectius es creu que són de tipus lambdoide, i d’altres no. Segurament se’n seguiran trobant en altres genomes bacterians que se seqüenciïn en el futur. Així, el bacteri que transporta un profag defectiu ha incorporat definitivament els gens d’aquest sense possibilitat de perdre’ls, almenys per activació del cicle lític. El bacteri ha adquirit material genètic nou, ha evolucionat. UNA EINA MOLT ÚTIL A MÉS D’UN MODEL: APLICACIONS DE λ EN BIOLOGIA MOLECULAR El coneixement sobre el fag λ ha proporcionat eines molt útils per aplicar-les en ciència. En concret, en la disciplina de la biologia molecular, en la qual s’estudia el funcionament biològic dels sistemes a escala molecular. Una de les aplicacions més simples del fag és aprofitar el seu DNA, fàcil d’extreure i de seccionar, com a marcador de pesos moleculars. Efectivament, el DNA del fag λ, un cop tallat amb enzims de restricció, que tallen en determinades zones del DNA, genera fragments de mida coneguda. Aquest patró de bandes del DNA del fag (de mida coneguda) es fa servir de manera comparativa per verificar la mida dels fragments de DNA amb els quals es treballa. Nombrosos laboratoris on es fan tècniques de reacció en cadena de la polimerasa (PCR) utilitzen marcadors basats en el

DNA del fag λ per comprovar la mida dels fragments amplificats amb PCR. A més, diversos fragments i gens del fag λ s’han fet servir per construir vectors, elements genètics que serveixen per clonar gens a la manera d’una màquina de replicació que, un cop introduïda dins d’un bacteri, ens genera nombroses còpies del gen en estudi. Entre aquests gens tenim zones per on λ comença a copiar el seu DNA (origen de replicació), zones d’homologia amb el cromosoma del bacteri, zones de recombinació, etc. Diversos processos han aprofitat el coneixement sobre el genoma de λ i la seva capacitat per introduir el seu DNA en el genoma del bacteri. El descobriment de les funcions de recombinació de λ ha portat a generar noves estratègies per aprofitar aquestes funcions. Enzims propis de λ s’utilitzen en aquests processos. Entre d’altres, integrases, de les quals hem parlat en les seccions anteriors, i recombinases. D’aquestes destaca la Red-recombinasa, una proteïna de λ que produeix la recombinació dels fragments de DNA lineal amb DNA bacterià utilitzant zones homòlogues del DNA, i que aconsegueix integrar-lo (Datsenko i Banner, 2000). Això permet introduir de manera artificial fragments del genoma que es vol estudiar dins d’un determinat bacteri. Majoritàriament, s’ha treballat amb E. coli, però recentment s’ha adaptat el sistema a altres bacteris (Friedman i Court, 2001). Aquestes característiques recombinatòries ja s’havien provat amb Saccharomyces cereviciae, però ha resultat que, gràcies a la utilització de la recombinació mitjançant λ, ara es pot aconseguir que E. coli faci el mateix, però amb molta més eficiència que Saccharomyces. Aquest sistema s’ha desenvolupat i ha arribat a tenir un nom propi, recombineering, que prové de la fusió dels termes anglesos recombination (‘recombinació’) i engineering Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

EL BACTERIÒFAG LAMBDA, UN MODEL DE DECISIÓ GENÈTICA 29

(‘enginyeria’). Es podria traduir com a enginyeria de recombinació. En aquesta enginyeria són possibles moltes aproximacions: fragments linears molt curts, variacions d’un sol nucleòtid i incorporació de fragments amplificats amb PCR, entre d’altres. El fag λ també s’ha utilitzat com a vehicle per transportar gens. Utilitzant partícules del fag en què s’han modificat algunes proteïnes de la càpsida s’ha aconseguit que aquest infecti i transfereixi el seu DNA a cèl·lules animals (Lankes et al., 2007). Una altra aplicació relacionada és la utilització del fag λ per presentar proteïnes en la seva càpsida. Aquesta metodologia rep la denominació de phage display en anglès, i consisteix a introduir el gen de la proteïna que volem presentar dins d’un gen d’una proteïna de la càpsida del fag. Quan genera la seva càpsida, el fag incorpora la proteïna en estudi associada a les proteïnes de la seva càpsida; aleshores diem que «presenta» la proteïna en estudi en la seva superfície. El phage display és una tecnologia que ha tingut èxit en diverses aplicacions durant els darrers anys, tant per a l’estudi de processos biològics com per aïllar molècules amb un valor pràctic (Garufi et al., 2005). El phage display presenta una vessant interessant del fag com a vehicle potencial per a vacunes. Els estudis duts a terme indiquen que el sistema immunitari del subjecte reacciona contra el fag. Si la proteïna del fag es modifica de manera que s’assembli, posem per cas, a la proteïna d’un virus de la grip, podríem estar generant una vacuna amb fag λ com a vehicle, en principi innocu per a l’individu, capaç de presentar la proteïna del virus de la grip al sistema immunitari i generar un augment de les defenses envers el virus (Lankes et al., 2007). Finalment, un altre ús dels fags que està incrementant la seva importància els darrers anys és la teràpia fàgica. Això és l’ús Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

de fags lítics per eliminar bacteris. Es presenta com una alternativa als antibiòtics i el van desenvolupar per a ús clínic ja fa molts anys diversos grups d’investigació de l’Europa de l’Est i dels Estats Units. Ara torna a ressorgir com a alternativa per tal d’evitar les resistències bacterianes als antibiòtics (Brüssow, 2005). La major part de la recerca en teràpia fàgica s’ha fet amb fags lítics que infecten E. coli. Aquests són fags de tipus T i tipus λ. Malgrat tot, el fet que alguns fags puguin fer el cicle lisogènic com λ pot tenir implicacions no desitjades d’intercanvi de DNA amb els bacteris i pot ser un inconvenient per utilitzar-los per a teràpia fàgica. BIBLIOGRAFIA Adams, M. H. (1959). Bacteriophages. Nova York: Insterscience Publishers. Barondess, J. J.; Beckwith, J. (1990). «A bacterial virulence determinant encoded by lysogenic coliphage lambda». Nature, 346: 871-874. Brüssow, H. (2005). «Phage therapy: the Escherichia coli experience». Microbiology, 151: 2133-2140. Campbell, A. (1962). «Episomes». Adv. Genetics, 11: 101-145. Canchaya, C.; Fournous, G.; Brussow, H. (2004). «The impact of prophages on bacterial chromosomes». Mol. Microbiol., 53: 9-18. Datsenko, K. A.; Wanner, B. L. (2000). «One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 6640-6645. Freeman, V. J. (1951). «Studies on the virulence of bacteriophages infected strains of Corynebacterium diphtheriae». J. Bacteriol., 61: 675-688. Friedman, D. I.; Court, D. L. (2001). «Bacteriophage lambda, alive and well and still doing its thing». Curr. Opin. Microbiol., 4: 201-207. Garufi, G.; Minenkova, O.; Lo Passo, C.; Pernice, I.; Felici, F. (2005). «Display libraries on bacteriophage lambda capsid». Biotechnol. Annu. Rev. 11: 153-190. Hendrix, R. W.; Lawrence, J. G.; Hatfull, G. F.; Casjens, S. (2000). «The origins and ongoing evolution of viruses». Trends Microbiol., 8: 504-508.

30 M. MUNIESA Hendrix, R. W.; Roberts, J. W.; Stahl, F. W.; Weisberg, R. A. (1983). Lambda II. Nova York: Cold Spring Harbor Lab. Press. Hendrix, R. W.; Smith, M. C.; Burns, R. N.; Ford, M. E.; Hatfull, G. F. (1999). «Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: all the world’s a phage». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 96: 2192-2197. Herskowitz, I.; Hagen, D. (1980). «The lysis-lysogenic decision of phage λ: explicit programming and responsiveness». Annu. Rev. Genet., 14: 399345. Lankes, H. A.; Zanghi, C. N.; Santos, K.; Capella, C.; Duke, C. M.; Dewhurst, S. (2007). «In vivo gene delivery and expression by bacteriophage lambda vectors». J. Appl. Microbiol., 102: 13371349. Lederberg, E. (1950). «Lysogenicity in Escherichia coli strain K-12». Microbial Genet. Bull., 1: 5-8. ― (1951). «Lysogenicity in E. coli K-12». Genetics, 36: 560. ― (1955). «Pleiotropy for maltose fermentations and phage resistance in E. coli K12». Genetics, 40: 580581. Little, J. W. (2006). «Gene regulatory circuitry of phage lambda». A: Calendar, R. [ed.]. The bacteriophages. Nova York: Oxford university press, p. 74-82. Morse, M.; Lederberg, E.; Lederberg, J. (1956). «Transduction in Escherichia coli K-12». Genetics, 41: 121-156.

Muniesa, M.; Serra-Moreno, R.; Jofre, J. (2009). «Bacteriophages within the Bacterial genomes: Contribution to bacterial variability». A: Horace, T. A. [ed.]. Contemporary Trends in Bacteriophages Research. Nova York: Nova Science Publishers, p. 47-78. O’brien, A. D.; Newland, J. W.; Miller, S. F.; Holmes, R. K.; Smith, H. W.; Formal, S. B. (1984). «Shiga like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorragic colitis or infantile diarrhea». Science, 226: 694-696. Oppenheim, A. B.; Kobiler, O.; Stavans, J.; Court, D. L.; Adhya, S. (2005). «Switches in bacteriophage lambda development». Annu. Rev. Genet., 39: 409-429. Serra-Moreno, R.; Jofre, J.; Muniesa, M. (2008). «The CI repressors of Shiga toxin-converting prophages are involved in coinfection of Escherichia coli strains, which causes a down regulation in the production of Shiga toxin 2». J. Bacteriol., 190: 4722-4735. Wagner, P. L.; Acheson, D. W.; Waldor, M. K. (1999). «Isogenic lysogens of diverse shiga toxin 2-encoding bacteriophages produce markedly different amounts of shiga toxin». Infect. Immun., 67: 6710-6714. Waldor, M. K.; Friedman, D. I.; Adhya, S. L. (2005). Phages: their role in bacterial pathogenesis and biotechnology. Washington DC: ASM Press. Willey, J. M.; Sherwood, L. M.; Woolverton, C. J. (2008). Principios de Microbiologia de Prescott. Madrid: McGraw-Hill, p. 427-446.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 19-30

DOI: 10.2436/20.1501.02.102

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 31-43

Escherichia coli, UN PETIT GRAN ORGANISME Carlos Balsalobre Departament de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona Adreça per a la correspondència: Carlos Balsalobre. Departament de Microbiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Tel.: 934 034 622. Adreça electrònica: cbalsalobre@ub.edu. RESUM Els processos essencials que tenen lloc dins les cèl·lules, tant fisiològics com genètics o bioquímics, estan altament conservats entre tots els éssers vius. Els bacteris són microorganismes d’estructura cel·lular senzilla en comparació de les cèl·lules dels organismes superiors. A més, molts bacteris es divideixen molt ràpidament, són fàcilment manipulables i es poden fer créixer en una àmplia varietat de medis de cultiu. Tot això ha fet que els bacteris s’hagin fet servir molt extensament com a model biològic per respondre qüestions sobre processos bàsics de la biologia que són comuns a tots els éssers vius. Per exemple, l’estat actual del coneixement biològic, el desenvolupament de la biologia molecular i moltes de les aplicacions biotecnològiques derivades són resultat, en gran mesura, de l’estudi en bacteriologia. Entre tots els bacteris utilitzats en laboratoris de recerca Escherichia coli ha estat, sens dubte, el més utilitzat, i ha donat lloc a molts dels coneixements de què disposem avui dia sobre el funcionament, l’estructura i l’evolució dels éssers vius. En aquest capítol fem una visió sobre l’ús passat, present i futur com a model biològic dels bacteris en general i d’E. coli en particular. Paraules clau: bacteri, Escherichia, microbiologia. Escherichia coli, A LITTLE BIG ORGANISM SUMMARY The basic physiological, biochemical and genetic processes that take place inside a cell are highly conserved among the different organisms. When compared with high organisms, bacteria are microorganisms that have a simple cell structure. Moreover, many bacteria can divide very quickly, are easy to handle and can grow in a broad variety of cul ture media. All these properties promoted that bacteria were used as model organisms to Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

32 C. BALSALOBRE

answer relevant biological questions common in all living beings. Present knowledge in biology, development of molecular biology and many biotechnological applications are mainly due to bacteriological studies. Among all, there is one bacterium that has been very extensively used in biological studies, Escherichia coli. Most of knowledge we have nowadays on the structure, physiology and evolution of the living creatures is based in data from E. coli based studies. In this chapter, an overview on the pass, present and future use of bacteria, and more specifically of E. coli, as a model organism is done. Key words: bacterium, Escherichia, microbiology. QUÈ ÉS UN BACTERI? La gran varietat d’organismes cel·lulars present sobre la Terra es pot dividir en dos grans grups: els organismes eucariotes, aquells en què les seves cèl·lules tenen el material genètic a l’interior d’una estructura membranosa ―el nucli― que el separa del citosol, i els procariotes, en què les cèllules no contenen embolcall nuclear i el material genètic es troba lliure al citoplasma. A més, i a diferència de les procariotes, les cèl·lules eucariotes presenten tota una sèrie d’orgànuls membranosos com els mitocondris, el reticle endoplasmàtic, l’aparell de Golgi, etc. Dins els organismes eucariotes trobem els animals, les plantes, els fongs i els protists. Els organismes procariotes són organismes microscòpics, predominantment unicel·lulars i que es reprodueixen asexualment per fissió binària. Mitjançant estudis de relacions filogenètiques s’han diferenciat dos grans dominis dintre dels organismes amb organització cel·lular procariota: els bacteris i els arqueus, aquests últims sovint associats amb ambients extrems. Els bacteris s’han dividit atenent a diferències estructurals de la paret cel·lular en grampositius i gramnegatius (Madigan et al., 2003). En aquest capítol ens centrarem en l’ús passat, present i futur dels bacteris com a organismes model en biologia. Els organismes model, a causa de diverses característiques, són útils com a material experimental per obtenir infor-

mació sobre processos biològics bàsics, extensibles a altres grups d’éssers vius. Un organisme model hauria de ser un sistema senzill, de fàcil estudi. Propietats com un creixement ràpid, una mida reduïda, disponibilitat i facilitat de manipulació són desitjades a l’hora d’escollir el model experimental en un treball de recerca. Com s’exposarà en aquest capítol, molts bacteris compleixen aquests requisits. Si bé les cèl·lules bacterianes, des d’un punt de vista estructural, són molt més simples que les cèl·lules dels organismes eucariotes, les diferències funcionals entre ambdues són molt més discretes. De fet, la major part dels processos essencials dintre de la cèl·lula, tant fisiològics com genètics o bioquímics, estan altament conservats entre tots els éssers vius, independentment de la presència o absència de nucli. Així, la composició química de les cèl·lules és similar, contenen els mateixos tipus de macromolècules: àcids nucleics, proteïnes, lípids i carbohidrats; utilitzen bàsicament les mateixes reaccions metabòliques per a la biosíntesi, obtenció i emmagatzemament d’energia a partir dels nutrients; i el flux de la informació genètica té lloc per processos aparentment idèntics. Aquesta dualitat, l’elevada conservació dels processos biològics bàsics i la simplicitat cel·lular van fer evident la idoneïtat dels bacteris com a model biològic per respondre qüestions fonamentals sobre l’estructura, el funcionament i l’evolució dels éssers vius. De fet, és remarTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

Escherichia coli, UN PETIT GRAN ORGANISME 33

cable que, a la primera meitat del segle xx, diversos fisiòlegs i genetistes que van iniciar treballs en sistemes eucariotes van canviar a bacteris perquè aquests proporcionaven un material experimental més adient per respondre les qüestions biològiques bàsiques plantejades. Les aportacions al coneixement científic fetes per estudis en què s’utilitzaven bacteris, al llarg dels últims cent anys, són molt nombroses. Potser cal remarcar que el seu ús va ser essencial en la que es considera, sens dubte, una de les grans fites científiques del segle xx: la caracterització de la naturalesa química del material hereditari. Els estudis pioners de Griffith l’any 1928 i els treballs d’Avery, MacLeod i McCarthy l’any 1944 sobre la transformació del bacteri Streptoccoccus pneumoniae van provar que l’àcid desoxiribonucleic (DNA) era el material hereditari. La descripció de l’estructura per part de Watson i Crick l’any 1953 va ser el punt de partida de la biologia moderna (Glass, 1982). Escherichia coli, LA «TOP MODEL» DINTRE DEL MÓN BACTERIÀ Són nombroses les espècies bacterianes que s’han utilitzat com a model experimental al llarg de la història recent de la ciència, però el bacteri Escherichia coli és possiblement l’organisme viu més estudiat. Alguns treballs fets amb aquest bacteri van permetre conèixer aspectes claus de la biologia, com ara la descripció d’un gran nombre de rutes metabòliques, la descripció detallada del concepte de gen, la resolució del codi genètic, els conceptes de mutació i recombinació, que han permès establir les bases moleculars de l’evolució dels éssers vius, etc. (Brock, 1990). E. coli és un bacteri present al tracte gastrointestinal dels animals endodèrmics que Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

va ser descobert el 1885 per Theodor Escherich, un doctor alemany especialitzat en l’estudi de malalties infeccioses que afectaven els infants. Theodor Escherich va batejar aquest bacteri com a Bacterium coli commune. L’any 1919 es va proposar la designació Escherichia coli, encara que no va ser oficialment acceptada fins a l’any 1958 (Shulman et al., 2007). E. coli és un bacil gramnegatiu no formador d’endòspores, mòbil i anaerobi facultatiu, és a dir, que pot créixer tant en presència com en absència d’oxigen (vegeu la figura 1). Atenent a tota una sèrie de característiques morfològiques i bioquímiques Escherichia està inclosa en la família de les Enterobacteriaceae, en què trobem tant espècies de vida lliure a la natura, com membres dels gèneres Klebsiella i Proteus, com espècies que estan adaptades a viure en associació amb hostes vertebrats, que inclouen membres de gèneres bacterians com Salmonella, Yersinia, Shigella, etc. (Madigan et al., 2003). E. coli pot sintetitzar tots els components cel·lulars necessaris a partir de diferents fonts de carboni, és un bacteri fàcilment cultivable que pot créixer en una àmplia varietat de medis de cultiu, incloent-hi medis de composició química definida. La

Figura 1. Imatge de cèl·lules d’E. coli obtinguda per microscòpia electrònica de transmissió. Es poden observar unes estructures filiformes que corresponen als flagels.

34 C. BALSALOBRE

temperatura òptima de creixement és de 37 °C i en condicions òptimes pot arribar a dividir-se cada 20 min (Neidhardt, 1996). Aquestes propietats, que són les desitjades en els organismes model, rapidesa i facilitat de creixement, no són exclusives d’E. coli, ja que també les presenten molts altres bacteris. Llavors, per què E. coli ha estat organisme model en biologia durant els últims cent anys? Les raons són diverses. A part de certes propietats intrínseques, com les esmentades anteriorment, és també el resultat de casualitats històriques i de la inèrcia que el coneixement facilita la generació de més coneixement. Al principi del segle xx, els bacteriòlegs interessats en estudis estructurals i fisiològics van escollir microorganismes que no fossin gaire virulents. Si bé, com veurem més endavant, hi ha soques d’E. coli que són importants patògens per a humans, les soques aïllades inicialment del tracte gastrointestinal de persones sanes i que s’han utilitzat de manera rutinària als laboratoris de recerca arreu del món compleixen aquest prerequisit. Així, les soques clàssiques de laboratori, denominades K-12, són innòcues per a l’ésser humà i no es requereixen mesures especials de contenció i bioseguretat per manipular-les al laboratori. Dos descobriments van ser decisius per potenciar la creixent popularitat d’E. coli entre la comunitat científica com a organisme model. El primer va ser la troballa per part de Massini el 1907 de variants d’E. coli aïllades del tracte gastrointestinal d’humans que no podien metabolitzar lactosa (lac‒), al contrari de les soques tipus d’E. coli, que eren capaces d’utilitzar aquest sucre (lac+). Aquest aïllament lac– es va denominar Escherichia colimutabile. Es va observar que a partir d’aquestes variants lac–, apareixien revertents lac+ amb una baixa freqüència. Aquests

descobriments van ser objecte d’acalorades discussions sobre l’origen de la variabilitat en bacteris i d’un intens debat sobre les visions lamarckianes i darwinianes de l’evolució. Treballs posteriors de Lewis (1934) i Luria i Delbrück (1943) amb E. coli van demostrar de manera convincent que les mutacions tenen lloc de manera espontània i es fan evidents sota pressió selectiva (Brock, 1990). Un altre fet important en la història d’E. coli va ser el descobriment que els bacteris, igual que les cèl·lules eucariotes, poden ser infectats per virus. Els virus bacterians, coneguts com a bacteriòfags, van ser descoberts per Herelle l’any 1917, quan estudiava casos de disenteria en humans causada per Shigella, un gènere bacterià molt proper a Escherichia (Waldor et al., 2005). Aquest descobriment va donar un fort impuls a la virologia, ja que la facilitat de cultivar els bacteris va permetre el desenvolupament de tècniques per a l’estudi dels virus. Els treballs pioners sobre els cicles vitals d’aquests microorganismes acel·lulars es van fer amb diferents espècies d’enterobacteris, especialment E. coli (vegeu el capítol sobre el bacteriòfag lambda). Aquests treballs van donar una empenta important a l’establiment d’E. coli com a organisme model. Així, segons relaten les cròniques de l’època, Jacques Monod, influenciat pel treball de genetistes bacterians, va escollir aquest bacteri per a la realització d’estudis fisiològics sobre creixement bacterià. Amb aquests treballs es va dur a terme la descripció del fenomen de la diàuxia, en què s’observava que quan Escherichia creixia en presència de dos sucres diferents (glucosa i lactosa) mostrava dues fases de creixement exponencial separades per un període de temps en què no es detectava increment de la població bacteriana. Aquests resultats foren determinants per establir que no tots els gens a les Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

Escherichia coli, UN PETIT GRAN ORGANISME 35

cèl·lules es troben expressant-se activament, sinó que hi ha mecanismes de regulació de l’expressió gènica que els modulen depenent de les condicions ambientals (Lewis, 2005). Finalment, va ser determinant per a l’establiment definitiu d’E. coli com a organisme model en les ciències biològiques que els mecanismes d’intercanvi genètic entre bacteris, com la conjugació i la transducció, tinguessin lloc de manera eficient en Escherichia. Això va permetre l’anàlisi genètica de diverses funcions cel·lulars. Amb el pas del temps, un altre aspecte beneficiós de treballar amb E. coli es va fer evident: com més se sap més fàcil és aprendre més. Les qüestions científiques poden ser resoltes d’una manera més eficient i les dades obtingudes poden ser interpretades més apropiadament quan es disposa d’un ampli coneixement de l’estructura, bioquímica, fisiologia i genètica de l’organisme utilitzat. La recerca amb E. coli resultava més eficient i productiva que amb altres bacteris menys estudiats o amb cèl·lules eucariotes. Amb aquest avantatge afegit, E. coli es va establir com un dels principals organismes model en biologia i ha estat una eina fonamental per aclarir molts secrets sobre com funcionen els éssers vius. Un punt d’inflexió en la història de la ciència moderna, que sens cap dubte ha influït tremendament la nostra societat, va ser el desenvolupament durant les dècades dels seixanta i setanta d’eines i metodologies que van permetre la manipulació in vitro del DNA, és a dir, el naixement de l’enginyeria genètica. Com no podria ser d’altra manera, el primer clonatge d’una molècula de DNA recombinant es va fer en E. coli l’any 1974 (Morrow et al., 1974). Des de llavors, la facilitat amb la qual és possible moure i eliminar gens en aquest bacteri ha permès estudiar la funció d’un elevat nombre de gens presents al seu genoma Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

mitjançant l’anàlisi genètica de mutants, i això ha promogut un ràpid progrés en el coneixement del funcionament de la cèl·lula bacteriana. És virtualment impossible enumerar els processos biològics que han estat descrits gràcies a estudis en què s’ha utilitzat E. coli com a model experimental. El seu ús ha estat clau per descriure la major part dels processos fisiològics que tenen lloc en una cèl·lula bacteriana. Per extensió, aquests coneixements han estat fonamentals per entendre la fisiologia de les cèl·lules eucariotes i dels organismes superiors, incloent-hi l’ésser humà. La biologia molecular, la immunologia, la virologia, la biologia cel·lular, la biologia del desenvolupament, etc., es basen en conceptes generats en estudis de genètica i fisiologia bacteriana. Si bé en aquest capítol ens hem centrat en el paper d’E. coli com a model experimental en ciència, hi ha moltes altres espècies bacterianes que han estat intensament utilitzades pels científics com a models experimentals. Així, s’ha de fer ressaltar, per exemple, un altre membre de la família Enterobacteriaceae, Salmonella enterica serovar Typhimurium, abans denominada Salmonella typhimurium, que ha estat extensament estudiada. El procés d’intercanvi genètic mitjançant transducció, que va donar un important impuls al desenvolupament de la genètica bacteriana, es va descobrir en Salmonella. Aquest bacteri, que té una important rellevància sanitària, ha estat utilitzat com a model per elucidar mecanismes bacterians que intervenen activament en el desenvolupament d’un procés infecciós. Un altre exemple seria Bacillus subtilis, un bacil grampositiu que normalment es troba al sòl, que forma endòspores en condicions adverses de creixement, i ha estat utilitzat com a model experimental en estudis de diferenciació i divisió cel·lular, segregació cromosòmica, etc.

36 C. BALSALOBRE

Escherichia coli, UNA EINA IMPRESCINDIBLE EN ELS LABORATORIS DE RECERCA I EL DESENVOLUPAMENT BIOTECNOLÒGIC La manipulació genètica en E. coli és molt més fàcil que en qualsevol altre organisme. Per això, encara avui dia, aquest bacteri és el més utilitzat per al clonatge de molècules de DNA recombinant. Al llarg de les últimes dècades s’han desenvolupat tota una sèrie d’eines, com soques modificades genèticament i vectors de clonatge que poden ser fàcilment transferits a Escherichia, que han optimitzat tremendament el procés de clonatge en aquest organisme. Així, independentment que l’objectiu final sigui o no el clonatge en Escherichia, és una pràctica comuna clonar DNA inicialment en aquest bacteri, atenent a la facilitat amb què s’hi poden manipular les molècules de DNA, abans de transferirles posteriorment a l’organisme destinatari. Una altra utilitat rellevant d’E. coli en els laboratoris d’investigació és l’ús per a l’expressió heteròloga de proteïnes, és a dir, la producció de proteïnes codificades en gens que han estat introduïts mitjançant enginyeria genètica. Tal com s’ha esmentat per al clonatge, també s’han dissenyat tota una sèrie de soques d’E. coli i vectors optimitzats per a la producció eficient de proteïnes tant per a ús en recerca bàsica com aplicada. L’avenç de la ciència va íntimament lligat al desenvolupament tecnològic i metodològic i E. coli és sovint l’organisme escollit per a l’optimització de noves metodologies experimentals, que posteriorment són aplicables a material biològic molt divers. Un bon exemple el tenim en el desenvolupament de la proteòmica, és a dir, les tècniques que pretenen identificar i quantificar cada una de les proteïnes presents en

una cèl·lula (Lee i Lee, 2003). Diversos estudis sobre el proteoma d’E. coli, disponible des de 1996, van ser pioners en l’ús d’aquestes metodologies (Appel et al., 1996; Han i Lee, 2006). A part del seu ús com a eina en l’enginyeria genètica, E. coli és directament utilitzat en nombroses aplicacions biotecnològiques. Així, es fa servir per a la producció industrial de metabòlits, com ara aminoàcids i proteïnes, tant per a ús terapèutic com industrial. A més, està sent utilitzat per a la producció de DNA per a terapèutica gènica i per a la creació de vacunes (Pósfai et al., 2006). Escherichia coli, UN MODEL DE PATOGÈNESI BACTERIANA E. coli és un bacteri altament especialitzat en la interacció amb organismes superiors i és un habitant freqüent del tracte gastrointestinal inferior de mamífers i ocells. La seva capacitat simbiòtica i l’èxit de la seva adaptació al tracte gastrointestinal és molt elevada, ja que es troba a la major part dels individus, encara que sigui un dels bacteris minoritaris de la població microbiana intestinal. La major part de les soques presents a l’intestí estableixen una relació de mutualisme amb l’hoste, en la qual Escherichia participa activament mitjançant la producció de vitamines que són absorbides per la mucosa intestinal (Wilson, 2005). Aquest tipus de soques, considerades beneficioses, es denominen comensals i són les que es van aïllar i utilitzar durant dècades als laboratoris de recerca biològica. Malgrat tot, entre les soques que conformen l’espècie E. coli en trobem una gran varietat quant al tipus de relacions que poden establir amb l’organisme hoste. A més de les soques comensals, trobem un grup molt divers de soques d’E. coli que poden causar infeccions en diferents òrgans de l’hoste. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

Escherichia coli, UN PETIT GRAN ORGANISME 37

Així, n’hi ha que causen diferents tipus d’afeccions gastrointestinals amb severitat variable, infeccions del tracte urinari, meningitis i sèpsies (vegeu la taula 1). Això fa d’E. coli un dels patògens més versàtils que es coneixen (Croxen i Finlay, 2010). La incidència d’infeccions causades per E. coli és important tant des d’un punt de vista sanitari com econòmic. Així, E. coli és considerada la causa d’un terç de les diarrees infantils en els països subdesenvolupats, la causa més comuna d’infeccions urinàries no hospitalàries i un dels principals responsables de sèpsies en humans. A més, és també l’agent causal de moltes de les diarrees associades amb animals de granja. Entre les prioritats de les autoritats sanitàries europees en relació amb les malalties infeccioses trobem el control de les infeccions per soques enterohemorràgiques d’E. coli, a causa de la severitat del quadre clínic que poden causar. Atenent a l’emergència actual de les malalties infeccioses com un problema sanitari a escala global de primer ordre, acompanyat de la problemàtica ineficàcia de moltes terapèutiques a causa del desenvolupament de resistència a antimicrobians per part dels bacteris patògens, s’ha fet evident la necessitat d’aprofundir en el coneixement dels mecanismes moleculars implicats en l’establiment d’un procés infecciós per part d’un microorganisme patogen. La descripció detallada de tots els passos que tenen lloc durant un procés infecciós podria permetre el desenvolupament de noves terapèutiques per fer front a les malalties infeccioses. L’estudi de diferents patògens ha permès establir l’existència d’estructures i processos que estan altament conservats entre diferents patògens i que són, per tant, possibles dianes per al desenvolupament de nous agents terapèutics. A continuació es detallen dos exemples en què les soques patògenes d’E. coli Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

s’han utilitzat com a model experimental per estudiar aquests aspectes. Un pas essencial en l’establiment d’un procés infecciós és l’adherència dels patògens a la superfície dels teixits de l’hoste. Això s’aconsegueix mitjançant l’expressió en la superfície dels bacteris de molècules que reconeixen específicament receptors presents a la superfície dels teixits. Aquestes molècules, denominades adhesines, es troben sovint a l’extrem d’unes estructures filiformes denominades fímbries (vegeu la figura 2). La descripció detallada del procés de síntesi, de l’estructura i dels aspectes funcionals de les fímbries es va fer principalment utilitzant soques d’E. coli que causen infeccions del tracte urinari (Hultgren et al., 1996). Aquestes fímbries són dianes per al desenvolupament de molècules amb un possible ús terapèutic, ja que si se’n pogués bloquejar la capacitat d’adherència o la producció, els bacteris perdrien la capacitat de causar infecció (Aronson et al., 1979; Aberg i Almqvist, 2007).

Figura 2. Imatge d’una cèl·lula fimbriada d’E. coli obtinguda per microscòpia de força atòmica.

38 C. BALSALOBRE Taula 1.

Diversitat dels aïllaments d’Escherichia coli

A. Soques comensals

B. Soques patògenes B1. Intestinals

B2. Extraintestinals

E. coli enteropatogènica (EPEC)

E. coli uropatògena (UPEC)

E. coli enterohemorràgica (EHEC)

E. coli causant de meningitis a nounats (NMEC)

E. coli enterotoxigènica (ETEC)

Soques causants de sèpsia

E. coli enteroinvasiva (EIEC) E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli amb adherència difusa (DAEC) Font: Adaptat de Croxen i Finlay (2010).

Un altre aspecte de la patogènesi és que la major part de patògens lliuren a l’espai extracel·lular o directament a les cèl·lules de l’hoste factors necessaris per induir la colonització i causar infecció mitjançant sistemes de secreció. Aquests sistemes es troben altament conservats en el món bacterià. E. coli ha estat l’organisme model per a la descripció de la majoria dels diversos sistemes de secreció bacterians (Desvaux et al., 2009). Aquests sistemes són possibles dianes per al disseny de noves molècules antivirulència, ja que la inactivació selectiva de la secreció proteica per part dels patògens n’implicaria l’atenuació i l’eliminació posterior per part del sistema immunitari (Baron i Coombes, 2007). La necessitat de disposar d’estratègies terapèutiques alternatives als antibiòtics ha fet ressorgir de nou l’interès per la fagoterapèutica, és a dir, l’ús dels bacteriòfags per a l’eliminació específica de bacteris patògens (vegeu el capítol 1). De fet, aquesta estratègia va ser utilitzada per al tractament de trastorns gastrointestinals durant la Segona Guerra Mundial per part de les tropes russes i alemanyes, però el descobriment dels antibiòtics en va aturar el desenvolupament. Com s’ha comentat, hi ha de

nou un interès en la possible aplicació de la fagoterapèutica en humans. Molts d’aquests estudis s’han fet amb bacteriòfags d’E. coli, anomenats colifags (Brüssow, 2005), i s’ha demostrat l’eficàcia d’aquests colifags per al tractament de malalties gastrointestinals en animals de granja (Smith et al., 1987). Escherichia coli COM A PROBIÒTIC El terme probiòtic fa referència a la utilització de preparacions de microorganismes vius que en ser aplicades o ingerides en les quantitats apropiades exerceixen un efecte positiu sobre la salut. Aquest concepte va ser popularitzat al principi del segle xx per Metchnikoff, que va proposar que una flora microbiana del tracte gastrointestinal sana proporcionava protecció envers patògens intestinals. La presència de gèneres bacterians del grup fisiològic dels bacteris de l’àcid làctic a la flora intestinal, com Bifidobacterium i Lactobacillus, es considera que influeix positivament en la fisiologia de l’hoste, protegeix enfront d’infeccions entèriques i retarda processos d’envelliment cel·lular que poden causar malalties Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

Escherichia coli, UN PETIT GRAN ORGANISME 39

greus (Klaenhammer, 2001). Aquestes propietats beneficioses que poden proporcionar certs bacteris han estat explotades des de llavors per millorar la qualitat de vida dels humans i millorar el rendiment a les explotacions ramaderes. Els bacteris de l’àcid làctic no són els únics que tenen un important interès com a probiòtics. Des del començament del segle xx, també es va provar el possible ús de certes soques d’E. coli com a probiòtics per evitar processos patològics. Com s’ha comentat anteriorment, certes soques d’E. coli, denominades comensals, formen part de la flora intestinal dels animals endodèrmics. En el cas dels humans, aquestes soques estableixen una relació de mutualisme bàsicament des del moment del naixement. La flora intestinal està formada majoritàriament per microorganismes anaerobis. En el 90 % dels adults, E. coli és el microorganisme anaerobi facultatiu més abundant, encara que representi un component minoritari de la microflora del tracte gastrointestinal (Wilson, 2005; Tenaillon et al., 2010). Durant la Primera Guerra Mundial, l’any 1917, Alfred Nissle, un metge alemany, va aïllar una soca d’E. coli d’un soldat que durant un període d’alta prevalença d’infeccions intestinals no en va patir cap. Es va veure que aquesta soca, denominada Nissle 1917, tenia un important efecte antagonístic enfront de patògens que causen afeccions gastrointestinals. Des de llavors i fins avui dia s’ha utilitzat l’administració oral de Nissle 1917 en càpsules per a ús terapèutic sota el nom de Mutaflor® (Schultz, 2008). Nissle 1917 presenta una sèrie de característiques especials que en permeten raonar el caràcter probiòtic: a) presenta la capacitat de produir diverses microcines que inhibeixen el creixement d’altres enterobacteris; b) presenta un lipopolisacàrid a la membrana externa amb propietats immunomoduladores que tenen Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

importància per la seva eficiència en el tractament de les colitis ulceroses; c) indueix la producció de defensines en les cèl·lules epitelials, estimulant el manteniment de la integritat física de la mucosa intestinal, i d) a més a més, alguns productes del seu metabolisme, com l’àcid acètic, promouen el moviment peristàltic del còlon. Diferents proves clíniques han mostrat la seva efectivitat enfront de la colitis ulcerosa, l’estrenyiment crònic i les diarrees agudes (Schulz, 2008). Altres soques d’E. coli també han estat utilitzades com a probiòtics en ramaderia per evitar infeccions en animals de granja i incrementar d’aquesta manera la rendibilitat de les explotacions i eludir la possible transmissió de patògens als consumidors (Klaenhammer, 2001). S’ha observat que un còctel de disset espècies d’E. coli i una soca de Proteus protegeix les vedelles de la infecció per la soca d’E. coli enterohemorràgica O157 (Zhao et al., 1998). Actualment E. coli s’està utilitzant com a model per al disseny de probiòtics per a la prevenció i el tractament de malalties gastrointestinals. Diferents estudis han mostrat que molts patògens utilitzen estructures de la superfície de les cèl·lules de l’hoste com a diana per a: a) la unió dels bacteris, que promou la colonització i invasió dels teixits, o b) la unió de les toxines bacterianes, que causa així danys cel·lulars. Això ha permès el desenvolupament de noves estratègies antiinfectives basades a interferir amb aquests processos d’unió amb els receptors de l’hoste. Aquestes estratègies poden ser especialment útils en malalties gastrointestinals. Es basen en la creació de bacteris probiòtics, que, per tant, són inofensius i poden sobreviure al tracte gastrointestinal, que expressin a la seva superfície grans quantitats dels receptors diana per a una toxina o patogen concret. D’aquesta manera, en ser administrats

40 C. BALSALOBRE

oralment i arribar a l’intestí, la major part de la toxina o el patogen present s’unirà al bacteri probiòtic en lloc de fer-ho a les cèllules de l’epiteli de l’hoste. Aquest segrest de les molècules inductores del procés patològic impedirà el desenvolupament de la malaltia (Paton et al., 2006). El fet que E. coli sigui un organisme fàcilment manipulable genèticament i que es disposi de soques amb un elevat caràcter probiòtic ha fet que aquest hagi estat el microorganisme utilitzat per provar l’efectivitat d’aquestes estratègies antiinfecció. Hi ha dades experimentals prometedores en què es mostra la capacitat de retenció de diferents toxines bacterianes per part de soques manipulades genèticament que expressen els receptors específics de les toxines a la seva superfície (Watanabe et al., 2004; Paton et al., 2005). L’ERA GENÒMICA La primera seqüència genòmica completa d’un organisme cel·lular va ser la del bacteri Haemophilus influenzae l’any 1995 (Fleishmann et al., 1995). Aquesta fita marca l’inici de l’era genòmica i va representar un important avenç en la història de la biologia. L’any 1997 es van completar i publicar les seqüències de dues soques K12 d’E. coli (Blattner et al., 1997; Yamammoto et al., 1997). Una de les sorpreses que van proporcionar aquests estudis va ser que, sent E. coli l’organisme més estudiat, dels aproximadament 4.400 gens trobats uns 2.000 no havien estat caracteritzats experimentalment. Això indica l’existència d’un nombre important de proteïnes de funció desconeguda que podrien participar en processos encara desconeguts en E. coli. Avui dia disposem de la seqüència genòmica d’un elevat nombre d’organismes, incloent-hi les seqüències completes de 29

soques diferents d’E. coli. Entre aquestes, trobem diverses soques K12, soques comensals no-K12 i soques patògenes. La genòmica ha permès el desenvolupament de metodologies d’estudi integrals, que permeten, per exemple, l’estudi del patró d’expressió gènica global de la cèl·lula mitjançant l’ús de microxips. També ha permès la creació d’eines de treball com la col·lecció Keio de soques mutants per a cada un dels 3.985 gens no essencials d’E. coli i la biblioteca de clons ASKA, que permet la sobreexpressió de qualsevol de les proteïnes codificades en E. coli (Baba et al., 2006; Kitagawa, 2005). Aquestes eines faciliten la determinació sistemàtica de funcions en gens i proteïnes mitjançant l’anàlisi genètica. Totes aquestes metodologies i estratègies a escala genòmica poden potencialment proporcionar grans quantitats d’informació per ampliar el coneixement del funcionament dels bacteris i, per extensió, de tots els éssers vius. Com a resultat de l’enorme quantitat d’informació que s’ha recol·lectat sobre E. coli durant els últims cent anys (fenotip de mutants, seqüència genòmica, vies reguladores i metabòliques) disposem de coneixement detallat sobre la regulació gènica, l’activitat proteica, centenars de reaccions enzimàtiques, vies metabòliques i interaccions reguladores d’aquest organisme model. Malgrat tot, entendre com tots aquests processos funcionen per formar una cèl·lula viva requereix una caracterització més detallada i integrar el coneixement experimental disponible amb models matemàtics i informàtics, és a dir, cal fer servir aproximacions de biologia de sistemes (systems biology approaches). E. coli és sens dubte el millor candidat per desenvolupar aquestes noves estratègies per entendre millor el funcionament d’un ésser viu, atenent a la quantitat d’informació bàsica disponible i a la facilitat de manipulació. Diverses metodologies de biologia de sisteTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

Escherichia coli, UN PETIT GRAN ORGANISME 41

mes han estat aplicades amb èxit de manera pionera en l’estudi de processos fisiològics complexos en E. coli, com són la quimiotaxi i la biosíntesi d’aminoàcids (Alexander i Zhulin, 2007; HernandezMontes et al., 2008). Un esforç per entendre el funcionament global de la cèl·lula d’E. coli accelerarà el desenvolupament de noves tecnologies, tant experimentals com informàtiques, que seran aplicables a altres microorganismes, plantes o animals. Així, des de la descripció de la seqüència genòmica d’E. coli, s’han fet anàlisis a escala global del seu transcriptoma (RNA), proteoma (proteïnes) i metaboloma (metabòlits), mitjançant l’ús de xips de DNA, electroforesi bidimensional en gel associada a espectrometria de masses, cromatografia líquida i de gasos associada a espectrometria de masses i bioinformàtica. Un valor afegit és que E. coli no és només l’organisme model més estudiat sinó que també és un microorganisme utilitzat en aplicacions industrials i biotecnològiques. A més, com ja s’ha comentat anteriorment, estableix relacions amb organismes hoste, tant beneficioses com perjudicials, per la qual cosa representa un model perfecte, mitjançant estudis de biologia de sistemes, per poder establir models d’estil de vida lliure i associat a organismes superiors, cosa que pot proporcionar informació important per entendre el comensalisme i els processos de patogènesi microbiana. ESTÀ PASSANT DE MODA Escherichia coli? A mesura que avança el coneixement científic, les qüestions no resoltes són cada vegada menys bàsiques. L’especialització de la recerca científica implica la necessitat de seleccionar organismes com a models experimentals que siguin adients per Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

als estudis plantejats. És obvi que els investigadors interessats en la fisiologia dels organismes superiors no poden utilitzar sempre bacteris com E. coli per demostrar les seves hipòtesis. Així, hi ha un nombre cada vegada més elevat d’organismes model en biologia, molts dels quals són tractats en els diferents capítols d’aquest volum monogràfic, i que han mostrat ser efectius per a l’àmbit científic corresponent. Igualment, el nombre de microorganismes utilitzats com a model experimental en microbiologia s’ha incrementat també en les últimes dècades. Per exemple, si uns microbiòlegs estan interessats a esbrinar els mecanismes implicats en les capacitats dels bacteris de degradar components tòxics presents a la natura no té cap sentit utilitzar E. coli com a model. Bacteris com Pseudomonas, Streptomyces, Caulobacter o Listeria, etc., estan sent intensament estudiats, i el coneixement derivat pot ser extensible a altres microorganismes relacionats bé per la seva semblança filogenètica, ecològica o fisiològica. Tot això indica que l’època daurada d’E. coli ha finalitzat? Bé, no hi ha cap dubte que perquè la ciència avanci es requereix una diversificació dels organismes model per utilitzar, però E. coli és encara l’organisme viu més estudiat i és utilitzat, com s’ha mostrat en diferents apartats d’aquest capítol, en molts estudis com a organisme model per intentar respondre qüestions bàsiques i particulars de rellevància per a l’avenç del coneixement bàsic i aplicat. A més a més, la seqüenciació del genoma ha provat que desconeixem d’E. coli molt més del que no ens pensàvem. Hi ha un gran nombre de gens que codifiquen proteïnes desconegudes que possiblement proporcionen funcions fins ara no descrites. Per tant, encara queda molta feina a fer, hem d’aprofundir en el coneixement d’aquest bacteri fascinant, fet que sens

42 C. BALSALOBRE

dubte pot proporcionar informació rellevant per entendre els sistemes biològics. AGRAÏMENTS Voldria agrair a Francisco Muñoa i a Cristina Madrid, del Departament de Microbiologia de la Universitat de Barcelona, la lectura crítica del text inicial i els suggeriments fets. BIBLIOGRAFIA Aberg, V.; Almqvist, F. (2007). «Pilicides-small molecules targeting bacterial virulence». Org. Biomol. Chem., 5: 1827-1834. Alexander, R. P.; Zhulin, I. B. (2007). «Evolutionary genomics reveals conserved structural determinants of signalling and adaptation in microbial chemoreceptors». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 104: 2885-2890. Appel, R. D.; Sanchez, J. C.; Bairoch, A.; Golaz, O.; Ravier, F.; Pasquali, C.; Hughes, G. J.; Hochstrasser, D. F. (1996). «The SWISS-2DPAGE database of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, its status in 1995». Nucleic Acids Res., 24: 180-181. Aronson, M.; Medalia, O.; Schori, L.; Mirelman, D.; Sharon, N.; Ofek, I. (1979). «Prevention of colonization of the urinary tract of mice with Escherichia coli by blocking of bacterial adherence with methyl alpha-D-mannopyranoside». J. Infect. Dis., 139: 329-332. Baba, T.; Ara, T.; Hasegawa, M.; Takai, Y.; Okumura, Y.; Baba, M.; Datsenko, K. A.; Tomita, M.; Wanner, B. L.; Mori, H. (2006). «Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection». Mol. Syst. Biol., 2: 2006-2008. Baron, C.; Coombes, B. (2007). «Targeting bacterial secretion systems: benefits of disarmament in the microcosm». Infect. Disord. Drug Targets., 7: 19-27. Blattner, F. R.; Plunkett, G.; Bloch, C. A.; Perna, N. T.; Burland, V.; Riley, M.; Collado-Vides, J.; Glasner, J. D.; Rode, C. K.; Mayhew, G. F.; Gregor, J.; Davis, N. W.; Kirkpatrick, H. A.; Goeden, M. A.; Rose, D. J.; Mau, B.; Shao, Y. (1997). «The complete genome sequence of Escherichia coli K-12». Science, 277: 1453-1462.

Brock, T. D. (1990). The emergence of bacterial genetics. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Brüssow, H. (2005). «Phage therapy: the Escherichia coli experience». Microbiology, 151: 2133-2140. Croxen, M. A.; Finlay, B. B. (2010). «Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity». Nature Review Microbiology, 8: 26-38. Desvaux, M.; Hébraud, M.; Talon, R.; Henderson, I. R. (2009). «Secretion and subcellular localizations of bacterial proteins: a semantic awareness issue». Trends Microbiol., 17: 139-145. Fleischmann, R. D. [et al.] (1995). «Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd». Science, 269: 496-512. Glass, R. E. (1982). Gene function. E. coli and its heritable elements. Berkeley, Los Angeles: University of California Press. Han, M.-J.; Lee, S. Y. (2006). «The Escherichia coli proteome: past, present and future prospects». Microbiology and molecular biology reviews, 70: 362439. Hernandez-Montes, G.; Diaz-Mejia, J. J.; PerezRueda, E.; Segovia, L. (2008). «The hidden universal distribution of amino acid biosynthetic networks: a genomic perspective on their origins and evolution». Genome Biol., 9: R25. Hultgren, S. J.; Jones, C. H.; Normark, S. (1996). «Bacterial adhesins and their assembly». A: Neidhardt, F. C. [ed.]. Escherichia coli and Salmonella. Washington: ASM Press, p. 2723-2756. Kitagawa, M.; Ara, T.; Arifuzzaman, M.; Ioka-Nakamichi, T.; Inamoto, E.; Toyonaga, H.; Mori, H. (2005). «Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K12 ORF archive): unique resources for biological research». DNA Res., 12: 291-299. Klaenhammer, T. R. (2001). «Probiotics and prebiotics». A: Doyle, M. P.; Beuchat, L. R.; Montville, T. J. [ed.]. Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. Washington: ASM Press, p. 797-812. Lee, P. T.; Lee, K. H. (2003). «Escherichia coli: a model system that benefits from and contributes to the evolution of proteomics». Biotechnology and bioengineering, 84: 801-814. Lewis, M. (2005). «The lac repressor». CR Biol., 328: 521-548. Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J. (2003). Brock biology of microorganisms. Upper Saddle River: Pearson Education, Inc. Morrow, J. F.; Cohen, S. N.; Chang, A. C. Y.; Boyer, H. W.; Goodman, H. M.; Helling, R. B. (1974). «Replication and transcription of eukaryotic DNA

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

Escherichia coli, UN PETIT GRAN ORGANISME 43 in Escherichia coli». Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 71: 1743-1747. Neidhardt, F. C. (1996). «The enteric bacterial cell and the age of bacteria». A: Neidhardt, F. C. [ed.]. Escherichia coli and Salmonella. Washington: ASM Press, p. 1-3. Paton, A. W.; Jennings, M. P.; Morona, R.; Wang, H.; Focareta, A.; Roddam, L. F.; Paton, J. C. (2005). «Recombinant probiotics for treatment and prevention of enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea». Gastroenterology, 128: 1219-1228. Paton, A. W.; Morona, R.; Paton, J. C. (2006). «Designer probiotics for prevention of enteric infections». Nature Rev. Microbiology, 4: 193-200. Pósfai, G. [et al.] (2006). «Emergent properties of reduced-genome Escherichia coli». Science, 312: 10441046. Schultz, M. (2008). «Clinical use of E. coli Nissle 1917 in immflamatory bowel disease». Innflamm. Bowel Dis., 14: 1012-1018. Shulman, S. T.; Friedmann, H. C.; Sims, R. H. (2007). «Theodor Escherich: the first pediatric infectious diseases physician?». Clinical Infectious Diseases, 45: 1025-1029. Smith, H. W.; Huggins, M. B.; Shaw, K. M. (1987). «The control of experimental Escherichia coli diarrhoea in calves by means pf bacteriophages». J. Gen. Microbiol., 133: 1111-1126.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 31-43

Tenaillon, O.; Skurnik, D.; Picard, B.; Denamur, E. (2010). «The population genetics of commensal Escherichia coli». Nature Reviews Microbiology, 8: 207-217. Waldor, M. K.; Friedman, D. I.; Adhya, S. L. (2005). Phages. Their role in pathogenesis and biotechnology. Washington: ASM Press. Watanabe, M.; Matsuoka, K.; Kita, E.; Igai, K.; Higashi, N.; Miyagawa, A.; Watanabe, T.; Yanoshita, R.; Samejima, Y.; Terunuma, D.; Natori, Y.; Nishikawa, K. (2004). «Oral therapeutic agents with highly clustered globotriose for treatment of Shiga toxigenic Escherichia coli infections». J. Infect. Dis., 189: 360-368. Wilson, M. (2005). Microbial inhabitants of humans. Cambridge: Cambridge University Press. Yamamoto, Y. [et al.] (1997). «Construction of a contiguous 874-kb sequence of the Escherichia coli K12 genome corresponding to 50.0-68.8 min on the linkage map and analysis of its sequence features». DNA Res., 4: 91-113. Zhao, T; Doyle, M. P.; Harmon, B. G.; Brown, C. A.; Mueller, P. O.; Parks, A. H. (1998). «Reduction of carriage of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in cattle by inoculation with probiotic bacteria». J. Clin. Microbiol., 36: 641-647.

DOI: 10.2436/20.1501.02.103

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 45-59

ELS LLEVATS COM A ORGANISME MODEL DE RECERCA EN BIOLOGIA Joaquín Ariño Departament de Bioquímica i Biologia Molecular i Institut de Biotecnologia i Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona Adreça per a la correspondència: Joaquín Ariño. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Edifici IBB, Universitat Autònoma de Barcelona. 08193 Bellaterra. Tel.: 935 812 182. Adreça electrònica: Joaquin.Arino@uab.cat. RESUM Els llevats, i en particular el llevat Saccharomyces cerevisiae, han estat durant molts anys un excel·lent organisme model per a estudis fonamentals en bioquímica, biologia cel·lular i genètica eucariòtica, i també per a la recerca aplicada. S. cerevisiae acumula una sèrie d’avantatges que no es troben en altres models, com un genoma compacte, una genètica senzilla i una manipulació molt fàcil, i és especialment adequat per a les aproximacions d’alt rendiment en genòmica, proteòmica i interactòmica. Per aquesta raó, és l’organisme d’elecció per desenvolupar i verificar noves tecnologies i per investigar processos biològics fonamentals i conservats evolutivament. Paraules clau: Saccharomyces cerevisiae, llevat, organisme model. YEAST AS A MODEL FOR RESEARCH IN BIOLOGY SUMMARY Yeasts, and particularly the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, have been for many years an outstanding model organism for fundamental studies in eukaryotic biochemistry, cell biology and genetics, as well as for applied research. S. cerevisiae accumulates a number of advantages that are not found in other models, such as a compact genome, straightforward genetics and easy manipulation, and it is particularly suitable for highthroughput genomic, proteomic and interactomic approaches. For that reason it is the organism of choice to develop and test new technologies and to investigate fundamental and evolutionarily conserved biological processes. Key words: Saccharomyces cerevisiae, yeast, model organism. Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

46 J. ARIÑO

QUÈ SÓN ELS LLEVATS Els llevats són eucariotes unicel·lulars que pertanyen al grup dels fongs. Hi comptem entorn de 1.500 espècies distribuïdes en els clades Ascomycota i Basidiomycota. Tot i que hi ha diversos llevats (i d’altres fongs) que són objecte continuat d’estudi en biologia (com ara Neurospora crassa, Candida albicans, Ustilago maydis o Aspergillus nidulans), aquesta revisió es concentrarà fonamentalment en una espècie, Saccharomyces cerevisiae, conegut també com a llevat de panificació o de cerveseria, pel fet que aquest hemiascomicet, a més de la seva rellevància industrial i en biotecnologia, constitueix un dels models de recerca més importants en biologia. De manera menys detallada també es descriuran algunes propietats de Schyzosaccharomyces pombe, un llevat filogenèticament molt distant de S. cerevisiae i que es reprodueix per fissió, la qual cosa el fa objecte d’interès, per exemple, en l’estudi del cicle cel·lular. PER QUÈ Saccharomyces cerevisiae ÉS UN SISTEMA MODEL EN BIOLOGIA? El llevat S. cerevisiae posseeix pràcticament totes les característiques que configuren un sistema model, a més d’altres que el fan pràcticament únic. Va ser introduït com a organisme experimental cap a la dècada dels trenta del segle passat i, des de llavors, l’elegància de la seva genètica i l’assoliment d’una sèrie de fites tecnològiques han fet que la seva contribució als camps de la biologia cel·lular i molecular hagi estat extraordinària. Es tracta d’un organisme que: a) Reuneix la complexitat d’una cèl·lula eucariota i la facilitat de manipulació d’un organisme unicel·lular.

b) És considerat com a no patogen (GRAS, generally regarded as safe), i pot ser manipulat sense precaucions especials. c) Creix ràpidament (temps de duplicació de 90-200 min) en medis de cultiu relativament poc complexos i força econòmics. d) És genèticament estable, i existeix en formes haploides i diploides que són interconvertibles a voluntat en el laboratori. e) El seu genoma és relativament petit (poc més de tres vegades el d’Escherichia coli), compacte i simple. La facilitat amb què aquest genoma pot ser manipulat és extraordinària i sense precedents en qualsevol altre eucariota. f ) Tot i la seva simplicitat, manté molts dels processos cel·lulars bàsics d’organismes més complexos (com ara processos biosintètics i la seva regulació, transcripció, regulació del cicle cel·lular, reparació del DNA, etc.), per la qual cosa molta de la informació obtinguda pot ser transferida a eucariotes més complexos, incloent-hi l’ésser humà. g) En part a causa del seu historial com a organisme d’interès industrial i tecnològic, en tenim un gran fons de coneixements bioquímics i genètics i s’han identificat i caracteritzat un gran nombre de mutants per a qualsevol funció cel·lular. UN REPÀS DE LA BIOLOGIA CEL·LULAR I LA GENÈTICA DE Saccharomyces cerevisiae Com és una cèl·lula de Saccharomyces cerevisiae? Normalment les cèl·lules haploides de S. cerevisiae són esferoides d’uns 4-5 μm de diàmetre, mentre que les diploides es mostren sota el microscopi com a el·lipsoides de 6 × 8 μm (vegeu la figura 1). El seu volum és entorn dels 70-120 μm3. Com tots Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

ELS LLEVATS COM A ORGANISME MODEL DE RECERCA EN BIOLOGIA 47

els llevats, està recobert d’una paret força gruixuda (100 a 200 nm) i que representa el 20 % de la massa cel·lular. Aquesta paret està feta principalment de polisacàrids (sobretot glucans i mannans, amb un petit percentatge de quitina, que es troba en les cicatrius de gemmació). La membrana plasmàtica té uns 7 nm de gruix i és una bicapa lipídica típica amb múltiples proteïnes inserides. La seva composició inclou fosfatidilcolina i fosfatidiletanolamina, amb quantitats més petites de fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol i fosfatidilserina. També conté diversos esterols, con ara ergosterol i zimosterol.

