TSCB, 59 by Institut d'Estudis Catalans

12:09

Página 1

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

03/03/09

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 59, 2008

Sobrecob 59 Soc Cat Bio

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ MERCÈ DURFORT I FRANCESCA VIDAL EDITORES Il·lustració de la sobrecoberta

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 59, 2008

Detall de l’obra La primavera (1573), que forma part de la sèrie de les estacions d’Arcimboldo (Milà, 1527-1593). Museu del Louvre, París. La flor (una liliàcia) ens permet visualitzar amb tot detall les seves dues parts: la femenina, que sobresurt, i els estams, que formen una corona a la base del pistil.

12:09

Página 1

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

03/03/09

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 59, 2008

Sobrecob 59 Soc Cat Bio

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ MERCÈ DURFORT I FRANCESCA VIDAL EDITORES Il·lustració de la sobrecoberta

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 59, 2008

14:07

Página 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

VOLUM 59, 2008

ÍNDEX

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ Antecedents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. DURFORT I F. VIDAL Una ullada a les transformacions epigenètiques del DNA en la reproducció . . . . . . . . . . . . . . . . J. A. SUBIRANA Transició de proteïnes nuclears i condensació de la cromatina espermiogènica. Proposta d’un model ancestral de l’espermiogènesi nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K. KURTZ, N. SAPERAS, J. AUSIÓ I M. CHIVA Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. MALDONADO I A. RIESGO L’imposex: el seu estudi i evolució en Bolinus brandaris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. J. AMOR, M. RAMÓN, A. RICHTER I M. DURFORT Ultraestructura dels espermatozoides de Crassostrea gigas, Mytilus galloprovincialis i Donax trunculus (Mollusca, Bivalvia) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. G. BOZZO, M. POQUET, E. SAGRISTÀ I M. DURFORT L’espermatogènesi en els crancs (Crustacea, Decapoda). Un model atípic de condensació del nucli espermàtic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. G. SIMEÓ, K. KURTZ, M. CHIVA, G. ROTLLANT I E. RIBES Control neuroendocrí de l’inici de la maduresa sexual en els vertebrats mitjançant la kisspeptina i el seu receptor, amb especial èmfasi pel que fa a la situació en els peixos teleostis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S. MECHALY, J. VIÑAS I F. PIFERRER Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . J. CERDÀ Conseqüències fisiològiques d’una activació del sistema immunitari sobre la reproducció i el creixement en peixos d’interès en aqüicultura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N. ROHER, D. CRESPO, Y. VRASKOU, M. DÍAZ, S. MACKENZIE I J. V. PLANAS Biotecnologia reproductiva en porcí: estat actual i reptes de futur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S. BONET, M. D. BRIZ, E. PINART, S. SANCHO, E. BUSSALLEU, M. YESTE, I. CASAS, A. FÁBREGAS, M. PUIGMULÉ, E. GARCÍA, M. SANTOS, E. TORNER I S. MICALÓ Producció in vivo versus in vitro d’embrions caprins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. T. PARAMIO I D. IZQUIERDO Un mateix camí amb dreceres diferents en funció del sexe: gametogènesi femenina . . . . . . . . . R. GARCIA-CRUZ, I. ROIG I M. GARCIA Anàlisi citogenètica d’espermatozoides humans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Z. SARRATE, E. ANTON, J. BLANCO I F. VIDAL Fragmentació del DNA espermàtic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. ESBERT, A. PACHECO, M. FLORENSA, M. RIQUEROS, M. MARTÍN, A. BALLESTEROS I G. CALDERÓN Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. RIUS, A. OBRADORS, M. OLIVER, J. BENET I J. NAVARRO Cultiu i desenvolupament in vitro d’embrions humans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. GROSSMANN I M. C. PONS Diagnòstic genètic preimplantacional en estadis embrionaris tardans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. PARRIEGO, A. VEIGA I F. VIDAL Criopreservació i tècniques de reproducció assistida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. SOLÉ, M. BOADA I A. VEIGA Derivació de línies de cèl·lules mare embrionàries a partir de blastòmers aïllats . . . . . . . . . . . . . S. GONZÁLEZ, N. COSTA-BORGES, E. IBÁÑEZ I J. SANTALÓ Derivació de línies de cèl·lules mare embrionàries humanes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B. ARAN, I. RODRIGUEZ, A. RAYA, Y. MUÑOZ, P. N. BARRI, J. C. IZPISÚA I A. VEIGA

7 9 13 29

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

2/3/2009

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

VOLUM 59, 2008

51 59 71

95 109 129

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

141 151 165 177 185 193 211 225 233 249 263

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 59, 2008

Cub. 59 Soc Cat Bio

BARCELONA 2009

14:07

Página 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

VOLUM 59, 2008

ÍNDEX

7 9 13 29

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

2/3/2009

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

VOLUM 59, 2008

51 59 71

95 109 129

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

141 151 165 177 185 193 211 225 233 249 263

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 59, 2008

Cub. 59 Soc Cat Bio

BARCELONA 2009

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

VOLUM 59, 2008

BARCELONA 2009

CONSELL DEPUBLICACIONS REDACCIÓ COMITÈ DE FRANCESC PIFERRER, Qresident, Institut de Ciències del Mar, CSIC, Barcelona RICARD ROCA, Tecretari, vocal de lexicografia, SCB MERCÈ PIQUERAS, Wocal, presidenta de l’ACCC JOAN JOFRE, WPcal, Universitat de Barcelona RAMON BARTRONS, WPcal, Universitat de Barcelona LLUÍS SERRA, Wocal, Universitat de Barcelona CÈLIA MARRASÉ, WPcal, Institut de Ciències del Mar

© dels autors dels articles Editat per la Societat Catalana de Biologia (filial de l’Institut d’Estudis Catalans) Carrer del Carme, 47. 08001 Barcelona Compost per Ricard Roca ricardroca@gmail.com Imprès a Limpergraf, SL Polígon industrial Can Salvatella, carrer de Mogoda, 29-31 Barberà del Vallès ISSN: 0212-3037 Dipòsit Legal: B. 12164-1963

Biologia de la reproducció

Mercè Durfort i Francesca Vidal editores

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 59, 2008

ÍNDEX Biologia de la reproducció Antecedents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Durfort i F. Vidal

Una ullada a les transformacions epigenètiques del DNA en la reproducció . . . . . . . . . J. A. Subirana

Transició de proteïnes nuclears i condensació de la cromatina espermiogènica. Proposta d’un model ancestral de l’espermiogènesi nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . K. Kurtz, N. Saperas, J. Ausió i M. Chiva

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. Maldonado i A. Riesgo

L’imposex: el seu estudi i evolució en Bolinus brandaris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. J. Amor, M. Ramón, A. Richter i M. Durfort

Ultraestructura dels espermatozoides de Crassostrea gigas, Mytilus galloprovincialis i Donax trunculus (Mollusca, Bivalvia) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . M. G. Bozzo, M. Poquet, E. Sagristà i M. Durfort

L’espermatogènesi en els crancs (Crustacea, Decapoda). Un model atípic de condensació del nucli espermàtic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

Control neuroendocrí de l’inici de la maduresa sexual en els vertebrats mitjançant la kisspeptina i el seu receptor, amb especial èmfasi pel que fa a la situació en els peixos teleostis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. S. Mechaly, J. Viñas i F. Piferrer

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins . . . . . . . . . . . . 109 J. Cerdà Conseqüències fisiològiques d’una activació del sistema immunitari sobre la reproducció i el creixement en peixos d’interès en aqüicultura . . . . . . . . . . . . . 129 N. Roher, D. Crespo, Y. Vraskou, M. Díaz, S. MacKenzie i J. V. Planas

Biotecnologia reproductiva en porcí: estat actual i reptes de futur . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 S. Bonet, M. D. Briz, E. Pinart, S. Sancho, E. Bussalleu, M. Yeste, I. Casas, A. Fábregas, M. Puigmulé, E. García, M. Santos, E. Torner i S. Micaló Producció in vivo versus in vitro d’embrions caprins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 M. T. Paramio i D. Izquierdo Un mateix camí amb dreceres diferents en funció del sexe: gametogènesi femenina . . 165 R. Garcia-Cruz, I. Roig i M. Garcia Anàlisi citogenètica d’espermatozoides humans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 Z. Sarrate, E. Anton, J. Blanco i F. Vidal Fragmentació del DNA espermàtic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 M. Esbert, A. Pacheco, M. Florensa, M. Riqueros, M. Martín, A. Ballesteros i G. Calderón Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 M. Rius, A. Obradors, M. Oliver, J. Benet i J. Navarro Cultiu i desenvolupament in vitro d’embrions humans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 M. Grossmann i M. C. Pons Diagnòstic genètic preimplantacional en estadis embrionaris tardans . . . . . . . . . . . . . . 225 M. Parriego, A. Veiga i F. Vidal Criopreservació i tècniques de reproducció assistida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233 M. Solé, M. Boada i A. Veiga Derivació de línies de cèl·lules mare embrionàries a partir de blastòmers aïllats . . . . . . 249 S. González, N. Costa-Borges, E. Ibáñez i J. Santaló Derivació de línies de cèl·lules mare embrionàries humanes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 B. Aran, I. Rodriguez, A. Raya, Y. Muñoz, P. N. Barri, J. C. Izpisúa i A. Veiga

ANTECEDENTS Mercè Durfort i Francesca Vidal L’any 1978 un grup d’investigadors interessats pels fenòmens reproductius en invertebrats i vertebrats que treballaven en diferents centres universitaris, al Consell Superior d’Investigacions Científiques i tam bé en centres hospitalaris públics i privats, van decidir crear una secció especialitzada en el marc de la Societat Catalana de Biologia, que van denominar Secció de Biologia de la reproducció. Entre altres, els membres fundadors van ser: Robert Bargalló i Jordi López Camps, del Servei de Microscòpia Electrònica de la Universitat de Barcelona; Mercè Durfort, Maria Gràcia Bozzo i Enric Ribes, del Departament de Morfologia Microscòpica (l’actual Departament de Biologia Cel·lular); Josep Egozcue, amb un bon nombre de persones del seu equip, com Montserrat Ponsà, Montserrat Garcia, Fan ny Vidal, Josep Santaló i Maria Dolors Coll, entre altres; també Josep Antoni Subirana, Lluís Cornudella i, més endavant, Manel Chiva, del Departament de Química Macromolecular de la Universitat Politècnica, i la participació dels clínics, com Simón Marina, Pablo Andolz i Pere N. Barri. Posteriorment s’afegirien altres col·lec tius, com el grup de recerca de Cristóbal Mezquita de la Facultat de Medicina de la Universitat de Barcelona i el de Sergi Bonet, de la Universitat de Girona. En el decurs del temps els grups inicials van anar creixent. Aquesta secció inicialment es reunia un cop al mes per tractar temes que estaven en estudi; aquestes trobades es feien al Servei de Microscòpia Electrònica de la Universitat de Barcelona i posteriorment a la Facultat de Biologia, quan es va traslladar aquesta a la Diagonal. Més endavant es va decidir fer unes reunions plenàries, unes Jornades de

Biologia de la Reproducció, amb una periodicitat de dos anys. La primera va tenir lloc el 27 d’abril de l989 i se celebrà a la Facultat de Biologia de la Universitat de Barcelona. En aquesta primera jornada es van presen tar trenta-set comunicacions per part d’integrants de tots els grups de treball de la Secció, comunicacions que van ser publicades en el volum 1 dels llibres de les Jornades, distribuït el mateix dia que va tenir lloc. En aquesta primera Jornada es va invitar Carlos Azevedo, de la Universitat de Porto, i el professor Bruslé, de la Universitat de Perpinyà, dues personalitats amb una llarga experiència en els estudis de formació de gàmetes. Els grups van créixer i alguns es van independitzar i van anar a treballar a d’altres centres públics i privats. Aquesta diàspora va ser particularment important en el grup del doctor Egozcue, tot i que va mantenir, en el decurs dels anys, importants lligams de col·laboració i d’amistat. Recentment hem hagut de lamentar les morts de Lluís Cornudella, Josep Egozcue i Pablo Andolz. L’any 1991 va aparèixer el volum 42 de tre balls de la societat catalana de biologia, que recollia onze treballs sobre biologia de la reproducció, entre els quals trobem autors del grup dels fundadors i d’altres que s’havien anat incorporant més tard, com Mark Grossmann, procedent del grup de Jo sep Egozcue, Anna Veiga i Gloria Calderón, de l’equip de l’Institut Universitari Dexeus, i Montserrat Daban, del grup de Subirana i Chiva, entre altres. Tambe vam tenir la col· laboració d’un grup de la Universitat de València: Carles Soler, Francisco Pérez i Joan Josep Montserrat.

Trenta anys després de l’acte fundacional de la Secció de Biologia de la reproducció de la Societat Catalana de Biologia hem invitat els seus membres a presentar treballs per al volum 59 de treballs de la societat catalana de biologia, i la resposta ha estat altament positiva. S’han pogut reunir vint articles procedents de la majoria dels grups que treballen

en diferents aspectes de la biologia de la reproducció, i és una satisfacció poder constatar la fidelitat del grup fundacional i el considerable increment que ha experimentat al llarg d’aquests anys. (L’ordre que s’ha donat als treballs que apareixen en aquesta publicació ha estat el filogenètic per a aquells que fan referència a la reproducció en l’àmbit de la biologia animal.)

DOI: 10.2436/20.1501.02.54

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 9-12

UNA ULLADA A LES TRANSFORMACIONS EPIGENÈTIQUES DEL DNA EN LA REPRODUCCIÓ Juan Antonio Subirana Universitat Politècnica de Catalunya. Adreça per a la correspondència: Juan Antonio Subirana. Universitat Politècnica de Catalunya. ETSEIB, Pavelló G. Av. Diagonal, 647. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: juan.a.subirana@upc.edu. RESUM Es presenta un resum de les transformacions epigenètiques que experimenta el DNA en el procés de diferenciació dels gàmetes i en el desenvolupament de l’embrió. Paraules clau: epigenètica, metilació del DNA, espermatozoide, oòcit, gàmeta. OVERVIEW OF DNA EPIGENETIC CHANGES IN REPRODUCTION SUMMARY The epigenetic transformations of DNA during the differenciation of gametes and the development of the embryo are briefly presented. Key words: epigenetics, DNA methylation, sperm, oocyte, gamete. Una visió de la transmissió del DNA de pares a fills és que es tracta d’un simple procés de duplicació del DNA des de les cèl· lules primordials de les gònades passant pels gàmetes, la fecundació i el desenvolupament embrionari. L’espermatozoide seria un simple vehicle de transport del genoma haploide del pare. En l’embrió aviat se separen les cèl·lules primordials que donen lloc a la gònada, la qual entra en un procés de diferenciació marcat en arribar a la madu-

resa sexual (pubertat en humans), moment en el qual comencen a formar-se gàmetes madurs en quantitats variables segons l’espècie. Aquest procés es veu influït aleatòriament per mutacions, delecions locals i duplicacions espontànies, que poden modificar la seqüència del DNA. En realitat el procés és més complex, ja que el DNA està subjecte a canvis més subtils, de tipus epigenètic, és a dir, canvis que no modifiquen la seqüència de bases del DNA. Els últims

10 J. A. Subirana

anys s’ha demostrat que aquests canvis tenen una gran importància en molts àmbits de la biologia (Allis et al., 2007). Per exemple algunes bases del DNA poden ser modificades, més o menys transitòriament, i marquen el DNA en el procés de diferenciació cel·lular (imprinting). El canvi més estudiat és la metilació de la citosina en algunes zones que tenen seqüències CG, però altres modificacions són possibles. Una modificació molt diferent són els canvis que es poden produir en zones repetitives que originin una inestabilitat del genoma (Somers, 2006; Lees-Murdock i Walsh, 2008). Un altre fenomen paral·lel és el canvi no-

table que experimenten les altres molècules associades amb el DNA al llarg de tot aquest procés, com descriuen Kurtz et al. en un article d’aquest volum. Els canvis en les proteïnes bàsiques són notables, però també hi ha canvis importants en altres proteïnes i en les molècules de RNA nuclear, que es troben en grans quantitats en els oòcits i en quantitats minúscules en els espermatozoides. En aquests últims no és clar quin és el paper d’aquest RNA (Costa, 2008; Carrel, 2008). En els organismes adults alguns gens estan marcats, de manera que tenen una expressió diferencial segons estiguin en un Oòcits en creixement

Oòcits aturats

Oòcit aturat en meiosi ÕÕ

XX Gònada primordial XY Espermatogoni

Espermàtida

Espermatozoide Desmetilació en la gònada no diferenciada

Fertilització

Cèl·lula primordial en migració

Cèl·lules somàtiques

Zigot

Desmetilació de les seqüències no marcades

Embrió

Figura 1. Procés de marcatge (imprinting) del DNA en els gàmetes. Quan les cèl·lules germinals primordials emigren a la gònada són desmetilades. Així els oòcits aturats en la meiosi i no presenten senyals de metilació. Més tard les cèl·lules germinals es tornen a metilar d’una manera especifica segons el sexe de l’embrió. Les marques de metilació s’indiquen simbòlicament com rodones blanques en els mascles i negres en les femelles. El nombre real de marques de metilació és molt més gran; les rodones solament indiquen el seu nombre relatiu (Lawrence i Moley, 2008).

Una ullada a les transformacions epigenètiques del DNA en la reproducció 11

cromosoma d’origen patern o matern. Els canvis en l’expressió maternopaterna estan associats a diverses malalties i a una viabilitat menor (Carrel 2006; Lawrence i Moley, 2008; Lees-Murdock i Walsh, 2008). Aquest marcatge s’està estudiant en detall tant en humans com en ratolins, les dues espècies que han servit per aclarir la complexitat d’aquest procés, que es presenta de manera simplificada a la figura 1. La metilació del DNA varia segons els teixits i l’estadi metabòlic de les cèl·lules. Moltes regions del genoma són metilades en algun moment, però només en alguns gens l’estat de metilació és transmès dels gàmetes a l’embrió. Com pot veure’s a la figura 1, el procés és diferent en els gàmetes masculins i femenins. Tant en els espermatogonis fetals com en els oòcits en repòs totes les marques de metilació han estat esborrades. Només quan s’activa el procés de diferenciació dels gàmetes el DNA és metilat d’una manera massiva. El procés es completa més aviat en els espermatozoides que en els oòcits. Com a resultat, en el zigot ens trobem amb un DNA metilat extensivament, però ràpidament el genoma és desmetilat en les primeres divisions cel·lulars. Només les zones que quedaran marcades en l’adult es mantenen metilades, i són les que generen el marcatge paternal o maternal. A mesura que l’embrió creix, torna a posar-se en marxa el procés de metilació del DNA que acompanya la diferenciació cel·lular. En canvi, en les cèl·lules que donaran lloc a la gònada primordial s’esborren totes les marques de DNA. Ens trobem doncs, en els zigots, un DNA que té un marcatge diferent del de qualsevol cèl·lula somàtica. Com és, doncs, possible, el procés de trasplantament nuclear? Eliminant el nucli d’un oòcit madur i introduint-li un nucli somàtic és possible obtenir un organisme adult clonat. Evidentment, el zigot pot, d’alguna manera, recuperar-se d’aquest marcatge diferencial i donar lloc

a un adult viable. Però aquesta recuperació no és completa i els organismes clonats d’aquesta manera presenten molts problemes: una mida sovint més gran, una mortalitat elevada, susceptibilitat a moltes malalties, activació defectuosa d’alguns gens, etc. Com a conclusió podem destacar que, a més dels grans canvis que experimenten els gàmetes en la seva composició proteica i en la seva morfologia, el DNA sofreix modificacions epigenètiques que influeixen d’una manera subtil en el desenvolupament de l’embrió. Aquests canvis poden influir en l’aparició de diverses malalties (Lawrence i Moley, 2008; Perrin et al., 2007). S’ha de tenir també en compte la presència de proteïnes minoritàries (Oliva et al., 2008) i de RNA (Costa, 2008) en els espermatozoides, el paper dels quals és desconegut. La presència d’histones minoritàries podria també influir en la funció dels espermatozoides (Kurtz et al., 2008). BIBLIOGRAFIA Allis, C. D.; Jenuwein, T.; Reinberg, D.; Caparros, M. L. (2007). Epigenetics. Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Carrell, D. (2008). «Contributions of spermatozoa to embryogenesis: assays to evaluate their genetic and epigenetic fitness». Reproductive BioMedicine Online, 16: 474-484. Costa, F. F. (2008). «Non-coding RNAs, epigenetics and complexity». Gene, 410: 9-17. Kurtz, K.; Martínez-Soler, F.; Ausió, J.; Chiva, M. (2008). «Histones and nucleosomes in Cancer sperm (Decapod: Crustacea) Previously described as lacking basic DNA-associated proteins: A new model of sperm chromatin». Journal of Cellular Biochemistry. [En premsa] Lawrence, L. T.; Moley, K. H. (2008). «Epigenetics and assited reproductive technologies: human imprinting syndromes». Seminars in Reproductive Medicine, 26: 143-152. Less-Murdock, D.; Walsh, C. P. (2008). «DNA methylation reprogramming in the germ line». A:

12 J. A. Subirana

Wilkins, J. [ed.]. Genomic imprinting. Berlín: Springer, 1-15. Oliva, R.; Martinez-Heredia, J.; Estanyol, J. M. ANY «Proteomics in the study of the sperm cell composition, differentiation and function». Systems Biology in Reproductive Medicine, 54: 23-36. Perrin, M. C.; Brown, A. S.; Malaspina, D. (2007).

«Aberrant epigenetic regulation could explain the relationship of paternal age to schizophrenia». Schizophrenia Bulletin, 33: 1270-1273. Somers, C. M. (2006). «Expanded simple tandem repeat (ESTR) mutation induction in the male germline: lessons learned from lab mice». Mutation Research, 598: 35-39.

DOI: 10.2436/20.1501.02.55

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 13-27

TRANSICIÓ DE PROTEÏNES NUCLEARS I CONDENSACIÓ DE LA CROMATINA ESPERMIOGÈNICA. PROPOSTA D’UN MODEL ANCESTRAL DE L’ESPERMIOGÈNESI NUCLEAR Kathryn Kurtz,1 Núria Saperas,2 Joan Ausió 3 i Manel Chiva 1 Departament de Ciències Fisiològiques II, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona. Departament d’Enginyeria Química, ETSEIB, Universitat Politècnica de Catalunya. 3 Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, BC, Canadà. 1 2

Adreça per a la correspondència: Manel Chiva. Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona. Campus de Bellvitge, Pavelló de Govern, 4a planta. Feixa Llarga, s/n. L’Hospitalet de Llobregat. Adreça electrònica: mchiva@ub.edu. RESUM Revisem la correlació entre tres processos que es donen en l’espermiogènesi: a) el recanvi de proteïnes nuclears, b) el patró de condensació de la cromatina i c) l’acetilació de les histones. L’estudi s’aplica a quatre espècies que presenten transicions de proteïnes nuclears de complexitat creixent: Sparus aurata, que reté les histones en els nuclis espermàtics madurs, Dicentrarchus labrax i Monodonta turbinata, en les quals les histones són substituïdes per una proteïna molt més bàsica, i Sepia officinalis, en la qual les histones són desplaçades per una proteïna precursora que es transforma en protamina en les últimes fases de l’espermiogènesi. Els resultats indiquen que en la primera fase de l’espermiogènesi de les quatre espècies, es dóna un procés idèntic, en el qual: a) la cromatina perd l’organització de tipus somàtic i queda estructurada en grànuls de 20 nm de diàmetre i b) les histones experimenten una acetilació moderada. A partir de l’estructura granular de 20 nm, cada tipus d’espermiogènesi segueix camins diferents. En les espermàtides de S. aurata les histones es desacetilen i la cromatina es condensa definitivament. En canvi, en les altres espermiogènesis es produeixen transicions estructurals més complexes que són analitzades en el text. Paraules clau: espermiogènesi, cromatina, proteïnes nuclears, acetilació, evolució.

14 K. Kurtz, N. Saperas, J. Ausió i M. Chiva

SPERMIOGENIC PROTEIN TRANSITIONS AND CHROMATIN CONDENSATION. PROPOSAL FOR AN ANCESTRAL MODEL OF NUCLEAR SPERMIOGENESIS SUMMARY We study the correlation between: i) nuclear protein exchange in spermiogenic nuclei, ii) the chromatin condensation pattern, and iii) the acetylation of histones. The study is applied to four species which demonstrate an increasing complexity in nuclear protein transitions. In Sparus aurata histones remain in sperm nuclei. In Dicentrarchus labrax and Monodonta turbinata the histones are substituted by a much more basic molecules. In spermiogenesis of Sepia officinalis histones are replaced by a precursor protamine, which is transformed into the protamine in the last phases of spermiogenesis. The results indicate that in the first phase of spermiogenesis of all four species an identical process is involved, in which: i) the chromatin looses typical somatic structure and ends up organized into granules measuring 20 nm in diameter, and ii) the histones undergo a moderate acetylation. Key words: spermiogenesis, chromatin, nuclear proteins, acetylation, evolution. INTRODUCCIÓ En les espermiogènesis dels animals, el nucli de les espermàtides experimenta una important transformació, amb la qual esdevé el nucli de l’espermatozoide. El procés de diferenciació nuclear es produeix en molts casos a través de l’expressió seqüencial de proteïnes específiques (anomenades genèricament proteïnes bàsiques del nucli espermàtic (SNBP), però que en alguns casos concrets s’anomenen protamines). Aquestes proteïnes penetren en el nucli i van desplaçant les histones i altres proteïnes nuclears. La substitució de les histones per les SNBP provoca la condensació progressiva de la cromatina. Així, el nucli final de l’espermatozoide conté una cromatina molt compactada, un volum reduït i una composició en proteïnes molt simplificada. La transformació del nucli de l’espermàtida en el nucli espermàtic és un procés complex que varia segons el grup taxonò-

mic estudiat. En alguns peixos ossis i aus, la histona H4 de les espermàtides presenta hiperacetilació en les etapes intermèdies de l’espermiogènesi, i a partir d’aquí les histones són reemplaçades per una proteïna molt bàsica (protamina) que es troba fosforilada (Sung i Dixon, 1970; Christensen i Dixon, 1982; Christensen et al., 1984; revisat a Oliva i Dixon, 1991). La substitució de les histones per la protamina produeix una desestructuració i desaparició dels nucleosomes (Oliva et al., 1987) i organitza el DNA en una estructura molt més compacta (nucleoprotamina). La substitució de proteïnes esmentada es dóna en els estadis intermedis de l’espermiogènesi, els quals coincideixen amb la progressió de la condensació de la cromatina. En els estadis finals de l’espermiogènesi té lloc la desfosforilació de la protamina i l’últim pas de la condensació de la cromatina. Una altra de les espermiogènesis més estudiades és la dels mamífers. Aquí es dóna una seqüència més comple-

Transició de proteïnes nuclears i condensació de la cromatina 15

xa en les substitucions de les proteïnes que interaccionen amb el DNA. Les histones es veuen parcialment reemplaçades per altres histones específiques del testicle, les quals són desplaçades més endavant per proteïnes de transició. Les proteïnes de transició seran reemplaçades posteriorment per protamines (una de les quals es troba en forma de precursor) (Meistrich, 1989; Courtens et al., 1995; Meistrich et al., 2003; Zhao et al., 2004; Churikov et al., 2004). En el decurs d’aquests canvis del tipus de proteïnes que s’uneixen al DNA també es produeixen una sèrie de modificacions posttraduccionals que permeten que el recanvi de proteïnes s’efectuï organitzadament. Entre aquestes modificacions cal destacar la hiperacetilació de la histona H4 i altres histones específiques del testicle, i la ubiquitinització de H3, H2B i TH3 (Grimes i Henderson, 1983; Chen et al., 1998; Hazzouri et al., 2000; Lahn et al., 2002). En el nucli espermàtic madur es troben protamines i també una certa proporció d’histones acetilades, les quals en l’espermatozoide humà organitzen un 15 % del genoma (Gusse et al., 1986; Gatewood et al., 1987, 1990). Evidentment, aquests canvis de proteïnes comporten canvis en l’estructura i la condensació de la cromatina, que es poden mostrar parcialment a través de l’observació mitjançant microscòpia electrònica. Les molècules relacionades amb la biologia reproductiva (així com els altres nivells de complexitat biològica relacionats amb la reproducció) han experimentat una evolució excepcionalment ràpida (Swanson i Vacquier, 2002). Això comporta que les característiques bioquímiques i morfològiques de l’espermiogènesi siguin molt variades entre les espècies. Des de fa temps, s’han fet classificacions molt interessants i acurades de les cèl·lules espermàtiques i de la seva possible evolució (vegeu, per exemple, Franzén, 1977), però encara no es coneix com

pot haver evolucionat el procés de l’espermiogènesi per produir tota la varietat d’espermatozoides que existeixen. En el present treball enfoquem aquest tema centrant-nos en el nucli espermàtic. Analitzem diferents tipus de canvis nuclears en quatre espermiogènesis escollides i intentem proposar un model ancestral del procés que segueix el nucli cel·lular en el decurs de la diferenciació espermàtica. MODELS DE CANVIS NUCLEARS EN LES ESPERMIOGÈNESIS Sparus aurata (model [H → H]) La figura 1 mostra en primer lloc (part superior) el canvi o transició de proteïnes nuclears en l’espermiogènesi d’aquesta espècie. És una transició molt simple: les espermàtides més joves contenen histones (marcades d’H1 a H4 a la figura) en el seu nucli. En el decurs de l’espermiogènesi, desapareixen les proteïnes no-histones (minoritàries a la figura 1, part superior esquerra), però en els nuclis espermàtics madurs romanen les histones (vegeu la figura 1, part superior dreta). Les digestions dels nuclis dels espermatozoides amb nucleasa micrococcal produeixen el patró típic de les cromatines organitzades en forma de nucleosomes (Kurtz et al., 2008). Per tant, l’estructura nucleosòmica no es perd en els nuclis espermiogènics. En la segona part de la figura 1 apareixen les imatges, obtingudes per microscòpia electrònica, de la compactació dels nuclis espermiogènics (fila i), així com del patró de la condensació de la cromatina (fila ii) i del marcatge amb anticòs antiacetillisina (fila iii) en cada un dels estadis de la condensació. El marcatge amb antiacetil-lisina dóna informació de l’acetilació de les

16 K. Kurtz, N. Saperas, J. Ausió i M. Chiva

Figura 1. Característiques dels nuclis espermiogènics de S. aurata. Part superior: Electroforesi bidimensional (àcid acètic/urea/tritó i SDS) de les proteïnes extretes dels nuclis d’una gònada molt immadura (a) o dels nuclis d’espermatozoides (d). Fila i. Nucli d’una espermàtida molt jove (a) i d’espermàtides en diferenciació (b, c); nucli d’un espermatozoide testicular (espermàtida molt avançada) (d). Barra: 0,5 µm per a totes les imatges de la fila. Fila ii. Patró de condensació de la cromatina espermiogènica. Cromatina en grànuls de 20 nm (b1, b2, c); cromatina condensada en les espermàtides molt avançades (d). Barra: 0,2 µm per a totes les imatges. Fila iii. Marcatge amb anticòs antiacetil-lisina en cada estadi de la condensació de la cromatina. Barra: 0,5 µm per a totes les imatges.

Transició de proteïnes nuclears i condensació de la cromatina 17

histones H3 i H4, tal i com ha estat comprovat amb transferència western (Kurtz et al., 2008). L’espermàtida primerenca conté una cromatina organitzada de manera similar als nuclis somàtics, formats per eucromatina i per grumolls d’heterocromatina acumulats a la perifèria i en algunes zones interiors dels nuclis (vegeu ia a la figura 1). En aquests nuclis (els quals contenen histones i una certa proporció d’altres proteïnes) apareix un nivell basal relativament baix d’acetilació (iiia). En els següents estadis de l’espermiogènesi, la cromatina de l’espermàtida s’organitza homogèniament en grànuls. El diàmetre dels grànuls és de 20 nm, la qual cosa suggereix que poden estar compostos per 4-6 nucleosomes cada un (un nucleosoma és un cilindre d’aproximadament 5,5 nm de radi i 5,5 nm d’alçada). Els grànuls de 20 nm contenen histones en un estat significatiu d’acetilació (iiib). De fet, l’acetilació en aquests estadis és la més intensa de tot el procés espermiogènic d’aquesta espècie. A mesura que progressa l’espermiogènesi de S. aurata, els grànuls de 20 nm es van concentrant en direcció al centre nuclear (ib → c) sense que se’n modifiqui la mida (iic). Aquest pas comporta finalment una reducció del volum nuclear, i possiblement una certa pèrdua de l’acetilació de les histones (iiic). En els estadis finals, la cromatina adopta un aspecte més homogèniament compactat (id), i l’organització en grànuls de 20 nm desapareix. És interessant observar que aquesta fase final coincideix amb la desacetilació completa de les histones (iiid). Dicentrarchus labrax (model [H → P]) La figura 2 és un recull de les transicions composicionals i estructurals del nucli i la cromatina del peix ossi D. labrax durant la seva espermiogènesi. L’anomenem model

[H → P] perquè les histones de les espermàtides són substituïdes per una protamina en els nuclis espermàtics madurs. A la part superior de la figura 2 es presenta el canvi en proteïnes, així com l’estructura primària de la protamina de D. labrax (Saperas et al., 1993). Es tracta d’una molècula molt petita (trenta-quatre residus aminoacídics) formada en un 61,8 % per residus d’arginina. Semblantment al cas anterior, l’espermàtida més primerenca presenta un nucli amb una organització de tipus somàtic (a la figura 2 ia, apareix un nucli d’una espermàtida no totalment primerenca on la cromatina de tipus somàtic comença a transformar-se). La cromatina d’aquests nuclis, a més de contenir DNA, conté histones com a principals proteïnes bàsiques associades (i no-histones en menor proporció) (vegeu la figura 2, part superior a). El marcatge amb antiacetil-lisina dóna una reacció basal relativament dèbil (iiia). El pas següent és la reorganització de la cromatina en grànuls de 20 nm de diàmetre (iib1, b2) idèntics als que presenta S. aurata. En aquesta transició també s’ha produït una acumulació dels grànuls en direcció al centre nuclear, la qual cosa ha provocat una important reducció del volum nuclear (ib). En els grànuls de 20 nm les histones (concretament les H3 i H4, quan és comprovat amb transferència western) manifesten un grau significatiu d’acetilació (iiib). En els estadis següents, la protamina penetra en els nuclis (electroforesi intermèdia, vegeu la part superior de la figura 2). Això provoca una remodelació de l’estructura de la cromatina: els grànuls de 20 nm passen a formar grànuls majors i més electrodensos que creixen fins a adoptar un diàmetre aproximat de 80 nm (ic, d; iic, d, e). La formació dels grànuls de 80 nm no s’efectua per simple fusió dels grànuls de 20 nm, ja que els grànuls de 80 nm no contenen histones, només DNA i protamina, la qual empaqueta

18 K. Kurtz, N. Saperas, J. Ausió i M. Chiva

el DNA d’una manera diferent de la nucleosòmica (Ward i Coffey, 1991; Daban, 2000). Les histones que apareixen en aquest estadi es troben en el seu grau màxim d’acetilació, la qual cosa està d’acord amb treballs

anteriors en els quals es mostra que quan la protamina desplaça les histones aquestes estan hiperacetilades (vegeu la revisió d’Oliva i Dixon, 1991). Aquesta transició o remodelació estructural provoca una sego-

Figura 2. Característiques dels nuclis espermiogènics de D. labrax. Part superior: Electroforesi en àcid acètic/urea del canvi de proteïnes nuclears en l’espermiogènesi de D. labrax (H: histones; P: protamina). També es mostra la seqüència aminoacídica de la protamina d’aquesta espècie. Fila i: Estadis de la diferenciació nuclear, des d’una espermàtida jove (a) a un espermatozoide testicular ( f ). Barra: 0,5 µm per a totes les imatges. Fila ii. Patró de condensació de la cromatina. b1 i b2) grànuls de 20 nm; c, d) remodelació dels grànuls de 20 a 80 nm; e) cromatina d’una espermàtida molt avançada. Barra: 0,2 µm per a totes les imatges. Fila iii. Marcatge amb antiacetil-lisina de cada tipus de cromatina. Barra: 0,5 µm per a totes les imatges.