El vacúol és un orgànul molt important en S. cerevisiae i pot arribar a ocupar un volum substancial de la cèl·lula. El seu paper principal és semblant al dels lisosomes en cèl·lules animals, i s’hi dóna la degradació no específica de proteïnes per part d’una varietat de proteases (endopeptidases, aminopeptidases, carboxipeptidases, etc.). A més, serveix com a lloc d’emmagatzemament d’aminoàcids, alguns metalls i ions, i col·labora en el procés d’osmoregulació. Els llevats contenen també peroxisomes, on tenen lloc diverses funcions metabòliques, com ara l’oxidació de fonts de carboni i nitrogen. Els mitocondris de S. cerevisiae, que

Figura 1. Diverses micrografies de S. cerevisiae i S. pombe. a) Tinció nuclear amb DAPI, que mostra la migració cromosòmica. b) Micrografia al microscopi electrònic en els moments previs a la citocinesi, que mostra el septe intercel·lular. c) Un exemple de marcatge diferencial que permet identificar la localització de dues proteïnes diferents. A l’esquerra la proteïna Chs3 (una quitina-sintasa) està marcada amb GFP. Al centre, la proteïna Pma1 (la H +-ATPasa de la membrana cel·lular) es veu amb fluorescència vermella pel marcatge amb RFP (una variant de la GFP). A la dreta observem una composició d’ambdues fotografies, per posar en evidència que la localització d’aquestes dues proteïnes és mútuament exclusiva. d ) Micrografia de S. pombe amb òptica Nomarski. e) Tinció dels vacúols de S. pombe. Les micrografies de S. cerevisiae han estat gentilment cedides per Cèsar Roncero i les de S. pombe per Pilar Pérez (tots dos pertanyen a l’Instituto de Microbiología Bioquímica, U. Salamanca/CSIC). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

48 J. ARIÑO

són dispensables durant el període fermentatiu, contenen quasi 86.000 pb de DNA, el qual codifica diverses proteïnes de la cadena de transport electrònic del mitocondri mateix. En S. cerevisiae el nucli té uns 1,5 μm de diàmetre i està separat del citosol per una doble membrana que, contràriament al que ocorre en molts altres eucariotes, no es desfà durant la mitosi. Les soques de laboratori contenen normalment 16 cromosomes, des de 0,23 a més d’1,5 Mbp, que poden ser separats fàcilment per tècniques d’electroforesi en camp polsant (PFGE). A més dels cromosomes, al nucli es poden trobar diversos elements genètics, com ara a) el plasmidi de 2 μm, de funció desconeguda, que és present en un alt nombre de còpies (20-50) i es replica a la vegada que els cromosomes; b) RNA i DNA lineal de doble cadena, típic de soques killer, que són tòxiques per a altres soques, i c) els elements Ty, que són equivalents al retrotransposons que es troben en altres tipus de cèl·lules eucariotes.

cus MAT: MATa o MATα. Parlem així de cèl·lules a o α. Totes dues poden dur a terme cicles cel·lulars mitòtics estables, en els quals la nova cèl·lula apareix per gemmació (1 i 2). Cadascun d’aquests tipus produeix una «feromona» peptídica (factor a o α) que és alliberada a l’entorn. Quan dues cèllules de «sexe» oposat es troben a prop, detecten la presència de la feromona mitjançant receptors 7TM i sistemes de senyalització molt semblants als que trobem en animals, i això indueix una aturada del cicle cel·lular en fase G1 i promou la fusió de totes dues cèl·lules i dels seus nuclis (3). De fet, aquestes feromones es fan servir a

α

α

a 6

Germinació α

7

a α a

a/α

Tot i que en la natura molts llevats es troben com a homotàl·lics, de vegades S. cerevisiae és heterotàl·lic, heterozigòtic i poliploide. Les soques de laboratori són sempre heterotàl·liques (és a dir, es poden individualitzar les formes sexuals en organismes independents a causa de l’existència d’un al·lel no funcional del gen HO, que impedeix l’intercanvi homotàl·lic) i poden existir en forma de cèl·lules haploides o diploides. Aquestes característiques són la base de la potència de la genètica clàssica en S. cerevisiae i defineixen el cicle vital d’aquest organisme (vegeu la figura 2). Les cèl·lules haploides poden existir en dues formes, definides per l’al·lel present al lo-

7

Esporulació

5

a/α

a/α

El cicle vital de Saccharomyces cerevisiae

Asc (tètrada)

Cicle vegetatiu diploide

4

a/α Conjugació 3 (mating)

X α

a

a 1

a

Cicles vegetatius haploides

a

α 2

α

α

Figura 2. El cicle vital de S. cerevisiae. Es mostren les etapes següents: 1 i 2) Cicle vegetatiu haploide. 3) Conjugació d’una cèl·lula a i una cèl·lula α. 4) Cicle vegetatiu diploide, estable fins a l’esgotament de nutrients. 5) Esporulació i formació de la tètrada. 6) Germinació de les espores, amb trencament de l’embolcall de l’asc. 7) Retorn a l’estat de creixement vegetatiu haploide. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

ELS LLEVATS COM A ORGANISME MODEL DE RECERCA EN BIOLOGIA 49

al laboratori per sincronitzar cultius, i d’aquesta manera s’«enganyen» els llevats. Es genera llavors una cèl·lula diploide, que és perfectament estable i pot iniciar tot un seguit de cicles mitòtics, sempre per gemmació, almenys mentre hi hagi nutrients. Curiosament, mentre que en les cèl·lules haploides la nova gemma apareix just al costat de la prèvia (gemmació axial), en les diploides apareix al pol oposat (gemmació bipolar). En qualsevol cas, davant l’absència de nutrients, principalment fonts de nitrogen, les divisions mitòtiques cessen i les cèl·lules entren en meiosi, i produeixen quatre espores haploides, dues de a i dues de α, normalment anomenades tètrades (5), embolcallades per una coberta (asc). Les espores són formes de resistència. En presència de nutrients, les espores haploides poden germinar (6) i entrar en un nou cicle mitòtic haploide o bé tornar a aparellar-se per formar diploides. Al laboratori es pot treure profit de cadascun d’aquests possibles estats (vegeu, per exemple, l’anàlisi de tètrades més endavant). Nocions bàsiques sobre nomenclatura de gens, soques de laboratori i mètodes de cultiu Des del moment en què es va iniciar la seqüenciació del genoma de S. cerevisiae va ser necessari definir una nomenclatura sistemàtica per als seus gens (i d’altres entitats genètiques). Així, la nomenclatura YFR015C defineix un gen, o més pròpiament, un open reading frame, de llevat (Y, de yeast, ‘llevat’), que es troba al cromosoma 6 (F és la sisena lletra de l’alfabet), és el quinzè open reading frame des del centròmer i està codificat en la cadena Crick (C, que correspon a la seqüència complementària de la dipositada en els bancs de dades). Però, en paral·lel a la nomenclatura sistemàtica, Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

és molt comú fer servir una nomenclatura genètica «clàssica», que sovint fa referència a la manera com es va descobrir el gen o la funció que té la proteïna que codifica. Per exemple, el gen YER133W és més conegut com a GSY1, nom que ens fa intuir que codifica un enzim del metabolisme del glicogen (de fet, codifica una de les dues glicogen-sintases de S. cerevisiae). Com que la nomenclatura genètica en S. cerevisiae és una mica particular, val la pena fer-hi esment. Normalment un gen cromosòmic es defineix per tres lletres i un nombre, escrits en cursiva. Quan parlem d’un al·lel dominant, es fan servir majúscules (GSY1, CDC25...), mentre que denotem al·lels recessius en minúscules (gsy1, cdc25...). En qualsevol cas, la proteïna que produiria la descriurem com a Gsy1 o Gsy1p. Els diferents al·lels es denominen mitjançant nombres (glc7-109, leu2-3...). Per indicar una deleció del gen es fa servir el símbol ∆ (gsy1∆1). Tot i que no és formalment correcte, és freqüent veure formes com gsy1∆, que s’interpreta com una deleció total del gen (o, més comunament, de l’ORF). Si veiem escrit gsy1::LEU2, llavors interpretarem que s’ha produït una inserció del gen LEU2 en el locus GSY1, de manera que el primer és funcional (i dominant) i aquest últim esdevé no funcional (i recessiu). Si ens volem referir al fenotip derivat d’un al·lel d’un gen determinat, no es fa servir cursiva i es posa un «+» o «–» com a superíndex segons el gen sigui funcional o no (per exemple, Gsy– ens indicaria una soca que no pot sintetitzar glicogen). La nomenclatura d’altres entitats genètiques cau fora d’aquest capítol. Per a més informació consulteu Sherman (2002) i http://www.yeastgenome. org/help/yeastGeneNomenclature.shtml. Quan es treballa amb S. cerevisiae és molt important recordar que no hi ha una «soca salvatge» o de referència universal. De fet, les soques més habituals (S288C, W303,

50 J. ARIÑO

X2180, BY4741, etc.) contenen diverses mutacions útils (leu2, ura3, etc.) que permeten la selecció quan es transformen amb plasmidis o altres fragments de DNA que contenen els gens salvatges corresponents, però sovint també d’altres no tan evidents que fan que el seu comportament pugui diferir molt. Per exemple, la mutació de certs gens en determinats fons genètics «salvatges» pot arribar a ser letal, mentre que en d’altres té efectes molt menys dramàtics. És a dir, és indispensable treballar sempre amb soques isogèniques i és molt perillós extrapolar resultats obtinguts amb soques que no ho són. Hi ha diverses fonts «oficials» de soques i de col·leccions de mutants, com ara el Yeast Genetics Stock Culture Center (ATCC), EUROSCARF, etc. (vegeu la taula 1). A Espanya, trobem la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), que inclou també d’altres microorganismes. No sembla haver-hi res semblant a Catalunya. La benevolència quasi llegendària dels investigadors en llevats fa que aquests rara-

ment deixin de respondre a una demanda raonable de soques. Al laboratori, S. cerevisiae es pot fer créixer en líquid (en batch o en quimiòstat) o en plaques semisòlides amb agar, normalment a 28-30 °C. Un medi usual és l’YP (extracte de llevat, peptona) suplementat amb una font de carboni. Aquest medi permet un creixement ràpid i vigorós, però no és selectiu. Per a aquesta finalitat es fan servir medis sintètics, com ara l’SD o SC (Adams et al., 1997; Sherman, 1991). La font de carboni ideal per a S. cerevisiae és la glucosa (emprada usualment al 2 %), tot i que moltes soques poden créixer a partir d’altres sucres (per exemple, galactosa o rafinosa) o altres fonts (glicerol, etanol, etc.). La font de carboni no és irrellevant. S. cerevisiae és un aerobi facultatiu, que metabolitzarà glucosa abans que qualsevol altra font de carboni. De fet, la presència de glucosa bloqueja les vies d’utilització d’altres fonts alternatives. La glucosa es metabolitza inicialment de manera anaeròbica, encara que

Glucosa

Creixement

- 30

- 20 Etanol - 10

Glucosa + etanol (g/l)

Densitat del cultiu (A600)

- 40

- 0 Temps de creixement (h)

Figura 3. La cinètica de creixement d’un cultiu de S. cerevisiae. Fins i tot en condiciones d’aerobiosi, S. cerevisiae fermenta la glucosa, és a dir, la deriva a etanol en lloc d’acetil-CoA i el procés respiratori. Quan la glucosa del medi es comença a esgotar, aquest llevat remodela la seva expressió gènica, reprimint tot un seguit de gens i activant-ne molts altres i comença a transformar etanol en acetil-CoA per dur-ne a terme l’oxidació mitocondrial fins a CO2. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

ELS LLEVATS COM A ORGANISME MODEL DE RECERCA EN BIOLOGIA 51

disposi d’oxigen, i el piruvat producte de la glicòlisi es deriva a etanol, en comptes d’acetil-CoA (vegeu la figura 3). Aquest període fermentatiu dóna lloc a un creixement exponencial, fins que s’esgota la glucosa. En aquest moment (shift diauxic) S. cerevisiae reestructura el seu metabolisme (via remodelació de l’expressió gènica) i comença un creixement respiratori, durant el qual transforma l’etanol produït en diòxid de carboni i aigua. Aquest comportament és força anòmal, fins i tot en llevats, i no cal dir la importància que ha tingut en les aplicacions més tradicionals d’aquest organisme (panificació, vinicultura, etc.). L’EXTRAORDINÀRIA POTÈNCIA DE LA GENÈTICA I LA BIOLOGIA MOLECULAR EN Saccharomyces cerevisiae La importància d’un genoma petit i compacte El genoma de S. cerevisiae va representar el primer genoma eucariòtic completament seqüenciat. Es va iniciar com un projecte cooperatiu europeu, tot i que hi van acabar participant els EUA, el Canadà i el Japó, i des de la publicació de la seqüència del primer cromosoma el 1992 fins a la descripció de la seqüència completa el 1996, va proporcionar una quantitat d’informació sobre l’estructura i la funció gènica que encara a hores d’ara no s’ha acabat d’explotar completament. S. cerevisiae conté uns 6.200 gens, densament empaquetats en poc més de 12 Mpb de genoma, distribuït en 16 cromosomes en la soca seqüenciada. Això vol dir una densitat d’un gen per cada 2 kpb, amb una llargària mitjana de 1,45 kpb. Només una minoria de gens contenen introns (aproximadament el 4 %), que solen ser curts i rarament més d’un, per la qual cosa Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

el genoma de S. cerevisiae ens apareix com una successió de «cDNA» flanquejats per promotors i terminadors. No obstant això, el processament d’introns és important en S. cerevisiae, ja que molts gens que codifiquen proteïnes ribosòmiques en contenen, i aquests gens s’expressen de manera molt abundant. De fet, S. cerevisiae ha estat i encara és un model formidable per a l’estudi de la maduració de l’mRNA. També van poder ser definits i caracteritzats d’altres elements gènics, com ara inicis de replicació (ARS), centròmers i telòmers. Aquests coneixements han servit per definir molècules útils per a l’enginyeria genètica (vectors), com ara els YAC (vegeu més endavant). El coneixement detallat del genoma de S. cerevisiae, juntament amb l’eficàcia dels processos de recombinació homòloga, han fet possible manipular aquest genoma amb una precisió extraordinària, com veurem més endavant. La utilitat de la genètica clàssica en Saccharomyces cerevisiae La capacitat de reproduir-se en un període curt de temps (90-180 min, depenent del medi de cultiu) és una característica molt important a l’hora de fer aproximacions genètiques. Molt del que sabem sobre sistemes eucariotes prové de l’estudi de determinats mutants de S. cerevisiae incapaços de créixer en absència d’un aminoàcid determinat o que presenten certs problemes per completar el seu cicle, etc. Alguns d’aquests mutants van aparèixer espontàniament, però molts d’altres van ser productes d’experiments de mutagènesi a l’atzar, emprant mutàgens químics (com l’MMS) o radiació UV. Des del moment en què es va aprendre a introduir DNA exogen en S. cerevisiae (el 1978) va ser possible aprofitar l’existència de vectors plasmídics

52 J. ARIÑO Taula 1.

Webs d’utilitat per als interessats en recerca en llevats

Bases de dades generals Saccharomyces Genome Database (SGD Stanford)

http://www.yeastgenome.org/

Comprehensive Yeast Genome Database (CYGD-MIPS)

http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast/index.jsp

Schizosaccharomyces pombe GeneDB

http://old.genedb.org/genedb/pombe/

Candida Genome Database

http://www.candidagenome.org/

Col·leccions de mutants Saccharomyces Genome Deletion Project

http://www-sequence.stanford.edu/ group/yeast_deletion_project/

EUROSCARF

http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/

Altres webs d’interès Mammalian homology to yeast (SGD)

http://www.yeastgenome.org/mammal/

Yeast homologues of human disease-associated genes http://mips.gsf.de/proj/yeast/reviews/human_diseases.ht ml

per intentar identificar i clonar els gens responsables del fenotips observats. És possible transformar S. cerevisiae amb relativament bona eficiència per diverses tècniques, que van des de la generació de protoplasts (llevats als quals s’ha eliminat la paret per tractament enzimàtic), fins a l’ús d’acetat de liti o l’electroporació. El DNA introduït pot reproduir-se bé per integració en un cromosoma o bé pel fet d’estar inserit en un vector plasmídic. Els vectors que fem servir en S. cerevisiae són de tipus shuttle, és a dir, també es poden reproduir en E. coli. N’hi ha d’alt nombre de còpies (20-50), que es basen en l’element replicatiu d’un plasmidi natural de S. cerevisiae, el plasmidi 2μ, i n’hi ha que porten una seqüència centromèrica (CEN, que en S. cerevisiae és anormalment petita i simple) i, per tant, pràcticament equivalent a una dosificació cromosòmica. L’eficiència de la recombinació homòloga en S. cerevisiae és extraordinària, de manera que calen no més de 40-50 nucleòtids idèntics per dirigir efectivament un fragment de DNA exogen a un locus cromosò-

mic precís. Això ha permès desenvolupar tècniques com la del short flanking homology gene deletion (Wach et al., 1994), que permet el reemplaçament precís de qualsevol seqüència cromosòmica per una altra (per exemple, l’eliminació o genoanul·lació d’un gen per part d’un determinat marcador). D’aquesta manera ha estat possible, per exemple, crear una col·lecció de mutants, cadascun mancat d’un gen determinat (en soques haploides, si el gen no és essencial, o com a diploides heterozigòtics si ho és). Una tècnica de gran potència en la genètica de S. cerevisiae és l’anàlisi de tètrades, que pot tenir utilitat fins i tot per a la recerca en altres organismes. Imaginem que hem clonat un cDNA humà (anomenem-lo cAbc1) que pensem que codifica una proteïna funcionalment homòloga a una proteïna de S. cerevisiae, diguem-ne que codificada pel gen ABC1. Una manera evident de comprovar-ho seria transformar l’hipotètic mutant abc1 amb un plasmidi que expressés cAbc1 i verificar que el cDNA humà és capaç de rescatar qualsevol fenotip produït per la mutació del gen de llevat. Però quiTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

ELS LLEVATS COM A ORGANISME MODEL DE RECERCA EN BIOLOGIA 53

na seria la situació si el gen ABC1 fos essencial en S. cerevisiae? No és una situació gaire improbable: una mica més del 20 % dels gens ho són. És evident que no podríem generar un mutant haploide abc1 amb pèrdua total de funció, perquè aquesta soca no seria viable. Ara bé, si generem un mutant diploide heterozigòtic per al gen ABC1 (ABC1 abc1), molt probablement viable, el podrem transformar amb el plasmidi portador de cAbc1. Si ara induïm l’esporulació d’aquesta soca (simplement posantla en un medi pobre en nutrients), els diploides vegetatius formaran ascs amb quatre espores. Dues d’aquestes tindran un genotip ABC1 i les altres dues abc1, però totes portaran el plasmidi amb cAbc1. És possible digerir parcialment la paret d’un asc i, mitjançant un micromanipulador (vegeu la figura 4), separar físicament les quatre espores dipositant-les en una placa de germinació per permetre el creixement dels derivats haploides. Passades 48-72 h el resultat parla per si mateix: si l’expressió de cAbc1 no és capaç de rescatar el fenotip letal de mutació abc1 (i, per tant, no és un homòleg funcional) només dues espores podran germinar (les que són ABC1). Si, al contrari, la funció que expressa cAbc1 correspon a la del gen ABC1, llavors totes quatre germinaran donant lloc a cèl·lules haploides viables (vegeu la figura 4).

DNA, avui dia estesa a molts més organismes, descrivim a continuació algunes d’aquestes eines. La col·lecció de soques mutants per deleció gènica. A causa de l’alta eficiència de la recombinació homòloga, que permet la inserció precisa de les seqüències de DNA en llocs específics del genoma del llevat, ha estat possible crear, per tècniques de PCR, cassets sintètics que substitueixen tots i cadascun dels gen per un simple marcador de selecció, per exemple el gen que codifica resistència a la kanamicina, flanquejats a

Saccharomyces cerevisiae com a banc de proves de les tècniques d’anàlisi massiva

Figura 4. L’anàlisi de tètrades en S. cerevisiae. La figura mostra un micromanipulador MSM 400 (Singer Instruments), la visió a 400× d’un parell de tètrades i el producte de la micromanipulació i germinació posterior de vuit tètrades en un experiment com el descrit en el text. Els nombres indiquen les diferent tètrades (1-4, diploide transformat amb un plasmidi buit; 5-8, amb el plasmidi que expressa el cDNA per comprovar). Les lletres (a-d) indiquen les diferents espores de cada tètrada dipositades a la placa. Noteu com dues de cada quatre espores a la placa de l’esquerra no poden germinar, fet que indica el fenotip letal de la mutació. L’equip MSM 400 es reprodueix amb permís de Singer Instruments Co. Ltd, RU.

La impressionant accessibilitat de S. cerevisiae a la manipulació genètica ha permès que aquest organisme esdevingués una veritable plataforma per desenvolupar avenços tecnològics en genòmica i proteòmica funcional. Sense comptar l’aplicació massiva de la tecnologia de microxips de Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

1 2

3

5

4

a

a

b

b

c

c

d

d

6

7

8

54 J. ARIÑO

més per seqüències curtes i específiques per a cada gen («codis de barres») (Winzeler et al., 1999). Aquestes biblioteques de mutants són comercials tant en la seva forma de soques haploides (unes 4.800 soques) com en la de diploides homozigòtiques i heterozigòtiques (unes 6.000 soques). La presència d’aquests «codis de barres» ha permès combinar experiments de creixement d’una barreja de tots aquests mutants en presència d’una determinada condició o compost amb la tecnologia de microxips de DNA, per tal d’esbrinar a escala genòmica global com afecta una determinada mutació al creixement en la condició estudiada (massive parallel analysis) (Giaever et al., 2002; Winzeler et al., 1999). La mateixa estratègia d’integració genòmica ha estat utilitzada de manera sistemàtica per reemplaçar els promotors de cadascun dels ORF (Mnaimneh et al., 2004) o per introduir-hi diferents etiquetes (GST, GFP) o epítops (HA, Myc, etc.). Matrius d’interaccions genètiques sintètiques i anàlisi de letalitat sintètica a escala genòmica. La metodologia de matrius d’interaccions genètiques sintètiques (synthetic genetic array o SGA) és una aplicació de la col·lecció de mutants esmentada abans que permet la construcció sistemàtica dels mutants dobles i l’anàlisi posterior dels fenotips de creixement (Tong et al., 2004). Es basa a encreuar una soca (A) que porta una mutació específica (una deleció o un al·lel condicional) amb la col·lecció sencera de mutants per deleció, aplicant un mètode de selecció que, una vegada es força l’esporulació, només permet el creixement de les cèl·lules haploides (Tong et al., 2006). Finalitzat el procediment de selecció, s’avaluen els fenotips (creixement lent, letalitat, etc.) en els dobles mutants que contenen el marcador de la soca A juntament amb el de la biblioteca de delecions. Aquests procediments es poden robotitzar i executar en

plaques d’alta densitat, que permeten l’anàlisi de manera automàtica de milers de combinacions gèniques. S’han desenvolupat un gran nombre de variants derivades del concepte de SGA. Per a una descripció més àmplia vegeu Suter et al. (2006). L’últim tour de force, publicat al començament de 2010, ha estat la generació de dades d’interaccions genètiques sintètiques corresponents a l’anàlisi de 5,4 milions de parells de gens (Costanzo et al., 2010). Identificació massiva de la localització subcel·lular de proteïnes. Aquest ambiciós objectiu va ser atacat fa prop de deu anys enrere pel grup de Michael Snyder fent servir una aproximació basada en l’ús d’etiquetatge a l’atzar de les proteïnes, mitjançat per transposons, amb els epítops de l’hemoaglutinina (HA) i el paramixovirus SV5 i sobreexpressió d’aquestes (Kumar et al., 2002). Aquesta aproximació, tot i rendir resultats molt apreciables, presentava alguns problemes i va ser millorada per la construcció d’una biblioteca de 6.029 fusions GFP Cterminals, que es podien avaluar al microscopi de fluorescència (Huh et al., 2003). En casos més específics, la localització subcellular s’ha confirmat per obtenció de preparacions enriquides d’orgànuls intracel·lulars seguida de la identificació de proteïnes per espectroscòpia de masses (MS). Els llevats, el regne de la interactòmica? Indubtablement, el llevat S. cerevisiae ha estat el territori en què els estudis d’interactòmica s’han desenvolupat amb més ímpetu. Alguns dels estudis originals es van fonamentar en la tècnica del doble híbrid, tal com la van dissenyar Fields i Song (Fields et al., 1989), és a dir, expressant la proteïna per estudiar com una fusió al domini d’unió a DNA de GAL4 i la proteïna que interacciona com una fusió del domini de transactivació del mateix GAL4, de tal manera que la interacció fructífera es detecta com la reconstitució d’un factor de transTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

ELS LLEVATS COM A ORGANISME MODEL DE RECERCA EN BIOLOGIA 55

cripció actiu que pot dirigir l’expressió d’un gen de selecció. Tot i que inicialment no era una tècnica d’anàlisi massiva, els primers estudis a gran escala es van publicar ja al començament de la dècada del 2000 (Ito et al., 2001; Uetz et al., 2000). Aquesta tècnica ha sofert un munt de modificacions, per tal d’adaptar-la a diverses situacions, com la selecció de compostos (com ara possibles fàrmacs) que afavoreixen o impedeixen la interacció de proteïnes (Bharucha et al., 2007), o l’adaptació per a la detecció d’interacció entre proteïnes que es troben ancorades a les membranes cel·lulars com, per exemple, els assaigs de complementació basats en la split-ubiquitin o el sistema de doble híbrid basat en membranes, conegut com a MbYTH (Lentze et al., 2008). Els primers estudis massius d’interaccions proteïna-proteïna en llevats, diferents dels duts a terme pel mètode del doble híbrid, van ser publicats el 2002 (Gavin et al., 2002; Ho et al., 2002) i es basaven en l’aïllament de determinades proteïnes, prèviament etiquetades amb certs epítops, seguit de la identificació de les proteïnes que hi interactuen amb MS. S’han desenvolupat diversos mètodes d’aïllament dels complexos. Avui dia el més popular és el sistema TAP-tag (Puig et al., 2001), basat en una doble selecció, primer retenint el complex amb una matriu d’immunoglobulines, via l’etiqueta de proteïna A, i tot seguit retenint l’eluat (per tractament amb la proteasa TEV) en una matriu de calmodulina, mitjançant una segona etiqueta de CBP (calmodulin binding peptide). Les proteïnes se separen llavors per electroforesi en gel i s’identifiquen amb MALDI-TOF MS. La tecnologia dels microxips de proteïnes. A banda de les típiques matrius de caire analític que contenen, per exemple, una bateria d’anticossos fixats a un suport, la tecnologia de microxips de proteïnes pot ser Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

emprada per a l’anàlisi funcional d’aquest tipus de molècules i, des d’aquest punt de vista, el treball en llevats ha estat pioner. Es tracta d’immobilitzar un conjunt de proteïnes sobre la superfície d’un microxip en condicions no desnaturalitzants de manera que poden ser assajades simultàniament amb una gran varietat de tests bioquímics. Per exemple, es pot marcar una proteïna (o d’altres molècules, com ara lípids, DNA o fàrmacs diversos) de manera fluorescent i investigar-ne la unió al conjunt de proteïnes presents al microxip de manera similar al que es fa per als microxips de DNA (Wolf-Yadlin et al., 2009). Una demostració de la potència d’aquesta tecnologia va ser l’expressió de 5.800 ORF de S. cerevisiae com a fusions amb GST, que va permetre la construcció del primer microxip amb un proteoma complet (Zhu et al., 2001). Aquesta eina va ser feta servir posteriorment per identificar substrats in vitro per a moltes de les proteïna-cinases de S. cerevisiae, en un treball que va marcar una fita en aquest tipus d’estudis (Ptacek et al., 2005). ELS LLEVATS «NO CONVENCIONALS» COM A MODELS DE RECERCA El llevat Schizosaccharomyces pombe (la paraula pombe deriva del suahili, ‘cervesa’), a diferència de S. cerevisiae, es divideix per fissió binària, de manera similar al que fan les cèl·lules animals. Això ha fet que, des de fa ja molts anys, hagi estat triat com un excel·lent model per estudiar el procés de divisió cel·lular (Yanagida, 2002). Aquestes cèl·lules tenen forma de bastonet d’uns 10 μm (vegeu la figura 1) i són força accessibles a les tècniques de genètica i biologia molecular. El seu genoma, d’uns 14 milions de pb i distribuït en només tres cromosomes, va ser seqüenciat completament l’any

56 J. ARIÑO

2002 i les dades són de lliure accés (vegeu la taula 1). Conté uns 5.000 gens, dels quals quasi la meitat tenen un o més introns. Tot i que pertany al grup dels ascomicetals (encara que hi ha estudis que els inclouen en els arqueascomicetals), des d’un punt de vista evolutiu S. pombe és extremadament distant de S. cerevisiae i ha estat proposat que ambdós organismes van divergir fa més de mil milions d’anys. De fet, podríem considerar S. cerevisiae i S. pombe com a dos organismes model complementaris (Forsburg, 1999). Altres espècies de llevats són utilitzats en recerca, encara que de manera menys general, i fonamentalment, a causa de determinades propietats específiques. Per exemple, el llevat metilòtrof Pichia pastoris s’ha convertit en el llevat d’elecció per a processos de producció industrial de proteïnes, basat en l’ús del seu potent promotor AOX1 (Cereghino et al., 2000), mentre que Candida albicans és investigada per la seva capacitat patogènica i com a model d’invasivitat en animals, i Debaryomyces hansenii, tot i que la seva genètica i biologia moleculars estan encara per desenvolupar plenament, sembla un excel·lent model per estudiar els mecanismes de tolerància salina (Gunde-Cimerman et al., 2009). COM Saccharomyces cerevisiae POT SERVIR PER A LA RECERCA EN ALTRES ORGANISMES MÉS COMPLEXOS Mes enllà de l’interès que té la recerca en S. cerevisiae, tant des d’un punt de vista fonamental com aplicat (producció alimentària, biotecnologia, etc.), el treball desenvolupat i els coneixements acumulats en aquest organisme troben aplicació en la recerca que es duu a terme en altres organismes més complexos. Aquesta capacitat de

transferència la podem considerar com a mínim des de dos punts de vista: quan el llevat és l’eina de treball per estudiar funcions específiques d’altres organismes, i quan el llevat és l’organisme en què es desxifra un procés fonamental, compartit per altres éssers vius. Les possibles aplicacions són tan diverses que només en podem descriure superficialment uns pocs exemples a continuació. Eines generals de recerca en biologia que utilitzen llevats o elements derivats Els YAC com a vectors de clonatge. Els cromosomes artificials de llevat (yeast artificial chromosome, YAC) són vectors de clonatge que contenen els elements bàsics de replicació, segregació cromosòmica (com ara CEN4) i seqüències telomèriques dels cromosomes de S. cerevisiae, juntament amb sistemes de selecció per la presència d’una inserció. D’aquesta manera és possible vehicular fragments de DNA de 50 a més de 2.000 kb, cosa que excedeix de molt la capacitat del vectors preexistents, basats en fags o cosmidis. Aquest sistema, per tant, fa possible l’estudi detallat d’enormes regions intactes de DNA. D’aquesta manera ha estat possible preparar biblioteques completes de genomes complexos com el de Caenorhabditis elegans (Coulson et al., 1991) o fins i tot de mamífers com el ratolí (Nusbaum et al., 1999), com a pas previ per seqüenciar-los. A més, els YAC són una alternativa per considerar com a possibles vectors a l’hora de generar animals transgènics (Moreira et al., 2007). La tècnica del doble híbrid i les seves variants més enllà del llevat. Com hem comentat abans, la tècnica del doble híbrid ―o les seves variants, com el doble híbrid revers, el triple híbrid, etc. (Bruckner et al., 2009)― es poden aplicar als objectius més Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

ELS LLEVATS COM A ORGANISME MODEL DE RECERCA EN BIOLOGIA 57

variats, des d’establir els dominis d’interacció entre dues proteïnes, sigui quin sigui el seu origen (vegetal, animal, etc.) fins al descobriment o validació de nous fàrmacs (Bharucha et al., 2007). Encara més important, el desenvolupament, fa ja més de vint anys, dels fonaments de la tècnica de doble híbrid en llevats, ha establert les bases per posar a punt tecnologies amb el mateixos objectius en altres tipus de cèl·lules, incloent-hi les de mamífers (Lievens et al., 2009). S. cerevisiae com a hoste per a expressió heteròloga. Des del punt de vista de la producció massiva de proteïnes, S. cerevisiae no és potser l’organisme d’elecció, si el comparem amb E. coli o fins i tot altres llevats com P. pastoris. No obstant això, el fet que S. cerevisiae és una cèl·lula eucariòtica que pot ser manipulada amb molta facilitat el fa molt atractiu com a hoste per a l’expressió heteròloga amb finalitats de recerca. La disponibilitat de mutants de tot tipus dóna peu a verificar per complementació o rescat fenotípic en S. cerevisiae la hipotètica funció de proteïnes de qualsevol origen amb raonables expectatives que, si la proteïna en qüestió requereix modificacions posttraduccionals per adquirir activitat (com ara fosforilació, miristilació, etc.), el llevat disposi de l’arsenal enzimàtic necessari per dur a terme aquestes transformacions (i, si no és així, sempre hi ha la possibilitat d’introduir-hi els elements necessaris). D’aquesta manera, hi ha una llarga llista de gens d’organismes molt diversos, incloent-hi molts gens humans, la funció dels quals (cicle cel·lular, replicació del DNA, apoptosi o senyalització hormonal) ha estat descoberta o confirmada en S. cerevisiae (Osborn et al., 2007). La capacitat de modificar S. cerevisiae genèticament de manera controlada permet produir en aquesta cèl·lula processos que són característics de cèl·lules humanes. Això es diu, col·loquialment, «la humanitzaTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

ció» del llevat. El que es fa és complementar mecanismes existents en el llevat amb els elements necessaris per reconstituir els processos que volem. Un bon exemple és la senyalització que involucra proteïnes G i els receptors acoblats a aquestes (GPCR), que constitueixen avui dia una de les dianes farmacològiques més importants. La senyalització mitjançant els GPCR és molt semblant a la que transmet en S. cerevisiae el senyal de feromones, que permet l’acoblament o mating. És possible, en principi, expressar en S. cerevisiae un GPCR de mamífer i acoblar-ne funcionalment el senyal, bé al de la subunitat α mateixa (codificada pel gen GPA1), o a subunitats α de mamífer (natives o quimèriques) coexpressades. La transmissió d’aquest senyal s’efectua normalment a través d’una cascada de MAPcinases que determina l’expressió de determinats gens, els quals permeten la selecció o fins i tot la quantificació de la intensitat del senyal. A causa de la senzillesa de cultiu i al curt temps de duplicació, aquests sistemes són perfectament adaptables per a l’anàlisi massiva de nous fàrmacs o inhibidors (Minic et al., 2005). Els llevats com a model de recerca en biomedicina La recerca en llevats ha constituït un dels pilars fonamentals per al desenvolupament de la bioquímica, la biologia cel·lular i la genètica i biologia moleculars (Brambl, 2009). A tall d’exemples, comentarem només uns pocs casos. D’una banda, els treballs de L. Hartwell, en S. cerevisiae, i P. Nurse, en S. pombe, que van ser clau per desxifrar els processos que determinen el cicle cel·lular i, que van ser, finalment, guardonats amb el Premi Nobel el 2001. D’altra banda, els estudis de B. Ephrussi, que van permetre caracteritzar el mutants

58 J. ARIÑO

petite, els quals van suposar el naixement de la genètica mitocondrial. També trobem en els llevats l’origen del concepte de resposta a l’estrès i de proteïnes de xoc tèrmic, d’on ha derivat la noció de xaperones. Avui dia, el llevat (principalment S. cerevisiae) és considerat un model vàlid d’estudi per a molts processos fonamentals de la vida, incloent-hi alguns que es consideraven poc rellevants en aquest organisme, com ara la maduració de l’mRNA (Meyer et al., 2009). Encara que sembli sorprenent, el llevat també s’ha utilitzat amb èxit durant molts anys com un model per a l’estudi de les malalties dels mamífers. A tall d’exemple, la diana cel·lular de la rapamicina, un immunosupressor usat com un fàrmac antirebuig en els trasplantaments de teixits, va ser descobert en el llevat i posteriorment es va verificar en els éssers humans (Heitman et al., 1991). En aquest sentit, el llevat és un valuós element de predicció de la funció dels gens humans: almenys el 31 % de les proteïnes codificades pels gens del llevat tenen homòlegs humans i, a la inversa, gairebé el 50 % dels gens humans implicats en malalties hereditàries troben homòlegs de llevat (Hartwell, 2004). En els darrers anys s’han dut a terme nombroses anàlisis sistemàtiques a la recerca de gens relacionats amb malalties humanes. Si el gen implicat en la malaltia té un homòleg en llevat, és possible estudiar-ne la funció directament. Si, d’altra banda, el gen subjacent de la malaltia està absent en el llevat, però causa la malaltia per un guany de funció deletèria en humans, pot ser encara modelitzada a través de l’expressió heteròloga del gen humà en cèl·lules de llevat. D’aquesta manera s’han fet importants avenços en àrees molt variades, que inclouen les bases moleculars del càncer, de diverses malalties neurodegeneratives (els llevats poden contenir proteïnes priòniques, semblants a les que desenvolupen les encefalopaties es-

pongiformes transmissibles), de malalties mitocondrials o fins i tot l’envelliment (Miller-Fleming et al., 2008; Perocchi et al., 2008; Roux et al., 2010). BIBLIOGRAFIA Adams, A.; Gottschling, D. E.; Kaiser, C. A.; Stearns, T. (1997). Methods in Yeast Genetics. Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Bharucha, N.; Kumar, A. (2007). «Yeast genomics and drug target identification». Comb. Chem. High Throughput. Screen., 10: 618-634. Brambl, R. (2009). «Fungal physiology and the origins of molecular biology». Microbiology, 155: 3799-3809. Bruckner, A.; Polge, C.; Lentze, N.; Auerbach, D.; Schlattner, U. (2009). «Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology». Int. J. Mol. Sci., 10: 2763-2788. Cereghino, J. L.; Cregg, J. M. (2000). «Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris». FEMS Microbiol. Rev., 24: 45-66. Costanzo, M. [et al.] (2010). «The genetic landscape of a cell». Science, 327: 425-431. Coulson, A.; Kozono, Y.; Lutterbach, B.; Shownkeen, R.; Sulston, J.; Waterston, R. (1991). «YACs and the C. elegans genome». Bioessays, 13: 413-417. Fields, S.; Song, O. (1989). «A novel genetic system to detect protein-protein interactions». Nature, 340: 245-246. Forsburg, S. L. (1999). «The best yeast?». Trends Genet., 15: 340-344. Gavin, A. C. [et al.] (2002). «Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes». Nature, 415: 141-147. Giaever, G. [et al.] (2002). «Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome». Nature, 418: 387-391. Gunde-Cimerman, N.; Ramos, J.; Plemenitas, A. (2009). «Halotolerant and halophilic fungi». Mycol. Res., 113: 1231-1241. Hartwell, L. H. (2004). «Yeast and cancer». Biosci. Rep., 24: 523-544. Heitman, J.; Movva, N. R.; Hall, M. N. (1991). «Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressant rapamycin in yeast». Science, 253: 905909.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

ELS LLEVATS COM A ORGANISME MODEL DE RECERCA EN BIOLOGIA 59 Ho, Y. [et al.] (2002). «Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry». Nature, 415: 180-183. Huh, W. K.; Falvo, J. V.; Gerke, L. C.; Carroll, A. S.; Howson, R. W.; Weissman, J. S.; O’Shea, E. K. (2003). «Global analysis of protein localization in budding yeast». Nature, 425: 686-691. Ito, T.; Chiba, T.; Ozawa, R.; Yoshida, M.; Hattori, M.; Sakaki, Y. (2001). «A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 4569-4574. Kumar, A. [et al.] (2002). «Subcellular localization of the yeast proteome». Genes Dev., 16: 707-719. Lentze, N.; Auerbach, D. (2008). «Membrane-based yeast two-hybrid system to detect protein interactions». Curr. Protoc. Protein Sci., 19: 19.17. Lievens, S.; Lemmens, I.; Tavernier, J. (2009). «Mammalian two-hybrids come of age». Trends Biochem. Sci., 34: 579-588. Meyer, M.; Vilardell, J. (2009). «The quest for a message: budding yeast, a model organism to study the control of pre-mRNA splicing». Brief. Funct. Genomic. Proteomic., 8: 60-67. Miller-Fleming, L.; Giorgini, F.; Outeiro, T. F. (2008). «Yeast as a model for studying human neurodegenerative disorders». Biotechnol. J., 3: 325-338. Minic, J.; Sautel, M.; Salesse, R.; Pajot-Augy, E. (2005). «Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors». Curr. Med. Chem., 12: 961-969. Mnaimneh, S. [et al]. (2004). «Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles». Cell, 118: 31-44. Moreira, P. N.; Pozueta, J.; Perez-Crespo, M.; Valdivieso, F.; Gutierrez-Adan, A.; Montoliu, L. (2007). «Improving the generation of genomic-type transgenic mice by ICSI». Transgenic Res., 16: 163-168. Nusbaum, C. [et al.] (1999). «A YAC-based physical map of the mouse genome». Nat. Genet., 22: 388393. Osborn, M. J.; Miller, J. R. (2007). «Rescuing yeast mutants with human genes». Brief. Funct. Genomic. Proteomic., 6: 104-111. Perocchi, F.; Mancera, E.; Steinmetz, L. M. (2008). «Systematic screens for human disease genes,

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 45-59

from yeast to human and back». Mol. Biosyst., 4: 18-29. Ptacek, J. [et al.] (2005). «Global analysis of protein phosphorylation in yeast». Nature, 438: 679-684. Puig, O.; Caspary, F.; Rigaut, G.; Rutz, B.; Bouveret, E.; Bragado-Nilsson, E.; Wilm, M.; Seraphin, B. (2001). «The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification». Methods, 24: 218-229. Roux, A. E.; Chartrand, P.; Ferbeyre, G.; Rokeach, L. A. (2010). «Fission yeast and other yeasts as emergent models to unravel cellular aging in eukaryotes». J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 65: 1-8. Sherman, F. (1991). «Guide to yeast genetics and molecular biology». Methods Enzymol., 194: 3-21. ― (2002). «Getting started with yeast». Methods Enzymol., 350: 3-41. Suter, B.; Auerbach, D.; Stagljar, I. (2006). «Yeastbased functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond». Biotechniques, 40: 625-644. Tong, A. H. [et al.] (2004). «Global mapping of the yeast genetic interaction network». Science, 303: 808-813. Tong, A. H.; Boone, C. (2006). «Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae». Methods Mol. Biol., 313: 171-192. Uetz, P. [et al.] (2000). «A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae». Nature, 403: 623-627. Wach, A.; Brachat, A.; Pohlmann, R.; Philippsen, P. (1994). «New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae». Yeast, 10: 1793-1808. Winzeler, E. A. [et al.] (1999). «Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis». Science, 285: 901-906. Wolf-Yadlin, A.; Sevecka, M.; MacBeath, G. (2009). «Dissecting protein function and signaling using protein microarrays». Curr. Opin. Chem. Biol., 13: 398-405. Yanagida, M. (2002). «The model unicellular eukaryote, Schizosaccharomyces pombe». Genome Biol., 3: 1-2. Zhu, H. [et al.] (2001). «Global analysis of protein activities using proteome chips». Science, 293: 2101-2105.

DOI: 10.2436/20.1501.02.104

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 61-78

Dictyostelium discoideum, UNA AMEBA PECULIAR María Galardi-Castilla 1 y Leandro Sastre 1, 2 1 2

Instituto de Investigaciones Biomédicas (CSIC-UAM) Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras

Dirección para la correspondencia: Leandro Sastre. Instituto de Investigaciones Biomédicas (CSIC-UAM). C/ Arturo Duperier, 4. 28029 Madrid. Tel.: 915 854 437. Correo electrónico: lsastre@iib.uam.es. RESUM Dictyostelium discoideum és una ameba unicel·lular, encara que també presenta una etapa de desenvolupament multicel·lular en el seu cicle biològic. Aquest organisme ha estat utilitzat com un sistema model des de fa més de quaranta anys a causa de la seva similitud funcional amb les cèl·lules de mamífer. A més, mostra molts avantatges experimentals per a estudis de biologia i bioquímica de la cèl·lula. És genèticament manejable i molt accessible per a la manipulació experimental. Les cèl·lules de D. discoideum són molt mòbils i s’han utilitzat àmpliament en estudis del citosquelet cel·lular, la motilitat cel·lular i la migració quimiotàctica. El desenvolupament multicel·lular és relativament simple i ha estat un terreny fèrtil per a l’estudi de l’agregació, la diferenciació cel·lular, la morfogènesi i les vies genètiques i de senyalització que regulen aquests processos. A més, les cèl·lules de D. discoideum són cada vegada més utilitzades per a l’estudi de les malalties humanes. Per exemple, la interacció de cèl·lules amb bacteris patògens, el mecanisme d’acció de diferents drogues, la resistència als medicaments o les bases moleculars de les malalties humanes han estat recentment analitzats en aquest organisme model. Paraules clau: Dictyostelium, desenvolupament, diferenciació, motilitat, model de malaltia. Dictyostelium discoideum, A SINGULAR AMOEBA SUMMARY Dictyostelium discoideum is a unicellular amoeba although it also presents a stage of multi-cellular development in its biological cycle. This organism has been used as a model system for over 40 years given its functional similarity to mammalian cells. In addition, Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

62 M. GALARDI-CASTILLA Y L. SASTRE

it shows many experimental advantages for biochemical and cell biology studies. It is genetically tractable and highly accessible for experimental manipulation. D. discoideum cells are highly motile and have been extensively used in studies of the cellular cytoskel eton, cell motility and chemotactic migration. Multi-cellular development is relatively simple and has been a fertile ground for the study of aggregation, cell differentiation, morphogenesis, and the genetic and signalling pathways that regulate these processes. In addition D. discoideum cells are being increasingly used for the study of human disease. For example, cell interaction with bacterial pathogens, the mechanism of action of different drugs, drug resistance or the molecular basis of human diseases have been recently studied using this model organism. Key words: Dictyostelium, development, differentiation, motility, disease models. INTRODUCCIÓN Las amebas que pertenecen a la especie Dictyostelium discoideum son pequeñas células (10-20 µm de diámetro) que viven en el suelo de los bosques, alimentándose de bacterias. ¿Por qué constituyen estos humildes microorganismos uno de los doce sistemas modelo elegidos por el Instituto de Salud de Estados Unidos (NIH) para estudiar la salud humana? A lo largo de este breve artículo trataremos de ofrecer algunas respuestas a esta pregunta. Probablemente la principal razón por la que este organismo captó la atención de los científicos fue su ciclo biológico. Como acabamos de mencionar, estas amebas viven en el suelo como individuos aislados, reproduciéndose por división binaria. Sin embargo, estos ambientes son muy variables y sufren notables fluctuaciones, por lo que periódicamente existen fuertes descensos en la población de bacterias. Las amebas del género Dictyostelium, y de otros próximos, son capaces de responder a estas situaciones de ayuno de forma muy peculiar. Cientos de miles de amebas se juntan y comienzan un proceso de desarrollo en el que se comportan como un solo organismo, resumido en la figura 1. Este seudoorganismo, en principio una masa amorfa de células, se transforma en tan solo 24 h

en un cuerpo fructífero formado por un disco basal del que surge un tallo coronado por una pequeña esfera, o soro. La mayor parte de las amebas iniciales (aproximadamente el 80 %) quedan dentro del soro, donde forman esporas. El resto de las células se sacrifican para formar el disco basal y el tallo, constituidos por células muertas. Las esporas pueden permanecer en este estado de latencia varias semanas, y únicamente germinan, dando lugar a nuevas amebas, cuando las condiciones ambientales son favorables. El comportamiento descrito ha motivado que a estos organismos se les conozca como amebas sociales. El peculiar ciclo biológico llamó fuertemente la atención de varios científicos a partir de los años treinta del anterior siglo, incluyendo a Albert Einstein, que quedó maravillado al ver una película del desarrollo de este organismo a principios de los años cincuenta ―se puede encontrar una descripción general del proceso del desarrollo en las revisiones de Thomason et al. (1999), Annesley y Fisher (2009) y Maeda (2005). Sin embargo, la asombrosa singularidad del ciclo biológico no justifica por si mismo el uso de esta ameba como organismo modelo. Existen varias razones de mayor peso. La principal, que sirve de soporte a todas las demás, es la similitud que existe entre estas amebas y nuestras propias céluTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

Dictyostelium discoideum, UNA AMEBA PECULIAR 63

las. El genoma de D. discoideum fue secuenciado en el año 2005 (Eichinger et al., 2005). Es un genoma compacto que codifica aproximadamente 12.500 proteínas, muchas de ellas con gran similitud con proteínas humanas. Existen 746 dominios funcionales conservados entre humanos y D. discoideum, implicados en proliferación, adhesión, motilidad o diferenciación celular, rutas de transducción de señales y procesos básicos como la replicación del DNA, la transcripción o la traducción. A lo largo del capítulo iremos viendo ejemplos concretos de esta conservación funcional de proteínas y procesos celulares. Haciendo un pequeño inciso cabe indicar que el establecimiento de la secuencia del genoma aportó también datos sólidos sobre la posición evolutiva de estos organismos. La comparación de la secuencia de 5.279 proteínas de D. discoideum con las

Figura 1. Ciclo biológico de D. discoideum. Las diferentes estructuras formadas una vez que han agregado las células se muestran de izquierda a derecha, girando en el sentido de las agujas de un reloj. El tiempo necesario para formar cada una de las estructuras está indicado en la parte inferior de cada fotografía. La estructura mostrada en la foto superior, slug, puede formarse o no, dependiendo de las condiciones ambientales. El segmento mostrado en la parte inferior corresponde a un tamaño de 1 mm en la fotografía tomada a las 24 h y de 0,5 mm en las demás fotografías. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

de otras diecisiete especies permitió establecer que dentro del grupo común de los eucariotas fueron divergiendo, primero, las plantas, luego los dictiostélidos (grupo al que pertenece D. discoideum) y finalmente se separaron hongos y animales. Los dictiostélidos constituyen, por lo tanto, un grupo independiente de plantas, hongos y animales, y están igualmente distante de todos ellos desde un punto de vista evolutivo. La segunda razón que ha favorecido el uso de D. discoideum como sistema modelo es la facilidad con la que puede ser cultivado en el laboratorio. Las amebas pueden crecer en placas de agar en las que se ha extendido un lecho de bacterias, habitualmente Klebsiella aerogenes o Escherichia coli. Al crecer las amebas se van comiendo a las bacterias, originando zonas libres de bacterias, denominadas placas de lisis. Esta forma de cultivo permite obtener poblaciones clonales de amebas, puesto que todas las células presentes en una placa de lisis proceden de un única ameba original. Por otro lado, las amebas del centro de cada placa, donde ya se han agotado las bacterias, comienzan el proceso de formación del cuerpo fructífero, pudiéndose observar las estructuras formadas a los 4 o 5 días de cultivo, como se muestra en la figura 2. Además, algunas cepas han sido adaptadas a crecer también en suspensión en medios líquidos de composición muy similar a la de los medios de cultivo de bacterias y levaduras. A estas cepas se las denomina axénicas y ofrecen la posibilidad de obtener grandes cantidades de células de forma económica y rápida. Las amebas se duplican cada 3 h creciendo sobre bacterias y cada 10 h en medio líquido. Cuando se crecen las amebas en suspensión también es fácil inducir el proceso de desarrollo retirando el medio nutritivo y resuspendiendo las células en tampones que no contengan

64 M. GALARDI-CASTILLA Y L. SASTRE

ningún elemento nutritivo. Las células se extienden sobre placas de agar o filtros de nitrocelulosa para observar las estructuras formadas durante el proceso de desarrollo. La tercera razón que ha llevado a utilizar D. discoideum como sistema modelo es la facilidad que ofrece para la manipulación experimental. El genoma de D. discoideum es relativamente pequeño, 33,8 Mb. Este tamaño se sitúa entre los de la levadura Saccharomyces cerevisiae (13 Mb) y la mosca Drosophila melanogaster (180 Mb), siendo todos ellos mucho menores que el genoma humano (2.917 Mb). La diferencia en el tamaño del genoma no se refleja en el número de genes estimado: 12.500 para D. discoideum, 5.538 para S. cerevisiae, 13.676 para D. melanogaster y unos 30.000 en humanos. Lo que indica es que el genoma de D. discoideum es muy compacto, los genes están muy próximos entre sí, las regiones intergénicas son pequeñas (típicamente menores de 2 kb) y los genes tienen pocos intrones (1-2) y de pequeño tamaño (146 pb de

Figura 2. Colonias de D. discoideum creciendo sobre un césped de bacterias. En el interior de las placas de lisis pueden observarse cuerpos fructíferos en distintas fases de desarrollo.

media). En la práctica es más fácil trabajar con los genes de D. discoideum que con los de otros organismos, que tienen un genoma mucho más complejo. En este mismo sentido, una ventaja relevante de trabajar con este organismo es que las células son haploides en las fases de crecimiento y desarrollo, lo que facilita mucho la generación de cepas mutantes. La mayor parte de los organismos poseen células diploides durante casi todo su ciclo biológico, siendo haploides únicamente los gametos. En los procesos de mutagénesis de las células diploides se originan heterocigotos, con un alelo mutado y el otro silvestre, siendo necesario realizar cruces para obtener células mutadas en los dos alelos. En el caso de D. discoideum solo hay un alelo para cada gen, por lo que la generación de mutantes es directa. Un vez que se ha mutado un gen la célula muestra un fenotipo mutante, sin necesidad de ningún paso adicional. Por esta razón se han desarrollado protocolos rápidos, sencillos y relativamente eficientes para generar mutantes en este organismo. Se puede generar mutantes de genes concretos, previamente seleccionados, por procesos de recombinación homóloga, que ocurre de forma bastante frecuente en D. discoideum. También existen protocolos para generar mutantes al azar, bien sea utilizando productos mutagénicos (mutagénesis química) o, mucho mas frecuentemente, por inserción al azar de un plásmido. Este método, denominado REMI (restriction-enzyme mediated integration) consiste en transformar simultáneamente las células con un plásmido cortado con un enzima de restricción y el propio enzima de restricción. Dentro de la célula el enzima corta el DNA genómico al azar de forma que el plásmido es capaz de introducirse en el hueco generado. Si el sitio en el que cortó el enzima esta dentro de la parte codificante o reguladora de un gen se proTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

Dictyostelium discoideum, UNA AMEBA PECULIAR 65

duce una cepa mutante que expresa una proteína truncada o que no la expresa en absoluto. La ventaja del procedimiento de inserción del plásmido sobre otras formas de mutagénesis es que es mucho más fácil identificar el gen mutado y caracterizar la mutación producida. Los métodos de introducción de material genético en las células de D. discoideum (transfección) también están bien desarrollados. Las células pueden ser transfectadas fácilmente, por ejemplo, por electroporación. Además se han desarrollado numerosos vectores plasmídicos que permiten la expresión de los genes transfectados. Se dispone de promotores que permiten dirigir la expresión de estos genes tanto en el tiempo (de forma constitutiva o regulable) como en el espacio (determinadas fases del proceso de desarrollo y distintas regiones de las estructuras, como veremos más adelante). Estos vectores permiten expresar proteínas de D. discoideum o de otros organismos para estudiar su función. También se pueden utilizar para llevar a cabo experimentos de complementación de mutantes o de búsqueda de genes supresores de mutaciones. Otra utilidad de estos vectores es la expresión de RNA interferentes que permitan silenciar la expresión de algún gen determinado, entre otras muchas aplicaciones. Las técnicas de biología celular y bioquímica también están bien desarrolladas en D. discoideum. Se han puesto a punto protocolos de microscopía óptica y electrónica e inmunohistoquímica que permiten la identificación y tinción de estructuras celulares. Existen marcadores de orgánulos celulares y anticuerpos específicos de bastantes proteínas. También se han desarrollado técnicas para el aislamiento de componentes celulares y la purificación de proteínas. En los últimos años se han puesto a punto también los análisis de proteómica. El acceTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

so a todos estos protocolos y reactivos, incluyendo vectores y secuencias de DNA, está muy bien organizado a través de un banco de datos denominado DictyBase (http://dictybase.org), que ofrece un servicio inapreciable a la comunidad de científicos que trabajan con este organismo. La última ventaja que queremos mencionar es la variedad de procesos biológicos que se pueden estudiar usando D. discoideum como modelo. En este organismo pueden realizarse, por ejemplo, estudios de proliferación, motilidad celular, quimiotaxis, fagocitosis, adhesión celular, determinación celular, diferenciación, morfogénesis, así como de rutas de señalización celular y regulación transcripcional implicadas en estos procesos. En los próximos apartados describiremos algunos ejemplos del uso de D. discoideum en el estudio de algunos de estos procesos. Mencionaremos también ejemplos de posibles aplicaciones al estudio de las bases moleculares de procesos patológicos humanos. UTILIZACIÓN DE Dictyostelium discoideum COMO SISTEMA MODELO EN INVESTIGACIÓN BÁSICA Motilidad celular y quimiotaxis Una de las características que más diferencian a D. discoideum de otros modelos eucariotas sencillos, como pueden ser las levaduras, es su capacidad de movimiento. Las amebas de D. discoideum están en continuo movimiento. Durante la fase de crecimiento se mueven para buscar bacterias, a las que ingieren a través de un proceso de fagocitosis. En condiciones de ayuno las células necesitan moverse para reunirse y formar agregados. Además, las células continúan moviéndose dentro de los agre-

66 M. GALARDI-CASTILLA Y L. SASTRE

gados y esta movilidad es necesaria para la formación del cuerpo fructífero, como veremos más adelante. En todos estos casos la dirección del movimiento está regulada por procesos de quimiotaxis. Es decir, las células se mueven hacia los lugares donde se está segregando un determinado compuesto químico. Podríamos decir que se orientan por el olfato. Cuando buscan alimento el compuesto que las guía es ácido fólico, que es segregado por las bacterias. Durante el proceso de agregación el compuesto es AMP cíclico (cAMP), que es segregado por algunas células que sirven de promotoras del proceso de agregación, atrayendo a las demás. La motilidad celular y la quimiotaxis también son procesos básicos en el desarrollo embrionario y en el funcionamiento de algunas células humanas. El paralelismo más evidente es la similitud que existe entre la captura y fagocitosis de las bacterias invasoras por los macrófagos de nuestro sistema inmunitario y el proceso de alimentación de D. discoideum. Los macrófagos también localizan y persiguen a las bacterias por quimiotaxis. Durante el proceso de desarrollo embrionario existen también muchas etapas en las que las células migran de una región del embrión a otra. Posiblemente el ejemplo más temprano y de mayor transcendencia sea la migración de las células del mesodermo durante el proceso de gastrulación. Las células mesodérmicas se originan en la parte central del embrión y migran por debajo de las células ectodérmicas, ocupando toda la superficie embrionaria y generando el mesodermo. Otro ejemplo muy llamativo es la migración de las células de la cresta neural. Estas células se originan en la parte dorsal del embrión, en la parte posterior de lo que será nuestra columna vertebral, y migran hacia la parte ventral, diseminándose por todo el embrión. Las

células derivadas de la cresta neural dan origen a estructuras muy importantes del embrión; por ejemplo, gran parte de la cara, parte del corazón o la totalidad de las células pigmentadas de la piel, los melanocitos. Muchos de estos procesos de migración celular que tienen lugar durante el desarrollo también están dirigidos por quimiotaxis hacia sustancias segregadas en determinadas zonas del embrión. Los estudios de motilidad celular realizados en D. discoideum han sido, y siguen siendo, pioneros en este área de investigación ―véase, por ejemplo las revisiones de Bozzaro et al. (2004) y King e Insall (2009). Muchos de los trabajos se han centrado en el proceso de agregación inducido por ayuno, que vamos a describir brevemente. Cuando las células de D. discoideum se encuentran en condiciones de ayuno comienzan un proceso de cambio en el programa de expresión génica. Dejan de expresar genes necesarios para proliferar y empiezan a expresar otros necesarios para la formación del cuerpo fructífero. Entre los primeros genes de diferenciación que se expresan están los necesarios para sintetizar cAMP y para segregar este compuesto fuera de la célula. Este proceso no ocurre de forma simultánea en todas las células y algunas empiezan a segregar cAMP antes que las demás. Cada una de estas células se convierte en un centro de agregación hacia donde van a migrar las células que se encuentran en las proximidades, atraídas por el cAMP. La cantidad de cAMP segregada por estas células es muy pequeña pero la señal puede llegar a células situadas a varios milímetros porque existe un proceso de amplificación. La presencia de cAMP extracelular es detectada por las células a través de su unión a unos receptores específicos, y se inicia una cadena de transducción de señales dentro de la célula que pone en marcha varias respuestas. Una Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

Dictyostelium discoideum, UNA AMEBA PECULIAR 67

de ellas es la producción y secreción de nuevo cAMP, amplificando la señal. Otra es la inducción del movimiento celular, como veremos más adelante. La tercera respuesta, que tarda más en manifestarse, es la inducción del proceso de adaptación al cAMP. Cuando una célula lleva varios segundos en presencia de cAMP deja de responder a este estímulo hasta unos minutos después (periodo refractario). Este efecto es muy importante para que la señal se transmita de forma centrífuga, es decir, desde el centro de agregación hacia las regiones más alejadas. Imaginemos que una primera célula emite cAMP y les llega la señal a las células vecinas. Estas emiten más cAMP, pero, gracias a la adaptación, la primera célula emisora ya no responde al cAMP. Únicamente responden las células que están al lado opuesto de la primera célula, transmitiendo la señal de dentro hacia fuera; de la primera célula a la segunda, de esta a la tercera y así sucesivamente, como una onda de las que se forman al tirar una piedra al agua. Esta señalización es, además, periódica. Aproximadamente 7 min después de emitir la primera señal de cAMP la primera célula es capaz de volver a segregar el compuesto, empezando una nueva onda de señalización. De esta forma se originan una serie de ondas de señalización durante unas 4 h. ¿Por qué se mueven las células hacia los centros de agregación al recibir estas señales? La respuesta fenomenológica es sencilla. Imaginemos una célula aislada hacia la que avanza la onda de cAMP. La región de la célula donde antes se detecta el cAMP se convierte en el frente de avance. Allí se forma un pseudópodo que se extiende hacia la onda de cAMP, se fija en el sustrato y al contraerse arrastra a la célula en esa dirección. Cuando pasa la onda de cAMP la célula pierde la orientación, pero al llegar la siguiente onda vuelve a avanzar otro poco Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

en la misma dirección. Este proceso continúa, onda tras onda, hasta que las células convergen en el centro de agregación. Desentrañar los mecanismos por los que ocurre este proceso esta llevando años de trabajo a varios de los mejores grupos que trabajan en este sistema. La capacidad de manipulación genética de D. discoideum ha sido de gran ayuda en este desafío. Uno de los abordajes más productivos ha sido generar de forma aleatoria miles de mutantes y seleccionar aquellos que no son capaces de formar agregados. La selección puede hacerse observando los clones de células creciendo sobre bacterias, puesto que las células que no agregan no forman ningún tipo de estructuras. La falta de agregación puede deberse a alteraciones en diversos procesos. Por ejemplo, puede ser que las células no produzcan cAMP o no sean capaces de detectar el cAMP extracelular y, por lo tanto, no generen o no reciban la señal de agregar. Pero también existen otros mutantes que generan y detectan las señales pero no son capaces de moverse en respuesta a las mismas. El estudio de este tipo de mutantes ha generado muchísima información sobre la quimiotaxis y, en general, la motilidad celular. Las ondas de cAMP no suponen situaciones de todo o nada sino que la concentración del compuesto va aumentando al aproximarse la onda, llega a un máximo y luego vuelve a descender. Es decir, se originan gradientes de concentración de cAMP tanto en el espacio, a lo largo de la longitud de la célula, como en el tiempo. La célula responde a estos gradientes polarizándose, estableciendo una región anterior, que es la primera que detecta el aumento en los niveles de cAMP y la que está en presencia de niveles más altos de este compuesto hasta la llegada del pico de la onda, y una posterior. El extremo posterior es el que detecta más tarde el aumento de

68 M. GALARDI-CASTILLA Y L. SASTRE

nivel de cAMP y que está en presencia de niveles menores hasta el paso del pico. Las células son capaces de detectar gradientes muy pequeños con diferencias de hasta un 2 % de concentración de cAMP entre la parte anterior y la posterior. Aún es un enigma cómo puede hacerlo. Se conoce algo más de las características de las regiones anterior y posterior. En la región anterior la unión de cAMP a sus receptores activa una serie de rutas de señalización, como indicamos anteriormente. Se han caracterizado algunas que activan la polimerización de actina en esta región, lo que lleva a la formación del pseudópodo. Por ejemplo, la activación del receptor de cAMP produce la disociación de proteínas G heterotriméricas, liberando las subunidades γ, que a su vez activan otras proteínas. Una de ellas es una quinasa que fosforila el fosfolípido PIP2, para dar lugar a la forma PIP3. Este compuesto se acumula en la cara interna de la membrana celular, en la parte anterior de la célula, donde sirve de punto de anclaje a una serie de proteínas que contienen el dominio PH (plecktrin homology); entre ellas se encuentran algunas que inducen la polimerización de actina. Otras proteínas que se activan en la parte anterior de la célula y que favorecen la formación de pseudópodos son la fosfolipasa A2 y la proteína quinasa TORC2, pero su papel en el proceso es poco conocido. Mientras en la región anterior se favorece la formación de un pseudópodo, en la región posterior se desencadena el proceso contrario. La unión de cAMP a su receptor en la región anterior también induce la activación del enzima guanilato ciclasa, que sintetiza GMP cíclico (cGMP). Este compuesto difunde por la célula y en la región posterior induce la polimerización de miosina en la zona subyacente a la membrana celular. La capa de miosina impide la for-

mación de pseudópodos en las zonas posteriores y laterales de la célula, que la conducirían en otras direcciones, además de favorecer la contracción de la región posterior, potenciando el avance de la célula hacia el gradiente. Estas rutas se describen con mucho mayor detalle en dos revisiones recientes: Dormann y Weijer, (2006) y King e Insall (2009). Hay que indicar que posteriormente se ha demostrado que las rutas de señalización y los mecanismos de motilidad celular identificados en D. discoideum son importantes también en la movilidad de células animales como los neutrófilos. Análisis de la diferenciación celular y el desarrollo Conocer como se forma un ser vivo a partir de una célula es uno de los temas más fascinantes que ha ocupado a los científicos en el último siglo. Se intenta comprender como se forman los distintos tipos celulares y como se organizan para formar tejidos, órganos y aparatos. En gran medida seguimos sin tener respuestas satisfactorias a estas preguntas debido, fundamentalmente, a la complejidad del proceso. En el desarrollo embrionario hay que conjugar procesos de proliferación celular, migración, adhesión de unas células con otras y con el sustrato, diferenciación de tipos celulares y muerte celular. Todos estos procesos tienen que estar coordinados en el tiempo y en el espacio para llegar a formar estructuras ordenadas en el lugar y momentos precisos. Por este motivo los estudios de desarrollo son enormemente difíciles en animales. Se forman más de un centenar de tipos celulares distintos, que involucran a miles de millones de células que forman estructuras muy complejas. D. discoideum aporta una sencillez mucho mayor para realizar estos estudios. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

Dictyostelium discoideum, UNA AMEBA PECULIAR 69

Solo se forman dos tipos básicos de células diferentes, las que forman las estructuras de soporte, a las que se denomina genéricamente células tallo, y las esporas. El número de células implicado también es mucho menor, unas 100.000, y la estructura formada relativamente sencilla. Sin embargo, los procesos básicos utilizados son los mismos descritos para los embriones de mamíferos. La necesidad de coordinación entre estos procesos para formar estructuras finales proporcionadas y del tamaño adecuado también es similar. La mayor diferencia está en el proceso de proliferación celular. Los embriones animales proceden de una única célula que se va dividiendo y proliferando de forma simultánea a los procesos de diferenciación y desarrollo. En el caso de D. discoideum el proceso comienza por la agregación de muchas células diferentes que prácticamente dejan de dividirse, por lo que diferenciación y morfogénesis ocurren en ausencia de proliferación celular. Por otro lado, los estudios en D. discoideum permiten utilizar las mismas armas genéticas y bioquímicas que mencionamos anteriormente para el estudio de la migración celular.

Figura 3. Formación de agregados celulares. En la fotografía de la izquierda puede observarse las hileras de células que van migrando hacia el centro de agregación, situado en la región izquierda, al mismo tiempo que se van uniendo unas con otras. La fotografía de la derecha muestra el mismo campo unas horas después, cuando los haces de células se fragmentan formando agregados. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

A continuación explicaremos brevemente como continúa la formación del cuerpo fructífero, una vez que se han agregado las células, para dar una idea de las aportaciones que pueden hacerse utilizando este sistema. Como indicamos anteriormente, cuando las células han agotado el alimento comienzan a agregarse. A lo largo del proceso las células se van uniendo entre sí, formando corrientes de células (conocidas como streams), que van confluyendo en el centro emisor de cAMP para formar agregados (mounds) (véase la figura 3). Las células del agregado segregan una matriz extracelular que contiene al agregado y lo aísla del exterior. El siguiente paso es la especificación de parte de las células para iniciar el proceso de diferenciación a células del tallo (células pretallo), mientras que el resto comienza el proceso de diferenciación a esporas (células preespora). No se conoce por qué eligen rutas diferentes, aunque se piensa que depende de la fase del ciclo celular en que se encuentran las células al comenzar el proceso de agregación. La especificación de estos dos tipos celulares no es definitiva y pueden cambiar de uno a otro tipo en etapas posteriores del desarrollo siguiendo programas homeostáticos dirigidos a mantener siempre la misma proporción de células tallo (20 %) y esporas (80 %). Las células pretallo y preespora se pueden identificar porque expresan genes específicos de cada tipo celular. Por ejemplo, las células pretallo expresan genes que codifican proteínas de la matriz extracelular, tales como EcmA y B (Ecm: extracellular matrix). Las células preespora expresan genes que codifican proteínas componentes de la cubierta de la espora, tales como scpA, B, C o D (scp: spore coat protein) o psaA (prespore gene A). La expresión de estos genes se puede visualizar fácilmente usando genes reporteros. Para ello se construyen vectores plasmídicos en los que se

70 M. GALARDI-CASTILLA Y L. SASTRE

sitúa el promotor del gen que se quiere seguir (por ejemplo, ecmB o psaA) controlando la expresión de un gen fácilmente detectable (gen reportero). Se suele usar como reportero el gen lacZ, que codifica βgalactosidasa. Las células de D. discoideum no poseen este gen. Por tanto, toda la actividad que podamos detectar proviene del gen lacZ transfectado en las células. La actividad β-galactosidasa se detecta fácilmente suministrando a las células un sustrato del enzima (X-Gal) que forma un precipitado azul al ser hidrolizado. Lo más importante de esta técnica es que únicamente las células que expresan el gen que estamos estudiando, cuyo promotor hemos incorporado al vector, expresan βgalactosidasa y únicamente ellas se tiñen de azul. Por ejemplo, si utilizamos un promotor de un gen pretallo (ecmB) se ponen azules las células pretallo, y si utilizamos un promotor de un gen específico de células preespora (psaA) serán estas las que se pongan azules (véase la figura 4). Utilizando esta técnica se ha podido ver que las células pretallo y preespora se diferencian independientemente unas de otras y aparecen distribuidas al azar en los agregados, entremezcladas. Las células en el agregado continúan moviéndose en círculos pero, poco a poco, las células pretallo van uniéndose entre sí y migrando hacia la parte central y superior del agregado. Al acumularse las células pretallo se forma, en esta zona, una pequeña prominencia, que se denomina tip, mientras que las células preespora quedan en la región inferior (véase las figuras 4a y b). Esta estructura va alargándose progresivamente hacia arriba adquiriendo una forma de dedo, por lo que se le llama finger, aunque sigue dividida en las dos mismas zonas (véase las figuras 4c y d). La estructura en la fase de finger puede dar lugar a una forma migratoria. En este

caso el finger se tumba en el sustrato y comienza a moverse como si fuera una pequeña babosa, por lo que se le denomina slug. En esta estructura una parte de las células pretallo ocupan la parte anterior, que encabeza el movimiento, y las células preespora la parte posterior (véase las figuras 4e y f). El movimiento de los slugs está dirigido por fototaxis y termotaxis, de forma que se dirige hacia la luz y hacia temperaturas más elevadas, lo cual les permite migrar hacia las capas superiores de los suelos forestales, quedando los cuerpos fructíferos expuestos al exterior para favorecer la dispersión de las esporas. Es interesante tener en cuenta que el slug está constituido por células independientes que se mueven continuamente en su interior, a pesar de lo cual se comporta como un seudoorganismo, por lo que esta estructura sigue siendo objeto de numerosos estudios. Una vez que el slug llega a un lugar idóneo para continuar el desarrollo vuelve a la posición erecta, típica de finger, con las células pretallo en la parte superior (véase la figura 4g). Comienza entonces la fase de formación del cuerpo fructífero, conocida como culminación. Algunas células pretallo migran hacia el sustrato, a través de la masa de células preespora dirigiéndose hacia un grupo de células pretallo que formarán el pie de la estructura (véase la figura 4h). Una vez iniciado, el proceso es continuo, de forma que casi todas las células pretallo van incorporándose progresivamente y se forma una columna de células apoyadas en el sustrato. Estas células se van diferenciando según se incorporan a la columna, se alargan verticalmente, segregan una capa rígida de celulosa y, finalmente, mueren. La elongación del tallo va elevando la masa de células preespora (véase las figuras 4i, j y k), mantenidas en la parte superior del tallo por unas estructuras de soporte, como pequeñas copas, Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

Dictyostelium discoideum, UNA AMEBA PECULIAR 71

formadas por células pretallo, y que se sitúan por encima y debajo de la masa de cé-

Figura 4. Evolución de las poblaciones de células pretallo y preespora a lo largo del proceso de desarrollo. En las distintas fotografías se muestra la localización de los dos grupos de células a lo largo del desarrollo. En un caso se muestran estructuras derivadas de células que expresan el gen lacZ bajo el control del promotor del gen ecmB, específico de células pretallo (paneles a, b, c, e, g, h, j). El resto de las estructuras provienen de células que expresan el gen lacZ bajo el control del promotor del gen psaA, específico de células preespora (paneles d, f, i, k). La expresión de lacZ se detecta por la formación de un precipitado azul al hidrolizarse el sustrato X-Gal. Posteriormente las estructuras se han teñido con eosina para facilitar la visualización de las células que no expresan lacZ. Se muestran estructuras correspondiente a los estados de agregados (a, b), finger (c, d ), slug (e, f ), inicio de la culminación (g, h, i) y culminación avanzada (j, k). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

lulas preespora (por ello estas estructuras son denominadas upper cup y lower cup) (véase la figura 4j). Una vez formado el tallo las células preespora se diferencian a esporas. El proceso de diferenciación supone la síntesis de una cubierta exterior, formada por celulosa y proteínas, que es impermeable, que aísla a las esporas del exterior. Las esporas sufren además un proceso de desecación y entran en una fase de letargo, con escasa actividad metabólica, en la que pueden permanecer varias semanas. Las esporas pueden ser dispersadas por el viento o arrastradas por distintos animales, diseminándose por el medio ambiente. En el caso de que caigan en un lugar adecuado germinan, comenzando un nuevo ciclo biológico. El proceso de desarrollo se ha podido analizar molecularmente y se han identificado múltiples genes necesarios para sus distintas etapas. Se han identificado, por ejemplo, mutantes deficientes en la formación del tallo o de las esporas, cepas que no forman slugs u otras en las que estos migran indefinidamente. Existen también cepas que tienen alterada la duración del proceso. La duración habitual es de 24 h pero hay cepas que realizan el proceso en varias horas menos y otras que llegan a tardar hasta 48 h. La caracterización de estos mutantes está permitiendo estudiar los mecanismos que regulan el proceso de desarrollo. A ello también está contribuyendo el uso de métodos de análisis masivos de niveles de expresión génica (microchips de DNA), que permiten conocer los genes que se inducen o reprimen en cada etapa del desarrollo y en los distintos mutantes generados. En los últimos años se ha progresado en el estudio de diversos aspectos del proceso de desarrollo ―revisado recientemente por Siu et al. (2004), Maeda (2005), Strmecki et al. (2005) y Williams (2006). Por poner

72 M. GALARDI-CASTILLA Y L. SASTRE

algunos ejemplos hablaremos brevemente sobre los procesos de comunicación intercelular que coordinan el desarrollo. El primer ejemplo está relacionado con la regulación del tamaño de los agregados y, por lo tanto, del cuerpo fructífero. ¿Por qué no se forman agregados de más de 100.000 células ni siquiera cuando los cultivos son muy densos? Se ha observado que al principio del proceso de agregación las células segregan proteínas que limitan el tamaño de los agregados. Se las denomina factor contador de células (cell-counting factor). Este factor se va acumulando en el medio en cantidad proporcional al número de células presentes. Cuando la concentración es elevada se une a las células disminuyendo su capacidad de adhesión y aumentando su motilidad. De esta manera desestabiliza los streams haciendo que si hay muchas células se rompan en varios trozos, formando varios agregados, más pequeños, en lugar de uno solo (véase la figura 3). También existen mecanismos para coordinar la diferenciación de las células del tallo y las esporas. En general, se trata de mecanismos de regulación recíproca mediados por sustancias segregadas por un tipo celular y que actúan sobre el otro tipo. Una de estas sustancias es DIF-1 (differentiation inducing factor 1), que es segregado por las células preespora al principio del proceso de culminación y que induce la diferenciación de las células del tallo. El proceso recíproco ocurre al final del proceso de culminación y el comienzo de la diferenciación de las esporas. Es conveniente que las esporas no se diferencien antes de que el soro que las contiene haya sido elevado del sustrato por el tallo. El proceso se coordina porque el tallo produce factores peptídicos tales como SDF-1 y SDF-2 (spore differentiation factors), que induce la diferenciación de las esporas.

UTILIZACIÓN DE Dictyostelium discoideum COMO SISTEMA MODELO EN INVESTIGACIÓN APLICADA En este apartado mencionaremos algunos ejemplos de campos de investigación aplicada a problemas sanitarios en los que se ha utilizado D. discoideum, sin mayor pretensión que dar una visión general de los trabajos realizados. En cada apartado se hace referencia a revisiones recientes en las que se aporta información mucho más detallada del tema específico. Estudio de la interacción huésped-patógeno Como hemos mencionado en varias ocasiones, D. discoideum vive alimentándose de bacterias. Normalmente las bacterias ingeridas quedan englobadas en fagosomas a los que se fusionan lisosomas, que aportan enzimas capaces de digerirlas para, a continuación, poder absorber los nutrientes generados. Sin embargo, algunas bacterias han desarrollado mecanismos de defensa para sobrevivir a estos ataques. Algunas veces segregan sustancias que matan a la célula predadora. En otras ocasiones son fagocitadas pero logran evitar ser destruidas en el fagosoma e incluso consiguen crear aquí las condiciones adecuadas para reproducirse, convirtiendo al predador en una célula portadora. Esta situación no solo se da en los ecosistemas de suelos forestales sino que es la base de algunas enfermedades infecciosas que nos afectan a los humanos. Quizás uno de los ejemplos más conocidos sean las infecciones por Legionella pneumophila, que causa la enfermedad de los legionarios. Esta bacteria crece en asociación con amebas, frecuentemente Hartmanella vermiformes o Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

Dictyostelium discoideum, UNA AMEBA PECULIAR 73

Acanthamoeba castellani, en ambientes acuosos (por ejemplo, hace pocos años se localizó un brote en torres de refrigeración de hospitales españoles). Las bacterias se reproducen dentro de las amebas pero, si son inhaladas por algún ser humano y son fagocitadas por macrófagos alveolares, también pueden reproducirse dentro de estas células de nuestro sistema inmunitario, causando la correspondiente neumonía. El hecho de que la ingestión de una bacteria por una célula fagocítica conduzca a la muerte de la bacteria o no, depende de una serie compleja de reacciones, que es lo que se conoce como interacción huéspedpatógeno. En los casos estudiados los mecanismos puestos en marcha cuando la bacteria es ingerida por un macrófago humano o por D. discoideum son similares. Estas observaciones han motivado una utilización creciente de D. discoideum para estudiar las respuestas inducidas por bacterias que provocan enfermedades humanas. Entre ellas tenemos Mycobacterium tuberculosis (causante de la tuberculosis), Salmonella typhimurium (salmonelosis), Pseudomonas aeruginosa (infecciones nosocomiales en pacientes quemados, con fibrosis cística o inmunodeprimidos), Yersinia pseudotuberculosis (enfermedades gastrointestinales, placas bubónicas) o Neisseria meningitides (sepsis, meningitis). El ensayo más sencillo para el que se ha empleado D. discoideum consiste en determinar la patogenicidad de las cepas bacterianas. D. discoideum puede crecer en placas de cultivo sobre bacterias, como se ha mencionado anteriormente, y el crecimiento se puede observar y cuantificar muy fácilmente por la aparición de placas de lisis. Si las bacterias son patógenas y matan a la célula que las ingiere o crecen en su interior no aparecen placas de lisis. Por lo tanto un ensayo sencillo para ver si una cepa aislada, por ejemplo, en una muestra hosTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

pitalaria, es patógena o no, consiste en utilizarla de sustrato para hacer crecer D. discoideum. En estos ensayos se ha observado muy buena correlación entre la patogenicidad observada en humanos y en D. discoideum. Sin embargo, la mayor parte de los estudios realizados se han basado en la capacidad de manipulación experimental de D. discoideum y en su versatilidad para experimentos de biología celular. Se han obtenido resultados interesantes sobre los mecanismos por los que las bacterias matan a las células huésped caracterizando mutantes de D. discoideum que son resistentes a la infección. En algunos casos se han aislado cepas resistentes analizando miles de mutantes generados al azar. La identificación del gen mutado ha permitido iniciar el estudio de nuevos mecanismos de interacción huésped-patógeno. En otros casos se ha utilizado D. discoideum para profundizar en el estudio de genes que ya se sospechaba que eran importantes en los mecanismos de patogenicidad. Disponer de cepas mutantes para estos genes permite realizar estudios adicionales y ofrece un modelo experimental para la búsqueda de nuevos tratamientos. La posibilidad de expresar proteínas bacterianas en D. discoideum, bien sean silvestres o mutantes, también es muy conveniente para estudiar su función y su posible interacción con proteínas del huésped. Por último, el desarrollo de técnicas de expresión y localización de proteínas en D. discoideum y el desarrollo de marcadores de las distintas estructuras celulares está permitiendo estudiar en detalle el proceso de fagocitosis de las bacterias y su evolución dentro de la célula. Este seguimiento se puede realizar en células no modificadas o tras la mutación o sobreexpresión de genes de interés, de manera que se facilita mucho su estudio funcional.

74 M. GALARDI-CASTILLA Y L. SASTRE

Estos trabajos han sido revisados recientemente por Fajardo et al. (2004), Steinert y Heuner (2005), Cosson y Soldati (2008) y Clarke (2010). Estudio de mecanismos de respuesta y de resistencia a fármacos antitumorales La resistencia a los fármacos empleados en terapia es uno de los principales problemas que se encuentran en el tratamiento de muchos tumores. Hay determinados tipos de tumores, y pacientes, que no responden a algunas drogas anticancerígenas. En otros muchos casos los tumores responden favorablemente durante un tiempo pero desarrollan mecanismos de resistencia y vuelven a crecer incontroladamente. Dado que el número de fármacos que existe para luchar contra el cáncer es escaso, especialmente para algunos tipos de tumores, es muy importante tratar de superar los mecanismos de resistencia. Para ello es necesario conocer lo mejor posible el mecanismo de acción de los fármacos, la respuesta de la célula ante la administración de los mismos y los mecanismos de resistencia que se inducen en la célula. D. discoideum ha sido utilizado en algunos de estos estudios. El primer ejemplo que queremos mencionar son los estudios realizados sobre los mecanismos de resistencia al cisplatino. Este compuesto es una de las drogas más utilizadas para el tratamiento de tumores sólidos, siendo frecuentes los casos de desarrollo de resistencia. Las células de D. discoideum son sensibles al cisplatino, por lo que fueron utilizadas en un ensayo de mutagénesis al azar, seleccionando células que fueran más resistentes a la droga. Se identificaron siete genes implicados en la respuesta al cisplatino que al ser mutados conferían mayor resistencia a las células. Ninguno de ellos había

sido identificado anteriormente en estudios de resistencia de células tumorales al cisplatino. Uno de ellos, que codifica la enzima esfingosina-1-fosfato liasa, ha sido estudiado en detalle en D. discoideum. Los resultados obtenidos han permitido conocer la importancia de las rutas de señalización mediadas por esfingolípidos y ceramidas en la muerte celular inducida por cisplatino, así como en el establecimiento de rutas de resistencia a este fármaco. La importancia de esta ruta ha sido confirmada posteriormente en células tumorales humanas. Estos trabajos han sido revisados recientemente (Alexander et al., 2006). D. discoideum ha sido empleado también para estudiar la respuesta celular al tratamiento con cisplatino (Driessche et al., 2007). En estos estudios se tratan las células con cisplatino y, a continuación, se comparan los genes expresados en las células antes y después del tratamiento. En este caso se comparó la expresión de 5.669 genes por técnicas de microchips y se encontró que había unos 400 que variaban su nivel de expresión al tratar a las células con cisplatino. Entre estos genes se espera que haya algunos importantes para determinar la sensibilidad a la droga. El estudio más detallado de alguno de ellos se puede realizar generando cepas mutantes, aprovechando la capacidad de recombinación homóloga que tienen las células de D. discoideum. Un tercer procedimiento experimental que se ha utilizado en D. discoideum para estudiar el mecanismo de acción de algunas drogas es mediante la sobreexpresión de proteínas. El fundamento del método es pensar que si una droga actúa uniéndose a una proteína podría interferirse su acción sobreexpresando la proteína, que actuaría como una especie de trampa para la droga, provocando cierta resistencia a la misma. En estos experimentos se transfecta una Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

Dictyostelium discoideum, UNA AMEBA PECULIAR 75

población grande de células con una colección de vectores que expresan la mayor parte de las proteínas de D. discoideum. Cada célula puede incorporar, idealmente, un vector de la colección y, por tanto, expresar una proteína diferente. La colección de células transfectadas se incuba a continuación con la droga para seleccionar las células resistentes. Posteriormente se identifica la proteína que resultó sobreexpresada y se caracteriza su capacidad para inducir resistencia y los mecanismos moleculares implicados. Este abordaje ha sido empleado, por ejemplo, para identificar la proteína con la que interaccionan los aminobifosfonatos, utilizados en el tratamiento de enfermedades que causan reabsorción ósea (Sugden et al., 2005). D. discoideum también ha sido empleado para estudiar el mecanismo de acción de fármacos utilizados para el tratamiento de enfermedades no oncológicas. Es, por ejemplo, el caso del ácido valproico y el litio, empleados en enfermedades psiquiátricas tales como el trastorno bipolar. Para estudiar el mecanismo de acción del litio se generó una colección de mutantes y se aislaron células resistentes. Una de ellas tenía mutado el gen que codifica una enzima, la prolil oligopeptidasa, asociada con enfermedades psiquiátricas. El estudio de estos mutantes permitió establecer que esta enzima es clave para regular los niveles de inositol(1,4,5)-trifosfato (PIP3) (King et al., 2009). Estos estudios llevaron a proponer que el litio produce un descenso en los niveles de este compuesto. Posteriormente se pudo observar que el ácido valproico también disminuye los niveles de PIP3, tanto en D. discoideum como en neuronas humanas. En base a estos resultados se ha utilizado posteriormente D. discoideum para ensayar el efecto de compuestos derivados del ácido valproico, buscando fármacos con menores efectos secundarios. Por otro Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

lado, D. discoideum se ha utilizado para estudiar el mecanismo por el que el ácido valproico activa la proteína quinasa Erk-2, reacción importante para el efecto neuroprotector de este compuesto. Los experimentos realizados en D. discoideum, utilizando diversos abordajes genéticos, permitieron determinar que el ácido valproico altera la ruta de señalización por cAMP a través de la proteína quinasa A y que esta ruta activa Erk-2. Estudios complementarios permitieron determinar que el litio también aumenta la actividad de Erk-2, en este caso por inhibición de la glucógeno sintetasa quinasa A. Este efecto también se ha observado en el cerebro de ratas tratadas con litio, respaldando el uso de D. discoideum como sistema modelo para estudiar el mecanismo de acción de estas drogas. Estos estudios han sido revisados recientemente (Williams et al., 2006). Estudio de enfermedades hereditarias humanas Cada día se conocen más enfermedades hereditarias causadas por mutaciones en un único gen. Generalmente aparecen con una frecuencia muy baja en la población, por lo que se las incluye en el grupo de enfermedades raras. Hasta el presente se han descrito unas 3.000 enfermedades de este tipo, que cursan con síntomas enormemente variados. El estudio de estas enfermedades, conocer por qué la mutación del gen origina los defectos morfológicos, funcionales o de comportamiento observados, es muy difícil. Una de las razones es la complejidad de nuestro desarrollo embrionario, puesto que el gen mutado puede actuar en cualquier momento del mismo y los defectos que observamos después del nacimiento pueden haberse generado en un momento desconocido de la gestación.

76 M. GALARDI-CASTILLA Y L. SASTRE

La sofisticada homeostasis de nuestro organismo también supone una dificultad añadida porque, a veces, los defectos observados en un órgano tienen su origen en otro lugar del organismo donde, por ejemplo, no se produce una señalización correcta. Por estas razones muchos investigadores intentan estudiar los genes mutados en sistemas modelo más sencillos, con la esperanza de poder extrapolar los resultados obtenidos al estudio de los pacientes afectados por la enfermedad. D. discoideum puede ser un modelo adecuado para el estudio de algunos de estos genes. Por ejemplo, el estudio de 287 genes implicados en enfermedades humanas permitió identificar 33 genes de D. discoideum que codifican proteínas muy similares. Los genes homólogos humanos están implicados en enfermedades muy diversas; entre otras, cáncer, enfermedades neurológicas, cardiovasculares o metabólicas. Además, algunos de estos genes no están presentes en otros sistemas modelo como las levaduras. El estudio de estos 33 genes en D. discoideum puede aportar datos interesantes que sirvan de referencia para la caracterización de los correspondientes genes humanos y para comprender las bases moleculares de las enfermedades asociadas. Lógicamente, en D. discoideum no se puede reproducir la sintomatología de las enfermedades humanas, ni los defectos anatomopatológicos o funcionales observados en humanos, al ser un organismo unicelular. El objetivo es estudiar la función de estos genes dentro de la célula, en qué proceso participan, como se regula su función, con qué otros genes y proteínas interaccionan y cuáles son las alteraciones derivadas de su mutación. En los últimos años se han realizado estudios sobre algunos de estos genes, que pueden darnos una idea sobre los resultados que se pueden esperar ―revisados por

Saxe (1999) y Williams et al. (2006). El primer ejemplo son los estudios realizados sobre el síndrome de Shwachman-BodianDiamond (SBDS), enfermedad que afecta al comportamiento de los neutrófilos, por lo que los pacientes sufren infecciones frecuentes. Aproximadamente el 70 % de los pacientes presentan mutaciones en el gen SBDS, que codifica una proteína con dominios de unión al RNA. D. discoideum tiene un gen que codifica una proteína con un 38 % de identidad y 69 % de similitud a la proteína humana. Se ha podido establecer que la proteína SBDS de D. discoideum se localiza en los pseudópodos de amebas migrando en un gradiente de cAMP, implicando directamente a esta proteína en la quimiotaxis y la motilidad celular, aunque aún no se ha podido determinar su mecanismo de acción. Otra enfermedad humana que se ha estudiado en D. discoideum es la lisencefalia, un desorden cerebral causado por mutaciones en genes que codifican proteínas asociadas al citoesqueleto, como LIS1. Esta proteína es un regulador de dineína, que es necesaria para el transporte de componentes celulares a lo largo de los microtúbulos. En D. discoideum existe una proteína con un 60 % de identidad con LIS1. Se ha podido generar en este organismo un modelo de la enfermedad humana expresando formas de LIS1 de D. discoideum que contienen los mismos cambios en la secuencia de aminoácidos encontrados en algunos enfermos. El análisis de estas células ha mostrado que LIS1 es requerida para mantener la integridad del sistema de Golgi y para el funcionamiento correcto del citoesqueleto de tubulina (microtúbulos). Los estudios realizados en D. discoideum también han demostrado que LIS1 es un componente del centrosoma y que participa en la regulación de rutas de transducción de señales dependientes de Rho, Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

Dictyostelium discoideum, UNA AMEBA PECULIAR 77

que, a su vez, regula la motilidad celular. También permitieron establecer que LIS1 interacciona con otras proteínas asociadas a los microtúbulos y a dineína. Todas estas interacciones podrían justificar los defectos observados en la migración de los precursores neuronales, que son el origen de la enfermedad humana, y abren nuevas posibilidades para su estudio. Otro tipo de enfermedades de origen genético son las enfermedades mitocondriales, que se originan como consecuencia de mutaciones en los genes contenidos en las mitocondrias, o en genes nucleares que codifican proteínas mitocondriales. Cada célula contiene centenares de mitocondrias, que se reparten aleatoriamente entre las células hijas en cada mitosis, lo que supone que no todas las mitocondrias de cada célula tengan que ser iguales. Por ejemplo, si surge una mutación en una mitocondria de una célula solo se ven afectadas esta mitocondria y sus descendientes, pero el resto de las mitocondrias de la célula son silvestres. En sucesivas divisiones el número de mitocondrias mutadas y silvestres se va distribuyendo al azar y varía de unas células a otras. Por esta razón, si la mutación provoca un funcionamiento anómalo de la mitocondria el grado de afectación puede variar entre células, según la proporción de mitocondrias afectadas que contengan. Este hecho se refleja en que las enfermedades mitocondriales muestran una sintomatología que puede variar entre distintos pacientes, en diferentes tejidos del mismo paciente o en distintas épocas de su vida. D. discoideum también está siendo utilizado como modelo para este tipo de enfermedades. Se han generado cepas mutantes para genes mitocondriales. Además, el aislamiento de distintos clones ha permitido clasificarlos en función de la proporción de mitocondrias mutantes que contienen. También se ha generado cepas en las que Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

se ha mutado genes nucleares que codifican proteínas mitocondriales o se ha disminuido su nivel de expresión utilizando RNA interferentes. Todas estas herramientas, junto con el hecho de que las disfunciones mitocondriales son fácilmente identificables en D. discoideum por los defectos que causan en la proliferación celular y en el proceso de desarrollo, están haciendo de esta ameba un buen modelo para el estudio de enfermedades mitocondriales. Estos trabajos han sido revisados por P. Fisher (Annesley y Fisher, 2009). BIBLIOGRAFÍA Alexander, S.; Min, J.; Alexander, H. (2006). «Dictyostelium discoideum to human cells: pharmacogenetic studies demonstrate a role for sphingolipids in chemoresistance». Biochim. Biophys. Acta, 1760: 301-309. Annesley, S. J.; Fisher, P. R. (2009). «Dictyostelium discoideum–a model for many reasons». Mol. Cell Biochem., 329: 73-91. Bozzaro, S.; Fisher, P. R.; Loomis, W.; Satir, P.; Segall, J. E. (2004). «Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis». Trends Cell Biol., 14: 585-588. Clarke, M. (2010). «Recent insights into host-pathogen interactions from Dictyostelium». Cell Microbiol., 12: 283-291. Cosson, P.; Soldati, T. (2008). «Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria». Curr. Opin. Microbiol., 11: 271-276. Dormann, D.; Weijer, C. J. (2006). «Imaging of cell migration». Embo J., 25: 3480-3493. Driessche, N. van; Alexander, H.; Min, J.; Kuspa, A.; Alexander, S.; Shaulsky, G. (2007). «Global transcriptional responses to cisplatin in Dictyostelium discoideum identify potential drug targets». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 15406-15411. Eichinger, L.; Pachebat, J. A.; Glockner, G.; Rajandream, M.; Sucgang, R.; Berriman, M.; Song, J.; Olsen, R.; Szafranski, K.; Xu, Q. (2005). «The genome of the social amoeba Dictyostelium discoideum». Nature, 435: 43-57. Fajardo, M.; Schleicher, M.; Noegel, A.; Bozzaro, S.; Killinger, S.; Heuner, K.; Hacker, J.; Stein-

78 M. GALARDI-CASTILLA Y L. SASTRE ert, M. (2004). «Calnexin, calreticulin and cytoskeleton-associated proteins modulate uptake and growth of Legionella pneumophila in Dictyostelium discoideum». Microbiology, 150: 2825-2835. King, J. S.; Insall, R. H. (2009). «Chemotaxis: finding the way forward with Dictyostelium». Trends Cell Biol., 19: 523-530. King, J. S.; Teo, R.; Ryves, J.; Reddy, J. V.; Peters, O.; Orabi, B.; Hoeller, O.; Williams, R. S.; Harwood, A. J. (2009). «The mood stabiliser lithium suppresses PIP3 signalling in Dictyostelium and human cells». Dis. Model Mech., 2: 306-312. Maeda, Y. (2005). «Regulation of growth and differentiation in Dictyostelium». International Review of Cytology, 244: 287-332. Saxe, C. L. (1999). «Learning from the slime mold: Dictyostelium and human disease». Am. J. Hum. Genet., 65: 25-30. Siu, C. H.; Harris, T. J.; Wang, J.; Wong, E. (2004). «Regulation of cell-cell adhesion during Dictyostelium development». Semin. Cell Dev. Biol., 15: 633-641.

Steinert, M.; Heuner, K. (2005). «Dictyostelium as host model for pathogenesis». Cell Microbiol., 7: 307-314. Strmecki, L.; Greene, D. M.; Pears, C. J. (2005). «Developmental decisions in Dictyostelium discoideum». Dev. Biol., 284: 25-36. Sugden, C. J.; Roper, J. R.; Williams, J. G. (2005). «Engineered gene over-expression as a method of drug target identification». Biochem. Biophys. Res. Commun., 334: 555-560. Thomason, P.; Traynor, D.; Kay, R. (1999). «Taking the plunge-terminal differentiation in Dictyostelium». Trends Genet., 15: 15-19. Williams, J. G. (2006). «Transcriptional regulation of Dictyostelium pattern formation». EMBO Rep., 7: 694-698. Williams, R. S.; Boeckeler, K.; Graf, R.; MullerTaubenberger, A.; Li, Z.; Isberg, R. R.; Wessels, D.; Soll, D. R.; Alexander, H.; Alexander, S. (2006). «Towards a molecular understanding of human diseases using Dictyostelium discoideum». Trends Mol. Med., 12: 415-424.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 61-78

DOI: 10.2436/20.1501.02.105

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 79-91

LA PLANTA MODEL Arabidopsis thaliana Elena Monte Departament de Genètica Molecular, Centre de Recerca en Agrigenòmica, Consorci CSIC-IRTA-UAB-UB Adreça per a la correspondència: Elena Monte. Departament de Genètica Molecular, Centre de Recerca en Agrigenòmica, Consorci CSIC-IRTA-UAB-UB. Campus UAB, Edifici CRAG. 08193 Bellaterra. Tel.: 935 636 600. Adreça electrònica: elena.monte@cid.csic.es. RESUM En els últims trenta anys la planta angiosperma Arabidopsis thaliana ha estat l’organisme model utilitzat per milers de biòlegs. Arabidopsis s’autopol·linitza, té un genoma petit, té un cicle de vida curt, és de mida petita i té uns requisits de creixement senzills que la fan fàcil de fer créixer en condicions de laboratori. L’èxit d’Arabidopsis com a planta model es basa en la disponibilitat de mètodes genòmics i d’eines que han estimulat la recerca en la biologia de plantes i han facilitat la investigació d’un ampli ventall de preguntes biològiques. Aquest article explica alguns dels esdeveniments clau en la història d’Arabidopsis com a planta model, i en el creixement de la comunitat d’investigadors que la utilitzen per a la seva recerca. I també il·lustra com Arabidopsis ha facilitat la recerca, amb l’exemple en un camp d’especial interès en plantes: el de la percepció i resposta a la llum del seu en torn. Paraules clau: Arabidopsis thaliana, planta model, mutant, fitocrom, factor interactor de fitocrom. THE MODEL PLANT Arabidopsis thaliana SUMMARY During the past 30 years, the flowering plant Arabidopsis thaliana has been the model organism of choice for thousands of biologists. Arabidopsis is self-fertilizing, has a small genome, has a short life cycle, and the small size and simple growth requirements make it easy to grow in laboratory conditions. The extensive acceptance of Arabidopsis as a model plant is based on the genomic methods and resources that are available for it, which have Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

80 E. MONTE

greatly stimulated plant biological research and have facilitated the investigation of a range of biological questions. Here, we review some of the key events in the history of Arabidopsis as a model plant and the growth of the Arabidopsis research community. And we explain how Arabidopsis has facilitated the research in a field of particular importance in plants: the perception and response to their light environment. Key words: Arabidopsis thaliana, model plant, mutant, phytochrome, phytochrome-interacting factor. PER QUÈ ES NECESSITA UNA PLANTA MODEL? Les plantes constitueixen la majoria de biomassa del nostre planeta i en podem trobar en un ventall molt ampli d’ecosistemes. La seva gran diversitat i capacitat d’adaptació a una varietat d’ambients molt àmplia va fer pensar durant molt de temps que les conclusions que es poguessin treure de l’estudi d’una planta model no es podrien aplicar fàcilment a cap altra planta. De fet, l’estudi de plantes model és relativament recent comparat amb l’ús, per exemple, d’animals model. Fins als anys vuitanta, quan va començar l’era molecular, la recerca genètica en plantes estava basada en plantes d’interès agronòmic o ornamental com el blat de moro, el tomàquet, l’ordi, el pèsol o la petúnia. Aquestes espècies atreien l’interès experimental per característiques que les feien atractives, com la grandària dels cromosomes de l’ordi o el color de les flors de la petúnia. L’interès d’aquestes espècies en justificava l’ús en recerca, però també va condicionar el tipus de preguntes que s’estudiaven. A partir dels anys vuitanta, quan es van desenvolupar les primeres tècniques de clonatge de gens, es va fer palès que moltes d’aquestes plantes d’interès agronòmic eren massa difícils d’utilitzar per a estudis genètics i moleculars, ja que posseïen genomes molt grans, poliploides i sovint amb alt contingut de DNA repetitiu, característiques que en complicaven l’anàlisi i manipulació ge-

nòmiques. Per tant, d’ençà de l’era molecular, el sistema model experimental idoni per a la comunitat científica de plantes havia de ser un organisme amb un genoma senzill que fos fàcil d’utilitzar tant en estudis de genètica clàssica com de genètica molecular. LA PLANTA MODEL Arabidopsis thaliana Des dels anys vuitanta, Arabidopsis ha estat l’organisme model de la comunitat de biòlegs de plantes (Somerville i Koornneef, 2002). A. thaliana és una petita planta angiosperma (planta que fa flors i llavors), una mala herba de la família de les brassicàcies i parent silvestre de les brassicàcies hortícoles com la col, el bròquil o la coliflor (vegeu la figura 1). S’han descrit més de 750 ecotips d’Arabidopsis, que són varietats adaptades a condicions ambientals específiques. Aquests ecotips estan distribuïts per tot el món, amb una gran variació natural tant a escala morfològica i de desenvolupament (per exemple, en la forma de les fulles), com de fisiologia (per exemple, en el temps de floració o la resistència a patògens). Atès l’elevat nombre d’espècies distribuïdes a l’Àsia central, es pensa que l’origen de l’espècie es trobaria en aquesta zona, mentre que la seva presència a Amèrica i a Austràlia s’atribuiria a les migracions humanes. Geogràficament, Arabidopsis té preferència per climes temperats amb Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

LA PLANTA MODEL Arabidopsis thaliana 81

poca pluja. Tots els ecotips descrits es poden trobar al centres ABRC (sigles en anglès de l’Arabidopsis Biological Resource Center), i NASC (sigles en anglès del Nottingham Arabidopsis Stock Center). Els ecotips més utilitzats en recerca són Columbia (Col), Landsberg erecta (Laer), i Wassilewskija (Ws). Arabidopsis no té interès agronòmic, però és molt adequada per a la recerca bàsica de genètica i biologia molecular per diverses raons: a) la seva mida petita i la facilitat de créixer en condicions de laboratori; b) el seu temps curt de generació (5-6 setmanes de la germinació a la planta madura), i c) el seu petit genoma (125.000.000 bases, un dels més petits de les plantes amb flor), diploide i seqüenciat l’any 2000. Un altre gran avantatge d’Arabidopsis com a model és la facilitat amb què una planta mutant (planta amb un gen afectat) es pot mantenir, ja que el pol·len d’una flor d’Arabidopsis fertilitza la seva mateixa flor mitjançant autopol·linització. A més, Arabidopsis es transforma fàcilment utilitzant el bacteri Agrobacterium tumefaciens. La transformació d’Arabidopsis permet introduir un gen d’interès al genoma de la planta utilitzant A. tumefaciens com a vector i generar una planta transgènica. Aquesta metodologia també s’ha utilitzat per generar mutants d’inserció de tDNA (en què es muten gens de la planta per interrupció de la seva seqüència a causa de la inserció de tDNA «buit» sense gens bacterians ni transgens). Actualment, la comunitat científica que treballa amb Arabidopsis també té disponibles eines com microxips de DNA, que permeten fer estudis dels gens que s’expressen en la planta en unes condicions ambientals determinades o sota el control de gens específics. Diverses pàgines web com TAIR (The Arabidopsis Information Resource, www.arabidopsis.org) recullen tota aquesta informació i la posen a disposició de la comunitat científica. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

Aquesta disponibilitat d’eines, recursos i estratègies experimentals per a Arabidopsis han fet que tingués gran acceptació com a planta model i han estimulat l’expansió de la recerca de la biologia de plantes en els últims trenta anys. HISTÒRIA D’Arabidopsis thaliana COM A ORGANISME MODEL Arabidopsis va ser descoberta per Johannes Thal (d’aquí ve el nom thaliana) al segle xvi a les muntanyes alemanyes de Harz. Thal li va donar el nom de Pilosella siliquos, i el nom actual el va proposar De Canddle l’any 1821. La primera descripció d’un mutant data del 1873, i l’any 1943 Friedrich Laibach va descriure els avantatges d’usar-

Figura 1. a) Arabidopsis thaliana crescuda a l’hivernacle durant quatre setmanes. b) Detall d’una inflorescència i dels fruits allargats (les síliqües), que contenen unes cinquanta llavors cadascuna. c) Llavors d’Arabidopsis observades amb augment.

82 E. MONTE

la en experiments genètics, i va suggerir que es podria utilitzar com a organisme model. Laibach va ser qui va establir que Arabidopsis té cinc cromosomes i va proposar que podria ser una bona planta model perquè es desenvolupa ràpid, per la seva facilitat de cultiu, el seu baix nombre de cromosomes i l’alta variació natural. L’any 1947 la seva estudiant Erna Reinholz va mostrar que era possible induir mutacions utilitzant raigs X i va crear la primera collecció de mutants induïts. En els anys cinquanta altres científics alemanys van adoptar Arabidopsis per als seus estudis, i al principi dels anys seixanta el seu ús es va estendre a Holanda, on es va utilitzar per a estudis de genètica bioquímica. La majoria dels estudis als anys seixanta que utilitzaven aquesta planta cercaven nous mutàgens químics. El 1963, alguns genetistes que treballaven amb Arabidopsis es van trobar al XI Congrés de Genètica que es va fer a la Haia i van establir el Servei d’Informació d’Arabidopsis (AIS, per la sigla en anglès), que va continuar actiu fins l’any 1990. La comunitat d’Arabidopsis començava a estar organitzada. El 1965 es va fer la primera Conferència Internacional d’Arabidopsis a Göttingen, Alemanya, amb vint-icinc participants, sobretot europeus. Durant els anys setanta l’interès per Arabidopsis va decréixer. Però al principi dels anys vuitanta, amb la nova metodologia molecular i el descobriment que A. tumefaciens podia transferir gens al genoma nuclear de plantes, Arabidopsis la van començar a adoptar com a organisme model els biòlegs de plantes que van veure les possibilitats d’utilitzar-la per estudiar temes que fins aquell moment no havien semblat abordables. La major part dels articles que utilitzen Arabidopsis publicats al principi dels anys vuitanta descriuen l’aïllament de mutants afectats en diferents processos. Per exemple, Maarten Koornneef va identi-

ficar una sèrie de mutants afectats en la resposta de les plantes a fitohormones i a llum. Aquests mutants demostraven la facilitat amb què diferents processos es podien alterar amb mutacions. Amb el desenvolupament de tècniques de clonatge de gens, aquestes col·leccions de mutants van permetre l’ús sistemàtic de la genètica i la biologia molecular per analitzar processos biològics fonamentals. Un dels articles més influents dels anys vuitanta feia una estimació de la mida del genoma d’Arabidopsis en només 70.000.000 bases de DNA nuclear, el més petit de les plantes superiors. Això va facilitar la construcció de genoteques o col·leccions de fragments de DNA que contenien representat tot el genoma, i que van incentivar molt l’ús d’aquesta planta en recerca. Les primeres seqüències de gens d’Arabidopsis es van publicar l’any 1986. A més, durant els anys vuitanta la possibilitat de transformar de manera molt eficient amb A. tumefaciens va donar lloc a les primeres col·leccions de mutants d’inserció de tDNA. El 1989 es va clonar el primer gen mutat a partir d’una d’aquestes línies de tDNA, la qual cosa va permetre determinar el gen causant del fenotip mutant de la línia. Aquests clonatges de gens al final dels anys vuitanta van ser clau per portar Arabidopsis a l’era molecular. Encara ara, la facilitat amb què es pot transformar la planta (ruixant d’A. tumefaciens les flors amb un esprai) facilita molt la caracterització gènica i explica per què és la planta model per als genetistes moleculars. A banda d’aquests avantatges tècnics, Arabidopsis també va demostrar que era molt útil per resoldre preguntes científiques complexes. Per exemple, al principi dels anys noranta es va desenvolupar el model combinatori ABC per explicar la morfogènesi de les flors a través de l’expressió de tres classes de gens (A, B i C) que determinen la identitat dels òrgans florals en sèpals, pètals, esTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

LA PLANTA MODEL Arabidopsis thaliana 83

tams i carpels (Weigel i Meyerowitz, 1994). En mutants en els quals falta una o més funcions A, B o C, la identitat dels òrgans està afectada, i en el cas extrem en què totes tres funcions estan mutades, tots els òrgans florals semblen fulles. El model es va basar en el clonatge de gens de patró floral a partir de mutants, en l’anàlisi del patró d’expressió, i en l’anàlisi de dobles i triples mutants, i va permetre entendre com cada funció A, B o C i la combinació d’AB o de BC en cada verticil de la flor determina el desenvolupament de l’òrgan floral corresponent. Aquest model simple i elegant explicava la morfogènesi floral, i el disseny i l’execució dels experiments demostrava que un procés tan complex de desenvolupament podia ser analitzat i entès en plantes. L’elegància d’aquests experiments va mobilitzar els biòlegs de plantes i va atraure molta gent a treballar amb Arabidopsis. Actualment, la Conferència Internacional d’Arabidopsis té lloc anualment amb més de mil participants d’arreu del món. Hi ha més de dotze mil científics d’Arabidopsis registrats a la pàgina web TAIR, i es publiquen més de 2.500 articles anualment en què es descriu recerca feta utilitzant Arabidopsis. A Catalunya hi ha uns vint grups treballant amb Arabidopsis, ubicats a la Universitat de Barcelona, a la Universitat Autònoma de Barcelona i al Departament de Genètica Molecular del Centre d’Investigació i Desenvolupament del CSIC. Actualment, la majoria d’aquests grups formen part del Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG), fruit d’una associació CSIC-IRTA-UAB-UB. Les primeres publicacions a Catalunya sobre Arabidopsis es van publicar al final dels anys vuitanta i al començament dels noranta, i diversos científics del CSIC van participar en la seqüenciació del genoma d’Arabidopsis, que va publicar en els anys 1999 i 2000 un equip internacional. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

EL GENOMA D’Arabidopsis: QUANTS GENS FAN UNA PLANTA? La comunitat internacional d’Arabidopsis va crear l’any 1996 el comitè AGI (de l’anglès Arabidopsis Genome Initiative), que es va encarregar de coordinar la seqüenciació del genoma per part de diferents equips dels Estats Units, d’Europa i del Japó. Per a la seqüenciació, es va escollir l’ecotip Columbia. La seqüència dels cromosomes 2 i 4 es va publicar l’any 1999, i la dels cromosomes 1, 3 i 5 es va publicar l’any 2000 (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). L’anàlisi de la seqüència d’Arabidopsis va incloure l’anotació de gens predits i l’assignació de categories funcionals, l’arquitectura dels cromosomes, la distribució de transposons, i la comparació amb genomes d’altres organismes, i ha permès de començar a entendre les bases genètiques de les diferències entre plantes i altres eucariotes. S’ha predit que el genoma d’Arabidopsis conté uns 28.000 gens, nombre similar a les estimacions en humans i més gran que els del cuc Caenorhabditis elegans (20.000) o la mosca Drosophila (14.000). Quant al nombre de proteïnes codificades, Arabidopsis sembla que en tindria entre 11.000 i 15.000 de diferents, nombre comparable a C. elegans, els humans o Drosophila. Aquests nombres suggereixen que aquest seria el mínim de proteïnes necessàries per tal que els organismes eucariotes multicel·lulars puguin desenvolupar-se i respondre al seu entorn. Arabidopsis és un organisme autotròfic que només necessita minerals, llum, aigua i aire per créixer. Per tant, una gran part del seu genoma codifica enzims implicats en processos metabòlics com la fotosíntesi, la respiració, el metabolisme intermediari, la captació de minerals i la síntesi de lípids, àcids grassos, aminoàcids, nucleòtids i cofactors. El conjunt de gens dedicats a

84 E. MONTE

aquests processos és similar al d’un altre organisme autotròfic: el cianobacteri Synechocistis. Però, mentre que Synechocistis generalment té un únic gen que codifica cada enzim, Arabidopsis normalment en té diversos i presenta un alt nivell de redundància. De fet, el genoma d’Arabidopsis conté un nombre de duplicacions gèniques gran (uns 6.000 gens, pràcticament la quarta part del seu genoma), que es pensa que pot conferir plasticitat al genoma i proporcionar-li noves funcions. En animals, el nombre de duplicacions gèniques no és tan elevat, i la plasticitat gènica sembla que està determinada per la presència de promotors alternatius o per la diferent maduració de l’RNA (tall i unió alternatiu), fenòmens menys freqüents en plantes. Al contrari que la majoria dels animals, les plantes no es mouen, es poden perpetuar indefinidament i sintetitzen tots els seus metabòlits. Com es determinen aquestes diferències a escala gènica? Gràcies a la seqüenciació del genoma d’Arabidopsis, s’han identificat nous receptors i components cel·lulars específics de plantes, i s’han descobert possibles noves vies metabòliques també específiques. Malgrat que moltes famílies de proteïnes són comunes a tots els eucariotes, s’ha vist que Arabidopsis en té unes 150 d’úniques, que inclouen factors de transcripció, proteïnes estructurals, enzims i moltes proteïnes de funció desconeguda. Curiosament, mentre que moltes de les proteïnes associades a la cromatina estan conservades entre els organismes eucariotes, un 85 % dels factors de transcripció d’Arabidopsis no té gens relacionats en altres genomes, la qual cosa reflecteix l’evolució independent i possibles funcions específiques dels factors de transcripció de plantes. Per contra, al voltant del 50 % de gens amb funcions en síntesi de proteïnes tenen equivalents en altres genomes eucariotes, cosa que reflecteix que les seves

funcions gèniques són més conservades. Quant a rutes de traducció de senyal, sembla que les vies de senyalització en resposta a patògens i a senyals ambientals són més abundants en Arabidopsis que en altres organismes, probablement per la importància que té per a la supervivència de les plantes la capacitat de percebre i respondre correctament al seu entorn, ja que no poden escapar-se de les condicions adverses. Finalment, la transferència d’un nombre relativament petit de gens de cianobacteris a partir d’un possible ancestre endosimbiòtic també ha afegit diversitat a les proteïnes que es troben en plantes, comparat amb les dels animals. ESTUDI DE LA FUNCIÓ DELS FITOCROMS, UN EXEMPLE DE L’ÈXIT D’Arabidopsis COM A ORGANISME MODEL Com veuen les plantes el que passa al seu entorn? La importància de la llum per a les plantes: la fotomorfogènesi Atès que són sèssils (és a dir, no poden moure’s) i necessiten fer fotosíntesi per sobreviure, la majoria de plantes han desenvolupat al llarg de l’evolució formes úniques de «veure» els canvis en el seu entorn lumínic per tal de respondre-hi adequadament i maximitzar la taxa de fotosíntesi (per exemple, evitant l’ombra) o iniciar les transicions de desenvolupament clau en el moment oportú (per exemple, la germinació o la inducció de la floració). Per a les plantes, la llum serveix, doncs, no solament com a font d’energia per fer la fotosíntesi, sinó també com a inductora i moduladora del seu desenvolupament (Schafer i Nagy, 2006). La importància de la llum en la regulació del creixement de les plantes s’ha documentat des de Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

LA PLANTA MODEL Arabidopsis thaliana 85

temps molt antics, amb unes primeres observacions de Teofrast d’Eresos (380287 aC), que es refereix als avets crescuts en l’ombra com de fusta pobra però bons per fer llargs pals de vaixell, mentre que els que creixen en llocs assolellats es poden utilitzar per fer pals curts més robustos. Sembla que allò que descrivia és l’efecte de l’ombra sobre el creixement de les plantes, ja que les que creixen en llocs ombrívols per la densitat de plantes veïnes s’allarguen per poder captar més llum solar. També Darwin, en un llibre escrit amb el seu fill Francis el 1880, detalla per primer cop els processos de desenvolupament que tenen lloc quan una plàntula etiolada (que ha germinat en foscor sota terra) emergeix a la superfície i entra en contacte amb la llum solar (vegeu la figura 2). Darwin també fa referència als moviments de les fulles o a la curvatura de les plantes cap a una font de llum lateral. Totes aquestes respostes reben el nom de fotomorfogènesi, que és la regulació del creixement amb els senyals de la llum, utilitzada no com a font d’energia sinó com a font d’informació. Els fotoreceptors fitocroms Les plantes «veuen» la llum solar utilitzant diversos fotoreceptors especialitzats en longituds d’ona específiques (Chen et al., 2004). Dels diferents fotoreceptors que tenen les plantes, els fitocroms són pigments que perceben llum de l’espectre vermell (V) (660 nm) i vermell llunyà (VL) (730 nm) de la llum solar. Els fitocroms tenen una funció crítica en la percepció de la quantitat, qualitat i periodicitat (durada del dia i la nit) de la llum en les plantes i passen aquesta informació a un gran nombre de vies de senyalització que regulen la fotomorfogènesi durant tota la vida de la Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

planta. Els fitocroms són reguladors de l’establiment de la plàntula (amb processos com la germinació de la llavor o la desetiolació, vegeu la figura 2), de la seva arquitectura (en la resposta a ombra, la regulació de l’àrea de la fulla i del nombre de branques, o el desenvolupament d’estomes), i de la reproducció (amb la inducció de la floració). El fitocrom existeix com a dímer, i cada monòmer és un polipèptid d’uns 125 kDa que té unit covalentment un cromòfor de bilina, que és l’antena que absorbeix la llum. Els fitocroms funcionen com un interruptor molecular que pot existir en dues conformacions: Pr i Pfr. Se sintetitzen en la foscor al citosol en la forma biològicament inactiva Pr, que pot absorbir llum V. L’activació biològica s’aconsegueix per l’absorció de llum V, que indueix la fotoconversió a la forma activa Pfr, que es transloca al nucli. Aquesta forma Pfr pot fotoconvertir-se de nou a Pr en absorbir llum VL, cosa que resulta en un fotoequilibri dinàmic entre Pr i Pfr en condicions de llum natural, que conté tant llum V com VL. El fitocrom canvia de «color» (és a dir, de propietats d’absorció) després d’absorbir llum. La forma Pr té un màxim d’absorció en llum V i té color blau turquesa, mentre que Pfr absorbeix preferentment llum VL i és de color verdós. Quants fitocroms té una planta i com funcionen? Algunes respostes (i preguntes) abans d’Arabidopsis El fitocrom es va descobrir al final de la dècada de 1940 mitjançant experiments fisiològics de l’efecte de la llum V i VL que es van fer en plantes com l’enciam, l’ordi, el bròquil, el pèsol, la soia o el nap. De la dècada de 1930 a la de 1950 es va descriure que les llavors d’enciam germinaven quan els donàvem llum V però no ho feien si

86 E. MONTE

la llum era VL. I si donàvem cicles de llum V i VL, la resposta depenia sempre de l’últim tractament de llum rebut. Aquests resultats suggerien que hi havia un fotoreceptor informacional que havia d’existir en dues formes, una amb un màxim d’acció

Figura 2. La desetiolació de la plàntula. Plàntules d’Arabidopsis quatre dies després de germinar. A l’esquerra, la plàntula ha crescut en foscor simulant les con dicions que es trobaria quan la germinació és sota terra, utilitzant les reserves de la llavor. Segueix un patró de desenvolupament etiolat, en què la plàntula creix de manera ràpida per arribar a la superfície gràcies al gran allargament de l’hipocòtil (tija embrionària), alhora que protegeix de dany mecànic el meristem apical (les cèl·lules indiferenciades que donaran lloc a tots els òrgans aeris) amb el ganxo tancat i els cotilèdons (fulles embrionàries) junts. A la dreta es mostra una plàntula crescuda en llum. En aquest cas segueix un patró de desenvolupament desetiolat o fotomorfogènic, amb hipocòtil curt, ganxo apical obert i cotilèdons separats. La plàntula acumula clorofil·la i és fotosintèticament activa.

en llum V i una altra en llum VL. Si eren dos pigments amb funcions antagòniques o un únic pigment fotoreversible entre V i VL, no es va poder resoldre fins a l’any 1959, quan W. L. Butler va purificar de plàntules de civada crescudes en foscor un pigment fotoreversible que va rebre el nom de fitocrom, per la seva característica de fotocromicitat. Ja que la majoria de respostes estudiades, com la germinació de llavors d’enciam, s’indueixen amb llum V i es reprimeixen amb llum VL, la forma Pfr es considera la forma biològicament activa, mentre que la forma Pr és la forma inactiva. Aquestes respostes reversibles per llum V i VL inclouen la germinació, la floració, el moviment de les fulles entre dia i nit o la tuberització en la patata, i són una indicació que el fitocrom és el fotoreceptor que percep la llum i mitjança en la resposta. Aquesta acció reversible dels fitocroms requereix una baixa intensitat de llum i es coneix com a LFR, de l’anglès low fluence response. Els fitocroms també estan implicats en dues respostes més: respostes d’alta irradiància (o HIR, de l’anglès high irradiance responses) amb intensitats de llum VL o V altes i temps d’irradiació prolongat, i respostes de molt baixa fluència (o VLFR, de l’anglès very low fluence response), en les quals uns pocs fotons, fins i tot uns segons de llum de les estrelles, són suficients per induir respostes. En resum, els experiments fisiològics i bioquímics van demostrar diferents funcions dels fitocroms en múltiples processos biològics, així com tres modes d’acció diferents, i també van demostrar que com a mínim hi havia dos tipus de fitocrom, un de làbil i un altre d’estable en llum. Malgrat tots aquests avenços, no va ser fins al començament de l’era molecular i l’ús de mutants d’Arabidopsis quan es van començar a resoldre moltes de les qüestions sobre els diferents tipus de fitocrom, les respostes de creixeTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

LA PLANTA MODEL Arabidopsis thaliana 87

ment que regulen, i la base molecular de la seva funció. L’entrada en l’era molecular amb Arabidopsis: clonatge de cinc gens de fitocrom i estudis de funció amb mutants L’evidència que hi havia diferents tipus de fitocrom en una mateixa espècie es va confirmar al final dels anys vuitanta i al començament dels noranta amb el clonatge i la seqüenciació de cinc gens d’Arabidopsis: FITA, FITB, FITC, FITD i FITE. Els estudis de detecció de proteïna amb anticossos específics per a cada fitocrom han determinat que tots estan presents en foscor en plàntules etiolades, però que el fitocrom A (fitA) és el més abundant en aquestes condicions. En irradiar aquestes plàntules amb llum, fitA es degrada molt ràpidament, mentre que fitB-fitE es degraden en menys mesura i romanen a nivells detectables. FitA correspon al que s’havia denominat fitocrom de tipus I, mentre que els fitocroms de tipus II engloben fitB-fitE. Per tal d’esbrinar la funció de cada membre de la família, va ser cabdal la identificació de mutants nuls en cadascun dels cinc fitocroms (Franklin i Quail, 2010). Els primers mutants deficients en fitocrom van ser una sèrie de mutants nuls d’Arabidopsis originàriament identificats mutagenitzant llavors d’Arabidopsis i fent-les créixer en llum contínua. La longitud de l’hipocòtil en aquestes condicions és un indicador de la capacitat de percebre i respondre a la llum: les plantes hiposensibles o cegues a la llum (a conseqüència de la disminució en la percepció) creixeran amb l’hipocòtil allargat com si ho fessin en foscor (vegeu la figura 3). Es van identificar entre aquests mutants plàntules amb hipocòtils llargs, anomenats mutants hy, i es va veure que hy3 és un mutant defiTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

cient en fitB, amb nivells molt reduïts de la proteïna fitB i mutacions en la seqüència del gen FITB. De manera semblant es van aïllar mutants deficients per als altres fitocroms, i l’estudi detallat ha aclarit que les respostes VLFR i HIR també resulten de la funció dels fitocroms i no d’altres fotoreceptors, i ha establert que els diversos fitocroms tenen funcions específiques: el fitocrom de tipus I fitA és el responsable de VLFR i de l’HIR en VL, mentre que les respostes fotoreversibles estan mitjançades pels fitocroms de tipus II fitB-fitE. Aquests estudis també han determinat que els cinc fitocroms d’Arabidopsis tenen funcions fotosensores o fisiològiques diferencials en diferents fases del cicle vital, però que a vegades s’encavalquen parcialment, i poden fins i tot ser antagòniques. Per entendre millor les relacions funcionals entre els diferents fitocroms, s’han generat mutants deficients en diverses combinacions de fitocroms. D’aquesta manera s’ha pogut establir que, en algunes respostes, diferents fitocroms actuen de manera additiva o parcialment redundant. Recentment s’ha descrit el mutant d’Arabidopsis deficient en tots cinc fitocroms, generat a partir dels mutants individuals (Strasser et al., 2010). Aquest quíntuple mutant deficient en fitAfitE sobreviu en llum blanca (on hi ha altres fotoreceptors informacionals actius, com per exemple els de llum blava), però no sobreviu en llum V, en què els únics fotoreceptors actius són els fitocroms. Aquest quíntuple mutant ha permès, doncs, separar la funció de la llum com a senyal informatiu de la seva funció com a font d’energia, i el fet que no sigui capaç de sobreviure en llum V (llum que permet activar la fotosíntesi) demostra que els senyals fotomorfogènics són necessaris per a la supervivència de la planta. El clonatge dels gens de fitocrom en Arabidopsis combinat amb tècniques de genèti-

88 E. MONTE

ca molecular també ha permès avançar en l’estudi de la base molecular de l’acció dels fitocroms. Diversos estudis de localització in vivo de fusions del fitocrom amb la proteïna verda fluorescent GFP (de l’anglès green fluorescent protein) expressada en plantes transgèniques d’Arabidopsis han determinat que tots cinc fitocroms es localitzen al citosol en la forma inactiva Pr, i que l’activació per fotoconversió a forma Pfr indueix la translocació al nucli. Com funciona el fitocrom actiu un cop és al nucli?

Figura 3. El fitocrom B és el fotoreceptor més important de llum vermella. Plàntules d’Arabidopsis crescudes sota llum vermella constant (670 nm) quatre dies després de germinar. A l’esquerra es mostra una plàntula silvestre (C) que segueix un patró desetiolat. A la dreta, un mutant deficient en fitocrom B (fitB) que és cec a la llum vermella i, per tant, creix allargat com si ho fes en foscor (compareu-ho amb la figura 2).

Els fitocroms regulen canvis d’expressió gènica en resposta a llum La percepció de canvis de llum en l’entorn de la planta per part dels fitocroms s’ha vist que inicia canvis ràpids en l’expressió gènica de gens diana. Aquests canvis d’expressió de gens regulats per llum són els responsables de dirigir les modificacions apropiades en el creixement i desenvolupament de la planta, que culminen amb l’adaptació al seu nou ambient lumínic. Per exemple, en la transició entre etiolació i desetiolació de la plàntula en la inducció de la fotomorfogènesi, els fitocroms indueixen l’expressió de gens relacionats amb la biogènesi del cloroplast i la fotosíntesi, com poden ser els gens implicats en l’acumulació de clorofil·les. Per tal d’identificar la xarxa transcripcional i de senyalització regulada per la família de fitocroms, s’ha combinat la disponibilitat de mutants d’Arabidopsis amb eines com els microxips de DNA, on es troben representats 22.000 gens d’Arabidopsis. Gràcies als microxips, s’ha pogut demostrar que la llum indueix canvis profunds en l’expressió dels gens en Arabidopsis (Lorrain et al., 2006). En el cas més extrem, s’han comparat plàntules crescudes en foscor amb plàntules crescudes en llum, i s’han vist diferències de gran escala que reflecteixen les diferències morfològiques i metabòliques entre plàntules crescudes en llum i foscor (vegeu la figura 2). També s’han avaluat els efectes de la llum a curt termini tot transferint a llum V plàntules prèviament crescudes en foscor. Després d’una hora en llum V, aproximadament el 10 % dels transcrits d’Arabidopsis modifiquen els seus nivells. Comparant el perfil transcriptòmic de plàntules silvestres control amb el de mutants deficients en fitocrom, s’ha vist que aquests canvis transcripcionals ràpids en llum V estan mitjançats pels fitocroms Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

LA PLANTA MODEL Arabidopsis thaliana 89

majoritaris fitA i fitB. Entre els gens afectats, un percentatge molt elevat correspon a factors de transcripció, fet que suggereix que després de l’activació dels fitocroms s’inicia una cascada transcripcional que orquestra l’inici de la fotomorfogènesi. Aquests experiments demostren que els fitocroms actius regulen l’expressió gènica, i encara que el mecanisme no és clar, sembla que no ho fan de manera directa actuant ells mateixos com a reguladors de la transcripció. Quin pot ser, doncs, el mecanisme?

acompanyada de la fosforilació dels PIF. El fet que els PIF s’acumulin en foscor va fer pensar que potser també tenien una funció en absència de llum. Efectivament, si bé els mutants simples deficients en PIF individuals només tenen un fenotip subtil en foscor, mutants quàdruples d’Arabidopsis deficients en quatre PIF (PIF1, PIF3, PIF4 i PIF5) tenen un fenotip marcat: es desenvolupen en foscor com si creixessin en llum (vegeu la figura 4) (Leivar et al., 2008). Aquests resultats indiquen que la planta té una sèrie de factors de transcripció ―els

Els PIF, factors de transcripció que interaccionen amb el fitocrom actiu Mitjançant la recerca d’interactors del fitocrom per la tècnica del doble híbrid en llevat, es va identificar PIF3 (de l’anglès phytochrome interacting factor 3). PIF3 interacciona específicament amb la forma activa Pfr dels fitocroms, i és un factor de transcripció de la família de les bHLH (de l’anglès basic helix-loop-helix). La família de les proteïnes bHLH està formada per més de cent vuitanta membres en Arabidopsis, i PIF3 forma part d’una subfamília de quinze proteïnes que conté d’altres PIF, com PIF1, PIF4, PIF5 o PIF7, les quals també poden interactuar específicament amb el fitocrom actiu (Bae i Choi, 2008). L’estudi de mutants d’Arabidopsis deficients en PIF3 i altres PIF n’ha permès determinar la funció. D’una banda, s’ha vist que els PIF són reguladors negatius de la senyalització de fitB en llum V, ja que els mutants són hipersensibles a llum V (amb hipocòtils més curts que els controls), a l’inrevés que els mutants deficients en fitB. D’altra banda, els estudis d’estabilitat de proteïna han determinat que PIF3 i altres PIF s’acumulen en foscor i es degraden ràpidament en llum. Aquesta degradació depèn de la interacció amb els fitocroms actius i està Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

Figura 4. Els factors de transcripció PIF reprimeixen la fotomorfogènesi en foscor. Plàntules d’Arabidopsis crescudes en foscor quatre dies després de germinar. A l’esquerra es mostra una plàntula silvestre (c) que segueix un patró de creixement etiolat amb l’hipocòtil molt allargat i la regió apical tancada. A la dreta es mostra el quàdruple mutant deficient en 4 PIF (PIF1, 3, 4 i 5) (pifq), que es desenvolupa en foscor com si ho fes en llum, amb l’hipocòtil curt i els cotilèdons separats (compareu-ho amb la figura 2).