Transició de proteïnes nuclears i condensació de la cromatina 19

na reducció del volum del nucli espermàtic (ic → f ). En les fases finals, el nucli ha reduït considerablement el seu volum (if ), i la cromatina apareix organitzada en grànuls de 80 nm (iie). No hi ha histones en aquesta cromatina, només protamina (electroforesi, figura 2f ). Monodonta turbinata (model [H → P]) En aquesta espècie de mol·lusc, les histones que es troben en les espermàtides primerenques són substituïdes per una proteïna de cent sis residus aminoacídics que formarà part del nucli espermàtic (vegeu la figura 3, electroforesi a → e). Aquesta proteïna no és una protamina típica, ni té un origen comú amb les protamines típiques (Chiva et al., 1992; Lewis et al., 2004). No obstant això, la seva estructura primària (resolta per Daban et al., 1995) comparteix característiques força semblants amb les protamines típiques (entre aquestes una gran proporció de residus bàsics i la disposició de les arginines en grups de 4 a 6 residus, vegeu part superior de la figura 3). En els primers estadis de la diferenciació espermiogènica, la cromatina de les espermàtides s’organitza de nou en grànuls de 20 nm (ib; iib, c), molt homogenis en el valor del seu diàmetre, que contenen histones en un estat significatiu d’acetilació (iiib, c). En aquesta primera etapa de la diferenciació espermiogènica, el nucli també disminueix el seu volum sense que la cromatina perdi la seva estructura granular (ib → c; iib, c). A partir d’aquest estadi, els canvis en la cromatina segueixen també un patró similar al que hem trobat en D. labrax. Els grànuls de 20 nm es remodelen en grànuls de 60 nm quan la «protamina» de M. turbinata substitueix les histones (ic, d; iid1). En els estadis en què la protamina comença a substituir les histones, aquestes es troben en el

seu màxim estat d’acetilació (iiid1). Posteriorment, la cromatina completa la seva remodelació i els complexos DNA-«protamina» adopten la forma de grànuls densos d’aproximadament 60 nm de diàmetre (iid2; iiid2). En el pas final, els grànuls de 60 nm es fusionen parcialment i la cromatina del nucli espermàtic presenta un estat relativament homogeni (ie). Sepia officinalis (model [H → Pp → P]) La transició de proteïnes en aquesta espècie és un grau més complexa que en els casos anteriors. A les figures 4 i 5 es presenta un resum dels estudis efectuats en aquesta espermiogènesi. Aquí, les histones són substituïdes per una molècula precursora de la protamina (vegeu, a la figura 4, les electroforesis de la part dreta), la qual es transforma en protamina per escissió del seu extrem aminoterminal (Martin-Ponthieu et al., 1991; Wouters-Tyrou et al., 1991; vegeu la figura 6). En aquest cas, doncs, les histones no són substituïdes directament per la protamina que trobarem al nucli espermàtic madur, sinó per una proteïna menys bàsica (el precursor). La transició estructural de la cromatina és més complicada del que esperaríem basant-nos en la transició de proteïnes (vegeu la figura 4). Es produeixen quatre transformacions (remodelacions) en l’estructura de la cromatina espermiogènica. El nucli de l’espermàtida primerenca conté cromatina de tipus somàtic que es reconverteix (com en els casos anteriors) en cromatina granular de 20 nm (vegeu la figura 4b). A diferència del que passava en les altres espermiogènesis, el nucli no pateix un decrement de volum (vegeu la figura 4 a → b). En estadis posteriors, la cromatina es remodela a una configuració fibril·lar (30-35 nm de diàmetre), i simultàniament el nucli adopta una forma

20 K. Kurtz, N. Saperas, J. Ausió i M. Chiva

Figura 3. Característiques dels nuclis espermiogènics de M. turbinata. Part superior: Electroforesi en àcid acètic/urea de la transició de proteïnes nuclears espermiogèniques (H: histones; P: protamina). També apareix l’estructura primària de la molècula de «protamina» de M. turbinata. Fila i. Diferenciació del nucli en l’espermatogènesi (el nucli en a correspon a un espermatogoni que representa l’organització de tipus somàtic de la cromatina). Barra: 1 µm per a totes les imatges de la fila. Fila ii. Patró de condensació de la cromatina espermiogènica. b, c) grànuls de 20 nm; d1) remodelació dels grànuls de 20 a 60 nm. d2) cromatina d’una espermàtida avançada. Barra: 0,5 µm per a totes les imatges de la fila. Fila ii. Marcatge amb antiacetil-lisina de la cromatina en les diferents fases de la condensació. Barra: 0,5 µm per a tota la fila.

Transició de proteïnes nuclears i condensació de la cromatina 21

Figura 4. Nucli i cromatina espermiogènica de S. officinalis. Columna esquerra: Modificació de la forma nuclear al llarg de l’espermiogènesi. Barra: 2 µm per a tota la columna. Columna central: Patró de condensació. Cromatina granular de 20 nm (b); cromatina en fibres de 3035 nm (c); en fibres de 40-50 nm (d); unió progressiva de les fibres de 40-50 nm (e → f ). Barra: 200 nm per a tota la columna. Columna dreta: Composició proteínica de cada tipus de cromatina. (H: histones; Pp: precursor de la protamina; P: protamina).

fusiforme (4c). En un estadi següent, tota la cromatina es reconverteix en fibres de 4050 nm sense que es modifiqui la forma nuclear (4d). En els últims estadis d’aquesta espermiogènesi, les fibres de 40-50 nm es van ajuntant progressivament per formar fibres majors i finalment la cromatina uniforme i compactada del nucli espermàtic (vegeu la figura 4 e → g). Els canvis de forma del nucli espermiogènic i les seves principals causes van ser descrits en un treball anterior (Martínez-Soler et al., 2007b), però no es consideren aquí en detall. Atesa la complexitat de les transicions estructurals, vam estudiar la composició de proteïnes (Martínez-Soler et al., 2007a) i l’estat d’acetilació de la histona H4 (Kurtz et al., 2007) en cada tipus de cromatina. Els resultats globals d’aquests estudis es presenten resumidament a la figura 5: la cromatina de tipus somàtic de l’espermàtida més jove conté histones (més altres proteïnes minoritàries) que presenten un estat d’acetilació baix. En la primera remodelació, els grànuls de 20 nm es troben formats per histones de les quals la H4 està en forma monoacetilada. En el pas immediatament posterior, la molècula precursora de la protamina penetra en el nucli i coexisteix amb les histones i el DNA. Aquest complex (histones-DNAprecursor) adopta la forma de fibres de 3035 nm. En aquestes estructures la histona H4 es troba hiperacetilada (fins a tres acetilacions per molècula de H4). En l’estadi següent, les histones han abandonat el nucli i només el precursor de la protamina es troba interaccionant amb el DNA. La cromatina s’organitza ara en fibres de 40-50 nm (vegeu la figura 5). Finalment, el processament del precursor (i possiblement la desfosforilació de la protamina) provoquen que les fibres de 40-50 nm es vagin fusionant entre si fins a formar el nucli espermàtic de Sepia, que conté només DNA i protamina i que presenta la cromatina molt electrodensa.

22 K. Kurtz, N. Saperas, J. Ausió i M. Chiva

Figura 5. Resum del patró de condensació, composició i acetilació de proteïnes en l’espermiogènesi de S. officinalis (Martínez-Soler et al., 2007b). Columna esquerra: Composició i estat d’acetilació de les histones. Columna central: Patró complet de condensació de la cromatina espermiogènica. Barra: 300 nm per a totes les figures excepte per a l’última (3 µm). Columna dreta: Principals esdeveniments causants dels canvis en la condensació de la cromatina.

Transició de proteïnes nuclears i condensació de la cromatina 23

DISCUSSIÓ En aquest treball definim tres tipus de transicions de proteïnes nuclears en l’espermiogènesi. En el tipus més simple de transició ([H → H]) només les proteïnes no-histones abandonen els nuclis espermiogènics. El nucli espermàtic conserva les histones i l’organització nucleosòmica. En el següent nivell de complexitat (transició [H → P]) es produeix un desplaçament directe de les histones per part d’una proteïna molt bàsica, que posteriorment serà la principal (o l’única) proteïna present en els nuclis de les cèl·lules espermàtiques. L’altra transició espermiogènica presenta una complexitat superior. Les histones de les espermàtides són desplaçades per una molècula precursora de la protamina, que posteriorment es transformarà en protamina a través d’una escissió i eliminació de la seva part aminoterminal (Martin-Ponthieu et al., 1991; Wouters-Tyrou et al., 1991). Aquest tipus de transició l’anomenem [H → Pp → P] (Kurtz et al., 2007). Una anàlisi comparativa de l’espermiogènesi de les quatre espècies (S. aurata, D. labrax, M. turbinata i S. officinalis) ens permet establir algunes correlacions interessants entre canvis químics i canvis estructurals/ morfològics de la cromatina espermiogènica. Apareix una característica que és compartida per totes aquestes espermiogènesis: en les primeres etapes del procés, les diferències estructurals entre eucromatina i heterocromatina desapareixen i tot el material nuclear s’organitza homogèniament en grànuls de 20 nm. La mida d’aquests grànuls és idèntica en totes les espècies. Els grànuls de 20 nm contenen en tots els casos histones i, en conseqüència, han d’estar constituïts per 4-6 nucleosomes. També en tots els casos les histones de la cromatina es troben parcialment acetilades. En S. officinalis hem demostrat que la histona H4 es

troba monoacetilada en la lisina 12 en els grànuls de 20 nm (Kurtz et al., 2007). Sembla molt probable que l’acetilació parcial de la histona H4 (i possiblement la histona H3) impedeixi la formació d’estructures d’ordre elevat d’empaquetament dels nucleosomes (García-Ramírez et al., 1995; revisat per Bulger, 2005; Calestagne-Morelli i Ausió, 2006), però d’altra banda pot afavorir l’agregació de petits grups de nucleosomes per formar els grànuls de 20 nm. De fet, un repàs de la literatura sobre el desenvolupament morfològic de l’espermiogènesi de diferents animals indica que la formació dels grànuls de 20 nm en les fases inicials de la condensació de la cromatina és un fenomen que es produeix en la majoria de les espècies (no en totes) (Ribes et al., 2001). D’altra banda, la formació de grànuls de 20 nm també permet que el nucli espermiogènic experimenti una reducció important en el seu volum (vegeu les figures 1, 2 i 3). No sembla que això sigui una propietat intrínseca de la cromatina de 20 nm, ja que en S. officinalis (i en altres espècies) la reorganització de la cromatina en grànuls de 20 nm no es produeix simultàniament a la reducció del volum nuclear (vegeu les figures 4 i 5). Aquesta disminució hauria de ser deguda a altres components (com per exemple les seves interaccions amb la matriu nuclear, etc.) relacionats amb la nucleomorfogènesi, però que han de ser estudiats encara en la major part de les espècies. En el cas de S. aurata (transició [H → H]), els grànuls de 20 nm experimenten una coalescència parcial en les darreres fases de l’espermiogènesi, i es produeix una cromatina espermàtica, d’aspecte quasi homogeni quan és observada per microscòpia electrònica. La coalescència d’aquests grànuls es produeix conjuntament amb la desaparició de l’acetilació de les histones (vegeu la figura 1). Aquest pas final és anàleg a la desfosforilació de la protamina en els altres

24 K. Kurtz, N. Saperas, J. Ausió i M. Chiva

tipus de transicions proteiques. La desacetilació de les histones augmenta la interacció electrostàtica entre proteïnes i DNA, i permet una major aproximació i redistribució dels nucleosomes. Això provoca la «disgregació» dels grànuls de 20 nm. En els restants casos analitzats en aquest treball, la cromatina prossegueix el procés de compactació. En D. labrax i M. turbinata els grànuls desapareixen per donar lloc a estructures més grans i més electrodenses de 80 i 60 nm de diàmetre, respectivament (vegeu les figures 2 i 3). La desaparició dels grànuls de 20 nm és precedit per una hiperacetilació de les histones, les quals ja no es trobaran presents en els grànuls de 80 i 60 nm (formats exclusivament per DNA i protamina probablement fosforilada). Malgrat que les protamines de D. labrax i M. turbinata són diferents, el procés general de la condensació és molt similar i només es diferencia en la mida dels grànuls majors. La fusió d’aquests grànuls majors al final de les espermiogènesis coincideix amb la desfosforilació de la protamina descrita per altres autors.

La condensació de la cromatina en S. officinalis és més complicada. En una primera fase es formen grànuls de 20 nm compostos per DNA i histones (amb la H4 monoacetilada). En una etapa immediatament posterior la molècula precursora de la protamina entra en el nucli, on coexisteix amb les histones (fibres de 35 nm). En etapes més avançades, la histona H4 és hiperacetilada i totes les histones són desplaçades de la cromatina (fibres de 40-50 nm). En les etapes finals, el precursor es converteix en protamina i les fibres es van ajuntant entre si. En diversos estudis ha estat suggerit que el tipus més primitiu d’espermatozoide conté histones en el seu nucli, i que a partir d’aquest model poden haver evolucionat diversos tipus de proteïnes nuclears espermàtiques anomenades genèricament SNBP (Ausió, 1995; Roccini et al., 1996; Ausió et al., 1997). El treball que presentem aquí està d’acord amb aquesta hipòtesi, i n’ofereix una explicació causal. És molt possible que l’acetilació limitada de les histones i la formació de grànuls de 20 nm siguin processos ancestrals en l’evolució de l’espermiogè-

T1 T2

Zona precursora 1-terminal ---------------------------------------------------------------------10 20 30 MKVAANSSKMLAEKLELMKGGRRRRRRSRRRRRRSRRRS V D L SR T

T1 T2

3rotamina -------------------------------------------------------------------------- 40 50 60 70 78 RSPYRRRYRRRRRRRRRRSRRRRYRRRRSYSRRRYRRRR S R ---

Figura 6. Precursor i protamina de S. officinalis. La protamina de S. officinalis és una proteïna microheterogènia que prové d’una proteïna major, o precursor. En aquesta figura es mostren les seqüències de les dues formes de la protamina de S. officinalis i dels seus precursors (T1 i T2, en la qual només apareixen els residus diferents). Els vint-i-un residus de l’extrem amino són eliminats de la molècula (i del nucli) en els estadis avançats de l’espermiogènesi. Les seqüències provenen de Martin-Ponthieu et al. (1991) i de Wouters-Tyrou et al. (1991).

Transició de proteïnes nuclears i condensació de la cromatina 25

nesi. D’una banda, la formació del grànuls en tot el volum nuclear provoca una homogeneïtat estructural, i anul·la les diferències zonals en l’organització (i possiblement en l’estat funcional) de la cromatina; d’altra banda, permet que el nucli espermàtic experimenti una important disminució en el seu volum. Finalment, representa una estructura que permet fàcilment el desplaçament de les histones per part de les SNBP que puguin haver sorgit en l’evolució. Aquestes SNBP (entre les quals hi ha les protamines típiques) poden produir una condensació addicional del nucli espermàtic. Hem de manifestar que les transicions estudiades no representen totes les espècies animals. En altres espermiogènesis es produeixen transicions molt més complexes amb patrons de condensació de la cromatina més elaborats (Meistrich, 1989; Cáceres et al., 1999; Ribes et al., 2001). Els nuclis d’aquests espermatozoides poden presentar morfologies molt peculiars adaptades als detalls de la biologia de la fertilització de cada espècie. AGRAÏMENTS Agraïm a J. A. Subirana, F. MartínezSoler, N. Cortadellas i E. Ribes el seu ajut i orientacions. Aquest treball ha estat finançat mitjançant dos ajuts del Ministeri d’Educació i Ciència (BFU2005-00123/ BMC, BFU2006-04035/BMC) i del Natural Sciences and Engineering Research Council (Canadà) (OGP 0046399-02). Les observacions mitjançant microscòpia electrònica s’han efectuat als Serveis Cientificotècnics de la Universitat de Barcelona. BIBLIOGRAFIA Ausió, J. (1995). «Histone H1 and the evolution of the

nuclear sperm specific proteins». A: Jamieson, B. G. M.; Ausió, J.; Justine, J. L. [ed.]. «Advances in spermatozoal taxonomy and phylogeny». Mémoires du Muséum National d’Histoire Naturelle, 166: 447-462. Ausió, J.; Veghel, M. L. J. van; Gómez, R.; Barreda, D. (1997). «The sperm nuclear basic proteins (SNBPs) of the sponge Neofibularia nolitangere: Implications for the molecular evolution of SNBPs». J. Mol. Evol., 45: 91-96. Bulger, M. (2005). «Hyperacetylated chromatin domains: Lessons from heterochromatin». J. Biol. Chem., 280: 21689-21692. Cáceres, C.; Giménez-Bonafé, P.; Ribes, E.; WoutersTyrou, D.; Martinage, A.; Kouach, M.; Sautière, P.; Muller, S.; Palau, J.; Subirana, J. A.; Cornudella, L.; Chiva, M. (1999). «DNA-interacting proteins in the spermiogenesis of the mollusc Murex brandaris». J. Biol. Chem., 247: 649-656. Calestagni-Morelli, A.; Ausió, J. (2006). «Long-range histone acetylation: biological significance, structural implications and mechanisms». Biochem. Cell Biol., 84: 518-527. Courtens, J. L.; Kistler, W. S.; Plöen, L. (1995). «Ultrastructural immunolocalisation of histones (H2B, H3, H4), transition protein (TP1) and protamine in rabbit spermatids and spermatozoa nuclei. Relation to condensation of the chromatin». Reprod. Nutr. Dev., 35: 569-582. Chen-Sun, J. M. M.; Zang, Y.; Davie, J. R.; Meistrich, M. L. (1998). «Ubiquitination of histone H3 in elongating spermatids of rat testis». J. Biol. Chem., 273: 13165-13169. Chiva, M.; Daban, M.; Rosenberg, E.; Kasinsky, H. E. (1992). «Protamines in polyplacophores and gastropods as a model for evolutionary changes in molluscan sperm basic proteins». A: Baccetti, B. [ed.]. Comparative spermatology. Nova York: Raven Press: 77-82. Christensen, M. E.; Dixon, G. H. (1982). «Hyperacetylation of histone H4 correlates with the terminal transcriptionally inactive stages of spermatogenesis in rainbow trout». Develop. Biol., 93: 404-415. Christensen, M. E.; Rattner, J. B.; Dixon, G. H. (1984). «Hyperacetylation of histone H4 promotes chromatin decondensation prior to histone replacement by protamines during spermiogenesis in rainbow trout». Nucleic Acid Res., 12: 4575-4592. Churikov, D.; Zalenskaya, I. A.; Zalensky, A. O. (2004). «Male germ line-specific histones in mouse and man». Citogenet. Genome Res., 105: 203-214. Daban, J. R. (2000). «Physical constraints in the condensation of eukaryotic chromosomes. Local concentration of DNA versus linear packing ratio

26 K. Kurtz, N. Saperas, J. Ausió i M. Chiva

in higher order chromatin structures». Biochemistry, 39: 3861-3866. Daban, M.; Martinage, A.; Kouach, M.; Chiva, M.; Subirana, J. A.; Sautière, P. (1995). «Sequence analysis and structural features of the largest known protamine isolated from the sperm of the archaeogastropod Monodonta turbinata». J. Mol. Evol., 40: 663-670. Frànzen, A (1977). «Sperm structure with regards to fertilization biology and phylogenetics» Vehr. Dtsch. Zool. Ges., 123-128. García-Ramírez, M.; Rocchini, C.; Ausió, J. (1995). «Modulation of chromatin folding by histone acetylation». J. Biol. Chem., 270: 17923-17928. Gatewood, J. M.; Cook, G. R.; Balhorn, R.; Bradbury, E. M.; Schmid, C. W. (1987). «Sequence-specific packaging of DNA in human sperm chromatin». Science, 236: 962-964. Gatewood, J. M.; Cook, G. R.; Balhorn, R.; Schmid, C. W.; Bradbury, E. M. (1990). «Isolation of four core histones from human sperm chromatin representing a minor subset of somatic histones». J. Biol. Chem., 265: 20662-20666. Grimes, S. R. Jr.; Henderson, N. (1983). «Acetilation of histones during spermatogenesis in the rat». Arch. Biochem. Biophys., 221: 108-116. Gusse, M.; Sautière, P.; Bélaiche, D.; Martinage, A.; Roux, C.; Dadoune, J. P.; Chevaillier, P. H. (1986). «Purification and characterization of nuclear basic proteins of human sperm». Biophys. Biochim. Acta, 884: 124-134. Hazzouri, M.; Pivot-Pajot, C.; Faure, A. K.; Usson, Y.; Pelletier, R.; Sèle, B.; Khochbin, S.; Rousseau, S. (2000). «Regulated hyperacetylation of core histones during mouse spermatogenesis: involvement of histone-deacetylases». Eur. J. Cell Biol., 79: 950-960. Kurtz, K.; Martínez-Soler, F.; Ausió, J.; Chiva, M. (2007). «Acetylation of histone H4 in complex structural transitions of spermiogenic chromatin». J. Cell. Biochem., 102: 1432-1441. Kurtz, K.; Saperas, N.; Ausió, J; Chiva, M. (2008). «Spermiogenic nuclear protein transitions and chromatin condensation. Proposal for an ancestral model of nuclear spermiogenesis». J. Exp. Zool. (Mol. Dev. Eol.). [En premsa] Lahn, B. T.; Tang, Z. L.; Zhou, J.; Barndt, R. J.; Parvineu, M.; Allis, C. D.; Page, D. (2002). «Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis». Proc. Nat. Acad. Sci., 99: 87007-87012. Lewis, J. D.; Saperas, N.; Song, Y.; Zamora, M. J.; Chiva, M.; Ausió, J. (2004). «Histone H1 and the origin of protamine». Proc. Nat. Acad. Sci., 101: 4148-4152.

Martin-Ponthieu, A.; Wouters-Tyrou, D.; Belaiche, D.; Sautière, P.; Schlinder, P.; Dorsselaer, A. van (1991). «Cuttlefish sperm protamines. 1. Amino acid sequences of two variants». Eur. J. Biochem., 195: 611-619. Martínez-Soler, F.; Kurtz, K.; Ausió, J.; Chiva, M. (2007a). «Transition of nuclear proteins and chromatin structure in spermiogenesis of Sepia officinalis». Mol. Reprod. Develop., 74: 360-370. Martínez-Soler, F.; Kurtz, K.; Chiva, M. (2007b). «Sperm nucleomorphogenesis in the cephalopod Sepia officinalis». Tissue and Cell, 39: 99-108. Meistrich, M. L. (1989). «Histone and basic nuclear protein transitions in mammalian spermatogenesis». A: Hnilica, L. S.; Stein, G. S.; Stein, J. L. [ed.]. Histones and other basic nuclear proteins. Orlando: CRC Press: 165-182. Meistrich, M. L.; Mohapatra, B.; Shirley, C. R.; Zhao, M. (2003). «Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis». Chromosoma, 111: 483-488. Oliva, R.; Bazzet-Jones, D.; Mezquita, C.; Dixon, G. H. (1987). «Factors affecting nucleosomal disassembly by protamines in vitro». J. Biol. Chem., 262: 17016-17025. Oliva, R.; Dixon, G. M. (1991). «Vertebrate protamine genes and the histone-to-protamine replacement reaction». Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 40: 2594. Ribes, E.; Sánchez De Romero, L. D.; Kasinsky, H. E.; Valle, L. del; Giménez-Bonafé, P.; Chiva, M. (2001). «Chromatin reorganization during spermiogenesis of the mollusc Thais hemostoma (Muricidae). Implications for sperm nuclear morphogenesis in cenogastropods». J. Exp. Zool., 289: 304-316. Rocchini, C.; Marx, R. M.; Carosfeld, J. S.; Kasinsky, H. E.; Rosenberg, E.; Sommer, F.; Ausió, J. (1996). «Replacement of nucleosomal histones by histone H1-like proteins during spermiogenesis in Cnidaria: Evolutionary implications». J. Mol. Evol., 42: 240-246. Saperas, N.; Ausió, J.; Lloris, D.; Chiva, M. (1994). «On the evolution of protamines in bony fish: Alternatives to the retroviral horizontal transmission». J. Mol. Evol., 39: 282-295. Saperas, N.; Ribes, E.; Buesa, C.; García-Hegart, F.; Chiva, M. (1993). «Differences in chromatin condensation during spermiogenesis in two species of bony fish with distinct protamines». J. Exp. Zool., 265: 185-194. Sung, M. T.; Dixon, G. M. (1970). «Modification of histones during spermiogenesis in trout: A molecular mechanism for altering histone binding to DNA». Proc. Nat. Acad. Sci., 67: 1616-1623. Swanson, W. J.; Vacquier, V. D. (2002). «Reproductive

Transició de proteïnes nuclears i condensació de la cromatina 27

protein evolution». Annu. Rev. Ecol. Syst., 33: 161179. Ward, W. S.; Coffey, D. S. (1991). «DNA packaging and organization in mammalian spermatozoa: Comparison with somatic cells». Biol. Reprod., 44: 569-574. Wouters-Tyrou, D.; Chartier-Harlin, M. C.; MartinPonthieu, A.; Boutillon, C.; Dorsselaer, A. van; Sautière, P. (1991). «Cuttlefish spermatid-specific

protein T. Molecular characterization of two variants T1 and T2, putative precursors of sperm protamine variants Sp1 and Sp2». J. Biol. Chem., 266: 17388-17395. Zhao, M.; Shirley, C. R.; Mounsey, S.; Meistrich, M. L. (2004). «Nucleoprotein transitions during spermiogenesis in mice with transition nuclear protein Tnp1 and Tnp2 mutations» Biol. Reprod., 71: 10161025.

DOI: 10.2436/20.1501.02.56

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 29-49

REPRODUCTION IN THE PHYLUM PORIFERA: A SYNOPTIC OVERVIEW Manuel Maldonado and Ana Riesgo Departament d’Ecologia Marina, Centre de Estudis Avançats de Blanes (CSIC). Corresponding author: Manuel Maldonado. Departament d’Ecologia Marina, Centre de Estudis Avançats de Blanes (CSIC). Accés Cala St. Francesc, 14. 17300 Blanes. Adreça electrònica: maldonado@ceab.csic.es. RESUM Les esponges són organismes importants des del punt de vista ecològic, evolutiu i biotecnològic: a) tenen un paper ecològic rellevant en moltes comunitats marines i participen en passos crucials en els cicles dels nutrients solubles i la matèria orgànica, b) els seus trets cel·lulars i genètics encara reflecteixen i proporcionen informació sobre la transició entre la condició unicel·lular i l’organització multicel·lular dels animals i c) les esponges i els seus simbionts són prometedores fonts de compostos amb interès per a la biomedicina i diversos processos industrials. Per aquestes raons, enginyers, químics, microbiòlegs, ecòlegs, genètics i biòlegs evolutius, generalment amb escassa formació en esponges, necessiten apropar-se professionalment a la complexa i distintiva biologia reproductiva d’aquest grup. Aquest repàs sinòptic, que no pretén ser una revisió total, intenta respondre les necessitats d’aquesta audiència heterogènia. Es resumeix el procés general de reproducció sexual i asexual en el fílum, combinant dades tant ecològiques com citològiques. Es fa èmfasi en els processos d’espermatogènesi, oogènesi i fecundació. A més de l’esquematització dels processos generals, es mencionen les excepcions més destacables, així com els punts febles en el coneixement actual amb intenció de promoure investigacions futures. Paraules clau: reproducció d’esponges, reproducció asexual, gametogènesi, desenvolupament d’invertebrats, larva d’esponges. SUMMARY Sponges (phylum Porifera) are important organisms from an ecological, evolutionary and biotechnological point of view: i) they play relevant ecological roles in many marine communities and participate in crucial steps of the cycle of dissolved nutrients and organic matter; ii) their cellular and genetic traits still reflect and inform about the ancient transition between the unicellular condition and the multicellular organization of animals, and

30 M. Maldonado and A. Riesgo

iii) they and/or their symbionts are a promising source of compounds of interest in biomedicine and some industrial processes. For these reasons, engineers, chemists, microbiologists, general ecologists, geneticists, and evolutionary biologists, who usually have little expertise with sponges, need to professionally approach the complex, unique reproductive biology of this group. This synoptic overview, which does not intend to be a comprehensive review, attempts to fulfill the needs of such a heterogeneous potential audience. It summarizes the general process of sexual and asexual reproduction in the phylum, combining both ecological and cytological data. Emphasis is made on the processes of spermatogenesis, oogenesis, and fertilization. In addition to outlining general processes, a brief mention of exceptions, recent relevant findings and the weak points in current knowledge is provided with the aim of encouraging future research. Key words: sponge reproduction, asexual reproduction, gametogenesis, invertebrate development, poriferan larva. INTRODUCTION The phylum Porifera (sponges) comprises more than 8,000 species distributed in 3 taxonomic classes: Hexactinellida (10%), Calcarea (5%), and Demospongiae (85%). Members of Hexactinellida show a distinct syncytial organization. Calcarea and Demospongiae posses a conventional cellular histology, but are distinguished from each other on the nature of their skeletal pieces (spicules), being calcareous in the former and siliceous in the latter. Sponges are sessile, mostly marine, with only a small cosmopolitan demosponge family (Spongillidae) inhabiting fresh waters. The body is organized around an intricate system of chambers interconnected by canals through which ambient water is pumped in and out. This water flow through the body is crucial for most physiological functions, facilitating food uptake (bacteria, microalgae, dissolved organic mater), elimination of digestion residuals and excretes, respiration and gas exchange, release and intake of gametes and other reproductive products, etc. Sponges lack true organ systems, having instead several lines of pluripotent cells which are able to undergo transient trans-differentiations and de-

differentiations into diverse cell types to accomplish a wide variety of functions (e.g., Simpson, 1984; Harrison and Vos, 1991). The body of adult sponges is externally limited by a pseudo-epithelium (cells or syncytia) that usually lacks sealing permanent junctions and a basement membrane. The walls of the aquiferous canals are lined by a similar internal pseudo-epithelium, except in regions where the tubes expand as chambers and are lined by characteristic monoflagellated collar cells, the choanocytes (figure 1a-b). These cells beat their flagellum to promote water circulation through the canal system and use their microvilli to entrap bacteria and other feeding materials suspended in the inflow. Between the external and the internal epithelial systems, there is a mesohyl which consists of a dense intercellular matrix rich in collagen fibrils, many large macromolecules and symbiotic «microorganisms» (i.e., bacteria, cyanobacteria, dinoflagellates, yeasts, etc.), and several types of amoeboid cells responsible for food delivery and energy storage, secretion of skeletal materials, phagocytosis of invading organisms and basic immunity, nursing of embryos, etc. Because of its lax nature and simple organization, the mesohyl has never been interpreted as a real tissue.

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 31

Likewise, there is controversy as to whether the internal and external epithelial systems of sponges can be equated to the ectodermal and endodermal layers of the other animals. SEXUAL REPRODUCTION General features Sponges use a variety of strategies for reproduction including sexual and asexual processes. Gametogenesis in sponges unfolds following the same basic sequence of processes as seen in other animals. The only noticeable difference is that, in the absence of a predetermined germ line, some lines of somatic cells became gonial cells at the time of gametogenesis. However, this situation is not exclusive to sponges and has also been reported in other lower invertebrates, such as some cnidarians, acoel flatworms, etc (e.g., Extavour, 2007). Regarding gamete production, sponges can be gonochoristic or hermaphroditic (table 1). Gonochoristic species do not exhibit sexual dimorphism. Reported sex ratios usually depart from 1:1 values, with frequent cases of female overabundance. Among hermaphroditic sponges, contemporaneous hermaphroditism is more common than successive hermaphroditism. In some species, contemporaneous hermaphroditism in most members of a population co-exists with the occurrence of a few gonochoristic individuals (e.g., Meewis, 1938). Inversely, populations consisting of mostly gonochoristic sponges have been reported to contain a minority of successive-hermaphroditic individuals (Baldacconi et al., 2007). Regarding development, sponges can be either oviparous or viviparous (table 1). Embryonic development is always external in

oviparous sponges, leading to formation of a free-swimming larval stage. In contrast, viviparous sponges brood their embryos in the mesohyl until their release through the aquiferous canals as free-swimming larvae. Larvae disperse for days to weeks in plankton before settling and giving rise to a sessile juvenile. In a few demosponges, the free-swimming larval stage has been lost and the embryos develop directly into a juvenile (table 1). Regarding reproductive timing, sponge populations may produce gametes and embryos either during a short period or over the year. This variability appears not to depend on phylogenetic constraints only, but it is modulated by environmental variables, with the longest periods of active reproduction reported from relatively stable environments and characterized by attenuate changes in temperature, food availability, etc over the annual cycle. The onset of gametogenesis is thought to be triggered by environmental factors, with temperature the most clearly influential parameter identified by correlation approaches. In latitudes subjected to recognizable seasonal changes, rising temperatures have widely been reported to trigger and/or accelerate gametogenesis, also synchronizing embryonic growth rates and larval release. For some species, declining rather than rising temperatures appear to trigger the reproductive process (e.g., Fromont and Bergquist, 1994; Corriero et al., 1998; Ereskovsky, 2000; Riesgo and Maldonado, 2009). In those habitats with only subtle temperature variations over the year, gametogenesis may instead depend on stimuli undergoing more intense changes over the annual cycle, such as photoperiod, wave height, salinity variations, peaks in food fluxes, etc (e.g., Elvin, 1976; Witte, 1996; Corriero et al., 1998).

IT, w

? ?

G? V

G/H O/V

F. Polymastiidae

F. Spirastrellidae

F. Stylocordylidae

F. Suberitidae

F. Tethyidae

F. Timeidae

F. Trachycladidae

F. Acanthochaetetidae

ET(w)

IT(w)

ET(w)

F. Placospongiidae

D; ?

F. Phloeodictyidae

F. Niphatidae

F. Chalinidae

F. Callyspongiidae

O. Haplosclerida

F. Astroscleridae

F. Agelasiidae

O. Agelasida

F. Halichondriidae

F. Dictyonellidae

F. Desmoxyidae

ET(4)

G O?

G/H O/V

F. Axinellidae

F. Hemiasterellidae

F. Latrunculiidae O. Halichondrida

F. Clionidae

F. Bubaride

ET(3)

F. Isodictyidae

O. Hadromerida

F. Alectonidae

F. Thrombidae

F. Podospongiidae

F. Pachastrellidae

ET(2)

F. Geodiidae

F. Calthropellidae

F. Merliidae

ET(1)

G? O

F. Ancorinidae

F. Hamacanthidae F. Mycalidae

O. Astrophorida

F. Esperiosidae

F. Spirasigmidae

D; ?

F. Guitarridae

IT/ET

H/G O

F. Cladorhizidae

F. Tedaniidae

Taxa

F. Samidae

Larval stage

F. Tetillidae

Development

F. Desmacellidae

Gametic status

O. Spirophorida

F. Plakinidae

O. Homosclerophorida

Taxa

GH/ V

H V(9)

H/G O/V

Gametic status

ET(w)

IT(w)

Development

stP

ntP *

ntP / tP

ntP

? (8)

stP

ntP

stP

ntP

Larval stage

Table 1. Summary of the taxonomic distribution (at the family level) of gametic, developmental and larval features in the phylum Porifera

32 M. Maldonado and A. Riesgo

G O/V

H? V

F. Rhabderemiidae

F. Chondropsidae

F. Coelosphaeridae

F. Crambeidae

F. Crellidae

F. Dendoricellidae

F. Desmacididae

F. Hymedesmiidae

F. Iotrochotidae

F. Myxillidae

F. Phellodermidae

ntP *

ntP

F. Verticillitidae

F. Aplysinellidae

F. Ianthellidae

F. Pseudoceratinidae

F. Aplysinidae

O. Verongida

F. Halisarcidae

O. Halisarcida

F. Dictyodendrillidae

F. Darwinellidae

O. Dendroceratida

G/H? O

G/H V

Gametic status

ET(w)

IT(w)

ET(w)

Development

stP

ntP

stP

Larval stage

Abbreviations and symbols are as it follows: H: hermaphroditic; G: gonochoric; O: oviparous; V: viviparous; IT: internal development; ET: external development; C: cinctoblastula; Cl: clavablastula; Hp: hoplitomella; tP: tufted parenchymella; ntP: non-tufted parenchymella; stP: to-be-studied parenchymella; Di: dispherula; D: direct development (absence of larva); ?: unknown or unseen condition; *: published information to be revised. Numbers, letters and symbols in brackets refer to annotations on the condition expressed in the table, as it follows: (w): features extrapolated from studies in very few members; (1): only known in Stelleta and Ancorina; (2): unknown in most genera, but ET in Geodia and Erylus; (3): unknown in most genera, external development in Thenea; (4): only known in Adreus; (5): only known from Theonella; (6): internal development in Eurypon and Echinodictyum; (7): only known in Batzella; (8): report on larva of Axinella cristagalli: Crambe crambe; (8): only in Siphonochalina.