90 E. MONTE

PIF― que, de manera conjunta, s’encarreguen de reprimir la fotomorfogènesi en foscor, evitant que la plàntula comenci a desenvolupar-se sota terra, cosa que en provocaria la mort. Els PIF, per tant, asseguren la supervivència de la plàntula després de la germinació en foscor, però també regulen l’inici de la fotomorfogènesi. En efecte, quan la plàntula emergeix a la superfície, la llum solar activa els fitocroms, per fotoconversió de forma Pr a forma Pfr, que es transloca al nucli i hi interactua amb els PIF. Aquesta interacció indueix la degradació ràpida dels PIF, cosa que permet a la plàntula desfer-se dels repressors de fotomorfogènesi i fer una transició ràpida entre etiolació i desetiolació. S’inicia així la fotomorfogènesi per adaptar-se amb èxit a les noves condicions lumíniques. Recentment, i també mitjançant la combinació de mutants d’Arabidopsis amb microxips, s’ha vist que els factors de transcripció PIF regulen l’expressió gènica en foscor. S’ha vist que el perfil d’expressió gènica en foscor del quàdruple mutant deficient en PIF se superposa amb el de plantes silvestres crescudes en llum, la qual cosa es correlaciona amb el fenotip morfològic del mutant, que creix en foscor com si creixés en llum (vegeu la figura 4). Així doncs, un possible mecanisme d’acció dels fitocroms com a reguladors de l’expressió gènica en llum seria mitjançant la interacció i degradació dels PIF, revertint la regulació gènica exercida pels PIF en foscor i iniciant, per tant, la fotomorfogènesi. CONCLUSIONS I PERSPECTIVES DE FUTUR La planta model Arabidopsis thaliana ha contribuït de manera molt important a l’avanç del camp de la biologia de plantes en els últims trenta anys. La disponibilitat

d’eines i recursos han estimulat molt la recerca, i la seqüenciació del seu genoma l’any 2000 va representar un gran pas endavant i va establir les bases per a la caracterització funcional de tots els gens d’una planta. Un dels reptes actuals i de futur és precisament entendre la funció de cadascun dels aproximadament 28.000 gens d’Arabidopsis. En els propers anys, Arabidopsis continuarà tenint molta importància com a model biològic per aprofundir en el coneixement bàsic de molts aspectes de la biologia de plantes. El desenvolupament de noves eines permetrà abordar noves preguntes, com per exemple els microxips de proteïnes, que permetran fer estudis globals a escala posttranscripcional. Encara que hi ha aspectes particulars en cada espècie, Arabidopsis està considerada un model biològic excel·lent, ja que està íntimament relacionada amb centenars de milers d’espècies de plantes a causa de la recent expansió de les angiospermes a partir d’un ancestre comú. S’espera, doncs, que tot aquest coneixement que s’està adquirint gràcies a Arabidopsis facilitarà l’estudi d’altres espècies, incloent-hi les d’interès agronòmic. De fet, ja s’està avançant molt en l’estudi de plantes com l’arròs, el tomàquet, la vinya o el meló, moltes ara també amb els seus genomes seqüenciats i per a les quals s’estan generant col·leccions d’eines de recerca genòmica importants. AGRAÏMENTS Voldríem donar gràcies a Maria Sentandreu, per les fotografies que acompanyen el text, al Ministeri de Ciència i Innovació (BIO2009-07675) i a la Generalitat de Catalunya (Xarxa de Recerca en Biotecnologia, 2009 SGR 206) pel finançament del laboratori.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

LA PLANTA MODEL Arabidopsis thaliana 91

BIBLIOGRAFIA Bae, G.; Choi, G. (2008). «Decoding of light signals by plant phytochromes and their interacting proteins». Annu. Rev. Plant Biol., 59: 281-311. Chen, M.; Chory, J.; Fankhauser, C. (2004). «Light signal transduction in higher plants». Annu. Rev. Genet., 38: 87-117. Franklin, K. A.; Quail, P. H. (2010). «Phytochrome functions in Arabidopsis development». J. Exp. Bot., 61: 11-24. Leivar, P.; Monte, E.; Oka, Y.; Liu, T.; Carle, C.; Castillon, A.; Huq, E.; Quail, P. H. (2008). «Multiple phytochrome-interacting bHLH transcription factors repress premature seedling photomorphogenesis in darkness». Curr. Biol., 18: 1815-1823.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 79-91

Lorrain, S.; Genoud, T.; Fankhauser, C. (2006). «Let there be light in the nucleus!» Curr. Opin. Plant Biol., 9: 509-514. Schafer, E.; Nagy, F. (2006). Photomorphogenesis in plants and bacteria. 3a. ed. Països Baixos: Springer. Somerville, C.; Koornneef, M. (2002). «A fortunate choice: the history of Arabidopsis as a model plant». Nat. Rev. Genet., 3: 883-889. Strasser, B.; Sánchez-Lamas, M.; Yanovsky, M. J.; Casal, J. J.; Cerdán, P. D. (2010). «Arabidopsis thaliana life without phytochromes». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 4776-4781. The Arabidopsis Genome Initiative (2000). «Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana». Nature, 408: 796-815. Weigel, D.; Meyerowitz, E. M. (1994). «The ABCs of floral homeotic genes». Cell, 78: 203-209.

DOI: 10.2436/20.1501.02.106

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 93-106

LA REGENERACIÓ I L’HOMEÒSTASI EN LES PLANÀRIES, UN MODEL CLÀSSIC DE BIOLOGIA DEL DESENVOLUPAMENT Francesc Cebrià, 1 Teresa Adell, 1 Josep Francesc Abril i Emili Saló Departament de Genètica, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona Adreça per a la correspondència: Emili Saló. Departament de Genètica, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Tel.: 934 035 977. Adreça electrònica: esalo@ub.edu. RESUM La regeneració és la capacitat d’un organisme de reemplaçar fragments perduts a causa d’una amputació traumàtica o degeneració. La regeneració de les noves estructures té lloc bé a partir de proliferació cel·lular i formació de novo, bé per remodelació dels teixits preexistents. Les planàries poden regenerar un nou organisme sencer a partir de petits fragments del seu cos. Aquest fet ha atret l’interès dels científics al llarg de la història. El 1814, Dalyell conclou que les planàries «es poden considerar immortals sota la fulla d’una na valla». La regeneració en les planàries requereix la generació de teixit nou en el lloc de la ferida mitjançant proliferació cel·lular, que produeix un teixit nou indiferenciat, el blastema, i el remodelatge dels teixits preexistents per recuperar les proporcions del nou organisme regenerat. Una altra propietat espectacular de les planàries és la capacitat de créixer i decréixer segons la ingesta d’aliment. En tot moment, però, al llarg d’aquest creixement/decreixement es mantenen les proporcions corporals i funcions correctes, gràcies al control homeostàtic. Tota aquesta plasticitat és deguda, a escala cel·lular, a la presència de cèl·lules mare totipotents en un alt percentatge (entre el 20-30 % del total cel·lular en un organisme adult). Una altra propietat fonamental és la contínua activitat dels mecanismes morfogenètics, que normalment apareixen una sola vegada en el desenvolupament de la resta dels altres organismes. L’aplicació de noves metodologies a escala cellular, molecular i genètica en l’era postgenòmica ens ha permès estudiar funcionalment vies i gens del desenvolupament en un nou escenari, la regeneració de planàries. Paraules clau: planària, regeneració, homeòstasi, cèl·lula mare, formació del patró.

1

Aquests autors han contribuït de la mateixa manera en aquest treball.

Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

94 F. CEBRIÀ, T. ADELL, J. F. ABRIL I E. SALÓ

PLANARIAN REGENERATION AND HOMEOSTASIS, A CLASSIC DEVELOPMENTAL BIOLOGY MODEL SUMMARY Regeneration is the ability of the fully developed organism to replace fragments lost by traumatic amputation or degeneration. Regeneration of the new structures is achieved either by cell proliferation and de novo formation, or by remodelling of the pre-existing tissues. Planarians, which can regenerate a whole new organism from a small piece of their body, have attracted the interest of scientists throughout history. In 1814, Dalyell concluded that planarians could “almost be called immortal under the edge of the knife”. Planarian regeneration involves the generation of new tissue at the wound site via cell proliferation, producing a new undifferentiated tissue or blastema, and the remodelling of pre-existing tissues to restore proportions. Another astonishing property of planarians is their capacity to grow and shrink depending on food availability and temperature. Remarkably, during the whole growth/degrowth process planarians keep normal body proportions and functions, thanks to a homeostatic control. All that plasticity is based, at the cellular level, upon the presence of totipotent stem cells in a high proportion (20-30% of total cell number in an adult organism). Another basic property is the continuous activity of the morphogenetic mechanisms that usually appear only once during the development of other model systems. The application of new methodologies at the cellular, molecular and genetic level in the postgenomics era allows us to functionally analyse the universal developmental pathways and genes in a new scenario, planarian regeneration. Key words: planarian, regeneration, homeostasis, stem cell, pattern formation. INTRODUCCIÓ La planària és un organisme simple però tan plàstic que es pot considerar un adult amb característiques embrionàries, molt accessible a l’estudi de fenòmens de determinació i manteniment del patró, control de cèl·lules mare, homeòstasi i formació d’òrgans. Tots aquests processos són presents en el desenvolupament de tots els organismes i estan molt conservats en el món animal. Si tenim un accident i perdem qualsevol part de les nostres extremitats no la podrem recuperar. En canvi, una planària es pot trossejar en centenars de petits fragments i en dues setmanes regeneraran centenars d’organismes sencers, ben proporcionats i totalment funcionals. Quines

són les diferències entre nosaltres i elles? Per què hi ha organismes amb una gran capacitat d’autoregenerar-se, mentre que altres no en tenen? La planària és un dels organismes amb una capacitat més alta de regeneració. Certament, ja que els fragments regenerats poden créixer de nou i produeixen organismes de la mateixa mida que la inicial, però més joves, ja que han estat reconstituïts per noves cèl·lules. Quines són les característiques que permeten regenerar tan eficientment les planàries? Un dels punts clau és l’existència en l’organisme adult d’una població de cèl·lules mare pluripotents, anomenades neoblasts, que proliferen contínuament i es diferencien en tots els tipus cel·lulars de l’organisme. Alhora, aquest organisme presenta Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

REGENERACIÓ I HOMEÒSTASI EN PLANÀRIES 95

una plasticitat morfològica impressionant; atès que hi ha un recanvi cel·lular constant, no té una mida fixa, i depenent de la ingesta d’aliment va modificant la seva grandària mantenint sempre la seva forma i funcionalitat. Això requereix mecanismes de manteniment del patró i de les proporcions que estiguin contínuament activats. Aquesta propietat és exclusiva de les planàries en tot el món animal i, per tant, l’estudi de la regeneració en les planàries representa una oportunitat única per a l’estudi de l’homeòstasi i la regeneració. Per contra, altres models biològics considerats clàssics en el camp del desenvolupament, com ara Drosophila, Caenorhabditis elegans, amfibis, el peix zebra, el pollet i el ratolí, presenten un model de desenvolupament canònic i terminal; és a dir, l’organisme es desenvolupa una sola vegada, en arribar a la fase adulta presenta tots els seus òrgans formats i és incapaç de repetir qualsevol procés de desenvolupament o regeneració total, tot i que algun d’aquests, com els amfibis, poden regenerar parts del cos com les extremitats, la mandíbula, la lent i la retina de l’ull. D’altra banda, el peix zebra pot regenerar els extrems de les aletes i la part distal del cor. Pel que fa als mamífers, la possibilitat de regenerar es limita a ossos fracturats, el fetge parcialment seccionat o estructures molt especialitzades, com és el cas del recanvi anual de les banyes dels cérvols mascles. Aquesta gran diversitat en la capacitat regenerativa, independent de la complexitat dels organismes, obre grans qüestions com ara: quins són els elements clau que permeten que hi hagi organismes capaços de regenerar-se i altres no? Com i què inicia el procés de regeneració? Quin és l’origen de les cèl·lules regeneratives? Com s’estableix el patró a les regions regenerades i com s’ajusta el teixit antic a les noves proporcions per restituir un nou organisme funcional? Són els mateixos mecaTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

nismes geneticomoleculars del desenvolupament actuant en un nou entorn? És possible reactivar aquests processos en organismes que no presenten capacitat regenerativa de manera natural i assolir així els reptes plantejats en l’anomenada medicina regenerativa? La quantitat de preguntes que es plantegen al voltant d’aquest tema és immens i el potencial de les respostes per a futures aplicacions mostra que la regeneració de les planàries permet afrontar reptes biològics no accessibles en altres models menys plàstics. Per intentar entendre el procés de regeneració, en el Departament de Genètica de la Universitat de Barcelona fa prop de quaranta anys es va iniciar una línia de recerca adreçada a l’estudi de la regeneració de les planàries. Actualment, dintre del que s’anomena l’era postgenòmica, les noves metodologies de la biologia molecular i de la nanotecnologia ens permeten rastrejar el genoma, transcriptoma i proteoma de les planàries en diverses condicions genètiques. Això ha permès caracteritzar funcionalment gens i vies del desenvolupament durant la regeneració d’aquests animals. EL MODEL Les planàries són cucs plans de vida lliure que representen un subgrup dels platihelmints. Encara que n’hi ha d’adaptats a la vida terrestre i marina, els del nostre estudi són d’aigües dolces. Les planàries són organismes tous, sense teixit esquelètic i aplanats dorsoventralment, no presenten sistema circulatori i l’oxigen dels teixits s’obté per difusió de l’exterior. Presenten una clara cefalització, amb un cervell anterior i, normalment, un parell d’ulls (vegeu la figura 1). El sistema digestiu consisteix en una faringe, en una posició central en l’animal, que connecta amb un intestí cec

96 F. CEBRIÀ, T. ADELL, J. F. ABRIL I E. SALÓ

sense anus i altament ramificat (vegeu la figura 1a). Entre el sistema digestiu i l’epidermis apareix un teixit parenquimàtic desorganitzat on es troben diferents tipus cel·lulars diferenciats i un d’indiferenciat, els neoblasts, els quals representen el 2030 % de les cèl·lules totals d’un organisme adult. Els neoblasts són els únics tipus cellulars amb capacitat proliferativa i de diferenciar-se en tots els tipus cel·lulars de la planària adulta, incloent-hi la línia germinal (Saló, 2006; Handberg-Thorsager et al., 2008). Les dades de filogènia molecular els situen dins dels lofotrocozous, estretament emparentats amb els anèl·lids i mol·luscs, grup germà dels ecdisozous, i conjuntament defineixen el grup de protostomats. En algunes espècies s’han desenvolupat estratègies de reproducció asexual per escissió, i es produeixen organismes clònics a partir de cues autoseccionades per estirament de l’organisme adult mateix. La regeneració posterior produeix planàries completes que ràpidament creixen i es tornen a dividir. D’aquesta manera, en el laboratori hem pogut establir línies clonals de milers d’organismes, generades a partir d’un únic individu, a força de facilitar-ne el creixement al màxim subministrant aliment de manera regular (fragments de fetge de vedella orgànica). La regeneració de les planàries Després de l’amputació d’un organisme adult, la primera reacció és la cicatrització. Aquesta té lloc gràcies a la contracció immediata dels músculs de la zona de la ferida, que permeten el contacte entre l’epidermis antiga dorsal i ventral, de manera que en els primers 15 min la ferida ja està recoberta per una fina capa de cèl·lules epidèrmiques totalment estirades provinents de l’epidermis més propera (vegeu la figura

2). Es considera que aquesta interacció epiteli-mesènquima que es produeix durant la cicatrització podria ser la iniciadora de la resposta regenerativa. De fet, les concentracions elevades de magnesi en el medi, que inhibeixen la contracció muscular, impossibiliten la cicatrització i també la regeneració. Un cop cicatritzada la ferida, s’inicia una ràpida i elevada resposta mitòtica dels neoblasts, especialment els situats propers a la zona de la ferida (uns 500 µm), en l’anomenat postblastema (Saló i Baguñà, 1984). No s’han observat processos de desdiferenciació, de manera que la producció de teixit nou inicialment indiferenciat i conseqüentment despigmentat de regeneració, anomenat blastema (vegeu la figura 2), es produeix exclusivament per l’aportació local dels nous neoblasts que proliferen en el postblastema. Els neoblasts situats lluny de la ferida, tot i que mostren un increment de l’activitat mitòtica, no participen en el creixement del blastema. Si la regió per regenerar és el cap, el blastema es diferencia en la regió distal perduda; en aquest cas es diferencien els ganglis cefàlics i aquests indueixen la diferenciació dels ulls i altres sensors del cap (vegeu la figura 2). Paral·lelament, la resta de l’organisme s’ajusta a les noves proporcions i hi ha un seguit de fenòmens de mort cel·lular, autofàgia (González-Estévez et al., 2007) i remodelació dels teixits preexistents, que permetran reajustar l’organisme a les noves proporcions axials. Les noves tecnologies aplicades a la planària L’aplicació de noves tecnologies a la planària en la darrera dècada ha obert noves perspectives en l’estudi de la regeneració. Les hibridacions in situ permeten visualitzar l’expressió, en l’espai i temps, de gens Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

REGENERACIÓ I HOMEÒSTASI EN PLANÀRIES 97

relacionats amb la regeneració. D’altra banda, l’accessibilitat de la genètica inversa en la planària per interferència de RNA (iRNA), mitjançant alimentació o injecció de RNA de doble cadena, ens permet interferir en l’expressió gènica i generar per primer cop fenotips mutants (Pineda et al., 2000). Finalment, la producció d’organismes transgènics per electroporació ens ha permès produir els primers organismes transgènics en l’espècie Girardia tigrina (González-Estévez et al., 2003), completant així el ventall de modificacions genètiques bàsiques per a l’estudi de qualsevol procés biològic a escala cel·lular, molecular i genètica. En els darrers anys, gràcies al treball del Centre de Seqüenciació Genòmica de la Universitat de Washington, a Saint Louis (EUA), hi ha accessibles més de catorze milions de traces de la seqüència genòmica de l’espècie objecte del nostre estudi, Schmidtea mediterranea. En aquests moments els primers esborranys del genoma de la planària ja han estat assemblats, malgrat que, a causa de les propietats intrínseques a escala de seqüència d’aquesta espècie, bàsicament el baix contingut de guanina-citosina i les característiques de les seqüències repetitives, aquests assemblatges estan força fragmentats. Per exemple, la versió 3.1 està formada per uns 90.000 còntigs, o per 45.000 còntigs si es te-

nen en compte un conjunt recent de traces aparellades (paired-end reads) (Robb et al., 2008). Aquest coneixement genòmic, però, juntament amb la informació existent de més de 10.000 unigenes (obtinguts per l’NCBI a partir de la clusterització d’un conjunt de 75.000 seqüències d’EST) i un projecte recentment dut a terme pel nostre laboratori per obtenir el transcriptoma (basat en les noves tecnologies de la piroseqüenciació 454) (Abril et al., 2010), permet afrontar la recerca de gens del desenvolu-

Figura 1. Planària d’aigua dolça Schmidtea mediterranea. a) Imatge de camp clar d’una planària lliscant al fons d’una càpsula de Petri. A la part anterior s’observen les taques oculars o ulls. A la part central, la faringe (f). b) Immunotinció contra la sinapsina (3C11), que ens permet observar els dos ganglis cefàlics (gc) connectats amb dos cordons nerviosos ventrals (cn). Barra: 1 mm.

Figura 2. Regeneració cefàlica del mateix organisme de la figura 1 en diversos temps. El blastema és el teixit no pigmentat. Els nombres fan referència a dies després de la decapitació. Després del tall (0) hi ha una contracció muscu lar i cicatrització, seguida d’una ràpida resposta mitòtica dels neoblasts propers a la ferida (1). Posteriorment, el nou teixit inicialment indiferenciat, i per tant despigmentat, va creixent (3). Tot seguit, s’inicia la diferenciació amb l’apari ció de la pigmentació de l’epidermis i la diferenciació de les taques oculars (5-10). Finalment, l’organisme modifica el teixit antic per tal d’ajustar-se a les noves proporcions (14). Barra: 1 mm. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

98 F. CEBRIÀ, T. ADELL, J. F. ABRIL I E. SALÓ

pament in silico. Aquesta cerca computacional es basa en la similitud de les seqüències dels gens del desenvolupament, ja que aquests es troben altament conservats en tota l’escala filogenètica animal. Les anàlisis preliminars dels resultats a escala d’expressió, obtinguts a partir de microxips de DNA amb sondes per a oligonucleòtids específics de planària que es van hibridar amb el transcriptoma de regenerants anteriors i regenerants posteriors, també ens ha permès localitzar gens candidats de les vies de senyalització en la formació de les estructures relacionades amb els ulls. D’altra banda, hem produït un conjunt de bases de dades de pèptids traduïts a partir de les seqüències dels còntigs de l’assemblatge i dels EST, per tal de facilitar la detecció i selecció de noves seqüències funcionals a escala de proteòmica (Fernandez-Taboada et al., 2011). Finalment, en disposar d’un catàleg més acurat dels transcrits de planària, s’han iniciat estudis d’expressió a escala de tot el transcriptoma, mitjançant anàlisis comparatives entre biblioteques DGE (digital gene expression) específiques de diferents tipus de mostres, com per exemple neoblasts i cèl·lules diferenciades. Aquesta plètora de noves metodologies moleculars i tecnologies de seqüenciació massiva ens permet explorar les oportunitats biològiques d’aquest sistema únic per a estudis de regeneració, manteniment del patró, homeòstasi i, especialment, el control de les cèllules mare en qualsevol circumstància biològica. RESULTATS Anem a veure alguns dels temes actuals de més interès que presenta la regeneració de les planàries i la seva possible repercussió en el coneixement de mecanismes moleculars comuns amb altres espècies.

Els neoblasts, les cèl·lules mare totipotents de planària En planàries intactes els neoblasts mostren un nivell proliferatiu basal per mantenir el recanvi cel·lular de tots els tipus cellulars diferenciats. Durant la regeneració, aquestes cèl·lules incrementen la taxa proliferativa per tal de produir el nou teixit de regeneració, o blastema, i permetre així la remodelació dels fragments regenerats a les noves proporcions. El coneixement dels mecanismes cel·lulars que controlen els fluxos de diferenciació i alhora permeten el manteniment d’un estoc estable de cèl·lules indiferenciades, així com el control proliferatiu per evitar la producció de tumors, o bé els diferents fluxos de diferenciació envers els diferents tipus cel·lulars per mantenir l’homeòstasi d’organismes que canvien contínuament de mida i de proporcions de tipus cel·lulars diferenciats, són algunes de les qüestions d’especial interès per la seva repercussió en altres models, com les cèl·lules mare de vertebrats. La comprensió del funcionament i la regulació dels neoblasts requereix un coneixement previ dels elements genètics específics que hi participen. En aquest sentit hem desenvolupat una estratègia de proteòmica de neoblasts. Aquesta consisteix a obtenir el proteoma d’organismes normals i confrontar-lo amb un segon proteoma provinent d’organismes que han perdut la població de neoblasts gràcies a la irradiació amb raigs X. Com que els neoblasts són l’únic tipus cellular proliferatiu, la irradiació ionitzant provoca delecions i duplicacions en el seu genoma, cosa que fa que les cèl·lules esdevinguin inviables i acabin morint. L’estudi del proteoma de les dues poblacions proteiques i la comparació dels perfils peptídics amb els perfils calculats in silico sobre una base de dades de proteïnes traduïdes a partir de les diferents anotacions gèniques Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

REGENERACIÓ I HOMEÒSTASI EN PLANÀRIES 99

sobre el genoma de planària, ens ha permès caracteritzar proteïnes relacionades amb la proliferació cel·lular, reparació del DNA, proteïnes d’estrès cel·lular com les HSP (proteïnes de xoc tèrmic) i proteïnes de la biosíntesi de RNA (Fernandez-Taboada et al., 2010, 2011), així com unes 6.000 seqüències candidates més que cal validar (treball en curs). En el nostre estudi, a més, l’aproximació proteòmica permet descartar l’excés de transcrits silenciats que s’acumulen en uns orgànuls cel·lulars, anomenats cossos cromatoides, que són específics dels neoblasts. El manteniment i la reformació del patró Un altre dels temes clau per resoldre en regeneració és entendre com es manté el patró axial, tant anteroposterior (AP) com dorsoventral (DV), així com l’establiment de la comunicació entre eixos per tal de regenerar un organisme totalment proporcionat. Sabem que qualsevol fragment de planària tallat transversalment, longitudinalment o diagonalment regenerarà un nou cap a l’extrem anterior i la cua al posterior, i recuperarà molt ràpidament la simetria bilateral. Per entendre com té lloc aquest restabliment dels principals eixos corporals hem estudiat les vies senyalitzadores de la β-catenina/Wnt i de les BMP (bone morphogenetic proteins), que tenen un paper bàsic en l’establiment dels eixos AP i DV durant el desenvolupament embrionari en altres models. En efecte, hem observat que les interferències de la via Wnt produeixen organismes que perden la capacitat de reconèixer la polaritat AP i regeneren caps en ambdós extrems, mentre que quan interferim la via BMP hi ha una ventralització de la regió dorsal, i apareixen organismes doblement ventrals enganxats per la regió central com si fossin siamesos. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

En tots els models, tant en embrions com en adults, la via Wnt regula un ampli ventall de processos, com el manteniment de cèl·lules mare, l’especificació de tipus cel·lulars, la determinació de la polaritat cel·lular i la migració (Logan i Nusse, 2004). Cal remarcar, però, que la via Wnt té una funció evolutivament conservada durant el desenvolupament inicial, en l’establiment de la primera asimetria en l’embrió, i, en estadis del desenvolupament més tardans, és essencial per conferir la identitat posterior (cua) enfront de l’anterior (cap) (Niehrs, 1999). En els darrers anys, juntament amb altres laboratoris, hem caracteritzat la funció de la via Wnt en el manteniment i restitució de la polaritat AP en planàries intactes i en fragments regenerants. Les primeres indicacions del seu paper en l’establiment de l’eix AP van aparèixer en caracteritzar funcionalment els gens GSK-3, un dels components del complex de destrucció de la β-catenina, que és l’element intercelul·lar clau de la via. La seva interferència, que impedeix la destrucció de la β-catenina i indueix la superactivació de la via, alterava la regeneració d’estructures anteriors, mentre que la regeneració posterior era normal (Adell et al., 2008). Ara bé, quan es va interferir directament la β-catenina-1 es van obtenir fenotips sorprenentment explícits: planàries totalment hipercefalitzades, en les quals només la identitat anterior podia diferenciar-se, amb un gran gangli cefàlic circular que induïa la diferenciació d’ulls a tota la vora de l’organisme (Gurley et al., 2008; Pettersen i Reddien, 2008; Iglesias et al., 2008) (vegeu la figura 3a). Cal remarcar que la polaritat DV no queda afectada. Aquests organismes, doncs, mantenen un sol eix de simetria, el DV, i per tant, han perdut la simetria bilateral, generada per la confrontació perpendicular dels dos eixos AP i DV, i han adquirit una simetria radial. Aquest fenotip és

100 F. CEBRIÀ, T. ADELL, J. F. ABRIL I E. SALÓ

únic i no s’havia observat mai en cap bilateral, ja que la manca de funció d’un gen essencial com la β-catenina, en altres models, menys plàstics que les planàries, causa letalitat. La superactivació de la via, mitjançant la interferència en la funció d’altres elements del complex de destrucció de la β-catenina, com els gens APC i les axines, a diferència del descrit amb GSK-3, van generar fenotips més evidents: planàries bicaudades, en les quals la diferenciació anterior està inhibida i, per això, en el blastema anterior es forma una cua. Més recentment hem caracteritzat la família de Wnt, els elements secretats i, per tant, els morfògens de la via. Del genoma de S. mediterranea hem pogut aïllar nou Wnt, dels quals quatre s’expressen a la part posterior de l’organisme, amb la qual cosa serien bons candidats per ser els activadors directes de la β-catenina-1 en aquesta zona. Els estudis funcionals mitjançant iRNA demostren que, en efecte, almenys dos d’aquests Wnt (WntP-1 i Wnt11-2) estan implicats en la diferenciació posterior, ja que la inhibició d’aquests genera planàries sense cua o amb cap en comptes de cua (Adell et al., 2009). La resta

de Wnt presenten patrons d’expressió molt específics en diferents teixits o estructures. Per exemple, el WntA s’expressa només en la part més posterior dels ganglis cefàlics, i el WntP-3, en la base de la faringe, fet que suggereix que seria el senyal integrat de tots els Wnt el responsable de generar el patró correcte tot al llarg de l’eix AP de la planària. D’altra banda, altres laboratoris han demostrat que l’activació dels Wnt seria responsabilitat de la via Hedgehog (Hh) (Rink et al., 2009), ja que Hh, l’element secretat, es presentaria en gradient continu en sentit AP, i es podria difondre pel sistema nerviós central (Yazawa et al., 2009) o a través d’unions gap (Oviedo et al., 2009). Més recentment hem estudiat la funció de l’homòleg de dishevelled, element intercel·lular comú a totes les branques de la via Wnt, tant dependent com independent de la β-catenina. La inhibició genera planàries totalment hipercefalitzades, com calia esperar, però amb defectes afegits, no observats en animals inhibits per β-catenina (Almuedo-Castillo et al., 2011). L’estudi d’aquests fenotips demostra que Dishevelled, a través del Wnt no canònic Wnt5, és essencial per a la connexió correcta del siste-

Figura 3. Alteracions dels eixos axials. a) Planària de 19 dies de regeneració després d’haver inhibit el gen de la βcatenina-1. Aquest organisme manté l’eix DV, però ha perdut l’eix AP, i presenta una simetria radial amb l’aparició d’ulls al llarg de la vora DV. Imatge cedida gentilment per Marta Iglesias. b) Organisme de 21 dies de regeneració ventralitzat. La zona dorsal central s’ha transformat en regió ventral despigmentada gràcies a la interferència de BMP. Tam bé es produeix una duplicació de la vora DV (sagetes) i la inducció d’ulls ectòpics per part dels ganglis cefàlics dorsals. Imatge cedida gentilment per Maria Dolores Molina. Barra: 1 mm. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

REGENERACIÓ I HOMEÒSTASI EN PLANÀRIES 101

ma nerviós, i que, juntament amb Van Gogh i Diversina, proteïnes de la xarxa conservada de planar cell polarity (PCP), és necessari per a l’ancoratge apical correcte dels cilis. En definitiva, la funcionalitat de la via Wnt canònica en l’establiment de l’eix AP, i de la via Wnt independent de la β-catenina durant la connexió neuronal i en el posicionament dels cilis epitelials, recapitula mecanismes paral·lels als observats en models embrionaris establerts, com els de Drosophila o Xenopus. La via BMP en embrions de vertebrats especifica el territori ventral. Les mutacions en els gens de la via BMP produeixen fenotips dorsalitzants, mentre que les mutacions en els gens antagonistes de la via, com noggin o chordin, produeixen fenotips ventralitzants. En els invertebrats hi ha una inversió d’aquest eix i la via BMP especifica la part dorsal. En el nostre laboratori vam iniciar la recerca dels gens de la via BMP, com el BMP mateix, Smad-1 i noggin (Molina et al., 2007). El silenciament mitjançant iRNA de BMP o Smad-1 produeix una alteració de l’eix DV tant en organismes regenerants com en intactes. La regió dorsal perd l’expressió de marcadors moleculars dorsals i alhora apareixen marcadors ventrals ectòpics. Aquesta ventralització parcial de la regió dorsal està refermada per l’aparició ectòpica d’un segon sistema nerviós central (SNC) en la regió dorsal (Molina et al., 2007) i una duplicació del marge DV (vegeu la figura 3b). Pel que fa als antagonistes de la via BMP, hem identificat un elevat nombre de gens noggin (Molina et al., 2009). Mentre que en la majoria d’animals s’han identificat entre dos i quatre gens noggin, la planària en té deu (Molina et al., 2009). Aquests es poden dividir en dos grups: dos gens noggin, Smed-nog1 i Smed-nog2, i vuit gens noggin-like (Smednlg1 a nlg8), que contenen una inserció de Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

llargada variable entre la 5a i 6a cisteïna del domini noggin. Alguns estudis funcionals recents han determinat que el gen Smed-nlg8 no actua com a inhibidor de la via BMP sinó més aviat com un agonista. Els gens noggin-like han estat conservats al llarg de l’evolució i, de fet, l’homòleg dels gens noggin-like en Xenopus també té una funció agonista, cosa que significa que aquests nous gens poden tenir un paper important en l’establiment de l’eix dorsoventral en els animals (Molina et al., 2011). Les planàries com a model per estudiar la regeneració del sistema nerviós A diferència de la majoria d’animals les planàries poden regenerar de novo un sistema nerviós central (SNC) en molts pocs dies ―per a una revisió vegeu Cebrià (2007). L’SNC de les planàries està constituït per un cervell anterior format per dos ganglis cefàlics connectats, normalment, per una comissura anterior, i dos cordons nerviosos ventrals que s’estenen tot al llarg de l’animal (vegeu la figura 1b). Aquest SNC conté diverses subpoblacions neuronals ben definides (Cebrià, 2008). A escala molecular s’han identificat dotzenes de gens que s’expressen específicament en l’SNC de la planària (Mineta et al., 2003), amb un elevat grau de conservació amb els seus homòlegs en vertebrats, i que poden associar-se a processos com: neurotransmissió, guiatge d’axons, morfogènesi del cervell, diferenciació neuronal i sistemes sensorials. Això vol dir que podem utilitzar les planàries per estudiar la funció d’aquests gens durant la regeneració i intentar correlacionar els resultats obtinguts amb la funció dels seus homòlegs durant el desenvolupament embrionari en vertebrats. Malgrat els avenços recents encara hi ha preguntes importants que cal respondre,

102 F. CEBRIÀ, T. ADELL, J. F. ABRIL I E. SALÓ

com ara: com es determinen els neoblasts al llinatge neural? Què passa just després de l’amputació de l’SNC a escala cel·lular i molecular? Quins factors estimulen la regeneració neural? No hi ha dubte que, atesa l’elevada incidència de malalties neurodegeneratives com l’Alzheimer o el Parkinson, així com de traumatismes en la medul·la espinal que es tradueixen en la pèrdua de mobilitat total o parcial de les persones afectades, qualsevol avenç a l’hora d’entendre com es regenera l’SNC d’altres organismes model pot tenir una gran rellevància i impacte social en la nostra societat. Gens necessaris per a la reconstrucció de xarxes neurals De manera conceptual la regeneració de l’SNC de planària es pot dividir en tres estadis principals: a) formació del primordi del cervell, b) creixement del nou cervell i dels cordons nerviosos truncats, que resulta en la formació de noves xarxes neurals, i c) recuperació final de totes les funcions pròpies d’aquest SNC (Cebrià et al., 2002a; Agata i Umesono, 2008). En cadascun d’aquests estadis s’expressen diferents grups de gens, cosa que suggereix una relació entre l’expressió d’aquests gens i els processos cel·lulars i moleculars que hi tenen lloc. Un aspecte important en el desenvolupament del sistema nerviós és entendre com els axons són capaços de viatjar distàncies, de vegades, força considerables, fins a trobar les seves cèl·lules diana. Les principals famílies de molècules implicades en el guiatge d’axons són: netrines, slit, efrines i semaforines. Algunes d’aquestes molècules actuen com a senyals atractius, guiant els axons cap a territoris permissius; altres senyals actuen com a repulsius, evitant que els axons es dirigeixin cap a regions no

permissives. Mentre que aquestes molècules tenen un paper molt important durant el desenvolupament embrionari, menys coneguda és la seva funció durant la regeneració neuronal. Així doncs, les planàries són un bon model en què es pot estudiar la funció d’aquestes molècules durant la reconstrucció de les xarxes neuronals. Les netrines van ser inicialment identificades com a molècules secretades amb funció atractiva en Drosophila, C. elegans i vertebrats, i duen a terme la seva funció a través de dues famílies de receptors: UNC5 i DCC (deleted in colorectal cancer). En la planària, les netrines i el seu receptor són necessaris tant per a la regeneració del seu SNC, com per al manteniment i la renovació d’aquest en animals no regenerants (Cebrià i Newmark, 2005). Sense l’acció d’aquests gens les planàries regeneren uns ganglis cefàlics anormals, més petits i amples del normal i connectats per una comissura anterior engruixida. A més, els cordons nerviosos truncats es regeneren i donen lloc a un entramat completament desorganitzat de projeccions axonals. Les netrines i el seu receptor són també necessaris perquè els axons de les cèl·lules fotosensitives dels ulls es projectin cap a la regió del cervell corresponent (Cebrià i Newmark, 2005). El gen nou-darake restringeix el cervell en la regió cefàlica La regeneració de nous teixits i òrgans requereix una regulació molt precisa de la mida i la posició. El gen nou-darake (ndk) exemplifica com aquesta restricció espacial és regulada durant la regeneració de l’SNC (Cebrià et al., 2002b). El nou cervell creix en una regió anterior que s’està també formant al mateix temps. D’alguna manera els creixements del cervell i la regió anterior Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

REGENERACIÓ I HOMEÒSTASI EN PLANÀRIES 103

han d’estar altament coordinats, de manera que el cervell ocuparà finalment la major part d’aquesta regió. La pèrdua de funció de ndk implica que en lloc de quedar restringit anteriorment, el nou cervell s’expandeix posteriorment al llarg de pràcticament tot l’animal (Cebrià et al., 2002b). ndk s’expressa específicament en la regió anterior de les planàries i codifica un receptor transmembrana semblant als receptors de FGF (fibroblast growth factor). NDK, però, manca del domini tirosina-cinasa característic d’aquesta família de receptors. A partir de diferents observacions s’ha postulat que NDK podria actuar com un regulador negatiu dels receptors de FGF (Cebrià et al., 2002b; Agata i Umesono, 2008). Un possible model d’actuació de NDK seria que aquest d’alguna manera restringiria la difusió d’un lligand de tipus FGF, que actuaria com a activador de la diferenciació del cervell en la planària. En absència de NDK aquest activador es podria difondre lliurement cap a regions més posteriors i induirhi la diferenciació de cervell (Cebrià et al., 2002b; Agata i Umesono, 2008).

Els ulls de les planàries i la universalitat dels circuits genètics que els generen i regeneren Charles Darwin, en el seu llibre sobre l’origen de les espècies, va dedicar un capítol sencer a l’origen de la visió, en el qual proposava que a partir d’un ull simple prototípic es van generar les diverses formes actuals. Aquest ull prototípic seria molt similar als ulls de les planàries (vegeu la figura 4). Aquest fet, més l’estreta col·laboració des de fa vint-i-cinc anys amb el grup de Walter Gehring, del Departament de Biologia Cel·lular del Biozentrum de la Universitat de Basilea (Suïssa), que va caracteritzar els elements genètics responsables de la determinació de la visió, va facilitar-nos una caracterització dels circuits genètics responsables de la determinació dels ulls durant la regeneració de les planàries (Pineda et al., 2000, 2002; Mannini et al., 2004). Les taques oculars (així és com s’anomenen els ulls simples de les planàries) estan formades per dos tipus cel·lulars: les cèl·lules fotoreceptores i les cèl·lules pigmentades, que protegeixen les primeres d’un excés de llum. Les fotoreceptores són neurones bipolars i els seus axons es pro-

Figura 4. Detalls de les taques oculars de les planàries. a) Amb les cèl·lules fotoreceptores (cf) de color verd (reconegudes per un anticòs contra arrestina, molècula relacionada amb la visió) i les cè l·lules pigmentades (cp) de color marró que protegeixen de l’excés de llum les cèl·lules fotoreceptores. L’anticòs permet observar la connexió de les cèl·lules fotoreceptores sobre els ganglis cefàlics (gc) i el quiasma òptic parcial (q). Imatge cedida gentilment per Kay Eckelt. Barra: 150 µm. b) Imatges en camp clar d’un organisme normal (b-1), amb els ulls diferenciats, i un mutant amb fenotip sense ulls (b-2), per pèrdua de funció mitjançant iRNA del gen six-1. c) Imatges de fluorescència d’un organisme transgènic que mostra l’expressió de la GFP en les cèl·lules fotoreceptores. Les sagetes indiquen els ulls. Imatge cedida gentilment per Cristina González-Estévez. Barra: 1 mm. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

104 F. CEBRIÀ, T. ADELL, J. F. ABRIL I E. SALÓ

jecten bé ipsolateralment cap a la regió dorsomedial dels ganglis cefàlics, bé contralateralment travessant la línia mitjana i formant un quiasma òptic. D’aquesta manera els senyals fotosensibles de cada taca ocular són integrats pels ganglis cefàlics. D’altra banda, les extremitats dendrítiques de les cèl·lules fotoreceptores formen estructures rabdomèriques, un microvil·li regular i ordenat on s’acumula l’opsina, el pigment fotosensible. El segon tipus cel·lular dels ulls de planària, les cèl·lules pigmentades, s’agrupen formant una estructura de copa invertida que protegeix en el seu interior els rabdòmers (vegeu la figura 4a). La determinació i diferenciació dels ulls està controlada per una xarxa gènica molt conservada en el món animal que s’inicia amb els gens Pax-6, sine oculis i eye absent. En el nostre laboratori hem caracteritzat aquests elements genètics en la planària, i hem produït pèrdues de funció d’alguns d’aquests gens mitjançant iRNA, que han generat fenotips sense ulls i, per tant, organismes cecs que no reaccionen a la llum (vegeu la figura 4b). També hem produït organismes transgènics amb una construcció que conté el promotor de l’opsina (el fotopigment universal dels ulls) amb un gen marcador de proteïna fluorescent, la GFP (green fluorescent protein) (González-Estévez et al., 2003) (vegeu la figura 4c). Actualment, estem duent a terme cerques in silico de gens candidats d’ulls ja caracteritzats en altres models ben coneguts com el peix zebra, el ratolí o Drosophila. A més, estem estenent les cerques utilitzant les seqüències obtingudes a partir de les anàlisis proteòmiques (Fernandez-Taboada et al., 2011), així com les seqüències obtingudes en el projecte de seqüenciació massiva basada en la tecnologia del 454 (Abril et al., 2010), totes dues descrites anteriorment.

A tall de cloenda podríem afirmar que l’extrema plasticitat morfològica de les planàries ens recorda un organisme adult que manté les propietats plàstiques d’un embrió. La presència d’un elevat percentatge de cèl·lules mare pluripotents en les planàries adultes es considera una sinapomorfia d’aquest «clade» entre tots els organismes bilaterals. Mitjançant iRNA es pot interferir, amb un elevat percentatge de penetrància, en qualsevol gen important del desenvolupament, cosa que ens permet visualitzar fenotips de morfogènesi i polaritat mai observats en altres models. En un futur proper, un cop es puguin establir quins són els diferents llinatges que porten els neoblasts a la diferenciació de tots els tipus cel·lulars, les planàries poden convertir-se en un model òptim per caracteritzar els diversos circuits genètics implicats en el manteniment i la diferenciació de les cèl·lules mare. AGRAÏMENTS Els autors volen agrair a tots aquells estudiants de doctorat que, treballant durant els darrers anys en les seves tesis doctorals en el Departament de Genètica de la Universitat de Barcelona, han contribuït als resultats mencionats en aquesta revisió. BIBLIOGRAFIA Abril, J. F.; Cebrià, F.; Rodríguez-Esteban, G.; Fraguas, S.; Horn, T.; Calvo, B.; Bartscherer, K.; Saló, E. (2010). «Smed454 dataset: unravelling the transcriptome of Schmidtea mediterranea». BMC genomics, 11: 731. Adell, T.; Marsal, M.; Salo, E. (2008). «Planarian GSK3s are involved in neural regeneration». Dev. Genes Evol., 218: 89-103. Adell, T.; Salo, E.; Boutros, M.; Bartscherer, K. (2009). «Smed-Evi/Wntless is required for beta-

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

REGENERACIÓ I HOMEÒSTASI EN PLANÀRIES 105 catenin-dependent and -independent processes during planarian regeneration». Development, 136: 905-910. Agata, K.; Umesono, Y. (2008). «Brain regeneration from pluripotent stem cells in planarian». Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 363: 2071-2078. Almuedo-Castillo, M.; Saló, E.; Adell, T. (2011). «Dishevelled is essential for neural connectivity and planar cell polarity in planarians». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108: 2813-2818. Cebrià, F. (2007). «Regenerating the central nervous system: how easy for planarians!» Dev. Genes Evol., 217: 733-748. ― (2008). «Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: an immunocytochemical study». Neurosci. Res., 61: 375-384. Cebrià, F.; Kobayashi, C.; Umesono, Y.; Nakazawa, M.; Mineta, K.; Ikeo, K.; Gojobori, T.; Itoh, M.; Taira, M.; Sanchez Alvarado, A. (2002b). «FGFR-related gene nou-darake restricts brain tissues to the head region of planarians». Nature, 419: 620-4. Cebrià, F.; Nakazawa, M.; Mineta, K.; Ikeo, K.; Gojobori, T.; Agata, K. (2002a). «Dissecting planarian central nervous system regeneration by the expression of neural-specific genes». Develop. Growth Differ., 44: 135-146. Cebrià, F.; Newmark, P. A. (2005). «Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture». Development, 132: 3691-3703. Fernandez-Taboada, E.; Moritz, S.; Zeuschner, D.; Stehling, M.; Scholer, H. R.; Saló, E.; Gentile, L. (2010). «Smed-SmB, a member of the LSm protein superfamily, is essential for chromatoid body organization and planarian stem cell proliferation». Development, 137: 1055-1065. Fernandez-Taboada, E.; Rodríguez-Esteban, G.; Saló, E.; Abril, J. F. (2011). «A proteomics approach to decipher the molecular nature of planarian stem cells». BMC genomics, 12: 133. Gonzalez-Estevez, C.; Felix, D. A.; Aboobaker, A.; Saló, E. (2007). «Gtdap-1 promotes autophagy and is required for planarian remodeling during regeneration and starvation». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 13373-13378. Gonzalez-Estevez, C.; Momose, T.; Gehring, W. J.; Saló, E. (2003). «Transgenic planarian lines obtained by electroporation using transposonderived vectors and an eye-specific GFP marker». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 14046-14051.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

Gurley, K. A.; Rink, J. C.; Sanchez Alvarado, A. (2008). «Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis». Science, 319: 323-327. Handberg-Thorsager, M.; Fernandez, E.; Saló, E. (2008). «Stem cells and regeneration in planarians». Front. Biosci., 13: 6374-6394. Iglesias, M.; Gomez-Skarmeta, J. L.; Saló, E.; Adell, T. (2008). «Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians». Development, 135: 1215-1221. Logan, C. Y.; Nusse, R. (2004). «The Wnt signaling pathway in development and disease». Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 20: 781-810. Mannini, L.; Rossi, L.; Deri, P.; Gremigni, V.; Salvetti, A.; Saló, E.; Batistoni, R. (2004). «Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1». Dev. Biol., 269: 346-359. Mineta, K.; Nakazawa, M.; Cebrià, F.; Ikeo, K.; Agata, K.; Gojobori, T. (2003). «Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 7666-7671. Molina, M. D.; Neto, A.; Maeso, I.; Gómez-Skarmeta, J. L.; Saló, E.; Cebrià, F. (2011). «Noggins, a noggin-like gene and a BMP/ADMP organizer control the regeneration of the planarian DV axis». Current Biology, 21: 300-305. Molina, M. D.; Saló, E.; Cebrià, F. (2007). «The BMP pathway is essential for re-specification and maintenance of the dorsoventral axis in regenerating and intact planarians». Dev. Biol., 311: 79-94. ― (2009). «Expression pattern of the expanded noggin gene family in the planarian Schmidtea mediterranea». Gene Expr. Patterns, 9: 246-253. Niehrs, C. (1999). «Head in the WNT: the molecular nature of Spemann’s head organizer». Trends Genet., 15: 314-319. Oviedo, N. J.; Morokuma, J.; Walentek, P.; Kema, I. P.; Gu, M. B.; Ahn, J. M.; Hwang, J. S.; Gojobori, T.; Levin, M. (2009). «Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration». Dev. Biol., 339: 188-199. Petersen, C. P.; Reddien, P. W. (2008). «Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration». Science, 319: 327-330. Pineda, D.; Gonzalez, J.; Callaerts, P.; Ikeo, K.; Gehring, W. J.; Salo, E. (2000). «Searching for the prototypic eye genetic network: Sine oculis is essential for eye regeneration in planarians». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4525-4529.

106 F. CEBRIÀ, T. ADELL, J. F. ABRIL I E. SALÓ Pineda, D.; Rossi, L.; Batistoni, R.; Salvetti, A.; Marsal, M.; Gremigni, V.; Falleni, A.; Gonzalez-Linares, J.; Deri, P.; Saló, E. (2002). «The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent». Development, 129: 1423-1434. Rink, J. C.; Gurley, K. A.; Elliott, S. A.; Sanchez Alvarado, A. (2009). «Planarian Hh signaling regulates regeneration polarity and links Hh pathway evolution to cilia». Science, 326: 14061410. Robb, S. M.; Ross, E.; Sanchez Alvarado, A. (2008). «SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database». Nucleic Acids Res., 36: D599-606.

Saló, E. (2006). «The power of regeneration and the stem-cell kingdom: freshwater planarians (Platyhelminthes)». Bioessays, 28: 546-559. Saló, E.; Baguna, J. (1984). «Regeneration and pattern formation in planarians. I. The pattern of mitosis in anterior and posterior regeneration in Dugesia (G) tigrina, and a new proposal for blastema formation». J. Embryol. Exp. Morphol., 83: 63-80. Yazawa, S.; Umesono, Y.; Hayashi, T.; Tarui, H.; Agata, K. (2009). «Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106: 22329-22334.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 93-106

DOI: 10.2436/20.1501.02.107

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 107-121

Caenorhabditis elegans: UNA HISTÒRIA FASCINANT Diana Dalfó Department of Pathology, Helen and Martin Kimmel Center for Stem Cells Biology, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine Adreça per a la correspondència: Diana Dalfó. Department of Pathology, Helen and Martin Kimmel Center for Stem Cells Biology, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, New York University School of Medicine. First Avenue, 540, 4a, laboratori 7. 10016 Nova York (EUA). Adreça electrònica: dalfod01@med.nyu.edu. RESUM El nematode Caenorhabditis elegans va ser escollit com a model genètic fa més de trenta anys. Des de llavors ha passat de ser un organisme que estava en la foscor a ser un dels organismes model més importants avui dia. C. elegans reuneix moltes característiques que en faciliten l’ús en estudis de genètica i de desenvolupament. Hi ha diversos factors que han influït en la seva gran popularitat, entre altres, el fet que fos el primer organisme multicel·lular que va tenir tot el seu genoma seqüenciat, i que es puguin expressar marcadors fluorescents in vivo. El gran avantatge de C. elegans com a sistema biològic és que permet estudiar qualsevol efecte en el context d’un organisme sencer. A més, el fet que si gui un organisme senzill però que al mateix temps molts processos biològics hi estiguin conservats al llarg de l’evolució fa d’aquest cuc un organisme ideal per estudiar malalties humanes. Aquesta revisió presenta els aspectes més importants d’aquest organisme, la gran variabilitat de recursos disponibles i, en definitiva, el gran potencial que té C. elegans per ajudar a entendre molts aspectes de la biologia humana. Paraules clau: Caenorhabditis elegans, organisme model, GFP, RNAi, malaltia humana. Caenorhabditis elegans: AN AMAZING STORY SUMMARY The nematode Caenorhabditis elegans was chosen as a model genetic organism more than 30 years ago. These years have taken this organism from obscurity to a position as one of the major model organisms. C. elegans has several distinct characteristics that make it suitable for genetic and developmental experiments. Several different aspects have Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

108 D. DALFÓ

helped make it popular, among others, the fact that it was the first multicellular organism with its entire genome sequenced and that fluorescent markers can be readily observed in vivo. As an experimental system, C. elegans offers a unique opportunity to study any effect in a whole-organism context. The conservation of disease pathways between C. elegans and higher organisms, together with its simplicity, make of this organism an important model for human diseases. This review describes the key features of this organism, the different resources available and, in summary, the potential of C. elegans to help to understand the human biology. Key words: Caenorhabditis elegans, model organism, GFP, RNAi, human disease. Our field has prospered and has come of age; what was once a joke organism… has now become a major experimental system for the study of development and developmental genetics. Sydney Brenner (1987)

INTRODUCCIÓ El 1965, Sydney Brenner va escollir el nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) com a model per estudiar processos de desenvolupament i de neurobiologia. Avui, C. elegans s’ha convertit en «el cuc» i és amb tota probabilitat un dels organismes més ben conegut a escala anatòmica, genètica, de desenvolupament i de comportament. De fet, hi ha molts estudis que utilitzen C. elegans per investigar una gran varietat de processos com ara la regulació gènica, el metabolisme, el cicle cel·lular, la mort cel·lular programada, etc. C. elegans és un cuc petit (1 mm de llarg), cilíndric, que viu a terra i que es pot trobar fàcilment en qualsevol part del món (vegeu la figura 1). S’alimenta de bacteris i el seu cicle vital ―temps necessari per desenvolupar-se d’ou a adult― és aproximadament de tres dies. C. elegans és hermafrodita, és a dir, el mateix organisme produeix esperma i oòcits i es reprodueix per autofecundació. Tanmateix, alguns cucs mascle apareixen espontàniament, amb una freqüència molt baixa, i poden fertilitzar els cucs hermafrodites. Cada hermafrodita pot

produir fins a 300 ous al llarg de la seva vida reproductora. El desenvolupament d’aquest organisme consta de tres fases: embrió, larva i adult (Wood, 1988a) (vegeu la figura 2). La primera fase s’inicia amb la fecundació dins de l’úter d’un adult i es finalitza a l’exterior. A mig camí de completar el procés d’embriogènesi, l’embrió és esfèric i conté unes 500 cèl·lules. A partir d’aquest moment la proliferació cel·lular s’atura i el cos s’allarga, el sistema nerviós es desenvolupa i finalment la primera fase larval (L1) trenca la cutícula, es mou lliurement i comença a alimentar-se de bacteris. Si les condicions ambientals no són bones (manca de menjar, temperatures altes, etc.) s’aturarà el desenvolupament i s’entrarà en una fase anomenada dauer (que en alemany significa ‘permanent’). Com a dauer l’animal pot aguantar fins a quatre mesos en condicions molt adverses i sense la necessitat de menjar. Quan les condicions ambientals milloren, prosseguirà el desenvolupament larval, que consta de tres etapes més (L2, L3 i L4). Durant aquestes fases larvals l’organisme augmenta de mida, però el més important és que es desenvolupa la línia germinal que acabarà donant Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

Caenorhabditis elegans: UNA HISTÒRIA FASCINANT 109

lloc a l’esperma i als oòcits (Hubbard i Greenstein, 2005). Una cèl·lula específica de l’embrió serà determinada genèticament per donar lloc a tota la línia germinal i això la farà diferent de la resta de les cèl·lules, que es diferenciaran en teixits somàtics, com ara la hipodermis, l’intestí, el sistema nerviós, etc. Aquesta cèl·lula germinal tindrà un procés de proliferació molt important en la fase larval, i passarà d’una sola cèl·lula a gairebé 2.000 cèl·lules. Aquest creixement s’evidenciarà per dos braços que naixeran a cada costat de l’úter i que s’aniran allargant a mesura que les cèl·lules germinals proliferin fins que formin dos braços en forma de u (vegeu la figura 1). Fins al final de la L3 totes les cèl·lules que formen part dels dos braços de la gònada estan en cicle mitòtic i es caracteritzen per multiplicar-se constantment. A partir d’a-

quest moment, però, serà la primera vegada que les cèl·lules que estan més a prop de l’úter (a la part proximal de cada braç) entraran en meiosi, i, per tant, en altres paraules, es diferenciaran (ja no podran multiplicar-se més) i donaran lloc als gàmetes, primer esperma i després oòcits. En la fase L4 es formarà la vulva, que unirà l’úter amb l’exterior (Sulston, 1988). En l’última fase del cicle vital, en l’adult, ja no hi haurà més divisions de cèl·lules somàtiques, però les cèl·lules germinals en mitosi es continuaran dividint al llarg de la vida adulta (Hirsh et al., 1976), la qual cosa les fa un model molt interessant per estudiar cèl·lules mare (Hubbard, 2007). Finalment, tindrà lloc la fertilització, cosa que tanca el cicle vital de C. elegans.

Figura 1. Anatomia d’un hermafrodita adult. A) Imatge DIC del costat esquerre d’un adult i de dos embrions que han estat expulsats a l’exterior (barra: 0,1 mm). B) Dibuix esquemàtic de les estructures anatòmiques d’un adult: faringe, intestí, úter, part proximal i distal de la gònada en forma de u i anus (©wormatlas.org). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

110 D. DALFÓ

Quines característiques té Caenorhabditis elegans que el fan un bon organisme model? a) És fàcil de mantenir amb una dieta d’Escherichia coli (E. coli), el bacteri més predominant en un laboratori. Només s’ha d’afegir una capa petita de bacteri en una placa de NGM (nematode growth medium) i transferir-hi els cucs. La temperatura ideal de manteniment és entre 16-25 °C. El ritme de creixement dependrà de la temperatura, i és 2,1 vegades més ràpid a 25 °C que a 16 °C. Aquesta diferència pot ser molt útil quan es plantegen diversos experiments. b) C. elegans es reprodueix ràpidament. A més, el fet que en només tres dies es desenvolupi d’ou a adult, que puguem obtenir 300 ous per hermafrodita i que, com que les plaques ocupen poc espai, en puguem acumular tantes com vulguem, fa possible generar milions d’animals al dia. c) Gràcies a la seva mida petita molts experiments es poden dur a terme en plaques de 96 pouets, cosa que permet analitzar un gran nombre d’animals per cada experiment i redueix significativament el cost de logística. A més a més, l’ús d’aquestes plaques ha fet possible la introducció de robots per manipular les mostres. d) És transparent al llarg de tot el desenvolupament. Això implica que amb un microscopi podem observar divisions cellulars, migracions i processos de diferenciació en un animal viu. Si, a més, fem servir algun marcador fluorescent, es poden estudiar in vivo fenòmens com ara el creixement dels axons, el metabolisme dels greixos o l’embriogènesi mateixa. e) És un animal multicel·lular sofisticat amb formació d’òrgans i teixits, com ara múscul, hipodermis, intestí, sistema reproductor i sistema nerviós. Un dels motius més importants pel qual s’utilitzen organismes model és que molts

estudis en humans, especialment estudis genètics, són extremadament difícils de portar a terme a causa de la complexitat de la biologia humana, la falta d’eines per alterar l’activitat específica d’un gen in vivo i, evidentment, tot de qüestions ètiques que aquests experiments comportarien. C. elegans, en canvi, és un model ideal per a estudis genètics, ja que el fet que s’autofecundi permet obtenir fàcilment individus homozigots per a una mutació específica (revisat a Jorgensen i Mango, 2002). A més, el fet que tant en humans com en formes més simples es conservin vies metabòliques senceres i complexos de proteïnes similars, fa que molts laboratoris utilitzin aquests organismes per establir models funcionals que ens poden ajudar a entendre la biologia humana. Sydney Brenner va concebre inicialment C. elegans com un sistema model per entendre aspectes fonamentals de genètica, desenvolupament i comportament. Brenner estava interessat en la relació entre gens i comportament però considerava que la mosca del vinagre, estudiada en gran detall a escala genètica, era massa complexa per a aquesta tasca. Brenner volia un organisme més senzill del qual es poguessin determinar totes les estructures del sistema nerviós. Al cap d’uns anys de la seva proposta es va aconseguir el que havia predit: C. elegans va ser el primer organisme del qual es va descriure la pauta de totes les connexions neuronals, que van ser reconstruïdes amb l’ajuda d’unes seccions en sèrie d’un microscopi electrònic (White et al., 1986). A més, el fet que les divisions cel·lulars siguin invariables entre individus ha fet possible estudiar el llinatge de totes les cèl·lules somàtiques d’aquest organisme (959 cèl·lules). Partint del zigot, que és una única cèl·lula, s’ha pogut seguir el naixement de totes les cèl·lules, quantes vegades proliferen, si tenen la capacitat de migrar i Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

Caenorhabditis elegans: UNA HISTÒRIA FASCINANT 111

com es diferenciaran, és a dir, a quin teixit donaran lloc. Encara que l’anatomia d’aquest cuc és senzilla, se sap que les 959 cèllules somàtiques de l’adult representen la major part de teixits diferenciats que podem trobar en humans, com ara múscul (11 cèl·lules), neurones (302 cèl·lules), intestí (34 cèl·lules) i epidermis (213 cèl·lules) (Sulston i Horvitz, 1977). Finalment, s’ha de destacar que el primer organisme multicel·lular que va tenir el seu genoma completament seqüenciat va ser, naturalment, el cuc C. elegans (The C. elegans Consortium, 1998). Sydney Brenner va tenir una gran intuïció quan va escollir aquest petit animal com a organisme model, ja que ha

quedat palès que el seu gran potencial no es limita a aquests aspectes sinó que es pot utilitzar per estudiar una gran varietat de processos biològics, incloent-hi diverses malalties humanes. En reconeixement a la gran aportació que Sydney Brenner va fer a la comunitat científica va ser guardonat amb el Premi Nobel de Medicina l’any 2002. Actualment, més de 35 anys després del primer article publicat per Sydney Brenner, hi ha més de 700 laboratoris registrats que utilitzen C. elegans com a organisme model de manera rutinària.