IT(w)

IT(7)

ET/ IT (6)

F. Dysideidae

F. Raspailiidae

ntP

F. Microcionidae IT

F. Thorectidae F. Spongiidae

ntP

F. Acamidae ET(w)

O. Poecilosclerida

F. Irciniidae

O. Dictyoceratida ET(5)

13 families; 41 genera

“Lithistids”

F. Petrosiidae F. Calcifibrospongiidae

Taxa

F. Spongillidae

Larval stage

F. Chondrillidae

F. Sollasellidae

Development

O. Chondrosida

Gametic status

Taxa

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 33

34 M. Maldonado and A. Riesgo

Spermatogenesis Spermatogonia are reported to be deriv ed from choanocytes in most members of Demospongiae and Calcarea (e.g., Reiswig, 1983; Simpson, 1984; Boury-Esnault and Jamieson, 1999), although totipotent archaeocytes have been suggested as the origin of spermatozoa in some cases (Fincher, 1940; Lévi, 1956). There are also described instances of choanocytes de-differentiating into archaeocyte-like cells before becoming recognizable spermatogonia (Reiswig, 1983). In Hexactinellida, since choanocytes are enucleated cells, spermatogonia are suspected to differentiate from archaeocyte congeries (e.g., Okada, 1928; Boury-Esnault et al., 1999). In most studied cases—nearly all of them belonging to the class Demospongiae—the choanocytes become spermatogonia in a chamber and maintain the flagellum during this differentiation (figure 1c) and subsequent stages. This situation is in contrast to the model followed by most animals, in which the flagellum only appears at late stages of gametogenesis. Nevertheless, in some sponges, such as Suberites massa (Diaz and Connes, 1980) and Spongia officinalis (Gaino et al., 1984), choanocytes appear to lose their flagella during differentiation into spermatogonia and then produce new flagella at the spermatocyte stage. The reason for this transient flagellum loss could be due to the fact that spermatogonia need to multiply by mitosis in order to increase their numbers before starting gametogeneFigure 1. a) General view of a choanocyte chamber of the poecilosclerid demosponge Crambe crambe. b) Detail of a choanocyte of the homosclerophorid demosponge Corticium candelabrum. c) View of a monoflagellated spermatogonia at the basal stratum of a spermatic cyst of C. candelabrum. cc: choanocyte; co: microvilli collar; f: flagellum; n: nucleus; ph: phagosome.

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 35

sis. Mitotic divisions of spermatogonia prior to the onset spermatogenesis have been described in Halisarca (Chen, 1976), Suberites (Diaz and Connes, 1980), Hippospongia and Spongia (Kaye and Reiswig, 1991). Each group of spermatogonia becomes a spermatic cyst, which in most species—but not always—is enveloped by a simple follicle of flat cells and/or a thin collagen layer (figure 2a). The cyst envelope is quite complex in some carnivorous demosponges that have lost their aquiferous canal system, which is the usual via for, not only food intake, but also sperm release (Vacelet and Boury-Esnault, 1995). In carnivorous, canal-lacking sponges, isolated spermatozoa are not released individually. Rather the spermatic cyst develops a thick protective envelope, a structure equivalent to the spermatophore of other invertebrates. This envelope often consists of multiple layers of intertwined cells, collagen, and special spicules (figure 2b; Riesgo et al., 2007b; Vacelet, 2007). When mature, the “spermato-

phore-like” cysts somehow migrate from the mesohyl to the sponge surface to be released. Within an individual sponge and depend ing on the species, spermatogenesis may be synchronized in all cysts or cysts may coexist at different stages of development. The former case is common in oviparous sponges, in which sperm release is a highly synchronous event linked to egg release and often takes place one or only a few days a year. Within a cyst, spermatogenesis may be either synchronous with all cells in the same spermatogenetic stage, or in a maturation gradient, with spermatogonia at the periphery of the cysts and mature spermatozoa towards the lumen (figure 2c). During the first phase of spermatogenesis (i.e., spermatocytogenesis), spermatogonia experience two consecutive divisions: first producing primary spermatocytes which in turn divide into secondary spermatocytes. Similar to that seen in other animals, the sister cells resulting from these

Figure 2. a) A synchronous spermatic cyst of poecilosclerid demosponge Crambe crambe limited by follicle (fc) cells and containing secondary spermatocytes (sp2) only. b) The complex envelope of collagen (c) and intertwined follicle cells (fc) in spermatic cyst of carnivorous poecilosclerid Asbestopluma occidentalis filled with nearly mature spermatozoa (s). c) A spermatic cyst of homosclerophorid demosponge Corticium candelabrum showing a maturation gradient from the peripheral spermatogonia (sg) towards the central mature spermatozoa (s), passing through spermatocyte stages (sp1, sp2) and spermatid stages (sp). Note cytoplasmic bridging (arrows) between sister spermatocytes in a and c.

36 M. Maldonado and A. Riesgo

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 37

divisions remain interconnected by cytoplasmic bridges (figure 3a) which are maintained until the very end of spermatogenesis (figure 3b). Primary spermatocytes are easily recognizable due to their nucleus which exhibits synaptonemal complexes typical of prophase i (figures 2a, 3c). In both primary and secondary spermatocytes, mitochondria are small and occur in high numbers (figure 3c), the Golgi complex consists of large, multiple cisternae, and the basal apparatus shows either a single centriole or a pair. During spermatidogenesis, secondary spermatocytes differentiate into haploid spermatids. This process is rapid and has rarely been documented in detail. The most characteristic feature is that cells diminish to the definitive size of the future spermatozoon by exocytosing most of the cytoplasm matrix and organelles in the form of residual bodies. Finally, spermiogenesis renders mature spermatozoa from spermatids. During this phase, chromatin condenses, several glycogen aggregates appear within the cytoplasm, and the many small mitochondria complete fusion to produce one or a few large mitochondrial units (figure 3b). In some sponges, the Golgi complex releases vesicles that will participate in the formation of acrosomal elements (figures 3d-e). In some demosponges, such as Lubomirskia baikalensis (Efremova and Papkovskaya, 1980), Spongilla lacustris (Paulus, 1989), Halichondria panicea (Barthel and Detmer, 1990), Crambe crambe (Tripepi et al., 1984), or Asbestopluma occidentalis (Riesgo et al., 2007b), in which spermatozoa are modified at different degrees, the reor-

ganizations required to produce the definitive morphology (i.e., lengthening, V-shape folding, formation of intracytoplasmic tunnel for the flagellum, etc) consistently take place during this phase. Consequently, sponge spermatozoa can be classified into two morphological types: “primitive” and “modified” (sensu Franzén, 1956; figure 4). Spermatozoa with “primitive” organization have a round head of about 2 µm, with a large round nucleus and several mitochondria (figure 4a-b). In most studied cases, a set of proacrosomal vesicles in the cell pole are evident opposite from the flagellum insertion (figure 4a). However, proacrosomal vesicles are lacking in some species, such as Aplysilla rosea (Tuzet et al., 1970), Halisarca na hantensis (Chen, 1976), and Ephydatia fluviatilis (Leveaux, 1942). Proacrosomal vesicles are usually regarded as the evolutionary prelude of the real acrosomes in higher animals and they are typical in the sperm of many sponges and most of the cnidarians (Franzén, 1970, 1996). Round “primitive” spermatozoa provided with a true acrosome have only been reported in members of the very distinct demosponge order Homosclerophorida (figure 4b; table 1; Baccetti et al., 1986; Boury-Esnault and Jamieson, 1999; Riesgo et al., 2007a). In addition to spermatozoa with “primitive” organization, highly modified types have been found in demosponges such as Halichondria panicea (Barthel and Detmer, 1990), Crambe crambe (figure 4c; Tripepi et al., 1984), and Asbestopluma occidentalis (figure 4d; Riesgo et al., 2007b). Interestingly,

Figure 3 (facing page). a) Primary spermatocytes of Corticium candelabrum connected by intercellular bridges (b). b) A spermatid of C. candelabrum showing intercellular bridging (b), a large mitochondrion (m) resulting from previous fusion of smaller units, and a highly condensed nucleus (n). c) Detail of the nucleus of a primary spermatocyte in Crambe crambe showing synaptonemal complexes (sy) and several small mitochondria (m). d) Detail of a small Golgi apparatus (g) and derived vesicle (v) in spermatid of C. candelabrum. e) Detail of a condensing vesicle from which the acrosome of C. candelabrum will be formed.

38 M. Maldonado and A. Riesgo

Figure 4. a) Spermatozoon of C. candelabrum showing the basal body of the flagellum (bb), the acrosome (a), 2 large mitochondria (m), and an indented condensed nucleus (n). b) Spermatozoon of haplosclerid demosponge Petrosia ficiformis showing a battery of proacrosomal vesicles (pa), large mitochondria (m) and a nucleus (n) condensed only at its central portion. c) Longitudinal section of a V-shaped spermatozoon (ls) adjacent to several cross-sectioned spermatozoa (cs). These spermatozoa are characterized by a conical acrosomal complex (a) with a perforatorium, a flagellum (f ) running through and an intracytoplasmic canal, and a nucleus (n) with helically condensed chromatin. d) Cross (cs) and longitudinal sections (ls) of lengthened spermatozoa of the carnivorous poecilosclerid Asbestopluma occidentalis showing a hammer-head condensed nucleus (n) and several proacrosomal vesicles at the tip of head.

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 39

the V-shaped spermatozoon of C. crambe carries a long striated rootlet and an acrosomal complex consisting of a conical acrosome and an adjacent subacrosomal rod. In contrast, the spermatozoon of A. occidentalis bears only proacrosomal vesicles and no rootlets, and that of H. panicea has neither acrosomal components nor rootlets. An aberrant sperm lacking both flagellum and acrosome has been reported in the Calcarea Leucosolenia complicata (Anakina and Drozdov, 2001). At present, both the functional and phylogenetic significance of the diverse morphologies in sponge sperm remain poorly understood. Oogenesis Oogenesis has been described in reasonable detail in quite a few demosponges, some calcareous sponges (e.g., Gallissian, 1988; Gallissian and Vacelet, 1990; Anakina and Drozdov, 2001), and, only partially, in 2 hexactinellids, Farrea sollasii (Okada, 1928) and Oopsacas minuta (Boury-Esnault et al., 1999). Oogonia are thought to be derived from choanocytes in most calcareous sponges and from archaeocytes in most demosponges and hexactinellids. Pinacocytes have been suggested to be the origin of oogonia in the calcareous sponge Ascandra minchini (Borojevic, 1969). In some calcareous species, the choanocytes leave the chambers and enter the adjacent mesohyl where they differentiate into oogonium-like cells that experience mitotic divisions before the onset of oogenesis (Fell, 1983). These pre-oogonial divisions are not common in Demospongiae, although they have been documented in Reniera elegans (Tuzet, 1947), Halisarca dujardini (Lévi, 1956), Hippospongia communis (Tuzet and Pavans de Ceccatty, 1958), and Octavella galangaui (Tuzet and Paris, 1964).

In some demosponges, particularly oviparous species, all oocytes are produced during only a short period in each annual cycle. They grow during a species-dependent time period and reach maturity more or less synchronously (figure 5a-b). Alternatively, other sponges produce new oocytes during many months of the year which leads to an asynchronous extended reproduction (figure 5c). Asynchrony is common in viviparous species. Early-stage oocytes are usually amoeboid cells (figure 5d) that may wander through the mesohyl while incorporating symbiotic microorganisms and diverse macromolecules from the mesohyl matrix (e.g., Maldonado, 2007). As oogenesis progresses, oocytes grow and become round. The initial stages of oocyte growth are previtellogenic, rarely involving yolk production (Fell, 1983; Simpson, 1984). Our observations in several demosponges suggest that massive vitellogenesis starts only after oocytes reach about ¼ of their final size. Yolk bodies are membrane-bound and show a very electron-dense core of striated substructure (suggesting the occurrence of highly condensed proteins) and a less electron-dense, narrow, peripheral band (figure 6a). Nevertheless, some species produce yolk bodies in which lipids, multi-membrane structures and the rests of digested microorganisms are packed into atypical heterogeneous structures (e.g., figure 6b; Fell, 1983; Gaino et al., 1986; Gaino and Sarà, 1994; Lepore et al., 1995; Riesgo and Maldonado, 2009). As in other animals, yolk production in Porifera can take place via autosynthesis, heterosynthesis or both processes simultaneously (Riesgo and Maldonado, 2009). Autosynthesis is carried out by the oocytes themselves using basic precursors acquired through the oocyte membrane by endo-, pino-, or phagocytosis and followed by intense synthetic activity (Fell,

40 M. Maldonado and A. Riesgo

1983). Sponges that appear to use strict autosynthesis are Suberites massa (Diaz et al., 1975), Aplysina cavernicola (Gallissian and Vacelet, 1976), Tetilla serica (Watanabe, 1978), Stelleta grubii (Sciscioli et al., 1991), and Raspaciona aculeata (figure 6c; Riesgo and Maldonado, 2009). Others use a semi-autosynthetic process, in which the precursors are not basic material but endocytosed micro-

organisms and large incorporated compounds, such as in Erylus discophorus (Sciscioli et al., 1989), Tethya aurantium (Sciscioli et al., 2002), Corticium candelabrum (Riesgo et al., 2007a), and Axinella damicornis (figure 6d; Riesgo and Maldonado, 2009). Yolk heterosynthesis involves participation of different types of somatic cells (e.g., archaeocytes, spherulose cells, microgranu-

Figure 5. a) Late-stage oocytes (oo) of the oviparous poecilosclerid Raspaciona aculeata maturing synchronously in the mesohyl and b) early-stage oocytes (oo) of the viviparous poecilosclerid C. crambe. Note section of endobiotic polychaete (po) in the sponge tissue. c) An early-stage oocyte (oo) developing adjacent to a gastrulating embryo (e) in the mesohyl of the viviparous C. candelabrum. Note also the occurrence of a spermatic cyst (sc), clearly distinguishable from the choanocyte chambers (ch). d) A mid-stage oocyte of R. aculeata with distinctive amoeboid shape and patent nucleolate (nu) nucleus (n).

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 41

lar cells, follicle cells, grey cells, amebocytes, choanocytes, bacteriocytes, etc), which become transiently compromised in oocyte nourishing and are generally referred to as “nurse cells”. These cells either elaborate yolk or its precursors in their cytoplasm and also incorporate extracellular microorganisms into vesicles, transporting and transferring all these materials to the growing oocytes (figure 6e-f ). Reserve materials and microorganisms stored in nurse cells can be either directly transferred to oocytes by fusion of the cell membranes or exocytosed to the perioocytic space to be subsequently incorporated by the oocytes, as in the demosponges Hippospongia communis (Tuzet and Pavans de Ceccatty, 1958), Sube rites massa (Diaz et al., 1975), Halisarca dujardini (Aisenstadt and Korotkova, 1976) and Axinella damicornis (Riesgo and Maldonado, 2009). In some instances, oocytes appear to phagocytose entire nurse cells, as in the calcareous Ascandra minchini (Borojevic, 1969) and Clathrina coriacea (Jonhson, 1979), and demosponges of the genera Haliclona (Fell, 1974), Halichondria (Witte and Barthel, 1994) and Chondrilla (Maldonado et al., 2005). In addition to yolk, the cytoplasm of oocytes contains plenty of other energetic inclusions in the form of glycogen and lipid droplets. It is assumed that most oocyte growth takes place while arrested in some step of the first meiotic division, since polar bodies have rarely been seen before oocyte maturation is reached. Polar body emission has been observed in very few sponges (e.g., Tuzet, 1947; Lévi, 1951; Tuzet and Pavans de Ceccatty, 1958; Tuzet and Paris, 1964) and documented by light microscopy (figure 7a). There is a single TEM report in which putative polar-bodies (but predominantly containing yolk) have been described in a homosclerophorid demosponge (Riesgo et al., 2007a).

Many sponge species produce mature oocytes that are surrounded by cells such as pinacocytes or collenocytes that are apparently not involved in the nourishing process (Fell, 1974). In many instances, oocytes are surrounded by packages of striate fibers, as in Tetilla serica and Tetilla japonica (Watanabe, 1978), by a thin layer of collagen fibrils, such as in Suberites massa (Diaz et al., 1975) and Aplysina cavernicola (Gallissian and Vacelet, 1976), or by a thick collagenous cover (probably some form of spongin) which remains undegraded for a long time after egg hatching, such as in the genera Agelas and Cliona (figure 7c-d). Fertilization Upon completion of gametogenesis, spermatozoa are released into the water column,. Male spawning takes places by fusion of the spermatic cysts to the wall of the exhalant aquiferous canals so that the mature spermatozoa are released into the outgoing flow and finally expelled through the oscules in the form of milky clouds. The process is similar for oocyte release in oviparous sponges. Oocytes or eggs are released either individually through the oscules or as chains embedded in mucous threads and abundantly accompanied by nurse cells (e.g., Lévi and Lévi, 1976; Reiswig 1970, 1976; Watanabe, 1978; Hoppe and Reichert, 1987). Fertilization is suspected to take place externally in many oviparous sponges (e.g., figure 7a-b; Fell 1983, 1989; Reiswig, 1970, 1983). However, personal observations in a Caribbean population of Chondrilla nucula in 2001 revealed that sperm release took place more than 3 days before female spawning, which consisted of mucous threads charged with both eggs and nurse cells (Maldonado et al., 2005). This observation corroborated

42 M. Maldonado and A. Riesgo

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 43

that Chondrilla nucula, despite being viviparous, experience internal fertilization, a condition also suggested from previous studies in Mediterranean populations (Sidri et al., 2005). Experimental external fertilization also performed in the laboratory by mixing male and female gametes of C. nucula rendered a high percentage of zygotes that developed until the late blastula stage (Maldonado, personal observations). Therefore, the natural process of internal fertilization in Chondrilla does not require oocytes to be nested in the mesohyl and it probably takes place when oocytes have already been discharged into the exhalant aquiferous canals for imminent spawning. External fertilization occurs in a manner similar to that observed in other lower invertebrates. There are even cases in which the egg produces a fertilization-like membrane, such as in the genus Tetilla (Watana be, 1978; 1990). However, the mechanisms by which eggs that are shed within follicle-like envelopes or cases are fertilized remain unclear. Viviparous sponges are spermcasters, i.e., they release sperm but retain the oocytes in the mesohyl for internal fertilization and subsequent embryo incubation. Interestingly, male sperm spawning in viviparous sponges has never been documented, probably because it is not a massive obvious event at the population level, but rather a subtle asynchronous process unnoticed by most divers. The process of internal fertilization in brooding sponges is only partially understood. Internal fertil-

ization has been well documented in a variety of calcareous sponges. The process is mediated by choanocytes, which phagocytose the spermatozoa entering the chambers in the inhalated water (e.g., Gallisian, 1980, 1989; Gaino et al., 1987; Gallisian and Vacelet, 1990; Anakina and Drozdov, 2001; Nakamura et al., 1998). These choanocytes which do not digest the phagocytosed spermatozoa, leave the chamber and de-differentiate into amoeboid cells called carriers cells. They migrate through the mesohyl to find an oocyte and transfer the encysted spermatozoon to it. During cell migration, the encysted spermatozoon, now referred to as spermiocyst, loses its flagellum and most other organelles. Spermiocyst transference may occur at early-stage oocytes or just immediately before their maturation, depending on the species. In contrast to the class Calcarea, the above-described fertilization mechanism has not been properly documented in Demospongiae and Hexactinellida. Thus, serious doubts are raised as to the universality of this process among Porifera (Reiswig, 1976). We have found evidence in the homosclerophorid demosponge Corticium candelabrum that spermatozoa are able to enter the choanocyte chambers (Riesgo et al., 2007a). Additionally, a «putative» spermatozoon in a “putative” carrier cell adjacent to choanocyte chamber was documented (Riesgo et al., 2007a). Both findings suggest that the carrier-cell mechanism appears to operate in at least members of this small demosponge order. An alternative mode of internal fertilization has been

Figure 6 (facing page). a) Yolk body (y) of Corticium candelabrum showing conventional homogeneous structure. Note the inset showing the striated substructure of yolk. b) Highly heterogeneous yolk (hy) body of Petrosia ficiformis incorporating multimembranes, lipids and diverse granules. c) Early (y1), mid (y2) and late (y3) stages of autosynthesis of yolk bodies of C. candelabrum. d) The early stage of formation of a yolk body in Axinella damicornis using mostly phagocytosed, digested bacteria (db). e) A nurse cell (nc) of P. ficiformis sectioned at the nucleus level (n) carrying homogeneous yolk bodies (y) and diverse inclusions (i) towards the oocyte (oo). f ) A nurse cell of Chondrilla nucula transporting groups of phagocytosed symbiotic yeasts (ye) and lipid droplets (li).

44 M. Maldonado and A. Riesgo

postulated for carnivorous demosponges, such as Asbestopluma hypogea (Vacelet, 2007) and Asbestopluma occidentalis (Riesgo et al., 2007b), which lack aquiferous systems and choanocyte chambers. In these sponges, spermatophore-like spermatic cysts are released from the sponges. The wall of these cysts consists of a complex, cellular envelope that also contains a peculiar type of protruding, hairpin-shaped spicules. Such spicules are thought to allow the spermatic cyst to both reach neutral buoyancy in the water column and become trapped by adjacent reproductive sponges. It is suspected that the thick envelope of the spermatic cysts is partially digested by symbiotic bacteria within special sponge cells, thus setting the spermatozoa free in the mesohyl for subsequent fertilization. Data about zygote formation are scarce. Pronuclei typically swell before fusion. In some sponges, oocyte meiotic divisions

proceed only after transference of the male pronucleus. This appears to be the case in Clathrina coriacea (Tuzet, 1947), Oscarella lobularis (Tuzet and Paris, 1964, as Octavella galangaui), and Hippospongia communis (Tuzet and Pavans de Ceccatty, 1958). Very little information exists concerning fertilization success. Fromont and Bergquist (1994) estimated that fertilization success rate in the oviparous demosponge Xestospongia bergquistia, was about 71%, with most eggs fertilized and starting cleavage within 5 hours. In contrast, Petrosia ficiformis, a Mediterranean species in the same suborder, exhibited an «in vitro» fertilization success rate of about 70%, their zygotes needing at least 12 hours to start cleavage (Maldonado, personal observation). Experimental «in vitro» fertilization has also been investigated in the verongid demosponge Aplysina aerophoba. In this species, the naturally released oocytes which were fertilized in

Figure 7. a) Spermatozoa swimming around recently spawned egg of the haplosclerid demosponge Petrosia ficiformis. Note that the 2 polar bodies (pb) are still visible at the egg surface. b) Spermatozoa (s) swimming around a recently spawned egg (oo) of the verongid demosponge Aplysina aerophoba. c-d) The envelope (en) around a developing embryo (e) of the hadromerid demosponge Cliona viridis. Note that the envelope resists degradation for weeks after embryo hatching. e) Multiple buds (bu) at the body surface of an individual of Aplysina fistularis.

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 45

more than 99% of cases, started cleavage in less than 4 hours (Maldonado, personal observation). To our knowledge, the success of internal fertilization has only been investigated in the demosponge C. candelabrum, in which a comparison between densities of mature oocytes and subsequent brooded embryos revealed a fertilization success rate of about 90% in a reproductive cycle (Riesgo et al., 2007a). Embryos and larvae Cleavage in sponges is usually total and equal, but some calcareous sponges produce blastulae with micromeres and macromeres. Late blastulae experience extensive cellular reorganizations. These embryonic reorganizations have been regarded by some authors as a gastrulation process equivalent to that occurring during the embryogenesis in other animal phyla (e.g., Boury-Esnault et al., 1999; Leys and Degnan, 2002; Maldonado and Bergquist, 2002; Maldonado, 2004; Leys, 2004). Some other authors do not accept the occurrence of gastrulation in Porifera (e.g., Ereskovsky and Dondua, 2006), but they propose no satisfactory alternative explanation concerning how cell fates are assigned to form the larval and juvenile stages (see Maldonado and Riesgo, 2008, for discussion). Embryogenesis gives rise to a ciliate or unciliated, swimming or crawling larval stage, except in those very few cases of direct development. Up to eight basic larval types have been described in Porifera (see table 1 for their taxonomic distribution): trichimella, amphiblastula, calciblastula, cinctoblastula or cinctogastrula, dispherula, hoplitomella, clavablastula, and parenchymella. These types are determined according not only to differences in their final morphology but also to a distinct embryogenesis in each case. Because many as-

pect of the biology and ultrastructure of embryos (Leys 2004; Maldonado 2004; Eer kes-Medrano and Leys, 2006) and larval stages (Maldonado and Bergquist, 2002; Leys and Ereskovsky, 2006; Maldonado 2006) have recently been reviewed by compiling and summarizing most of the findings attained in the past 30 years, readers are re-directed to those papers and the literature cited therein for further information on this issue. ASEXUAL REPRODUCTION It is thought that while population maintenance of most sponges depends primarily on sexual reproduction, a few sponges largely rely on asexual reproduction or a combination of both processes (e.g., Dayton, 1979; Fell, 1993). Asexual reproduction typically occurs by budding, gemmulation, or fragmentation (Fell, 1993). Some sponges produce buds (see Fell, 1974, 1993 and Simpson, 1984, for a review) which are cell masses growing at the external surface of the body that subsequently separate from the parental body by constriction of the tissue bridges (figure 7e). After being dispersed by currents and waves for days to months, freed buds attach to the bottom and give rise to a small sponge. The cytological composition of buds varies largely between species. The most usual elements in buds are a dense matrix of collagen fibrils, totipotent archaeocytes, and cells charged with large inclusions presumably for energy storage. They may also contain skeletal pieces and choanocytes. Gemmules are typically produced by sponges adapted to fresh-water and estuarine habitats, although some marine species also generate them (see Fell, 1974, 1993 and Simpson, 1984, for a review). Gemmules are dormant, resistance bodies formed internally,

46 M. Maldonado and A. Riesgo

usually at the base of the sponge. Typically, they are composed of a dense mass of totipotent archaeocytes and storage cells (thesocytes, nurse cells, etc) surrounded by a thick protective envelope. The structure and thickness of the envelope, which may even incorporate skeletal materials and pneumatic cavities, varies largely between species. Unlike buds, gemmules are freed only after extensive tissue damage. They are thought to provide a means to assure timely population restoration after extended severe mortality by transient unfavorable conditions (drainage or freezing of water bodies, extreme temperature events, etc). The relative resistance of gemmules to both desiccation and the digestive process in the tract of large animals makes them suitable for long-range dispersal via winds, birds, etc (Fell, 1993). Accidental fragmentation of the sponge body as a result of storms, waves, animal or human activity may also function as a mechanism for asexual propagation. This is due to the pluripotent capacity of many sponge cell types and even small fragments of the body that can contain cells enough to regenerate a new complete, small sponge. Before attaching, small fragments can be transported over considerable distances by currents and storms (Wulff, 1985, 1991). Interestingly, fragments of some species have been demonstrated to contain developing embryos of sexual origin. Even small fragments often carry the essentials cells for not only reorganizing as small sponges, but also for nourishing the developing embryos which can successfully complete development and leave fragments as free-swimming larvae (Maldonado and Uriz, 1999). Therefore, fragmentation may interact with sexual reproduction, so that the dispersal capacity of sexually produced propagules is maximized by the additional dispersal of the asexual fragment. The dispersal of em-

bryo-bearing fragments also maximizes the chance that several distinct genotypes will reach a new area, increasing the chance of establishing new populations. FUTURE DIRECTIONS Many aspects of sponge reproduction have not been elucidated. For example, the process by which somatic cells become gonial cells has never been investigated using modern techniques. Likewise, the migration mechanisms of mature spermatic cysts and oocytes from the mesohyl to the exhalant aquiferous canals for spawning remain poorly understood. The processes determining and synchronizing spawning at the population level has also been largely neglected by experimental approaches. Many cytological aspects of fertilization need to be clarified, particularly in the case of internal fertilization in Demospongiae and Hexactinellida, where the actual mechanisms for sperm transference to the oocytes have yet to be discovered. There is also a serious scarcity of studies concerning age, size and/or nutritional condition required for an individual sponge to reach sexual maturity. The contribution of sexual versus asexual reproduction for long-term maintenance of natural populations has only been roughly addressed so far and in very few species. Therefore, much investigational effort needs to be devoted to the reproductive biology of Porifera in order to palliate this situation and reach the standard level of knowledge attained in other invertebrate groups. ACKNOWLEDGMENTS The authors thank Sally Leys (University of Alberta) for making material of A. oc-

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 47

cidentalis available for TEM study. This research was supported by 2 grants from the Spanish Ministry for Science and Education (MECCTM2005-05366/MAR; BFU200800227/BMC). BIBLIOGRAPHY Aisenstadt, T. B.; Korotkova, G. P. (1976). «A study of oogenesis in marine sponge Halisarca dujardini Johnston (Dendroceratidae, Demospongiae). II. Phagocytic activity of the oocytes and vitellogenesis». Tsitologiya, 18: 818-823. Anakina, R. P.; Drozdov, A. L. (2001). «Gamete structure and fertilization in the Barents Sea sponge Leucosolenia complicata». Russ. J. Mar. Biol., 27: 143150. Baccetti, B.; Gaino, E.; Sarà, M. (1986). «A sponge with acrosome: Oscarella lobularis». J. Ultrastruct. Mol. Struct. Res., 94: 195-198. Baldacconi, R.; Nonnis-Marzano, C.; Gaino, E.; Corriero, G. (2007). «Sexual reproduction, larval development and release in Spongia officinalis L. (Porifera, Demospongiae) from the Apulian coast». Mar. Biol., 152: 969-979. Barthel, D.; Detmer, A. (1990). «The spermatogenesis of Halichondria panicea (Porifera, Demospongiae)». Zoomorphology, 110: 9-15. Borojevic, R. (1969). «Étude de développement et de la différenciation celullaire d’éponges calcaires calcinéennes (genre Clathrina et Ascandra)». Ann. Embryol. Morph. Fr., 2: 15-36. Boury-Esnault, N.; Efremova, S.; Bézac, C.; Vacelet, J. (1999). «Reproduction of a hexactinellid sponge: first description of gastrulation by cellular delamination in the Porifera». Invertebr. Reprod. Dev., 35: 187-201. Boury-Esnault, N.; Jamieson, B. (1999). «Porifera». In: Adiyodi, K. G.; Adiyodi, R. G. [ed.]. Reproductive biology of invertebrates. Progress in male gamete ultrastructure and phylogeny. Chichester: John Wiley and Sons, 1-20. Corriero, G.; Scalera-Liaci, L.; Nonnis-Marzano, C.; Gaino, E. (1998). «Reproductive strategies of Mycale contarenii (Porifera: Demospongiae)». Mar. Biol., 131: 319-327. Chen, W. T. (1976). «Reproduction and speciation in Halisarca». In: Harrison, F. W.; Cowden, R. R. [ed.]. Aspects of sponge biology. New York: Academic Press, 113-139. Dayton, P. K. (1979). «Observations of growth, dis-

persal and population dynamics of some sponges in McMurdo Sound, Antarctica». Colloques internationaux du C.N.R.S., 291: 271-282. Diaz, J. P.; Connes, R. (1980). «Étude ultrastructurale de la spermatogenèse d’une Démosponge». Biol. Cell., 38: 225-230. Diaz, J. P.; Connes, R.; Paris, J. (1975). «Etude ultra structurale de l’ovogenèse d’une Demosponge: Su berites massa Nardo». J. Microsc. Paris, 24: 105-116. Eerkes-Medrano, D. I.; Leys, S. P. (2006). «Ultrastructure and embryonic development of a syconoid calcareous sponge». Invertebr. Biol., 125: 177-194. Efremova, S.; Papkovskaya, M. (1980). «Spermatogenesis of the sponge Lubomirskia baicalensis (Pallas). Ultrastructural investigation». Arkh. Anat. Gistol. Ehmbriol., 12: 8895. Elvin, D. W. (1976). «Seasonal growth and reproduction of an intertidal sponge, Haliclona permollis (Bowerbank)». Biol. Bull., 151: 108. Ereskovsky, A. V. (2000). «Reproduction cycles and strategies of cold-water sponges Halisarca dujardini (Demospongiae, Dendroceratida), Myxilla incrustans and Iophon piceus (Demospongiae, Poecilosclerida) from the White Sea». Biol. Bull., 198: 77-87. Ereskovsky, A. V.; Dondua, A. K. (2006). «The problem of germ layers in sponges (Porifera) and some issues concerning early metazoan evolution». Zool. Anz., 245: 65-76. Extavour, C. (2007). «Evolution of the bilaterian germ line: lineage origin and modulation of specification mechanisms». Integr. Comp. Biol, 47: 770-785. Fell, P. E. (1974). «Porifera». In: Giese, A. C.; Pearse, J. S. [ed.]. Acoelomate and pseudocoelomate metazoans. New York, London: Academic Press, 51-132. — (1983). «Porifera». In: Adiyodi, K. G.; Adiyodi, R. G. [ed.]. Reproductive biology of invertebrates. Chichester: John Wiley & Sons Ltd., 1-29. — (1989). «Porifera». In: Adiyodi, K. G.; Adiyodi, R. G. [ed.]. Reproductive biology of invertebrates. IV, part A. Fertilization, development and parental care. New York: John Wiley & Sons, 1-41. — (1993). «Porifera». In: Adiyodi, K. G.; Adiyodi, R. G. [ed.]. Reproductive biology of invertebrates. VI. Asexual propagation and reproductive strategies. New Delhi: Oxford & IBH Publishing Company, 1-44. Fincher, J. A. (1940). «The origin of germ cells in Stylotella heliophyla Wilson (Tetraxonida)». J. Morphol., 67: 175-197. Franzén, Å. (1956). «On spermiogenesis, morphology of spermatozoon, and biology of fertilization among invertebrates». Zool. Bidrag, Uppsala, 3: 355482. — (1970). «Phylogenetic aspects of the morphology of spermatozoa and spermiogenesis». In: Baccet-

48 M. Maldonado and A. Riesgo

ti, B. [ed.]. Comparative spermatology. New York: Academic Press, 29-46. — (1996). «Ultrastructure of spermatozoa and spermiogenesis in the hydrozoan Cordylophora caspia with comments on structure and evolution of the sperm in the Cnidaria and the Porifera». Invertebr. Reprod. Dev., 29: 19-26. Fromont, J.; Bergquist, P. R. (1994). «Reproductive biology of three sponge species of the genus Xestospongia (Porifera: Demospongiae: Petrosiida) from the Great Barrier Reef». Coral Reefs, 13: 119126. Gaino, E.; Burlando, B.; Buffa, P. (1987). «Ultrastructural study of oogenesis and fertilization in Sycon ciliatum (Porifera, Calcispongiae)». Int. J. Invert. Reprod. Dev., 11: 73-82. Gaino, E.; Burlando, B.; Buffa, P.; Sarà, M. (1986). «Ultrastructural study of spermatogenesis in Oscarella lobularis (Porifera, Demospongiae)». Int. J. Invert. Reprod. Dev., 10: 297-305. Gaino, E.; Burlando, B.; Zunino, L.; Pansini, M.; Buffa, P. (1984). «Origin of male gametes from choanocytes in Spongia officinalis (Porifera, Demospongiae)». Int. J. Invert. Reprod. Dev., 7: 83-93. Gaino, E.; Sarà, M. (1994). «An ultrastructural comparative study of the eggs of two species of Tethya (Porifera, Demospongiae)». Invertebr. Reprod. Dev., 26: 99-106. Gallissian, M. F. (1988). «Étude ultrastructurale de l’ovogenè se et de la fécondation chez Leucilla endoumensis (Spongiaire, Calcarea)». Compte Rendu de l’Académie des Sciences. Paris, 306: 245-252. Gallissian, M. F.; Vacelet, J. (1976). «Ultrastructure de quelques stades de l’ovogénèse des spongiaires du genre Verongia (Dictyoceratida)». Ann. Sci. Nat. Zool. Biol., 18: 381-404. — (1990). «Fertilization and nutrition of the oocyte in the calcified sponge Petrobiona massiliana». In: Rützler, K. [ed.]. New perspectives in sponge biology. Washington, D.C.: Smithsonian Institution Press, 175-181. Harrison, F. W.; Vos, L. de (1991). «Porifera». In: Harrison, F. W.; Westfall, J. A. [ed.]. Microscopic anatomy of invertebrates. 2. Placozoa, Porifera, Cnidaria and Ctenophora. New York: John Wiley & Sons, 29-89. Hoppe, W. F.; Reichert, M. J. M. (1987). «Predictable annual mass release of gametes by the coral reef sponge Neofibularia nolitangere (Porifera: Demospongiae)». Mar. Biol., 94: 277-285. Johnson, M. (1979). «Gametogenesis and embryonic development in the calcareous sponges Clathrina coriacea and C. blanca from Santa Catalina Island, California». Bull. South. Calif. Acad. Sci., 78: 183-191.