Figura 2. Cicle vital de C. elegans a 22 °C. El moment de la fecundació és considerat el minut zero. La durada de cada etapa està indicada en hores (hr). La llargada de l’animal està indicada en micròmetres (µm) (©wormatlas.org). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

112 D. DALFÓ

TÈCNIQUES DISPONIBLES EN Caenorhabditis elegans Una de les primeres coses que sorprenen més quan es comença a treballar amb aquest curiós cuc és la gran varietat de tècniques desenvolupades, com ara tècniques clàssiques de genètica, de biologia molecular, d’introducció de DNA o RNA exogen en la línia germinal del cuc, etc. S’ha de destacar, però, que dos dels avenços més importants han estat guardonats també amb el Premi Nobel, com a reconeixement al gran paper que han tingut no solament dins del camp dels nematodes sinó de la ciència en general. Un d’aquests descobriments va ser la introducció de marcadors fluorescents i l’altre es refereix a l’RNA d’interferència. Green fluorescent protein Una de les històries més captivadores sobre aquest organisme fa referència al descobriment de la proteïna fluorescent verda o GFP (de les sigles en anglès, green fluorescent protein). El 1961 Osamu Shimomura es va posar a treballar amb la medusa Aequorea victoria amb la idea d’estudiar-ne la bioluminiscència. L’objectiu era clar: purificar la substància luminescent que permetia a aquesta medusa emetre una fascinant llum blava. Tanmateix, tots els intents del jove Shimomura van fracassar. Va treballar dia i nit, va provar centenars de tècniques diferents, però cada vegada que intentava extreure aquella substància fluorescent acabava amb una gran foscor. Un dia, desesperat després d’un altre intent sense èxit, va llançar l’extracte que havia obtingut a la pica i llavors va quedar sorprès en veure que una intensa llum blava il·luminava la pica per uns segons. Aquella pica s’estava utilitzant com a desguàs d’un

aquari d’aigua salada situat prop del laboratori. Shimomura va deduir que el calci de l’aigua salada havia fet possible la luminescència. A partir d’aquí va ser més fàcil purificar aquesta nova proteïna, que en presència de calci emetia llum blava. La va anomenar aequorina (Shimomura et al., 1962). Tanmateix, a més d’haver-hi aequorina en la medusa també hi havia present una proteïna més petita que en algunes circumstàncies podia rebre la llum blava produïda per l’aequorina i emetre llum verda. Quan Shimomura va purificar l’aequorina també va purificar aquesta proteïna, i com que emetia llum verda, la va anomenar GFP (Morise et al., 1974). La GFP, però, tenia una característica que la diferenciava de qualsevol altra proteïna fluorescent. Fins aquell moment es creia que les proteïnes fluorescents eren el resultat d’un complex format per una proteïna i una substància fluorescent. La GFP era una proteïna fluorescent molt especial perquè no necessitava cap substància fluorescent per emetre llum, com l’aequorina, ja que una part intrínseca de la seva molècula és la responsable d’emetre llum. Aquest descobriment va ser molt important, ja que suggeria que

Figura 3. Expressió de la GFP en C. elegans in vivo. Adult hermafrodita que expressa GFP en totes les cèl·lules del sistema nerviós (Chalfie, 2009). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

Caenorhabditis elegans: UNA HISTÒRIA FASCINANT 113

es podia clonar la GFP i que hauria de ser capaç d’emetre llum per si sola. Tanmateix, Shimomura va deixar de treballar amb la GFP i no es va saber res més d’aquesta proteïna fins al 1989. Martin Chalfie, professor de la Columbia University, a Nova York, va assistir a una conferència en què es parlava dels descobriments fets més de vint anys enrere per Shimomura. En aquell temps Chalfie estava treballant en l’expressió de diversos gens en el sistema nerviós del C. elegans. En aquella època hi havia diferents sistemes per detectar l’expressió de gens i proteïnes, però tots obligaven a fixar l’animal, i per tant només es podien observar teixits d’animals morts. Quan Chalfie va sentir per primera vegada parlar d’una proteïna que emetia llum verda de seguida va començar a imaginar de quina manera la podia fer servir com a marcador biològic per estudiar cucs vius, els quals, recordemho, són transparents al llarg de tot el seu cicle vital (vegeu la figura 3). El 1994 Chalfie i els seus col·laboradors van publicar un article a la revista Science en què demostraven que l’expressió de la GFP en organismes procariotes (E. coli) o eucariotes (C. elegans) produïa una intensa llum verda que es podia fer servir per seguir l’expressió de gens o la localització de proteïnes en organismes vius (Chalfie et al., 1994). La importància que ha tingut la GFP en l’estudi de processos in vivo ha estat reconeguda amb el Premi Nobel de Química de l’any 2008, quan Osamu Shimomura juntament amb Martin Chalfie i Roger Tsien van ser guardonats amb aquest prestigiós premi. Avui, molts laboratoris utilitzen la GFP de manera rutinària amb diverses finalitats; per exemple, com a marcador de proteïnes, de compartiments subcel·lulars, de cèl·lules, per seguir processos de migració o per seguir la introducció de DNA extern en C. elegans (revisat a Hodgkin i Herman, 1998). Actualment hi ha diverses soques comerciTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

als que expressen la GFP en diversos teixits o tipus cel·lulars. RNA d’interferència Cap a la meitat dels anys cinquanta es va introduir per primera vegada el concepte de RNA de doble cadena (dsRNA, de les sigles en anglès double-strand RNA): quan dues cadenes de RNA mostren grans regions de seqüència complementària poden unir-se (com si fossin les dues tires d’una cremallera) formant una molècula de dsRNA (Rich i Davies, 1956). Al principi dels anys seixanta, però, es creia que la font d’aquest tipus d’estructura era majoritàriament vírica (Baltimore et al., 1964). En aquella època el dogma deia que el DNA de doble hèlix, on es guarda la informació genòmica, es transcriu a RNA d’una sola cadena, que al seu torn es tradueix a proteïna. En aquell moment el dsRNA no tenia cap paper en la biologia cel·lular. No va ser fins al final dels anys noranta quan Craig Mello i Andrew Fire van entrar en escena. El seu objectiu era disminuir l’expressió d’un gen utilitzant RNA d’una sola cadena. L’RNA era introduït en la gònada del cuc amb una agulla molt petita, tècnica que rep el nom de microinjecció (Mello et al., 1991). Aquests investigadors van començar utilitzant l’RNA complementari al gen unc-22, un dels responsables de controlar el moviment del cuc. La idea era que quan l’RNA introduït es trobés una molècula de RNA endògena del gen unc-22, com que les seqüències serien complementàries, s’unirien formant una cremallera i això n’impediria la traducció a proteïna i disminuiria així l’activitat del gen en qüestió. L’efecte, tot i que evident, no era gaire significatiu, ja que només una petita part de la descendència mostrava un moviment deficient. En aquell moment ja se sabia que el

114 D. DALFÓ

dsRNA era bastant més estable que l’RNA d’una sola cadena i en un moment d’inspiració aquests investigadors van decidir barrejar en un tub una cadena de RNA sentit i una d’antisentit per generar així molècules de dsRNA. Van intentar de nou les microinjeccions, però aquesta vegada amb dsRNA. Per a sorpresa seva l’efecte va ser molt més gran i ara la major part de la descendència tenia un moviment defectuós (Fire et al., 1998). Havia nascut l’RNA d’interferència (RNAi). S’havia demostrat que el dsRNA era capaç de degradar l’RNA missatger (mRNA) de la cèl·lula amb la qual comparteix una seqüència idèntica. Més tard es va diversificar la manera d’introduir el dsRNA. Tot i que la microinjecció funcionava, era una tècnica que requeria una gran dosi d’experiència i molta habilitat. Així doncs, es va decidir modificar genèticament el bacteri que es menja el cuc, l’E. coli, perquè pogués generar dsRNA a partir d’un vector que conté una seqüència de DNA. Per a sorpresa seva, quan el C. elegans es menjava aquest bacteri es veia el mateix efecte en la descendència que amb les microinjeccions (Timmons i Fire, 1998). També van demostrar que si se submergia un cuc en una solució que contingués molècules de dsRNA aquestes eren capaces de travessar les membranes cel·lulars i distribuir-se per tot el cos (Tabara et al., 1998). D’una manera que avui encara no està del tot clara, el dsRNA és capaç de distribuir-se al llarg del cos del cuc, independentment de com hagi entrat. Tots aquests mecanismes produeixen una disminució de l’expressió d’un gen específic que es pot trobar en qualsevol lloc de l’organisme. La gran aportació d’aquests dos científics va ser l’estudi dels gens implicats en el mètode pel qual el dsRNA és capaç de silenciar l’expressió d’un gen (Parrish et al., 2000). El fet que es trobessin resultats similars en mosques, plantes i finalment

humans va fer evident que es tractava d’un procés conservat evolutivament. És a dir, el mecanisme amb el qual es basa l’RNAi és, de fet, molt antic, està present de manera natural en diversos organismes i s’utilitza com a defensa davant de virus o transposons. Avui, l’RNAi s’ha convertit en una de les tècniques més utilitzades per estudiar la funció d’un gen, especialment en C. elegans (revisat a Boutros i Ahringer, 2008). Els avantatges de l’RNAi són diversos, com ara el fet que la seqüència dels gens implicats és coneguda abans de començar l’experiment; el dsRNA es pot introduir en diferents estadis del desenvolupament i es poden silenciar famílies gèniques senceres si comparteixen un fragment de seqüència, i s’elimina així el problema de la redundància funcional. D’altra banda, no tots els gens són receptius a l’RNAi, alguns teixits no responen a aquesta tècnica (especialment el teixit neural), l’efecte que produeix l’RNAi desapareix quan s’elimina la font del dsRNA (per exemple, menjar) i finalment s’ha de tenir en compte que de vegades no s’aconsegueix una reducció total del nivell de l’mRNA, i per tant encara hi pot haver una petita producció de proteïna. Com a reconeixement a la gran feina que van fer, Craig Mello i Andrew Fire van rebre el Premi Nobel el 2006. TÈCNIQUES I RECURSOS DISPONIBLES EN Caenorhabditis elegans Els avenços que han tingut lloc en el camp del C. elegans han estat, en part, gràcies al fet que històricament hi ha hagut una gran col·laboració entre els diferents laboratoris. Això ha significat que hi hagi un gran nombre de tècniques i de recursos informàtics a l’abast de qualsevol investigador. A continuació hi ha un resum de les Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

Caenorhabditis elegans: UNA HISTÒRIA FASCINANT 115

pàgines d’Internet de més utilitat (revisat a Antoshechkin i Sternberg, 2007): Els llibres The nematode Caenorhabditis elegans i el seu successor C. elegans II són d’un interès enorme (Riddle et al., 1997; Wood, 1988b). Recentment es va decidir actualitzar una vegada més el llibre, però aquest cop amb una versió en línia (http:// www.wormbook.org). L’objectiu és presentar de manera intel·ligible tots els aspectes coneguts de la biologia del cuc i descriure’n les diverses tècniques disponibles. Cal destacar la formació recent d’una pàgina molt útil per a estudiants i professors de secundària (http://www.wormclassroom. org). En aquesta pàgina s’explica què és un organisme model, es dóna una descripció general del C. elegans i a més hi ha accés a vídeos, protocols experimentals i molts recursos educatius més. La base de dades http://www.wormbase. org és coneguda com la més important sobre C. elegans i altres nematodes. Conté informació sobre seqüències genòmiques i proposa models estructurals de gens. Cada gen té una pàgina pròpia on es resumeix tota la informació coneguda que s’extreu manualment dels articles publicats cada any. A més, el fet que el genoma d’altres nematodes estigui disponibles fa d’aquesta pàgina una eina molt important per a la genòmica comparada. A http://www.wormatlas.org es dóna una informació exhaustiva de l’anatomia del C. elegans. Cada capítol està acompanyat d’uns diagrames que descriuen les diferents parts anatòmiques amb gran detall. És una manera excel·lent d’explorar aquest organisme. El Caenorhabditis Genetics Center (http:// biosci.umn.edu/CGC) és el responsable de col·leccionar, mantenir i distribuir totes les soques que s’han generat de C. elegans des del 1978. El fet que es puguin congelar cucs en estadi larval (L1) permet tenir una Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

font permanent de totes les mutacions que s’han generat al llarg del temps. Una altra funció essencial del CGC és la coordinació de la nomenclatura. Històricament els investigadors en C. elegans han seguit normes molt estrictes per a cada gen descobert. Això ha assegurat una uniformitat dels noms dels gens que ha disminuït substancialment les confusions que poden donar-se en altres organismes quan el mateix gen rep dos noms diferents. Textpresso (http://textpresso.org) és un cercador que va ser específicament dissenyat per a la bibliografia del C. elegans. Acumula més de vuit mil articles, a més de resums de xerrades dels congressos internacionals i nacionals. Cada any s’hi afegeixen al voltant d’uns mil articles. El gran avantatge d’aquest cercador és que pot accedir a tot el text d’aquests articles i xerrades, mentre que els altres cercadors es limiten al resum que hi ha davant de cada article. Històricament el servidor C. elegans WWW (http://elegans.swmed.edu) ha servit per unir els diversos tipus d’informació que hi ha sobre C. elegans i com a punt de trobada entre els científics. A més a més, totes aquestes pàgines tenen enllaços entre si, cosa que en facilita la interconnexió. UN GENOMA COMPLETAMENT SEQÜENCIAT Un dels grans avenços en la història d’aquest cuc va tenir lloc al final de l’any 1998, quan el C. elegans es va convertir en el primer organisme multicel·lular que va tenir tot el genoma seqüenciat (The C. elegans Consortium, 1998). Per poder completar el projecte es van necessitar uns 3.000 clons i la feina coordinada de centenars de científics del Sanger Institute (Regne Unit) i del Genome Sequencing Center (EUA). Aquest

116 D. DALFÓ

èxit va ser un pas important per assolir la seqüència del genoma humà uns anys més tard (International Human Genome Consortium, 2004). Aquests dos fets van fer una empenta a la genòmica comparada, que es dedica a comparar els genomes de diverses espècies per estudiar l’efecte que tenen els processos evolutius. Avui sabem aproximadament quants gens hi ha en els humans i en organismes model i com estan distribuïts al llarg del genoma. El repte següent, però, serà entendre la funció de tots els gens i de les parts del genoma no codificants. En altres paraules, si ens imaginem que el genoma és un llibre i que cada base del DNA és una lletra, actualment coneixem totes les lletres que formen aquest llibre, la seva posició i que formen paraules. Sabem el significat d’algunes paraules però encara n’hi ha moltes que no sabem què volen dir. Si comparem diversos llibres podrem obtenir informació que ens ajudarà a entendre el significat de més paraules i de l’estructura dels llibres en general. El genoma del C. elegans conté més de 19.000 gens que codifiquen proteïnes i que es troben dispersos al llarg dels 97 milions de bases de què consta el seu genoma. Aproximadament el 42 % de les proteïnes en C. elegans tenen alguna semblança amb proteïnes d’espècies que no són nematodes, la qual cosa suggereix que s’han conservat al llarg de l’evolució. Per contra, un 34 % de les proteïnes només mostren algun grau de semblança amb proteïnes que es troben exclusivament en els nematodes (Green et al., 1993). Els científics s’han centrat en el primer grup, especialment si mostren homologia amb proteïnes humanes. El genoma, però, no està format exclusivament per gens que codifiquen proteïnes sinó que hi ha altres tipus de seqüències. En el cas del C. elegans s’han trobat diversos centenars de gens que es transcriuen a RNA però que no codifiquen

proteïnes, com per exemple els gens que codifiquen tRNA. A més, també hi ha seqüències no codificants que són importants per a la regulació gènica i per al manteniment dels cromosomes. Com en altres organismes multicel·lulars, una part important d’aquestes seqüències és repetitiva. Les repeticions en tàndem constitueixen el 2,7 % del genoma i les invertides un 3,6 %. No estan distribuïdes uniformement, ja que és més probable que es trobin en els introns que entre els gens (The C. elegans Consortium, 1998). S’ha de destacar que el genoma del cuc sembla bastant uniforme pel que fa al contingut de GC, que és pràcticament invariable al llarg de tots els cromosomes (al voltant d’un 36 %), a diferència del contingut de GC en vertebrats (Bernardi, 1995). A més, té un percentatge de seqüència codificant més alt que en l’humà, els introns i les seqüències reguladores són més petites i conté menys heterocromatina (més definició) que el genoma humà (Reinke i White, 2002). Una dada molt interessant que es va obtenir a partir de l’estudi del genoma del C. elegans és que aquest organisme conté un nombre de gens més alt del que s’havia predit. Com a referència tenim el genoma humà que, tot i contenir més de tres mil milions de bases de DNA (trenta vegades més gran que el genoma del cuc), «només» conté uns 30.000 gens (1,5 vegades més que el nombre de gens en C. elegans) (International Human Genome Consortium, 2004). Per què un animal suposadament «senzill» necessita uns 20.000 gens, si per fer un ésser humà sembla que amb 30.000 ja n’hi ha prou? Hi ha diverses raons que podrien explicar, almenys en part, per què aquestes dues espècies tenen un nombre de gens tan similar (revisat a Hodgkin, 2001). S’ha de tenir en compte que en el genoma humà hi ha una gran varietat de proteïnes gràcies a l’empalmament alternatiu (de l’anglès alTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

Caenorhabditis elegans: UNA HISTÒRIA FASCINANT 117

ternative splicing). L’empalmament consisteix a eliminar les seqüències intròniques del pre-mRNA i unir els exons que estan separats pels introns per tal de formar un mRNA madur que serà traduït a proteïna. L’empalmament alternatiu és una sofisticació del sistema en el qual alguns exons també poden ser eliminats juntament amb els introns fronterers. Això incrementa significativament les diferents formes de mRNA, i per tant, de proteïnes, que es poden obtenir d’un sol gen. Dels 30.000 gens que hi ha en els humans, de fet, es poden arribar a generar al voltant d’unes 100.000 proteïnes diferents. En C. elegans, tot i que aquest fenomen també s’hi dóna, és en una freqüència molt més baixa que en humans. Només s’ha pogut confirmar que succeeixi en un 4 % dels gens. Una altra diferència és que els gens humans tendeixen a codificar proteïnes que tenen diversos dominis funcionals, mentre que les proteïnes en C. elegans són generalment més senzilles i això fa necessari que diferents dominis siguin codificats per gens independents. Un altre factor important és que hi ha hagut diversos processos de duplicacions específics de la línia dels nematodes, i això fa que molts gens en el cuc s’hagin duplicat. Això genera famílies gèniques grans que poden dificultar els estudis genètics, ja que no seria suficient mutar un sol gen per anul·lar la funció i s’hauria de recórrer a mutants dobles o més complexos. S’ha de dir, però, que en el cas del C. elegans, en la majoria dels casos la redundància funcional és incompleta. És a dir, dos gens poden coincidir en algunes de les seves funcions, però cada un té com a mínim una funció específica que no té l’altre. Un bon exemple d’això el trobem en els dos receptors de Notch en el cuc, lin-12 i glp-1, que comparteixen algunes funcions durant l’embriogènesi però tenen funcions postembriòniques diferents (Kimble i Simpson, 1997). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

El 2002 es va poder accedir per primera vegada al genoma complet d’un altre nematode, el C. briggsae (Stein et al., 2003). Estudiar les relacions filogenètiques entre C. elegans i altres nematodes és important per a l’anàlisi comparada de comportament, morfologia, desenvolupament, mecanismes moleculars i de genomes (Gupta, 2007). Tot i que aquestes dues espècies van divergir d’un ancestre comú fa més de 100 milions d’anys, tenen un desenvolupament i una morfologia molt similar. De fet, comparteixen un 80 % d’identitat en seqüències que estan sota una gran pressió per conservar-se però només un 30 % d’identitat en altres parts del genoma (Kent i Zahler, 2000). L’estudi comparatiu entre C. briggsae i C. elegans pot permetre inferir característiques específiques de cada espècie, però també pot donar informació sobre quines característiques s’han conservat al llarg de l’evolució i quines s’han quedat restringides als nematodes. C. elegans i malalties humanes Es pot utilitzar C. elegans com a organisme model per estudiar malalties humanes? El millor organisme per estudiar com es desenvolupen malalties i per analitzar tractaments és, segurament, el ratolí, ja que representa el model més semblant que tenim a l’ésser humà. Tanmateix, l’estudi d’organismes més senzills pot ser d’una gran ajuda per estudiar funcions bàsiques dels gens o per identificar els membres implicats en una via metabòlica. Una de les raons utilitzades en contra de l’ús del C. elegans en aquest camp és la idea que un cuc i un humà són tan diferents que no és possible que tinguin res en comú. Gràcies a la genòmica comparada s’ha identificat que entre un 60-80 % dels gens implicats en alguna malaltia humana tenen un gen homò-

118 D. DALFÓ

leg en C. elegans (Lai et al., 2000; Culetto i Sattelle, 2000). Aquests estudis van revelar una gran i sorprenent conservació a escala molecular i de processos cel·lulars entre l’ésser humà i el cuc que permet l’ús del C. elegans en aquests estudis. A més, s’ha de recordar que, malgrat que el cuc és un organisme «senzill», té una fisiologia basada en la formació d’òrgans, com la que té l’ésser humà. Per tant, C. elegans pot ser un model per a malalties molt valuós sempre que la malaltia es pugui definir a escala molecular. La genòmica comparada també ha servit per identificar en C. elegans els ortòlegs de molts gens implicats en malalties humanes (els ortòlegs són gens que es troben en dues espècies i que han evolucionat directament a partir d’un sol gen que es trobava en l’ancestre comú). D’acord amb el grau de conservació de seqüència entre dos gens es pot predir la probabilitat que comparteixin la mateixa funció. Malauradament, l’evolució d’aquesta no sempre és paral·lela a l’evolució de la seqüència. Per tant, per decidir si C. elegans és un bon model per a una malaltia específica no s’hauria d’utilitzar el grau de conservació de la seqüència com a criteri únic. Com a exemple tenim el receptor GABA, que està implicat en l’epilèpsia i que, per tant, és un destinatari important de les drogues antiepilèptiques. Aquesta funció està conservada independentment del grau de conservació de la seqüència. En un primer moment els programes informàtics per identificar ortòlegs en C. elegans no van identificar el gen unc-49 com a ortòleg del receptor humà GABA, la qual cosa hauria suggerit que C. elegans no era un bon model per estudiar l’epilèpsia. Tanmateix, estudis d’aquest gen en el cuc han aportat molta informació sobre la ruta metabòlica GABA. És cert que la situació contrària també existeix: en una família gènica gran, com per exemple la família dels receptors

nhr (de l’anglès nuclear hormone receptors), és molt difícil d’assenyalar quin gen és l’autèntic ortòleg, encara que la seqüència entre el cuc i l’ésser humà estigui altament conservada (revisat a Kaletta i Hengartner, 2006). Una altra de les limitacions en l’ús d’aquest organisme és que no es pot esperar que pugui recapitular tots els símptomes característics de les malalties humanes, però els estudis de genètica, tan fàcils en el cuc i gairebé tan impossibles en l’ésser humà, ajudaran a tenir més informació sobre la base genètica de les malalties humanes. A continuació es donen alguns exemples que demostren que aquest organisme pot ser molt útil per a aquest tipus d’estudis si se’n coneixen els avantatges i les limitacions com a organisme model. El gen humà DPC4, implicat en el carcinoma del pàncrees, és similar al gen sma-4 de C. elegans. Els experiments fets amb aquest organisme demostren que aquest gen forma part de la ruta metabòlica del TGF-β (transforming growth factor β), que controla el creixement (Savage et al., 1996). Per tant, una mutació en el gen DPC4 podria causar càncer per una alteració en el senyal del TGF-β. Més estudis en C. elegans poden donar informació directa de com funcionen els gens humans. C. elegans també ha tingut un paper important en els estudis sobre la malaltia d’Alzheimer. La proteïna humana pèptid β-amiloide, que està implicada en aquesta malaltia, ha estat expressada amb èxit en C. elegans (Link, 1995). Prèviament als estudis fets amb C. elegans es considerava que l’acumulació del pèptid β-amiloide era un marcador per a la malaltia i segurament era el primer pas per desenvolupar-la. Diversos estudis fets amb el cuc van demostrar que aquesta acumulació és més aviat el resultat d’una resposta cel·lular per eliminar proteïnes que no són correctes i, per tant, és la conseqüència d’una disfunció Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

Caenorhabditis elegans: UNA HISTÒRIA FASCINANT 119

cel·lular, més que ser l’iniciador del problema (Cohen et al., 2006). L’obesitat és un dels problemes més greus del nostre temps i els pronòstics per al futur no són gaire bons. Tots els organismes han d’arribar a un equilibri entre l’energia que entra amb el menjar i la que s’utilitza per sobreviure. Moltes de les proteïnes implicades en la formació, el transport i l’ús dels greixos estan altament conservades entre els nematodes i els mamífers. L’ús del C. elegans ha permès la identificació de nous gens necessaris per a l’equilibri de l’energia. A més, el fet que el sistema nerviós d’aquest organisme sigui més senzill que l’humà el fa un sistema atractiu per estudiar com els organismes detecten nutrients i canvien el seu comportament per adaptar-s’hi. Depenent de si hi ha menjar o no, els cucs alteraran la velocitat amb la qual s’alimenten, amb la qual es mouen, i també el nombre d’ous generats. Molts dels components necessaris per a aquests canvis de comportament també són responsables del comportament de l’ésser humà respecte al menjar, com per exemple la serotonina (Jones i Ashrafi, 2009). També s’ha utilitzat C. elegans per estudiar gens implicats en l’esperança de vida. S’han identificat uns cent gens que quan estan mutats incrementen l’esperança de vida del cuc. Entre aquests destaca el paper de la insulina (Hamilton et al., 2009). Tots els animals estan exposats a una gran varietat de microbis i han desenvolupat complexes respostes immunitàries per protegir-se. En els vertebrats hi ha dos tipus de respostes: la innata i l’adaptada. Mentre que la segona és específica dels vertebrats, la primera és la més universal i la que reacciona abans. C. elegans és un bon model per estudiar quins gens són importants per protegir-se dels patògens. A part de les barreres físiques com la hipodermis Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

o la faringe (extremadament eficaç en triturar microorganismes) hi ha com a mínim sis vies metabòliques que s’activen depenent del tipus d’infecció: TGF-β, insulina, mort cel·lular programada i tres vies diferents de MAP-cinases. També té un paper important el sistema nerviós, que permet al cuc detectar ambients no saludables i apartar-se’n per moure’s cap a ambients més bons. Algunes d’aquestes respostes poden ser específiques del C. elegans però d’altres poden representar respostes conservades al llarg de l’evolució que ens poden ajudar a combatre infeccions en l’ésser humà (Gravato-Nobre i Hodgkin, 2005). C. elegans també ha contribuït amb estudis fets sobre el Parkinson, la distròfia muscular, la malaltia de Huntington, el càncer, la diabetis, la depressió, etc. (revisat a Kaletta i Hengartner, 2006). Sobretot en aquest últim cas ha estat molt útil el desenvolupament dels cribratges amb components químics. Això ha permès analitzar el paper d’algunes drogues (com alguns antidepressius) i buscar mutacions de manera eficaç i ràpida que facin que el cuc sigui insensible o hipersensible a la droga. El gran avantatge d’utilitzar C. elegans és que permet estudiar in vivo els efectes del component químic en un organisme sencer i és suficientment simple perquè se’n pugui fer la dissecció del mecanisme d’acció amb tot detall. L’altre avantatge és que permet eliminar components tòxics en els primers estudis d’acció, i s’estalvien així els estudis en organismes més complexos (revisat a Ahringer, 1997). Voldria acabar amb una reflexió personal. L’objectiu d’aquest capítol era mostrar el gran potencial del C. elegans com a organisme model i ensenyar les múltiples possibilitats que hi ha d’utilitzar-lo. Espero haver pogut transmetre com és de fascinant la història d’aquest «senzill» cuc i com és d’apassionant la ciència en general. Perso-

120 D. DALFÓ

nalment crec que el fet que hi hagi tants processos conservats entre l’ésser humà i el cuc, i que tants aspectes de la vida es puguin estudiar en C. elegans, tot i que no tots, no deixa de ser una lliçó moral per a nosaltres, els humans. Finalment, espero que el nostre amic C. elegans s’hagi guanyat el respecte dels lectors. BIBLIOGRAFIA Ahringer, J. (1997). «Turn to the worm!» Curr. Opin. Genet. Dev., 7: 410-415. Antoshechkin, I.; Sternberg, P. W. (2007). «The versatile worm: genetic and genomic resources for Caenorhabditis elegans research». Nat. Rev. Genet., 8: 518-532. Baltimore, D.; Becker, Y.; Darnell, J. E. (1964). «Virus-specific double-stranded RNA in poliovirus-infected cells». Science, 143: 1034-1036. Bernardi, G. (1995). «The human genome: organization and evolutionary history». Annu. Rev. Genet., 29: 445-476. Boutros, M.; Ahringer, J. (2008). «The art and design of genetic screens: RNA interference». Nat. Rev. Genet., 9: 554-566. Chalfie, M. (2009). «GFP: lighting up life». Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 48: 5603-5611. Chalfie, M.; Tu, Y.; Euskirchen, G.; Ward, W.; Prasher, D. C. (1994). «Green fluorescent protein as a marker for gene expression». Science, 263: 802805. Cohen, E.; Bieschke, J.; Perciavalle, R. M.; Kelly, J. W.; Dillin, A. (2006). «Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity». Science, 313: 1604-1610. Culetto, E.; Sattelle, D. B. (2000). «A role for C. elegans in understanding the function and interactions of human disease genes». Hum. Mol. Genet., 9: 869-877. Fire, A.; Xu, S.; Montgomery, M. K.; Kostas, S. A.; Driver, S. E.; Mello, C. C. (1998). «Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans». Nature, 391: 806811. Gravato-Nobre, M. J.; Hodgkin, J. (2005). «Caenorhabditis elegans as a model for innate immunity to pathogens». Cell Microbiol., 7: 741-751. Green, P.; Lipman, D.; Hillier, L.; Waterston, R.; States, D.; Claverie, J. M. (1993). «Ancient con-

served regions in new gene sequences and the protein databases». Science, 259: 1711-1716. Gupta, B. P. (2007). «Genomics and biology of the nematode C. briggsae». WormBook [ed.]. The C. elegans Research Community, WormBook. DOI: 10. 1895/wormbook.1.136.1. Hamilton, B. [et al.] (2005). «A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans». Genes Dev., 19: 1544-1555. Hirsh, D.; Oppenheim, D.; Klass, M. (1976). «Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans». Dev. Biol., 49: 200-219. Hodgkin, J. (2001). «What does a worm want with 20,000 genes?» Genome Biol., 2: 1-4. Hodgkin, J.; Herman, R. K. (1998). «Changing styles in C. elegans genetics». Trends Genet., 14: 352-357. Hubbard, E. J. A. (2007). «Caenorhabditis elegans germ line: a model for stem cell biology». Dev. Dyn., 236: 3343-3357. Hubbard, E. J. A.; Greenstein, D. (2005). «Introduction to the germ line». WormBook [ed.]. The C. elegans Research Community, WormBook. DOI: 10. 1895/wormbook.1.18.1. International Human Genome Sequencing Consortium. (2004). «Finishing the euchromatic sequence of the human genome». Nature, 431: 931945. Jones, K. T.; Ashrafi, K. (2009). «Caenorhabditis elegans as an emerging model for studying the basic biology of obesity». Dis. Model Mech., 2: 224-229. Jorgensen, E. M.; Mango, S. E. (2002). «The art and design of genetic screens: Caenorhabditis elegans». Nat. Rev. Genet., 3: 356-369. Kaletta, T.; Hengartner, M. O. (2006). «Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism». Nat. Rev. Drug Discov., 5: 387-398. Kent, W. J.; Zahler, A. M. (2000). «Conservation, regulation, synteny, and introns in a large-scale C. briggsae-C. elegans genomic alignment». Genome Res., 10: 1115-1125. Kimble, J.; Simpson, P. (1997). «The LIN-12/Notch signaling pathway and its regulation». Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 13: 333-361. Lai, C. H.; Chou, C. Y.; Chang, L. Y.; Liu, C. S.; Lin, W. (2000). «Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics». Genome Res., 10: 703-713. Link, C. D. (1995). «Expression of human β-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 9368-9372. Mello, C. C.; Kramer, J. M.; Stinchcomb, D.; Ambros, V. (1991). «Efficient gene transfer in C. eleTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

Caenorhabditis elegans: UNA HISTÒRIA FASCINANT 121 gans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences». EMBO J., 10: 3959-3970. Morise, H.; Shimomura, O.; Johnson, F. H.; Winant, J. (1974). «Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea». Biochemistry, 13: 2656-2662. Parrish, S.; Fleenor, J.; Xu, S.; Mello, C.; Fire, A. (2000). «Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference». Mol. Cell., 6: 10771087. Reinke, V.; White, K. P. (2002). «Developmental genomic approaches in model organisms». Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 3: 153-178. Rich, A.; Davies, D. R. (1956). «A new two-stranded helical structure: polyadenylic acid and polyuridylic acid». J. Am. Chem. Soc., 78: 3548-3549. Riddle, D. L.; Blumenthal, T.; Meyer, B. J.; Priess, J. R. (1997). C. elegans II. Plainview: Cold Spring Laboratory Press. Savage, C.; Das, P.; Finelli, A. L.; Townsend, S. R.; Sun, C. Y.; Baird, S. E.; Padgett, R. W. (1996). «C. elegans genes sma-2, sma-3, and sma-4 define a conserved family of TGF-β pathway components». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 790-794. Shimomura, O.; Johnson, F. H.; Saiga, Y. (1962). «Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea». J. Cell. Comp. Physiol., 59: 223-239.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 107-121

Stein, L. D. [et al.] (2003). «The genome sequence of Caenorhabditis briggsae: a platform for comparative genomics». PLoS. Biol., 1: e45. Sulston, J. (1988). «Cell lineage». A: Wood, W. B. [ed.]. The Nematode Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 123-155. Sulston, J. E.; Horvitz, H. R. (1977). «Post-embryonic cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans». Dev. Biol., 56: 110-156. Tabara, H.; Grishok, A.; Mello, C. C. (1998). «RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence». Science, 282: 430-431. The C. elegans Sequencing Consortium. (1998). «Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology». Science, 282: 2012-2018. Timmons, L.; Fire, A. (1998). «Specific interference by ingested dsRNA». Nature, 395: 854. White, J. G.; Southgate, E.; Thomson, J. N.; Brenner, S. (1986). «The structure of the nervous system C. elegans». Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 314: 1-340. Wood, W. B. (1988a). «Introduction to C. elegans biology». A: Wood, W. B. [ed.]. The Nematode Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1-16. ― (1988b). The Nematode Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

DOI: 10.2436/20.1501.02.108

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 123-130

Drosophila melanogaster COM A ORGANISME MODEL: UNA FONT D’INFORMACIÓ EN RECERCA BIOMÈDICA Florenci Serras 1 i Jordi Casanova 2 1

Departament de Genètica, Facultat de Biologia, Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona 2 Institut de Biologia Molecular de Barcelona (CSIC), Institut de Recerca Biomèdica, Barcelona Adreça per a la correspondència: Florenci Serras. Departament de Genètica, Facultat de Biologia, Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: fserras@ub.edu. RESUM Drosophila melanogaster és un exemple d’organisme model des de fa més de cent anys. S’ha utilitzat des d’aleshores com a sistema per investigar alguns dels principis fonamentals de la genètica, la biologia molecular, l’enginyeria genètica, la biologia del desenvolupament i l’evolució. Però en les darreres dècades, Drosophila ha esdevingut un element clau com a font d’informació per entendre les bases genètiques en la recerca biomèdica. En aquest article discutirem alguns exemples de l’ús d’aquest organisme model. Paraules clau: Drosophila, desenvolupament, genètica, biomedicina. Drosophila melanogaster AS A MODEL SYSTEM: A SOURCE OF INFORMATION FOR BIOMEDICAL RESEARCH SUMMARY Drosophila melanogaster is an example of model organism since a hundred years ago. It has been used as a model system to investigate the basic principles of genetics, molecular biology, genetic engineering, developmental biology and evolution. But in the last decades, Drosophila has become key for the understanding of the genetic basis of diseases in biomedical research. In this article we will discuss some of the relevant features of Drosophila as model organism. Key words: Drosophila, development, genetics, biomedicine.

Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

124 F. SERRAS I J. CASANOVA

INTRODUCCIÓ Avui, l’any 2011, la mosca del vinagre, o Drosophila melanogaster en la nomenclatura científica, és una eina útil per adreçar pràcticament qualsevol recerca de tipus biomèdic. Aspectes tan diferents com les malalties neurodegeneratives, el càncer, la drogoaddicció, les malalties metabòliques o fins i tot els estudis sobre el canvi climàtic són exemples en què Drosophila ha contribuït a conèixer-ne les causes. I no és només la varietat de temes d’estudi el que ha donat rellevància a Drosophila, sinó també la seva potència com a eina amb repercussions cada vegada més significatives. Un organisme model ha de tenir dues propietats. Primer, ha de ser útil perquè les conclusions dels estudis que s’hi fan siguin de rellevància general i, en el cas de la recerca biomèdica en particular, han de tenir implicacions per als humans. I segona, ha de permetre fer estudis i experiments de manera que es combinin la senzillesa amb la potència i sofisticació de les tècniques emprades, en un grau que no seria possible per a aquelles altres espècies per a les quals aquest organismes es vol establir com a model. Aquestes propietats es troben presents en Drosophila. L’elecció d’un organisme com a model pot haver estat en alguns casos fins i tot fortuïta en el seu origen. És l’ús el que acaba decidint o no la utilitat, de vegades per la descoberta d’algunes propietats que no eren conegudes en el moment de la tria. No és sorprenent aleshores que, en un exemple de mecanisme d’autoalimentació, un bon organisme model és aquell del qual se’n sap més i, per tant, com més s’empra més bon model esdevé. Aquest és clarament el cas de Drosophila melanogaster. En aquesta revisió repassarem a grans trets com la història l’ha portat a desenvolupar el paper d’organisme mo-

del alhora que intentarem explicitar alguns exemples que en posin de manifest la utilitat com a model en la recerca biomèdica. També farem un repàs de l’us de Drosophila com a eina en l’ensenyament. ELS ORÍGENS DE Drosophila COM A MODEL Des del descobriment de les lleis bàsiques de la genètica inferides a partir dels treballs de Gregor Mendel (1822-1884) en plantes, es va creure convenient la necessitat d’utilitzar un organisme animal en què es pogués experimentar el comportament dels gens. Calia que aquest organisme tingués un cicle vital relativament curt, que es poguessin alterar els gens (mutacions) i analitzar els efectes en la descendència i que fos de fàcil manteniment al laboratori. El biòleg nord-americà Thomas Hunt Morgan (1866-1945) va presentar Drosophila com a model animal per investigar i entendre las bases de l’herència en els animals (Morgan, 1910). De fet, la introducció de Drosophila als laboratoris havia estat més aviat per a estudis de morfologia o embriologia però Morgan, a la Universitat de Columbia a Nova York, va fer servir aquest organisme com a eina experimental per formular amb tres dels seus estudiants més destacats, A. H. Sturtevant, C. B. Bridges i H. J. Muller, una teoria que revolucionaria la biologia: la teoria cromosòmica de l’herència. El que és més remarcable dels seus estudis és que amb tan sols encreuaments de mosques mutants van arribar a descobrir que els caràcters es troben en els cromosomes i que aquests s’hereten de generació en generació. L’any 1933 T. H. Morgan va rebre el Premi Nobel de Fisiologia o Medicina per «els seus descobriments relacionats amb el paper que tenen els cromosomes en l’herència». Però no tan sols la teTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 123-130

D. melanogaster COM A ORGANISME MODEL: UNA FONT D’INFORMACIÓ EN RECERCA BIOMÈDICA 125

oria cromosòmica de l’herència, sinó que molts dels principis bàsics de la genètica actual, com la naturalesa del gen, la recombinació i segregació meiòtica dels cromosomes, el lligament genètic, la mutagenicitat de les radiacions ionitzants, es van descriure a partir d’investigacions fetes en Drosophila per l’equip de Morgan entre l’any 1910 i el final dels anys trenta. Així doncs, l’ús de Drosophila melanogaster té una història de més de cent anys i, per tant, és la més llarga de qualsevol organisme model en genètica. Aquest aspecte és important no solament pel temps que fa que s’usa al laboratori sinó perquè nombrosos centres arreu la utilitzen actualment. És més, en l’era de la tecnologia del DNA recombinant, el paper de Drosophila ha estat crític. Fragments de DNA de Drosophila va estar entre els primers dels eucariotes a ser clonats i caracteritzats, i en estudis capdavanters es van fer correspondre fenotips de l’animal amb lesions moleculars en el genoma. Però un dels impactes més rellevants de l’ús de Drosophila en les darreres dècades és que la recerca sobre els mecanismes de control de la senyalització i la proliferació cel·lular han permès descobrir factors que estarien estretament relacionats amb el càncer, les malalties cardiovasculars, o els desordres neurològics o la neurodegeneració i l’envelliment, entre altres. EL CICLE VITAL DE Drosophila El cicle vital de Drosophila inclou la fecundació, l’embrió, els estadis larvaris, la pupa i l’adult (vegeu la figura 1). El període de desenvolupament de Drosophila melanogaster varia amb la temperatura, com és el cas d’altres espècies d’animals ectotèrmics. En condicions òptimes, el temps de desenvolupament (des de la fecundació Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 123-130

fins a l’adult, o cicle vital complet) a 25 °C és de nou dies i a 18 °C és de dinou. El temps menor de desenvolupament és de set dies i s’assoleix a 28 °C. El temps de desenvolupament augmenta a temperatures més altes (onze dies a 30 °C) per l’estrès tèrmic. A la natura, les femelles ponen uns 400-500 ous, que són d’uns 0,5 mm de llarg, sobre fruites o fongs en descomposició. El desenvolupament embrionari s’inicia amb la fecundació. El nucli haploide del mascle es fusiona amb el de l’oòcit per donar la composició diploide que caracteritza l’espècie. Durant les primeres dues hores de desenvolupament postfecundació, els nuclis diploides es divideixen, i donen lloc a un embrió amb múltiples nuclis (estadi de blastoderma sincicial). Posteriorment aquests nuclis migren en direcció a la superfície de l’ou, on les membranes cel·lulars els envolten (blastoderma cel·lular). Seguidament s’inicia la gastrulació. Els moviments propis de la gastrulació faran que els principals òrgans i teixits es disposin ordenadament al lloc que els correspon. En aquest procés es veuen implicats tots els derivats dels fulls blastodèrmics, com els de l’ectoderma (p. ex., epidermis, derivats de l’epidermis i sistema nerviós), endoderma (p. ex., sistema digestiu), mesoderma (p. ex., musculatura), a més de les cèl·lules de la la línia germinal. A 25 °C els embrions desclouen a les 22-24 h després de la fecundació i en surten les larves, que creixen al voltant de quatre dies més. Hi ha tres estadis larvaris, L1, L2 i L3, que tenen una durada de 24, 24 i 48 h, respectivament. Les L1 s’alimenten de la superfície del medi i només començaran a excavar caus per ingerir els nutrients quan muden a L2. Després de 24 h en L2, la larva muda de nou per convertir-se en larva L3. Durant el períodes de L2 i L3 les larves s’alimenten contínuament. Només al final de L3, les

126 F. SERRAS I J. CASANOVA

larves entren en un estadi errant, en el qual deixen la font d’aliment i cerquen un indret on inicien la pupació. L’estadi de pupa dura uns cinc dies. Durant aquest temps es produeix la metamorfosi, o canvi de larva a adult. Quan un adult surt de la pupa, tots els òrgans estan completament formats. Per tancar el cicle, cal esmentar que les femelles es tornen receptives als mascles a les 8-12 h després de l’eclosió de la pupa. A partir d’aquest moment ja poden copular, pondran ous, i el cicle comença de nou. Els mascles reprodueixen una seqüència de patrons estereotipats de comportament abans de la còpula. En primer lloc, els mascles estenen horitzontalment les seves ales i les fan vibrar amb intensitat. Poc després, el mascle se situa a la part posterior de l’abdomen de la femella per contactar els genitals femenins i iniciar la còpula. La durada mitjana de la còpula és de 30 min, durant els quals els mascles transfereixen uns quants centenars d’espermatozoides a la femella. Les femelles emmagatzemen l’esperma en un recipient tubular i en dues

Figura 1. Cicle vital de Drosophila melanogaster (imatge de FlyMove).

espermateques. Els ous són fecundats al seu pas per l’oviducte, i són conduïts fins a dipositar-se sobre alguna font d’aliment. Per a més informació vegeu Ashburner et al. (2005). Drosophila I LA RECERCA BIOMÈDICA Avui sabem que la gran majoria de les malalties humanes tenen un component genètic. No obstant això, malgrat que les mutacions en gens específics s’associen a certes malalties, en molts casos l’etiologia és poc coneguda. Un organisme relativament simple com Drosophila, en què es poden aplicar tècniques genètiques, cel·lulars o moleculars, ha esdevingut una eina per analitzar el funcionament dels productes gènics en condicions normals i en condicions patològiques en un entorn cel·lular força semblant al dels humans. Però com es pot utilitzar un organisme que és tan diferent dels humans per entendre malalties que ens afecten? Un aspecte clau, que va marcar un abans i un després, va ser la seqüenciació del genoma de Drosophila (Adams et al., 2000) i la del genoma humà (Venter et al., 2001). Aquestes dades han permès establir que la gran majoria dels gens de Drosophila són homòlegs a gens humans. I per tant, podem tenir informació útil de l’acció d’aquests gens humans mitjançant l’estudi dels seus homòlegs en Drosophila. I fer-ho en un entorn cel·lular i tissular que, malgrat les diferències, té prou semblances per permetre treure conclusions aplicables als mamífers i en concret als humans. Les seqüències dels genomes són de domini públic i els investigadors hi poden accedir fàcilment i establir les correspondències entre els gens dels organismes model i els gens involucrats en els mecanismes de les malalties humanes Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 123-130

D. melanogaster COM A ORGANISME MODEL: UNA FONT D’INFORMACIÓ EN RECERCA BIOMÈDICA 127

(Reiter et al., 2001). A partir d’aquí es pot manipular en Drosophila el funcionament d’un gen homòleg al d’un gen humà relacionat amb una determinada malaltia i analitzar com el funcionament d’aquest gen afecta la fisiologia cel·lular en condicions normals i patològiques. En concret un disseny experimental canònic i força utilitzat actualment arreu seria: a) cercar un gen d’interès que es vegi alterat en una malaltia humana, b) cercar-ne l’homòleg en Drosophila, c) generar mosques mutants per a aquest gen utilitzant tècniques d’enginyeria genètica, d) estudiar-ne els defectes a escala cel·lular i molecular i e) veure en mamífers (p. ex., ratolins) si l’alteració descrita en Drosophila també s’hi dóna. Aquest tipus de disseny permet esbrinar les causes de la malaltia i, per tant, dissenyar fàrmacs específics o teràpies concretes que puguin pal·liar la funció alterada d’un gen. A continuació presentem alguns exemples de l’ús de Drosophila en estudis biomèdics, començant per alguns en l’àmbit del que es considera recerca de tipus més bàsic fins a d’altres ja més clarament orientats a possibles aplicacions pràctiques. Desenvolupament embrionari i malformacions congènites Quin va ser el detonant per pensar que es podien utilitzar mosques per entendre l’acció gènica en les malalties humanes? Ed Lewis (1918-2004), Premi Nobel el 1995, va descobrir i analitzar alguns dels gens més rellevants que estan implicats en el desenvolupament del patró corporal de Drosophila. En concret, gens que s’encarreguen de l’organització i disseny de les diferents parts de l’individu. Els primers que va trobar són el gens del complex Bithorax, un conjunt de gens que donen a diverses parts o segments del cos les instruccions del proTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 123-130

grama de desenvolupament que han de seguir (Lewis, 1978; Sánchez-Herrero et al., 1985). Si un d’aquests gens no funciona correctament en el segment que li pertoca, aquest segment produirà components que corresponen a un altre segment. Per exemple, mutacions en el gen Ultrabithorax originaven mosques amb un parell d’ales extra perquè el tercer segment toràcic, un segment que no té ales, es transforma en un nou segon segment toràcic, que és el que té ales. D’aquesta manera obtenim una mosca que en lloc de tenir un segon i un tercer segments toràcics té dos segons segments toràcics, i per tant, dos parells d’ales. Aquest tipus de transformacions són anomenades transformacions homeòtiques. És important recalcar que les transformacions homeòtiques no produeixen estructures anòmales o estranyes; són estructures perfectament normals però que apareixen en un lloc que no és el seu, en substitució d’aquelles estructures que normalment hi haurien de ser. Les transformacions homeòtiques es deuen bàsicament a mutacions en gens dels complexos Bithorax i Antenapedia. Els gens d’aquests complexos s’expressen en un patró altament ordenat, des de la part anterior del cos, on es formarà el cap, fins a la posterior o abdominal. És a dir, l’organització anteroposterior d’aquests gens controla l’organització anteroposterior del cos de l’animal (cap, segments toràcics, segments abdominals). Aquests gens, anomenats gens Hox, contenen una seqüència que codifica un domini d’unió al DNA, l’homeobox (McGinnis et al., 1984; Scott i Weiner, 1984). D’aquesta manera, els productes dels gens Hox poden regular la transcripció d’altres gens específics, que són els que acaben executant les funcions que donen a cada segment les seves característiques pròpies i diferencials. Doncs bé, s’ha vist que en mamífers, inclosos els humans, els

128 F. SERRAS I J. CASANOVA

homòlegs dels mateixos gens també s’expressen en una distribució anteroposterior com ho fan en les mosques (Krumlauf, 1992; Gellon i McGinnis, 1998; Alexander et al., 2009). Així, gens que en la mosca són responsables del desenvolupament de les parts posteriors del cos també s’expressen i són responsables de desenvolupar les parts posteriors del cos en els humans, i aquells que s’expressen en la zona anterior de la mosca ho fan així mateix en els humans. Més encara, s’ha vist que els Hox tenen la funció conservada entre totes dues espècies. Per exemple, una mosca deficient per a un gen Hox, i que per tant hauria de presentar una transformació homeòtica, es desenvoluparà normalment si s’hi activa de manera adequada el gen homòleg humà, tot demostrant que la funció del gen en humans i en mosques és la mateixa, o com a mínim molt similar. Aquest tipus d’estudis van permetre concloure que el circuit genètic encarregat d’organitzar l’embrió està, a grans trets, molt conservat evolutivament. Aquesta conservació funcional té implicacions fonamentals. Malformacions congènites en els humans s’han correlacionat amb mutacions en els gens Hox. I avui entenem les causes a escala cel·lular i molecular d’aquestes malformacions gràcies als estudis de les mutacions en els gens homòlegs en Drosophila. Càncer El primer exemple d’un gen supressor de tumors el va obtenir E. Gateff en estudiar una mutació recessiva que causava tumors en diferents òrgans de la larva, entre els quals el cervell, i que va anomenar lethal giant larve (lgl). El que va ser més impactant era que en trasplantar els tumors cerebrals a un organisme normal, els tumors

s’escampaven, envaïen l’hoste, un procés similar al de les metàstasis humanes (Gateff, 1978). Així doncs, el procés de tumorigènesi i metàstasi es podia estudiar en Drosophila. Anys més tard es va trobar que l’homòleg de lgl en ratolins provocava tumors neuronals embrionaris (Klezovitch et al., 2004) i que lgl, així com altres gens supressors de tumors neuronals, estarien implicats a regular la divisió asimètrica de les cèl·lules mare neuronals, i en cas de mutació, es generaria un excés d’aquestes cèl·lules mare que portarien a un sobrecreixement del teixit neuronal. Aquest és un camp que actualment està en plena efervescència. Després d’aquests treballs pioners, altres estudis han permès identificar altres gens fonamentals per entendre els processos tumorigènics. Més específicament, s’han pogut començar a establir models adequats per a tumors que es desenvolupen en diferents teixits humans. Només un darrer exemple en aquest apartat. Un punt on es concentra actualment una forta recerca és en la relació que té la transició epiteli-mesènquima (EMT, per les seves inicials en anglès) en el procés de tumorigènesi i metàstasi. L’EMT és un procés mitjançant el qual cèl·lules de naturalesa epitelial adquireixen propietats mesenquimàtiques, tot perdent l’adhesió entre si i adquirint la capacitat de migrar. L’EMT es dóna normalment durant el desenvolupament embrionari i es pensa que l’activació fora de temps i de lloc podria ser una causa de malignitat. Doncs bé, el gen principal responsable d’iniciar l’EMT és el gen snail, identificat en la formació del mesoderma en Drosophila, i l’alta expressió de gens homòlegs de snail es troba associada a molts processos tumorals. De la Drosophila als humans, de la ciència bàsica a la medicina.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 123-130

D. melanogaster COM A ORGANISME MODEL: UNA FONT D’INFORMACIÓ EN RECERCA BIOMÈDICA 129

Drosophila com a eina per entendre les bases de la drogoaddicció La drogoaddicció és un del problemes socials i mèdics de més ressò. Encara que milions de persones moren anualment per les conseqüències de la drogoaddicció, les estratègies per combatre i entendre aquest problema són encara limitades i poc eficients. Això és per diverses raons. En primer lloc perquè no es considera plenament com una malaltia. Segon, encara que se sap que hi ha tant factors genètics com de l’entorn que contribueixen a la predisposició, els factors genètics semblen complexos i desconeguts. I tercer, es desconeixen els canvis cel·lulars i moleculars del cervell que porten a la drogoaddicció. A partir dels anys noranta es va utilitzar Drosophila per estudiar els mecanismes que porten a canvis en el sistema nerviós per exposició repetida a drogues. L’aproximació experimental es va basar en dues assumpcions: la primera, que els gens que podrien ser responsables de les addiccions estarien conservats evolutivament. La segona, que estudiant comportaments o conductes simples que responen a drogues es podrien entendre fenòmens més complexos com l'addicció. Un exemple és l’addicció a l’alcohol. Fins fa poc es creia que l’etanol tenia efectes poc específics, que s’intercalava a la capa lipídica de les membranes cel·lulars i n’alterava la fluïdesa, i la funció de les proteïnes associades. Però actualment se sap que l’etanol actua de manera molt directa i específica sobre proteïnes, com el cas d’alguns canals i receptors (Wolf i Heberlein, 2003). Per tant, el repte per als investigadors va ser esbrinar com l’efecte directe de l’etanol sobre proteïnes en el sistema nerviós pot portar a comportaments com l’addicció. A l’hàbitat natural, Drosophila viu en un entorn on hi ha alcohol en fermentació, Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 123-130

amb un percentatge de fins al 6 % d’etanol, que pot metabolitzar i utilitzar com a font d’energia. En primer lloc es coneixen comportaments induïts per la droga (en aquest cas, l’etanol), que es poden quantificar amb assaigs al laboratori. En segon lloc, es poden utilitzar col·leccions de mutants per veure si aquells comportaments estimats i quantificats varien. Tercer, un cop s’aïllen mutants que alteren el comportament, es poden identificar els gens afectats per la mutació. En paral·lel es poden estudiar les anomalies cel·lulars i moleculars que provoca la droga en el sistema nerviós i també analitzar si determinades mutacions incrementen o disminueixen aquests efectes. Això porta a identificar quins són els mecanismes cel·lulars i moleculars responsables. Finalment els gens aïllats es poden estudiar en mamífers, com en els ratolins, per veure si els fenòmens descrits es reprodueixen. En certa manera, aquests estudis sobre drogoaddicció es poden considerar un cas especial dels estudis de comportament i, més encara, del control genètic de la conducta. Aquests estudis que fa temps que es prossegueixen en Drosophila últimament han permès començar a establir una correspondència entre una determinada conducta, l’acció d’un determinat gen, i un determinat circuit neuronal. Aquests resultats obren noves possibilitats en l’estudi del funcionament del sistema nerviós i la conducta. Drosophila com a eina en l’ensenyament Un dels punts destacats de Drosophila com a organisme model és la seva utilitat en l’ensenyament, tant a les escoles com a la universitat. Permet als estudiants l’observació del dimorfisme sexual, aparellar mascles i femelles i uns deu dies després

130 F. SERRAS I J. CASANOVA

de la fecundació obtenir embrions i seguir el cicle fins a assolir l’adult. L’ús de mutants, d’al·lels recessius i dominants, de caràcters lligats als sexe, de dihibridisme, etc., permet als estudiants apropar-se a la genètica d’una manera relativament fàcil. Un aspecte fonamental és que tant per a la docència com per a la recerca hi ha una gran disponibilitat de mutants que es mantenen en centres especialitzats (Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University (http://flystocks.bio.indiana.edu), i dels quals es pot treure informació a FlyBase (http://flybase.bio.indiana.edu). Hi ha gran varietat de recursos docents a Internet, així com webs interactives i d’animacions, entre les quals cal destacar FlyMove (http://flymove.uni-muenster.de). Es tracta d’una eina interactiva per a l’estudi de la genètica i el desenvolupament embrionari de D. melanogaster, dissenyada per a estudiants universitaris i professors. Conté imatges, vídeos i animacions interactives que faciliten la comprensió de processos biològics complexos. També cal esmentar webs interactives on es poden dissenyar encreuaments entre diversos genotips per a estudis bàsics de genètica (Simple Mendelian Genetics: http://math.hws.edu/javamath/ryan/ Genetics1.html; Drosophila Science Course: http://www.sciencecourseware.org/vcise/ drosophila/index.html). BIBLIOGRAFIA Adams, M. D. [et al.] (2000). «The genome sequence of Drosophila melanogaster». Science, 287: 21852195.

Alexander, T.; Nolte, C.; Krumlauf, R. (2009). «Hox genes and segmentation of the hindbrain and axial skeleton». Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 25: 431-456. Ashburner, M.; Golic, K. G.; Hawley, R. S. (2005). Drosophila. A laboratory manual. Cold Spring Harbor, Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gateff, E. (1978). «Malignant neoplasms of genetic origin in Drosophila melanogaster». Science, 200: 1448-1459. Gellon, G.; Mcginnis, W. (1998). «Shaping animal body plans in development and evolution by modulation of Hox expression patterns». Bioessays, 20: 116-125. Klezovitch, O.; Fernandez, T. E.; Tapscott, S. J.; Vasioukhin, V. (2004). «Loss of cell polarity causes severe brain dysplasia in Lgl1 knockout mice». Genes Dev., 18: 559-571. Krumlauf, R. (1992). «Evolution of the vertebrate Hox homeobox genes». Bioessays, 14: 245-252. Lewis, E. B. (1978). «A gene complex controlling segmentation in Drosophila». Nature, 276: 565-570. Mcginnis, W.; Levine, M. S.; Hafen, E.; Kuroiwa, A.; Gehring, W. J. (1984). «A conserved DNA sequence in homoeotic genes of the Drosophila Antennapedia and bithorax complexes». Nature, 308: 428-433. Morgan, T. H. (1910). «Sex limited inheritance in Drosophila». Science, 32: 120-122. Reiter, L. T.; Potocki, L.; Chien, S.; Gribskov, M.; Bier, E. (2001). «A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster». Genome Res., 11: 1114-1125. Sánchez-Herrero, E.; Vernós, I.; Marco, R.; Morata, G. (1985). «Genetic organization of Drosophila bithorax complex». Nature, 313: 108-113. Scott, M. P.; Weiner A. J. (1984). «Structural relationships among genes that control development: sequence homology between the Antennapedia, Ultrabithorax, and fushi tarazu loci of Drosophila». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4115-4119. Venter, J. C. [et al.] (2001). «The sequence of the human genome». Science, 291: 1304-1351. Wolf, F. W.; Heberlein, U. (2003). «Invertebrate models of drug abuse». J. Neurobiol., 54: 161-178.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 123-130

DOI: 10.2436/20.1501.02.109

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 131-139

EL PETIT AMFIOX: EL MIRATGE DE L’ORIGEN DELS VERTEBRATS Jordi Garcia-Fernàndez 1 i Èlia Benito-Gutiérrez 2 1 2

Departament de Genètica, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona Developmental Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg

Adreça per a la correspondència: Jordi Garcia-Fernàndez. Departament de Genètica, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: jordigarcia@ub.edu. RESUM L’origen dels vertebrats és un dels centres d’interès de molts científics i de la societat, i el nostre animal favorit, el petit i amigable amfiox, fa més d’un segle que ocupa aquesta posició privilegiada, i reflecteix en un miratge, com a fòssil vivent, el que va ocórrer en aquell transcendental moment de l’evolució. No és només morfològicament el representant viu de l’ancestre de tots els cordats, sinó que a més posseeix un genoma preduplica tiu, un model en versió simple del genoma de tots els vertebrats, incloent-hi l’humà. L’a nàlisi del genoma de l’amfiox ha permès clarificar l’origen del nostre genoma propi, alhora que l’ha situat en una posició clau per entendre l’origen i funcionament de famílies i xarxes gèniques importants per al desenvolupament embrionari i la fisiologia. A més, els avenços tècnics en la reproducció i experimentació permeten raonadament somiar a resoldre els secrets dels nostres orígens i del funcionament del genoma. Paraules clau: amfiox, evo-devo, cordats, genòmica comparada, fòssil vivent. THE LITTLE AMPHIOXUS: A MIRAGE TO THE ORIGEN OF VERTEBRATES SUMMARY The origin of vertebrates is one of the top interests for many scientists and the society, and our favorite animal has occupied this privileged position for more than a century, reflecting in a mirage, as a living fossil, what occurred in this critical landmark of evolution. It is not only morphologically the closest living relative of Chordates, but also possesses a preduplicative genome, a simple model for the genome of all vertebrates, including humans. The analysis of the amphioxus genome has served to clarify the origin of our own Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

132 J. GARCIA-FERNÀNDEZ I È. BENITO-GUTIÉRREZ

genome, and as showed it is in a key position to understand the origin and functioning of gene families and gene networks critical for embryonic development and physiology. Besides, technical advances in its reproduction and experimentation make plausible to dream in illuminating the secrets of our origins and the functioning of the genome. Key words: amphioxus, evo-devo, chordates, comparative genomics, living fossil. LA BAULA PERDUDA «Sembla un peix però no és un peix, és un invertebrat molt semblant als nostres avantpassats». Aquesta descripció de la posició en l’arbre evolutiu de l’amfiox és d’en Roger Garcia als seus companys i companyes de quart de primària, quan va portar a l’escola uns exemplars que mantenia a casa, dins uns tubs hermètics als quals canviava l’aigua de mar tot sovint, i que alimentava amb algues unicel·lulars. El que en Roger no sap és que Darwin mateix, en L’origen de les espècies (Darwin, 1859), defineix l’amfiox com un peix senzill, tan estructuralment senzill que s’aproxima als invertebrats. I tampoc no sap que l’amfiox va ser descrit per primera vegada el 1774 com un llimac, dins els grup dels mol·luscs (Pallas, 1774). De fet, no va ser fins a la segona meitat del segle xix que l’anatomia i l’embriologia comparades van reconèixer que l’amfiox compartia molts dels trets característics que defineixen els vertebrats (vegeu la figura 1): un tub nerviós en posició dorsal, musculatura segmentada, cua postanal i, sobretot, un tub d’origen mesodèrmic, ventral al tub nerviós, i transitori durant el desenvolupament embrionari dels vertebrats, el notocordi, que en l’amfiox es manté també en l’etapa adulta, i que dóna el nom al fílum dels cordats, fílum que inclou els vertebrats, els urocordats (ascidis) i cefalocordats (amfioxos) (vegeu la figura 2). No obstant això, a l’amfiox li manquen la majoria d’estructures avançades que comparteixen tots els vertebrats: extremitats, cervell anterior desenvo-

lupat, o òrgans sensorials parells. De fet, l’amfiox s’ha definit com la forma minimalista d’un vertebrat (Garcia-Fernàndez i Benito-Gutiérrez, 2009) o, en el context evolutiu, l’organisme més semblant al que hauria estat l’ancestre dels vertebrats, la baula perduda de la transició invertebrats/ vertebrats. En un antic llibre de text de biologia animal es deia que «si l’amfiox no hagués estat descobert, s’hauria d’haver inventat» (Grove i Newell, 1961). En el context d’un llibre sobre organismes model, doncs, no ha de ser difícil esbrinar per què l’amfiox és model. L’amfiox és el model dels vertebrats, de fet, de tots els cordats, en ser el parent viu més proper a com es creu va ser el nostre ancestre fa uns cinc-cents milions d’anys, el que anomenem un fòssil vivent. Aquesta posició es correspon, com es veurà, amb un patró corporal arquetípic, simple i model de tots els vertebrats. I, com sabem des de fa molt poc, també en un genoma simple, arquetípic respecte a com era el genoma ancestral dels cordats abans de patir els extensius fenòmens de duplicació gènica que van tenir lloc en l’origen i durant l’evolució dels vertebrats, fins a arribar a esculpir el nostre genoma actual. UN FÒSSIL VIVENT AMB UN EXCITANT CICLE VITAL Actualment, vint-i-nou espècies d’amfiox habiten els nostres oceans i mars. Aquest nombre és sorprenentment alt, tenint en compte que fa més de cinc-cents Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 131-139

EL PETIT AMFIOX: EL MIRATGE DE L’ORIGEN DELS VERTEBRATS 133

milions d’anys ja hi havia animals molt similars als amfioxos actuals, com han revelat els fòssils de l’època cambriana Pikaia i Haikouella (Holland i Chen, 2001). Probablement Pikaia, com els actuals amfioxos, vivia ensorrat quasi totalment en el substrat sorrenc, bellugant-se amb moviments ondulatoris dirigits pel flexible notocordi, o mantenint només el cap fora del substrat, filtrant pacientment aigua a la recerca del seu aliment, les algues unicel·lulars procedents del plàncton de la superfície marina. La seva pacífica vida s’altera en l’època reproductora, la primavera tardana en el cas de l’espècie europea que s’utilitza experimentalment, Branchiostoma lanceolatum, o l’estiu en el cas de l’americana, Branchiostoma floridae (Fuentes et al., 2007). Aleshores, un vespre, en marxar el sol, els amfioxos de tota la població inicien sèries de ràpides fugides cap amunt, fins que inevitablement mascles i femelles inunden d’esperma i ous l’aigua que els envolta, i mili-

ons de zigots acabats de formar inicien dins la membrana de fecundació el desenvolupament embrionari. En l’estadi de nèurula primerenca els embrions surten de la membrana i inicien una vida lliure planctònica fins que, passades de tres a dotze setmanes, segons l’espècie, pateixen una lleugera metamorfosi que els convertirà en juvenils, estat en el qual tornaran a ensorrar-se al fons, per iniciar de nou el cicle vital. EL DESENVOLUPAMENT EMBRIONARI DE L’AMFIOX, MODEL DE LA TRANSICIÓ INVERTEBRATS/VERTEBRATS: MORFOLOGIA I GENÈTICA La genètica del desenvolupament va revolucionar la biologia, i potser la nostra imatge de la vida i l’evolució, en mostrar que hi ha gens responsables per a la majo-

Figura 1. a) El pla corporal de l’amfiox. Fotografia d’un juvenil de l’espècie Branchiostoma lanceolatum amb les estructures i òrgans més destacats. b) Adults en l’època reproductora amb les gònades de color groc intens (femelles) o clar (mascles) situades a la part ventral de l’animal. Adaptat de Garcia-Fernàndez i Benito-Gutiérrez (2009). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 131-139

134 J. GARCIA-FERNÀNDEZ I È. BENITO-GUTIÉRREZ

Tunicats

Cefalocordats

Deuteròstoms

Ciclòstoms

Cordats

Condrictis

Olfactors

Tetràpodes

Vertebrats

x2

x2

noderms), com eriçons i estrelles de mar. No obstant això, a partir de la neurulació, l’embrió d’amfiox recapitula de manera simple els processos típics dels embrions de vertebrats, com la formació de la placa neural dorsal, o l’elongació posterior d’ectoderma, mesoderma i endoderma (vegeu la figura 3). Una vegada descoberts els gens del desenvolupament era obvi voler estudiar, doncs, si els mecanismes moleculars responsables del desenvolupament embrionari en l’amfiox eren els mateixos, similars, o més senzills que en els seus parents vertebrats. I així va ser. L’amfiox té un complex Hox prototípic respecte als quatre complexos Hox dels vertebrats (Garcia-Fernàndez i Holland, 1994), un centre organitzador durant la gastrulació que instrueix els eixos anteroposterior i dorsoventral (Yu et al., 2007), o centres senyalitzadors dirigits per Fgfs, entre molts altres exemples. En els darrers quinze anys un alt nombre de treballs, utilitzant l’amfiox com a model, han estudiat la base molecular comuna per Mandibulats

ria d’esdeveniments clau en la formació del patró corporal i, sobretot, que gens molt similars estan presents en organismes tan distants com una mosca, un ratolí, o un cuc (Caroll, 2005). Sens dubte, l’exemple més clar el representen els gens dels complexos Hox, un grup de gens situats contigus en el genoma, que s’encarreguen d’esculpir el patró anteroposterior del cos de Drosophila o dels vertebrats (Lewis, 1978). La nova disciplina de l’evo-devo, o evolució del desenvolupament, és la punta d’aquesta revolució, en intentar explicar com els canvis en aquests gens i mecanismes que els regulen són, de fet, la base del procés evolutiu. La genètica del desenvolupament va fer rellançar amb força els estudis amb amfiox al final del segle xx. Durant el final del segle xix i l’inici del xx els embriòlegs comparats van estudiar en detall els processos inicials del desenvolupament embrionari de l’amfiox. Així, les etapes inicials, des de la segmentació radial fins a la gastrulació, són similars a les d’altres invertebrats deuteròstoms no cordats (hemicordats i equi-

Equinoderms Hemicordats Figura 2. Representació esquemàtica de la filogènia dels deuteròstoms i la doble duplicació del genoma (2R). Els cefalocordats (amfiox) són descendents dels primers cordats. L’anàlisi del genoma de l’amfiox ha revelat que dues ron des de duplicació completa del genoma van tenir lloc aviat en l’origen dels vertebrats, abans de la radiació dels verte brats mandibulats. Modificat de Garcia-Fernàndez i Benito-Gutiérrez (2009). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 131-139

EL PETIT AMFIOX: EL MIRATGE DE L’ORIGEN DELS VERTEBRATS 135

identificar els mecanismes moleculars bàsics de com es desenvolupa un cordat i, alhora, per identificar els canvis genètics que poden haver estat en la base de les innovacions morfològiques característiques dels vertebrats, com les estructures cranials derivades de la cresta neural, el cervell anterior, les extremitats, o les estructures esquelètiques (revisat a Benito-Gutiérrez, 2010).