Kaye, H. R.; Reiswig, H. M. (1991). «Sexual reproduction in four Caribbean commercial sponges. I. Reproductive cycles and spermatogenesis». Invertebr. Reprod. Dev., 19: 1-11. Lepore, E.; Sciscioli, M.; Gherardi, M.; Scalera-Liaci, L. (1995). «The ultrastructure of the mature oocyte and the nurse cells of the Ceractinomorpha Petrosia ficiformis». Cah. Biol. Mar., 36: 1520. Leveaux, M. (1942). «Contribution à l’étude histologique de l’ovogénèse et de la spermatogénèse des Spongillidae». Ann. Soc. R. Zool. Belg., 73: 3350. Lévi, C. (1951). «L’Oviparité chez les Spongiaires». C. R. Acad. Sci., Paris, 233: 272-275. — (1956). «Étude des Halisarca de Roscoff. Embryologie et systématique des Demosponges». Arch. Zool. Exp. Gén., 93: 1-181. Lévi, C.; Lévi, P. (1976). «Embryogénese de Chondrosia reniformis (Nardo), démosponge ovipare, et transmission des bactéries symbiotiques». Ann. Sci. Nat. (Zool.), 18: 367-380. Leys, S. P. (2004). «Gastrulation in sponges». In: Stern, C. D. [ed.]. Gastrulation. From cells to embryo. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 23-31. Leys, S. P.; Degnan, B. M. (2002). «Embryogenesis and metamorphosis in a haplosclerid demosponge: gastrulation and transdifferentiation of larval ciliated cells to choanocytes». Invertebr. Biol., 121: 171189. Leys, S. P.; Ereskovsky, A. V. (2006). «Embryogenesis and larval differentiation in sponges». Can. J. Zool., 84: 262-287. Maldonado, M. (2004). «Choanoflagellates, choanocytes, and animal multicellularity». Invertebr. Biol., 123: 231-242. — (2006). «The ecology of the sponge larva». Can. J. Zool., 84: 175-194. — (2007). «Intergenerational transmission of symbiotic bacteria in oviparous and viviparous demosponges, with emphasis on intracytoplasmically-compartmented bacterial types». J. Mar. Biol. Assoc. UK, 87: 1701-1713. Maldonado, M.; Bergquist, P. R. (2002). «Phylum Porifera». In: Young, C. M.; Sewell, M. A.; Rice, M. E. [ed.]. Atlas of marine invertebrate larvae. San Diego: Academic Press, 21-50. Maldonado, M.; Cortadellas, N.; Trillas, M. I.; Rützler, K. (2005). «Endosymbiotic yeast maternally transmitted in a marine sponge». Biol. Bull. Mar. Biol. Lab. Woods Hole, 209: 94-106. Maldonado, M.; Riesgo, A. (2008). «Reproductive output in a Mediterranean population of the homosclerophorid Corticium candelabrum (Porifera,

Reproduction in the phyllum Porifera: a synoptic overview 49

Demospongiae), with notes on the ultrastructure and behavior of the larva». Mar. Ecol. Evol. Persp., 29: 298-316. Maldonado, M.; Uriz, M. J. (1999). «Sexual propagation by sponge fragments». Nature, 398: 476. Meewis, H. (1938). «Biologie des Eponges». Bull. Soc. R. Linn. Bruxel., 5: 69-91. Nakamura, Y.; Okada, K. (1998). «The ultrastructure of spermatozoa and its structural change in the choanocytes of Sycon calcaravis Hozawa». In: Watanabe, Y.; Fusetani, N. [ed.]. Sponge sciences: multidisciplinary perspectives. Tokyo: Springer, 179-191. Okada, Y. (1928). «On the development of a hexacti nellid sponge Farrea sollasii». Journal of the Faculty of Sciences of the Imperial University of Tokyo, 2: 1-29. Paulus, W. (1989). «Ultrastructural investigations of spermatogenesis in Spongilla lacustris and Ephydatia fluviatilis (Porifera, Spongillidae)». Zoomorphology, 109: 123-130. Reiswig, H. M. (1970). «Porifera: sudden sperm release by tropical Demospongiae». Science, 170: 538-539. Reiswig, H. M. (1976). «Natural gamete release and oviparity in Caribbean Demospongiae». In: Harrison, F. W.; Cowden, R. R. [ed.]. Aspects of sponge biology. New York, San Francisco, London: Academic Press, 99-112. — (1983). «Porifera». In: Adiyodi, K. G.; Adiyodi, R. G. [ed.]. Reproductive biology of invertebrates. Chichester: Wiley and Sons, 1-21. Riesgo, A.; Maldonado, M. (2008). «Differences in reproductive timing between sponges sharing habitat and thermal regime». Invertebr. Biol., 127: 357367. — (2009). «Ultrastructure of oogenesis in two oviparous demosponges: Axinella damicornis and Raspaciona aculeata (Porifera)». Tissue Cell, 41: 51-65. Riesgo, A.; Maldonado, M.; Durfort, M. (2007a). «Dynamics of gametogenesis, embryogenesis, and larval release in a Mediterranean homosclerophorid demosponge». Mar. Fresh. Res., 58: 398-417. Riesgo, A.; Taylor, C.; Leys, S. (2007b). «Reproduction in a carnivorous sponge: the significance of the absence of an aquiferous system to the sponge body plan». Evol. Dev., 9: 618-631. Sciscioli, M.; Lepore, E.; Mastrodonato, M.; ScaleraLiaci, L.; Gaino, E. (2002). «Ultrastructural study of the mature oocyte of Tethya aurantium (Porifera: Demospongiae)». Cah. Biol. Mar., 43: 1-7. Sciscioli, M.; Lepore, E.; Scalera-Liaci, L.; Gherardi, M. (1989). «Indagine ultrastructurale sugli ovociti di Erylus discophorus (Schmidt) (Porifera, Tetractinellida)». Oebalia, 15: 939-941. Sciscioli, M.; Scalera-Liaci, L.; Gherardi, M.; Simpson, T. L. (1991). «Ultrastructural study of the ma-

ture egg of the marine sponge Stelleta grubii (Porifera, Demospongiae)». Mol. Repr. Develop., 28: 346-350. Sidri, M.; Milanese, M.; Bümmer, F. (2005). «First observation on egg release in the oviparous sponge Chondrilla nucula (Demospongiae, Chondrosida, Chondrillidae) in the Mediterranean sea». Invertebr. Biol., 124: 91-97. Simpson, T. L. (1984). The cell biology of sponges. New York: Springer-Verlag. Tuzet, O. (1947). «L’ovogenèse et la fécondation de l’éponge calcaire Leucosolenia (Clathrina) coriacea Mont. et de l’éponge siliceuse Reniera elegans Bow». Arch. Zool. Exp. Gén., 85: 127-148. — (1964). «Remarques sur la classification des Sycon telle qu’elle a été conçue par Burton (1963)». Arch. Zool. Exp. Gén., 104: 68-82. Tuzet, O.; Garrone, R.; Pavans De Ceccatty, M. (1970). «Observations ultrastructurales sur la sper matogenèse chez la Démosponge Aplysilla rosea Schulze (Dendroceratide): Une métaplaisie exemplaire». Ann. Sci. Nat., Zoologie, 12ème Série, 12: 2750. Tuzet, O.; Paris, J. (1964). «La spermatogenèse, l’ovogenèse, la fécondation et les premiers stades du développment chez Octavella galangaui Tuzet et Paris». Vie et Milieu, 15: 309-327. Tuzet, O.; Pavans De Ceccatty, M. (1958). «La spermatogenèse, l’ovogenèse, la fécondation et les premiers stades du développement chez Octavella galangaui». Vie et Milieu, 115: 309-327. Vacelet, J. (2007). «Diversity and evolution of deepsea carnivorous sponges». In: Custódio, M. R.; Lô bo-Hajdu, G.; Hajdu, E.; Muricy, G. [ed.]. Porifera research. Biodiversity, innovation and sustainability. Rio de Janeiro: Museu Nacional, 107-115. Vacelet, J.; Boury-Esnault, N. (1995). «Carnivorous sponges». Nature, 373: 333-335. Watanabe, Y. (1978). «The development of two species of Tetilla (Demosponge)». Nat. Sci. Rep. Ochanomizu Univ., 29: 71-106. Watanabe, Y.; Masuda, Y. (1990). «Structure of fiber bundles in the egg of Tetilla japonica and their possible function in development». In: Rützler, K. [ed.]. New perspectives in sponge biology. Washington, D.C.: Smithsonian Institution Press, 193-199. Witte, U. (1996). «Seasonal reproduction in deep-sea sponges triggered by vertical particle flux?». Mar. Biol., 124: 571-581. Witte, U.; Barthel, D. (1994). «Reproductive cycle and oogenesis of Halichondria panicea (Pallas) in Kiel Bight». In: Soest, R. W. M. van; Kempen, T. M. G. van; Braekman, J. C. [ed.]. Sponges in time and space. Rotterdam: A.A. Balkema, 297-305.

DOI: 10.2436/20.1501.02.57

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 51-57

L’IMPOSEX: EL SEU ESTUDI I EVOLUCIÓ EN Bolinus brandaris M. José Amor,1,5 Montserrat Ramón,2,3,5 Alexandra Richter 4 i Mercè Durfort 1,5 Departament de Biologia Cel·lular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. IEO-Centre Oceanogràfic de Balears. 3 CSIC-ICM. 4 Dipartimento di Biologia Animale e dell’Uomo, Università della Sapienza di Roma. Departamento de Biología, Universitat Autònoma de Madrid. 5 Centre de Referència i Desenvolupament en Aqüicultura de la Generalitat de Catalunya. 1 2

Adreça per a la correspondència: M. José Amor. Departament de Biologia Cel·lular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: mamor@ub.edu. RESUM El seguiment del fenomen de l’imposex (aparició de caràcters masculins en les femelles a causa de la presència del tributilestany (TBT) a l’aigua del mar) ha estat estudiat durant onze anys, de l999 a 2008, en el gasteròpode Bolinus brandaris, capturat principalment a la localitat de St. Carles de la Ràpita. Durant els primers set anys es van trobar anomalies anatòmiques en més d’un 90 % dels casos, malgrat les normes dictades per la Conselleria de Medi Ambient a partir de 1990 per evitar aquesta contaminació. Anatòmicament, es van observar petites diferències entre els conductes deferents i el penis del mascle respecte als de la femella. En els darrers tres anys aquest fenomen ha disminuït, i pràcticament ha desaparegut en els exemplars procedents de St. Carles de la Ràpita. Paraules clau: gasteròpode, contaminació, tributilestany, masculinització, imposex. THE IMPOSEX PHENOMENA: STUDY AND EVOLUTION IN Bolinus brandaris SUMMARY The present work represent a case study of the evolution of the imposex phenomena in the Mediterranean sea. The presence of males secondary sexual characters in females caused by the TBT pollution of the sea water has been monitored during the last 11 years in the gastropod Bolinus brandaris, a commercially exploited neogastropod species with a distribution area extending along the whole Mediterranean sea and nearby Eastern Atlantic coast. The provenience of the monitored animals were from St. Carles de la Ràpita

52 M. J. Amor, M. Ramón, A. Richter i M. Durfort

(Tarragona, Northeast coast of Spain). During the first seven years, females with imposex made up more than 90% of the population, in spite of the application of restrictive laws prohibiting the extensive usage of antifouling paints with TBT. The results of the study reveal the existence of some differences among functional males and imposex affected females in the histology and ultrastructural organization of the penis and vas deferent. The results also show a trend in the decrease of the percentage of females exhibiting imposex in the last three years. Besides, available data from the present year point to its almost complete disappearance in St. Carles de la Ràpita. Key words: gastropoda, pollution, trybutiltin, sex-change, imposex.

INTRODUCCIÓ En els cascos dels vaixells marins és habitual l’acumulació d’organismes: bacteris, protozous, algues, briozous i mol·luscs, entre altres. Normalment es reprodueixen a gran velocitat i provoquen la corrosió de la zona poblada, així com un excés de pes que podria arribar a alentir la velocitat del vaixell. Els fenicis ja idearen fer recobriments amb coure, la qual cosa es va utilitzar fins a finals del segle xviii, quan van aparèixer els primers vaixells fets de ferro (abans només es feien amb fusta), i es van fer provatures amb la finalitat de pintar aquestes estructures amb aliatges de diferents metalls, amb predilecció pels de coure. Més tard, s’hi afegiren pintures que tenien estany, i això donava un resultat aparentment més escaient, més eficient (Quintela Sánchez, 2002). Des de la dècada dels setanta, els pescadors d’Arcachon (França) començaren a detectar el decreixement de la població d’ostres i d’altres espècies de mol·luscs marins, com Nucella lapillus, de les costes angleses, a la dècada dels vuitanta. Per fi es va comprovar que en aquest fenomen estaven implicades les pintures antifouling dels vaixells, preferentment el tributilestany (TBT) que, justament a causa de la presència de l’estany, alterava el sistema endocrí dels mol· luscs marins, i afectava principalment les

hormones femenines; apareixien òrgans sexuals masculins, com el conducte deferent i el penis en les femelles, i això provocava esterilitat (Bryan i Gibbs, 1991). Aquesta esterilitat era deguda al fet que el conducte deferent tapa la papil·la genital femenina i bloqueja la vulva, i impedeix tant la copulació com la posta d’ous (Ramón i Amor, 2001). Les concentracions del tributilestany (TBT) de l’aigua de mar estan molt relacionades amb el grau de desenvolupament de l’imposex, fins al punt que s’han pogut establir quocients TBT/grau imposex, per la qual cosa és un bon indicador de la contaminació de les aigües, i aquesta es pot quantificar en funció del desenvolupament dels òrgans masculins que presenten les femelles (Gibbs et al., 1998; Oehlmann et al., 1992; Stroben et al., 1992). MATERIALS I MÈTODES Durant un període d’onze anys (de 1997 a 2008) hem fet un seguiment de la presència d’imposex en exemplars procedents de diferents punts de la costa catalana, principalment de Blanes i de St. Carles de la Ràpita. En els darrers tres anys ens hem centrat en l’estudi dels exemplars procedents de St. Carles de la Ràpita. El seguiment s’ha fet durant els mesos de primavera, principal-

L’imposex: el seu estudi i evolució en Bolinus brandaris 53

ment abril i maig, època en què la majoria dels exemplars ja són sexualment madurs. Els individus van ser anestesiats amb 7,67 g de MgCl2 en 93 ml d’aigua destil·lada amb 93 ml d’aigua de mar, de manera que es va obtenir una solució de MgCl2 isotònica amb l’aigua marina. Una vegada anestesiats es van mesurar diferents paràmetres externs de la closca, que posteriorment es va trencar, amb el cos de l’exemplar al descobert; llavors es va fer l’estudi anatòmic del penis i del conducte deferent de les femelles a fi d’observar el grau d’imposex. Aquestes parts van ser tot seguit processades per a l’estudi amb microscòpia òptica i electrònica (SEM i TEM). Per a la fixació es va seguir el protocol de rutina: doble fixació amb glutaraldehid al 2,5 % tamponat amb PBS 0,1 M, a pH 7,4 a 4 °C durant dues hores; després d’un rentatge de trenta minuts en la solució tamponadora es va fer la postfixació amb tetraòxid d’osmi a l’1 %, igualment preparat amb PBS, a pH 7,4 i a 4 °C durant una hora. Després d’una acurada deshidratació amb acetones de graduació ascendent es van incloure les mostres amb la reïna Spurr (1969). Els talls semifins de control es van tenyir amb blau de metilè a l’1% preparat amb bòrax al 10 %. Els talls ultrafins es van obtenir amb un Ultracut (Reichert), i es van contrastar rutinàriament amb acetat d’uranil i posteriorment amb citrat de plom, preparat segons la tècnica de Reynolds (1963). Les mostres a estudiar amb el microscopi de rastreig es van recobrir unes amb carboni i altres amb or. Les observacions es van fer amb micros copis electrònics de transmissió i de rastreig, respectivament: un Hitachi 600 dels Serveis Cientificotècnics de la Universitat de Barcelona i un Hitachi 570 de l’Institut de Ciències del Mar (CSIC, Barcelona).

RESULTATS I DISCUSSIÓ De la gònada de B. brandaris, protegida per la cloaca, surten els corresponents conductes que realitzaran la funció de la conducció dels gàmetes i la copulació. Els òrgans destinats a tals efectes acaben a la regió cefàlica de l’individu, concretament a l’esquerra del tentacle dret (vegeu les figures 1 i 2). Com s’ha dit a la introducció, es distingei xen diversos graus d’imposex, segons el grau de desenvolupament dels caràcters mascu lins en les femelles, que es podrien catalogar, segons Fioroni et al. (1991), en: — Grau 1: absència de penis. Només un bocinet de conducte deferent. — Grau 2: el vas deferent s’acosta a l’orifici de la vagina i entra en contacte directe amb l’aparell genital femení. — Grau 3: petit penis sense conducte. — Grau 4: penis amb un conducte penià curt que acaba en un cul-de-sac. — Grau 5: el conducte penià contacta amb el vas deferent. — Grau 6: el vas deferent, llarg, comunica amb el conducte penià i connecta amb l’orifici genital femení. ESTUDI MACROSCÒPIC En el nostre cas, i com hem mencionat, al llarg d’onze anys hem pogut diferenciar dos períodes en el grau de desenvolupament de l’imposex. Fins a l’any 2003 vam trobar un desenvolupament considerable. Quantificant aquesta anomalia anatòmica tenim els resultats següents, seguint la classificació esmentada de Fioroni et al. (1991), la més admesa internacionalment: — Grau 1: 3 %. — Grau 2: cap. — Grau 3: 4 %. — Grau 4: 92 %.

54 M. J. Amor, M. Ramón, A. Richter i M. Durfort

Només un 1 % no va presentar cap anomalia (Amor et al., 2003). En tots els casos, tant la copulació com la posta va ser viable (Ramón i Amor, 2001) i no en va que-

dar alterada l’oogènesi (Amor et al., 2001). Per tant, no va haver-hi perill d’extinció d’aquesta espècie a la costa mediterrània, a diferència del que passa amb altres espèci-

Figures 1-6. Vista macroscòpica de l’aparell reproductor masculí de Bolinus brandaris al cap, on es troben els òrgans copuladors. La figura 1 ens mostra el penis (fletxa) i el conducte deferent (asterisc). A la figura 2 es pot observar la disposició del penis (fletxes), situat a la dreta del tentacle dret (asterisc). Les figures 3, 4, 5 i 6 ens mostren diversos estadis del desenvolupament de l’imposex en la femella observats amb SEM. Les figures 3 i 4 mostren un grau 3 d’imposex i les figures 5 i 6 l’imposex en grau 4. p: penis; pp: esbós de penis; vd: conducte deferent; ob: obertura vaginal.

L’imposex: el seu estudi i evolució en Bolinus brandaris 55

es de gasteròpodes (Gibas et al., 1988). Recordem que aquesta espècie té un gran valor gastronòmic i, per tant, comercial. ESTUDI MICROSCÒPIC I ULTRAESTRUCTURAL Microscòpia òptica. Segons les nostres observacions, la llum, tant del conducte deferent com del penis masculí, és més gran que la de la femella (250-300 µm i 50 µm). Aquesta llum és recoberta per una mucosa amb un epiteli prismàtic ciliat i amb algunes glàndules mucoses (vegeu les figures 7, 8, 9, 10, 11 i 12). Aquest conducte està envoltat per musculatura llisa, que en el mascle

es conserva fins a arribar al penis; en la femella apareix una banda de teixit conjuntiu entre aquesta musculatura i la capa més externa (vegeu les figures 7, 8 i 11). En tots dos casos, la part externa també presenta una mucosa (vegeu les figures 8, 9, 10 i 11) (Amor et al., 2003a, b). Concretament, en el penis masculí és freqüent trobar semen (vegeu la figura 8), i presenta espermatozoides tant del tipus eupirè com de l’apirè (Amor i Durfort, 1990a, b). Finalment, cal assenyalar el fet que en el penis masculí, on sí que hi ha abundant teixit conjuntiu entre la musculatura llisa que envolta el gonoducte i la musculatura externa, es detecta la presència de nervis (vegeu la figura 9) i espais hemolimfàtics, a fi de facilitar la

Figures 7-12. Figura 7. Tall transversal del conducte (C) del mascle a nivell alt, és a dir, a prop del testicle, amb la mucosa del conducte amb l’epiteli ciliat (fletxes) (MO). Figura 8. Tall transversal baix del conducte deferent del mascle (C). S’hi pot veure tot envoltat d’una musculatura llisa (ml), seguint la seva mucosa interna revestida per un epiteli ciliat (fletxa). Es pot veure teixit adipós (asterisc) de la massa visceral, així com un revestiment extern format per la mucosa del mantell (M), formada per epiteli ciliat i cèl·lules mucoses (MO). Figura 9. Imatge de microscòpia òptica d’un tall transversal del conducte deferent de la femella amb nivell 3 d’imposex (C). Es pot observar el grau de desenvolupament menor que en el cas del mascle, encara que la seva mucosa interna està revestida també per un epiteli ciliat (fletxa). Exteriorment, també està revestit per la mucosa del mantell que, igual que en el mascle, és ciliada (M) i amb cèl·lules mucoses (ms). Figures 10, 11 i 12. Estudi comparatiu de talls microscòpics del penis femení (figures 10 i 11) respecte al masculí (figura 12). Noteu que en tots dos casos el conducte intern (C), està revestit per un epiteli ciliat (fletxes), però la secció és diferent: més rodó en el cas del penis femení (figura 10) que no pas en el masculí, que presenta forma ovalada (figura 12). En tots dos casos, es mostra una musculatura llisa (ml), així com teixit alveolar (asteriscs). Noteu la presència de nervis (n) al mig de la musculatura llisa del penis masculí, que no apareixen en el femení.

56 M. J. Amor, M. Ramón, A. Richter i M. Durfort

copulació, que no s’observen en la femella (Amor, 1987). Microscòpia electrònica. Les diferències cel·lulars més notables les trobem en l’epiteli de la mucosa del gonoducte. Així, trobem que el nombre de cilis és més irregular en les femelles (més o menys dos cilis per 1 µm de secció) que en els mascles, en què,

a part de ser més nombrosos, no tenen un valor per secció constant al llarg del conducte. En tots dos casos, aquestes cèl·lules presenten microvil·li (vegeu la figura 16) i la proporció dels mateixos entre mascles i femelles també presenta diferències (Amor et al., 2003a). També s’observa que, així com les membranes plasmàtiques laterals entre

Figures 13-16. Figures 13 i 14. Estudi comparatiu ultraestructural de les cèl·lules epitelials dels conductes del penis femení (figura 13) respecte del masculí (figura 14). Noteu que la gran diferència es presenta a la part basal de la cèl·lula. La cèl·lula en la femella té una làmina basal poc desenvolupada (figura 13), i no presenta cap invaginació. En canvi, la làmina basal (LB) de les cèl·lules dels exemplars masculins (figura 14) està molt més desenvolupada, i el citoplasma està pràcticament ple de replegaments de la membrana plasmàtica basal (m). A causa dels augments, en aquest cas no apareixen els nuclis, que sí que es detecten a la figura 13 (N) però que, en realitat, serien molt semblants en aquest cas. Figures 15 i 16. Nuclis (N) de l’epiteli femení, que apareixen en ocasions, amb patró de cromatina molt peculiar (asterisc). C: estroma conjuntiu; c: bilis de la llum; L: llum; LB: làmina basal; mp: membrana plasmàtica que separa dues cèl·lules contigües.

L’imposex: el seu estudi i evolució en Bolinus brandaris 57

dues cèl·lules veïnes són rectilínies i la làmina basal no està gaire desenvolupada en les femelles (vegeu la figura 13), en els mascles la làmina basal està molt desenvolupada i les membranes contigües entre dues cèl·lules presenten grans invaginacions. A la part basal és on es detecta la presència de gran nombre d’orgànuls citoplasmàtics, com és habitual en les cèl·lules en què hi ha gran activitat d’intercanvi (vegeu la figura 14). Finalment, i com a cosa molt curiosa, cal assenyalar que, alhora que el patró de distribució de la cromatina nuclear en molts casos és semblant en els dos sexes, alguns nuclis de les cèl·lules de la mucosa femenina presenten una distribució de la cromatina força particular, molt irregular i d’aspecte inconfusible (vegeu les figures 15 i 16) (Amor et al., 2007). BIBLIOGRAFIA Amor, M. J. (1987). La espermatogénesis de Murex brandaris Gastropoda, Prosobranchia. Estudio ultraes tructural. Barcelona: Universitat de Barcelona. [Tesi doctoral] Amor, M. J.; Durfort, M. (1990a) «Changes in nuclear structure during eupyrene spermatogenesis in Murex brandaris». Molecular Reproduction and Development, 25: 348-356. — (1990b). «Atypical spermatogenesis in Murex bran daris». Molecular Reproduction and Development, 25: 357-363. Amor, M. J.; Ramon, M.; Durfort, M. (2003a). «Estudio morfológico y ultraestructural del conducto deferente y del pene de la hembra del molusco Bolinus brandaris afectada por el síndrome del imposex (grado 3)». Libro de Resúmenes del XII Congreso Nacional de Histología e Ingeniería Tisular: 232. — (2003b). «El fenomen de l’imposex en el gasteròpode Bolinus brandaris a la costa catalana». Biologia de la Reproducció, 8: 15-17.

— (2004). «Ultrastructural studies of oogenesis in Bo linus brandaris (Gastropoda, Muricidae)». Scientia Marina, 68: 343-353. Bryan, G.; Gibbs, P. (1991). «Impact of low concentrations of trybutiltin (TBT) on marine organisms: a review». A: Newmann, M. C.; McIntosh, A. W. [ed.]. Metal ecotoxicology: concepts and applications. Ann Arbor: Lewish: 323-361. Fioroni, P.; Stroben, E; Oehlmann, J. (1991). «Fréquence et degré d’expression du pseudohermaphroditime chez quelques Prosobranches stenoglosses de la Baies Morlaix et de la Manche. 1. Situation au printemps de 1998». Cah. Biol. Mar., 32: 281-294. Gibbs, P. E.; Bryan, G. W.; Pasloe, P. L.; Burt, G. R. (1988). «Sexe changes in the female dog-whelk Nucella lapillus induced by tributiltin from antifouling paint». J. Mar. Biol. Ass. UK, 68: 715-731. Oehlmann, J.; Stroben, J.; Fioroni, P. (1992). «The rough tingle Ocenebra erinacea: an exhibitior of imposex in comparision to Nucella lapillus». Hellgoländer Meersuntercschungen, 46: 311-328. Quintela Sánchez, M. [en línia]. (2002). «Cambio de sexo en moluscos gallegos». <www.consumaseguridad.com/ciencia-y-tecnologia2002/11/27/4248.php> Ramón, M.; Amor, M. J. (2001). «Increasing imposex in populations of Bolinus brandaris (Gastropoda: Muricidae) in the north-western Mediterranean». Marine Environmental Research, 52: 463-475. — (2002). «Reproductive cycle of Bolinus brandaris and penis and genital duct size variations in a population affected by imposex». Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 82: 435442. Reynolds, E. S. (1963). «The use of lead citrate at high pH as electron opaque stain in electron microscopy» J. Cell Biol., 17: 208-212. Spurr, A. R. (1969). «A low viscosity epoxi resin embedding medium for electron microscopy». Journal of Ultrastructure Research, 26: 36-43. Stroben, E.; Oehlmann, J.; Fioroni, P. (1992). «The morphological expression of imposex in Hinia reticulata (Gastropoda, Buccinidae): a potential indicator of tributiltyn pollution». Marine Biology, 113: 625-636.

DOI: 10.2436/20.1501.02.58

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 59-70

ULTRAESTRUCTURA DELS ESPERMATOZOIDES DE Crassostrea gigas, Mytilus galloprovincialis I Donax trunculus (MOLLUSCA, BIVALVIA) Maria Gràcia Bozzo, Montserrat Poquet, Elena Sagristà i Mercè Durfort Departament de Biologia Cel·lular, Universitat de Barcelona. Centre de Referència i Desenvolupament en Aqüicultura de la Generalitat de Catalunya. Adreça per a la correspondència: Maria Gràcia Bozzo. Departament de Biologia Cel·lular, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 645. 08071 Barcelona. Adreça electrònica: mbozzo@ub.edu. RESUM La majoria dels mol·luscs bivalves són organismes gonocòrics, amb alguns casos d’hermafroditisme en diferents grups. La gònada masculina, quan és madura, envaeix tota la cavitat del mantell i els gàmetes són alliberats a la cavitat paleal de l’individu. Els espermatozoides dels bivalves són del tipus primitiu, com tots els dels organismes aquàtics que presenten fecundació externa. Són cèl·lules en les quals es distingeixen tres parts ben diferenciades: cap, peça intermèdia i cua. En les tres espècies estudiades, Crassostrea gigas, Mytilus galloprovincialis i Donax trunculus, els espermatozoides responen a aquest patró, però amb variacions morfològiques especifiques que estan relacionades amb les característiques dels oòcits que han de fecundar. En C. gigas el cap de l’espermatozoide és arrodonit i entre l’acrosoma i el nucli destaca la regió subacrosòmica, amb components fibril·lars d’actina. L’espermatozoide de M. galloprovincialis és molt més allargat que l’anterior i el sistema fibril·lar de la regió subacrosòmica forma un canal intranuclear. L’acrosoma destaca per la seva longitud. L’espermatozoide de D. trunculus segueix el patró considerat primitiu, tot i que en la peça intermèdia conté més mitocondris i els centríols tenen una disposició en línia i no ortogonal, com en els altres estudiats. Paraules clau: reproducció en mol·luscs bivalves, ostres, musclos, tellerines, espermatozoides.

60 M. G. Bozzo, M. Poquet, E. Sagristà i M. Durfort

ULTRASTRUCTURE OF THE SPERMATOZOA IN Crassostrea gigas, Mytilus edulis AND Donax trunculus (MOLLUSCA, BIVALVIA) SUMMARY The majority of bivalve mollusks are gonocoric organisms, and some cases of hermaphroditic individuals have been reported in different groups. When it reaches maturity, the male gonad invades the whole of the mantle cavity and gametes are released into the pallial cavity of the individual. The spermatozoa of bivalve mollusks are of a primitive type, as those of all aquatic organisms with external fertilization. They are cells in which three clearly differentiated parts can be identified: a head, a middle piece and a tail. In all three analyzed species: Crassostrea gigas, Mytilus galloprovincialis and Donax trunculus, the spermatozoa fit within this pattern, but with specific morphological variations related to the characteristics of the oocytes they fertilize. In C. gigas, the sperm head is rounded and between the acrosome and the nucleus stands out the subacrosomal region with fibrillar components of actin. The sperm of M. galloprovincialis is much more elongated and the fibrillar system of the subacrosomal region forms an intranuclear channel. The acrosome is conspicuous because of its length. The sperm of D. trunculus fits with the pattern considered to be primitive, although the middle piece has more mitochondria and the centrioles are arranged in a line instead of being orthogonally oriented as in the other analyzed species. Key words: bivalvia, reproduction in Mollusca, oysters, mussels, clams, spermatozoa. He vist una multitud d’animalons vivents, més de mil, movent-se en un volum de líquid equivalent al d’un gra de sorra. Anton Van Leeuwenhoek, 1677, fent referència als espermatozoides. INTRODUCCIÓ La reproducció dels mol·luscs bivalves Els mol·luscs bivalves tenen un sistema reproductor molt senzill en comparació dels mol·luscs gasteròpodes o dels cefalòpodes. La majoria de les espècies són unisexuades (dioics, gonocòrics), i tenen una gònada que continua en un gonoducte que en algunes espècies s’ajunta amb el nefridi

i desemboca conjuntament a través del porus nefridial, a la cavitat del mantell (Mytilus). En d’altres bivalves el gonoducte es manté independent en tot el seu trajecte i acaba en el gonopor (Crassostrea). L’hermafroditisme apareix en determinats grups de bivalves, i en el cas de les ostres trobem espècies gonocòriques i espècies hermafrodites. Les espècies hermafrodites poden presentar diferents modalitats: a) Hermafroditisme funcional o simultani: l’exemplar té túbuls seminífers i fol·licles ovàrics funcionals i madurs alhora, per bé que els gàmetes s’expulsen en dues etapes; aquest fenomen es dóna en les vieires (Pecten maximus i P. jacobeus) (Roman i Pérez Camacho, 1976) i en algunes espècies del gènere Cardium (Fretter i Graham, 1964). b) Hermafroditisme consecutiu: en cada

Ultraestructura dels espermatozoides de C. gigas, M. galloprovincialis i D. trunculus 61

cicle vital es passa per una etapa masculina que va seguida d’una etapa femenina; aquest model el trobem en Mercenaria, per bé que en ocasions l’ordre s’inverteix. c) Hermafroditisme rítmic consecutiu: el trobem en les diferents espècies d’Ostrea. En aquest cas el mateix individu pot funcionar com a mascle i després com a femella en la mateixa temporada de posta. El pas de mascle a femella és molt ràpid, per la qual cosa es pot observar en un tall histològic la fase final de l’espermatogènesi i la fase inicial de l’oogènesi. d) Hermafroditisme alternatiu en Crassostrea gigas i en C. virginica: en un període de posta hi ha únicament una fase sexual i el canvi de sexe no es produeix fins al període següent (Franc, 1960). Hi ha moltes dades sobre aquests canvis de sexe i no sempre són coincidents, ja que en gran part depenen de les condicions del medi on viuen els organismes i de factors endògens procedents del sistema nerviós i de l’endocrí (Pérez Camacho i Roman, 1987). Les èpoques de maduresa sexual varien segons factors mediambientals; així, la temperatura i la salinitat de les aigües són determinants, atesa la incidència que tenen sobre el fitoplàncton i el zooplàncton (recordem que els bivalves són espècies filtradores). Aquest fet determina que les dades que tenim de cicles reproductors d’altres latituds no serveixin de gaire per estudiar les espècies de la costa catalana; hi ha fins i tot diferències de ritme reproductor entre els exemplars de la Costa Brava i els del delta de l’Ebre. El dimorfisme sexual extern no és freqüent en els bivalves. En alguns casos es pot determinar per la pigmentació de les gònades quan aquestes són madures. Les tonalitats varien d’una espècie a una altra. Així, en el musclos Mytilus edulis i M. galloprovincialis les femelles sexualment madu-

res en un 90 % dels casos són de color taronja i els mascles són blanquinosos, per bé que la verificació correcta cal fer-la al microscopi. En el cas de Donax trunculus, les tellerines, la femella és de color blau violeta i el mascle és grisós. El grau de maduresa sexual a ull nu s’aprecia pel gruix i el color de la massa visceral, i l’observació d’aposicions de la gònada al microscopi ens permet identificar els gàmetes. En els talls histològics es quantifica la maduresa d’acord amb el desenvolupament del teixit conjuntiu intersticial i la presència dels diferents estadis de la

Figura 1. Esquema del patró de l’organització dels espermatozoides de les espècies aquàtiques, segons B. Baccetti (1977). AC: acrosoma; SA: material subacrosòmic; N: nucli; CP: centríol proximal; CD: centríol distal; AX: axonema.

62 M. G. Bozzo, M. Poquet, E. Sagristà i M. Durfort

gametogènesi en els túbuls seminífers i en el fol·licles ovàrics, respectivament. Habitualment hi ha dues èpoques de maduresa sexual pel maig-juny i pel setembre-octubre, per bé que, tal com ja s’ha dit abans, això depèn dels factors mediambientals. Hi ha hagut estius molt calorosos en què la mortalitat ha estat extremadament elevada i el cicle reproductor totalment avortat. La gònada madura, dita també bossa de putxinel·li, situada sota el peu, augmen-

ta considerablement de volum i s’expandeix entre les dues fulles del mantell, la fulla visceral i parietal, amb la qual cosa aquesta part de la massa visceral adopta la pigmentació de la gònada i podem apreciar unes ramificacions molt tènues, de color generalment més clar, que corresponen als gonoductes. Per bé que els gàmetes s’evacuïn pels gonoductes, hi ha una autèntica destrucció tissular de la gònada i del mantell, que és

Figura 2. Espermatozoides de Crassostrea Figura 2gigas. a) Micrografia electrònica de rastreig, 32.000×. b) Ultraestructura de la cèl·lula, secció longitudinal. A: acrosoma; SA: regió subacrosòmica; ax: eix fibril·lar; N: nucli; M: mitocondris; 35.000×. c) Mitocondris envoltant el centríol; 60.000×. d) Sistema d’ancoratge de l’axonema a la membrana plasmàtica, que forma una estrella de nou braços (fletxes); 90.000×. e) Immunolocalització d’actina a la regió subacrosòmica; 50.000×.

Ultraestructura dels espermatozoides de C. gigas, M. galloprovincialis i D. trunculus 63

seguida d’un procés de cicatrització i regeneració de les parts destruïdes. En els bivalves la fecundació és externa: els gàmetes són evacuats a l’aigua, tot i que en algunes espècies la fecundació es dóna a la cavitat paleal. El desenvolupament pot ser directe o amb larves trocòfores i velígeres. Ostrea edulis allibera larves de tipus velígera, mentre que Crassotrea gigas allibera ous fecundats, de deu a cent milions per posta (noteu la variabilitat numèrica). Les condicions mediambientals que es donen principalment a l’estiu fan que els bivalves siguin propensos a patir infestacions per part, sobretot, de trematodes, que tenen com a principal òrgan diana l’hepatopàncrees. En els primers estadis del procés invasiu no es detecten, però quan el grau d’infestació augmenta els paràsits s’escampen i envaeixen altres òrgans, com les gònades i les brànquies, i en aquest cas hi ha elevats nivells de mortalitat (Durfort et al.,

l991, 2003). L’alteració de la glàndula digestiva provoca també un efecte inhibidor en el cicle reproductor dels bivalves, per exemple alterant la formació de plaquetes vitel· lines i, per tant, reduint la taxa reproductiva dels exemplars afectats (Princep et al., 1996). En els mol·luscs bivalves de les costes catalanes s’ha detectat parasitosi per Protoeces maculatus en el musclo i per Bucephalus haimeanus en l’ostra, dues espècies de trematodes digènids força freqüents en els exemplars procedents de muscleres (Durfort et al., 1995). També a l’hepatopàncrees s’instal·len alguns copèpodes que destaquen pel seu color vermell en fer la dissociació de la glàndula digestiva. Són Mytilicola intestinalis, en el musclo, i M. orientalis en l’ostra. En cas de trobar-s’hi, n’hi ha de dos a vuit exemplars per bivalve, però ocasionalment pot havern’hi de trenta a cinquanta, amb la qual cosa l’hepatopàncrees queda pràcticament

c a b

Figura 3. Patró de l’organització dels espermatozoides de la subfamília dels mitilínids, segons Kafanov et al. (1998). a: Mytilus coruscus, b: Mytilus trossulus, c: Crenomytilus grayanus, d: Mytilus galloprovincialis, e: Mytilus edulis, f: Perna perna, g: Perna viridis.