Els vertebrats som poliploides i el genoma de l’amfiox és el model L’era molecular en l’amfiox s’inicià el 1992, amb el descobriment del gen AmphiHox3, igualment relacionat amb els tres gens Hox3 dels mamífers. Aquest resultat va rellançar la hipòtesi pionera de Sosumu Ohno, que va suggerir el 1970 (Ohno, 1970) que la complexitat dels vertebrats podia ser deguda a la plasticitat gènica derivada de l’excés de còpies gèniques, no constrenyides evolutivament, que es van generar en l’origen dels vertebrats per fenòmens de duplicació del genoma, cosa que posterior-

Figura 3. Desenvolupament embrionari. a-i) Embrions de Branchiostoma lanceolatum crescuts a 19 °C. El temps de desenvolupament s’indica a cada panell. i) Imatge de microscòpia de rastreig d’una gàstrula de 7 h de desenvolupament. j) Esquema d’una secció longitudinal d’una nèurula tardana. np: placa neural; nt: tub neural; n: notocordi; s: so mites; tb: primordi de la cua; nc: canal neural. h) Embrions de B. lanceolatum procedents d’ous microinjectats amb un marcador fluorescent vermell, fotografiats amb llum visible (esquerra) o amb llum fluorescent (dreta). Adaptat de Gar cia-Fernàndez et al. (2009) i Garcia-Fernàndez i Benito-Gutiérrez (2009). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 131-139

136 J. GARCIA-FERNÀNDEZ I È. BENITO-GUTIÉRREZ

ment s’ha anomenat hipòtesi 2R, o doble duplicació del genoma. Ni l’anàlisi del genoma humà (Human Consortium, 2001) va permetre concloure si la hipòtesi 2R era correcta. Set anys més tard el genoma de l’amfiox va veure per fi la llum (Putman et al., 2008) i va permetre resoldre el dubte. I aquí és quan més que mai l’amfiox és un model clau. En una frase, l’amfiox no és només el parent viu més semblant a l’ancestre dels vertebrats, sinó que el seu genoma és el model més semblant al genoma de l’ancestre dels vertebrats, que es va duplicar dues vegades en l’origen i les etapes inicials de la radiació dels vertebrats (vegeu la figura 2). És, doncs, un genoma clau per entendre l’evolució de gairebé qualsevol família gènica, xarxa de regulació gènica, o element estructural o funcional del nostre genoma. A continuació, s’esmenten alguns dels seus trets i conseqüències. 2R o no? L’anàlisi del genoma de l’amfiox sense cap dubte confirma la hipòtesi 2R (vegeu la figura 2). Entre els seus 21.900 gens codificants, l’amfiox posseeix només un membre per a la majoria de famílies gèniques dels vertebrats. Això fa de l’amfiox un excel·lent representant del genoma ancestral en els cordats, no solament quant al contingut en gens, sinó també respecte a l’organització en exons/introns i cromosòmica. Després de les dues duplicacions genòmiques, aproximadament el 20-25 % dels gens duplicats es va mantenir en el genoma vertebrat, amb un clar biaix envers la retenció de gens duplicats involucrats en regulació transcripcional, transducció de senyal, desenvolupament i processos neuronals. Aquestes classes de gens acostumen a tenir regions reguladores complexes, cosa que

permet especular que els gens i regions reguladores duplicades produïssin flexibilitat genòmica que facilités l’emergència de novetats morfològiques i fisiològiques, en una versió actualitzada i refinada, més envers les regions reguladores i no tant les codificants, de les idees d’Ohno de la duplicació com a motor de l’evolució (Jimènez et al., 2009). Sintènia: grans blocs de genoma conservats fins a l’ésser humà L’anàlisi del genoma de l’amfiox va servir per identificar disset grups de sintènia ancestrals (protocromosomes): grans segments de genoma que es conserven entre amfioxos i humans. Aquests disset grups es van duplicar dues vegades a l’origen i aviat en la radiació dels vertebrats. Posteriors reordenaments cromosòmics van dibuixar el genoma humà tal com el coneixem ara, amb restes d’aquests quatre blocs de disset protocromosomes reordenats en els vint-i-tres parells de cromosomes actuals (vegeu la figura 4). Així, ara coneixem l’origen del 95 % del genoma humà; per exemple, el protocromosoma 8 es va quadruplicar, i les quatre còpies van acabar en els cromosomes humans 5 i X (còpia a), en dos segments del cromosoma 4 (còpia b), en un segment del cromosoma 11 i en dos del 13 (còpia c) i en els cromosomes 2 i X (còpia d). Elements no codificants conservats En comparar els genomes humans i de l’amfiox, es van identificar cinquanta-nou petites regions no codificants de funció desconeguda. Molt probablement, algunes d’aquestes regions corresponen a elements funcionalment clau per a la regulació de Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 131-139

EL PETIT AMFIOX: EL MIRATGE DE L’ORIGEN DELS VERTEBRATS 137

l’expressió de gens clau en el desenvolupament. En ser nous, aquesta troballa obre noves vies d’investigació amb vista a identificar-ne la funció en humans i, si és el cas, esbrinar si poden estar relacionats amb gens o processos d’importància mèdica o social. Avui dia, l’estudi de la regulació de l’expressió gènica i la seva disfunció són a la frontera de la recerca en biomedicina.

El genoma model ho té tot i no perd res El genoma de l’amfiox ha permès clarificar la història evolutiva de moltes famílies gèniques i dels processos fisiològics o del desenvolupament (Holland et al., 2008; Garcia-Fernàndez i Benito-Gutiérrez, 2009). Ara, quan es treballa amb el gen x en l’espècie y, les relacions d’homologia gènica sovint són més precises, cosa que fa que les inferències sobre evolució o com de mo-

Figura 4. Origen del genoma humà per quadruplicació del genoma del cordat ancestral, representat pel genoma actu al de l’amfiox (a dalt). Un genoma format per disset protocromosomes es va duplicar dues vegades, i les còpies resul tants (a, b, c i d) van acabar esculpint els vint-i-tres cromosomes actuals de l’espècie humana (baix). L’esquema representa el destí del protocromosoma 8, que després de les duplicacions va anar a formar part dels cromosomes hu mans 2, 4, 5, 11, 13 i X. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 131-139

138 J. GARCIA-FERNÀNDEZ I È. BENITO-GUTIÉRREZ

del és un procés o un gen, s’hagin clarificat. A més, el genoma de l’amfiox ha permès adonar-se que gens que es pensava que eren exclusius d’invertebrats no ho són, o que gens presumptament invencions dels vertebrats tampoc no eren exclusius d’aquests. De fet, en gairebé tots els llinatges evolutius han tingut lloc pèrdues gèniques, amb una excepció remarcable: l’amfiox. Dos exemples clars són la presència de vuitanta-set famílies de gens amb caixes homeòtiques (grup clau de factors de transcripció), cosa que implica que en el llinatge de l’amfiox no s’ha perdut ni una sola família (Takatori et al., 2009), mentre que en el llinatge envers els humans se n’han perdut nou. O pel que fa als gens codificants dels receptors amb tirosina-cinasa (D’Aniello et al., 2009); de nou, el genoma de l’amfiox ha mantingut les trenta-tres classes, mentre que en el llinatge envers el genoma humà se n’han perdut dues. MODEL PER AL PASSAT ENVERS EL FUTUR El reconeixement del genoma de l’amfiox com a prototípic dels vertebrats i el seu pla corporal primitiu està fent créixer sense aturada la recerca amb aquest pacífic animal. Els genomes de dues espècies més no trigaran a estar disponibles, i el nombre de grups de recerca que s’aturen en el punt de l’evolució que representa l’amfiox és cada dia superior al dia anterior. Anticipem que la recerca amb l’amfiox s’incrementarà encara més, i que l’estudi de processos biològics complexos sovint es traslladarà a un marc senzill (pel genoma preduplicatiu alhora que molt similar a l’humà), l’embrió o l’adult amfiox. La recerca amb l’organisme viu no és fàcil. No és un model pels seus avantatges tècnics, com tants d’altres, sinó per la seva posició

clau en l’escala animal. Fa pocs anys que, gràcies a una iniciativa conjunta de laboratoris europeus, l’amfiox es reprodueix, no sense dificultats, al laboratori (Fuentes et al., 2007). També, els primers assaigs de manipulació genètica de l’embrió són incipients (Garcia-Fernàndez et al., 2009), però alhora prometedors. Estem en l’excitant via de modificar el present, l’amfiox, per provar el passat, els mecanismes genètics que van generar els vertebrats, i per ajudar a entendre els secrets del genoma que han permès generar una immensa varietat de meravelloses formes vives, i entendre per què quelcom falla, i el primer que cal saber per solucionar la fallada. BIBLIOGRAFIA Benito-Gutiérrez, E. (2010). «Amphioxus as a model for mechanisms in vertebrate development». A: Encyclopedia of Life Sciences. Chichester: John Wiley & Sons Ltd. Carroll, S. B.; Grenier, J. K.; Weatherbee, S. D. (2005). From DNA to Diversity. Molecular Genetics and the Evolution of Animal Design. Malden: Blackwell Science. Darwin, C. (1859). On the origin of the species. Londres: John Murray. Fuentes, M.; Benito, E.; Bertrand, S.; Paris, M.; Mignardot, A.; Godoy, L.; Jimenez-Delgado, S.; Oliveri, D.; Candiani, S.; Hirsinger, E.; D’Aniello, S.; Pascual-Anaya, J.; Maeso, I.; Pestarino, M.; Vernier, P.; Nicolas, J. F.; Schubert, M.; Laudet, V.; Genevieve, A. M.; Albalat, R.; Garcia-Fernàndez, J.; Holland, N. D.; Escriva, H. (2007). «Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum)». J. Exp. Zoolog. Part B Mol. Dev. Evol., 308: 484-493. Garcia-Fernàndez, J. (2005). «The genesis and evolution of homeobox gene clusters». Nature Rev. Genetics, 6: 881-892. Garcia-Fernàndez, J.; Holland, P. W. H. (1994). «Archetypal organization of the amphioxus Hox gene cluster». Nature, 370: 563-566. Garcia-Fernàndez, J.; Benito-Gutiérrez, E. (2009). «It’s a long way from amphioxus: descend-

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 131-139

EL PETIT AMFIOX: EL MIRATGE DE L’ORIGEN DELS VERTEBRATS 139 ants of the earliest chordate». BioEssays, 31: 665675. Garcia-Fernàndez, J.; Jiménez-Delgado, S.; Pascual-Anaya, J.; Maeso, I.; Irimia, M.; Minguillón, C.; Benito-Gutiérrez, E.; Gardenyes, J.; Bertrand, S.; D’Aniello, S. (2009). «From the American to the European amphioxus: towards experimental Evo-Devo at the origin of chordates». Int. J. Dev. Biol., 53: 1359-1366. Grove, A. J.; Newell, G. E. (1961). Animal Biology. Londres: University Tutorial Press Ltd. Holland, N. D.; Chen, J. Y. (2001). «Origin and early evolution of the vertebrates: new insights from advances in molecular biology, anatomy, and palaeontology». BioEssays, 23: 142-151. Holland, L. Z. [et al.] (2008) «The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology». Genome Resarch, 18: 1100-1111. Human Consortium (2001) «Initial sequencing and analysis of the human genome». Nature, 409: 860921. Jiménez-Delgado, S.; Pascual-Anaya, J.; GarciaFernàndez, J. (2009). «Implications of duplicated cis-regulatory elements in the evolution of metazoans: the DDI model or how simplicity begets

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 131-139

novelty». Brief. Funct. Genomic Proteomic, 8: 266275. Lewis, E. B. (1978). «A gene complex controlling segmentation in Drosophila». Nature, 276: 565-570. Ohno, S. (1970). Evolution by gene duplication. Londres: Allen & Unwin; Nova York: Springer-Verlag. Pallas, P. S. (1774). Spicilegia Zoologica Quibus Novae Imprimis et Obscurae Animalium Specie Iconibus, Descriptionibus atque Commentariis Illustrantur. Berlín: Berolini and Stralund Gottlieb August Lange, p. 19. Putman, I. [et al.] (2008) «The amphioxus genome and the evolution of the chordate karyotype». Nature, 453: 1064-1071. Takatori, N.; Butts, T.; Candiani, S.; Pestarino, M.; Ferrier, D. E.; Saiga, H., Holland, P. W. (2009). «Comprehensive survey and classification of homeobox genes in the genome of amphioxus, Branchiostoma floridae». Dev. Genes Evol., 218: 579590. Yu, J. K; Satou, Y.; Holland, N. D.; Shin-I, T.; Kohara, Y.; Satoh, N.; Bronner-Fraser, M.; Holland, L. Z. (2007). «Axial patterning in cephalochordates and the evolution of the organizer». Nature, 445: 613-617.

DOI: 10.2436/20.1501.02.110

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 141-153

EL PEIX ZEBRA COM A SISTEMA MODEL PER A L’ESTUDI DE MALALTIES HUMANES Andrea Durán i Hernán López-Schier Laboratori de Biologia Cel·lular i Organogènesi Sensorial, CRG, Barcelona Adreça per a la correspondència: Hernán López-Schier. Laboratori de Biologia Cel·lular i Organogènesi Sensorial, Centre de Regulació Genòmica. C. del Dr. Aiguader, 88. 08003 Barcelona. Adreça electrònica: hernan.lopez@crg.es. RESUM El potencial dels estudis de malalties humanes en organismes model ha crescut substancialment durant els últims anys. L’herència evolutiva compartida entre els vertebrats permet l’ús d’organismes genèticament modificables per modelitzar malalties humanes de difícil estudi in vitro, i també faciliten l’estudi de malalties multifactorials complexes que en humans es presenten amb diferències d’expressivitat i penetrància, cosa que en dificulta la caracterització. Estudis en diversos organismes model han demostrat que diversos gens el producte dels quals permet el desenvolupament i assemblatge de teixits i òrgans també estan involucrats en malalties hereditàries i congènites comunes. Els desenvolupaments tecnològics aconseguits durant els darrers anys també ens permeten modelitzar malalties rares en organismes model. En aquest article intentarem demostrar que el peix zebra és un sistema que presenta qualitats que el fan ideal per a aquests estudis. En particular, presentarem com a exemple algunes malalties neurodegeneratives i la pèrdua d’audició i equilibri. Finalment, també discutirem la utilitat del peix zebra per a estudis de regeneració de cèl·lules sensorials. Paraules clau: organisme model, peix zebra, malaltia humana, degeneració, regeneració. THE ZEBRAFISH AS A MODEL SYSTEM FOR THE STUDY OF HUMAN PATHOLOGIES SUMMARY The potential of studying human pathologies in model organisms has grown substantially over the past few years. The shared evolutionary history among all vertebrates alRebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

142 A. DURÁN I H. LÓPEZ-SCHIER

lows the use of genetically modified organisms to model human diseases that cannot be studied in vitro. It also facilitates the study of multifactorial complex pathologies that in humans present differences in expressivity and penetrance, which complicates their characterization. Studies in several model organisms have demonstrated that genes products that direct the development and assembly of tissues and organs are also involved in common genetic and congenital diseases. Additionally, technological developments permit the modeling of rare diseases in model organisms. In this chapter we will try to demonstrate that the zebrafish is a model that presents several qualities that make it ideal for this kind of studies. In particular, we will present some neurodegenerative diseases and loss of hearing and balance as examples. Finally, we will discuss the use of the zebrafish for studies on the regeneration of sensory cells. Key words: model organism, zebrafish, human disease, degeneration, regeneration. INTRODUCCIÓ Una de les motivacions de la recerca biomèdica és el descobriment de les causes que provoquen el desenvolupament de malalties en els éssers humans. Al mateix temps, la millora de mètodes diagnòstics i d’estratègies terapèutiques complementen els descobriments bàsics sobre els factors casuals de les malalties. Amb els mitjans actuals de detecció de malalties es diagnostiquen cada any malalties greus en milions de persones. Moltes malalties són tractables en qualsevol moment, però d’altres, si no són tractades a temps, poden derivar en trastorns físics i emocionals permanents i en un conseqüent deteriorament de la qualitat i l’expectativa de vida del pacient. Moltes altres, eventualment poden conduir a la invalidesa permanent o a la mort de la persona afectada. Les característiques de moltes malalties fan que el diagnòstic es faci posteriorment a l’aparició de símptomes severs o irreversibles. Moltes vegades, això significa que la malaltia està massa avançada per poder ser tractada farmacològicament, i cal decantar-se per tractaments quirúrgics. Freqüentment, les complicacions de la cirurgia en molts pacients involucren alguna debilitat permanent. Per exemple, aproximadament la meitat dels

pacients operats de schwannoma vestibular perdran part de l’audició en l’orella afectada i en casos més severs es podran presentar danys en altres nervis, cosa que derivarà en una paràlisi facial. Conseqüentment, el diagnòstic precoç de moltes malalties és de summa importància per prevenir-ne les conseqüències més serioses. Un dels problemes fonamentals de moltes malalties és que els mecanismes cellulars involucrats en el procés de la seva generació encara són desconeguts. Això és deu, principalment, al fet que l’observació directa dels òrgans afectats està obstaculitzada per la seva situació profunda dintre de cavitats corporals o protegits pels ossos, com és el cas del cervell. La lentitud del procés de generació de moltes malalties en humans n’impedeix l’anàlisi i caracterització. Aquestes dificultats han creat una gran manca de coneixement sobre el desenvolupament inicial de les malalties, i n’ha dificultat el diagnòstic precoç. Les investigacions que intenten modelitzar malalties humanes en animals model tenen la finalitat d’analitzar i caracteritzar, en detall, els mecanismes cel·lulars i moleculars que deriven en la formació de malalties. Molts d’aquests estudis tenen l’objectiu de trobar dianes moleculars per desenvolupar mètodes diagnòstics precoços que ajudin al Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

EL PEIX ZEBRA COM A SISTEMA MODEL PER A L’ESTUDI DE MALALTIES HUMANES 143

tractament farmacològic o quirúrgic dels pacients. La modelització i l’estudi de les primeres etapes del desenvolupament de malalties humanes en sistemes model, usant animals de laboratori, està motivat per la necessitat de solucionar aquestes dificultats (Strome i Doudet, 2007). EL PEIX ZEBRA COM A SISTEMA EXPERIMENTAL PER MODELITZAR MALALTIES HUMANES Els sistemes experimentals amb animals de laboratori són una condició sine qua non per a l’estudi de malalties humanes, atès que moltes d’aquestes no poden modelitzar-se in vitro o in silico. Cada espècie animal de laboratori posseeix qualitats específiques superiors, però no existeix el sistema experimental universal (Hirsch et al., 2003; Hirsch, 2006, 2007). Per aquesta raó, l’elecció del sistema experimental ideal dependrà de la malaltia que es vulgui modelitzar i del tipus d’investigacions que es planegi fer. Amb la finalitat d’exemplificar aquest concepte, es podrien comparar la mosca del vinagre (Drosophila melanogaster) i el ratolí (Mus musculus). Tot i que el ratolí és un animal evolutivament més proper a l’ésser humà, molts estudis que involucrin la utilització de milers d’animals, com per exemple el cribratge mutagènic, serien poc pràctics i extremadament costosos. En aquests casos, l’ús de Drosophila seria una decisió més encertada, ja que la manutenció i el cribratge de centenars de milers de mosques és relativament fàcil i econòmic. No obstant això, la mosca no és adequada per a molts estudis, ja que no posseeix alguns dels òrgans característics dels mamífers. Per aquestes raons, durant molts anys es va intentar adoptar un sistema animal model que presentés característiques atractives des del punt de vista pràctic, i que Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

també fos suficientment proper a l’humà per permetre l’estudi de la major quantitat possible de malalties. Durant els anys setanta, George Streisinger va advertir que el peix zebra, Danio rerio, seria un model apropiat, ja que posseeix molts sistemes orgànics funcionalment molt semblants a l’humà, encara que freqüentment anatòmicament molt més simples (Streisinger et al., 1981; Walker i Streisinger, 1983; Amsterdam i Hopkins, 2006; Lieschke i Currie, 2007). El peix zebra és un petit teleosti tropical originari del sud-est asiàtic (vegeu la figura 1). Un criteri fonamental que s’utilitza per valorar la possibilitat de modelitzar una malaltia humana en un animal és la identificació d’elements comuns o homòlegs entre ambdues espècies. Així mateix, les alteracions presentades pels models animals han de reproduir exactament aquelles que desenvolupen els pacients humans. En aquest sentit, els grups de recerca abocats a l’estudi del peix zebra l’han validat com a model experimental moltes vegades. Per exemple, ja s’ha demostrat que la formació i funció de molts tipus cellulars i les seves activitats fisiològiques són similars o idèntiques a les humanes. Fins i tot, mutacions en el peix zebra que produeixen ceguera o sordesa profunda també en causen en humans, i alteracions genètiques que produeixen càncer en humans, també ho fan en el peix. Finalment, fàr-

Figura 1. Fotografia d’una femella adulta de peix zebra. L’animal rep el seu nom comú a partir del patró «zebrat» (o amb dibuix de zebra) que conté la pigmentació.

144 A. DURÁN I H. LÓPEZ-SCHIER

macs amb activitat tòxica i que alternativament posen remei a una malaltia o símptoma, actuen de manera semblant en ambdues espècies. La capacitat de generar coneixement valuós sobre l’adquisició i progressió d’una malaltia ha estat freqüentment limitada per la tecnologia disponible. Per tant, les millores en la capacitat de modificar i de visualitzar les cèl·lules involucrades en una malaltia permetrien adquirir grans quantitats de dades de valor diagnòstic. Per aquestes raons, durant els últims anys, molts investigadors han dedicat un gran esforç per desenvolupar i millorar les tecnologies per al peix zebra (Grunwald et al., 1988; Ritter et al., 2001; Lawson i Weinstein, 2002; Brustein et al., 2003; Das et al., 2003; McLean i Fetcho, 2008; Rao et al., 2009; Bandmann i Burton, 2010; Kabli et al., 2010; Paquet et al., 2010; Sager et al., 2010). Gràcies a aquest fet, s’ha avançat significativament en la generació de noves eines que permeten manipular genèticament i visualitzar dinàmicament les cèl·lules individuals en el context dels òrgans complets (vegeu la figura 2). Des del punt de vista tecnològic, el peix zebra es compara favorablement amb altres animals model de recerca genètica, i ofereix un gran nombre d’avantatges, com ara: a) És molt més econòmic de mantenir i produir que el ratolí.

Figura 2. Fotografia d’un peix zebra aleví de set dies de vida, tenyit amb l’anticòs monoclonal 3A 10, que marca els neurofilaments. En aquest cas, la pigmentació revela el sistema nerviós perifèric de l’animal.

b) Un peix zebra madura sexualment als tres mesos, cosa que permet l’obtenció de diverses generacions a l’any. c) Cada parella d’animals és capaç de produir més d’un centenar d’ous per setmana. d) El seu desenvolupament és accelerat. La majoria dels òrgans presents en el peix adult es formen durant els primers tres dies de la vida de l’embrió. e) El desenvolupament de l’animal és extern. A més, durant les primeres setmanes de vida, el peix zebra és pràcticament transparent, cosa que facilita la simple inspecció visual dels òrgans interns. f ) És possible expressar gens forans en el peix mitjançant tècniques d’electroporació (Rambabu et al., 2005; Cerda et al., 2006; Rao et al., 2008). g) L’estudi funcional de gens mitjançant la pèrdua o el guany de la funció és ràpid i molt senzill. Només requereix la microinjecció en l’ou fertilitzat de DNA o de RNA missatger, o de nucleòtids antisentit (Draper et al., 2001; Bill et al., 2009). Una sola persona amb certa pràctica pot injectar fins a cinc-cents ous per dia. h) La generació de peixos transgènics no requereix mà d’obra especialitzada o instrumental sofisticat (Jessen et al., 1998; Grabher et al., 2004; Kawakami, 2004). i) La producció d’un gran nombre de peixos mutants utilitzant agents químics o a partir d’insercions de material genètic forà és relativament fàcil. j) Ja s’ha desenvolupat la tecnologia que permet generar mutacions en gens d’interès, anomenada inducció de lesions dirigida en genomes (TILLING, per les seves sigles en anglès) (Sood et al., 2006; Moens et al., 2008). Aquestes característiques reforcen la convicció que el peix zebra és un sistema idoni per modelitzar malalties humanes (Zon, 1999; Barut i Zon, 2000; Penberthy et Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

EL PEIX ZEBRA COM A SISTEMA MODEL PER A L’ESTUDI DE MALALTIES HUMANES 145

al., 2002; Ward i Lieschke, 2002; Keller i Murtha, 2004; Guyon et al., 2007; Kari et al., 2007; Ingham, 2009). De fet, moltes malalties ja han estat replicades amb èxit en el peix. Seguidament farem ressaltar alguns casos puntuals. MALALTIES NEURODEGENERATIVES Les malalties neurodegeneratives són aquelles que presenten un quadre de pèrdua progressiva de grups neuronals en els sistemes nerviosos central o perifèric. Els efectes de la disminució de la capacitat motriu o cognitiva, entre d’altres, dependran del tipus neuronal en degeneració. En molts casos la pèrdua neuronal és una conseqüència directa de l’efecte genètic o mediambiental que la produeix. En altres, la degeneració neuronal està indirectament causada per problemes en altres cèl·lules, com per exemple la glia. Algunes malalties neurodegeneratives que ja han estat replicades en el peix i actualment són estudiades en detall són la corea de Huntington, les malalties de Parkinson i d’Alzheimer, l’esclerosi múltiple, la degeneració de la retina, etc. (Karlovich et al., 1998; Daly i Sandell, 2000; Strome i Doudet, 2007; Paquet et al., 2009; Li et al., 2010; Paquet et al., 2010; Ramesh et al., 2010; Xia, 2010). Bàsicament, hi ha quatre maneres de generar un peix model per a una malaltia neurodegenerativa i l’elecció de la més adequada dependrà de diversos factors. Si la malaltia és de naturalesa genètica dominant, o els gens responsables del seu desenvolupament es coneixen i el tipus neuronal afectat també és conegut, l’opció ideal és la creació d’un animal transgènic que expressi el gen mutat en les neurones rellevants. Aquesta estratègia experimental s’adequa a les malalties d’Alzheimer, d’atàxia espinocerebral, o Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

a la corea de Huntington. Per exemple, un nombre important de neurones degeneren quan s’expressen proteïnes amb llargues cadenes repetides de trinucleòtids, perquè produeixen agregats proteínics que interfereixen amb la viabilitat cel·lular. Les cadenes de glutamina en la proteïna ATXN1 produeixen l’atàxia espinocerebral de tipus 1 i en la proteïna ATXN3 produeixen la malaltia de Joseph-Machado (Bettencourt et al., 2009; Carlson et al., 2009). Encara que algunes malalties podrien replicar-se en un model transgènic, la mort neuronal també pot generar-se farmacològicament mitjançant l’aplicació directa d’una neurotoxina. Per exemple, la degeneració de les neurones dopaminèrgiques que es dóna en la malaltia de Parkinson pot obtenir-se mitjançant la incubació de peixos amb Paraquat o MPTP (Bretaud et al., 2004). Aquesta opció evita la necessitat de generar una línia transgènica, cosa que permet una recerca més ràpida i menys costosa. Si la malaltia neurodegenerativa és recessiva, o l’alteració genètica no està determinada, l’única opció per replicar-la en un animal model és la generació d’un mutant mitjançant cribratges específics. Si el tipus cel·lular que degenera és conegut, el cribratge podria utilitzar marcadors moleculars que remarquin la viabilitat cel·lular. Per exemple, la modelització de les esclerosis amiotròfica o múltiple, o les neuropaties autonòmiques o sensorials, podria basar-se en aquesta estratègia. En cas contrari, el cribratge hauria de fer-se mesurant les respostes de comportament associades a la malaltia que es vulgui modelitzar en el peix (Nicolson et al., 1998; Artinger et al., 1999; Seiler et al., 2004; Jing i Malicki, 2009). Un exemple d’un cribratge mutacional amb molt èxit és aquell en què, basant-se en observacions preliminars que indiquen que la glia perifèrica en el peix té un perfil d’expressió gènica similar a la humana, un

146 A. DURÁN I H. LÓPEZ-SCHIER

grup d’investigadors de la Universitat de Standford va cribrar animals mitjançant mutagènesi química amb la finalitat d’identificar mutacions que afectaran la producció d’una proteïna de la glia perifèrica (Lyons et al., 2005; Pogoda et al., 2006). Aquesta recerca va generar diverses línies de peixos mutants, una de les quals va presentar problemes en la mielinització dels axons, de manera idèntica a la descrita en la síndrome Goldberg-Shprintzen. Aquest és un desordre congènit caracteritzat per microcefàlia, dimorfisme facial i retard mental. Actualment és una condició incurable. Recentment, mutacions en el gen codificant de la proteïna KBP (proteïna d’unió a la família 1 de cinesines), anomenat KIAA1279, han estat identificades com a responsables del desenvolupament d’aquesta malaltia. Poc després, es va identificar una mutació en aquest mateix gen en el peix, i es va generar el primer model animal de la síndrome de Goldberg-Shprintzen (Lyons et al., 2008). Gràcies al model en el peix, es va poder establir que la funció de KBP és necessària per al creixement i manteniment dels axons de les neurones dels sistemes nerviosos central i perifèric. Un dels avantatges mencionats anteriorment del peix zebra va permetre analitzar les neurones in vivo mitjançant videomicroscòpia, la qual cosa va demostrar que la velocitat de creixement dels axons és menor en els animals mutants. Estudis ultraestructurals van revelar defectes en l’estructura dels microtúbuls i en la localització dels mitocondris als axons. SORDESA I PÈRDUA D’EQUILIBRI La percepció sensorial és un procés complex que permet als éssers humans i altres animals interpretar senyals provinents del medi ambient i reaccionar conseqüent-

ment. L’enorme impacte negatiu de la pèrdua de les funcions sensorials invariablement resulta en la disminució de la qualitat de vida de l’individu afectat. Entre els humans, per exemple, els desordres auditius i de l’equilibri són condicions patològiques agudes o progressives, amb una prevalença de més del 30 % de la població major de seixanta anys d’edat. La hipoacúsia pot ser lleu, caracteritzada clínicament per la pèrdua d’agudesa sensorial, o severa, i arriba en molts casos a la sordesa profunda (Lindsay, 1973; Hilgert et al., 2009; Mackenzie i Smith, 2009). Els símptomes de la deficiència auditiva són causats majoritàriament per la pèrdua de funció de les cèl·lules mecanoreceptores de l’orella interna, anomenades cèl·lules piloses (Petit, 1996; Estivill et al., 1998; Hudspeth, 2000; Michel et al., 2003; Petit, 2006; Petit i Richardson, 2009). A l’orella interna, a la zona coneguda com la còclea, les cèl·lules piloses es dediquen a l’audició pròpiament dita, mentre que aquelles que es distribueixen pel sistema vestibular (canals semicirculars, sàcul i utricle) estan dedicades al manteniment de l’equilibri. Per actuar com a receptors en l’orella interna, les cèl·lules piloses han de ser capaces de produir senyals mecanoelèctrics, és a dir, generar potencials elèctrics en resposta a una estimulació mecànica externa. Estímuls mecànics, com ara el so o l’acceleració, produeixen una flexió en els estereocilis o microvellositats apicals, que resulta en l’acoblament de canals mecànics de traducció, l’apertura dels quals permet l’entrada d’un corrent iònic que despolaritza la membrana plasmàtica cellular, amb el conseqüent alliberament de neurotransmissors que generen una transmissió sinàptica aferent al llarg del nervi cranial viii (vestibulococlear). Més d’un centenar de locus han estat associats a la falta d’audició hereditària en humans. En alguns casos, els gens lesionats ja han estat Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

EL PEIX ZEBRA COM A SISTEMA MODEL PER A L’ESTUDI DE MALALTIES HUMANES 147

identificats molecularment mitjançant el mapatge genètic de posició. Les causes de moltes formes d’hipoacúsia encara són desconegudes, malgrat que alguns resultats indiquen que els factors ambientals tenen un paper important en el progrés de la pèrdua d’audició. Estudis clínics en humans i experimentals en models animals han demostrat que els antibiòtics d’ampli espectre de la família dels aminoglicòsids tenen efectes ototòxics que deriven en la pèrdua irreversible de l’audició. Altres estudis experimentals i epidemiològics indiquen que l’exposició a sons d’alt nivell és una de les principals causes de la disminució progressiva de la capacitat auditiva en la població adulta de països industrialitzats. Segons un informe de l’Organització Mundial de la Salut, Espanya es troba entre els països amb més soroll ambiental del món. Els peixos posseeixen capacitats sensorials molt desenvolupades. La visió i l’audició en el peix zebra utilitzen mecanismes fisiològics idèntics als dels humans. L’estructura tissular de l’ull i l’orella interna en ambdues espècies és molt similar, i també ho són les bases genètiques que permeten la construcció d’aquests òrgans i el seu funcionament. Aquestes característiques han permès l’obtenció de peixos mutants que desenvolupen ceguera, degeneració macular, microftàlmia, sordesa i problemes d’equilibri. L’any 1996 es van publicar una sèrie d’articles que descrivien la generació i caracterització de centenars de línies mutants del peix zebra (Driever i Fishman, 1996; Driever et al., 1996; Haffter et al., 1996; Haffter i Nusslein-Volhard, 1996). Moltes d’aquestes produeixen alteracions estructurals en l’orella interna (Malicki et al., 1996; Whitfield et al., 1996). Per exemple, el mutant dog eared presenta defectes en el gen codificant de la proteïna Eya1. La falta de funció d’aquesta proteïna en humans causa la síndrome anomenaTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

da branquiootorenal (BOR), també anomenada síndrome de Melnick-Fraser. Aquesta malaltia és de caràcter hereditari i freqüentment s’expressa de manera dominant, amb una incidència d’un entre quaranta mil nadons. Es caracteritza per defectes embriològics branquials, displàsia i insuficiència renal i defectes estructurals de l’orella amb hipoacúsia severa. Els defectes en els peixos mutants d’Eya1 són idèntics als presents en humans, tot i que encara no s’ha trobat una expressió dominant de BOR en el peix (Kozlowski et al., 2005; Nica et al., 2006). Les similituds entre ambdues espècies han permès caracteritzar amb detall els defectes associats a la falta de funció d’Eya1. En particular, s’ha determinat que Eya1, juntament amb la proteïna Six1, a la qual s’associa per funcionar com a factor de transcripció, permet la producció de les cèl·lules ciliades mecanoreceptores i, al mateix temps, inhibeix la formació de neurones mitjançant una regulació alternativa de la proliferació i la mort cel·lular en aquests dos llinatges cel·lulars (Bricaud i Collazo, 2006). Una altra forma de sordesa profunda en els humans, els ratolins i també el peix, és aquella derivada de mutacions en el gen codificant de la proteïna TMIE (en anglès, transmembrane inner ear) (Mitchem et al., 2002; Naz et al., 2002). TMIE és una petita proteïna que travessa la membrana plasmàtica cel·lular, la funció de la qual en humans i ratolins va romandre desconeguda fins a la descoberta i caracterització en el peix zebra (Gleason et al., 2009). A partir d’acurats i detallats estudis fenotípics en aquests animals es va determinar que l’absència de TMIE produeix problemes en les microvellositats apicals de les cèl·lules piloses. Encara que aquestes cèl·lules es desenvolupen normalment i mantenen connexions neuronals, no tenen la capacitat de respondre als senyals mecànics. En conseqüència, els canals mecano-

148 A. DURÁN I H. LÓPEZ-SCHIER

transductors resten tancats. Atès que les mateixes cèl·lules que participen en l’audició també són necessàries per a l’equilibri, tant ratolins com persones, i també els peixos mutants TMIE, pateixen problemes vestibulars. En el cas del peix, aquests defectes s’evidencien a partir de la trajectòria circular de la natació del peix (vegeu la figura 3). Per descomptat, alguns defectes de l’audició en éssers humans no poden modelitzar-se en el peix, ateses algunes diferències anatòmiques; per exemple, el peix no posseeix els tres petits ossos de l’orella mitjana (martell, enclusa i estrep) que martellegen sobre el timpà per transmetre els senyals auditius cap a l’orella interna. DESENVOLUPAMENT, DANY I REGENERACIÓ DELS ÒRGANS SENSORIALS A més de la modelització de malalties, el peix zebra es presenta com un sistema ideal per dissenyar i validar mètodes terapèutics. En particular, la capacitat regenerativa del peix permet analitzar factors i condicions que permeten la reparació d’un dany en qualsevol òrgan o teixit (Poss et al., 2003; Becker i Becker, 2008; Brittijn et al., 2009). El camp de la medicina regenerativa creixerà sobre la necessitat de noves teràpies destinades a alleugerir les malalties associades a la vellesa, la qual cosa és cada

cop més rellevant, atès l’increment sostingut de l’expectativa de vida de la població humana. Les línies terapèutiques d’aquesta naturalesa dependran de la disponibilitat d’informació sobre el comportament de les cèl·lules troncals adultes i de la seva resposta a l’administració de fàrmacs. Malgrat que totes les funcions sensorials són propenses a deteriorar-se durant la vida d’un animal, alguns òrgans sensorials posseeixen la capacitat de recuperar-se després d’un dany. En canvi, d’altres com l’orella interna dels mamífers són incapaços de fer-ho. En humans, les cèl·lules piloses es formen només entre el primer i el segon trimestre de gestació i han de mantenir-se saludables durant la resta de la vida de l’individu, ja que la pèrdua és normalment irreversible. Una sèrie de treballs publicats a mitjan anys vuitanta van demostrar que altres vertebrats com ara peixos, amfibis i ocells, poden regenerar cèl·lules piloses de la seva orella o línies laterals (Corwin i Cotanche, 1988; Corwin et al., 1991; Cotanche et al., 1991; Cotanche i Lee, 1994; Jones i Corwin, 1996). Encara que s’ha progressat enormement durant les últimes dues dècades, fins avui es desconeix la resposta a les preguntes més fonamentals del procés regeneratiu. Per exemple, es desconeix la identitat de les cèl·lules progenitores residents, o quins mecanismes controlen la producció de cèl·lules ciliades durant la regeneració. És més, encara hi ha la contro-

Figura 3. Sèrie de fotografies d’una filmació de dos peixos adults, un de normal i l’altre amb una sordesa profunda i falta d’equilibri (asterisc), mentre neden dintre un aquari. El peix que és sord és homozigot en un al·lel mutant del gen TMIE. Noteu el seu patró de natació circular. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

EL PEIX ZEBRA COM A SISTEMA MODEL PER A L’ESTUDI DE MALALTIES HUMANES 149

vèrsia sobre si el procés de regeneració depèn de la proliferació de les cèl·lules de suport que envolten les cèl·lules ciliades danyades. Alguns investigadors sostenen que noves cèl·lules piloses s’originen a partir de la diferenciació de les cèl·lules de suport sense la intervenció de divisions mitòtiques. Una possibilitat molt atractiva és que el neuroepiteli auditiu posseeixi cèl·lules progenitores pluripotents capaces de regenerar cèl·lules piloses. Aquesta hipòtesi ha pres força a partir d’unes publicacions que indiquen la possible presència de cèl·lules troncals adultes en l’utricle, l’única part de l’orella que manté cèl·lules proliferatives en el mamífer adult. Cèl·lules utriculars murines condicionades amb un còctel de factors de creixement en cultiu van poder contribuir a la regeneració de cèl·lules piloses quan van ser empeltades a la càpsula òtica d’embrions de pollastre (Brigande i Heller, 2009). No obstant això, també van generar una multitud d’altres tipus cel·lulars, pertanyents a les tres capes germinals. Altres grups d’investigació han informat de resultats idèntics utilitzant cèl·lules troncals embrionàries, cosa que suggereix que l’utricle podria estar desproveït de cèl·lules troncals adultes dedicades al reemplaçament de cèl·lules piloses danyades. Les cèllules troncals són cèl·lules multipotents amb capacitat d’autorenovació. Ocasionalment, poden generar un o més tipus cel·lulars diferenciats mitjançant divisions asimètriques. Una diferència important entre les cèl·lules troncals cultivades i condicionades i aquelles residents en els teixits adults és la capacitat proliferativa i de diferenciació que les caracteritza. Les cèl·lules troncals adultes, ja sigui pel fet de tenir característiques intrínseques de diferenciació, o per estar influïdes pel microambient cel·lular que les envolta, generalment donen lloc a tipus cel·lulars diferenciats característics dels teixits o òrgans que les acuTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

llen. Un exemple d’això són les cèl·lules troncals nervioses: sempre que romanguin confinades a la zona neurogènica de l’òrgan que les allotja, només generaran neurones, astròglia i oligodendròcits. Tot i així, fora del seu context natural, les cèl·lules troncals nervioses presenten més plasticitat, i són capaces de proliferar activament i de donar lloc a una varietat cel·lular molt més àmplia. Aquesta característica les fa potencialment perilloses, ja que la proliferació descontrolada podria esdevenir en tumors. A més, en cas de ser portat al camp clínic, l’empelt de cèl·lules troncals requeriria una intervenció quirúrgica invasiva i seguiments postoperatoris constants. Per aquestes raons, la possibilitat de recuperar teixits malmesos o envellits a partir de cèllules troncals adultes residents és una alternativa amb un gran potencial terapèutic. No obstant això, un dels principals obstacles en el camp de la medicina regenerativa és la falta d’informació sobre l’existència, perfil molecular i localització de cèl·lules troncals adultes en els òrgans. Malgrat la seva gran importància, els mecanismes que governen el procés de regeneració de les cèl·lules piloses encara són desconeguts. Ni tan sols no s’ha pogut visualitzar directament la formació o regeneració d’aquestes cèl·lules. Això es deu principalment al fet que l’observació directa de l’epiteli auditiu es veu obstaculitzada per la localització de l’orella interna, situada profundament dins de l’os temporal en mamífers, ocells i amfibis. Més encara, la lentitud del procés de regeneració cel·lular en aquests animals en dificulta la visualització de manera contínua. Idealment, estudis bàsics sobre l’existència i el comportament de progenitors endògens haurien de portar-se a terme en models animals amb neuroepitelis accessibles i capaços de regenerar cèl·lules piloses ràpidament. Els tractaments que produeixen sordesa en mamí-

150 A. DURÁN I H. LÓPEZ-SCHIER

fers també són letals per a les cèl·lules piloses en el peix zebra. La pèrdua d’aquestes cèl·lules en el peix zebra és només momentània, ja que aquests animals poden reemplaçar les cèl·lules ciliades malmeses amb molta rapidesa. Per al futur es preveuen un gran nombre de línies d’investigació bàsica sobre aquests temes en animals model com ara el peix zebra (Fan i Collodi, 2006; Chen i Zon, 2009; Kaslin et al., 2009). El coneixement dels factors moleculars que influeixen en el comportament de les cèl·lules troncals en animals capaços de regenerar òrgans serà de gran utilitat per als estudis comparatius i d’extrapolació als humans. Els projectes de recerca d’aquesta índole podrien examinar directament si els òrgans amb baixa capacitat regenerativa estan igualment proveïts de cèl·lules troncals adultes. Per aquests motius, la caracterització de la capacitat regenerativa en el peix zebra és una àrea d’investigació bàsica amb un gran potencial biomèdic. BIBLIOGRAFIA Amsterdam, A.; Hopkins, N. (2006). «Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease». Trends Genet., 22: 473-478. Artinger, K. B.; Chitnis, A. B.; Mercola, M.; Driever, W. (1999). «Zebrafish narrowminded suggests a genetic link between formation of neural crest and primary sensory neurons». Development, 126: 3969-3979. Bandmann, O.; Burton, E. A. (2010). «Genetic zebrafish models of neurodegenerative diseases». Neurobiol. Dis. [En premsa] Barut, B. A.; Zon, L. I. (2000). «Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease». Physiol. Genomics, 2: 49-51. Becker, C. G.; Becker, T. (2008). «Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration». Restor. Neurol. Neurosci., 26: 71-80. Bettencourt, C.; Santos, C.; Montiel, R.; Kay, T.; Vasconcelos, J.; Maciel, P.; Lima, M. (2009). «The (CAG)n tract of Machado-Joseph Disease

gene (ATXN3): a comparison between DNA and mRNA in patients and controls». Eur. J. Hum. Genet., 18: 621-623. Bill, B. R.; Petzold, A. M.; Clark, K. J.; Schimmenti, L. A.; Ekker, S. C. (2009). «A primer for morpholino use in zebrafish». Zebrafish, 6: 69-77. Bretaud, S.; Lee, S.; Guo, S. (2004). «Sensitivity of zebrafish to environmental toxins implicated in Parkinson’s disease». Neurotoxicol. Teratol., 26: 857-864. Bricaud, O.; Collazo, A. (2006). «The transcription factor six1 inhibits neuronal and promotes hair cell fate in the developing zebrafish (Danio rerio) inner ear». J. Neurosci., 26: 10438-10451. Brigande, J. V.; Heller, S. (2009). «Quo vadis, hair, cell regeneration?» Nat. Neurosci., 12: 679-685. Brittijn, S. A. [et al.] (2009). «Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research». Int. J. Dev. Biol., 53: 835-850. Brustein, E.; Marandi, N.; Kovalchuk, Y.; Drapeau, P.; Konnerth, A. (2003). «In vivo monitoring of neuronal network activity in zebrafish by two-photon Ca2+ imaging». Pflugers. Arch., 446: 766-773. Carlson, K. M.; Melcher, L.; Lai, S.; Zoghbi, H. Y.; Clark, H. B.; Orr, H. T. (2009). «Characterization of the zebrafish atxn1/axh gene family». J. Neurogenet., 23: 313-323. Cerda, G. A.; Thomas, J. E.; Allende, M. L.; Karlstrom, R. O.; Palma, V. (2006). «Electroporation of DNA, RNA and morpholinos into zebrafish embryos». Methods, 39: 207-211. Chen, A. T.; Zon, L. I. (2009). «Zebrafish blood stem cells». J. Cell. Biochem., 108: 35-42. Corwin, J. T.; Cotanche, D. A. (1988). «Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma». Science, 240: 1772-1774. Corwin, J. T.; Jones, J. E.; Katayama, A.; Kelley, M. W.; Warchol, M. E. (1991). «Hair cell regeneration: the identities of progenitor cells, potential triggers and instructive cues». Ciba Found. Symp., 160: 103-120 [Discussió: 120-130] Cotanche, D. A.; Lee, K. H. (1994). «Regeneration of hair cells in the vestibulocochlear system of birds and mammals». Curr. Opin. Neurobiol., 4: 509-514. Cotanche, D. A.; Petrell, A.; Picard, D. A. (1991). «Structural reorganization of hair cells and supporting cells during noise damage, recovery and regeneration in the chick cochlea». Ciba Found. Symp., 160: 131-142. [Discussió: 142-150] Daly, F. J.; Sandell, J. H. (2000). «Inherited retinal degeneration and apoptosis in mutant zebrafish». Anat. Rec., 258: 145-155. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

EL PEIX ZEBRA COM A SISTEMA MODEL PER A L’ESTUDI DE MALALTIES HUMANES 151 Das, T.; Payer, B.; Cayouette, M.; Harris, W. A. (2003). «In vivo time-lapse imaging of cell divisions during neurogenesis in the developing zebrafish retina». Neuron, 37: 597-609. Draper, B. W.; Morcos, P. A.; Kimmel, C. B. (2001). «Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown». Genesis, 30: 154-156. Driever, W. [et al.] (1996). «A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish». Development, 123: 37-46. Driever, W.; Fishman, M. C. (1996). «The zebrafish: heritable disorders in transparent embryos». J. Clin. Invest., 97: 1788-1794. Estivill, X.; Fortina, P.; Surrey, S.; Rabionet, R.; Melchionda, S.; D’Agruma, L.; Mansfield, E.; Rappaport, E.; Govea, N.; Mila, M.; Zelante, L.; Gasparini, P. (1998). «Connexin-26 mutations in sporadic and inherited sensorineural deafness». Lancet, 351: 394-398. Fan, L.; Collodi, P. (2006). «Zebrafish embryonic stem cells». Methods Enzymol., 418: 64-77. Gleason, M. R.; Nagiel, A.; Jamet, S.; Vologodskaia, M.; Lopez-Schier, H.; Hudspeth, A. J. (2009). «The transmembrane inner ear (TMIE) protein is essential for normal hearing and balance in the zebrafish». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106: 21347-21352. Grabher, C.; Joly, J. S.; Wittbrodt, J. (2004). «Highly efficient zebrafish transgenesis mediated by the meganuclease I-SceI». Methods Cell Biol., 77: 381-401. Grunwald, D. J.; Kimmel, C. B.; Westerfield, M.; Walker, C.; Streisinger, G. (1988). «A neural degeneration mutation that spares primary neurons in the zebrafish». Dev. Biol., 126: 115-128. Guyon, J. R.; Steffen, L. S.; Howell, M. H.; Pusack, T. J.; Lawrence, C.; Kunkel, L. M. (2007). «Modeling human muscle disease in zebrafish». Biochim. Biophys. Acta, 1772: 205-215. Haffter, P. [et al.] (1996). «The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio». Development, 123: 1-36. Haffter, P.; Nusslein-Volhard, C. (1996). «Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish». Int. J. Dev. Biol., 40: 221-227. Hilgert, N.; Smith, R. J. van; Camp, G. (2009). «Function and expression pattern of nonsyndromic deafness genes». Curr. Mol. Med., 9: 546564. Hirsch, E. C. (2006). «How to judge animal models of Parkinson’s disease in terms of neuroprotection». J. Neural. Transm., supl.: 255-260. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

Hirsch, E. C. (2007). «Animal models in neurodegenerative diseases». J. Neur. Transm., supl.: 87-90. Hirsch, E. C. [et al.] (2003). «Animal models of Parkinson’s disease in rodents induced by toxins: an update». J. Neural. Transm., supl.: 89-100. Hudspeth, A. J. (2000). «Hearing and deafness». Neurobiol. Dis., 7: 511-514. Ingham, P. W. (2009). «The power of the zebrafish for disease analysis». Hum. Mol. Genet., 18: R107112. Jessen, J. R.; Meng, A.; Mcfarlane, R. J.; Paw, B. H.; Zon, L. I.; Smith, G. R.; Lin, S. (1998). «Modification of bacterial artificial chromosomes through chi-stimulated homologous recombination and its application in zebrafish transgenesis». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5121-5126. Jing, X.; Malicki, J. (2009). «Zebrafish ale oko, an essential determinant of sensory neuron survival and the polarity of retinal radial glia, encodes the p50 subunit of dynactin». Development, 136: 29552964. Jones, J. E.; Corwin, J. T. (1996). «Regeneration of sensory cells after laser ablation in the lateral line system: hair cell lineage and macrophage behavior revealed by time-lapse video microscopy». J. Neurosci., 16: 649-662. Kabli, S.; He, S.; Spaink, H. P.; Hurlstone, A.; Jagalska, E. S.; De Groot, H. J.; Alia, A. (2010). «In vivo magnetic resonance imaging to detect malignant melanoma in adult zebrafish». Zebrafish, 7: 143-148. Kari, G.; Rodeck, U.; Dicker, A. P. (2007). «Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery». Clin. Pharmacol. Ther., 82: 70-80. Karlovich, C. A.; John, R. M.; Ramirez, L.; Stainier, D. Y.; Myers, R. M. (1998). «Characterization of the Huntington’s disease (HD) gene homologue in the zebrafish Danio rerio». Gene, 217: 117125. Kaslin, J.; Ganz, J.; Geffarth, M.; Grandel, H.; Hans, S.; Brand, M. (2009). «Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche». J. Neurosci., 29: 6142-6153. Kawakami, K. (2004). «Transgenesis and gene trap methods in zebrafish by using the Tol2 transposable element». Methods Cell Biol., 77: 201-222. Keller, E. T.; Murtha, J. M. (2004). «The use of mature zebrafish (Danio rerio) as a model for human aging and disease». Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol., 138: 335-341. Kozlowski, D. J.; Whitfield, T. T.; Hukriede, N. A.; Lam, W. K.; Weinberg, E. S. (2005). «The zebra-

152 A. DURÁN I H. LÓPEZ-SCHIER fish dog-eared mutation disrupts eya1, a gene required for cell survival and differentiation in the inner ear and lateral line». Dev. Biol., 277: 27-41. Lawson, N. D.; Weinstein, B. M. (2002). «In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish». Dev. Biol., 248: 307-318. Li, L.; Li, Y.; Chen, D.; Shao, J.; Li, X.; Xu, C. (2010). «Fishing for age-related visual system mutants: behavioral screening of retinal degeneration genes in zebrafish». Curr. Aging. Sci., 3: 43-45. Lieschke, G. J.; Currie, P. D. (2007). «Animal models of human disease: zebrafish swim into view». Nat. Rev. Genet., 8: 353-367. Lindsay, J. R. (1973). «Profound childhood deafness. Inner ear pathology». Ann. Otol. Rhinol. Laryngol., 82 (supl. 5): 1-121. Lyons, D. A. [et al.] (2005). «erbb3 and erbb2 are essential for schwann cell migration and myelination in zebrafish». Curr. Biol., 15: 513-524. Lyons, D. A.; Naylor, S.; Mercurio, S.; Dominguez, C.; Talbot, W. S. (2008). «KBP is essential for axonal structure, outgrowth and maintenance in zebrafish, providing insight into the cellular basis of Goldberg-Shprintzen syndrome». Development, 135: 599-608. Mackenzie, I.; Smith, A. (2009). «Deafness―the neglected and hidden disability». Ann. Trop. Med. Parasitol., 103: 565-571. Malicki, J.; Schier, A. F.; Solnica-Krezel, L.; Stemple, D. L.; Neuhauss, S. C.; Stainier, D. Y.; Abdelilah, S.; Rangini, Z.; Zwartkruis, F.; Driever, W. (1996). «Mutations affecting development of the zebrafish ear». Development, 123: 275-283. Mclean, D. L.; Fetcho, J. R. (2008). «Using imaging and genetics in zebrafish to study developing spinal circuits in vivo». Dev. Neurobiol., 68: 817834. Michel, V.; Hardelin, J. P.; Petit, C. (2003). «Molecular mechanism of a frequent genetic form of deafness». N. Engl. J. Med., 349: 716-717. Mitchem, K. L. [et al.] (2002). «Mutation of the novel gene Tmie results in sensory cell defects in the inner ear of spinner, a mouse model of human hearing loss DFNB6». Hum. Mol. Genet., 11: 1887-1898. Moens, C. B.; Donn, T. M.; Wolf-Saxon, E. R.; Ma, T. P. (2008). «Reverse genetics in zebrafish by TILLING». Brief Funct. Genomic Proteomic, 7: 454459. Naz, S. [et al.] (2002). «Mutations in a novel gene, TMIE, are, associated with hearing loss linked to the DFNB6 locus». Am. J. Hum. Genet., 71: 632636.

Nica, G.; Herzog, W.; Sonntag, C.; Nowak, M.; Schwarz, H.; Zapata, A. G.; Hammerschmidt, M. (2006). «Eya1 is required for lineage-specific differentiation, but not for cell survival in the zebrafish adenohypophysis». Dev. Biol., 292: 189204. Nicolson, T.; Rusch, A.; Friedrich, R. W.; Granato, M.; Ruppersberg, J. P.; Nusslein-Volhard, C. (1998). «Genetic analysis of vertebrate sensory hair cell mechanosensation: the zebrafish circler mutants». Neuron, 20: 271-283. Paquet, D. [et al.] (2009). «A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation». J. Clin. Invest., 119: 1382-1395. Paquet, D.; Schmid, B.; Haass, C. (2010). «Transgenic zebrafish as a novel animal model to study tauopathies and other neurodegenerative disorders in vivo». Neurodegener. Dis., 7: 99-102. Penberthy, W. T.; Shafizadeh, E.; Lin, S. (2002). «The zebrafish as a model for human disease». Front. Biosci., 7: d1439-1453. Petit, C. (1996). «Genes responsible for human hereditary deafness: symphony of a thousand». Nat. Genet., 14: 385-391. ― (2006). «From deafness genes to hearing mechanisms: harmony and counterpoint». Trends. Mol. Med., 12: 57-64. Petit, C.; Richardson, G. P. (2009). «Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function». Nat. Neurosci., 12: 703-710. Pogoda, H. M. [et al.] (2006). «A genetic screen identifies genes essential for development of myelinated axons in zebrafish». Dev. Biol., 298: 118-131. Poss, K. D.; Keating, M. T.; Nechiporuk, A. (2003). «Tales of regeneration in zebrafish». Dev. Dyn., 226: 202-210. Rambabu, K. M.; Rao, S. H.; Rao, N. M. (2005). «Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation». BMC Biotechnol., 5: 29. Ramesh, T.; Lyon, A. N.; Pineda, R. H.; Wang, C.; Janssen, P. M.; Canan, B. D.; Burghes, A. H.; Beattie, C. E. (2010). «A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease». Dis. Model Mech. [En premsa] Rao, K. D.; Alex, A.; Verma, Y.; Thampi, S.; Gupta, P. K. (2009). «Real-time in vivo imaging of adult zebrafish brain using optical coherence tomography». J. Biophotonics, 2: 288-291. Rao, N. M.; Rambabu, K. M.; Rao, S. H. (2008). «Electroporation of adult zebrafish». Methods Mol. Biol., 423: 289-298.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

EL PEIX ZEBRA COM A SISTEMA MODEL PER A L’ESTUDI DE MALALTIES HUMANES 153 Ritter, D. A.; Bhatt, D. H.; Fetcho, J. R. (2001). «In vivo imaging of zebrafish reveals differences in the spinal networks for escape and swimming movements». J. Neurosci., 21: 8956-8965. Sager, J. J.; Bai, Q.; Burton, E. A. (2010). «Transgenic zebrafish models of neurodegenerative diseases». Brain Struct. Funct., 214: 285-302. Seiler, C. [et al.] (2004). «Myosin VI is required for structural integrity of the apical surface of sensory hair cells in zebrafish». Dev. Biol., 272: 328338. Sood, R. [et al.] (2006). «Methods for reverse genetic screening in zebrafish by resequencing and TILLING». Methods, 39: 220-227. Streisinger, G.; Walker, C.; Dower, N.; Knauber, D.; Singer, F. (1981). «Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio)». Nature, 291: 293-296.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 141-153

Strome, E. M.; Doudet, D. J. (2007). «Animal models of neurodegenerative disease: insights from in vivo imaging studies». Mol. Imaging Biol., 9: 186195. Walker, C.; Streisinger, G. (1983). «Induction of mutations by gamma-rays in pregonial germ cells of zebrafish embryos». Genetics, 103: 125-136. Ward, A. C.; Lieschke, G. J. (2002). «The zebrafish as a model system for human disease». Front. Biosci., 7:d827-833. Whitfield, T. T. [et al.] (1996). «Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line». Development, 123: 241-254. Xia, W. (2010). «Exploring Alzheimer’s disease in zebrafish». J. Alzheimers Dis., 20: 981-990. Zon, L. I. (1999). «Zebrafish: a new model for human disease». Genome Res., 9: 99-100.