64 M. G. Bozzo, M. Poquet, E. Sagristà i M. Durfort

g e destruït i això provoca un alt índex de c mor patopàncrees (Riera et al., 1995) i el mateix talitat. La incidència sobre la reproduc passa amb Perkinsus atlanticus (Apicomple ció és indirecta, com en el cas del tremato xa), que parasita les cloïsses Tapes decussatus des. També hi haa una alteració morfològica i Tapes semidecussatus, i causa elevades ta i ultraestructural important de tots els ele xes de mortalitat (Santmartí et al., 1995). En ments vibràtils de l’exemplar: galloprovincialis es tro f b brànquies, dels oòcits de Mytilus gonoductes i voreres del mantell, entre al ba el microsporidi Steinhausia mytilovum en tres (Durfort et al., 1990). diferents fases del seu cicle de desenvolu En menor freqüència trobem protozous pament. La proporció de parasitosis arriba paràsits, malgrat que hi ha hagut anys en al 50 % durant els mesos d’estiu. Les espo què Marteilia refringens (Paramyxea) ha afec res d’aquest protozou les podem veure fins tat un 80 % dels exemplars d’Ostrea edulis i tot en el nucli dels oòcits (Sagristà et al., i de Crassotrea gigas, principalment a l’he 1998).

Figura 4. Espermatozoides de Mytilus galloprovincialis. a) Micrografia electrònica de rastreig; es distingeix bé el cap amb l’acrosoma (A), el nucli (N) i el flagel (F); 12.000×. b) Ultraestructura d’una secció longitudinal. S’observen: acrosoma (A), regió subacrosòmica (fletxa), nucli (N), peça intermèdia amb els mitocondris (M); 14.000×. c) Imatge obtinguda amb el microscopi confocal. En vermell es veu l’eix fibril·lar axial detectat amb fal·loïdina-TRICT; 300×. d) i e) Seccions longitudinal i transversal, respectivament, de l’acrosoma i la regió subacrosòmica; 60.000 i 70.000×.

Ultraestructura dels espermatozoides de C. gigas, M. galloprovincialis i D. trunculus 65

En general la majoria de parasitosis afec ten el desenvolupament normal de les gòna des i, en conseqüència, l’alteració del procés reproductiu, i arriba a provocar la castració dels exemplars. Aquest fet és més freqüent en els conreus que en estat salvatge. També hi ha contaminants dissolts en l’aigua que afecten el desenvolupament correcte de l’aparell reproductor: nivells no gaire elevats de plom, cadmi, zinc i mercuri alteren el procés de l’espermatogènesi i pro voquen alteracions morfològiques a l’acro soma i a la cua dels espermatozoides, que en determinen la inviabilitat. Morfologia dels espermatozoides dels mol·luscs bivalves Les gònades masculines de moltes es pècies de bivalves s’estructuren en agre gats, més o menys esfèrics, constituïts per les cèl·lules germinals en successius esta dis de diferenciació i maduració. Aquestes masses, anomenades per alguns autors boles espermàtiques o també fol·licles testiculars, estan envoltades per cèl·lules somàtiques, a les quals s’atorguen funcions de sosteni ment i tròfiques. La sortida dels gàmetes es fa a través d’un gonoducte, tot i que so vint, en períodes d’hipertròfia de la gòna da, es produeix l’explosió de les boles esper màtiques i es dóna una invasió general dels gàmetes per tota la cavitat paleal de l’organisme. La principal distinció en la morfologia dels espermatozoides és deguda al desen volupament de la fecundació interna o ex terna. La fecundació externa està relaciona da amb el que s’anomena forma primitiva de l’espermatozoide, mentre que la fecundació interna està associada a les formes d’esper matozoides més modificades. En els bivalves els espermatozoides s’alli

beren a l’aigua i es produeix la fecundació externa. Només s’ha registrat fecundació in terna en alguns grups (Galeommatoidea i Teredinidae), que utilitzen els tentacles o si fons com a òrgans copuladors, de manera semblant a com ho fan els cefalòpodes i al guns gasteròpodes. La morfologia espermàtica és molt menys diversificada que en altres grups de mol· luscs. Respon al patró de l’espermatozoide d’organismes aquàtics descrit per Baccetti (1977) (vegeu la figura 1). En els mol·luscs de la classe bivalves, concretament en les es pècies estudiades (Mytilus galloprovincialis, Crassostrea gigas i Donax trunculus) els es permatozoides presenten tres parts ben di ferenciades: cap, peça mitjana i cua (Fran zén, 1956). Els components del cap, el nucli i l’acrosoma mostren certa diversitat mor fològica. Les variacions en la forma del cap dels espermatozoides estan relacionades amb les característiques de les cobertes dels oòcits que han de fecundar. El nucli conté la cromatina molt condensa da i presenta una electrodensitat uniforme. A mesura que l’espermiogènesi progressa, la cromatina es va densificant i la part pos terior de l’orgànul s’evagina per formar una fosseta nuclear, on s’insereix el centríol pro ximal. L’acrosoma té una forma ben diferent en les tres espècies, i sovint és una estruc tura molt prominent formada per la vesícu la acrosòmica i la regió subacrosòmica. La presència de la regió subacrosòmica o perforatorium, que és l’espai entre el nucli i l’acro soma, no és exclusiva dels bivalves, i ha es tat també descrita en els espermatozoides de molts altres grups (Baccetti, 1979). La cua o flagel està ancorada a la membrana plas màtica mitjançant sistemes radials més o menys complexos.

66 M. G. Bozzo, M. Poquet, E. Sagristà i M. Durfort

MATERIALS I MÈTODES Durant un període de sis anys hem fet un seguiment de la maduració de les gònades de tres espècies de mol·luscs bivalves, Crassostrea gigas, Mytilus edulis i Donax trunculus, procedents de diferents àrees de la costa catalana, principalment de Calella, Badalona i St. Carles de la Ràpita. Les gònades madures s’han processat per a la microscòpia electrònica de transmissió seguint el protocol de rutina: doble fixació amb glutaraldehid al 2,5 % amb PBS 0,1 M, a pH 7,4 a 4 °C durant dues hores; després d’un rentatge de trenta minuts en la solució amortidora es va fer la postfixació amb tetraòxid d’osmi a l’1 %, igualment preparat amb PBS, a pH 7,4 i a 4 °C durant una hora. Després d’una deshidratació amb acetones de graduació ascendent es van incloure les mostres amb la reïna Spurr (1969). Els talls semifins de control han estat tenyits amb blau de metilè a l’1 % preparat amb bòrax al 10 %. Els talls ultrafins han estat obtinguts amb un Ultracut (Reichert) i han estat contrastats amb acetat d’uranil i posteriorment amb citrat de plom, preparat segons la tècnica de Reynolds (1963). Alguns talls han estat contrastats amb àcid fosfotúngstic (PTA), per a la visualització de glicoproteïnes. Per a la immunolocalització de l’actina els talls ultrafins han estat tractats amb anticossos monoclonals antiactina com a primari i anti-IgG conjugats amb partícules d’or col·loïdal de 10 nm com a secundari. Les mostres a estudiar amb el microscopi de rastreig han estat recobertes amb carboni o amb or. Les observacions es van fer amb els microscopis electrònics de transmissió Phillips 300 i Hitachi 600 AB i amb el microscopi electrònic de rastreig Zeiss DSM 940 dels Serveis Cientificotècnics de la Universitat de Barcelona. També s’ha aplicat la tècnica de la fal·loïdina-TRICT per observar la dis-

tribució de l’actina amb el microscopi confocal. RESULTATS I CONCLUSIONS Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) (Ostra portuguesa) L’espermatozoide madur de C. gigas és una cèl·lula petita; el cap té uns 2 μm de diàmetre i el flagel uns 50 μm de llargada (vegeu la figura 2a). L’acrosoma i el nucli estan en contacte però no en tota la seva superfície. Estan separats pel material subacrosòmic, que es disposa entre els dos orgànuls i forma una fosseta, tant al nucli com a l’acrosoma (vegeu la figura 2b). El contingut de l’acrosoma és molt dens i en la part més apical es veu un sistema laminar en el qual alternen capes fines i capes denses. Aquesta regió presenta reacció positiva a la tinció de PTA (àcid fosfotúngstic) per a la detecció de glicoproteïnes (Bozzo et al., 1993). La regió subacrosòmica té un contingut finament granulós i homogeni, entre el qual es distingeix una formació axial fibril· lar (ax) amb els filaments orientats en sentit anteroposterior, com en M. galloprovincialis. El reconeixement de l’actina com a compo nent d’aquesta estructura axial s’ha comprovat mitjançant la tècnica d’immunolocalització amb microscòpia electrònica de transmissió. El resultat mostra un marcatge positiu ben patent (vegeu la figura 2e). El nucli és més ample que llarg i té una aparença uniformement molt electrodensa. La peça intermèdia està constituïda per quatre mitocondris disposats al voltant dels centríols proximal i distal (vegeu la figura 2c). Dels microtúbuls A del centríol distal emergeixen nou radis cap a la membrana plasmàtica, que formen un sistema d’anco-

Ultraestructura dels espermatozoides de C. gigas, M. galloprovincialis i D. trunculus 67

ratge en forma d’estrella de nou puntes (vegeu la figura 2d). La prolongació del centríol distal forma l’axonema del flagel amb

l’estructura normal de 9 + 2 doblets de microtúbuls.

a A

* N

Figura 5. Espermatozoides de Donax trunculus. a) Micrografia electrònica de Figura 5 A: acrosoma, N: nucli, M: mitocondris; rastreig a 3.000×. b) Secció longitudinal. 33.000×. c) Detall de l’acrosoma; el constitueixen materials de diferent densitat (fletxa) i el material subacrosòmic homogeni (asterisc). També es veuen grans de glicogen (punta de fletxa); 70.000×. d) Regió pericentriolar, amb mitocondris i glicogen abundant; 60.000×.

68 M. G. Bozzo, M. Poquet, E. Sagristà i M. Durfort

Mytilus galloprovincialis (Lamarck, l819) (musclo) El patró morfològic dels espermatozoides de la subfamília dels mitilínids es pot observar a la figura 3 (Kafanov et al., 1998). L’espermatozoide del musclo M. galloprovincialis és una cèl·lula molt allargada. El cap de més de 6 μm de llargada conté el nucli esfèric molt electrodens i un acrosoma extraordinàriament llarg, de 5 μm de longitud, estret i amb forma cònica (vegeu la figura 4a). Segons Franzén (1983), el nucli i l’acrosoma de M. galloprovincialis es desvien de la forma típica dels espermatozoides dels bivalves. L’acrosoma està format per components de diferent densitat electrònica que formen capes superposades per sota de la membrana acrosòmica (vegeu la figura 4b). La part posterior de la vesícula acrosòmica s’invagina i forma un canal central; és la regió subacrosòmica, on hi ha l’eix fibril·lar, format per filaments d’actina. La distribució específica i la localització d’aquesta proteïna es posa de manifest gràcies al marcatge amb fal·loïdina conjugada amb TRICT (isocianat de tetrametilrodamina) i observant-ho amb el microscopi confocal. Mitjançant aquesta tècnica es pot veure com el feix de filaments d’actina penetra pel canal central del nucli (vegeu la figura 4c). El paper de l’actina està ben definit: provoca la projecció del contingut de l’acrosoma sobre la membrana vitel·lina dels oòcits, que no presenten cèl·lules fol·liculars. El nucli té la cromatina homogènia, interrompuda pel canal intranuclear, que va d’un extrem a l’altre (vegeu la figura 4b). La peça intermèdia conté cinc o sis mitocondris disposats en cercle, al centre del qual es troba el centríol proximal i distal, amb algunes restes de glicogen. Sota l’anella de mitocondris trobem l’aparell d’anco-

ratge que subjecta la peça mitjana a la membrana plasmàtica. El flagel, d’uns 45 μm de llargada, respon al patró general d’axonema microtubular. Donax trunculus (Linnaeus, 1758) (tellerina) La morfologia de l’espermatozoide d’a quest bivalve és pot considerar que està entre les dues espècies anteriors. És una cèl· lula més allargada que els espermatozoides de C. gigas, però menys que els de M. galloprovincialis. El cap mesura 2 μm d’amplada per 4 μm de llarg. L’organització dels orgànuls que conté (acrosoma i nucli) és semblant a les altres dues espècies (vegeu la figura 5b). L’acrosoma té una regió densa i una clara, i està en contacte amb el nucli, interromput per la regió subacrosòmica, el contingut de la qual és homogeni. No s’observa una estructura amb forma d’eix fibril· lar, com en els casos anteriors (vegeu la figura 4c). La peça intermèdia està formada per quatre o cinc mitocondris i sovint s’observa que els centríols no estan en disposició ortogonal, sinó que es troben alineats segons l’eix de la cèl·lula. També destaquen en aquesta zona el sistema radial d’ancoratge i grans de glicogen ben visibles (vegeu la figura 5d). El flagel té l’estructura habitual, però s’observen algunes cèl·lules en les quals emergeix en angle recte respecte del cap. AGRAÏMENTS El nostre sincer reconeixement a Núria Cortadellas i a Almudena Garcia, dels Serveis Cientificotècnics de la Universitat de Barcelona (Hospital Clínic), per la seva col· laboració en el processament de les mostres

Ultraestructura dels espermatozoides de C. gigas, M. galloprovincialis i D. trunculus 69

per a l’estudi amb el microscopi electrònic. Aquest treball ha estat parcialment finançat per a la Xarxa de Referència de Recerca i Desenvolupament en Aqüicultura de la Generalitat de Catalunya. BIBLIOGRAFIA Baccetti, B. (1977). «Lo spermatozoo dei Sipunculidi». R. Sc. Fisiche Mate. Natl. Acad. Naz. Lincei, 62: 8993. — (1979). «The evolution of the acrosomal complex». A: Fawcett, D. W.; Bedford, J. M. [ed.]. The spermatozoon. Baltimore: Urban & Schwarzenberg: 305329. Bayed, A. (1990). «Reproduction de Donax trunculus sur la côte Atlantique marocaine». Cah. Biol. Mar., 31: 159-169. Bigatti, G.; Peharda, M.; Taylor, J. (2004). «Size at first maturity, oocyte envelopes and external morphology of sperm in three species of lucinidae (Mollusca: Bivalvia) From Florida Keys, U.S.A». Malacologia, 46: 417-426. Bozzo, M. G.; Ribes, E.; Sagristà, E.; Poquet, M.; Durfort, M. (1993). «Fine structure of the spermatozoa of Crassostrea gigas (Mollusca, Bivalvia)». Mol. Rep. Dev., 34: 206-211. Durfort, M. (1993). Técnicas histopatológicas en moluscos en acuicultura marina: fundamentos biológicos y tecnología. Barcelona: Universitat de Barcelona. — (1995). «Revisión de las parasitosis más frecuentes de los moluscos bivalvos de interés comercial del Mar Catalán (Mediterráneo)». A: Actas V Congreso Nacional de Acuicultura. Barcelona: Universitat de Barcelona. — (2002). «Òrgans diana de les principals parasitosis de mol·luscs bivalves d’interès gastronòmic». Rev. Reial Acad. Medicina de Catalunya, 17: 97-102. Durfort, M.; Bigas, M.; Bozzo, M. G.; Poquet, M.; Sagristà, E. (2003) «Alteraciones tisulares y del desarrollo gonadal de Donax trunculus debidas la presencia de Gymnophallus strigatus». Actas XX Congreso Soc. Esp. Histologia e Ingenieria Tisular: 230. Durfort, M.; Bozzo, M. G.; Poquet, M.; Sagristà, E.; Ferrer, J.; García Valero, J.; Amor, M. J.; Ribes, E. (1990). «Ultraestructura del epitelio vibrátil de los gonoductos de Tapes decussatus y de Tapes semidecussatus». Actas III Congreso Nac. de Acuicultura: 587592. Durfort, M.; Ferrer, J.; Sagristà, E.; Poquet, M.; Boz-

zo, M. G.; Garcia Valero, J.; Ribes,E. (1991). «Alteraciones tisulares en la ostra portuguesa (Crassotrea gigas) debidas a la presencia de esporocistos de Bucephalus haimeanus (Tremátodo, Digénido)». Histología Médica, 7: 61-63. Eckelbarger, K. J.; Bieler, R.; Mikelsen, P. M. (1990). «Ultrastructure of sperm development and mature sperm morphology in three species of commensal Bivalves (Mollusca: Galeommatoidea)». J. Morphology, 205: 63-75. Eckelbarger, K. J.; Davis, C. V. (1996). «Ultrastructure of the gonad and gametogenesis in the eastern oyster, Crassostrea virginica. II. Testis and spermatogenesis». Marine Biology, 127: 89-96. Erkan, M.; Sousa, M. (2002). «Fine structural study of the spermatogenic cycle in Pitarrudis and Chamelea gallina (Mollusca, Bivalvia, Veneridae)». Tissue and Cell, 34: 262-272. Franc, A. (1960). «Classe des Bivalves». A: Grassé, P. P. [ed.]. Traité de zoologie. París: Masson et Cie. Franzén, A. (1956). «On spermiogenesis, morphology of the spermatozoon, and biology of fertilization among invertebrates». Zool. B. Uppsala, 31: 355-482. — (1983). «Ultrastructural studies of spermatozoa in three bivalve species with notes on evolution of elongated sperm nucleus in primitive spermatozoa». Gamete Res., 7: 199-214. Fretter, V.; Graham, A. (1964). «Reproduction» A: Wilbur, K. M.; Yonge, C. M. [ed.]. Physiology of mollusca. Nova York: Academic Press: 127-164. Gwo, J. C.; Yang, W. T.; Sheu, H. Y.; Cheng, H. Y. (2002). «Spermatozoan morphology of four species of bivalve Heterodonta, Veneridae from Taiwan» Tissue and Cell, 34: 39-43. Hodgson, A. N.; Bernard, R. T. F.; Horst, G. van der (1990). «Comparative spermatology of three species of Donax (Bivalvia) from South Africa». J. Moll. Stud., 56: 257-265. Kafanov, A. I.; Drozdov, A. L. (1998). «Comparative sperm morphology and phylogenetic classification of recent Mytiloidea (Bivalvia)». Malacologia, 39: 129-139. Longo, F. J. (1983). «Meiotic maturation and fertilization». A: Wilbur, K. M. [ed.]. The mollusca, vol. 3. Orlando: Academic Press, 49-89. — (1997). Fertilization. Londres: Chapman & Hall. Lutzen, J.; Jespersen, A.; Takahashai, T.; Kai, T. (2004). «Morphology, structure of dimorphic sperm, and reproduction in the hermaphroditic commensal bivalve Pseudopythina tsurumaru (Galeommatoidea: Kellidae)». J. Morphology, 262: 407-420. Matos, E.; Matos, P.; Corral, L.; Azevedo, C. (1995). «Estudo ultraestrutural da espermatogénese de

70 M. G. Bozzo, M. Poquet, E. Sagristà i M. Durfort

Donax striatus Linnaeus (Mollusca, Bivalvia) do litoral Norte do Brasil». Revta. Bras. Zool., 12: 211220. Pérez Camacho, A.; Román, G. (1987). «La reproducción en los moluscos bivalvos». A: Espinosa de los Monteros, J.; Labarta, U. [ed.]. Reproducción en acuicultura. Madrid: Caicyt, 133-184. Princep, M.; Bigas, M.; Durfort, M. (1996). «Incidencia de Bucephallus haimeanus (Lacaze-Duthiers, l854) (Trematoda, Digenea) en el hepatopáncreas de Ostrea edulis Linné». Iberus, 14: 211-220. Reynolds, E. S. (1963). «The use of lead citrate at high pH as electron opaque stain in electron microscopy». J. Cell Biol., 17: 208-212. Riera, V.; Bigas, M.; Santmartí, M.; Durfort, M. (1995). «Prevalencia del protozoo parásito Marteilia refringens en las poblaciones de ostra plana (Ostrea edulis) del maresme (NE Barcelona)». Actas V Congreso Nacional de Acuicultura: 242-247.

Román, R.; Pérez Camacho, A. (1976). «Cultivo de larvas de vieira, Pecten maximus (Linnaeus), en laboratorio». Bol. Inst. Espa. Océano, 223: 17. Sagristà, E.; Bozzo, M. G.; Bigas, M.; Poquet, M.; Durfort, M. (1998) «Developmental cycle and ultrastructure of Steinhausia mytilovum, a Microsporidian parasite of oocytes of the mussel, Mytillus galloprovincialis (Mollusca, Bivalvia)». Europ. J. Protistol., 34: 58-68. Santmartí, M. M.; García Valero, J.; Montes, J.; Pech, A.; Durfort, M. (1995). «Seguimiento del protozoo Perkinsus sp. en las poblaciones de Tapes decussatus y Tapes semidecussatus del delta del Ebro». Actas V Congreso Nacional de Acuicultura: 260-265. Spurr, A. R. (1969). «A low viscosity epoxi resin embedding medium for electron microscopy». Journal of Ultrastructure Research, 26: 36-43.

DOI: 10.2436/20.1501.02.59

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 71-93

L’ESPERMATOGÈNESI EN ELS CRANCS (CRUSTACEA, BRACHYURA). UN MODEL ATÍPIC DE CONDENSACIÓ DEL NUCLI ESPERMÀTIC Carles G. Simeó,1,4 Kathryn Kurtz,2 Manel Chiva,2 Guiomar Rotllant 1,4 i Enric Ribes 3,4 Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries, Sant Carles de la Ràpita. Departament de Ciències Fisiològiques II, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona. 3 Departament de Biologia Cel·lular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. 4 Xarxa de Referència de Recerca, Desenvolupament i Innovació en Aqüicultura de la Generalitat de Catalunya. 1 2

Adreça per a la correspondència: Enric Ribes Mora. Departament de Biologia Cel·lular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 645. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: eribes@ub.edu. RESUM Els espermatozoides dels crustacis decàpodes es caracteritzen per tenir un nucli amb cromatina poc condensada, un acrosoma complex i un citoplasma reduït sense flagel. Es disposa d’una àmplia informació sobre la ultraestructura i variabilitat morfològica dels espermatozoides dels crustacis decàpodes, i particularment dels braquiürs, ja que la seva especificitat ha permès utilitzar-los com a caràcter filogenètic, però el procés d’espermatogènesi i la naturalesa de les proteïnes associades a la cromatina dels espermatozoides són qüestions encara no resoltes. En aquest treball hem tractat aquestes dues qüestions utilitzant com a model dues espècies de braquiürs: la cabra de mar, Maja brachydactyla, i el bou de mar, Cancer pagurus. D’aquesta manera, hem realitzat una breu descripció de la morfologia de l’aparell reproductor masculí de M. brachydactyla, hem localitzat el lloc on es desenvolupa l’espermatogènesi i hem descrit la formació dels espermatòfors que són transferits a la femella. A continuació, hem comparat el procés d’espermatogènesi de M. brachydactyla, amb els estudis fets en altres espècies, considerant de manera preferent la formació de l’acrosoma. Finalment, hem descrit diferents aspectes del nucli dels espermatozoides dels braquiürs, fent un estudi específic de les proteïnes associades al nucli de l’espermatozoide de C. pagurus. Paraules clau: aparell reproductor masculí, espermatogènesi, espermatozoide, cromatina, Brachyura.

72 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

SPERMATOGENESIS IN CRABS (CRUSTACEA: BRACHYURA). AN ATYPICAL CONDENSATION MODEL OF THE SPERMATIC NUCLEI SUMMARY Decapods crustacean spermatozoa are characterized by a nucleus containing a low condensed chromatin, a complex acrosome and reduced cytoplasm lacking of flagellum. Large information on ultrastructure and morphological variability of the spermatozoa is available in crustacean particularly, in Brachyuran, since their specificity has been used as a phylogenetic character. However, the spermatogenesis and the nature of the proteins associated to chromatin in the nucleus of the spermatozoa are still unclear. In the present study, we have dealt both topics using two brachyuran species as model: the spider crab, Maja brachydactyla and the edible crab, Cancer pagurus. Thus, we have briefly described the morphology of the male reproductive system of M. brachydactyla in order to locate the spermatogenesis process and to describe the formation of the spermatophore transferred to the female. Finally, we have also described and compared with previous studies, the spermatogenesis process of M. brachydactyla with special attention to the acrosomal vesicle. We have finished our study describing the different characters presented in the nucleus of the spermatozoa, with special reference to the proteins associated to chromatin in C. pagurus. Key words: male reproductive system, spermatogenesis, spermatozoa, chromatin, Brachyura.

INTRODUCCIÓ A diferència d’altres grups taxonòmics, els crustacis decàpodes presenten un espermatozoide caracteritzat per la falta de flagel, un nucli amb una cromatina laxa i poc condensada i un acrosoma complex de gran varietat morfològica (Felgenhauer i Abele, 1991). La morfologia de l’espermatozoide dels crustacis decàpodes va despertar gran interès, i va donar lloc lloc a les primeres descripcions de l’espermatogènesi dels braquiürs (Binford, 1913; Fasten, 1918, 1924, 1926; Nath, 1932; Estampador, 1949). La utilització de la microscòpia electrònica va permetre observar la ultraestructura dels diferents components de l’espermatozoide (Yasuzumi, 1960; Langreth, 1969; Reger, 1970; Medina i Rodríguez, 1992a), i va mostrar una gran diversitat morfològica en els

espermatozoides dels crustacis decàpodes, la qual cosa ha estat utilitzada per dur a terme reconstruccions filogenètiques, especialment en els braquiürs (Jamieson, 1991a, 1994b; Jamieson et al., 1995). Tanmateix, la utilització de la microscòpia electrònica va demostrar que la cromatina d’aquests espermatozoides era poc electrodensa, i això indicava una falta de compactació del DNA i va obrir les portes a l’estudi de les proteïnes associades a la cromatina en l’espermatozoide (Chevaillier, 1966a, 1967, 1968; Vaughn i Locy, 1969; Vaughn i Hinsch, 1972; Vaughn i Thomson, 1972). Els estudis ultraestructurals de l’espermatogènesi van anar perdent interès al voltant de l’any 1970, i alguns aspectes, com ara l’origen de l’acrosoma, el sistema de membranes de l’espermatozoide, la baixa condensació de la cromatina i la naturale-

L’espermatogènesi en els crancs 73

sa de les proteïnes associades, van quedar sense resoldre. En el present treball tractem el procés de l’espermatogènesi i l’estudi de les proteïnes associades a la cromatina dels nuclis dels espermatozoides. L’APARELL REPRODUCTOR DELS BRAQUIÜRS La cabra de mar, Maja brachydactyla L’absència del flagel és un dels aspectes més característics en els espermatozoides dels crustacis decàpodes (Felgenhauer i Abele, 1991); per tant, els espermatozoides resten immòbils o tenen una mobilitat reduïda, i és per això que els crustacis decàpodes han desenvolupat diferents estratègies reproductives, que assoleixen la màxima complexitat en els braquiürs. Els mascles dels crustacis decàpodes transfereixen els espermatozoides en estructures anomenades espermatòfors, que en els braquiürs estan formats per espermatozoides envoltats per una capa de material amorf, envoltats de grans quantitats de fluids seminals (Hinsch, 1991; Subramonian, 1991). Els espermatòfors i els fluids seminals dels braquiürs són injectats mitjançant el primer parell de pleopodis modificats per a la funció copuladora (gonopodis) als receptacles seminals de la femella, uns allargaments de l’aparell reproductor connectats als ovaris per uns oviductes (Bauer, 1986; Rotllant et al., 2007). La fecundació és interna i es produeix aprofitant el pas dels oòcits per una cambra dels receptacles seminals de la femella abans de ser alliberats pels gonopors i ser adherits als pleopodis (Diesel, 1991). L’aparell reproductor masculí dels braquiürs consta de dos testicles, dos vasos deferents i dos conductes ejaculadors situats sobre l’hepatopàncrees (vegeu la figura 1a).

Els testicles es localitzen a la part anterior del cefalotòrax, i s’estenen anteriorment i lateralment en forma de banyes. En algunes espècies, ambdós testicles estan units per una comissura localitzada entre l’estómac i el cor (Mouchet, 1931). Els braquiürs presenten dos tipus de testicles (Nagao i Munehara, 2003): els de forma lobular, que també es troben en la resta de decàpodes, i estan formats per uns àcins o lòbuls connectats per un conducte col·lector, i els de forma tubular, exclusius dels braquiürs, que estan formats per un únic tub seminífer molt recaragolat. Malgrat les diferents morfologies, la fisiologia del testicle sembla equivalent en ambdós casos. Les espermatogònies es troben a la perifèria del lòbul o del tub seminífer i els diferents estadis de l’espermatogènesi ocupen l’espai central. A l’extrem oposat de les espermatogònies es troba generalment la zona col·lectora testicular, que transporta els espermatozoides al conducte deferent. En el cas de M. brachydactyla, els testicles s’estenen descrivint un arc des de la base de l’epipodi del maxil·lípede fins a la part anterior del cor. Cada testicle està format per un únic tub seminífer altament recaragolat, i per això ha estat classificat com a testicle tubular (Simeó et al., en revisió) (vegeu la figura 1b). El tub seminífer de M. brachydactyla es troba organitzat en tres zones: germinal, de transformació i d’evacuació (Simeó et al., en revisió) (vegeu la figura 1c). La zona germinal està localitzada en un pol del tub, i conté espermatogònies i cèl· lules accessòries. Aquesta zona és una fina capa durant la major part de l’espermatogènesi i augmenta de mida en el moment en què la zona de transformació presenta espermatozoides. La zona de transformació ocupa la zona central i és on es produeix la maduració dels espermatòcits fins arribar als espermatozoides. És en aquesta zona on les cèl·lules gamètiques es troben acompanyades per prominents cèl·lules accessòries

74 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

(vegeu la figura 1c). La zona d’evacuació, al pol oposat al de la zona germinal, conté exclusivament els espermatozoides produïts a la zona de transformació i els trasllada fins al conducte deferent, on són empaquetats en espermatòfors. El conducte deferent dels braquiürs està situat a la part posterior del cefalotòrax, i es divideix en tres regions: anterior, mitjana i posterior, d’acord amb criteris morfològics

i funcionals (Krol et al., 1992). El conducte deferent anterior és un tub on es produeix la formació de l’espermatòfor mitjançant les secrecions de l’epiteli de la paret del conducte. Les regions mitjana i posterior del conducte deferent són els llocs d’emmagatzematge dels espermatòfors i de la producció dels fluids seminals que els engloben durant l’ejaculació (Diesel, 1991). Aquestes dues regions presenten expansions laterals

Figura 1. Maja brachydactyla. a) Diagrama de l’anatomia interna; es mostra l’aparell reproductor localitzat en el cefalotòrax. b) Diagrama que representa la morfologia externa del testicle amb un únic tub seminífer (cap de fletxa blanca) i del conducte deferent amb la presència de diverticles que van augmentant des del conducte anterior fins al mitjà (cap de fletxa negra); el conducte deferent posterior és un tub que té associada una glàndula accessòria formada per diverticles molt ramificats. c) Secció transversal del tub seminífer (MO, tinció de Mallory); el tub seminífer es troba dividit en tres zones: germinal, de transformació i d’evacuació. d) Porció distal del conducte deferent anterior (MO, hematoxilina i eosina); els espermatòfors ja formats es troben envoltats per les secrecions produïdes per l’epiteli. Brq: brànquies; CA: cèl·lula accessòria; CDA: conducte deferent anterior; CDM: conducte deferent mitjà; CDP: conducte deferent posterior; Epp: epipodi; Ept: epiteli; Esp: espermatòfor; Est: estómac; GAc: glàndula accessòria; Hep: hepatopàncrees; pd: porció distal del conducte deferent anterior; pp: porció proximal del conducte deferent anterior; T: testicle; ZE: zona d’evacuació; ZG: zona germinal; ZT: zona de transformació.

L’espermatogènesi en els crancs 75

o diverticles que augmenten la superfície de secreció i el volum d’emmagatzematge, i assoleixen mides considerables (Mouchet, 1931; Adiyodi i Anilkumar, 1988). En M. brachydactyla, tal com s’ha descrit en la resta de braquiürs, el conducte deferent també s’ha dividit en tres regions (Simeó et al., en revisió) (vegeu la figura 1b). El conducte deferent anterior és un tub doblegat dividit en dues porcions: proximal i distal; la porció proximal, propera al testicle, és un tub llis, mentre que la distal presenta uns petits diverticles aïllats (vegeu la figura 1b). Al llarg del conducte deferent anterior es produeix la formació de l’espermatòfor, de manera que els espermatozoides provinents dels testicles s’agrupen en petites masses mitjançant dues secrecions de l’epiteli secretor de la paret del conducte deferent (vegeu la figura 1d). El conducte deferent mitjà és un tub enrotllat helicoïdalment que presenta un gran nombre de diverticles localitzats en un pol del tub (vegeu la figura 1b); tant a la llum d’aquest conducte com als diverticles es troben grans quantitats d’espermatòfors envoltats per noves secrecions elaborades per l’epiteli d’aquesta regió del conducte (vegeu la figura 1d). El conducte deferent posterior té associada una gran glàndula accessòria, formada per diverticles altament ramificats que produeixen i emmagatzemen un fluid seminal secretat per l’epiteli de la seva paret (vegeu la figura 1b), que és abocat al conducte deferent posterior i engloba els espermatòfors provinents del conducte deferent mitjà durant l’ejaculació. El conducte ejaculador de M. brachydactyla està situat entre la musculatura de la coxa de la cinquena pota marxadora. En la seva paret per sota de l’epiteli mostra una capa de musculatura esquelètica molt desenvolupada, que és la responsable de l’extrusió dels espermatòfors i del fluid seminal fins al gonopor (Simeó et al., en revisió).

L’ESPERMATOGÈNESI DELS BRAQUIÜRS L’espermatogènesi de la cabra de mar, Maja brachydactyla L’estudi de l’espermatogènesi de M. bra chydactyla s’ha centrat en la zona de transformació del tub seminífer, on podem trobar des dels espermatòcits primaris fins als espermatozoides madurs (Simeó et al., en preparació) (vegeu la figura 1c). Els espermatòcits primaris són cèl·lules esfèriques amb una alta relació nucli/citoplasma (vegeu la figura 2). El nucli és esfèric i voluminós i ocupa la zona central de la cèl· lula. La cromatina presenta les diferents figures meiòtiques de la primera divisió meiòtica, com ara els complexos sinaptinemals durant el paquitè (vegeu les fletxes de la figura 2b). El citoplasma conté pocs mitocondris, un complex sistema d’endomembranes i el nucleolus-like body o nuage. El sistema d’endomembranes es desenvolupa progressivament al llarg dels diferents estadis, i durant el paquitè mostra una característica disposició concèntrica de les membranes amb dilatacions laterals (vegeu la figura 2b), mentre que durant el diplotè el sistema d’endomembranes es troba altament desenvolupat i s’organitza en estructures conegudes com a làmines anellades i d’altres formacions membranoses (vegeu la figura 2c). El nuage apareix com un cos electrodens que està present en pràcticament tots els estadis d’espermatòcits primaris i és especialment prominent durant el diplotè (vegeu la figura 2a i c). Després de la diacinesi de la primera divisió meiòtica (vegeu la figura 2d), els estadis dels espermatòcits secundaris transcorren molt ràpidament i fan difícil l’obtenció de mostres per microscòpia. Les espermàtides primerenques són cèl· lules esfèriques, amb una relació nucli/

76 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

citoplasma alta, que mostren els primers signes de polarització. Així, el nucli es troba lleugerament desplaçat del centre de la cèl·lula en el que serà el pol nuclear de l’espermatozoide, mentre que al pol oposat, el pol acrosòmic, es desenvoluparà la vesícula acrosòmica (vegeu la figura 3a). El nucli de l’espermàtida primerenca és esfèric i té la cromatina condensada en grumolls. D’altra

banda, el citoplasma conté alguns mitocondris i un sistema de membranes poc desenvolupat. El primer canvi que es produeix durant l’espermiogènesi és la descondensació de la cromatina nuclear, que adquireix un aspecte granular homogeni (vegeu la figura 3b). En el citoplasma, el sistema de membranes constituït pel reticle endoplasmàtic i el complex de Golgi es desenvolupa

Figura 2. Maja brachydactyla. Espermatòcits primaris (TEM). a) Preleptotè (esquerra) i leptotè (dreta). La condensació dels cromosomes augmenta durant el preleptotè i el leptotè. En aquest darrer estadi, el citoplasma conté pocs mitocondris i nuage. b) Paquitè. S’observen complexos sinaptinemals (fletxes) en el nucli i la disposició concèntrica del sistema d’endomembranes. c) Diplotè. El sistema d’endomembranes es troba molt desenvolupat i s’observen làmines anellades. El nuage assoleix la màxima mida en aquest estadi. d) Diacinesi. Es pot veure una reducció del sistema d’endomembranes. LA: làmines anellades; Mtc: mitocondri; Nu: nuage; SEC: sistema d’endomembranes concèntric.

L’espermatogènesi en els crancs 77 Taula 1. Estudis de l’espermatogènesi en diferents espècies de braquiürs Superfamília

Espècie

Procés

Tècnica

Autor

Majoidea

Maja brachydactyla

Espermatogènesi

(Simeó et al., en preparació(b))

Cancroidea

Cancer magister

Espermatogènesi

Fasten, 1918

Cancer productus Cancer oregonensis Cancer gracilis

Espermatogènesi

Fasten, 1924

Cancer borealis Cancer irroratus Cancer magister Cancer productus

Espermiogènesi

Langreth, 1969

Portunoidea

Scylla serrata Scylla paramamosain Scylla oceanica Scylla tranquebarica

Espermatogènesi

Estampador, 1949

Xanthoidea

Menippe mercenaria

Espermatogènesi

Binford, 1913

Potamoidea

Sartorina spinigera

Espermatogènesi

Nath, 1932

Pinnotheroidea

Pinnixa sp

Espermiogènesi

Reger, 1970

Ocypodoidea

Uca tangeri

Espermiogènesi

Medina i Rodríguez, 1992b

Grapsoidea

Eriocheir sinensis

Espermatogènesi

Hoestlandt, 1948

Eriocheir japonicus

Espermàtides finals

Yasuzumi, 1960

ME: microscòpia electrònica; MO: microscòpia òptica.

i s’organitza progressivament, de manera que el complex de Golgi produeix dos tipus de vesícules: les de baixa i les de mitjana electrodensitat, que es fusionen al pol acrosòmic i donen lloc a la vesícula proacrosòmica, que conté material granulat homogèniament distribuït. Al llarg de l’espermàtida intermèdia la vesícula proacrosòmica creix paral·lelament al desenvolupament del reticle endoplasmàtic i del complex de Golgi, són desplaçats a la zona equatorial de la cèl· lula entre el nucli i la vesícula proacrosòmica, i s’observa a l’interior de la vesícula l’aparició d’un grànul electrodens (vegeu la figura 3c). La fase d’espermàtida intermèdia finalitza amb el trencament de les membra-

nes nuclears a la zona equatorial de la cèl· lula i la degeneració del reticle endoplasmàtic. L’espermàtida madura es mostra com una cèl·lula altament polaritzada (vegeu la figura 3d); el nucli, en el pol nuclear, presenta forma de mitja lluna, i la vesícula proacrosòmica, en el pol acrosòmic, apareix com un cos esfèric i molt voluminós. En aquesta fase, la vesícula proacrosòmica experimenta una gran transformació morfològica: a la zona apical es veu una fina banda altament electrodensa que donarà lloc al barret acrosòmic o opercle (acrosomal cap, operculum), mentre que a la zona basal es forma una invaginació de la vesícula, embolcallada d’un material granular electrodens, que donarà

78 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

L’espermatogènesi en els crancs 79

lloc al tub acrosòmic (acrosomal tube, perforatium) (vegeu la fletxa de la figura 3d). El citoplasma és molt reduït i es troba localitzat entre els extrems del nucli i la vesícula proacrosòmica, i conté un sistema de membranes, produït per la degeneració del reticle endoplasmàtic i el complex de Golgi, associat a mitocondris i microtúbuls (vegeu la figura 5). A continuació, en la fase final de l’espermiogènesi, s’observa com el component granular present a l’interior de la vesícula proacrosòmica es va condensant i origina una sèrie de capes concèntriques, de diferent electrodensitat al voltant del tub acrosòmic (vegeu les fletxes blanques de la figura 3e). En aquesta fase també s’observa com el nucli va formant quatre prolongacions laterals (lateral arm) que tenen el seu interior ple de fibres de cromatina (vegeu els asteriscs de la figura 3f ). L’espermatozoide de M. brachydactyla té forma esferoïdal estrellada (vegeu la figura 4a). L’acrosoma ocupa el centre de la cèl· lula i es troba envoltat basalment i lateralment per una fina franja de citoplasma i per un nucli que ocupa una posició més perifèrica (vegeu la figura 4b). L’acrosoma és esfèric, i a la part anterior té un opercle de forma lenticular còncava amb una petita protuberància. L’acrosoma està constituït també per tres capes:

externa, intermèdia i interna (vegeu la figura 4b). La formació de cadascuna d’aquestes tres capes té lloc independentment durant l’espermiogènesi. La capa interna que envolta el perforatorium s’origina a partir d’un grànul electrodens d’origen citoplasmàtic, mentre que les capes intermèdia i externa es formen a partir de la condensació seriada del contingut de la vesícula proacrosòmica (vegeu les figures 3c, d, e i f ). El citoplasma, en l’espermatozoide madur, es troba restringit a una zona estreta en forma d’anell que envolta l’acrosoma just per sota de l’opercle; en aquesta regió del citoplasma és on s’observa un sistema de membranes i microtúbuls juntament amb un nombre reduït de petits mitocondris, que tenen una matriu electrodensa amb poques crestes (vegeu la figura 4B). Una altra zona estreta de citoplasma es localitza entre la zona basal de l’acrosoma i el nucli, i és en aquesta on s’observen un o dos centríols. El nucli s’estén pràcticament per tot el volum cel·lular, excepte en l’espai ocupat per l’acrosoma i l’estreta franja de citoplasma que l’envolta. Les membranes de l’embolcall nuclear se situen properes a la membrana citoplasmàtica i donen lloc a una estructura multimembranosa electrodensa que delimita la superfície de l’espermatozoide. La cromatina és poc condensada i mostra un

Figura 3 (pàgina anterior). Maja brachydactyla. Espermàtides (TEM). a) Espermàtida primerenca. El nucli es troba desplaçat del centre de la cèl·lula i presenta petits grumolls de cromatina condensada (fletxes), mentre que el citoplasma ho fa en sentit contrari. b) Espermàtida intermèdia. La cromatina s’ha descondensat i mostra un aspecte granular. Al citoplasma, el sistema d’endomembranes s’ha desenvolupat i diferenciat en reticle endoplasmàtic i complex de Golgi, l’activitat dels quals dóna lloc a la vesícula proacrosòmica. c) Espermàtida intermèdia. En una fase més avançada, apareix un grànul electrodens a l’interior de la vesícula proacrosòmica. La fletxa blanca indica la zona on es produeix el trencament de l’embocall nuclear. d) Espermàtida madura. El nucli presenta una forma de mitja lluna i el citoplasma reduït conté un sistema de membranes. La vesícula proacrosòmica mostra un opercle sobre el grànul electrodens en posició apical. A la base de la vesícula observem una capa de material granular a la zona on es formarà el tub acrosòmic (fletxa). e) Espermàtida madura. El nucli s’estén envoltant la vesícula proacrosòmica. Els components de la vesícula es condensen en petits grumolls (fletxes blanques) que s’organitzen al voltant del tub acrosòmic. f ) Espermàtida madura. El nucli s’expandeix, i desenvolupa les prolongacions laterals o lateral arm (asteriscs). Els components de la vesícula proacrosòmica s’organitzen concèntricament al voltant del tub acrosòmic. BA: barret acrosòmic o opercle; CG: complex de Golgi; G: grànul de la vesícula proacrosòmica; N: nucli; PA: pol acrosòmic; RE: reticle endoplasmàtic; SM: sistema de membranes; TA: tub acrosòmic o perforatium; VP: vesícula proacrosòmica.

80 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

aspecte fibril·lar homogeni al llarg de tot el nucli, i arriba fins i tot a ocupar l’espai interior de les quatre prolongacions de l’espermatozoide (vegeu la figura 4b).

L’espermatogènesi en altres espècies de braquiürs El procés d’espermatogènesi segueix un patró comú en relació amb el nucli, el citoplasma i el desenvolupament de la vesícu-

Figura 4. Maja brachydactyla. Espermatozoide. a) SEM. L’espermatozoide mostra una forma ovoidal amb quatre llargues prolongacions laterals. b) TEM. El nucli de l’espermatozoide conté cromatina poc condensada. A la base de les prolongacions laterals es troba el sistema de membranes. L’acrosoma és esfèric i està format per tres capes concèntriques. La capa interna envolta el tub acrosòmic. La part apical presenta l’opercle amb una depressió central. AE: capa externa de l’acrosoma; AI: capa interna de l’acrosoma; AInt: capa intermèdia de l’acrosoma; BA: barret acrosòmic o opercle; EN: prolongacions laterals del nucli; N: nucli; SM: sistema de membranes; TA: tub acrosòmic.

Figura 5. Maja brachydactyla. Síntesi dels esdeveniments cel·lulars durant el procés de maduració de les espermàtides.

L’espermatogènesi en els crancs 81

la acrosòmica, malgrat la gran variabilitat morfològica dels espermatozoides dels braquiürs estudiats (vegeu la taula 1). El fet més particular que experimenta el nucli al llarg de l’espermatogènesi és la descondensació de la cromatina. Les espermàtides primerenques presenten una cromatina condensada en grànuls a la perifèria del nucli (Langreth, 1969; Reger, 1970; Simeó et

Figura 6. Cancer pagurus. Activació dels espermatozoides. a) Espermatozoides intactes de C. pagurus observats per microscòpia de contrast de fase (a1), i per tinció del nucli amb el reactiu de Hoechst (a2). b) Espermatozoides activats del mateix animal, observats per contrast de fase (b1) i per tinció del seu nucli amb reactiu de Hoechst (b2). c) Esquema de l’activació de l’espermatozoide quan entra en contacte amb la coberta externa oocitària (1) abans de l’activació; 2) durant l’activació). El nucli ha de travessar el canal intern que forma l’acrosoma en la seva eversió. Ch: cromatina; IAR i OAR: regions acrosòmiques interna i externa (observeu el canvi de posició de IAR/OAR després de l’eversió); OE: coberta oocitària; OP: citoplasma de l’oòcit.

al., en preparació) o un aspecte granular homogeni (Medina i Rodríguez, 1992a). Al final de l’espermatogènesi, el nucli de les espermàtides mostra una cromatina poc condensada d’aspecte fibrós. Paral·lelament a la descondensació de la cromatina, es dóna un augment del volum del nucli i un desenvolupament de les prolongacions nuclears (Medina i Rodríguez, 1992a). Aquests canvis estan associats a modificacions de les proteïnes que acompanyen la cromatina i que possiblement tenen un paper molt important en el moment de la fertilització de l’oòcit. Un altre fet característic és el trencament de les membranes nuclears (Langreth, 1969; Reger, 1970; Medina i Rodríguez, 1992a; Simeó et al., en preparació), de tal manera que la cromatina queda en contacte, però no barrejada, amb el citoplasma. Aquesta desintegració de les membranes nuclears sol estar associada a la zona basal de l’acrosoma i, més específicament, a la base del tub acrosòmic, i facilita el pas del nucli a través del canal format pel tub acrosòmic durant la fertilització. Les membranes nuclears s’ajunten entre si (Langreth, 1969; Reger, 1970; Medina i Ro dríguez, 1992a) i amb la membrana plasmàtica per formar un sistema pentalaminar (Reger, 1970). Al llarg de l’espermiogènesi es produeix una gran reducció del citoplasma en favor de la vesícula acrosòmica (Reger, 1970; Medina i Rodríguez, 1992a). El citoplasma és activament abocat fora de la cèl·lula (Langreth, 1969) i fins i tot es desprenen regions senceres dins de vesícules membranoses (Reger, 1970). Els canvis soferts pel citoplasma també afecten els diferents components citoplasmàtics: mitocondris, centríols i el sistema d’endomembranes. Els mitocondris, que són poc nombrosos i presenten unes crestes poc desenvolupades (Medina i Rodríguez, 1992a; Simeó et al., en

82 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes Llista d’estudis sobre la ultraestructura dels espermatozoides dels braquiürs Superfamília

Espècie

Homolodromia kai Moreirodromia antillensis Dromidiopsis edwardsi Stimdromia lateralis Sphaerodromia lamellata Metadynomene tanensis Paradynomene tuberculata Tymolus sp. Homoloidea Homola ranunculus Homologenus levii Homolomannia sibogae Latreillopsis gracilipes Dagnaudus petterdi Paromola bathyalis Paromolopsis boasi Latreillia sp. Raninoidea Lyreidus brevifrons Ranina ranina Raninoides sp. Cosmonotus sp. Cyclodorippoidea Xeinostoma richeri Cymonomus sp. Dorippoidea Neodorippe callida Ethusa indica Calappoidea Calappa hepatica Calappa gallus Mursia microspina Leucosioidea Iliacantha subglobosa Bellidilia laevis Tanaoa serenei Odiomaris pilosus Odiomaris estuarius Elamena vesca Majoidea Maja brachydactyla Chionoecetes opilio Cyrtomaia furici Grypacheus hyalinus Macropodia longirostris Platymaia rebierei Podochela riisei Stenorhynchus seticornis Inachus phalangium Hyastenus diacanthus Libinia dubia Libinia emarginata Macrocoeloma trispinosum Mithrax sp. Menaethius monoceros Oxypleurodon orbiculatum Homolodroioidea Dromoidea

Autor Jamieson et al., 1995; Guinot et al., 1998 Brown, 1966; Felgenhauer i Abele, 1991 Jamieson, 1994a; Jamieson et al., 1993d, 1994b Jamieson, 1990, 1991a, 1991b, 1994a; Guinot et al., 1994 Guinot et al., 1998 Jamieson et al., 1995; Guinot et al., 1998 Jamieson, 1994a; Jamieson et al., 1993b Jamieson, 1994a; Jamieson et al., 1994a Guinot et al., 1994 Jamieson et al., 1993c Jamieson et al., 1993c Jamieson, 1994a; Jamieson et al., 1993c, 1994b Guinot et al., 1994 Guinot et al., 1994 Jamieson et al., 1993c Jamieson, 1994a, 1994b Jamieson, 1994a; Jamieson et al., 1994b Jamieson, 1989a, 1991a, 1991b, 1994a; Guinot et al., 1994 Jamieson, 1994a, 1994b; Jamieson et al., 1994b Jamieson i Tudge, 2000 Jamieson, 1994a; Jamieson et al., 1994a Jamieson, 1994a; Jamieson et al., 1994a Jamieson, 1991b, 1994a; Jamieson i Tudge, 1990 Jamieson i Tudge, 2000 Jamieson, 1991a Jamieson i Tudge, 2000 Jamieson i Tudge, 2000 Felgenhauer i Abele, 1991 Jamieson i Tudge, 2000 Jamieson i Tudge, 2000 Forges et al., 1997 Forges et al., 1997 Jamieson i Tudge, 2000 Tudge i Justine, 1994 Beninger et al., 1988; Chiba et al., 1992 Jamieson i Tudge, 2000; Jamieson et al., 1998 Jamieson i Tudge, 2000; Jamieson et al., 1998 Jamieson i Tudge, 2000; Jamieson et al., 1998 Jamieson i Tudge, 2000; Jamieson et al., 1998 Hinsch, 1973 Hinsch, 1973 Rorandelli et al., 2008 Jamieson i Tudge, 2000; Jamieson et al., 1998 Hinsch, 1973 Hinsch, 1969, 1971, 1973, 1986; Vaughn i Hinsch, 1972; Hernandez et al., 1989; Murray et al., 1991 Hinsch, 1973 Hinsch, 1973 Jamieson, 1991a, 1994a Jamieson i Tudge, 2000; Jamieson et al., 1998

L’espermatogènesi en els crancs 83 Oxypleurodon stuckiae Jamieson i Tudge, 2000; Jamieson et al., 1998 Pitho lherminieri Hinsch, 1973 Parthenopoidea Parthenopidae sp. Jamieson i Tudge, 2000 Heterocrytpa granulata Hinsch, 1973 Parthenope serratus Hinsch, 1973 Retroplumoidea Retropluma sp. Jamieson i Tudge, 2000 Cancroidea Corystes cassivelaunus Jamieson et al., 1997 Cancer borealis Langreth, 1965, 1969 Cancer irroratus Langreth, 1965, 1969 Cancer magister Langreth, 1965, 1969 Cancer pagurus Pochon-Masson, 1968; Tudge i Justine, 1994; Tudge et al., 1994; Jamieson et al., 1997 Cancer productus Langreth, 1965, 1969 Platepistoma nanum Jamieson et al., 1997 Portunoidea Portunus pelagicus Jamieson, 1989a, 1991a, 1994a; Jamieson i Tudge, 1990; El-Sherief, 1991; Guinot et al., 1994 Callinectes sapidus Brown, 1966; Felgenhauer i Abele, 1991 Xaiva sp. Jamieson i Tudge, 2000 Caphyra loevis Jamieson, 1991a, 1994a Caphyra rotundifronis Jamieson, 1991a, 1994a Carcinus maenas Pochon-Masson, 1962, 1968; Chevaillier, 1966b, 1967, 1969; Pearson i Walker, 1975; Goudeau, 1982; Reger et al., 1984 Ovalipes ocellatus Hinsch, 1986 Ovalipes molleri Jamieson i Tudge, 2000 Podophthalmus vigil Jamieson i Tudge, 2000 Chaceon fenneri Hinsch, 1988 Chaceon quinquedens Hinsch, 1988 Bythograeoidea Austinograea alayseae Tudge et al., 1998 Bythograea thermydron Tudge et al., 1998 Segonzacia mesatlantica Tudge et al., 1998 Xanthoidea Atergatis floridus Jamieson, 1989b, 1989c, 1991a; Jamieson et al., 1993a Etisus laevimanus Jamieson, 1989c, 1991a Pilodius areolatus Jamieson, 1989c, 1991a, 1994a Liagore rubromaculata Jamieson, 1989c, 1991a Eurypanopeus depressus Felgenhauer i Abele, 1991; Jamieson i Tudge, 2000 Eurytium limosum Felgenhauer i Abele, 1991 Panopeus obesus Jamieson i Tudge, 2000 Ceratoplax sp. Jamieson i Tudge, 2000 Hexaplax megalops Jamieson i Tudge, 2000 Menippe mercenaria Brown, 1966 Eriphia sebana Jamieson i Tudge, 2000 Pilumnus semilanatus Jamieson i Tudge, 2000 Gonatonotus granulosus Jamieson i Tudge, 2000 Harrovia albolineata Jamieson i Tudge, 2000 Trapezia cymodoce Jamieson, 1993b Tetralia glaberrima Jamieson i Tudge, 2000 Tetralia nigrolineata Jamieson i Tudge, 2000 Calocarcinus africanus Jamieson, 1994a; Jamieson et al., 1993a Goneplacoidea Australocarcinus riparius Jamieson i Guinot, 1996 Carcinoplax microphthalmus Jamieson i Tudge, 2000 Goneplax sp. Jamieson i Tudge, 2000 Potamoidea Potamon fluviatile Tudge i Justine, 1994; Guinot et al., 1997 Potamon ibericum Guinot et al., 1997 Potamonautes perlatus sidneyii Jamieson, 1993a, 1994a, 1994b

84 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes Gecarcinucoidea Cryptochiroidea Pinnotheroidea Ocypodoidea

Grapsoidea

Holthusiana transversa Cryptochirus coralliodytes Hapalocarcinus marsupialis Pinnixa sp. Mictyris longicarpus Macrophthalmus crassipes Ocypode ceratophthalmus Uca paradussumieri Uca polita Uca pugilator Uca tangeri Uca uruguayensis Cardisoma carnifex Grapsus albolineatus Cyclograpsus punctatus Varuna litterata Eriocheir japonica Eriocheir sinensis Armases cinereum Chiromantes haematocheir Parasesarma erythodactyla Parasesarma catenatum Sesarma reticulatum

Jamieson i Tudge, 2000 Jamieson i Tudge, 2000 Jamieson i Tudge, 2000 Reger, 1970 Jamieson, 1993a, 1994a Jamieson, 1991a, 1994b Jamieson, 1991a, 1994b Jamieson, 1991a, 1994b Jamieson i Tudge, 2000 Jamieson i Tudge, 2000 Medina, 1992; Medina i Rodríguez, 1992a, 1992b Cuartas i Sousa, 2007 Jamieson et al., 1996 Jamieson, 1991a Jamieson i Tudge, 2000 Jamieson et al., 1996 Yasuzumi, 1960 Du et al., 1987, 1993 Jamieson i Tudge, 2000 Honma et al., 1992 Jamieson, 1991a Jamieson i Tudge, 2000 Felgenhauer i Abele, 1991; Jamieson i Tudge, 2000

preparació), són susceptibles de ser abocats a les cèl·lules accessòries amb la resta del citoplasma (Langreth, 1969). Una característica comuna a totes les espermiogènesis descrites de braquiürs és que els mitocondris que resten en les espermàtides queden embolcallats pel sistema de membranes (PochonMasson, 1962; Langreth, 1969; Reger, 1970; Medina i Rodríguez, 1992a; Simeó et al., en preparació). El centríols, per la seva banda, es localitzen per sota del tub acrosòmic a la base de la vesícula proacrosòmica (PochonMasson, 1962). En alguns casos, els centríols presenten signes de degeneració (Langreth, 1969), i poden arribar a desaparèixer en algunes espècies (Reger, 1970). El fet que els centríols es trobin presents o absents en els espermatozoides obre una incògnita sobre la seva funció, i s’ha suggerit que podrien tenir un paper important durant la reacció acrosòmica. El sistema d’endomembranes és un dels grans tòpics en els estudis de l’espermiogènesi dels crustacis decàpodes, i tant l’origen com el desenvolupament i la funció romanen encara incerts. Al llarg

de l’espermiogènesi es poden distingir dos tipus de sistemes d’endomembranes: el sistema de membranes i les vesícules citoplasmàtiques. El sistema de membranes ha rebut noms diferents en els treballs realitzats: orgànul membranós (membranous organelle, Reger, 1970), chondriofusome (Pochon-Masson, 1962), complex membranós (membrane complex, Langreth, 1969) i làmines membranoses (membranous lamellae, Medina i Rodríguez, 1992a). La seva estructura i origen pot variar en les diferents espècies: en Carcinus maenas (Pochon-Masson, 1962) està format per fragments de les membranes nuclears, centríols i mitocondris; en Cancer sp. (Langreth, 1969) s’origina a partir de les cisternes del reticle endoplasmàtic lliures de ribosomes, associades a microtúbuls i mitocondris, mentre que en Pinnixia sp. (Reger, 1970) està format per les membranes de l’embolcall nuclear i el reticle endoplasmàtic. La funció del sistema de membranes encara no està aclarida. L’origen de les vesícules citoplasmàtiques varia segons les espècies estudiades, ja sigui del reticle en-

L’espermatogènesi en els crancs 85

doplasmàtic rugós (Pochon-Masson, 1962), del reticle endoplasmàtic llis (Langreth, 1969) o del complex de Golgi (Reger, 1970). En M. brachydactyla, com s’ha descrit en l’apartat anterior, les vesícules citoplasmà-

Figura 7. Cancer pagurus. Estructura general de l’espermatozoide (TEM). a) Espermatòfor obtingut del conducte deferent. b) Secció meridional d’un espermatozoide. c) Secció tallada equatorialment on es poden observar els orgànuls d’origen citoplasmàtic immersos en la cromatina. A: acrosoma; Ch: cromatina; m: mitocondri; ms: sistema de membranes; npm: membrana nucleocitoplasmàtica; p: perforatorium; vnm: membranes vesiculades.

tiques, que en fusionar-se donaran lloc a la vesícula proacrosòmica, deriven fonamentalment del complex de Golgi, mentre que el sistema de membranes s’origina a partir de fragments de membranes del reticle endoplasmàtic i s’associa a microtúbuls i mitocondris (Simeó et al., en preparació). El desenvolupament de la vesícula acrosòmica es dóna en un pol de la cèl·lula (Medina i Rodríguez, 1992a; Simeó et al., en preparació) que, en augmentar de volum, desplaça el nucli a la perifèria de l’espermàtida, i llavors el citoplasma queda entre

Figura 8. Cancer pagurus. Proteïnes bàsiques de l’espermatozoide. Gels de: poliacrilamida/SDS (a dalt, esquerra), de poliacrilamida/acíd acètic/urea (a dalt, mig), i de poliacrilamida/acètic/urea/tritó (a dalt, dreta) de les proteïnes espermàtiques solubilitzades amb 0,4 N HCl. De 1 a 5: histones H1, H2A, H2B, H3, H4 i H5; 3(d): dímer de H3; 3(m): monòmer de H3. A baix: immunodetecció (a partir d’una separació en gel de SDS) de les proteïnes bàsiques dels espermatozoides de C. pagurus amb anti-H4 i anti-H2A. Cp: C. pagurus; S1: estàndard d’histones d’eritròcit de gallina; S2: estàndard d’histones d’espermatozoide de llampresa.

86 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

el nucli i la vesícula. L’origen de l’acrosoma varia entre les espècies estudiades, i s’han descrit fins al moment els possibles llocs de procedència següents: el reticle endoplasmàtic (Pochon-Masson, 1962), les vesícules citoplasmàtiques d’origen no determinat (Langreth, 1969) i el reticle endoplasmàtic i el complex de Golgi (Reger, 1970; Simeó et al., en preparació). Al llarg de l’espermiogènesi, la vesícula proacrosòmica presenta una regionalització deguda a una reorganització interna dels seus components. El primer signe de diferenciació és l’aparició d’una regió electrodensa a la zona apical de la vesícula (Pochon-Masson, 1962; Langreth, 1969; Medina i Rodríguez, 1992a; Simeó et al., en preparació) que, en forma de grànul, dóna lloc en alguns casos a l’opercle (Pochon-Masson, 1962; Langreth, 1969). Simultàniament apareix a la zona basal de la vesícula proacrosòmica una fina capa de material granular que envolta una inva-

ginació de la vesícula, de la qual resultarà el tub acrosòmic (Langreth, 1969; Medina i Rodríguez, 1992a; Simeó et al., en preparació). Altres components granulars que es dipositen a la vesícula proacrosòmica s’organitzen, durant les fases finals de l’espermiogènesi, generalment en tres capes concèntriques al voltant del tub acrosòmic. L’espermatozoide dels braquiürs, com hem pogut constatar en aquest treball, és una cèl·lula aflagel·lada amb un acrosoma ben desenvolupat i complex, envoltat per una estreta franja de citoplasma i per un nucli amb cromatina poc condensada que ocupa la part més perifèrica de la cèl·lula. El nucli sol tenir prolongacions laterals en un nombre que varia segons les espècies. Els diferents tàxons de braquiürs presenten una gran diversitat morfològica espermàtica, que ha comportat un gran nombre d’estudis de la ultraestructura dels espermatozoides (vegeu la llista d’estudis).

Figura 9. Cancer pagurus. Cromatina espermàtica. Esquerra: gel bidimensional que resol les proteïnes contingudes en els fragments de cromatina (obtinguts a partir de la digestió amb nucleasa micrococcal). Observeu que els mononucleosomes (M) i els di i trinucleosomes (D, T) contenen histones (H3, H2A, H2B, H4). Dreta: Gels d’agarosa amb els fragments de DNA que provenen de diferents temps d’incubació amb nucleasa micrococcal de la cromatina espermàtica d’Holothuria tubulosa (utilitzada com a control conegut) i de la cromatina espermàtica de C. pagurus (cinètiques d’incubació). 1 a 6: 2, 5, 10, 20, 40 i 120 minuts d’incubació; S: sobrenedant de les incubacions; P: sediment; L: estàndard de DNA de 123 parells de bases i dels seus múltiples. A la part de sota dels gels de DNA demostrem que les histones es troben associades als fragments de DNA, tant en el sobrenedant (Si), com en el sediment (Pi) de la reacció.

L’espermatogènesi en els crancs 87

EL NUCLI ESPERMÀTIC DELS CRUSTACIS DECÀPODES BRAQUIÜRS La cromatina espermàtica El nucli espermàtic dels braquiürs ocupa una posició perifèrica a la cèl·lula i el seu contingut, la cromatina, mostra un aspecte poc electrodens i poc condensat (Chevaillier, 1966a, 1967, 1968; Langreth, 1969). Aquest últim aspecte contrasta amb la major part dels espermatozoides d’altres espècies animals, els quals tenen la cromatina molt condensada (apareix amb una elevadíssima electrodensitat en les imatges de microscòpia electrònica), i un volum nuclear molt reduït (vegeu Kurtz et al., 2008). Moltes de les propietats del nucli espermàtic dels braquiürs estan relacionades amb el seu particular procés de fertilització. L’espermatozoide dels crustacis és aflagel·lat, i el moviment necessari per a la penetració del nucli espermàtic en el citoplasma oocitari és generat per un procés d’eversió del grànul acrosòmic (Hinsch, 1971; Brown, 1976; Goudeau, 1982; Medina i Rodríguez, 1992a). L’eversió de l’acrosoma origina un canal intern i provoca un arrossegament del nucli cap a l’interior del citoplasma oocitari a través de l’estret canal intern (vegeu la figura 6). Els nuclis d’aquests espermatozoides han de tenir una consistència suficient per poder ser arrossegats sense trencar-se, i simultàniament una flexibilitat o capacitat de deformació adequada per poder travessar l’estret canal per on entren dins de l’oòcit. Figura 10. Cancer pagurus. Acetilació de les histones de l’espermatozoide. a) Electroforesi bidimensional de les proteïnes extretes dels espermatozoides de C. pagurus (a dalt), i de la seva reacció amb l’anticòs antiacetil-lisina (a sota). b) Formes mono, di i triacetilades de la histona H4 demostrades a través de la seva reacció amb anticossos específics contra la H4 acetilada en la lisina 16 i la lisina 12. L: histones estàndard d’espermatozoide de llampresa; Cp: histones de C. pagurus.

88 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

Evidentment, els responsables principals d’aquestes propietats són la composició química i l’organització estructural de la cromatina. L’anàlisi de les proteïnes de la cromatina espermàtica ha estat un objectiu a assolir força complicat. La major part dels estudis es van fer entre els anys seixanta i vuitanta del segle passat, i posteriorment van ser abandonats. En un article clàssic en aquest camp del coneixement, Bloch (1969) va demostrar a través de tincions histoquímiques que els nuclis dels crustacis decàpodes no contenien histones, ni protamina, ni cap altra proteïna bàsica que interaccionés amb el DNA. Els estudis realitzats per altres autors (la major part dels quals utilitzaven tècniques de tincions histoquímiques i d’altres a partir de cromatina solubilitzada) tampoc no van posar de manifest la presència de proteïnes bàsiques (Chevaillier, 1966a, 1967, 1968; Vaughn i Locy, 1969; Vaughn i Hinsch, 1972; Vaughn i Thomson, 1972). Vaughn i Hinsch (1972) van descriure en Libinia emarginata que l’única fracció de proteïnes que es podia solubilitzar a partir de la cromatina espermàtica, tenia un caràcter acídic. A partir de l’any 1980 es troben molt pocs treballs que tractin de les proteïnes nuclears espermàtiques dels crustacis, i en particular dels braquiürs, i com a conseqüència el tema de la composició i organització de la cromatina espermàtica dels crustacis resta sense ser resolta. Composició i estructura de la cromatina de Cancer pagurus Els espermatozoides de C. pagurus es troben estretament agrupats en els espermatòfors (vegeu la figura 7a). En aquesta figura també es pot observar l’espermatozoide d’aquest animal en secció meridional i equatorial (vegeu les figures 7b i c). Es pot

apreciar que la cromatina coexisteix sense una separació física completa (és a dir, a través d’un sistema de membranes) amb mitocondris, microtúbuls i altres components citoplasmàtics. En un treball recent (Kurtz et al., 2008), s’han reexaminat la composició i estructura del nucli espermàtic del decàpode braquiür C. pagurus, i s´han obtingut uns resultats que no coincideixen amb els dels estudis precedents, però que poden explicar-los, tal com es discuteix breument al final d’aquest apartat. En primer lloc s’ha trobat que les cèl·lules espermàtiques íntegres (alliberades dels espermatòfors) contenen proteïnes que es poden identificar com a histones, perquè manifesten un comportament electroforètic en gels de poliacrilamida i SDS igual al de les histones control, i perquè reaccionen amb els anticossos antihistona (vegeu la figura 8). Aquesta figura també mostra com les histones de l’espermatozoide de C. pagurus es resolen en diverses bandes electroforètiques quan són analitzades en gels de poliacrilamida/urea amb o sense tritó. Això suggereix que aquestes histones contenen modificacions postraduccionals (vegeu més endavant). En segon lloc s’han observat, a través de digestions amb la nucleasa micrococcal, que aquestes histones es troben interaccionant amb el DNA, organitzant-lo en nucleosomes de 165-170 parells de bases (vegeu la figura 9). En aquest experiment també s’ha trobat que només el 50-60 % del DNA estaria associat a les histones. Finalment, s’han estudiat algunes de les característiques d’aquestes histones. És destacable que la histona H4 de la cromatina espermàtica es troba en un estat elevat d’acetilació, i que les histones H2B i H3 també presenten acetilació però en un grau molt menor (vegeu la figura 10). És important tenir present que l’acetilació de les his-

L’espermatogènesi en els crancs 89

tones disminueix la interacció electrostàtica entre aquestes proteïnes i el DNA i no permet que la cromatina es replegui en estructures més compactes. Una altra característica notable que ha posat en evidència l’estudi esmentat és que la relació proteïna/ DNA en el nucli espermàtic és de 1,0 a 1,2 en aquelles especies que condensen la cromatina, però que només té un valor de 0,5 a 0,6 en dues especies del gènere Cancer. Aquesta proporció correspon aproximadament a la proporció de DNA no unit a histones (40-50 %) estimat a partir de les digestions amb la nucleasa micrococcal. Consideracions respecte als estudis dels altres autors S’intenta poder respondre la pregunta: per quin motiu els diferents investigadors no van poder observar proteïnes bàsiques interaccionant amb el DNA en el nucli espermàtic madur d’aquestes espècies? La major part dels treballs citats anteriorment es van efectuar a través de tincions histoquímiques, i alguns pocs a través d’anàlisis electroforètiques. D’una banda, la baixa proporció relativa entre histones i DNA (així com l’estat d’acetilació) probablement limita la intensitat de la reacció histoquímica (reactiu amb grups amino de les histones) i, per tant, la reacció no arribaria a un llindar mínim per ser detectada. També hem de dir que l’anàlisi electroforètica de les histones no és trivial: els nuclis no es poden purificar (ja que són molt fluids i es trenquen pels mètodes convencionals), i els extractes de proteïnes totals dels espermatozoides produeixen patrons electroforètics molt complexos en els quals la major part de proteïnes provenen del grànul acrosòmic, i en què les histones són minoritàries i no es poden reconèixer. Una última possibilitat a afegir és que actualment es disposa

de combinacions d’inhibidors de la proteòlisi molt eficaços, mentre que els investigadors dels anys 1960-1980 no podien controlar adequadament l’activitat proteolítica. CONCLUSIONS Els espermatozoides dels crustacis decàpodes han despertat un gran interès per la seva morfologia poc usual: no tenen flagel i, per tant, no són mòbils o amb escassa mobilitat, fet que contrasta amb el típic model flagel·lat. La informació respecte als diferents aspectes sobre l’espermatogènesi dels crustacis decàpodes és escassa. En aquest treball, hem abordat aquest fet utilitzant els braquiürs com a model per a la descripció morfològica de l’espermatogènesi i l’estudi de les proteïnes associades a la cromatina dels espermatozoides. Els aspectes més rellevants de l’espermatogènesi són: a) La formació d’un complex i voluminós acrosoma format, en el cas de la cabra de mar, M. brachydactyla, a partir de vesícules originades principalment pel complex de Golgi; b) la formació d’un sistema de membranes a partir del reticle endoplasmàtic, associat a microtúbuls i a pocs mitocondris, que forma un anell en la base de les prolongacions nuclears; c) la fusió de les membranes plasmàtica i nuclear, que donen lloc a una estructura membranosa pentalaminar en algunes regions de la superfície cel·lular i d) la poca condensació que presenta el nucli de l’espermatozoide, a causa de la baixa proporció i la modificació de les histones associades a la cromatina. El procés especial de la fertilització dels gàmetes dels crustacis decàpodes braquiürs posa una sèrie de restriccions estructurals i funcionals en els nuclis espermàtics. És molt possible que entre els crustacis hagin aparegut diferents solucions evolutives a tals restriccions i que no tots els nuclis

90 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

dels espermatozoides dels crancs tinguin una composició igual a la de C. pagurus. No obstant això, la composició d’aquesta cromatina (DNA organitzat en nucleosomes però no en estructures d’ordre superior a causa de l’acetilació de la histona H4, regions àmplies del DNA lliure d’histones) permet comprendre, almenys parcialment, la deformabilitat i fluïdesa del nucli per poder fecundar l’oòcit. AGRAÏMENTS Els autors resten agraïts a Núria Cortadellas i Almudena García, de la Unitat de Microscòpia Electrònica dels Serveis Cientificotècnics de la Universitat de Barcelona, i a Joan Ausió, del Departament de Bioquímica i Microbiologia de la Universitat de Victoria, British Columbia, Canadà. Aquest estudi s’ha realitzat amb el finançament del Departament d’Innovació, Universitats i Empresa i la Xarxa de Referència de Recerca, Desenvolupament i Innovació en Aqüicultura de la Generalitat de Catalunya, la Junta Asesora de Cultivos Marinos (JACUMAR), el Ministeri de Ciència i Innovació (ajut BFU 2005-00123/BMC i el programa Ramón i Cajal ) i el Fons Social Europeu. BIBLIOGRAFIA Adiyodi, K. G.; Anilkumar, R. G. (1988). «Accessory sex glands». A: Adiyodi, K. G.; Adiyodi, R. G. [ed.]. Reproductive biology of invertebrates. Kerala: John Wiley and Sons: 261-318. Bauer, R. T. (1986). «Phylogenetic trends in sperm transfer and storage complexity in decapod crustaceans». J. Crustacean Biol., 6: 313-325. Beninger, P. G.; Elner, R. W.; Foyle, T. P.; Odense, P. H. (1988). «Functional anatomy of the male reproductive system and the female spermatheca in the snow crab Chionoecetes opilio (O. Fabricius) (Decapoda: Majidae) and a hypotheses for fertilization». J. Crustacean Biol., 8: 322-332.