DOI: 10.2436/20.1501.02.111

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 155-164

EL POLLET COM A SISTEMA MODEL: LES NOVES POSSIBILITATS D’UN MODEL CLÀSSIC Cristina Pujades Departament de Ciències Experimentals i de la Salut, Universitat Pompeu Fabra, Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona Adreça per a la correspondència: Cristina Pujades. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut, Universitat Pompeu Fabra, Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona. C. del Dr Aiguader, 88. 08003 Barcelona. Adreça electrònica: cristina.pujades@upf.edu. RESUM L’embrió de pollet té una llarga i distingida història com a model en biologia del desenvolupament, i també ha contribuït de manera important en immunologia, genètica, virologia, càncer i biologia cel·lular. Actualment, és encara més potent gràcies al desenvolupament de les noves tecnologies: l’electroporació in vivo (que permet guany i pèrdua de funció controlant tant el temps com l’espai), els nous mètodes de transgènesi, l’aparició del primer esborrany del seu genoma junt amb noves eines per accedir a aquesta infor mació i les altament sofisticades tècniques d’imatge. En combinació amb les tècniques clàssiques com són l’embriologia experimental i el traçat del llinatge cel·lular, el pollet és ara un dels sistemes experimentals més versàtils dels quals disposem. En aquest context, ens centrarem en l’anàlisi dels avantatges i inconvenients d’aquest organisme com a sistema model en biologia del desenvolupament. Paraules clau: pollet, embrió, desenvolupament, genòmica, imatge. THE CHICK AS A MODEL SYSTEM: THE NEW EXCITEMENT OF AN OLD MODEL SUMMARY The chick embryo has a long and distinguished history as a major model system in developmental biology and has also contributed major concepts to immunology, genetics, virology, cancer, and cell biology. Now, it has become even more powerful thanks to several new technologies: in vivo electroporation (allowing gain and loss of function in vivo Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

156 C. PUJADES

in a time and space controlled way), novel methods for transgenesis, the sophisticated imaging techniques, and the completion of the first draft of the sequence of its genome along with many new resources to access this information. In combination with classical techniques such as grafting and cell lineage tracing, the chicken is now one of the most versatile experimental systems available. In this context, we will focus on the analysis of advantages and disadvantages of this organism as a model system in developmental biology. Key words: chick, embryo, development, genomics, imaging. El desenvolupament embrionari és un procés complex, que ha fascinat l’ésser humà des del principi de la història. Com resulta la fertilització en la formació d’un individu complet i independent? Com es passa d’una cèl·lula fertilitzada diploide (el zigot) a un organisme pluri i multicel·lular ben organitzat entorn d’uns eixos corporals? On es troba la informació que estableix aquesta complexitat, i quins són els mecanismes que fan que es codifiqui apropiadament? Per respondre aquestes preguntes, la ciència ha fet servir un gran nombre de sistemes model, cadascun amb una sèrie d’avantatges que fa que es puguin aplicar certes aproximacions experimentals amb diferents graus d’èxit. Malgrat els esforços fets, encara no s’ha trobat l’organisme model que pugui ser bona fide. Els models de vertebrats més importants per estudiar el desenvolupament inclouen el peix zebra (Danio rerio), el gripau (Xenopus laevis), el pollet (Gallus gallus) i el ratolí (Mus musculus). D’aquests, el pollet va ser el primer que es va utilitzar per a investigacions sobre el desenvolupament embrionari. El pollet és un amniota i en el seu estadi d’embrió té una morfologia molt similar a la dels embrions de mamífer. El desenvolupament embrionari primerenc es dóna en un blastoderma pla, cosa que fa que sigui molt accessible per manipular-lo. Malgrat que els moviments morfogenètics en els primers estadis embrionaris semblin molt diferents, el que sabem és que els proces-

sos bàsics a escala molecular són els mateixos en tots els vertebrats. El cicle vital del pollet és de vint-i-un dies. L’ou és fecundat i comença el procés de segmentació quan encara és en l’oviducte de la gallina. A causa a la massa del rovell, la segmentació es confina en una porció molt petita de citoplasma d’alguns mil·límetres de diàmetre, que conté el nucli i es troba a sobre el rovell. Aquest procés resulta en la formació del blastoderma. Durant les 20 h que passa a l’oviducte, l’ou s’envolta de l’albúmina (la clara), les membranes i la closca. En el moment de la posta, el blastoderma està format per unes seixanta mil cèl·lules i es troba a sobre del rovell. Aquest blastoderma segueix el procés de gastrulació i unes 50 h després de la posta l’embrió ja té el primordi del sistema nerviós central i del cor formats (vegeu la figura 1) i comença el procés d’organogènesi. Finalment, vint-i-un dies després de la posta l’ou desclou i tenim el pollet. ELS PRINCIPIS L’ou de pollet és una font tan comuna i accessible d’embrions que ja va atraure l’interès dels antics egipcis, així com d’Aristòtil, que obria ous en diferents estadis d’incubació i examinava la progressió en el desenvolupament dels embrions. Fins al segle xix, aquestes observacions dels embrions en diferents estadis s’utilitzaven per donar suport a qualsevol de les dues teoriTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 155-164

EL POLLET COM A SISTEMA MODEL: LES NOVES POSSIBILITATS D’UN MODEL CLÀSSIC 157

es del gran debat existent a l’època: la preformació (l’adult està preformat des del moment de la fertilització, i només creix; per tant, l’embrió seria un adult en miniatura), i l’epigènesi (l’embrió incrementa en complexitat amb el temps i els nous òrgans es formen a mesura que es desenvolupa) (Wolpert, 2004). Al mateix temps, els filòsofs anaven fent descobriments, com el cas de Malpighi, que amb l’ajuda d’un microscopi va veure el tub neural (el primordi del sistema nerviós central) i els somites (en l’origen de les vèrtebres), malgrat les seves conviccions preformacionistes. Els progressos subseqüents van seguir d’una manera molt propera els nous avanços tècnics. Les millores en microscòpia i els primers experiments de seccionar embrions van portar al descobriment de les tres capes o fulls germinals (ectoderma, mesoderma i endoderma) i a les primeres indicacions d’interaccions entre aquests (el

que més endavant es va anomenar inducció). Aquesta millora dels microscopis, juntament amb la innovació introduïda amb els colorants vitals que permeten tenyir els embrions vius, i l’aparició de mètodes més sofisticats per seccionar els embrions, van permetre generar una descripció exhaustiva dels canvis en l’estructura i morfologia de l’embrió durant el desenvolupament. La majoria dels conceptes moderns i dels noms dels components anatòmics de l’embrió es deuen al treball d’un gran grup d’històlegs (majoritàriament alemanys, com Hensen, Koller, etc). Al final del segle xix, l’embriologia va tornar a ressorgir. Els experiments d’embriologia experimental en què es destorbava el desenvolupament van aportar informació sobre el potencial de desenvolupament d’aquelles cèl·lules en l’embrió. Aquests estudis es van aplicar a altres espècies i es van generar els mapes de destí (fate maps), i

Figura 1. El cicle vital del pollet. a) Embrió de pollet en l’estadi de blastoderma (primitive-streak). b) Després de 24 h de la posta (estadi de 13 somites), l’embrió té ja format el tub neural o primordi del sistema nerviós central (vegeu les vesícules cerebrals en la part anterior de l’embrió) i els parells de somites com a blocs sòlids a ambdós can tons del notocordi. Els eixos anteroposterior, dorsoventral i esquerra-dreta ja estan clara ment definits. c) Embrió a les 50 h després de la posta (estadi de 22 somites), en què es veu clarament el primordi del cor, les vesícules òptiques i òtiques. Els embrions b i c han estat tenyits amb una proteïna anomenada Brachyury que marca el mesoderma primerenc i el notocordi. L’eix anterior és cap a dalt en totes les fotografies. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 155-164

158 C. PUJADES

van permetre la definició formal de termes com regulació, inducció, determinació, i competència, i la clara noció que el desenvolupament depèn d’un flux instructiu de senyals entre les diferents poblacions cel·lulars. Al mateix temps, T. Morgan estava construint la disciplina de la genètica del desenvolupament utilitzant la mosca Drosophila com a model. La combinació d’aquestes dues disciplines ―l’embriologia experimental i anàlisi genètica― va donar lloc al naixement de la biologia del desenvolupament moderna. El 1930, va començar la gran influència d’una figura com C. H. Waddington, que durant els propers deu anys va explorar sistemàticament la capacitat regulativa, el poder inductor, i la competència dels embrions primerencs i de les seves diferents regions. Així es van descriure els mecanismes de la asimetria esquerra-dreta, les interaccions entre fulls embrionaris que comporten el control de la direcció dels moviments cel·lulars i la inducció del sistema nerviós i els placodes sensorials (revisat a Stern, 2000). Entre altres descobertes, Waddington va descriure la inducció del mesoderma per part de l’endoderma extraembrionari, i el node de Hensen com l’organitzador en els amniotes. La dècada següent es va caracteritzar per l’aprofundiment en aquestes qüestions. Finalment, la incorporació de la biologia cel·lular va permetre caracteritzar les contribucions de diferents tipus cel·lulars. Així, es va descriure la zona d’activitat polaritzant (ZPA, zone of polarizing activity) i la cresta ectodèrmica anterior (AER, anterior ectodermal ridge), amb propietats inductores en el desenvolupament de l’extremitat del pollet. Durant aquest període s’introdueix la tècnica de les quimeres pollet-guatlla per seguir la migració i diferenciació de poblacions cellulars en embrions intactes (Douarin, 1993). Això va permetre un coneixement

exhaustiu dels orígens i destí final de les cèl·lules de la cresta neural, la descoberta de l’hemangioblast (el reservori de cèl·lules pluripotents hematopoètiques), i molts aspectes de la regionalització del tub neural. Malgrat tot, entre els quaranta i els setanta l’embriologia experimental va perdre protagonisme. Es van fer moltes observacions i descripcions morfològiques, però tots aquests estudis van aportar poc al coneixement dels mecanismes moleculars del desenvolupament. La fita més important va ser la incorporació de la tecnologia del DNA recombinant, que va atraure un gran nombre de biòlegs moleculars a estudiar el desenvolupament embrionari. En els vuitanta, el Xenopus (gripau) es va convertir en el model estrella per als nouvinguts. Com que ponen uns ous tan grans, es podien injectar directament les construccions de DNA recombinant en l’ou fertilitzat, i com que no hi ha creixement però sí divisió cel·lular, es podia seguir fàcilment l’efecte funcional de les manipulacions. A més, permetien obtenir quantitats importants de material per fer aproximacions bioquímiques. En aquells moments, però, això encara no era factible amb el pollet. Malgrat tot, en combinar embriologia experimental i marcatge molecular, alguns laboratoris van fer aportacions importants com són: la demostració que la subdivisió dels somites al llarg de l’eix anteroposterior guia el creixement dels nervis motors i de les cèl·lules de la cresta neural (Keynes i Stern, 1984), la demostració d’una organització metamèrica del romboencèfal o cervell posterior (Lumsden i Keynes, 1989), la inducció de la placa del terra per part del notocordi (Straaten et al., 1985), i la troballa que els cicles d’oscil·lació en l’expressió gènica precedeixen la formació dels somites (Palmeirim et al., 1997). El clar inconvenient era poder fer manipulacions gèniques, bé fent genètica, com Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 155-164

EL POLLET COM A SISTEMA MODEL: LES NOVES POSSIBILITATS D’UN MODEL CLÀSSIC 159

es feia en el ratolí, bé manipulant de manera temporal l’expressió gènica com es feia en Xenopus. La primera aproximació a aportar resultats en aquest sentit va ser la utilització de vectors retrovírics. En combinació amb altres tècniques va permetre identificar les molècules clau secretades per la ZPA i l’AER, i que, per tant, iniciaven la regionalització dorsoventral de l’extremitat i el seu creixement (Tickle, 2004). A això va seguir el descobriment del primer grup de gens que s’expressaven de manera asimètrica al llarg de l’eix esquerra-dreta i la demostració del seu paper clau a l’hora de crear aquesta asimetria. Aquesta era la situació entorn de la fi del segle passat ―el pollet era un sistema vell i venerat que havia contribuït a molts conceptes clau i havia descrit esdeveniments embriològics que semblaven generalitzables, però que havia perdut la modernitat perquè era difícil fer experiments de guany i pèrdua de funció més sofisticats. El cicle vital del pollet és massa llarg, hi ha un nombre molt petit de mutants, i no és fàcil generar transgènics d’una manera rutinària com en el ratolí. A més, la seqüenciació del seu genoma no era una prioritat, ja que tots els esforços anaven dirigits a la seqüència del llevat, el nematode, la mosca, el ratolí i l’ésser humà. Però tot això ha canviat en els últims anys, i sobretot l’any 2004 va ser un punt d’inflexió. UNA NOVA OPORTUNITAT En els últims anys, les aproximacions clàssiques s’han enriquit enormement de quatre avanços tècnics: la introducció dels nous mètodes per fer experiments de guany i pèrdua de funció i d’anàlisi de promotors, l’aïllament de cèl·lules mare embrionàries (ES) i el desenvolupament de mètodes de transgènesi, la seqüenciació del Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 155-164

genoma del pollet amb l’establiment d’un nombre important de recursos electrònics (vegeu l’apartat de bibliografia en xarxa) (Stern, 2005), i el desenvolupament de noves tècniques d’imatge. Nous mètodes per guany i pèrdua de funció i anàlisi de promotors El 1997, en explorar la possibilitat d’expressar gens ectòpicament de manera controlada en l’espai i el temps en embrions de pollet a partir de vectors no vírics, es va observar que l’electroporació in ovo era una tècnica molt eficient. Estudis posteriors, sobretot del grup de Nakamura, van refinar aquesta tècnica, i van fer possible que s’introduïssin construccions d’expressió de manera molt eficient en qualsevol regió de l’embrió i en el moment del desenvolupament que es volgués (Nakamura et al., 2004). Gràcies al perfeccionament dels vectors d’expressió, actualment es disposa d’una gran col·lecció d’aquests per a diferents aplicacions. Per fer experiments d’expressió ectòpica normalment s’utilitzen vectors que contenen promotors ubics com la β-actina o CMV, seguits d’un polilligador on s’insereix el gen d’interès, seguit d’un senyal IRES, i un gen traçador com les proteïnes fluorescents o la β-galactosidasa (GFP, green fluorescence protein; RFP, red fluorescence protein; LacZ, etc.), que ens permet seguir les cèl·lules que han incorporat la construcció. Controlant la forma, la mida i la posició dels elèctrodes es poden electroporar regions més grans o més petites. Es poden definir subterritoris d’electroporació substituint els promotors ubics per promotors específics de teixit, o per promotors que continguin elements induïbles. Així doncs, atenent als nostres interessos dissenyarem un tipus de vector d’expressió o un altre. Aquesta aproximació permet es-

160 C. PUJADES

tudis de guany de funció relativament ràpids controlant la posició i el temps d’expressió del gen d’interès (vegeu la figura 2). Això també permet estudis de pèrdua de funció no solament introduint construccions que siguin inhibidores o dominants negatives, sinó que es poden introduir morpholinos (MO, oligonucleòtids que inhibeixen la traducció de la proteïna o el tall i unió de l’RNA) marcats amb fluorescència, o bé construccions de DNA que produeixin RNA d’interferència (siRNA). El principal avantatge és que les construccions són de DNA i, per tant, molt fàcils de manipular, i es pot controlar i afinar molt bé tant la regió on es vol electroporar com el moment. A part dels experiments de guany i pèrdua de funció, l’electroporació també permet fer experiments d’anàlisi de l’activitat dels promotors in vivo (Uchikawa et al., 2003). Utilitzant la GFP (o altres proteïnes fluorescents) com a traçador, es poden ob-

tenir resultats en poques hores a partir de l’observació directa dels embrions i fent experiments de time-lapse (seguiment en temps real a partir de pel·lícules). En aquest cas, el pollet presenta grans avantatges respecte a altres organismes clàssics per a l’estudi de promotors, com és el ratolí, ja que aquest requereix la producció d’animals transgènics. Sense cap dubte, aquesta tecnologia ha transformat l’embrió de pollet en un sistema amb moltes possibilitats. Si a més tenim en compte que les regions promotores normalment funcionen de manera heteròloga, és a dir, interespecífica, la potencialitat del pollet és enorme. Cèl·lules mare i transgènesi La importància de les cèl·lules mare embrionàries de ratolí en estudis de desenvolupament embrionari ha estat clau, ja que

Figura 2. Hibridació in situ després de l’electroporació d’embrions de pollet. Els tubs neurals (o primordis del sistema nerviós central) d’embrions de pollet han estat electroporats amb una construcció que conté el gen mvHnf1 i la proteïna GFP (a-f, el cantó dret és l’electroporat). L’expressió ectòpica de mvHnf1 o de la proteïna GFP es pot seguir a partir d’hibridacions in situ per a vHnf1 (en vermell en c, o per tincions immunohistoquímiques amb l’anticòs anti-GFP (en vermell en d-e). El fenotip provocat per l’expressió ectòpica d’aquest gen es pot estudiar fent marcatges per a altres gens com Krox20 (en blau en a-c) o MafB (en blau en d-f). Imatge d’Aragon et al. (2005). Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 155-164

EL POLLET COM A SISTEMA MODEL: LES NOVES POSSIBILITATS D’UN MODEL CLÀSSIC 161

s’han utilitzat no solament per a la generació d’animals transgènics per recombinació homòloga o per a la construcció de quimeres, sinó també per a l’estudi de diversos aspectes de la diferenciació cel·lular i el paper de diversos gens en la determinació cel·lular. Malgrat tots els estudis fets en altres organismes, les veritables cèl·lules mare embrionàries amb el potencial de contribuir a tots els teixits somàtics així com a la línia germinal s’han generat només a partir de blastocists de ratolí. Avanços recents han generat optimisme que això aviat serà possible en el pollet. La dissociació de cèl·lules embrionàries en l’estadi de blàstula, seguida de cultius en condicions especials que afavoreixen la proliferació i inhibeixen la diferenciació, permeten generar línies cel·lulars que poden continuar després de diverses passades in vitro. Quan aquestes cèl·lules s’introdueixen en blastocists, s’ha vist que poden contribuir a tots els tipus cel·lulars somàtics que han estat analitzats, i també a la línia germinal (malgrat que en una freqüència molt baixa). Mentre estan en cultiu, les cèllules mare embrionàries es poden manipular genèticament per transfecció, però la recombinació homòloga no s’ha aconseguit encara de manera eficient (Stern, 2005). La progressió en aquest camp ha estat tan ràpida que probablement només es tracta d’una qüestió de temps abans que aquests mètodes es puguin perfeccionar i, per tant, aconseguir una transmissió dels trangens a la línia germinal. El genoma del pollet El primer gran pas envers la seqüenciació del genoma de pollet el va fer, el març del 2003, a partir de la producció i seqüenciació de seixanta-quatre genoteques de cDNA de vint-i-un teixits embrionaris i Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 155-164

adults diferents, un consorci liderat pel Roslin Institute of Edinburg, l’UMIST de Manchester, i les universitats de Dundee i Nottingham (Regne Unit). Això va generar 339.314 seqüències EST que es van acabar assemblant en aproximadament deu mil gens (Boardman et al., 2002). Es van anar afegint EST d’altres genoteques d’altres projectes, i es van acabar generant unes cinc-centes mil seqüències d’EST (vegeu la bibliografia en xarxa). Al març del 2004 es va publicar el primer esborrany del genoma complet de pollet, complementat per la producció de genoteques de bacterial artificial chromosomes (BAC), la identificació d’un gran nombre de single nucleotide polymorphisms (SNP) (International Chicken Polimorphism Map Consortium, 2004), i la compilació d’un mapa genètic per al genoma del pollet. La seqüenciació final va ser aconseguida pel consorci liderat per la Universitat de Washington (St. Louis, EUA), que va utilitzar una aproximació per clonatge a l’atzar. La primera versió de l’anotació va ser al maig, i l’anàlisi inicial es va publicar a Nature al juny (International Chicken Genome Sequencing Consortium, 2004), juntament amb els articles mencionats. El genoma del pollet té un contingut haploide de 1,2 × 10 9 parells de bases organitzats en quaranta cromosomes (que inclouen els cromosomes sexuals W i Z, tenint en compte que la femella és heterogamètica WZ). L’esborrany de la seqüència comprèn el 91 % del genoma, del qual un 89 % es mapa en cromosomes identificables. El genoma és molt compacte, i es prediu que conté entre 20.000 i 23.000 gens que codifiquen proteïnes (en la part baixa dels genomes de mamífers) i aproximadament 600 RNA no codificants. Els gens codificants presenten gran similitud amb els gens humans. Aquest és el primer genoma seqüenciat d’un amniota no mamífer, i des que va sor-

162 C. PUJADES

tir l’esborrany ha estat una molt bona eina, particularment per als estudis de genòmica comparada, sobretot en la identificació de les regions conservades no codificants, a causa de la posició de la branca dels ocells respecte als altres vertebrats en l’arbre evolutiu i a la compactació del seu genoma. Es creu que els ocells i els mamífers van divergir fa 310 milions d’anys, i per tant és un esglaó important entre el genoma dels primats i el d’altres organismes vertebrats com són el peix zebra, el peix globus o Fugu, i el Xenopus. El genoma del pollet no ha sofert un procés de duplicació com el dels peixos, i per tant en la majoria de casos hi ha una correspondència de 1:1 entre els gens de mamífers i pollet, amb una gran conservació a escala de seqüències intròniques i de seqüències no codificants reguladores. Per als biòlegs del desenvolupament i també per als biòlegs evolutius, així com per a molts altres, aquestes característiques del genoma del pollet són molt bones notícies. Una de les raons més importants per portar a terme aquest projecte de seqüenciació era que la compactació del genoma del pollet facilitaria la identificació de regions reguladores importants a partir de comparacions genòmiques amb altres espècies. De totes maneres, les expectatives s’han vist una mica frustrades, ja que després de set anys seguim sense tenir l’assemblatge final i una bona anotació del genoma. Esperem que el projecte no serà abandonat per canvis en les prioritats. Imatges en desenvolupament L’embrió de pollet ha estat un dels sistemes model primaris per als estudis d’imatge, ja que és fàcilment accessible per manipular-lo i fàcil de fer créixer en cultiu. Els últims avenços en les tècniques d’imatge

han fer possible monitorar molts esdeveniments del desenvolupament (Kulesa, 2004). Ens centrarem en el marcatge cel·lular, que ens permet seguir les cèl·lules al llarg del temps, i en les noves tècniques d’imatge que s’utilitzen actualment en biologia del desenvolupament. Durant els anys vuitanta, els colorants vitals (DiI, un marcador lipofílic de la membrana plasmàtica, i altres marcadors histoquímics fluorescents) es microinjectaven en les regions d’interès de l’embrió en desenvolupament. Com que aquests marcadors s’integren en les membranes, passen a les cèl·lules filles i, per tant, a la generació de les cèl·lules marcades, i permeten així monitorar la descendència a partir de microscòpia (Stern et al., 1988). Es van desenvolupar les tècniques de microinjecció amb capil·lars per poder marcar les cèllules amb els colorants vitals. Actualment, els més utilitzats són el DiI, el DiO, i l’LRD, però aquests són només uns quants de tots el que es poden fer servir. Més recentment, la utilització de les proteïnes fluorescents, com la GFP, ha permès visualitzar durant més temps estructures cel·lulars que abans eren indetectables. La GFP és una proteïna no tòxica, que es pot introduir dins de les cèl·lules per electroporació i genera el senyal només utilitzant llum amb una longitud d’ona específica. Ara hi ha variants de diferents colors, com CFP (cyan fluorescence protein), YFP (yellow), RPF (red), tomato, cherry, etc., que varien en l’espectre d’emissió. Com que les proteïnes fluorescents són codificades genèticament, les noves varietats de proteïnes de fusió les podem dirigir a compartiments cel·lulars específics, com seria el nucli o la membrana plasmàtica. El fet de disposar de microscopis no convencionals, com són els microscopis confocals (CLSM, confocal laser scanning microscopy) o el microscopi de làser de dos fotons, i combinar-ho amb esTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 155-164

EL POLLET COM A SISTEMA MODEL: LES NOVES POSSIBILITATS D’UN MODEL CLÀSSIC 163

pectroscòpia d’imatge, ens permet resoldre l’espectre d’emissió de moltes d’aquestes proteïnes fluorescents al mateix temps (Kulesa, 2004). Així doncs, marcant les cèllules amb diferents colors és possible traçar-ne el llinatge i al mateix temps observar els canvis en els components cel·lulars. El desenvolupament de la tecnologia de les GFP fotoactivables (PA-GFP) i l’aplicació al marcatge cel·lular in vivo (Patterson i Lippincott-Schwartz, 2002) és un valor afegit als avanços esmentats anteriorment. Aquesta nova tècnica de fotoactivació de la GFP implica un canvi conformacional de la proteïna sota una longitud d’ona determinada, que fa que canviï l’espectre d’emissió i, per tant, el color. Així, es poden fotoactivar les PA-GFP en les cèl·lules embrionàries de la regió d’interès en el moment que es vulgui i seguir-ne el llinatge i destí. Ara el repte és desenvolupar modalitats d’imatge que permetin extrapolar estudis típicament fets en 2D a 3D i 4D. Un nou mètode òptic que ha generat clares expectatives és l’OPT (optical projection tomography) (Sharpe et al., 2002). Les reconstruccions d’OPT deriven d’imatges que s’obtenen d’un objecte (l’embrió sencer) que rota al voltant d’un eix. La tècnica es pot utilitzar en camp clar o amb fluorescència. Per tant, el potencial de l’OPT es basa a poder fer una correlació entre les estructures anatòmiques en 3D i els patrons d’expressió gènica.

ments reguladors, mitjançant comparacions de les regions no codificants del DNA entre el genoma del pollet i dels mamífers, que a més poden ser verificats de manera molt ràpida per electroporació d’embrions. La pèrdua i guany de funció també es poden fer de manera rutinària i fàcil. El desenvolupament de tècniques sofisticades de marcatge cel·lular i d’imatge permeten fer experiments que no s’havien ni somiat possibles. Però probablement per als biòlegs del desenvolupament els nous descobriments vindran per la combinació de les noves i antigues tecnologies: l’anàlisi del llinatge cel·lular aplicant els nous descobriments i manipulacions genètiques, i combinant-ho amb els experiments de trasplantaments de regions o territoris (embriologia experimental). La publicació de l’esborrany del genoma del pollet va estar acompanyat d’una fluïdesa de la informació entre grups de recerca que no s’havia donat abans. S’han intentat implementar congressos internacionals dedicats a aquest model, que fins ara han estat poc regulars, a fi de poder intercanviar informació sobre les noves eines desenvolupades en aquest organisme. El pollet ha començat ara una nova etapa com a model protagonista en biologia, medicina i agricultura. Esperem que les agències finançadores faran el possible per mantenir els recursos genètics ara disponibles, i aconseguir-ne per fi la seqüència final del genoma.

EL FUTUR

BIBLIOGRAFIA EN XARXA

Els nous recursos i tecnologies obren una nova era per al pollet com un sistema per a estudis en biologia del desenvolupament, genètica, biologia molecular i moltes altres disciplines. A partir d’ara ja es poden identificar de manera eficient possibles ele-

Chick ESTdatabase: http://www.chick. manchester.ac.uk/index.html Bird Base: http://ag.udel.edu/anfs/birdbase/ index.html Genome Chicken Sever Ensembl: http:// www.ensembl.org/Gallus_gallus/Info/Index

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 155-164

164 C. PUJADES

The Genome Center: http://genome.wustl. edu/genomes/view/gallus_gallus/ Imatges in vivo del desenvolupament del pollet: http://pr.caltech.edu/events/kulesa/ Gallus Expression In Situ Hybridization Analysis: http://geisha.arizona.edu/geisha/ BIBLIOGRAFIA Aragon, F.; Vazquez-Echeverria, C.; Ulloa, E.; Reber, M.; Cereghini, S.; Alsina, B.; Giraldez, F.; Pujades, C. (2005). «vHnf1 regulates specification of caudal rhombomere identity in the chick hindbrain». Dev. Dyn., 234: 567-576. Boardman, P. E.; Sanz-Ezquerro, J.; Overton, I. M.; Burt, D. W.; Bosch, E.; Fong, W. T.; Tickle, C.; Brown, W. R.; Wilson, S. A.; Hubbard, S. J. (2002). «A comprehensive collection of chicken cDNAs». Curr. Biol., 12: 1965-1969. Douarin, N. M. le (1993). «Embryonic neural chimaeras in the study of brain development». Trends Neurosci., 16: 64-72. International Chicken Genome Sequencing Consortium (2004). «Sequence and comparative analysis of the chicken genome provide unique perspectives on vertebrate evolution». Nature, 432: 695-716. Keynes, R. J.; Stern, C. D. (1984). «Segmentation in the vertebrate nervous system». Nature, 310: 786789. Kulesa, P. M. (2004). «Developmental imaging: insights into the avian embryo». Birth Defects Res. C. Embryo. Today, 72: 260-266. Lumsden, A.; Keynes, R. (1989). «Segmental patterns of neuronal development in the chick hindbrain». Nature, 337: 424-428. Nakamura, H.; Katahira, T.; Sato, T.; Watanabe, Y.; Funahashi, J. (2004). «Gain- and loss-of-func-

tion in chick embryos by electroporation». Mech. Dev., 121: 1137-1143. Palmeirim, I.; Henrique, D.; Ish-Horowicz, D.; Pourquie, O. (1997). «Avian hairy gene expression identifies a molecular clock linked to vertebrate segmentation and somitogenesis». Cell, 91: 639-648. Patterson, G. H.; Lippincott-Schwartz, J. (2002). «A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells». Science, 297: 18731877. Sharpe, J.; Ahlgren, U.; Perry, P.; Hill, B.; Ross, A.; Hecksher-Sorensen, J.; Baldock, R.; Davidson, D. (2002). «Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies». Science, 296: 541-545. Stern, C. D. (2000). «Conrad H. Waddington’s contributions to avian and mammalian development, 1930-1940». Int. J. Dev. Biol., 44: 15-22. ― (2005). «The chick, a great model system becomes even greater». Dev. Cell, 8: 9-17. Stern, C. D.; Fraser, S. E.; Keynes, R. J.; Primmett, D. R. (1988). «A cell lineage analysis of segmentation in the chick embryo». Development, 104 (suppl.): 231-244. Straaten, H. W. van; Thors, F.; Wiertz-Hoessels, L.; Hekking, J.; Drukker, J. (1985). «Effect of a notochordal implant on the early morphogenesis of the neural tube and neuroblasts: histometrical and histological results». Dev. Biol., 110: 247-254. Tickle, C. (2004). «The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development». Mech. Dev., 121: 1019-1029. Uchikawa, M.; Ishida, Y.; Takemoto, T.; Kamachi, Y.; Kondoh, H. (2003). «Functional analysis of chicken Sox2 enhancers highlights an array of diverse regulatory elements that are conserved in mammals». Dev. Cell., 4: 509-519. Wolpert, L. (2004). «Much more from the chicken’s egg than breakfast―a wonderful model system». Mech. Dev., 121: 1015-1017.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 155-164

DOI: 10.2436/20.1501.02.112

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 165-177

EL RATOLÍ COM A SISTEMA MODEL EN BIOLOGIA Anna Merlos-Suárez Programa d’Oncologia, Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona Adreça per a la correspondència: Anna Merlos-Suárez. Institut de Recerca Biomèdica. C. de Baldiri Reixac, 10. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: anna.merlos@irbbarcelona.org. RESUM Des de l’establiment de les primeres soques de laboratori al començament del segle xx, el ratolí s’ha convertit en una eina fonamental en la recerca en biologia. Múltiples models experimentals han permès ampliar el nostre coneixement en camps com l’embriogènesi, la fisiologia o la biomedicina, entre d’altres. El desenvolupament de les tecnologies de modificació genètica ha consolidat definitivament el ratolí com el mamífer d’elecció a l’hora de caracteritzar patrons d’expressió, funcions i interaccions entre gens, així com en la modelització de malalties humanes i l’assaig de nous fàrmacs. Aquest capítol pretén oferir una visió general de les àmplies possibilitats que es deriven de l’ús del ratolí en el laboratori i inclou exemples que demostren per què és un element clau en la recerca en biologia actualment. Paraules clau: soca, cèl·lula, expressió gènica, mutació, model transgènic. THE MOUSE AS A MODEL SYSTEM IN BIOLOGY SUMMARY Since the beginning of the 20th century, when the first laboratory strains were developed, the mouse has become a central tool in biological research. Many experimental models have allowed the broadening of our knowledge in scientific fields such as embryogenesis, physiology or biomedicine. Development of genetic modification techniques has definitely established the mouse as the mammal organism of choice for the characterization of gene expression patterns, functions and interactions among genes as well as for the modeling of human diseases and drug testing. This chapter wants to offer a general view on the possibilities derived from the use of the mouse in the laboratory, and in cludes examples showing why it has become a key element in biological research. Key words: strain, cell, gene expression, mutation, transgenic model. Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

166 A. MERLOS-SUÁREZ

La utilització del ratolí (Mus musculus) com a animal d’experimentació es remunta al segle xvii, però no va ser fins al principi del segle xx que les primeres soques que actualment s’utilitzen en el laboratori van començar a generar-se. Ja en aquell moment es va fer evident la necessitat que els animals utilitzats per a la recerca en el laboratori representessin una població el més uniforme possible per tal de garantir la fiabilitat i reproductibilitat de les observacions fetes. Així, l’any 1909 C. C. Little va establir la primera soca de ratolí endogàmica (Russell, 1978) amb l’objectiu de reduir la variabilitat genètica entre els seus individus. D’aquesta manera es generava una homogeneïtat que permetia que les úniques variables existents fossin aquelles introduïdes i controlades per l’investigador. A part de les soques endogàmiques, i utilitzant diferents sistemes d’encreuament, s’han generat també altres tipus de soques (híbrides, congènites, exogàmiques, etc.) cadascuna amb diferents característiques pel que fa a la susceptibilitat a determinades malalties, durada de la vida fèrtil,

nombre de cries per part, producció d’hormones, competència immunitària i un llarg etcètera que s’ha de considerar amb cura a l’hora d’escollir quina s’adapta millor als requisits de l’experiment que farem. La figura 1 mostra la imatge de dues de les soques més utilitzades normalment en el laboratori, la C57BL/6 i la Nude, i una llista de totes les soques de ratolí de laboratori disponibles pot trobar-se a http://www. informatics.jax.org/. Però a part de la diversitat genètica, els factors ambientals als quals els animals d’experimentació estan sotmesos poden també introduir un grau de variabilitat que afecta els resultats obtinguts i la interpretació. Per aquest motiu el control de les condicions en les quals els ratolins són estabulats és fonamental. Dieta, temperatura i humitat, hores de llum, control d’infeccions per patògens o estrès són alguns dels paràmetres que es regulen de manera estricta per garantir tant la qualitat dels experiments com el benestar dels animals. Precisament, aquest últim és un altre dels aspectes que s’ha de considerar més seriosament a l’hora de treballar amb ratolins en el laboratori. Tots els protocols experi-

a

b

INTRODUCCIÓ

Figura 1. El ratolí com a model en el laboratori. La gran varietat de soques de ratolí de laboratori disponibles actu alment permet l’elecció d’aquelles que s’ajusten millor al disseny experimental en funció de les seves característiques. a) Ratolí de la soca C57BL/6, normalment anomenada «Black 6». b) Ratolí immunodeficient de la soca Nude. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

EL RATOLÍ COM A SISTEMA MODEL EN BIOLOGIA 167

mentals que involucren l’ús de ratolins han de ser aprovats per un comitè ètic que valora si compleixen la legislació vigent. D’aquesta manera, es pretén assegurar que el patiment dels animals durant el procediment es redueix al màxim, així com que el nombre d’animals utilitzats és el mínim indispensable. Són diverses les característiques que converteixen el ratolí en un dels models més emprats en la recerca en biologia. Un dels seus principals avantatges és la similitud que té amb l’ésser humà tant a escala genètica com anatòmica i fisiològica. A això se suma la seva mida petita, que en comparació de la resta de mamífers usats en el laboratori (rata, conill, porc, gos, etc.) en facilita la manipulació i estabulació. A més, la durada del cicle reproductiu (entre dinou i vint-i-un dies en funció de la soca) i l’elevat nombre de cries en cada ventrada (de quatre a catorze també depenent de la soca) fan que la formació de colònies i l’anàlisi de la descendència siguin relativament ràpids. Finalment, les tècniques de manipulació genètica han demostrat funcionar de manera molt eficient en el ratolí, fet que n’incrementa encara més el potencial com a model de laboratori. No obstant això, i com succeeix també en altres models de vertebrats, hi ha factors com la redundància gènica que de vegades en dificulten l’ús. A continuació, es comenten les principals aplicacions del ratolí com a organisme model en biologia i s’inclouen alguns exemples que en demostren la utilitat, fent especial èmfasi en els ratolins modificats genèticament.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

PRINCIPALS APLICACIONS DEL RATOLÍ EN EL LABORATORI Aquest apartat comenta de manera breu alguns dels usos més comuns del ratolí. Les aplicacions del ratolí en el laboratori són molt àmplies i abasten l’estudi de pràcticament tots els aspectes de la biologia i patofisiologia de l’organisme. El ratolí ha resultat ser un model molt útil en camps com el desenvolupament embrionari, l’homeòstasi de teixits adults, la fisiologia o l’etologia. El gran nombre d’estudis existents en cadascun d’aquests camps dificulta resumir-los i va més enllà de l’abast d’aquest capítol. Tanmateix, per a una informació àmplia i detallada sobre aquests aspectes el llibre The laboratory mouse és una excel·lent referència (Hedrich et al., 2006). Assaigs preclínics L’ús del ratolí és de gran importància en els assaigs preclínics de fàrmacs de desenvolupament nou. Abans que aquests compostos siguin aprovats per utilitzar-los en humans (assaigs clínics), la toxicitat, farmacocinètica i eficàcia han de ser avaluades en el laboratori amb l’objectiu d’establir els possibles beneficis o riscs derivats de l’administració i d’optimitzar-ne les condicions. Un dels exemples més habituals és el dels assaigs preclínics de teràpies antitumorals (Kelland, 2004). La base d’aquests assaigs és la injecció en ratolins de cèl·lules cancerígenes humanes que creixen i donen lloc a tumors similars als que desenvolupen els pacients. Els animals són aleshores tractats amb els fàrmacs en prova seguint diferents pautes i dosis d’administració, i es monitoren paràmetres com l’eficàcia en l’eliminació de cèl·lules cancerígenes o els possibles efectes secundaris. La soca de ratolí utilitzada en aquests experi-

168 A. MERLOS-SUÁREZ

ments és un factor crític per garantir-ne l’èxit. Els xenoempelts, o implantacions de cèl·lules procedents d’una altra espècie (en aquest cas humanes), desencadenen en l’hoste una resposta immunitària destinada a reconèixer i eliminar les cèl·lules estranyes. Així, per evitar el rebuig de les cèl·lules tumorals humanes cal utilitzar soques immunodeprimides, que no tenen la capacitat de respondre immunitàriament a antígens externs i destruir-los. Dues de les soques de ratolins immunodeprimits més utilitzades en el laboratori són la Nude (vegeu la figura 1b), que no té timus, i per tant, no té limfòcits T per una mutació en el gen Foxn1 (Segre et al., 1995), i la NOD Scid, portadora d’una mutació que afecta la funció dels limfòcits B i T (Fullop i Phillips, 1990). És important tenir en compte que a més de ser molt útils en experiments de tumorigenicitat i assaigs preclínics, aquestes soques representen en si mateixes models animals per a síndromes d’immunodeficiències humanes. Models de malalties humanes Una de les aplicacions que fa del ratolí un dels animals més emprats en biologia és la seva relativa similitud amb l’ésser humà i el potencial que això representa a l’hora de generar models que reprodueixin de manera fidel malalties humanes i que permetin tant l’estudi del desenvolupament com l’assaig de teràpies experimentals. La generació d’un model acurat de malaltia humana requereix, en molts casos, la manipulació genètica dels animals (vegeu més endavant). Això només és possible quan les alteracions gèniques responsables d’iniciar la malaltia són conegudes, almenys en part, i suposa a més un disseny experimental molt complex i una important inversió econòmica. No obstant això,

hi ha també models de malalties generats sense necessitat d’alterar el material genètic de l’animal i mitjançant, per exemple, l’administració de substàncies (toxines, hormones, etc.) o intervencions quirúrgiques que indueixen condicions comparables a les descrites en certes malalties. Aquest és el cas d’alguns models de pancreatitis, inflamació del pàncrees que quan cursa de manera crònica és un possible factor de risc per al desenvolupament de càncer de pàncrees. L’administració d’anàlegs hormonals com la ceruleïna o l’obstrucció del conducte pancreàtic mitjançant el lligament provoquen lesions equivalents a les que pateixen els pacients de pancreatitis i proporcionen un model a partir del qual podem estudiar, per exemple, les possibles estratègies per a la regeneració d’aquest òrgan (Sakaguchi et al., 2006). Un altre model molt utilitzat en el laboratori és el de la colitis ulcerativa, que és induïda mitjançant l’administració en l’aigua d’un potent agent inflamatori (dextran sodi sulfat, DSS) que provoca l’erosió de l’epiteli colònic i reprodueix així la simptomatologia dels pacients d’aquesta malaltia (Okayasu et al., 1990). Producció d’anticossos monoclonals La producció d’anticossos monoclonals destinats a la detecció o purificació de determinats antígens, o fins i tot en alguns casos al tractament de certes malalties, se serveix també del ratolí com una de les seves principals eines. La tecnologia dels anticossos monoclonals es va desenvolupar fa més de trenta anys (Schwaber i Cohen, 1973) i representa una de les aplicacions més importants del ratolí en el laboratori.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

EL RATOLÍ COM A SISTEMA MODEL EN BIOLOGIA 169

RATOLINS MODIFICATS GENÈTICAMENT Els ratolins modificats genèticament permeten estudiar pràcticament tots els aspectes de la fisiologia i patologia animal a escala dels gens que hi són implicats. Aquest avanç ha esdevingut possible gràcies al desenvolupament de la tecnologia del DNA recombinant, que permet la manipulació del genoma de manera que es poden mutar (afegir, substituir o eliminar) seqüències, en funció de quines siguin les preguntes que l’investigador es planteja i la informació que es vol obtenir. A continuació es comenten els diferents tipus de modificació genètica existents i la metodologia per generar animals modificats genèticament i algunes de les seves aplicacions. Mutagènesi a l’atzar La mutagènesi a l’atzar, com el seu nom indica, consisteix en l’alteració de seqüències genòmiques que no han estat prèviament determinades per l’investigador. Aquesta metodologia s’empra quan l’objectiu de l’estudi és identificar gens implicats en un determinat procés biològic, sense haver fet una decisió prèvia sobre els gens que es volen investigar. Al contrari de les tècniques que es comenten més endavant, en aquest cas el subjecte d’interès no és un gen determinat sinó un fenotip, i per tant l’investigador seleccionarà per a l’anàlisi aquells gens que, en ser mutats, afecten el fenotip d’estudi (assaig basat en el fenotip). Tècnicament, això s’aconsegueix mitjançant l’administració d’un agent (químic o radiació) que indueix mutacions en el genoma del ratolí de manera aleatòria. El mutagen químic més àmpliament utilitzat és l’etilnitrosourea (ENU), un compost alquilant que provoca mutacions puntuals Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

en el DNA (Russell et al., 1979). Si aquestes mutacions recauen en la seqüència corresponent a un gen o en una de les regions que en controlen l’expressió, es pot produir un guany o pèrdua de funció, de manera que les vies de senyalització o processos biològics en els quals participa aquest gen es poden veure afectats. Les mutacions que afectin les cèl·lules germinals de l’animal tractat són transmeses a la seva descendència, de manera que cada ratolí fill incorpora una mutació única i diferent de la dels seus germans de ventrada. L’anàlisi del fenotip d’interès en cadascun d’aquests animals genèticament manipulats permet identificar aquelles mutacions que provoquen una alteració en aquest fenotip, i per tant, els gens que hi estan involucrats (Nolan et al., 2000). Un exemple de la utilitat de la mutagènesi a l’atzar són els estudis fets pel grup de K. V. Anderson, en els quals el procés biològic d’interès és la morfogènesi durant el desenvolupament embrionari. Amb l’objectiu d’identificar gens que participen en aquest procés es va administrar ENU a un grup de ratolins que posteriorment es van encreuar amb animals salvatges per obtenir-ne descendència. Els investigadors van analitzar els embrions derivats d’aquests encreuaments i van seleccionar aquells que presentaven anomalies morfològiques en comparació d’embrions salvatges. Mitjançant tècniques de seqüenciació i lligament genètic, es van identificar quaranta-tres gens que en ser mutats generen defectes en la morfogènesi. Cal destacar que trenta-vuit d’aquests quaranta-tres gens no havien estat estudiats prèviament, cosa que demostra el poder d’aquesta tècnica a l’hora d’identificar i relacionar nous gens amb processos i vies de senyalització coneguts (García-García et al., 2004). L’acció mutagènica de l’ENU ha estat utilitzada per al cribratge de gens descrit a

170 A. MERLOS-SUÁREZ

dalt, i a més per a la inducció de tumorigènesi en animals amb alteracions genètiques, amb l’objectiu d’establir si aquestes proporcionen predisposició al desenvolupament tumoral (Mitsumori et al., 2000).

Ratolins transgènics Una de les aproximacions experimentals més utilitzades a l’hora de caracteritzar la funció d’un gen es basa a induir-ne la sobreexpressió introduint a l’atzar en el ge-

Figura 2. Estratègies de manipulació genètica per a la generació de ratolins model en el laboratori. Diferents estratègies basades en la tecnologia del DNA recombinant permeten modificar de manera controlada l’expressió gènica en el tipus cel·lular i moment del desenvolupament que vulguem. a) La transgènesi consisteix en la inserció en el genoma del ratolí d’un gen heteròleg (transgèn) acompanyat d’una regió reguladora, o promotor, que en controla l’expressió. Aquesta inserció implica un fenomen de recombinació no homòloga (a l’atzar), de manera que el lloc del genoma en el qual s’integrarà el gen no és conegut ni pot ser escollit a priori. Quan el promotor que acompanya el transgèn és induïble, l’expressió només tindrà lloc en presència de l’agent inductor. b) La tècnica coneguda com a genomodificació comporta la substitució d’una de les còpies d’un gen endogen per un gen heteròleg (gen reporter, toxina, etc.). Aquesta es tratègia requereix un procés de recombinació homòloga (marcada amb dues creus a la figura) que garanteix que el gen s’inserirà en el locus que volem i reproduirà el patró d’expressió del gen endogen. c) La genoanul·lació d’un gen consisteix en l’eliminació, parcial o total, de la seva seqüència amb l’objectiu de silenciar-ne l’expressió o la funcionalitat de la proteïna que codifica. En un model de genoanul·lació constitutiu el gen és eliminat en totes les cèl·lules de l’organisme mitjançant recombinació homòloga. En una genoanul·lació condicional, en canvi, el tipus cel·lular i moment de la deleció són controlats mitjançant l’expressió de la Cre-recombinasa sota el control d’un promotor específic de tipus ce l·lular o induïble. P: promotor; PI: promotor induïble. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

EL RATOLÍ COM A SISTEMA MODEL EN BIOLOGIA 171

noma una o diverses còpies addicionals de la seqüència (transgèn) (vegeu la figura 2a). D’aquesta manera, i analitzant el fenotip de l’animal transgènic, és possible identificar els processos biològics en els quals participa el gen. Una variant d’aquesta tècnica consisteix a introduir mutacions en la seqüència del transgèn amb l’objectiu de generar una versió modificada de la proteïna que codifica normalment. Tal modificació pot donar lloc a una activitat constitutiva de la proteïna, independent dels mecanismes de regulació propis de la cèl·lula que l’expressa o, al contrari, una proteïna inactiva que a més interfereixi amb la forma salvatge endògena (dominant negatiu). En aquest últim cas, el resultat final és l’equivalent a una pèrdua de funció del gen, cosa que també aporta informació sobre les vies en les quals està involucrat. La seqüència codificant d’un gen ha d’anar acompanyada d’una regió reguladora (promotor), que és fonamental per determinar en quin moment i teixit s’expressa el gen. L’elecció del promotor que acompanya el transgèn aporta, doncs, molta flexibilitat al disseny experimental, i permet també algunes variacions. El promotor escollit pot ser específic del tipus cel·lular en el qual el gen d’interès s’expressa normalment, però alternativament és possible l’ús d’un promotor corresponent a un tipus cellular en el qual el gen mai no és actiu amb l’objectiu d’analitzar l’efecte de l’expressió ectòpica. L’exemple més ampli d’aquest cas és la utilització d’un promotor ubic, com per exemple el de l’actina, que s’expressa en totes les cèl·lules de l’organisme, i per tant permet analitzar els efectes de l’expressió del gen d’interès en tots els teixits. Finalment, l’ús d’un promotor induïble (només actiu en presència d’un compost d’administració externa) fa possible l’expressió del transgèn no solament en el lloc sinó també en el moment que volem (emTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

brió, nounat, adult, etc.) (vegeu la figura 2a). L’expressió induïble d’una forma constitutivament activa de l’oncogèn KRas (KRas G12D) és un exemple clàssic de la utilitat dels animals transgènics a l’hora d’estudiar els mecanismes involucrats en la iniciació de càncers com el de pàncrees (Aguirre et al., 2003). Ratolins genomodificats La genomodificació consisteix també en la inserció d’un gen heteròleg en el genoma però en aquest cas, i a diferència de la transgènesi, aquesta inserció no es fa a l’atzar, sinó que és dirigida a un locus determinat. Això és possible gràcies a un procés de recombinació homòloga (vegeu la figura 2b). D’aquesta manera el gen introduït s’expressa sota el control del promotor del locus escollit, substitueix el gen endogen i en reprodueix el patró d’expressió espacial i temporal. Aquests models acostumen a mantenir-se en heterozigosi (se substitueix una sola còpia del gen endogen), ja que habitualment una sola còpia del gen heteròleg és suficient per a la seva funció, i d’altra banda la substitució dels dos al·lels endògens podria comprometre la viabilitat de l’animal. Una de les aplicacions d’aquesta tècnica és determinar el patró d’expressió del gen substituït. Quan no hi ha anticossos per a la detecció de la proteïna codificada pel gen estudiat, freqüentment aquest se substitueix per un gen reporter ―per exemple, proteïna fluorescent verda (GFP) o lacZ― que permet visualitzar en quin moment del desenvolupament i tipus cellular és actiu el promotor del gen d’interès. Un exemple d’aquest cas és el del gen Lgr5. Lgr5 és actiu en les cèl·lules troncals del tracte gastrointestinal (estómac, intestí prim i còlon) i per estudiar-ne en detall

172 A. MERLOS-SUÁREZ

l’expressió els investigadors van generar un model genomodificat en el qual el gen reporter GFP es va inserir sota el control del promotor de Lgr5, de manera que va interrompre la seqüència del gen endogen i en va eliminar així l’expressió (Barker et al., 2007). El gen GFP codifica la proteïna fluorescent verda, que permet identificar les cèl·lules que l’expressen mitjançant la visualització amb microscòpia de fluorescència (vegeu la figura 3a). Aquesta és, per tant, una manera indirecta de monitorar l’expressió del gen.

Un altre dels casos en què la tècnica de la genomodificació ha mostrat ser de gran utilitat és l’ablació cel·lular. Una de les maneres d’estudiar la funció d’un determinat tipus cel·lular en un teixit és analitzar les conseqüències que en té l’eliminació sobre el desenvolupament, la fisiologia o el comportament de l’animal. Aconseguir l’ablació d’un tipus cel·lular concret és possible gràcies a l’expressió d’un gen letal (per exemple, el que codifica la toxina diftèrica) en les cèl·lules que es volen eliminar (Palmiter et al., 1987). Amb aquest objectiu, el

Figura 3. Exemples de ratolins modificats genèticament. a) Model genomodificat en el qual el gen de la proteïna fluorescent verda (GFP) ha estat introduït en el locus del gen Lgr5 (Lgr5-EGFP). Una secció de l’intestí prim d’aquest animal mostra que el promotor de Lgr5 s’expressa específicament a les cèl·lules mare intestinals que es localitzen al fons de les criptes (cèl·lules verdes). b) Secció del budell prim d’un animal control (WT). Les cèl·lules de Paneth (cèl·lules diferenciades marcades de color marró per a l’expressió del gen del lisozim) es localitzen al fons de la cripta, juntament amb les cè l·lules mare. c) En un animal genoanul·lat doble per als gens ephb2 i ephb3 (ephb2–/–; ephb3–/–) les cèl·lules de Paneth no es localitzen correctament al fons de la cripta intestinal (fletxes negres), cosa que demostra que aquests dos gens són necessaris per al posicionament correcte d’aquest tipus cel·lular. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

EL RATOLÍ COM A SISTEMA MODEL EN BIOLOGIA 173

gen letal s’insereix en el genoma específicament sota el control d’un promotor actiu únicament en les cèl·lules d’estudi, i substitueix el gen que controla normalment aquest promotor. Les cèl·lules moriran en el moment en què el gen letal comenci a expressar-se i aleshores l’efecte de l’eliminació podrà ser analitzat. Una modificació d’aquesta estratègia és la inserció del gen que codifica el receptor de la toxina diftèrica, en lloc de la toxina mateixa. Aquest sistema permet eliminar les cèl·lules d’interès en el moment que vulguem, a través de l’administració controlada de la toxina. Aquest model s’ha utilitzat, entre molts altres casos, per estudiar la regeneració de les cèl·lules β-pancreàtiques (Thorel et al., 2010) o per identificar les neurones responsables del control de la ingesta en ratolins adults (Luquet et al., 2005). Ratolins genoanul·lats La genoanul·lació, com indica el seu nom, comporta l’eliminació (total o parcial) dels dos al·lels d’un gen endogen i permet, per tant, establir quina és la seva funció per defecte. La generació de ratolins genoanul·lats es basa també en la tecnologia de la recombinació homòloga, que permet silenciar el gen que es vol estudiar mitjançant la inserció d’un fragment de DNA heteròleg que interromp la seqüència i fa que el gen no es transcrigui o es transcrigui amb alteracions que el fan inactiu (vegeu la figura 2c). Els primers models de genoanul·lació en ratolí van ser generats gràcies als treballs dels investigadors M. Capecchi, M. Evans i O. Smithies (Thomas i Capecchi, 1987; Doetschman et al., 1987), que van obtenir el Premi Nobel de Medicina l’any 2007 pel desenvolupament d’aquesta tecnologia i les àmplies aplicacions que ha tingut fins avui dia. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

Un exemple clar de la utilitat d’aquesta tècnica a l’hora de definir el paper d’un gen in vivo és el de la proteïna ciclina A2, involucrada en la regulació del cicle cel·lular. La deleció del gen que codifica aquesta proteïna demostra que la seva funció és indispensable durant el desenvolupament embrionari, ja que els animals genoanullats moren abans de néixer (Murphy et al., 1997). Així mateix, i com s’ha comentat anteriorment, hi ha diversos exemples d’animals genoanul·lats que serveixen com a model de malalties humanes. Un dels més ben caracteritzats és el de la fibrosi quística, descrit pel grup de M. J. Evans. En generar una deleció de tan sols tres parells de bases en el gen cftr els investigadors van aconseguir reproduir la malaltia humana, en la qual la proteïna codificada per aquest gen es transcriu però no és funcional a causa de l’absència d’un aminoàcid en la seva seqüència (Colledge et al., 1995). Els models genoanul·lats comentats fins ara comporten la inactivació de la funció del gen en la línia germinal, fet que implica que aquest no s’expressa (o ho fa de manera no funcional) en cap de les cèl·lules de l’organisme al llarg de tota la seva vida. Per aquest motiu reben també el nom de genoanul·lats constitutius. Els models genoanul·lats condicionals, en canvi, estan dissenyats perquè el gen d’interès sigui eliminat únicament en el tipus cel·lular o teixit que es vol estudiar i s’evitin així interferències en els resultats degudes a l’efecte de la deleció en altres òrgans. La generació de genoanul·lats condicionals es basa en la tecnologia de la recombinació homòloga mitjançant la recombinasa Cre (Gu et al., 1994). Breument, el gen que es vol delecionar (o alguna de les seves parts) és flanquejat per dues seqüències de DNA anomenades lox P que són reconegudes i recombinades per la recombinasa Cre en

174 A. MERLOS-SUÁREZ

les cèl·lules que l’expressen. Aquesta recombinació provoca l’eliminació del fragment del gen que es troba entre els llocs loxP, de manera que se n’interromp així la seqüència i s’impedeix la transcripció de la proteïna corresponent (vegeu la figura 2c). Per tant, l’expressió del gen que codifica la recombinasa Cre sota el control d’un promotor específic del tipus cel·lular d’interès permet la deleció del gen només en aquestes cèl·lules. En el nostre grup hem utilitzat aquest sistema per descriure com les interaccions entre els receptors EphB i els seus lligands ephrinB suprimeixen la progressió del càncer colorectal (Cortina et al., 2007). El gen efnB1 es va delecionar en les cèl·lules de l’intestí gràcies a l’expressió de la Cre-recombinasa sota el control del promotor Villin, que és actiu específicament en aquestes cèl·lules. L’encreuament d’aquests animals amb una soca susceptible a desenvolupar tumors (ratolins APC Min/+) va revelar un fenotip de tumorigènesi accelerada causada per l’expansió de les cèl·lules tumorals en absència d’ephrinB1. Finalment, la generació de genoanul·lats induïbles permet controlar no solament el lloc (tipus cel·lular), sinó també el moment en el qual el gen és delecionat. Això s’aconsegueix expressant la Cre-recombinassa sota el control d’un promotor que només és actiu en presència d’un agent inductor, com s’ha comentat anteriorment (vegeu la figura 2c). Malgrat les moltes possibilitats que ofereixen els models genoanul·lats, en alguns casos la utilització es veu complicada a causa del fenomen de la redundància, que té lloc quan la funció del gen delecionat és compensada per un altre gen, que impossibilita així la identificació del fenotip causat per l’absència del primer. De vegades és possible predir la identitat del gen redundant, que acostuma a ser un membre de la mateixa família del gen delecionat. Quan

això succeeix, aquest segon gen pot ser silenciat a la vegada que el primer i generar així un model genoanul·lat doble. Precisament l’ús de models genoanul·lats dobles ha fet possible identificar els mecanismes a través dels quals s’organitzen les cèl·lules de l’epiteli intestinal seguint una jerarquia que separa els compartiments proliferatiu i diferenciat per assegurar la localització i migració correctes de tots els tipus cel·lulars en l’epiteli (Batlle et al., 2002). Tècniques per a la generació d’animals genèticament modificats La transferència del DNA recombinant que es vol introduir en el genoma del ratolí pot aconseguir-se fonamentalment a través de dues tècniques que es comenten breument a continuació. ― Transformació de cèl·lules troncals embrionàries (cèl·lules ES). Les cèl·lules ES constitueixen la massa interna del blastocist, que esdevé finalment l’embrió. Aquestes cèl·lules poden ser aïllades i mantingudes en cultiu, cosa que en permet la manipulació genètica. Les cèl·lules ES són transfectades amb el DNA recombinant que es vol introduir en el genoma del ratolí i posteriorment injectades en un blastocist que s’implanta a l’úter d’una mare adoptiva. L’embrió que es desenvolupa a partir d’aquest blastocist conté una barreja de cèl·lules salvatges i cèl·lules modificades, i dóna lloc així a un animal quimèric. Si alguna de les cèl·lules modificades ha generat gàmetes, un determinat percentatge de la descendència que resulta d’encreuar l’animal quimèric amb un animal salvatge (F1) conté ja una còpia (heterozigot) del gen modificat en totes les seves cèl·lules (vegeu la figura 4a). Per obtenir animals homozigots (dues còpies de la modificació genètica) els animals de la F1 s’encreuen entre ells per Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

EL RATOLÍ COM A SISTEMA MODEL EN BIOLOGIA 175

produir una segona generació (F2) en la qual el 25 % dels animals portaran els dos al·lels del gen modificats. ― Injecció de pronuclis. En aquest cas el DNA recombinant s’injecta en un dels pronuclis d’òvuls fertilitzats. Aquests òvuls són aleshores implantats en una mare adoptiva i donen lloc a una descendència que és analitzada igual que en el cas anterior, per determinar la presència del gen recombinant (vegeu la figura 4b).

Noves tecnologies Basats en combinacions i modificacions de les tècniques que es descriuen a dalt, nous models de ratolí estan sent generats per permetre la realització d’experiments d’una gran sofisticació, com el marcatge genètic de cèl·lules individuals dintre d’un teixit i el monitoratge consegüent de la seva descendència (seguiment de llinatge). Aquests experiments obren la porta a l’es-

Figura 4. Tecnologia per a la generació d’animals modificats genèticament. Els diferents tipus de manipulació ge nètica descrits a la figura 2 s’aconsegueixen mitjançant la introducció del DNA heteròleg en les cèl·lules precursores que donaran lloc a l’embrió. Una manera de fer-ho és transfectant cèl·lules troncals embrionàries (cèl·lules ES) amb el material genètic que volem (a). Les cèl·lules que incorporen el DNA exogen són seleccionades mitjançant un marca dor (cèl·lules blaves) i s’injecten en la massa cel·lular interna de blastocists de ratolí, que seran llavors implantats en una mare adoptiva, on es desenvoluparan. Alternativament, el DNA recombinant pot ser injectat en un dels pronuclis d’òvuls fertilitzats, els quals s’implanten també en una mare adoptiva (b). En ambdós casos, la descendència obtinguda és analitzada per identificar els animals que han incorporat el material genètic introduït. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

176 A. MERLOS-SUÁREZ

tudi de les dinàmiques d’homeòstasi, la interacció entre tipus cel·lulars i la regeneració en diferents òrgans amb un grau de resolució impossible d’assolir amb les tècniques disponibles fins al moment (Livet et al., 2007). CONCLUSIONS Gràcies als descobriments de la tecnologia del DNA recombinant i la manipulació de cèl·lules ES des del final del segle passat ha esdevingut possible la generació de ratolins modificats genèticament. Això ha representat un salt qualitatiu que ha permès modelitzar moltes malalties humanes i dissenyar estratègies efectives per prevenirles i curar-les. La ràpida i constant evolució d’aquest camp fa fàcil preveure que durant aquest segle continuarem avançant en el nostre coneixement sobre les malalties que ens afecten, i que el ratolí seguirà tenint, com fins ara, un paper fonamental. AGRAÏMENTS Agraeixo a Eduard Batlle, Francisco Barriga i Andreu Casali els seus comentaris sobre el text, i a Xavier Hernando i Sergio Palomo les fotografies que s’inclouen en les figures. BIBLIOGRAFIA Aguirre, A. J.; Bardeesy, N.; Sinha, M.; Lopez, L.; Tuveson, D. A.; Horner, J.; Redston, M. S.; Depinho, R. A. (2003). «Activated Kras and Ink4a/ Arf deficiency cooperate to produce metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma». Genes Dev., 17: 3112-3126. Barker, N.; Es, J. H. van; Kuipers, J.; Kujala, P.; Born, M. van den; Cozijnsen, M.; Haegebarth, A.; Korving, J.; Begthel, H.; Peters, P. J.; Clev-

ers, H. (2007). «Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5». Nature, 449: 1003-1007. Batlle, E.; Henderson, J. T.; Beghtel, H.; Born, M. M. van den; Sancho, E.; Huls, G.; Meeldijk, J.; Robertson, J.; Wetering, M. van de; Pawson, T.; Clevers, H. (2002). «Beta-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB». Cell, 111: 251-263. Colledge, W. H.; Abella, B. S.; Southern, K. W.; Ratcliff, R.; Jiang, C.; Cheng, S. H.; Macvinish, L. J.; Anderson, J. R.; Cuthbert, A. W.; Evans, M. J. (1995). «Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model». Nat. Genet., 10: 445-452. Cortina, C.; Palomo-Ponce, S.; Iglesias, M.; Fernández-Masip, J. L.; Vivancos, A.; Whissell, G.; Humà, M.; Peiró, N.; Gallego, L.; Jonkheer, S.; Davy, A.; Lloreta, J.; Sancho, E.; Batlle E. (2007). «EphB-ephrin-B interactions suppress colorectal cancer progression by compartmentalizing tumor cells». Nat. Genet., 39: 1376-1383. Doetschman, T.; Gregg, R. G.; Maeda, N.; Hooper, M. L.; Melton, D. W.; Thompson, S.; Smithies, O. (1987). «Targetted correction of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells». Nature, 330: 576-578. Fullop, G. M.; Phillips, R. A. (1990). «The scid mutation in mice causes a general defect in DNA repair». Nature, 347: 479-482. García-García, M. J.; Eggenschwiler, J. T.; Caspary, T.; Alcorn, H. L.; Wyler, M. R.; Huangfu, D.; Rakeman, A. S.; Lee, J. D.; Feinberg, E. H.; Timmer, J. R.; Anderson, K. V. (2005). «Analysis of mouse embryonic patterning and morphogenesis by forward genetics». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 5913-5919. Gu, H.; Marth, J. D.; Orban, P. C.; Mossmann, H.; Rajewsky, K. (1994). «Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting». Science, 265: 103106. Hedrich, H.; Bullock, G. I.; Petrusz, P. (2006). The Laboratory Mouse. San Diego: Elsevier Press. Kelland, L. R. (2004). «Of mice and men: values and liabilities of the athymic nude mouse model in anticancer drug development». Eur. J. Cancer, 40: 827-836. Livet, J.; Weissman, T. A.; Kang, H.; Draft, R. W.; Lu, J.; Bennis, R. A.; Sanes, J. R.; Lichtman, J. W. (2007). «Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system». Nature, 450: 56-62. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

EL RATOLÍ COM A SISTEMA MODEL EN BIOLOGIA 177 Luquet, S.; Perez, F. A.; Hnasko, T. S.; Palmiter, R. D. (2005). «NPY/AgRP neurons are essential for feeding in adult mice but can be ablated in neonates». Science, 310: 683-685. Mitsumori, K.; Onodera, H.; Shimo, T.; Yasuhara, K.; Takagi, H.; Koujitani, T.; Hirose, M.; Maruyama, C.; Wakana, S. (2000). «Rapid induction of uterine tumors with p53 point mutations in heterozygous p53-deficient CBA mice given a single intraperitoneal administration of N-ethyl-N-nitrosourea». Carcinogenesis, 21: 1039-1042. Murphy, M.; Stinnakre, M. G.; Senamaud-Beaufort, C.; Winston, N. J.; Sweeney, C.; Kubelka, M.; Carrington, M.; Bréchot, C.; Sobczak-Thépot, J. (1997). «Delayed early embryonic lethality following disruption of the murine cyclin A2 gene». Nat. Genet, 15: 83-86. Nolan, P. M. [et al.] (2000). «A systematic, genomewide, phenotype-driven mutagenesis programme for gene function studies in the mouse». Nat. Genet, 25: 440-443. Okayasu, I.; Hatakeyama, S.; Yamada, M.; Ohkusa, T.; Inagaki, Y.; Nakaya, R. A. (1990). «Novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice». Gastroenterology, 98: 694-702. Palmiter, R. D.; Behringer, R. R.; Quaife, C. J.; Maxwell, F.; Maxwell, I. H.; Brinster, R. L. (1987). «Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene». Cell, 50: 435-443.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 165-177

Russell, E. S. (1978). «Origins and History of Mouse Inbred Strains: Contributions of Clarence Cook Little». A: Morse, H. C. [ed.]. In origins of inbred mice. Nova York: Academic Press, p. 33-44. Russell, W. L.; Kelly, E. M.; Hunsicker, P. R.; Bangham, J. W.; Maddux, S. C.; Phipps, E. L. (1979). «Specific-locus test shows ethylnitrosourea to be the most potent mutagen in the mouse». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5818-5819. Sakaguchi, Y.; Inaba, M.; Kusafuka, K.; Okazaki, K.; Ikehara, S. (2006). «Establishment of animal models for three types of pancreatitis and analyses of regeneration mechanisms». Pancreas, 33: 371-381. Schwaber, J.; Cohen, E. P. (1973). «Human x mouse somatic cell hybrid clone secreting immunoglobulins of both parental types». Nature, 244: 444-447. Segre, J. A.; Nemhauser, J. L.; Taylor, B. A.; Nadeau, J. H.; Lander, E. S. (1995). «Positional cloning of the nude locus: genetic, physical, transcription maps of the region and mutations in the mouse and rat». Genomics, 28: 549-559. Thomas, K. R.; Capecchi M. R. (1987). «Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells». Cell, 51: 503-512. Thorel, F.; Népote, V.; Avril, I.; Kohno, K.; Desgraz, R.; Chera, S.; Herrera, P. L. (2010). «Conversion of adult pancreatic alpha-cells to betacells after extreme beta-cell loss». Nature, 464: 1149-1154.

DOI: 10.2436/20.1501.02.113

Organismes model en biologia (Montserrat Corominas i Marc Valls, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 62 (2011) 179-190

MODELS ANIMALS PER A L’ESTUDI DE LA DIABETIS Núria Roglans, Marta Alegret i Juan Carlos Laguna Unitat de Farmacologia, Departament de Farmacologia i Química Terapèutica, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona Centro de Investigación Biomédica en Red de Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición Adreça per a la correspondència: Juan Carlos Laguna Egea. Unitat de Farmacologia, Departament de Farmacologia i Química Terapèutica, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 643. 08028 Barcelona. Tel.: 934 024 530. Adreça electrònica: jclagunae@ub.edu. RESUM La diabetis mellitus (DM) s’origina per mancança dels efectes de la insulina, bé perquè el pàncrees és incapaç de produir-ne, bé perquè els seus òrgans diana no responen ade quadament, o per una combinació d’ambdues situacions, amb l’aparició d’hiperglucèmia, poliúria i polidípsia. En absència total de la insulina (DM tipus 1) hi ha metabolisme accelerat de proteïna muscular i greix, que pot acabar en cetoacidosi metabòlica i mort. Amb activitat insulínica residual (DM tipus 2), la malaltia es cronifica, amb obesitat, micro i macroangiopaties, i les seves manifestacions clíniques (insuficiència renal, alteracions retinals, neuropaties, infart de miocardi, etc.). La DM és un problema sanitari de primer ordre i, en ser una malaltia complexa, en la qual intervenen factors genètics i adquirits, no hi ha un model animal perfecte per estudiar-la que reprodueixi totes les característiques de la malaltia humana. La majoria de models utilitzen rosegadors, per una sèrie d’avantatges: petita grandària, facilitat d’obtenció, ràpid recanvi generacional i facilitat de manipulació genètica. En aquesta revisió parlarem de models induïts, en els quals reproduïm la malaltia mitjançant una manipulació determinada, models espontanis, consistents en soques d’animals que s’han seleccionat genèticament al llarg de successives generacions per tal que manifestin la malaltia, i models obtinguts per modificació genètica. Paraules clau: diabetis, model experimental, insulina, resistència a la insulina.

Rebut: 18/02/2011. Acceptat: 30/03/2011.

180 N. ROGLANS, M. ALEGRET I J. CARLOS LAGUNA

ANIMAL EXPERIMENTAL MODELS FOR THE STUDY OF DIABETES SUMMARY Diabetes mellitus (DM) originates from a lack of insulin effects, due to a deficit of pancreatic production, or to an inadequate response of target organs, or a combination of both situations, ensuing hyperglycaemia, polyuria and polydipsia. When insulin is totally absent (Type 1 DM), there is an increased metabolism of muscular protein and fat, ending in metabolic ketoacidosis and death. With a residual insulin activity (Type 2 DM), diabetes becomes chronic, with obesity, micro- and macroangiopathies and their corresponding clinical manifestations (renal failure, retinal alterations, neuropathies, myocardial infarct, etc.). DM is a serious health problem and, as it is a complex illness, in which participate genetic and acquired factors, there is not a single perfect animal model for its study, able to reproduce all the characteristics of the human malady. The great majority of models use rodents, given their advantages: small size, easy access, fast reproduction rate, and a feasible genetic manipulation. We will discuss about induced models, in which the illness is reproduced by means of a specific manipulation, spontaneous models, comprised by animal breeds genetically selected along successive generations in order to them to develop the malady, and genetically engineered models. Key words: diabetes, experimental model, insulin, insulin resistance. INTRODUCCIÓ Aquesta revisió pretén fer una recopilació senzilla i entenedora dels models animals que s’han utilitzat al llarg dels anys en els laboratoris de recerca arreu del món per tal d’esbrinar a escala cel·lular i molecular les característiques de la diabetis mellitus, sempre amb el punt de mira final de trobar noves eines terapèutiques que permetin el control d’aquesta malaltia. Des que l’any 1922 Banting i Best (Banting i Best, 1922) van demostrar que l’administració d’extractes de pàncrees a gossos als quals s’havia extirpat aquest òrgan normalitzava les concentracions sanguínies de glucosa, els animals d’experimentació han contribuït de manera incalculable a la millora de les expectatives i la qualitat de vida dels malalts de diabetis. Abans de passar a la descripció dels diversos models animals existents, farem un resum dels co-

neixements actuals sobre la malaltia. Val a dir que per a l’obtenció de molts d’aquests coneixements, especialment aquells relacionats amb les bases moleculars de la malaltia, la utilització de models animals ha estat imprescindible. En la mesura del possible, citarem fonts d’informació en forma de revisions o compendis sobre els diversos temes, de manera que aquells lectors que hi vulguin aprofundir puguin trobar una bona base de partida sobre la qual puguin iniciar la seva cerca. DIABETIS MELLITUS La diabetis mellitus és un trastorn crònic del metabolisme energètic de l’organisme que s’origina per una mancança dels efectes d’una hormona pancreàtica, la insulina. Aquesta mancança s’origina bé perquè el pàncrees és incapaç de produir-ne, Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

MODELS ANIMALS PER A L’ESTUDI DE LA DIABETIS 181

bé perquè els òrgans que responen als efectes de la insulina (bàsicament fetge, múscul esquelètic i teixit adipós) no ho fan adequadament, o per una combinació de totes dues situacions. L’efecte més immediat del dèficit d’insulina és l’elevació de les concentracions a la sang de glucosa, el que es coneix com a hiperglucèmia (més de 7 mM en dejú o més d’11,1 mM dues hores després d’un àpat). L’excés de glucosa en sang fa que aquesta es perdi per l’orina, situació que es coneix com a glucosúria, i que no es produeix en persones sanes. La glucosa en orina arrossega una gran quantitat d’aigua, que incrementa el volum d’orina produït (poliúria) i produeix una deshidratació de l’organisme, que es tradueix en un augment de la ingestió de líquids o polidípsia. Com que les cèl·lules de l’organisme no utilitzen la glucosa a causa de la mancança d’insulina, per produir energia vital destrueixen proteïnes, cosa que condueix a una pèrdua progressiva de massa muscular, i greixos. Si aquest últim fenomen, el metabolisme excessiu dels greixos, es produeix de manera intensa i continuada, per una absència total d’insulina a l’organisme, l’acumulació en la sang de greixos parcialment metabolitzats, coneguts com a cossos cetònics (vulgarment acetona), pot induir una acidificació de la sang. Aquesta situació, anomenada cetoacidosi diabètica, constitueix una urgència mèdica que, si no es corregeix ràpidament, pot arribar a ser mortal. A llarg termini, l’alteració continuada del metabolisme afecta els vasos sanguinis, i condueix a l’aparició de macroangiopaties (quan s’afecten vasos sanguinis de gran calibre) i microangiopaties (afectació de vasos de petit calibre). La macroangiopatia comporta una acceleració en la formació de placa d’ateroma a la paret de les grans artèries, que incrementa progressivament el risc de patir un accident cardiovascular relacionat, com infart de miocarTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

di. La microangiopatia afecta primordialment la retina, els ronyons i els nervis perifèrics i, a la llarga, pot conduir a l’aparició d’insuficiència renal o ceguesa. Totes dues situacions redueixen enormement les expectatives i la qualitat de vida del pacient diabètic. Des del punt de vista de la causa inicial que origina la malaltia, podem parlar de dos tipus de diabetis: Diabetis mellitus de tipus 1 (DMT1), produïda per una reacció autoimmunitària que destrueix les cèl·lules pancreàtiques productores d’insulina. En absència de tractament insulínic substitutiu, apareix ràpidament cetoacidosi diabètica, que condueix a la mort del pacient. Diabetis mellitus de tipus 2 (DMT2), que moltes vegades s’associa a obesitat, relacionada amb la hiperinsulinèmia crònica. D’aparició més insidiosa en el temps, es deu a un defecte dels teixits diana de la insulina (fetge, múscul esquelètic i teixit adipós), que dificulta la manifestació dels efectes d’aquesta hormona, fenomen anomenat resistència a la insulina, moltes vegades associat a una alteració en la secreció d’insulina. A l’inici de la malaltia, el pàncrees reacciona produint més quantitat d’insulina, per contrarestar aquesta resistència tissular, de manera que no és estrany trobar pacients amb DMT2 amb concentracions anormalment elevades d’insulina en sang (hiperinsulinèmia). Amb els anys, el pàncrees esgota la seva capacitat de produir insulina, i apareix hipoinsulinèmia, de manera que molts pacients que s’han mantingut estables amb dieta i tractament amb fàrmacs com els hipoglucemiants orals o els sensibilitzadors a la insulina, necessiten finalment l’administració d’insulina exògena per al control adequat de la malaltia. La incidència de diabetis mellitus està arribant a proporcions pandèmiques, amb una estimació de 151 milions de casos l’any 2000 (Engelgau, 2003) i previsions de 500

182 N. ROGLANS, M. ALEGRET I J. CARLOS LAGUNA

milions de casos per a l’any 2025 (Hansen, 1999), concentrats especialment als EUA, la Xina i l’Índia (King, 1998). D’aquests casos, aproximadament un 90-95 % són de DMT2. Encara que al segle passat la gran majoria de casos diagnosticats de DMT2 eren en pacients d’edats superiors als cinquanta anys, cada vegada els nous casos diagnosticats de DMT2 es presenten en pacients més joves (Drake, 2002), cosa que incrementa el risc de manifestacions patològiques micro i macroangiopàtiques amb els anys. Per tant, la diabetis mellitus és, avui dia i en un futur pròxim, un problema sanitari de primer ordre. MODELS ANIMALS DE DIABETIS MELLITUS: CONSIDERACIONS GENERALS La diabetis mellitus és una malaltia complexa, multifactorial, en la qual intervenen factors genètics i adquirits, especialment relacionats amb els hàbits dietètics i l’estil de vida de cada individu. Per tant, és evident que no hi ha un model animal perfecte, que representi i reprodueixi totes les característiques de la malaltia humana; en molts casos, se solen utilitzar diversos models animals complementaris, a fi d’obtenir dades experimentals que s’apropin el més possible a la situació humana. Encara que s’utilitzen diverses espècies de mamífers en l’estudi de la diabetis, com gossos, simis, etc., una gran majoria de models experimentals utilitzen espècies de rosegadors, ratolins o rates, per una sèrie d’avantatges evidents: petita grandària, cosa que redueix les despeses d’estabulació i en facilita la manipulació, facilitat d’obtenció, ràpid recanvi generacional i facilitat de manipulació genètica, especialment en ratolins. De manera general, parlarem de tres tipus bàsics de models experimentals:

models induïts, en el quals provoquem la malaltia en l’animal d’experimentació mitjançant una intervenció quirúrgica, l’administració d’una toxina determinada, una dieta específica o una combinació d’aquestes possibilitats; models espontanis, consistents en soques d’animals que s’han seleccionat genèticament al llarg de successives generacions per tal que manifestin la malaltia o alguna de les seves característiques; en aquest sentit, el procés condueix a un enriquiment de gens i fenotips que no han d’estar necessàriament implicats tots en la producció de la malaltia. Finalment, el tercer tipus comprèn animals modificats genèticament, per ablació o sobreexpressió de gens o combinacions de gens, que estan contribuint enormement al desxiframent de les bases moleculars de la diabetis. Per a una informació més extensa i detallada sobre el tema, referirem el lector a les excellents monografies de MacNeil (1999) i Sima i Shafrir (2001); pel que fa a models que representin les complicacions vasculars associades a la diabetis, és molt interessant la revisió de Thompson (2008). En la taula 1 es presenta un resum dels diversos models experimentals de diabetis induïts i espontanis. MODELS ANIMALS DE DMT1 Com ja hem comentat, la DMT1 es caracteritza per l’absència total de producció d’insulina, a causa d’una reacció autoimmunitària que destrueix les cèl·lules productores pancreàtiques. Un dels primers models de diabetis mellitus utilitzats, el gos amb el pàncrees extirpat de Banting i Best (1922), és, de fet, un model de DMT1 induït quirúrgicament. Avui dia s’utilitza més com a model induït la destrucció química de les cèl·lules pancreàtiques de rata per administració d’estreptozotocina, un Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

MODELS ANIMALS PER A L’ESTUDI DE LA DIABETIS 183 Taula 1.

Classificació dels models animals de diabetis, excloent-hi els models obtingut per modificació genètica

Tipus de Model Induït

Espontanis Anàlegs

DMT1 Extirpació pancreàtica Administració d’estreptozotocina

DMT2 Dietes riques en greixos Estreptozotocina neonatal Corticosteroides Ratolí ALS/Lt més al·loxà

Ratolí NOD

Ratolí NZO Ratolí KK Ratolí NSY Ratolí TSOD Ratolí M16 Rata GK Rata OLEFT Rata Cohen Rata de la sorra o del desert Macaco Rhesus Ratolins db/db i ob/ob Ratolí Akita Ratolí Agouti Rates ZF i ZDF Rates SHR/N-cp i JCR/LA-cp

Rata BB

Intrínsecs

antibiòtic d’ampli espectre amb activitat alquilant. L’estructura molecular d’aquest compost, que conté una molècula de glucosa, fa que sigui internalitzada pels transportadors cel·lulars de glucosa i es concentri de manera massiva en les cèl·lules pancreàtiques productores d’insulina, on produeix l’efecte tòxic (Arias-Díaz, 2007). Encara que una dosi única massiva d’estreptozotocina pot induir diabetis en rates, és més freqüent utilitzar una dosificació múltiple a dosis petites (40 mg/dia en cinc dies consecutius), que produeix una insulinopènia en la qual participa una certa reacció autoimmunitària al pàncrees. En qualsevol cas, la participació del sistema immunitari en els models induïts, a diferència de la malaltia humana, és mínima. Molt més utilitzats són els models espontanis de DMT1, com el conill blanc New Zealand, el gos Keeshond i, especialment, el ratolí NOD (non-obese diabetic) i la rata BB (bio breeding). En aquests dos models hi ha una participació autoimmunitària en la Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

producció de la malaltia, amb atac per part de limfòcits B i T, així com macròfags i cèllules NK (natural killer), al teixit pancreàtic. En conseqüència, l’administració preventiva de fàrmacs immunosupressors a aquests animals retarda de manera manifesta l’aparició de la DMT1 (Rees, 2005). Ratolins NOD Aquests ratolins, caracteritzats fa més de vint-i-cinc anys, presenten a les 4-5 setmanes de vida hipoinsulinèmia per destrucció progressiva espontània de les cèl·lules βpancreàtiques productores d’insulina, que es manifesta en forma de clara malaltia diabètica entre les dotze i trenta setmanes de vida. Encara que les manifestacions de la malaltia en aquest model són molt similars a la malaltia humana, s’ha d’indicar que els ratolins NOD no solen presentar una cetoacidosi molt marcada, per la qual cosa poden sobreviure un temps considerable

184 N. ROGLANS, M. ALEGRET I J. CARLOS LAGUNA

(setmanes) sense l’administració d’insulina exògena. Rata BB Aquesta soca de rates deu el seu nom al laboratori comercial, Bio Breeding Laboratories, d’Ottawa, Canadà, que la va caracteritzar primer l’any 1974. Al voltant de les dotze setmanes de vida, aquestes rates manifesten pèrdua de pes, poliúria, polidípsia, hiperglucèmia i insulinopènia, i, a diferència dels ratolins NOD, cetoacidosi severa que necessita l’administració immediata d’insulina. En els darrers anys, s’està incrementant la utilització de models d’animals modificats genèticament per a l’estudi de la DMT1. Entre aquests podríem citar el ratolí OVE26, en el qual s’ha induït la sobreexpressió del gen de la calmodulina en les cèl·lules pancreàtiques productores d’insulina. Com a resultat d’aquesta modificació, els animals desenvolupen hiperglucèmia, hipoinsulinèmia i hipertrigliceridèmia. Aquest model es pot induir en el ratolí NOD, i produeix una alteració diabètica molt més intensa que la que presenta el ratolí NOD no modificat. Igualment, es pot induir DMT1 amb estreptozotocina en un model modificat genèticament; és el cas, per exemple, de la rata (mRen-2)27, hipertensa per sobreexpressió del sistema renina-angiotensina, o el ratolí HuBtg, que expressa l’apolipoproteïna B humana (Thompson, 2008). MODELS ANIMALS DE DMT2 La DMT2 es presenta de manera espontània en diverses espècies de mamífers, tant en animals de companyia com de ramaderia, i molts dels models utilitzats avui

dia en la recerca de la DMT2 manifesten una complexitat i una heterogeneïtat similar a la presentada per la malaltia humana. Per a una informació més extensa, el lector es pot adreçar a les revisions de Chen i Wang (2005), Masiello (2006), Srinivasan i Ramarao (2007) i Nugent et al. (2008). Models induïts de DMT2 Tradicionalment s’han utilitzat models induïts de DMT2 per administració de dieta, sobre tot dieta rica en greixos (bàsicament en ratolins de la soca C57BL/6J), fàrmacs i toxines, especialment els corticosteroides i, de nou, l’estreptozotocina. El model de DMT2 induïda per administració de dosis elevades i sostingudes de corticosteroides a animals d’experimentació com la rata és idoni per a l’estudi de la DMT2 humana induïda precisament per tractament amb corticosteroides durant llargs períodes de temps, com és el cas de la immunosupressió associada als trasplantaments d’òrgans. En el cas de l’estreptozotocina, s’ha demostrat que l’administració a animals d’experimentació (rates, gossos, etc.) en el període neonatal predisposa l’animal a patir DMT2 en l’edat adulta, atès que la recuperació pancreàtica dels animals tractats amb la toxina és incompleta. Recentment s’ha caracteritzat una soca de ratolí (ALS/Lt) altament susceptible a l’al·loxà, una molècula tòxica per a les cèl·lules pancreàtiques productores d’insulina. Els mascles d’aquesta soca poden manifestar hiperinsulinèmia i intolerància a la glucosa a les 6-8 setmanes de vida sense necessitat d’administrar la toxina. De totes maneres, avui dia s’està estenent enormement la utilització de models d’inducció de DMT2 no tradicionals, per modificació genètica, dels quals parlarem posteriorment.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

MODELS ANIMALS PER A L’ESTUDI DE LA DIABETIS 185

Models espontanis de DMT2 Entre els models espontanis de DMT2 val la pena diferenciar entre models anàlegs i models intrínsecs. Els primers són models constituïts pel tipus clàssic de selecció genètica al llarg de generacions, que condueix a l’establiment de soques d’animals que manifesten de manera espontània, per un enriquiment d’alteracions genètiques diverses i, moltes vegades, desconegudes, una malaltia molt similar, si no idèntica, a la humana. Els models intrínsecs, al contrari, desenvolupen la simptomatologia de DMT2 per una mutació específica, puntual, en un gen determinat. Encara que la malaltia humana és, com ja hem comentat, de naturalesa poligènica, els models espontanis intrínsecs ens permeten establir recerques específiques sobre determinades molècules o vies metabòliques i establir-ne el paper determinant o no en la malaltia humana (Arias-Díaz, 2007). Entre els models espontanis anàlegs de DMT2 podem destacar els següents: Rata Goto-Kakizaki (GK). Aquest model, desenvolupat al Japó a la dècada dels noranta del segle passat a partir de rates de la soca Wistar amb nivells de glucosa plasmàtics en el límit de la normalitat, és un dels que millor reprodueix la malaltia humana, i presenta igualment complicacions renals, retinals i als nervis perifèrics. Així mateix, l’estudi d’aquesta soca ha permès determinar que la hiperglicèmia in utero indueix un desenvolupament pancreàtic anormal que facilita l’aparició de DMT2 a l’edat adulta. Ratolí New Zealand obès (NZO). Aquests ratolins presenten, des del seu naixement, obesitat per hipertròfia de les cèl·lules del teixit adipós, associada a resistència a la insulina, i no manifesten hiperglicèmia fins a les setze setmanes de vida. Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

Ratolí KK (Kuo-Kondo). Aquesta soca, també originada al Japó, és, juntament amb la rata GK, una de les que reprodueix la malaltia humana amb més fidelitat. Originada per l’encreuament continuat de ratolins propensos a l’obesitat, els ratolins KK adquireixen de manera progressiva, en ferse adults, obesitat, resistència a la insulina als teixits perifèrics, i hiperinsulinèmia de compensació que no pot evitar l’aparició d’una hiperglucèmia moderada. És interessant destacar que la disseminació i manteniment d’aquesta soca en laboratoris arreu del món ha produït, al llarg dels anys, una deriva genètica que fa que hi hagi, avui dia, soques de ratolins KK diferenciades genotípicament i fenotípica. Aquestes diferències poden ser la causa de la falta de concordança en els resultats experimentals observada en treballs publicats per diversos laboratoris que utilitzen, teòricament, el mateix model de ratolí KK. Ratolí NSY (Nagoya-Shibata-Yasuda). Aquest model deriva, per selecció genètica, de la mateixa soca de ratolí que va originar el ratolí NOD, model de DMT1, la soca Jc1:ICR. Aquests animals desenvolupen DMT2 de manera espontània amb l’edat, presenten una resistència dels teixits perifèrics a la insulina moderada i una secreció pancreàtica d’insulina defectiva, sense manifestar una obesitat gaire marcada. És un dels models que presenta, a diferència del que passa en humans, un dimorfisme sexual molt marcat respecte a la malaltia; pràcticament el 100 % dels mascles desenvolupen la malaltia, per un 30 % de les femelles. Ratolí TSOD (Tsumara Suzuki obese diabetes). Aquesta soca, de caracterització recent, desenvolupa polidípsia i poliúria a les vuit setmanes d’edat, i apareixen progressivament hiperglicèmia, hiperinsulinèmia i obesitat, bàsicament en els ratolins mascles.

186 N. ROGLANS, M. ALEGRET I J. CARLOS LAGUNA

Ratolí M16. També de caracterització recent, aquests ratolins desenvolupen ràpidament, abans de les vuit setmanes d’edat, obesitat acompanyada d’hiperfàgia, hiperinsulinèmia i hiperglicèmia en tots dos sexes. Rata de la sorra o del desert (Psammonys obesus). Aquest rosegador, que no és estrictament una rata, sinó una espècie de jerbu, constitueix de fet una barreja entre un model induït i espontani de DMT2. Quan es manté alimentada en condicions de captivitat amb la seva dieta habitual, constituïda per vegetació del desert, la rata de sorra es manté sana, sense manifestar cap malaltia metabòlica. No obstant això, si se li subministra la dieta habitual de laboratori per a rates, molt més energètica, desenvolupa ràpidament obesitat, resistència perifèrica a la insulina i hiperglicèmia i, si la dieta subministrada conté colesterol, franca hiperlipèmia que condueix a l’aparició d’arteriosclerosi. És, per tant, un bon model per a l’estudi de la influència de la dieta i l’exercici físic en el desenvolupament de la DMT2. Un model no tan utilitzat, però que reacciona de manera similar a la dieta de laboratori, és el ratolí espinós (Acomys calirinus), espècie també originària d’ambients desèrtics i esteparis. Rata OLEFT (Otsuka Long-Evans Takashima fatty rat). Al 1984, als estabularis de la companyia farmacèutica Otsuka, es va identificar, dintre d’una colònia de rates de la soca Long Evans, uns individus que desenvolupaven de manera espontània diabetis. Aquests animals van ser els fundadors de la línia de rates OLEFT que utilitzem avui dia. Les rates adultes d’aquesta soca, especialment els mascles, manifesten una obesitat discreta, poliúria, polidípsia, hiperglucèmia i hiperinsulinèmia. Amb la progressió de la malaltia sol aparèixer nefropatia diabètica i alteracions, i finalment atròfia dels illots pancreàtics productors

d’insulina, en un procés temporal molt similar al que es produeix en la DMT2 humana. Les rates OLEFT es caracteritzen, a més, per presentar alteracions en l’expressió del gen de la colecistocinina A i de les vies de senyalització de la sensació de sacietat al sistema nerviós central, cosa que facilita la ingesta energètica excessiva i l’aparició d’obesitat. Rata Cohen diabètica. Els animals sensibles d’aquesta soca desenvolupen DMT2 sense obesitat quan s’alimenten amb una dieta rica en carbohidrats. Macaco Rhesus (Macaca mullata). Aquests simis, en condicions d’estabulació i amb dieta ad libitum, desenvolupen amb els anys obesitat, hiperinsulinèmia i resistència perifèrica a la insulina, amb fallida final de secreció d’insulina al pàncrees. Com a models de DMT2 de naturalesa espontània i intrínseca destacarem: Ratolí db/db. Aquests ratolins presenten una mutació puntual en el gen db (gen de la diabetis) que codifica la proteïna receptora d’una hormona sintetitzada al teixit adipós, la leptina. La mutació, que es transmet de manera autosòmica recessiva, implica una mancança de transmissió del senyal de la leptina que condueix a l’aparició d’una simptomatologia similar a la de la DMT2 humana. Inicialment, els ratolins db/db presenten hiperglucèmia i hiperinsulinèmia, amb increment de pes evident. A les 20-26 setmanes d’edat, apareix degeneració pancreàtica, amb hipoinsulinèmia i pèrdua progressiva de pes corporal. Aquesta situació pot retardar-se en substituir la dieta normal amb una dieta hiperproteica, pràcticament desproveïda de carbohidrats, que redueix l’estrès secretori d’insulina imposat sobre el pàncrees. Ratolí ob/ob. En aquest cas, la mutació afecta el gen mateix de la leptina, de manera que aquesta hormona no és detectable en el plasma d’aquests ratolins. El ratolí Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

MODELS ANIMALS PER A L’ESTUDI DE LA DIABETIS 187

ob/ob presenta clara obesitat, però símptomes diabètics molt menys accentuats que el ratolí db/db. La manca de leptina també indueix hipercortisolisme en aquests animals, cosa que afavoreix les manifestacions de resistència a la insulina. Ratolí Akita. Aquest ratolins presenten una mutació, també coneguda com a Mody, que impedeix una secreció d’insulina adequada, i manifesten signes de DMT2 (polidípsia i poliúria) sense obesitat a les 34 setmanes de vida. Ratolí Agouti o KK/Ay. La proteïna codificada pel gen agouti (Ay) afecta el metabolisme dels melanòcits de la pell, induint una coloració groguenca; conjuntament, l’expressió d’aquest gen també controla l’activitat hipotalàmica implicada en el control del pes corporal. Els ratolins homozigots per al gen agouti no són viables; els animals heterozigots presenten manifestacions clíniques de la malaltia a les vuit setmanes de vida amb manifestacions fenotípiques complexes, amb pigmentació groguenca, obesitat i resistència a la insulina. La transcendència d’aquest model està en el fet que el gen agouti també s’expressa en el teixit adipós humà, en el qual sembla que participa en el control del metabolisme energètic. Rata Zucker (fa/fa). En la rata, el gen recessiu fa codifica un receptor de la leptina defectuós, no funcional, de manera que els animals homozigots per a aquest gen presenten obesitat, ja manifesta a les quatre setmanes de vida, hipertrigliceridèmia, hipercolesterolèmia, hiperglucèmia moderada i hiperinsulinèmia. Aquest gen va ser identificat per Zucker i Zucker el 1961 (Zucker i Zucker, 1961), i per això el nom del model. Les rates Zucker (fa/fa) presenten obesitat mòrbida (la matèria grassa pot representar més del 40 % de la composició corporal de l’animal adult), relacionada amb la resistència a la insulina al fetge i el Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

teixit muscular. Dins les rates Zucker, algunes soques presenten un defecte associat en la funcionalitat de les cèl·lules productores d’insulina pancreàtiques, de manera que aquests animals amb el temps perden la capacitat de secretar insulina i necessiten teràpia amb insulina per sobreviure. Per aquestes raons, moltes vegades aquestes soques són anomenades de manera específica com el model de rata ZDF (Zucker diabetic fatty). Rata SHR/N-cp (Spontaneously HypertensiveRat/NIH-corpulent). Els mascles d’aquesta soca de rata, homozigots per al gen corpulent (cp), representen un model de l’associació d’obesitat amb hiperfàgia, DMT2 i hipertensió. El gen cp codifica un receptor a la leptina no funcional. Rata JCR/LA-cp (James C. Russel/LA-cp). Els mascles homozigots per al gen cp d’aquesta soca manifesten una malaltia similar a la de la rata SHR/N-cp, però sense presentar hipertensió. Aquest model, amb el temps, desenvolupa, de manera similar als humans, alteracions vasculars i cardíaques. Els models espontanis, i alguns dels models induïts de DMT2 poden reagrupar-se en una altra classificació, en funció de si presenten unes cèl·lules pancreàtiques productores d’insulina «làbils» o «resistents» (vegeu la taula 2). La transició en les diferents espècies animals que pateixen DMT2 d’un estat de resistència a la insulina compensat fins a la DMT2 florida, que necessita teràpia insulínica, normalment es produeix en quatre estadis ben diferenciats (Shafrir, 1999). En l’estadi inicial (a), els animals de pocs dies o joves són normoglucèmics i normoinsulinèmics. Amb el decurs del temps, comença a manifestar-se la resistència a la insulina en forma de més producció de glucosa hepàtica i menys captació de glucosa plasmàtica per part del múscul esquelètic; aquests animals, per

188 N. ROGLANS, M. ALEGRET I J. CARLOS LAGUNA Taula 2. Tipus de model Induït Espontanis Anàlegs

Intrínsecs

Models de DMT2 classificats en funció de posseir cèl·lules β-pancreàtiques «làbils» o «resistents» Cèl·lules làbils Estreptozootozina Ratolí ALS/Lt

Cèl·lules resistents* Corticosteroides Models dietètics en ratolins

Ratolí NSY Rata GK Rata de la sorra o del desert Rata OLEFT Rata Cohen Ratolí db/db Ratolí Akita Rates ZDF

Ratolí NZO Ratolí KK Ratolí TSOD Ratolí M16 Macaco Rhesus Ratolí ob/ob Ratolí Agouti Rates ZF Rates SHR/N-cp i JCR/LA-cp

* Aquests models s’acompanyen d’obesitat manifesta, sobretot de tipus visceral.

mantenir la normoglicèmia, necessiten secretar concentracions d’insulina superiors a les habituals, i presenten hiperinsulinèmia (estadi b). Amb la progressió de la resistència a la insulina, la quantitat d’insulina secretada pel pàncrees no és suficient per mantenir la normoglicèmia, i es manifesta hiperglucèmia i hiperinsulinèmia (estadi c); normalment, els animals presenten en aquest estadi obesitat manifesta (el que els autors anglosaxons anomenen diabesity) i nivells elevats en plasma d’insulina no processada o proinsulina, reflex de l’estrès secretor al qual es veu sotmès el pàncrees. Finalment, les cèl·lules pancreàtiques col·lapsen i, en l’estat d, el pàncrees deixa de produir insulina, i apareix hiperglucèmia, hipoinsulinèmia i pèrdua progressiva de pes, fins a la instauració de cetoacidosi diabètica si no es tracta exògenament amb insulina. Dintre dels models animals existents, aquells que presenten cèl·lules pancreàtiques «resistents» no progressen a l’estadi d, i es mantenen de manera crònica en l’estadi c, amb hiperinsulinèmia, hiperglucèmia i obesitat. Al contrari, els models animals amb cèl·lules pancreàtiques «làbils» progressen amb el temps, més o menys ràpidament, a l’estadi d, i necessiten insulinoteràpia per sobre-

viure. Des d’aquest punt de vista, els models amb cèl·lules «làbils» mimetitzen millor la DMT2 en l’ésser humà, que, pràcticament en tots els casos, acaba amb fallida pancreàtica i insulinoteràpia. De fet, la DMT2 en l’ésser humà ha estat definida com «una fallida de les cèl·lules β-pancreàtiques per compensar la resistència a la insulina programada de manera genètica» (Polonsky, 1996). Animals modificats genèticament per a l’estudi de la DMT2 Les tècniques de biologia molecular permeten, avui dia, utilitzant el ratolí com a base biològica, dissenyar pràcticament models «a demanda» per a l’estudi de la rellevància d’un gen determinat en la patofisiologia de la DMT2. Per a una descripció detallada dels diversos models utilitzats el lector podrà adreçar-se a les excel·lents revisions de Nandi et al. (2004), Biddinger i Kahn (2006), LeRoith i Gavrilova (2008), i LeRoith i Accilli (2006). Pràcticament totes les modificacions genètiques possibles s’han utilitzat en l’estudi de la DMT2; a continuació, farem una descripció breu i senzilla de cadascun dels possibles aborTreb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

MODELS ANIMALS PER A L’ESTUDI DE LA DIABETIS 189

datges metodològics que han estat utilitzats. Utilització de ratolins transgènics que sobreexpressen un gen determinat. Per obtenir aquests ratolins modificats, s’incorpora el gen que vulguem, o transgèn, al nucli d’un oòcit fertilitzat que, posteriorment, s’implantarà en una mare adoptiva. Atès que la incorporació en el genoma del transgèn és aleatòria, només una petita proporció dels oòcits fertilitzats donaran lloc a ratolins que sobreexpressin el gen. La interpretació dels resultats pot ser complicada pel fet que el transgèn pot, en incorporar-se al genoma, alterar l’expressió d’un gen nadiu, endogen, del ratolí; igualment, la càrrega genètica del ratolí «hoste» pot modificar els efectes de la introducció del transgèn, per la qual cosa és molt important considerar la soca de ratolí utilitzada per obtenir l’animal transgènic. Utilització de ratolins en els quals s’ha eliminat un gen determinat (ratolins genoanul·lats), o bé s’ha introduït un gen alterat o que pertany a una altra espècie, normalment, un gen humà (genomodificats). Per això, s’elimina o altera el gen corresponent en cèl·lules troncals embrionàries que donaran lloc a animals quimèrics. Quan la modificació dóna lloc a un animal inviable, normalment perquè el gen alterat o eliminat és essencial per al desenvolupament fetal, es pot intentar evitar el problema fent el que es denominen genoanul·lacions o genomodificacions condicionals, en què es modifica el gen introduït de manera que només s’expressi en un teixit o tipus de cèl·lules determinades, sense que es vegin afectats la resta de teixits. Així, per exemple, s’han generat ratolins genoanul·lats per al receptor a la insulina en cada un dels teixits diana de l’acció insulínica, fetge, múscul esquelètic i teixit adipós, així com en les cèl·lules pancreàtiques productores d’insulina mateixes, que han permès esbrinar Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

clarament la funció d’aquesta hormona en els teixits esmentats i les conseqüències de la mancança. S’ha d’indicar que els models genètics no són la panacea que soluciona tots els interrogants i també presenten problemes d’interpretació. Aquests problemes es relacionen majoritàriament amb l’aparició d’efectes suprafisiològics per la sobreexpressió de gens que, probablement, mai no es trobarien en individus sans i, fins i tot, patològics, i pels fenòmens de compensació. Aquest últims poden donar-se en els organismes genoanul·lats quan la carència del gen eliminat és substituïda per l’activitat d’un altre gen endogen compensatori. Un exemple el tenim en el cas del gen que codifica la proteïna IRS-1 o substrat del receptor de la insulina-1. Totes les dades que es posseïen sobre aquesta proteïna indicaven que és una molècula capital en la transmissió intracel·lular del senyal de la insulina, quan està activa al seu receptor. Per això, va ser molt decebedor observar que el primer ratolí genoanul·lat per a IRS-1, encara que presentava retard del creixement i hipertensió, només manifestava un cert grau d’intolerància a la glucosa, sense manifestar simptomatologia diabètica clara. El trencaclosques es va resoldre quan es va descobrir l’existència d’altres gens que codificaven d’altres proteïnes IRS i, en concret, el gen IRS-2 era capaç pràcticament de suplir totes les missions d’IRS-1 relacionades amb la sensibilitat a la insulina i l’activitat pancreàtica. En els ratolins genoanul·lats per a IRS-1, IRS-2 se sobreexpressava de manera espontània i pal·liava parcialment l’absència del primer. De la lectura d’aquesta revisió queda palesa l’extrema diversitat de models animals de diabetis, especialment en el cas de la DMT2. En un sentit estricte, qualsevol investigador interessat en l’estudi d’aquesta malaltia hauria d’utilitzar més d’un model

190 N. ROGLANS, M. ALEGRET I J. CARLOS LAGUNA

animal, de manera que els seus resultats, si fossin consistents en els diversos models utilitzats, tindrien més transcendència amb vista a la malaltia humana. En la pràctica, atès el cost i la durada de molts dissenys experimentals, molts grups d’investigació treballen amb un model determinat, en el qual tenen experiència i amb el qual, progressivament, van adquirint un coneixement més profund dels mecanismes moleculars implicats en la producció de la malaltia. Per tot això, caldria indicar, en el cas de la DMT2, que aquells models que desenvolupen els mateixos estadis de la malaltia humana, i acaben en fallida pancreàtica i necessitat d’insulinoteràpia, serien els més idonis per iniciar la recerca. BIBLIOGRAFIA Arias-Díaz, J.; Balibrea, J. (2007). «Modelos animales de intolerancia a la glucosa i diabetes tipo 2». Nutr. Hosp., 22: 160-168. Banting, F. G.; Best, C. H. (1922). «The internal secretion of the pancreas». J. Lab. Clin. Med., 7: 256271. Biddinger, S. B.; Ronald Kahn, C. (2006). «From mice to men: Insights into the insulin resistance syndromes». Annu. Rev. Physiol., 68: 121-158. Chen, D.; Wang, M.-W. (2005). «Development and application of rodent models for type 2 diabetes». Diabetes Ob. Metabol., 7: 307-317. Drake, A. J.; Smith, A.; Betts, P. R.; Crowne, E. C.; Shield, J. P. H. (2002). «Type 2 diabetes in obese white children». Arch. Dis. Child. 86: 207-208. Engelgau, M. M.; Narayan, K. M. V.; Suddine, J. B.; Vinicar, F. (2003). «Addressing the burden of diabetes in the 21st century: better care and primary prevention». J. Am. Soc. Nephrol., 14: S8891.

Hansen, B. C. (1999). «The metabolic syndrome X». Ann. NY Acad. Sci., 892: 1-24. King, H.; Aubert, R. E.; Herman, W. H. (1998). «Global burden of diabetes, 1995-2025: prevalence, numerical estimates and projections». Diabetes Care, 21: 1414-1431. Leroith, D.; Accilli, D. (2008). «Mechanisms of disease: using genetically altered mice to study concepts of type 2 diabetes». Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab., 4: 164-172. Leroith, D.; Gavrilova, O. (2006). «Mouse models created to study the pathophysiology of type 2 diabetes». Int. J. Biochem. Cell Biol., 38: 904-912. Masiello, P. (2006). «Animal models of type 2 diabetes with reduced pancreatic β-cell mass». Int. J. Biochem. Cell Biol., 38: 873-893. Mcneil, J. H. (1999). Experimental models of diabetes. Florida: CRC Press LLC. Nandi, A.; Kitamura, Y.; Ronald Kahn, C.; Accili, D. (2004). «Mouse models of insulin resistance». Physiol. Rev., 84: 623-647. Nugent, D. A.; Smith, D. M.; Jones, H. B. (2008). «A review of islet of Langerhans degeneration in rodent models of Type 2 diabetes». Toxicol. Pathol., 36: 529-551. Polonsky, K.; Sturis, J.; Bell, G. J. (1996). «Non-insulin-dependent-diabetes mellitus – A genetically programmed failure of the beta cell to compensate for insulin resistance». N. England J. Med., 334: 777-783. Rees, D. A.; Alcolado, J. C. (2005). «Animal models of diabetes mellitus». Diabet. Med., 22: 359-370. Shafrir, E.; Ziv, E.; Mosthaf, L. (1999). «Nutritionally induced insulin resistance and receptor defect leading to β-cell failure in animal models». Ann. NY Acad. Sci., 892: 223-246. Sima, A. A. F.; Shafrir, E. (2001). A primer on animal models of diabetes. Amsterdam: Harwood Academic Press. Srinivasan, K.; Ramarao, P. (2007). «Animal models in type 2 diabetes research: An overview». Indian J. Med. Res., 125: 451-472. Thompson, C. S. (2008). «Animal models of Diabetes Mellitus: Relevance to vascular complications». Curr. Pharm. Design, 14: 309-324. Zucker, L. M.; Zucker, T. F. (1961). «Fatty, a new mutation in the rat». J. Hered., 52: 275-278.

Treb. Soc. Cat. Biol., 62: 179-190

ÍNDEX D’AUTORS Abril, J. F. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Adell, T.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Alegret, M.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 Ariño, J.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 Balsalobre, C.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Benito-Gutiérrez, È.. . . . . . . . . . . . . . . . 131 Casanova, J.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 Cebrià, F.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Dalfó, D.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107 Domingo, E.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Durán, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Galardi-Castilla, M.. . . . . . . . . . . . . . . . 61

Garcia-Fernàndez, J.. . . . . . . . . . . . . . . . 131 Laguna, J. C.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 López-Schier, H.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Merlos-Suárez, A.. . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Monte, E.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 Muniesa, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 Pujades, C.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 Roglans, N.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 Saló, E.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Sastre, L.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Serras, F.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Consell Directiu President Vicepresidenta 1a Vicepresident 2n Secretari General Vicesecretari Tresorera Vocal de Publicacions Vocal de Sessions Vocal d’Acció Territorial Vocal de Comunicació Vocal d’Ensenyament Vocal d’Estudiants Vocal de Promoció Delegat de l’IEC

Lluís Tort Àurea Navarro Jordi Barquinero Josep Clotet Arcadi Navarro Carme Segarra Ricard Roca Ramon Roca Jordi Bermúdez Joan Duran Rosa Pérez Marta Llauradó Francesc Piferrer Ricard Guerrero

Secretàries administratives

Maite Sánchez Mariàngels Gallego

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Seccions especialitzades Aqüicultura Biofísica Biologia del desenvolupament Biologia evolutiva Biologia i indústria Biologia molecular Biologia molecular del càncer Biologia de sistemes Biologia de la reproducció Biologia i societat Ecologia marina Ecologia terrestre Ensenyament Genòmica i proteòmica Microbiologia Neurobiologia experimental Senyalització cel·lular i metabolisme Virologia Estudiants SCB a Alacant SCB a les Balears SCB a Lleida SCB al Pallars SCB a València SCB a Vic

Josep Planas Pere Garriga Jordi Garcia-Fernández Montserrat Papaceit Ramon Roca Albert Jordan Gabriel Capellà Albert Sorribas Enric Ribes Cristina Junyent Ramon Massana Josep Maria Espelta Rosa Pérez Francesc Xavier Avilés Mercè Berlanga Josep Saura Francesc Vinyals Miguel À. Martínez i Ana Angulo Marta Llauradó Sergi Soriano Balbina Nogales M. Ángeles de la Torre Xavier Castells Helena Mira Jordi Planas

ACTIVITATS DEL CURS 2010-2011 I.

CONGRESSOS I SIMPOSIS

30 de setembre i 1 d’octubre de 2010 «Functional integration of membrane trafficking, intracellular signaling and cytoskeleton dynamics» Sala Pere Coromines, IEC Organitza: Secció de Biologia Molecular 14 i 15 d’octubre de 2010 Reunió anual «BCN Developmental Biology Join Retreat 2010» Eden Roc Hotel, Sant Feliu de Guíxols Organitza: Secció de Biologia del Desenvolupament 19 i 20 d’octubre de 2010 VIII Simposi de neurobiologia experimental IEC Organitza: Secció de Neurobiologia Experimental 16 i 17 de novembre de 2010 Congrés «GDRE Comparative genomics» Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Biologia Evolutiva 25 i 26 de novembre de 2010 RECAM 2010: VII Reunió Científica Anual de la Secció de Microbiologia Sala Nicolau d’Olwer, IEC Organitza: Secció de Microbiologia 9 i 10 de desembre de 2010 Congrés «Systems biology: bridging the gaps between disciplines» Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Biologia de Sistemes

196

8-12 de maig de 2011 XII International Congress on Molecular Systems Biology Universitat de Lleida

II.

CURSOS I SEMINARIS

15 de setembre de 2010 «How cells sense force» Facultat de Medicina, UAB 25 d’octubre de 2010 «Systems Biology» Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Biologia de Sistemes 23-26 de novembre de 2010 IX Workshop sobre mètodes ràpids i automatització en microbiologia alimentària Facultat de Veterinària, UAB Organitza: Secció de Microbiologia 15 de febrer de 2011 «Structural basis of substrate-induced permeation by an amino acid antiporter» Sala de Graus, Facultat de Medicina, UAB Organitza: Secció de Biofísica 20 de maig de 2011 «Efecte de la cadena O del LPS de Yersinia sobre la funció del sistema de secreció tipus III codificat en el plasmidi de virulència» Aula Multiusos dels Serveis Cientificotècnics, Campus de la UIB 23-27 de maig de 2011 Curs pràctic d’anàlisi i interpretació estadística de les dades experimentals en la indústria Sala Pi i Sunyer, IEC Organitza: Secció de Biologia i Indústria

197

3 de juny de 2011 «MLS in the analysis of the distribution of genomovars in P. stutzeri» Aula Multiusos dels Serveis Cientificotècnics, Campus de la UIB Organitza: Secció de la SCB a les Balears 8 de juliol de 2011 «Aplicación de métodos moleculares en el análisis de alimentos: GMO’s, alergenos y patógenos» Aula Multiusos dels Serveis Cientificotècnics, Campus de la UIB Organitza: Secció de la SCB a les Balears 15 de juliol de 2011 «Caracterización genómica de Citreicella sp. 357» Aula Multiusos dels Serveis Cientificotècnics, Campus de la UIB Organitza: Secció de la SCB a les Balears 17 de juny de 2011 «Anaerobic hydrocarbon degradation by marine sulfate-reducing bacterial strains» Aula Multiusos dels Serveis Cientificotècnics, Campus de la UIB Organitza: Secció de la SCB a les Balears 17 de juny de 2011 «Signalling molecules in diabetes: search for potential targets in intrinsic pathways for prediction and intervention in diabetes» Saló d’Actes de l’Institut de Bioenginyeria, UMH Organitza: Secció de la SCB a Alacant 21 de juny de 2011 «Effect of estrogens and antiestrogens on oxidative stress» Saló d’Actes de l’Institut de Bioenginyeria, UMH Organitza: Secció de la SCB a Alacant 24 de juny de 2011 «Diversidad de aislados clínicos y ambientales de Pseudomonas aeruginosa» Aula Multiusos dels Serveis Cientificotècnics, Campus de la UIB Organitza: Secció de la SCB a Balears

198

III.

JORNADES

8 d’octubre de 2010 VII Jornada d’Avenços en Ecologia Centre d’Estudis Avançats de Blanes Organitza: Secció d’Ecologia Aquàtica 23 de novembre de 2010 X Jornada de Virologia Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Virologia 17 de desembre de 2010 I Reunió Anual de la Secció de Genòmica i Proteòmica de la SCB Sala d’Actes Josep Marull, Hospital del Mar Organitza: Secció de Genòmica i Proteòmica 19 de febrer de 2011 VIII Matinal Pràctica de Biologia Molecular Facultat de Medicina i Ciències de la Salut, UIC 5 de març de 2011 II Matinal de Seqüenciació de DNA Unitat de Genòmica dels Serveis Cientificotècnics, UB 9 d’abril de 2011 IV Jornada de Bioquímica del Benestar Sala Pere i Joan Coromines, IEC 28 d’abril de 2011 Jornada conjunta SCB-SCI: «Immunologia i teràpia: dels anticossos monoclonals de César Milstein a les noves teràpies cel·lulars» Sala Pere i Joan Coromines, IEC 1 de juny de 2011 XII Jornada de Biologia de la Reproducció Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Biologia de la Reproducció

199

7 i 8 de juny de 2011 XIX Jornades de Biologia Molecular IEC Organitza: Secció de Biologia Molecular 28 de juny de 2011 Jornada: «Quant carboni tenim sota els peus? Carboni subterrani i funcionament dels boscos» Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció d’Ecologia, Acció COST FP0803, CREAF i IRTA 11 de juliol de 2011 XI Jornada de Biologia Evolutiva Sala Pere i Joan Coromines, IEC Organitza: Secció de Biologia Evolutiva

IV.

ALTRES

De l’1 d’octubre al 28 de novembre de 2010 Visites guiades: «Investiga la Ciència» Institut de Recerca Biomèdica i Escola Tècnica Superior d’Enginyeria Agrària 14 d’octubre de 2010 Visita guiada: «Investiga la diabetis» Institut de Bioenginyeria Organitza: Secció de la SCB a Alacant 22-26 de novembre de 2010 Exposició del I Concurs de fotografia científica Universitat Miguel Hernández Organitza: Secció d’Alacant de la SCB i ANEI SIGLO XXI 22-26 de novembre de 2010 Exposició dels Premis Nobel 2009 Universitat Miguel Hernández Organitza: Secció d’Alacant de la SCB i ANEI SIGLO XXI

200

27 de novembre de 2010 I Taller «Eines i metodologies per a la docència de la biologia» Virolai Escola

Interior 59 Soc Cat Bio

2/3/2009

14:19

Página 1

NORMES DE PUBLICACIÓ DE TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Abast. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publica: a) monografies i revisions sobre temes de ciències de la vida encarregades per la Societat, i b) comunicacions presentades a les sessions ordinàries i extraordinàries organitzades per la Societat o les seves seccions especialitzades. Els temes poden ser proposats pels membres del Consell Directiu o per socis que desitgin ocupar-se de la preparació d’un volum de la revista fent d’editors. El Consell Directiu decideix si un tema és apropiat per dedicar-hi un volum de Treb. Soc. Cat. Biol. Idioma. Els originals seran redactats en català, excepte en casos justificats per als quals el Consell Directiu pugui acceptar una altra llengua. Lliurament dels originals. La submissió implicarà que el material és original i que no ha estat enviat, acceptat o publicat en cap altre lloc. Els originals els lliurarà l’editor del volum per correu electrònic (scb@iecat.net), adreçat al president del Consell de Redacció. Cal enviar els següents arxius, preferentment empaquetats amb ZIP: — Un arxiu únic en format RTF o MS Word anomenat Text_TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el text del volum, incloent-hi, en aquest ordre: coberta, índex, presentació, els capítols en l’ordre desitjat i les seves taules, si n’hi ha. Les pàgines hauran d’anar numerades consecutivament començant per la núm. 1, que serà la de la coberta. Tot el text serà escrit íntegrament amb Times New Roman de cos 12 amb interlineat d’1,5. L’arxiu amb el text no podrà contenir figures ni objectes incrustats. — Un arxiu per cada figura anomenat Figura_[número de figura]_[cognom del primer autor]. Les figures, si no contenen text (a part del peu), es poden remetre en qualsevol dels formats gràfics habituals (PNG, JPEG, TIFF); si contenen text, s’han d’enviar en un format que permeti editar-lo (EPS, PDF, Powerpoint). — Cal enviar també una còpia impresa electrònica en format PDF de tot el volum, anomenada TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el contingut, incloent-hi les figures. Aquest arxiu es farà servir com a text imprès de referència durant el procés de tractament del text. Per aquest motiu, els autors i l’editor han de tenir cura personalment que en aquesta còpia hi hagi tot el contingut imprès correctament, incloent-hi sobretot els símbols o caràcters especials, equacions, etc. Cada article o, en un volum monogràfic, cada capítol, incloent-hi la bibliografia, taules i figures, hauria de tenir una extensió entre quinze i vint fulls DIN A4, escrits amb el tipus, mida i interlineat esmentats abans. Només es podrà ultrapassar aquest límit amb l’acord previ del Consell de Redacció de Treballs de la SCB. Els volums monogràfics haurien de contenir un mínim d’uns deu capítols. El Consell de Redacció consultarà especialistes, els quals recomanaran si un article pot publicar-se immediatament, necessita revisió, o bé és rebutjat. Els autors rebran notificació de la decisió. Si el treball requereix revisió, es facilitaran als autors els comentaris escrits dels especialistes que l’hagin revisat. Estructura dels originals. Els originals que no s’ajustin a aquestes instruccions seran retornats als autors perquè els modifiquin abans de la seva tramitació. Dintre de cada capítol o article se seguirà el següent ordre pel que fa als diferents components:

— Títol, escrit en majúscules i negreta. — Nom i primer cognom de l’autor. Si n’hi ha més d’un, els seus noms aniran separats amb una coma. L’autor per a la correspondència s’identificarà amb un asterisc posat al final del seu cognom. — Adreça postal completa de tots els autors. Telèfon, fax i correu electrònic de l’autor per a la correspondència — Resum en català, d’un màxim de dues-centes paraules. — Paraules clau en català, màxim de cinc. — Resum en anglès (que, òbviament, haurà d’ésser traducció fidel del resum en català i haurà d’anar precedit de la traducció del títol del manuscrit). — Paraules clau en anglès, màxim de cinc. — Text, que, si és una revisió, podrà estar dividit fins a dos nivells en els apartats (no numerats) que es creguin més oportuns. Si es tracta d’un article de recerca, el manuscrit haurà d’incloure Introducció, Materials i mètodes, Resultats i Discussió. No es podran fer servir notes a peu de pàgina ni text subratllat. — Agraïments, si escau. — Referències, segons el format indicat més endavant. — Taules. Portaran un títol descriptiu breu i aniran numerades correlativament amb números àrabs. Una taula per full. — Text de peus de figures. Il·lustracions. Les il·lustracions cal que siguin de bona qualitat i contrast, tenint en compte la possible reducció, ja que, a causa del format de la revista, un cop publicades poden ésser, com a màxim, de 14 cm d’ample per 19 cm d’alt. Totes les il·lustracions seran en blanc i negre, excepte en cas que el color sigui essencial per a comprendre’n el significat. Atès que la publicació de fotografies en color encareix molt el procés editorial, els autors que desitgin incloure alguna fotografia en color hauran de pagar les despeses extra. En cas que les taules o figures hagin estat publicades anteriorment, caldrà indicar-ne la procedència i, si escau, el copyright. Referències. Totes les referències, tant publicades com en premsa, citades al text, hauran d’ésser incloses a la llista de referències, ordenades alfabèticament. En el text s’indicaran els noms dels autors i l’any de publicació per ordre cronològic; en el cas que una referència tingui més de dos autors, se citarà el primer seguit d’et al. A continuació hi ha exemples de l’estil que s’ha de seguir per a citar articles, capítols o monografies. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Proves d’impremta i extrets. De tots els originals acceptats, l’autor de correspondència en rebrà unes proves d’impremta per a corregir-les, i aquestes proves hauran d’ésser retornades, per correu urgent, a: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/ Maria Aurèlia Capmany, 14-16, 08001 Barcelona (tel. 933 248 584; fax 932 701 180; a/e: scb@iec.cat) dins el termini màxim d’una setmana. En les proves no podran ésser introduïdes correccions d’estil, i només hi seran admeses les de caràcter ortogràfic i tècnic. Un cop publicat l’article, es lliuraran a l’autor vint extrets sense càrrec.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Scope. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publishes: a) monographs and reviews on life sciences topics commissioned by the Society; and b) lectures presented at both ordinary and extraordinary sessions organized by the Society or their specialized sections. Submission of originals. Submission implies that the material is original and that has not been submitted, accepted or published elsewhere. Originals will be submitted by the editor of the volume to the following e-mail address scb@iecat.net addressed to the President of the Publications Board. The following files will be provided, preferably ZIP-compressed: — A single file in format RTS or MS Word named Text_TSCB_ [editor’s last name], containing all the text of the volume, including, in this order, the following parts: cover page, table of contents, presentation, the chapters in the order that they should appear and their corresponding tables. Pages should be consecutively numbered, staring with page 1, which will be the cover page. All text should be written in Times New Roman, pt 12 with 1.5 spaces between lines. The text file cannot contain figures and incrustated objects. — One file for each figure named Figure_[figure number]_ [last name of the first author]. Figures that do not contain text characters can be submitted in standard graphic format (PNG, JPEG, and TIFF); figures that do contain text have to be submitted in an editable format (EPS, PDF, Powerpoint). — A single PDF file named TSCB_[editor’s last name] containing all text plus all figures. Authors and the editor are responsible that in this file, all contents appear correctly printed, in particular special symbols and equations. Each article or, in a monograph, each chapter, including text plus references, tables and figures, should be between fifteen and twenty DIN A4 sheets long, written with the font type and spaces between lines specified above. The maximum length can be surpassed only with prior approval from the Treballs de la SCB Publications Board. Monographs should have a minimum of 10 chapters. The Publications Board will contact specialists who will recommend immediate publication, acceptance after modifications or rejection of the submitted originals. Authors will be notified in due course. If revision is required, authors will receive the corresponding written comments for modifications. Structure of manuscripts. Manuscripts that do not conform to these instructions will be returned to the authors for modifications before their processing. Each chapter or manuscript should have the following structure: — Title, written in capitals and bold case. — Name and last name of author. If there is more than one author, their names will be separated with commas. The corresponding author will be identified with an asterisk placed after their last name.

— Full postal address of all authors. Phone, fax and e-mail address of the corresponding author. — Abstract, maximum two hundred words. — Keywords, maximum five — Text of manuscript. In the case of review articles, a maximum of two (not numbered) subheadings will be accepted. In the case of research articles, the manuscript will include the following sections: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion. Footnotes or underlined text will not be accepted. — Acknowledgments, if appropriate — References (see format below) — Tables. They will be preceded with a brief, descriptive title and will be numbered with Arabian numerals. One table per page — Figure legends Figure. Figures should be of good quality and contrast, taking into account that they can be reduced in size, and that once published they can be at most 14 cm width x 19 cm height. All figures will be in black and white, unless the use of color is essential to understand their meaning. The authors will pay extra costs of publishing color figures. If tables or figures have been previously published elsewhere, the original source must be indicated and it will be the responsibility of authors to deal with possible copyrights. References. All references published and in press cited within the text will have to be included in the reference list arranged in alphabetical order by the last name of the first author. In the text, the name of the authors and the publication year should be used in chronological order. If there are more than two authors, only the name of the first author followed by «et al.» will be used. The following examples represent the appropriate manner in which to cite articles, book chapters and books, respectively. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Galleyproofs and reprints. Once a manuscript has been accepted, the corresponding author will receive the galleyproofs. Galleyproofs will be returned by courier to: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/Maria Aurèlia Capmany, 1416, 08001 Barcelona (tel. +34-933 248 584; fax +34-932 701 180; e-mail: scb@iec.cat) within one week. Style corrections cannot be accepted in galleyproofs. Only typographic and technical corrections will be accepted. Once published, authors will receive 20 reprints free of charge.

VOLUM 62, 2011

ÍNDEX

Organismes model en biologia Presentació . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Corominas i M. Valls

7

Virus como modelo en biología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Domingo

9

El bacteriòfag lambda, un model de decisió genètica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Muniesa

19

Escherichia coli, un petit gran organisme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. Balsalobre

31

Els llevats com a organisme model de recerca en biologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Ariño

45

Dictyostelium discoideum, una ameba peculiar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Galardi-Castilla i L. Sastre

61

La planta model Arabidopsis thaliana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E. Monte

79

Caenorhabditis elegans: una història fascinant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D. Dalfó Drosophila melanogaster com a organisme model: una font d’informació en recerca biomèdica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. Serras i J. Casanova

VOLUM 62, 2011

93 107

Filial de l’Institut d’Estudis Catalans

123

El petit amfiox: el miratge de l’origen dels vertebrats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. Garcia-Fernàndez i È. Benito-Gutiérrez

131

El peix zebra com a sistema model per a l’estudi de malalties humanes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Durán i H. López-Schier

141

El pollet com a sistema model: les noves possibilitats d’un model clàssic . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. Pujades

155

El ratolí com a sistema model en biologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. Merlos-Suárez

165

Models animals per a l’estudi de la diabetis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N. Roglans, M. Alegret i J. C. Laguna

179

Cob biologia 62.indd 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Organismes model en biologia

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 62, 2011

La regeneració i l’homeòstasi en les planàries, un model clàssic de biologia del desenvolupament . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . F. Cebrià, T. Adell, J. F. Abril i E. Saló

Organismes model en biologia

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

BARCELONA 2011

28/10/2011 10:36:47

organismes model en biologia TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 62, 2011 Sobrecob biologia 62.indd 1

Organismes model en biologia

Montserrat Corominas i Marc Valls editors Il·lustració de la sobrecoberta

treballs de la societat catalana de biologia VOLUM 62, 2011

L’eriçó de mar és un animal molt emprat com a model en estudis de vitel·logènesi, cicle cel·lular i interacció ou-esperma. L’exemplar de la imatge pertany a l’espècie Echinus melo, de la costa de l’Alguer. (© Marco Busdraghi, Wikimedia Commons)

28/10/2011 10:35:56

organismes model en biologia TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 62, 2011 Sobrecob biologia 62.indd 1

Organismes model en biologia

Montserrat Corominas i Marc Valls editors Il·lustració de la sobrecoberta

treballs de la societat catalana de biologia VOLUM 62, 2011

L’eriçó de mar és un animal molt emprat com a model en estudis de vitel·logènesi, cicle cel·lular i interacció ou-esperma. L’exemplar de la imatge pertany a l’espècie Echinus melo, de la costa de l’Alguer. (© Marco Busdraghi, Wikimedia Commons)

28/10/2011 10:35:56