Binford, R. (1913). «The germ-cells and the process of fertilization in the crab, Menippe mercenaria». J. Morphol., 24: 147-201. Bloch, D. P. (1969). «A catalog of sperm histones». Genetics, 61 (supl. 1): 93-111. Brown, G. G. (1966). «Ultrastructural studies of sperm morphology and sperm-egg interaction in the decapod Callinectes sapidus». J. Ultra. Res., 14: 425-440. — (1976). «Scanning electron-microscopical and other observations of sperm fertilization reactions in Limulus polyphemus L. (Merostomata-Xiphosura)». J. Cell. Sci., 22: 547-562. Cuartas, E. I.; Sousa, L. G. (2007). «Ultrastructure study of the spermatophores and spermatozoa in Uca uruguayensis (Decapoda, Brachyura, Ocypodidae)». Biociências, 15: 21-28. Chevaillier, P. (1966a). «Structure et constitution cytochimique de la capsule du spermatozoïde des Crustacés Décapodes». C. R. Acad. Sci. Paris, D262: 1546-1549. — (1966b). «Contribution à l’étude du complexe ADNhistone dans le spermatozoide du pagure Eupagurus bernhardus L. (Crustace Decapode)». J. Microsc., 5: 739-758. — (1967). «Mise en évidence et étude cytochimique d’une protéine basique extranucleaire dans les spermatozoïdes des crustacés decapodes». J. Cell. Biol., 32: 547-556. — (1968). «Etude cytochimique des nucléoprotéins dans le spermatozoide du pagurus Eupagurus ber nhardus (Crustace decapode)». J. Micr., 7: 107-114. — (1969). «Evolution des constituants nucléaires et cytoplasmaiques au cours de la spermatogenèse chez les Crustacés Décapodes». C. R. Acad. Sci. Paris, D269: 2251-2253. Chiba, A.; Kon, T.; Honma, Y. (1992). «Ultrastructure of the spermatozoa and spermatophores of the zuwai crab, Chionoecetes opilio (Majidae, Brachyura)». Acta Zool., 73: 103-108. Diesel, R. (1991). «Sperm competition and the evolution of mating behaviour in Brachyura, with special reference to spider crabs (Decapoda, Majidae)». A: Bauer, R. T.; Martin, J. W. [ed.]. Crustacean sexual biology. Nova York: Columbia University Press: 145-163. Du, N. H.; Lai, W.; Xue, L. H. (1987). «Acrosome reaction of the sperm in the chinese mitten-handed crab, Eriocheir sinensis (Crustacea, Decapoda)». Acta Zool. Sinica, 33: 8-13. Du, N. S.; Lai, W.; An, Y.; Jiang, H. W. (1993). «Studies on the cytology of fertilization in the chinese mitten-handed crab, Eriocheir sinensis (Crustacea, Decapoda)». Sci. China B, 36: 288-296.

L’espermatogènesi en els crancs 91

El-Sherief, S. S. (1991). «Fine structure of the sperm and spermatophores of Portunus pelagicus (L.) (Decapoda, Brachyura)». Crustaceana, 61: 271-279. Estampador, E. P. (1949). «Scylla (Crustacea: Portunidae) II. Comparative studies on spermatogenesis and oogenesis». Philip. Jour. Sci., 78: 95-109. Fasten, N. (1918). «Spermatogenesis of the pacific coast edible crab, Cancer magister Dana». Biol. Bull., 34: 277-307. — (1924). «Comparative stages in the spermatogenesis of various Cancer crabs». J. Morphol., 39: 47-61. — (1926). «Spermatogenesis of the black-clawed crab, Lophopanopeus bellus (Stimpson) Rathburn.». Biol. Bull., 50: 277-293. Felgenhauer, B. E.; Abele, L. G. (1991). «Morphological diversity of decapoda spermatozoa». A: Bauer, R. T.; Martin, J. W. [ed.]. Crustacean sexual biology. Nova York: Columbia University Press, 322-339. Forges, B. R. de; Jamieson, B. G. M.; Guinot, D.; Tudge, C. C. (1997). «Ultrastructure of the spermatozoa of Hymenosomatidae (Crustacea: Brachyura) and the relationships of the family». Mar. Biol., 130: 233-242. Goudeau, M. (1982). «Fertilization in a crab. 1: Early events in the ovary, and cytological aspects of the acrosome reaction and gamete contacts». Tissue & Cell, 14: 97-111. Guinot, D.; Jamieson, B. G. M.; Deforges, B. R. (1994). «Relationship of Homolidae and Dromiidae—Evidence from spermatozoal ultrastructure (Crustacea, Decapoda)». Acta Zool., 75: 255-267. Guinot, D.; Jamieson, B. G. M.; Forges, B. R. de; Tudge, C. C. (1998). «Comparative spermatozoal ultra structure of the three dromiacean families exemplified by Homolodromia kai (Homolodromiidae), Sphaerodromia lamellata (Dromiidae), and Dynomene tanensis (Dynomenidae) (Podotremata: Brachyura)». J. Crustacean Biol., 18: 78-94. Guinot, D.; Jamieson, B. G. M.; Tudge, C. C. (1997). «Ultrastructure and relationships of spermatozoa of the freshwater crabs Potamon fluviatile and Potamon ibericum (Crustacea, Brachyura, Potamidae)». J. Zool., 241: 229-244. Hernandez, W.; Berry, D.; Baccetti, B.; Ahluwalia, B.; Murray, S. A.; Anderson, W. A. (1989). «Remodeling of the nucleocytoplasm as consequence of the acrosomal reaction of the spider crab sperm». J. Submicrosc. Cytol. Pathol., 21: 163-186. Hinsch, G. W. (1969). «Microtubules in the sperm of the spider crab, Libinia emarginata L.». J. Ultra. Res., 29: 525-534. — (1971). «Penetration of the oocyte envelope by spermatozoa in the spider crab». J. Ultra. Res., 35: 86-97.

— (1973). «Sperm structure of Oxyrhyncha». Can. J. Zool., 51: 421-426. — (1986). «A comparison of sperm morphologies, transfer and sperm mass storage between two species of crab, Ovalipes ocellatus and Libinia emarginata». Int. J. Invertebr. Repr. Dev., 10: 79-87. — (1988). «Ultrastructure of the sperm and spermatophores of the golden crab Geryon fenneri and a closely related species, the red crab G. quinquedens, from the eastern gulf of Mexico». J. Crustacean Biol., 8: 340-345. — (1991). «Structure and chemical content of the spermatophores and seminal fluid of reptantian decapods». A: Bauer, R. T.; Martin, J. W. [ed.]. Crustacean sexual biology. Nova York: Columbia University Press: 290-307. Honma, Y.; Ogiwara, M.; Chiba, A. (1992). «Studies on gonad maturity in some marine invertebrates. XII. Light and electron microscope studies on spermatozoa of the land crab, Sesarma haematocheir (de Haan)». Rpt. Sado Mar. Biol. Sta. Niigata Uni., 22: 1321. Jamieson, B. G. M. (1989a). «Ultrastructural comparison of the spermatozoa of Ranina ranina (Oxystomata) and of other crabs exemplified by Portunus pelagicus (Brachygnatha) (Crustacea, Brachyura)». Zoomorphology, 109: 103-111. — (1989b). «A comparison of the spermatozoa of Ora tosquilla stephensoni and Squilla mantis (Crustacea, Stomatopoda) with comments on the phylogeny of the Malacostraca». Zool. Scr., 18: 509-517. — (1989c). «The ultrastructure of the spermatozoa of 4 species of xanthid crabs (Crustacea, Brachyura, Xanthidae)». J. Submicrosc. Cytol. Pathol., 21: 579584. — (1990). «The ultrastructure of the spermatozoa of Petalomera laterali (Gray) (Crustacea, Brachyura, Dromiacea) and its phylogenetic significance». Invertebr. Reprod. Dev., 17: 39-45. — (1991a). «Sperm and phylogeny in the Brachyura (Crustacea)». A: Bacetti, B. [ed.]. Comparative spermatology 20 year after. Nova York: Raven Press: 967972. — (1991b). «UItrastructure and phylogeny of crustacean spermatozoa». Mem. Queensl. Mus., 31: 109142. — (1993a). «Ultrastructure of the spermatozoon of Potamonautes perlatus sidneyii (Heterotremata, Brachyura, Crustacea)». S. Afr. J. Zool., 28: 40-45. — (1993b). «Spermatological evidence for the taxonomic status of Trapezia (Crustacea: Brachyura: Heterotremata)». Mem. Queensl. Mus., 33: 225-234. — (1994a). «Phylogeny of the Brachyura with particular reference to the Podotremata: Evidence from a

92 C. G. Simeó, K. Kurtz, M. Chiva, G. Rotllant i E. Ribes

review of spermatozoal ultrastructure (Crustacea, Decapoda)». Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 345: 373-393. — (1994b). «Phylogeny of the Brachyura with particular reference to the Podotremata (Crustacea, Decapoda)». A: Bradley, M.; Cummins, J. [ed.]. Seventh International Symposium on Spermatology. Cairns (19-20 d’octubre). Jamieson, B. G. M.; Guinot, D. (1996). «The ultrastructure of the spermatozoon of Australocarcinus ripa ris (Crustacea: Brachyura: Trogoplacinae)». Mem. Queensl. Mus., 39: 289-296. Jamieson, B. G. M.; Guinot, D.; Deforges, B. R. (1993a). «The spermatozoon of Calocarcinus africanus (Heterotremata, Brachyura, Crustacea): Ultrastructural synapomorphies with xanthid sperm». Inver tebr. Reprod. Dev., 24: 189-196. — (1993b). «The ultrastructure of the spermatozoon of Paradynomene tuberculata Sakai, 1963 (Crustacea, Brachyura, Dynomenidae): Synapomorphies with dromiid sperm». Helgol. Meeresunters, 47: 311-322. — (1993c). «Spermatozoal ultrastructure in four genera of Homolidae (Crustacea, Decapoda): Exemplified by Homologenus sp., Latreillopsis sp., Homolomannia sibogae and Paromolopsis boasi». Helgol. Meeresunters, 47: 323-334. — (1994b). «Relationships of the Cyclodorippoidea Ortmann—Evidence from Spermatozoal Ultrastructure in the Genera Xeinostoma, Tymolus and Cymonomus (Crustacea, Decapoda)». Invertebr. Reprod. Dev., 26: 153-164. — (1996). «Contrasting spermatozoal ultrastructure in two thoracotreme crabs, Cardisoma carnifex (Gecarcinidae) and Varuna litterata (Grapsidae) (Crustacea: Brachyura)». Invertebr. Reprod. Dev., 29: 111126. — (1994a). «Podotreme affinities of Raninoides sp. and Lyreidus brevifrons: evidence from spermatozoal ultrastructure (Crustacea: Brachyura: Raninoidea)». Mar. Biol., 120: 239-249. — (1995). «Phylogeny of the Brachyura (Crustacea, Decapoda): evidence from spermatozoal ultra structure». Mém. Mus. Natn. Hist. Nat, 166: 265283. Jamieson, B. G. M.; Guinot, D.; Tudge, C. C.; Forges, B. R. de (1997). «Ultrastructure of the spermatozoa of Corystes cassivelaunus (Corystidae), Platepistoma nanum (Cancridae) and Cancer pagurus (Cancridae) supports recognition of the Corystoidea (Crustacea, Brachyura, Heterotremata)». Helgol. Meeresunters, 51: 83-93. Jamieson, B. G. M.; Scheltinga, D. M.; Forges, B. R. de (1998). «An ultrastructural study of spermatozoa of the Majidae with particular reference to the

aberrant spermatozoon of Macropodia longirostris (Crustacea, Decapoda, Brachyura)». Acta Zool., 79: 193-206. Jamieson, B. G. M.; Tudge, C. C. (1990). «Dorippids are Heterotremata: evidence from ultrastructure of the spermatozoa of Neodorippe astuta (Dorippidae) and Portunus pelagicus (Portunidae) Brachyura: Decapoda». Mar. Biol., 106: 347-354. — (2000). «Crustacea-Decapoda». A: Jamieson, B. G. M. [ed.]. Reproductive biology of invertebrates. Nova Delhi: Oxford & IBH Publishing: 1-95. Jamieson, B. G. M.; Tudge, C. C.; Scheltinga, D. M. (1993d). «The ultrastructure of the spermatozoon of Dromidiopsis edwardsi Rathburn, 1919 (Crustacea: Brachyura: Dromiidae): Confirmation of a dromiid sperm type». Aust. J. Zool., 41: 537-548. Krol, R. M.; Hawkins, W. E.; Overstreet, R. M. (1992). «Reproductive components». A: Harrison, F. W.; Humes, A. G. [ed.]. Microscopic anatomy of invertebrates. Nova York: Wiley-Liss, Inc.: 295-343. Kurtz, K.; Martínez-Soler, F.; Ausió, J.; Chiva, M. (2008). «Histones and nucleosomes in Cancer sperm (Decapod: Crustacea) previously described as lacking basic DNA-associated proteins: A new model of sperm chromatin». J. Cell. Biochem., 105: 574-584. Langreth, S. G. (1965). «Ultrastructural observations on sperm of crab Cancer borealis». J. Cell. Biol., 27: A56-A57. — (1969). «Spermiogenesis in cancer crabs». J. Cell. Biol., 43: 575-603. Medina, A. (1992). «Structural modifications of sperm from the fiddler crab Uca tangeri (Decapoda) during early stages of fertilization». J. Crustacean Biol., 12: 610-614. Medina, A.; Rodríguez, A. (1992a). «Spermiogenesis and sperm structure in the crab Uca tangeri (Crustacea, Brachyura), with special reference to the acrosome differentiation». Zoomorphology, 111: 161165. — (1992b). «Structural changes in sperm from the fiddler crab, Uca tangeri (Crustacea, Brachyura), during the acrosome reaction». Mol. Reprod. Dev., 33: 195-201. Mouchet, S. (1931). «Spermatophores des Crustacés Décapodes Anomures et Brachyoures et castration parasitaire chez quelques Pagures». Ann. Sta. Océanogr. Salammbô, VI: 1-203. Murray, S. A.; Gesiotto, J.; Perez, R.; Baccetti, B.; Anderson, W. A. (1991). «Polyethylene-glycol induced fusion of crustacean sperm and rat-liver cells in culture». A: Baccetti, B. [ed.]. Comparative spermatology 20 years after. Nova York: Raven Press: 575579.

L’espermatogènesi en els crancs 93

Nagao, J.; Munehara, H. (2003). «Annual cycle of testicular maturation in the helmet crab Telmessus cheiragonus». Fish. Sci., 69: 1200-1208. Nath, V. (1932). «The spermatid and sperm of the crab Paratelphusa spinigera». Q. J. Microsc. Sci., 75: 543556. Pearson, P. J.; Walker, M. H. (1975). «Alteration of cytochrome-C oxidase activity during spermatogenesis in Carcinus maenas». Cell Tissue Res., 164: 401410. Pochon-Masson, J. (1962). «Le chondriofusome des ga mètes males du Crustacé Décapode Carcinus maenas». C. R. Acad. Sci. Paris, 254: 4076-4078. — (1968). «L’ultrastructure des spermatozoïdes vési cularies chez les crustacés décapodes avant et au cours de leur dévegination expérimentale. I. Bra chyoures et Anomoures». Ann. Sci. Nat. Zool., 10: 1100. Reger, J. F. (1970). «Studies on the fine structure of spermatids and spermatozoa of the crab, Pinnixia sp.». J. Morphol., 132: 89-100. Reger, J. F.; Escaig, F.; Pochon-Masson, J.; Fitzgerald, M. E. C. (1984). «Observations on crab, Carcinus maenas, spermatozoa following rapid-freeze and conventional fixation techniques». J. Ultra. Res., 89: 12-22. Rorandelli, R.; Paoli, F.; Cannicci, S.; Mercati, D.; Giusti, F. (2008). «Characteristics and fate of the spermatozoa of Inachus phalangium (Decapoda, Majidae): Description of novel sperm structures and evidence for an additional mechanism of sperm competition in brachyura». J. Morphol., 269: 259-271. Rotllant, G.; González-Gurriarán, E.; Fernández, L.; Benhalima, K.; Ribes, E. (2007). «Ovarian maturation of the multi-spawning spider crab Maja brachydactyla (Decapoda: Majidae) with special reference to yolk formation». Mar. Biol., 152: 383394. Simeó, C. G.; Kurtz, K.; Chiva, M.; Ribes, E.; Rotllant, G. «Spermatogenesis of the spider crab, Ma-

ja brachydactyla (Decapoda: Brachyura)». [En prepa ració] Simeó, C. G.; Ribes, E.; Rotllant, G. «Internal anatomy and ultrastructure of the male reproductive system of the spider crab Maja brachydactyla (Decapoda: Brachyura)». [En revisió] Subramonian, T. (1991). «Spermatophores and sperm transfer in marine crustaceans». Adv. Mar. Biol., 29: 129-214. Tudge, C. C.; Grellier, P.; Justine, J. L. (1994). «Actin in the acrosome of the spermatozoa of the crab, Cancer pagurus L. (Decapoda, Crustacea)». Mol. Reprod. Dev., 38: 178-186. Tudge, C. C.; Jamieson, B. G. M.; Segonzac, M.; Guinot, D. (1998). «Spermatozoal ultrastructure in three species of hydrothermal vent crab, in the genera Bythograea, Austinograea and Segonzacia (Decapoda, Brachyura, Bythograeidae)». Invertebr. Reprod. Dev., 34: 13-23. Tudge, C. C.; Justine, J. L. (1994). «The cytoskeletal proteins actin and tubulin in the spermatozoa of 4 decapod crabs (Crustacea, Decapoda)». Acta Zool., 75: 277-285. Vaughn, J. C.; Hinsch, G. W. (1972). «Isolation and characterization of chromatin and DNA from the sperm of the spider crab, Libinia emarginata». J. Cell Sci., 11: 131-152. Vaughn, J. C.; Locy, R. D. (1969). «Changing nuclear histone patterns during development. III: The deoxyribonucleic acid content of spermatogenic cells in the crab Emerita analoga». J. Histochem. Cytochem., 17: 591-600. Vaughn, J. C.; Thomson, L. A. (1972). «A kinetic study of DNA and basic protein metabolism during spermatogenesis in the sand crab, Emerita analoga». J. Cell. Biol., 52: 322-337. Yasuzumi, G. (1960). «Spermatogenesis in animals as revealed by electron microscopy: VII. Spermatid differentiation in the crab, Eriocheir japonicus». J. Biophys. Biochem. Cytol., 7: 73-78.

DOI: 10.2436/20.1501.02.60

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 95-107

CONTROL NEUROENDOCRÍ DE L’INICI DE LA MADURESA SEXUAL EN ELS VERTEBRATS MITJANÇANT LA KISSPEPTINA I EL SEU RECEPTOR, AMB ESPECIAL ÈMFASI PEL QUE FA A LA SITUACIÓ EN ELS PEIXOS TELEOSTIS Alejandro S. Mechaly, Jordi Viñas i Francesc Piferrer Institut de Ciències del Mar, Consell Superior d’Investigacions Científiques. Adreça per a la correspondència: Francesc Piferrer. Institut de Ciències del Mar, Consell Superior d’Investigacions Científiques. Passeig Marítim, 37-49. 08003 Barcelona. Adreça electrònica: piferrer@icm.csic.es. RESUM El recent descobriment de la kisspeptina (producte del gen KISS1), conjuntament amb el seu receptor (producte del gen KISS1R), i de la seva relació amb el control de l’inici de la maduresa sexual en tots els vertebrats, ha estat descrit com una de les troballes més rellevants de la biologia reproductiva en els últims anys. La kisspeptina té un efecte directe sobre l’hormona alliberadora de gonadotrofines, la qual desencadena una cascada hormonal que finalment acaba a les gònades amb la secreció dels esteroides sexuals, els quals provoquen la consegüent maduració de l’individu. En aquest treball s’explica el descobriment dels gens KISS1 i KISS1R, l’estructura d’aquests gens i dels seus productes proteics, i es fa referència als mecanismes endocrins responsables tant de la regulació endògena com dels possibles factors externs que afecten el sistema kisspeptina-KISS1R. També, i amb especial èmfasi en els peixos teleostis, es discuteixen les possibles causes de les diferències i similituds trobades en l’expressió cerebral del sistema kisspeptina-KISS1R. Finalment, s’avaluen les perspectives futures en el camp del control de la reproducció mitjançant la manipulació del sistema kisspeptina-KISS1R. Paraules clau: maduresa sexual, kisspeptina, KISS1R, GPR54, GnRH, teleostis.

96 A. S. Mechaly, J. Viñas i F. Piferrer

INVOLVEMENT OF KISSPEPTIN AND ITS RECEPTOR ON THE NEUROENDOCRINE CONTROL OF THE ONSET OF PUBERTY IN VERTEBRATES, WITH SPECIAL EMPHASIS ON THE SITUATION IN TELEOSTS SUMMARY The discovery of kisspeptin (the product of the KISS1 gene) together with its receptor (product of the KISS1R gene), and the relationship with the control of the onset of puberty in all vertebrates has been described as one the most important findings in reproductive biology in the last years. Kisspeptin stimulates gonadotrophin-releasing hormone (GnRH), initiating the hormonal cascade which ends in the gonads with the secretion of the sex steroids which, in turn, drive sexual maturation. This paper describes the origin and discovery of the KISS1 and KISS1R genes, the structure of these genes as well as their protein products. The endocrine mechanisms and the exogenous factors affecting the kisspeptinKISS1R complex are also discussed. Finally, we describe the multiple functions in relationship with this system in all vertebrates and discuss the differences and similarities regarding the neural expression of kisspeptin-KISS1R complex in several teleost fishes. Finally, the future perspectives in the field of the control reproduction by the manipulation of the kisspeptin-KISS1R complex are discussed. Key words: puberty, kisspeptin, KISS1R, GPR54, GnRH, teleosts.

LA KISSPEPTINA I EL SEU RECEPTOR (KISS1R). DESCOBRIMENT I IMPORTÀNCIA EN EL CONTROL DE LA MADURESA SEXUAL L’inici de la maduresa sexual i les seves conseqüències fisiològiques representa una de les transformacions més importants que ocorren al llarg de la vida dels vertebrats i que, a més, comporta una gran complexitat pel que fa a la regulació endocrina. Durant aquest període se succeeixen una sèrie d’interaccions dinàmiques entre factors genètics i ambientals, que conclouen amb la transició d’un sistema reproductor immadur a un de madur. Aquest procés està controlat mitjançant l’acció seqüencial d’hormones que s’originen a l’hipotàlem i que tenen el seu efecte final a les gònades. En

els mamífers, en què el procés és més conegut, el control endocrí s’inicia amb la producció de l’hormona alliberadora de les gonadotrofines (GnRH). A continuació, la GnRH estimula la hipòfisi o glàndula pituïtària, i provoca la secreció de les dues gonadotrofines: l’hormona fol·liculoestimulant (FSH) i l’hormona luteïnitzant (LH). Aquestes gonadotrofines circulen pel sistema vascular fins a arribar a les gònades, les quals comencen a madurar un cop han rebut el senyal de les gonadotrofines a través de receptors de membrana específics. És en aquest darrer procés quan els esteroides sexuals tenen un paper molt important, ja que són els responsables de la maduració final de la gònada. Malgrat que tota aquesta cascada d’esdeveniments és relativament ben coneguda, encara existeixen molts aspectes desconeguts o que es coneixen parcialment.

Control neuroendocrí de l’inici de la maduresa sexual en els vertebrats 97

Per exemple, un dels punts que ha centrat l’atenció els darrers anys ha estat el control neuroendocrí de la secreció de GnRH. L’any 1996 es va aïllar en mamífers el gen anomenat KISS1. Inicialment es va considerar un gen tumoral a causa de la seva capacitat d’inhibir la metàstasi en els melanomes. Per aquest motiu, en els estudis inicials la proteïna producte d’aquest gen es va anomenar metastina (Lee et al., 1999). Paral·lelament, l’any 1999, en estudis duts a

terme en rates es va descobrir un nou receptor de membrana, orfe, associat a la proteïna G, que inicialment es va anomenar GPR54 (Lee et al., 1999). No va ser sinó dos anys més tard que es va establir que el producte proteic del gen KISS era el lligand natural del receptor GPR54 (Kotani et al., 2001; Muir et al., 2001; Ohtaki et al., 2001). En estudis posteriors centrats en el receptor, es va descobrir que certes mutacions i delecions del gen eren responsables de la

Factors fisiològics

Factors ambientals

Nutrició

Fotoperíode

Estrès

Temperatura

Cervell Neurona KISS1 KISS1

Hipotàlem KISS1

KISS1R Neurona GnRH

AVPV Retroalimentació (+)

GnRH

ARC Retroalimentació (–)

Glàndula pituïtària FSH/LH Gònades Gametogènesi Esteroides sexuals (Estradiol i testosterona)

Figura 1. Esquema del mecanisme de regulació neuroendocrí del sistema kisspeptina (KISS1) a través del seu receptor (KISS1R) dins l’eix hipotàlempituïtària-gònada (HPG). AVPV: nucli anteroventral periventricular; ARC: nucli arcuat de l’hipotàlem; GnRH: hormona alliberadora de les gonadotrofines; FSH: hormona fol·liculoestimulant; LH: hormona luteïnitzant.

98 A. S. Mechaly, J. Viñas i F. Piferrer

condició anomenada hipogonadisme hipogonadotròfic (HH) en humans. Aquesta malaltia es caracteritza per la incapacitat de maduració sexual i, en conseqüència, provoca la infertilitat dels individus (Roux et al., 2003; Seminara et al., 2003). Un fenotip similar, d’insuficiència reproductora, també es va observar en ratolins després d’un experiment de desactivació del gen del receptor mitjançant la tècnica de genoanul· lació (knockout) (Funes et al., 2003). A partir de les primeres proves que mostraven que aquest sistema no solament estava relacionat en metàstasi, la proteïna inicialment coneguda com a metastina va passar a anomenar-se, més genèricament, kisspeptina, i el nom del receptor es va canviar de GPR54 a KISS1R. Com s’ha vist, el nom KISS1 es va establir amb anterioritat al fet que es conegués la relació d’aquest gen i el control de la pubertat (Roux et al., 2003; Funes et al., 2003; Seminara et al., 2003). Quant a l’etimologia del nom KISS1, el prefix KI fa referència a una coneguda marca de xocolata, Hershey Chocolate Kiss, originària del mateix lloc on treballaven els investigadors que van descobrir el gen. Les lletres SS fan referència a la supressor sequence, en relació amb la primera funció coneguda del gen, i finalment el nombre 1 no és res més que una convenció en la nomenclatura (Smith et al., 2006). A partir de la relació de KISS1 amb l’inici de la pubertat, alguns el començaren a anomenar «el gen del primer petó», nom interpretable a partir de la traducció de l’anglès de l’acrònim KISS1 (Smith et al., 2006; Tena-Sempere, 2006). L’efecte de mutacions del gen del receptor s’elimina amb l’administració exògena de GnRH (Seminara et al., 2003). En les rates, injeccions intracerebrals de GnRH indueixen la secreció de LH (Matsui et al., 2004; Navarro et al., 2004a) i FSH (Navarro et al., 2005). Estudis addicionals han confirmat la importància el sistema kisspeptina-KISS1R

en la regulació de la GnRH, les gonadotrofines i el control endocrí de la pubertat (Seminara i Kaiser, 2005). Per exemple, l’efecte estimulant de la kisspeptina sobre la secreció de LH s’ha observat amb independència de la dosi, la ruta d’administració i l’estadi de desenvolupament de l’individu (Gottsch et al., 2004; Irwig et al., 2004; Messager et al., 2005). Fins i tot estudis recents han demostrat una resposta heteròloga. En amfibis, i concretament en la granota d’ungles (Xenopus laevis), l’administració de kisspeptina humana també provoca un augment en la secreció de gonadotrofines (Moon et al., 2008). Un efecte similar s’ha observat en els peixos, en què l’administració de kisspeptina de mamífer indueix la producció de RNA missatger (mRNA) del gen de la GnRH (Filby et al., 2008). Tots aquests estudis posen de manifest el paper clau de la kisspeptina i el seu receptor en la regulació de la pubertat (Elizur et al., 2008). A més, aquesta funció de regulació de la reproducció no solament es dóna en mamífers, sinó que està conservada al llarg de l’evolució dels vertebrats. Així, s’ha afirmat que el descobriment de la kisspeptina i del seu receptor és un dels avenços més rellevants en el camp de la biologia de la reproducció des de la caracterització de la GnRH en la dècada dels anys setanta (Messager, 2005). Com a característiques generals, l’expressió del gen KISS1R es localitza en el cervell anterior en les neurones hipotalàmiques responsables de la secreció de GnRH. Aquest fet indica que la kisspeptina, el gen del qual també s’expressa en el cervell, i principalment en l’hipotàlem i els ganglis de la base (Muir et al., 2001), pot actuar directament sobre aquestes neurones. A més, el control neuroendocrí del sistema està lligat a l’expressió diferencial de la kisspeptina entre el nucli anteroventral periventricular (AVPV) i el nucli arcuat (ARC). En aquesta zona del cervell la kisspeptina esti-

Control neuroendocrí de l’inici de la maduresa sexual en els vertebrats 99

mula l’alliberació de GnRH, que desencadena la cascada hormonal fins a les gònades, on es produeixen els esteroides sexuals i, finalment, la gametogènesi. Tot aquest cicle es completa amb una regulació per retroalimentació dels esteroides sexuals cap al cervell, amb una inhibició del gen KISS1 en l’ARC o, també, amb una inducció del mateix gen en l’AVPV (vegeu la figura 1). També s’han destacat diversos factors externs o ambientals que sembla que influeixen en l’alliberació de kisspeptina en l’hipotàlem. Entre aquests es troben la temperatura, el fotoperíode, la nutrició i l’estrès (vegeu la figura 1). Cal destacar que tots aquest factors tenen un cert grau de relació amb l’aparició de la maduresa sexual.

ESTRUCTURA DELS GENS I DE LES PROTEÏNES En l’espècie humana, el gen KISS1 s’estructura en quatre exons i tres introns, amb un total de 438 parells de bases (bp) en la regió codificadora (West et al., 1998). El primer producte d’aquest gen és un precursor de neuropèptid de 145 aminoàcids anomenat KP-145. Aquesta preproteïna conté una seqüència senyal (aminoàcids 1 a 19), dos possibles llocs de clivatge (aminoàcids 57 i 67) i un lloc de clivatge terminal o aminació (aminoàcids 121 a 124) (Kotani et al., 2001; Muir et al., 2001; Ohtaki et al., 2001) (vegeu la figura 2). Segons el lloc on es realitza la modificació proteolítica d’aquesta preproteïna, s’obtenen diferents pèptids, tots anomenats kisspeptina. El de major grandària conté cinquanta-quatre aminoàcids i s’anomena kisspeptina-54 (KP-54). Aquest és el pèptid que originàriament es coneixia com a

DNA genòmic (humans) I 5´

exó 1

III

II exó 2

exó 3

exó 4

3´

Precursor de kisspeptines (KP-145) 1

NH2-

19 20

65 68

121 124

145

-COOH

Senyal 68

121 Kisspeptina-54 (KP-54) 108

121

KP-14 109

121

KP-13 112 121 KP-10

Figura 2. Organització de l’estructura gènica del gen de la kisspeptina (KISS1) en humans. Estructura del pèptid precursor (KP-145) i dels seus productes peptídics (KP-54, KP-14, KP-13 i KP-10). En gris es mostra la regió codificadora. Els aminoàcids de l’1 al 19 corresponen a la seqüència senyal i les X marquen els llocs de clivatge que originen les diferents kisspeptines (modificat de Tena-Sempere, 2006).

100 A. S. Mechaly, J. Viñas i F. Piferrer

metastina. Altres pèptids producte d’aquestes modificacions del mateix precursor són la kisspeptina-14 (KP-14), la kisspeptina-13 (KP-13) i la kisspeptina-10 (KP-10) (Kotani et al., 2001). La KP-10 correspon als últims deu aminoàcids de la KP-54, i sembla que són els més importants en l’activació del receptor KISS1R. Aquests deu aminoàcids estan altament conservats (Stafford et al., 2002). Per la seva importància en la regulació de la maduresa sexual, aquest gen és l’objectiu de molts estudis i s’està trobant cada dia en més espècies. Actualment, la seqüència de KISS1 es coneix en algunes espècies de mamífers, com ara la rata (Rattus norvegicus) (NP_859043), el ratolí (Mus musculus) (NP_839991), els humans (Homo sapiens) (NP_002247), el ximpanzé (Pan troglodytes) (XP_514123), l’orangutan (Pongo pygmaeus) (AY706214), el macaco (Macaca mulatta) (XP_001098284), el hàmster siberià (Phodopus sungorus) (EU365872), l’ovella (Ovis aries) (DQ059506), la vaca (Bos taurus) (XP_872566) i l’opòssum de cua grisa (Monodelphis domestica) (BK006296). La quantitat creixent de seqüències disponibles ha facilitat que darrerament s’hagi pogut clonar el gen KISS1 en un amfibi, la granota d’ungles (Xenopus tropicale) (BK006297). D’altra banda, mitjançant l’anàlisi bioinformàtica i de sintènia, també s’ha pogut clonar i localitzar en dues espècies de peixos teleostis que són espècies model: el medaka, un petit peix habitual als camps d’arròs de l’Orient (Oryzias latipes) (NM_001122921) i el peix zebra (Danio rerio) (NP_001106961) (Kanda et al., 2008; Aerle et al., 2008). Curiosament, en el peix zebra, i a diferència del que s’observa en humans, el gen KISS1 només presenta dos exons i un intró. Aquests dos exons correspondrien als exons 3 i 4 d’aquest gen en els humans (Biran et al., 2008). La major homologia de seqüència es troba en el segment que codifica la KP-10, i aquest és l’únic pèptid descrit fins ara en peixos (Biran et

al., 2008). Un dels resultats recents més sorprenents ha estat el descobriment amb cercadors bioinformàtics d’un gen paràleg de la kisspeptina, el KISS-2, en el peix zebra i el medaka. Aquest fet ha permès que mitjançant una cerca en les seqüències genòmiques també s’identifiquessin in silico els dos gens paràlegs de les kisspeptines, el KISS-1 i el KISS-2, en l’ornitorinc (Ornithorhynchus anatinus) i, curiosament, fins a tres gens en una única espècie com la granota d’ungles (Xenopus tropicalis) (Kitahashi et al., 2008). Felip et al. (2008) han trobat recentment la duplicació gènica de la kisspeptina en una altra espècie de gran importància comercial com és el llobarro (Dicentrarchus labrax). Felip et al. (2008) han clonat els dos gens paràlegs de KISS, KISS-1 i KISS-2, d’aquesta espècie, i també han demostrat que en assaigs amb administració de les dues kisspeptines en el llobarro, la KISS-2 té molta més eficàcia que la KISS-1 en provocar la secreció de FSH i LH, contràriament al que succeeix en rata, en què la KISS-1 és la que presenta més eficàcia. Pel que fa al gen del receptor, el KISS1R, la seva organització genòmica comprèn cinc exons i quatre introns (Clements et al., 2001) (vegeu la figura 3). A diferència del gen de la kisspeptina, l’homologia de la seqüència codificadora és molt més elevada i en totes les espècies està al voltant d’uns 1.200 bp. Gràcies a aquesta gran homologia s’ha pogut identificar aquest gen en moltes espècies. Des del primer clonatge en rates (NP_076482) l’any 1999 (Lee et al., 1999), s’ha anat trobant successivament en l’espècie humana (Homo sapiens) (AAK83235), el ratolí (Mus musculus) (AAK83236), el porc (Sus scrofa) (ABE73453), el gos (Canis lupus familiaris) (XM_850105) i el macaco (Macaca mulatta) (XP_001117198). També s’ha caracteritzat en amfibis, com en la granota bramadora (Rana catesbeiana) (EU681171) i en diverses espècies de peixos teleostis,

Control neuroendocrí de l’inici de la maduresa sexual en els vertebrats 101

com ara la tilàpia del Nil (Oreochromis niloticus) (BAD34454), la llissa (Mugil cephalus) (ABG76790), la còbia (Rachycentron canadum) (ABC75101), el reig del Brasil (Micropogonias undulatus) (DQ347412), el carpí de cap gros (Pimephales promelas) (EF672266), el llenguado senegalès (Solea senegalensis) (EU136710) i el peix zebra (Danio rerio) (ABV44612). Fins ara, l’únic treball que ha confirmat la mateixa estructura gènica que la descrita en humans de cinc exons i quatre introns en un vertebrat no mamífer s’ha realitzat en el llenguado senegalès, en el nostre laboratori (Mechaly et al., 2008). Aquesta mateixa estructura també s’ha pogut deduir en altres espècies de teleostis, però ha estat a partir de la seqüència codificadora i inferint els possibles límits entre introns i exons en els teleostis (Biran et al., 2008; Filby et al., 2007; Mohamed et al., 2007; Nocillado et al., 2007; Parhar et al., 2004).

Així, doncs, l’anàlisi de l’estructura gènica en el llenguado senegalès i en altres espècies de teleostis ha permès confirmar que l’estructura general d’aquest gen és similar a la que ja s’havia observat en humans, i a més s’han afegit noves característiques de l’organització genòmica que prèviament no havien estat descrites en cap altra espècie. D’altra banda, en el nostre estudi amb el llenguado senegalès es va poder observar la presència de dues variants (v) de transcrits de mRNA diferenciats aproximadament en uns 80 bp de grandària. El transcrit curt, Ss KISS1R_v1, va resultar ser de 1.137 bp; en canvi, el transcrit llarg, Ss KISS1R_v2, era de 1.218 bp de grandària. A partir de l’anàlisi de la seqüència nucleotídica d’aquests dos transcrits es va observar que Ss KISS1R_v2 presentava tot l’intró 3, que justament té una longitud de 81 bp. A més, aquest intró presentava seqüències

DNA genòmic (humans) I

5´ exó 1

exó 2

III

exó 3

DNA genòmic (llenguado senegalès) 252 bp

5´

exó 1

exó 2

exó 5

3´

456 bp

129 bp

2.5 kb

exó 4

II 0.2 kb

131 bp

244 bp

exó 3

exó 4 81 bp

381 bp

IV 1.3 kb

exó 5

3´

(Intró III)

RNA missatger (Ss KISS1R_v1) TM 1

5´

TM 2

TM 3

exó 1

exó 2

TM 4 exó 3

TM 5 exó 4

TM 6 TM 7 exó 5

3´

RNA missatger (Ss KISS1R_v2) TM 1

5´

exó 1

TM 2

TM 3 exó 2

TM 4 exon3 3 exó

TM 5 exó 4

TM 6

TM 7

exó 5

3´

Figura 3. Estructura gènica del receptor de la kisspeptina (KISS1R) en mamífers (humans) i en un peix teleosti, el llenguado senegalès. En el llenguado senegalès hi ha dues isoformes del receptor KISS1: una de curta, Ss KISS1R_v1, i una de llarga, originada per la retenció total de l’intró 3 (Ss KISS1R_v2). També s’indiquen els set dominis transmembranosos (TM).

102 A. S. Mechaly, J. Viñas i F. Piferrer Taula 1. Resum dels nivells d’expressió del gen KISS1R en el cervell en diferents espècies de peixos teleostis en els diferents estadis de desenvolupament Maduració Immadur Tilàpia del Nil (Oreochromis niloticus)

Còbia (Rachycentron canadum)

Llissa (Mugil cephalus)

Inicial

Mitjana

Tardana

Madur +++

+++ +++

+++

kiss1ra

+++

kiss1rb

+++

Carpí de cap gros (Pimephales promelas) Peix zebra (Danio rerio)

Llenguado senegalès (Solea senegalensis) Ss KISS1R_v1

Ss KISS1R_v2

+++ indica una elevada expressió del gen, ++ una expressió moderada i + una baixa expressió. La manca de símbol significa que no hi ha resultat per a l’espècie i en l’estadi corresponent

característiques d’un mecanisme d’empalmament alternatiu (alternative splicing); per tant, es pot deduir que les dues isoformes es generen pel mecanisme d’un empalmament alternatiu, amb una retenció de l’intró 3 en la isoforma Ss KISS1R_v2. Una altra prova a favor d’un empalmament alternatiu és la presència de dos codons terminadors en la seqüència aminoacídica de l’insert-intró 3. La generació de mRNA amb codons terminadors s’ha relacionat amb l’empalmament alternatiu, i és un dels mecanismes més importants del control de l’expressió gènica. Per tant, es pot deduir que possiblement la variant llarga, Ss KISS1R_v2, es tradueix a una proteïna truncada i no funcional. En canvi, la variant curta, Ss KISS1R_v1, produeix la proteïna funcional. Aquest resultat és destacable si es considera que aquesta és la primera vegada que es descriu un mecanisme d’empalmament alternatiu en el gen de la KISS1R. Com s’ha esmentat en l’apartat anterior, aquesta proteïna pertany a la

família de receptors associats a una proteïna G. Gairebé totes els gens que codifiquen aquests receptors presenten més d’una isoforma producte d’un empalmament alternatiu (Gottsch et al., 2006). Un altre resultat no esperat, i per ara només observat en peixos, és la presència de dos paràlegs dins d’una espècie. Així, recentment, en el peix zebra s’han trobat dos paràlegs del receptor: el KISS1Ra i el KISS1Rb de peix zebra, que, a més, tenen un comportament d’expressió diferenciat durant la maduresa sexual (vegeu l’apartat següent) i un mecanisme d’acció també diferent. Mentre que KISS1ra té la seva activitat únicament per via d’una proteïna cinasa C (PKC), amb un sistema similar al dels humans, KISS1Rb actua mitjançant la PKC i la proteïna cinasa A (PKA) (Biran et al., 2008).

Control neuroendocrí de l’inici de la maduresa sexual en els vertebrats 103

FUNCIONS ASSOCIADES AL SISTEMA KISSPEPTINA-KISS1R EN VERTEBRATS. DIFERÈNCIES D’EXPRESSIÓ DEL RECEPTOR KISS1 EN EL CERVELL DE PEIXOS TELEOSTIS Com s’ha esmentat anteriorment, molts estudis han relacionat el sistema kisspeptina-KISS1R amb el control neuroendocrí de la reproducció dins l’eix gonadotròfic (Roux et al., 2003; Funes et al., 2003; Seminara et al., 2003). També s’ha vist que en un principi el gen KISS1 es va relacionar amb metàstasis. Concretament, s’ha relacionat amb el càncer de mama, d’ovari, d’esòfag, de tiroides i gàstric. D’altra banda, estudis recents han posat de manifest que aquest sistema no solament té un efecte metastàtic i de control de maduresa sexual. Per exemple, en el gen KISS1 els nivells de mRNA es troben en la placenta (Bilban et al., 2004), però la seva possible relació amb l’embaràs encara és desconeguda (Gottsch et al., 2006). Altres efectes pleotròpics inclouen la regulació de l’ovulació en rates (Navarro et al., 2004b) i la regulació en la secreció d’insulina (Hauge-Evans et al., 2006). De les altres funcions en les quals aparentment el sistema kisspeptina-KISS1R també està relacionat cal destacar que s’han observat importants efectes fisiològics sobre el sistema cardiovascular associat amb la presència d’arteriosclerosi, segurament vinculats a la potent acció vasoconstrictora de la KP-10, -13 i -54 (Mead et al., 2007). Quan ens centrem en peixos, l’anàlisi de la relació entre el sistema kisspeptina-receptor amb el desenvolupament de la maduresa sexual s’ha analitzat mesurant el grau d’expressió gènica del gen del receptor, KISS1R, en el cervell, mitjançant la tècnica de la PCR a temps real. A la taula 1 es resumeixen el nivells d’expressió gènica en els diferents estadis de desenvolupament

puberal (immadurs, en maduració i madurs) de tots els estudis publicats fins ara. Així, en la tilàpia del Nil s’observa un increment d’expressió gènica del receptor entre individus immadurs i individus madurs (Parhar, 2005). També en la còbia s’ha observat un increment dels nivells de mRNA a mesura que avança la maduració (Mohamed et al., 2007). D’altra banda, en la llissa els nivells d’expressió són contraposats. En aquesta espècie l’expressió del receptor és major en els estadis inicials (Nocillado et al., 2007). Un cas similar és el carpí de cap gros, en què també s’ha observat més expressió al començament de la maduresa que no pas en els individus madurs (Filby et al., 2007). En aquests casos, el màxim d’expressió s’ha detectat en els individus al començament de la maduració, i amb un decreixement posterior de l’expressió a mesura que avança aquesta. Curiosament, s’observen discrepàncies en els nivells d’expressió entre els dos gens paràlegs del peix zebra. Mentre que en el gen KISS1Ra de peix zebra els nivells de mRNA baixen significativament entre la fase tardana de la maduresa i la dels individus madurs, el gen KISS1Rb de peix zebra manté els nivells relativament elevats a partir de la fase mitjana de maduració fins a l’estadi madur (Biran et al., 2008). També, s’ha detectat expressió diferencial en les dues isoformes de llenguado senegalès. La isoforma Ss KISS1R_v1 s’expressa més en el cervell; en canvi, la isoforma Ss KISS1R_v2 principalment s’expressa en les gònades (Mechaly et al., 2008). Per tant, i recapitulant tots els resultats que s’han obtingut en diverses espècies de peixos, quan es vol determinar en quin moment del procés de maduració actua la kisspeptina mitjançant l’anàlisi de l’expressió del gen del receptor KISS1R no s’observa cap patró d’expressió que sigui compartit per totes les espècies. Això pot ser degut a la gran diversitat d’estratègies reproductores

104 A. S. Mechaly, J. Viñas i F. Piferrer

en els peixos. Ara bé, també es pot suggerir que aquestes discrepàncies poden ser causades per la presència de diversos gens dins d’una mateixa espècie, com en el cas del peix zebra, o de diverses isoformes producte d’un empalmament alternatiu, com s’ha observat en el llenguado senegalès, i que encara no han estat detectats en la gran majoria d’espècies estudiades. PERSPECTIVES SOBRE L’ESTUDI DEL SISTEMA KISSPETINA-KISS1R I DE LES POSSIBLES APLICACIONS PRÀCTIQUES Com s’ha comentat al principi, la primera funció relacionada amb el sistema kisspeptina-KISS1R tenia relació amb el càncer, i malgrat que posteriorment s’han anat trobat múltiples funcions, totes semblen se-

cundàries quan es comparen amb la gran importància que té la kisspeptina en la regulació de la maduració sexual. Tot i així, i precisament a causa del gran nombre de teixits que expressen el receptor de kisspeptina, és important investigar en quines altres funcions fisiològiques pot estar relacionada. Si ens centrem en el camp de la reproducció, encara queda molta feina per fer. Per exemple, ja es coneix relativament bé l’estructura dels gens de kisspeptina i del seu receptor en diverses espècies, però en canvi, el coneixement sobre la seva regulació encara és molt limitat. Com s’ha vist, sembla que fins i tot entre espècies relativament properes hi pot haver diferències d’expressió segons el moment en què s’examinen els principals teixits relacionats amb la reproducció (cervell i gònades). En aquest sentit, el recent descobriment de gens paràlegs de KISS1R en el peix zebra o diferents isofor-

1.800 1.600

Articles Citacions

1.400 1.200

60 1.000 800 40 600

Nombre de citacions

Nombre d'articles publicats

100

400

200 0

0 2000

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

2008*

Any

Figura 4. Evolució de l’esforç de recerca sobre el sistema kisspeptina-KISS1R des del seu descobriment com a tal el 2001. Es mostren el nombre d’articles publicats i les citacions relacionades, extrets amb una cerca de subjecte amb els mots clau kisspeptin, metastin, gpr54 o KISS1R, fet a la Web of Science de Thomson Reuters. L’asterisc indica que les dades del 2008 són parcials, i inclouen fins al 30 d’octubre.

Control neuroendocrí de l’inici de la maduresa sexual en els vertebrats 105

mes de KISS1R en el llenguado senegalès, que, a més, presenten nivells d’expressió diferents segons el sexe i l’estat de maduració, obre noves vies de recerca en el camp del control de la maduració sexual, i constitueixen dos exemples ben clars de com cada cop més sovint s’inverteix la situació: ara hi ha descobriments en peixos que poden obrir noves vies de recerca en mamífers. Un altre aspecte rellevant que queda per investigar són els canvis ontogènics, i encara un altre més és la relació entre l’activació del receptor i els efectes fisiològics. Des d’un punt de vista més aplicat, i encara que només es tingui en compte que el sistema kisspeptina-KISS1R controla l’inici de la pubertat i s’oblidin així altres possibles funcions, és fàcil apreciar l’interès de moltes companyies farmacèutiques en el desenvolupament d’agonistes i antagonistes de la kisspeptina per aplicar-los en casos d’endarreriment de l’aparició de la pubertat, o bé en la pubertat precoç. A més, com que el sistema kisspeptina-KISS1R sembla que és present en tots els vertebrats, i no solament és aplicable a l’espècie humana, pot tenir interès en el control de la reproducció d’animals domèstics o de producció ramadera. En el cas dels peixos d’interès en aqüicultura seria interessant poder disposar de mètodes per estimular l’alliberament de gonadotrofines endògenes mitjançant la manipulació del sistema kisspeptina-KISS1R. També en peixos s’ha pensat en la possibilitat d’actuar sobre aquest sistema per aconseguir l’efecte contrari, és a dir, el bloqueig del desenvolupament gonadal. Poder crear peixos estèrils amb aquest procediment podria ser molt interessant com a alternativa a la inducció de la triploïdia, fet que podria, per exemple, contribuir a minimitzar l’impacte genètic de l’aqüicultura sobre les poblacions naturals. En resum, el pèptid kisspeptina i el seu receptor, KISS1R, estan presents en tots els

vertebrats. Ambdós s’expressen en el cervell i constitueixen una peça fonamental en la integració d’estímuls, tant endògens com exògens, per al control de la reproducció. La comunitat científica es pregunta com un sistema tan important i central havia pogut passar desapercebut fins fa relativament ben poc. A més, el sistema kisspeptina-KISS1R s’expressa en molts altres llocs del cos, en alguns fins i tot de manera més prominent que en el cervell mateix, i se succeeixen contínuament nous descobriments sobre aquest tema. Des que aquest sistema fou caracteritzat com a tal per primer cop el 2001, hi ha hagut una autèntica explosió, tant en el nombre d’articles com de cites, actualment amb una mitjana de dos nous articles per setmana (vegeu la figura 4). Així, a causa de la seva importància fonamental en el control de la reproducció (però també en moltes altres funcions fisiològiques, en les quals el seu paper encara està pobrament caracteritzat) el sistema kisspeptinaKISS1R seguirà sent de ben segur objecte d’una intensa activitat de recerca arreu del món durant els propers anys. BIBLIOGRAFIA Aerle, R. van; Kille, P.; Lange, A.; Tyler C. R. (2008). «Evidence for the existence of a functional Kiss1/ Kiss1 receptor pathway in fish». Peptides, 29; 57-64. Bilban, M.; Ghaffari-Tabrizi, N.; Hintermann, E.; Bauer, S.; Molzer, S.; Zoratti, C.; Malli, R.; Sharabi, A.; Hiden, U.; Graier, W.; Knofler, M.; Andreae, F.; Wagner, O.; Quaranta, V.; Desoye, G. (2004). «Kisspeptin-10, a KiSS-1/metastin-derived decapeptide, is a physiological invasion inhibitor of primary human trophoblasts». J. Cell Sci., 117: 1319-1328. Biran, J.; Ben-Dor, S.; Levavi-Sivan, B. (2008). «Molecular identification and functional characterization of the Kisspeptin/Kisspeptin receptor system in lower vertebrates». Biol. Reprod., 79: 776-786. Clements, M. K.; McDonald, T. P.; Wang, R. P.; Xie, G. C.; O’Dowd, B. F.; George, S. R.; Austin, C. P.; Liu, Q. Y. (2001). «FMRFamide-related neuropeptides

106 A. S. Mechaly, J. Viñas i F. Piferrer

are agonists of the orphan G-protein-coupled receptor GPR54». Biochem. Biophys. Res. Comm., 284: 1189-1193. Elizur, A. (2008). «The KiSS1/GPR54 system in fish». Peptides. DOI: 10.1016/j.peptides.2008.08.018. Felip, A.; Zanuy, S.; Pineda, R.; Pinilla, L.; Carri llo, M.; Tena-Sempere, M.; Gómez, A. (2008). «Evidence for two distinct KiSS genes in non-placental vertebrates that encode kisspeptins with different gonadotropin-releasing activities in fish and mammals». Mol. Cel. Endocrinol. DOI: 10.1016/ j.mce.2008.11.017. Filby, A. L.; Aerle, R. van; Duitman, J.; Tyler, C. R. (2008). «The kisspeptin/gonadotropin-releasing hormone pathway and molecular signaling of puberty in fish». Biol. Reprod., 78: 278-289. Funes, S.; Hedrick, J. A.; Vassileva, G.; Markowitz, L.; Abbondanzo, S.; Golovko, A.; Yang, S. J.; Monsma, F. J.; Gustafson, E. L. (2003). «The KiSS-1 receptor GPR54 is essential for the development of the murine reproductive system». Biochem. Biophys. Res. Comm., 312: 1357-1363. Gottsch, M. L.; Clifton, D. K.; Steiner, R. A. (2006). «Kisspepeptin-GPR54 signaling in the neuroendocrine reproductive axis». Mol. Cel. Endocrinol., 254: 91-96. Gottsch, M. L.; Cunningham, M. J.; Smith, J. T.; Popa, S. M.; Acohido, B. V.; Crowley, W. F.; Seminara, S.; Clifton, D. K.; Steiner R. A. (2004). «A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse». Endocrinology, 145: 40734077. Hauge-Evans, A. C.; Richardson, C. C.; Milne, H. M.; Christie, M. R.; Persaud, S. J.; Jones P. M. (2006). «A role for kisspeptin in islet function». Diabetologia, 49: 2131-2135. Irwig, M. S.; Fraleyb, G. S.; Smith, J. T.; Acohido, B. V.; Popa, S. M.; Cunningham, M. J.; Gottsch, M. L.; Clifton, D. K.; Steiner, R. A. (2004). «Kisspeptin activation of gonadotropin releasing hormone neurons and regulation of KiSS-1 mRNA in the male rat». Neuroendocrinology, 80: 264-272. Kanda, S.; Akazome, Y.; Matsunaga, T.; Yamamoto, N.; Yamada, S.; Tsukamura, H.; Maeda, K. I.; Oka, Y. (2008). «Identification of KiSS-1 product Kisspeptin and steroid-sensitive sexually-dimorphic kisspeptin neurons in medaka (Oryzias latipes)». Endocrinology, 149: 2467-2476. Kitahashi, T.; Ogawa, S.; Parhar, I. S. (2008). «Cloning and expression of kiss2 in the zebrafish and medaka». Endocrinology. DOI: 10.1210/en.2008-0940. Kotani, M.; Detheux, M.; Vandenbbogaerde, A.; Communi, D.; Vanderwinden, J. M.; Le Poul, E.; Brezillon, S.; Tyldesley, R.; Suarez-Huerta, N.; Vandeput,

F.; Blanpain, C.; Schiffmann, S. N.; Vassart, G.; Parmentier, M. (2001). «The metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes kisspeptins, the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54». J. Biol. Chem., 276: 34631-34636. Lee, D. K.; Nguyen, T.; O’Neill, G. P.; Cheng, R.; Liu, Y.; Howard, A. D.; Coulombe, N.; Tan, C. P.; TangNguyen, A. T.; George, S. R.; O’Dowd, B. F. (1999). «Discovery of a receptor related to the galanin receptors». Febs Lett., 446: 103-107. Matsui, H.; Takatsu, Y.; Kumano, S.; Matsumoto, H.; Ohtaki, T. (2004). «Peripheral administration of metastin induces marked gonadotropin release and ovulation in the rat». Biochem. Biophys. Res. Comm., 320: 383-388. Mead, E. J.; Maguire, J. J.; Kuc, R. E.; Davenport, A. P. (2007). «Kisspeptins are novel potent vasoconstrictors in humans, with a discrete localization of their receptor, G protein-coupled receptor 54, to atherosclerosis-prone vessels». Endocrinology, 148: 140-147. Mechaly, A. S.; Viñas, J.; Piferrer, F. (2008). «Identification of two isoforms of the Kisspeptin-1 receptor (kiss1r) generated by alternative splicing in a modern teleost, the Senegalese sole (Solea senegalensis)». Biol. Reprod., 80. DOI: 10.1095/biolreprod.108.072173. Messager, S. (2005). «Kisspeptin and its receptor: New gatekeepers of puberty». J. Neuroendocrinol., 17: 687-688. Messager, S.; Chatzidaki, E. E.; Ma, D.; Hendrick, A. G.; Zahn, D.; Dixon, J.; Thresher, R. R.; Malinge, I.; Lomet, D.; Carlton, M. B. L.; Colledge, W. H.; Caraty, A.; Aparicio, S. A. J. R. (2005). «Kisspeptin directly stimulates gonadotropin-releasing hormone release via G protein-coupled receptor 54». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 1761-1766. Mohamed, J. S.; Benninghoff, A. D.; Holt, G. J.; Khan, I. A. (2007). «Developmental expression of the G protein-coupled receptor 54 and three GnRH mRNAs in the teleost fish cobia». J. Mol. Endocrinol., 38: 235-244. Moon, J. S.; Lee, Y. R.; Oh, D. Y.; Hwang, J. I.; Lee, J. Y.; Kim, J.; Vaudry, H.; Kwon, H. B.; Seong, Y. (2008). «Molecular cloning of the bullfrog kisspeptin receptor GPR54 with high sensitivity to Xenopus kisspeptin». Peptides. DOI: 10.1016/j.peptides. 2008.04.015 Muir, A. I.; Chamberlain, L.; Elshourbagy, N. A.; Michalovich, D.; Moore, D. J.; Calamari, A.; Sze keres, P. G.; Sarau, H. M.; Chambers, J. K.; Murdock, P.; Steplewski, K.; Shabon, U.; Miller, J. E.; Middleton, S. E.; Darker, J. G.; Larminie, C. G. C.; Wilson, S.; Bergsma, D. J.; Emson, P.; Faull, R.;

Control neuroendocrí de l’inici de la maduresa sexual en els vertebrats 107

Philpott, K. L.; Harrison, D. C. (2001). «AXOR12, a novel human G protein-coupled receptor, activated by the peptide KiSS-1». J. Biol. Chem., 276: 2896928975. Navarro, V. M.; Castellano, J. M.; Fernandez-Fer nandez, R.; Barreiro, M. L.; Roa, J.; Sanchez-Criado, J. E.; Aguilar, E.; Dieguez, C.; Pinilla, L.; Tena-Sempere, M. (2004a). «Developmental and hormonally regulated messenger ribonucleic acid expression of KiSS-1 and its putative receptor, GPR54, in rat hypothalamus and potent luteinizing hormone-releasing activity of KiSS-1 peptide». Endocrinology, 145: 4565-4574. Navarro, V. M.; Castellano, J. M.; Fernandez-Fer nandez, R.; Tovar, S.; Roa, J.; Mayen, A.; Barreiro, M. L.; Casanueva, F. F.; Aguilar, E.; Dieguez, C.; Pinilla, L.; Tena-Sempere, M. (2005). «Effects of KiSS-1 peptide, the natural ligand of GPR54, on follicle-stimulating hormone secretion in the rat». Endocrinology, 146: 1689-1697. Navarro, V. M.; Fernandez-Fernandez, R.; Caste llano, J. M.; Roa, J.; Mayen, A.; Barreiro, M. L.; Gaytan, F.; Aguilar, E.; Pinilla, L.; Dieguez, C.; Tena-Sempere, M. (2004b). «Advanced vaginal opening and precocious activation of the reproductive axis by KiSS-1 peptide, the endogenous ligand of GPR54». J. Physiol. (London), 561: 379-386. Nocillado, J. N.; Levavi-Sivan, B.; Carrick, F.; Elizur, A. (2007). «Temporal expression of G-protein-coupled receptor 54 (GPR54) gonadotropin-releasing hormones (GnRH), and dopamine receptor D2 (drd2) in pubertal female grey mullet, Mugil cephalus». Gen. Comp. Endocrinol., 150: 278-287. Ohtaki, T.; Shintani, Y.; Honda, S.; Matsumoto, H.; Hori, A.; Kanehashi, K.; Terao, Y.; Kumano, S.; Takatsu, Y.; Masuda, Y.; Ishibashi, Y.; Watanabe, T.; Asada, M.; Yamada, T.; Suenaga, M.; Kitada, C.; Usuki, S.; Kurokawa, T.; Onda, H.; Nishimura, O.; Fujino, M. (2001). «Metastasis suppressor gene KiSS-1 encodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor». Nature, 411: 613-617.

Parhar, I. S.; Ogawa, S.; Sakuma, Y. (2004). «Laser-captured single digoxigenin-labeled neurons of gonadotropin-releasing hormone types reveal a novel g protein-coupled receptor (Gpr54) during maturation in cichlid fish». Endocrinology, 145: 3613-3618. Roux, N. de; Genin, E.; Carel, J. C.; Matsuda, F.; Chaussain, J. L.; Milgrom, E. (2003). «Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 10972-10976. Seminara, S. B.; Kaiser U. B. (2005). «New gatekeepers of reproduction: GPR54 and its cognate ligand, KiSS-1». Endocrinology, 146: 1686-1688. Seminara, S. B.; Messager, S.; Chatzidaki, E. E.; Thresher, R. R.; Acierno, J. S.; Shagoury, J. K.; BoAbbas, Y.; Kuohung, W.; Schwinof, K. M.; Hendrick, A. G.; Zahn, D.; Dixon, J.; Kaiser, U. B.; Slaugenhaupt, S. A.; Gusella, J. F.; O’Rahilly, S.; Carlton, M. B. L.; Crowley, W. F.; Aparicio, S. A. J. R.; Colledge, W. H. (2003). «The GPR54 gene as a regulator of puberty». New Engl. J. Med., 349: 16141627. Smith, C. W. J.; Valcarcel, J. (2000). «Alternative premRNA splicing: the logic of combinatorial control». Trends Biochem. Sci., 25: 381-388. Smith, J. T.; Clifton, D. K.; Steiner R. A. (2006). «Regulation of the neuroendocrine reproductive axis by kisspeptin-GPR54 signaling». Reproduction, 131: 623-630. Stafford, L. J.; Xia, C. Z.; Ma, W. B.; Cai, Y.; Liu, M. Y. (2002). «Identification and characterization of mouse metastasis-suppressor KiSS1 and its G-protein-coupled receptor». Cancer Res., 62: 5399-5404. Tena-Sempere, M. (2006). «GPR54 and kisspeptin in reproduction». Human Reprod. Update, 12: 631-639. West, A.; Vojta, P. J.; Welch, D. R.; Weissman, B. E. (1998). «Chromosome localization and genomic structure of the KiSS-1 metastasis suppressor gene (KISS1)». Genomics, 54: 145-148.

DOI: 10.2436/20.1501.02.61

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 109-127

DESXIFRANT LA BASE MOLECULAR DE LA FORMACIÓ DE L’OU EN ELS PEIXOS MARINS Joan Cerdà Laboratori Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries, Institut de Ciències del Mar (CSIC). Adreça per a la correspondència: Joan Cerdà. Laboratori IRTA, Institut de Ciències del Mar (CSIC). Passeig Marítim, 37-49. 08003 Barcelona. Adreça electrònica: joan.cerda@irta.cat. RESUM La hidratació de l’oòcit de peixos marins durant les darreres fases de la formació de l’ou és un factor crític per al desenvolupament i supervivència correctes de l’embrió. No obstant això, encara que s’ha avançat molt en el coneixement dels mecanismes que controlen la maduració meiòtica dels oòcits de peixos, els mecanismes moleculars implicats en la hidratació són molt desconeguts. En aquest treball es revisen estudis que han identificat els principals efectors osmòtics durant la hidratació de l’oòcit de peixos, així com els darrers treballs que han descobert per primera vegada la funció d’un nou canal molecular d’aigua (aquaporina, AQP) durant aquest procés. El canal descobert, anomenat aquaporina-1b (Aqp1b), pertany a una nova subfamília d’AQP, similars a l’aquaporina-1 (AQP1) de mamífers, que ha evolucionat específicament en teleostis possiblement per duplicació gènica, seguida d’una divergència estructural de l’extrem carboxiterminal de la proteïna, amb adquisició de dominis reguladors del transport intracel·lular, i la neofuncionalització posterior en oòcits, per al transport d’aigua. Aquests estudis estan contribuint, per tant, a desxifrar la base molecular de la producció d’ous viables en peixos marins. Paraules clau: teleostis, oòcit, hidratació, proteïnes del vitel, aquaporina. SUMMARY The hydration of the oocyte of marine fish during the last stages of egg formation is a critical factor for the correct development and survival of the embryo. However, although increasing information is available on the mechanisms that control meiotic maduration in fish oocytes, the identification of the molecular mechanisms involved in oocyte hydration remain elusive. In this work, I review the studies that have identified the main osmotic effectors playing a role during oocyte hydration, as well as recent works that have discovered

110 J. Cerdà

for first time the function of a novel molecular water channel (aquaporin, AQP) during this process. This channel, called aquaporin-1b (Aqp1b), belongs to a new subfamily of AQPs, similar to the mammalian aquaporin-1 (AQP1), that has evolved specifically in teleosts possibly by gene duplication, followed by structural divergence at the C terminus of the protein and acquisition of regulatory domains for the control of intracellular transport, and further neofunctionalization in oocytes for water uptake. These studies are thus contributing to uncover the molecular basis of the production of viable eggs in marine fish. Key words: teleosts, oocyte, hydration, yolk proteins, aquaporin. INTRODUCCIÓ Com en altres vertebrats inferiors, els oòcits de teleostis passen una sèrie d’etapes de desenvolupament dins de l’ovari, que culminen eventualment en la producció d’un gàmeta femení madur o ou. Durant la majoria d’aquest temps la meiosi en els oòcits està detinguda en la profase i, i les despeses energètiques es concentren en la síntesi i la incorporació de diverses substàncies (p. ex., la vitel·logenina) que són essencials per al desenvolupament tant de l’oòcit com del futur embrió. Després d’aquesta etapa de creixement de l’oòcit, la meiosi és activada per senyals hormonals, i llavors es «trenca» el nucli de l’oòcit, la meitat dels cromosomes són eliminats en un petit corpuscle polar mitjançant la citocinesi, i la resta s’alinea en una segona metafase meiòtica en el pol animal. Durant aquest procés, anomenat maduració meiòtica, o simplement maduració, generalment té lloc l’ovulació, és a dir, l’alliberament de l’oòcit madur de les capes de cèl·lules somàtiques (fol·liculars) que l’envolten. Poc després, arriba la segona metafase meiòtica, i aleshores l’oòcit esdevé capaç de ser fertilitzat i, per tant, es converteix en un ou. Els oòcits de teleostis marins experimenten un augment de volum molt significatiu com a conseqüència de l’entrada massiva d’aigua durant el procés de maduració meiòtica. Aquest mecanisme fisiològic de teleostis marins, únic entre vertebrats, co-

negut com hidratació de l’oòcit, va ser descrit fa més de cent anys (Fulton, 1898), encara que els mecanismes moleculars i cel·lulars implicats han estat ignorats durant molt de temps. No obstant això, ara es reconeix que aquest procés té implicacions fisiològiques i ecològiques molt importants, especialment en teleostis pelàgics, en els quals l’alt contingut en aigua dels ous contribueix a la flotabilitat en aigua de mar, fet que facilita l’intercanvi d’oxigen amb l’atmosfera i la dispersió dels ous i embrions en l’oceà, i això n’augmenta la supervivència (Craik i Harvey, 1987; Mellinger, 1994; Nissling et al., 2003). Tanmateix, l’elevada hidratació dels ous i embrions de peixos marins, encara que necessària per al seu desenvolupament, complica enormement els mètodes de congelació (criopreservació), i aquesta és una de les raons que han fet que aquests mètodes, que facilitarien la creació de bancs genètics i programes de selecció genètica en peixos, no hagin estat encara desenvolupats. Per tant, el procés d’hidratació de l’oòcit de peixos té també un gran interès en biotecnologia i aqüicultura. Durant els últims anys una quantitat considerable d’estudis han contribuït notablement al coneixement dels mecanismes que creen les condicions osmòtiques necessàries en l’oòcit de peixos marins per a l’entrada d’aigua. No obstant això, no ha estat fins recentment que han estat esbrinats els mecanismes cel·lulars responsables del ràpid transport d’aigua a l’oòcit, i això ha fornit

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins 111

informació nova sobre la base molecular de la formació dels ous de peixos marins. En aquest treball, tots aquests estudis són revisats, i es presenten dades recents que suggereixen per primera vegada que la hidratació de l’oòcit de peixos durant la maduració és, de fet, un procés altament controlat. MADURACIÓ I HIDRATACIÓ DE L’OÒCIT DELS PEIXOS La maduració dels oòcits en els peixos està regulada pels esteroides inductors de la maduració (MIS), com la 17α,20β-dihidroxiprogesterona, la qual és produïda per les cèl·lules fol·liculars que envolten l’oòcit en resposta a l’hormona luteïnitzant (LH). El MIS interacciona amb un receptor de membrana de l’oòcit i estimula les vies intracel· lulars que provoquen l’activació de la meiosi mitjançant l’activació del factor promotor de la maduració (MPF) (revisat per Suwa i Yamashita, 2007). A diferència d’altres vertebrats, el 67-75 % del volum final de l’ou dels teleostis s’obté durant la maduració, a causa de la captació d’aigua (vegeu la figura 1). El contingut en aigua dels oòcits madurs en les espècies que produeixen ous molt hidratats i flotants (ous pelàgics), que s’anomenen pelagòfiles (pràcticament només espècies marines), pot contribuir fins al 9095 % del seu pes. Les espècies que produeixen ous poc hidratats, amb una flotabilitat nul·la o molt reduïda (demersals) es denominen bentòfiles (espècies d’aigua dolça i algunes espècies marines). Els aminoàcids lliures com a efectors osmòtics Fa aproximadament vint anys, Wallace et al. van descriure per primera vegada en el fúndul (Fundulus heteroclitus) el procés d’hi-

dròlisi de les proteïnes del vitel de l’oòcit, que ocorre específicament durant la maduració i hidratació (Wallace i Selman, 1985; Wallace i Begovac, 1985). Aquest mecanisme d’hidròlisi, únic en vertebrats ovípars, s’ha observat després en moltes altres espècies de teleostis (vegeu la figura 2), però és especialment més pronunciat en les espècies pelagòfiles marines (revisat per Cerdà et al., 2007). Thorsen et al. (1996) van observar que existeix un perfil similar d’abundància d’aminoàcids entre els aminoàcids lliures disponibles (free amino acids, FAA) dels ous i algunes proteïnes del vitel de l’oòcit, fet que indica que els FAA s’originen molt probablement a partir d’aquestes proteïnes. En algunes espècies s’ha demostrat que els processos d’hidròlisi i acumulació de FAA tenen una correlació positiva amb el contingut d’aigua dels ous, i això confirma el paper dels FAA com a efectors osmòtics durant la hidratació de l’oòcit (Cerdà et al., 2007). Hi ha, a més, una sèrie d’evidències que donen suport a aquesta hipòtesi. En primer lloc, s’ha observat que algunes espècies pelagòfiles que viuen en zones del mar Bàltic amb salinitat oscil·lant poden ajustar la flotabilitat dels ous mitjançant el control de la hidròlisi del vitel i la consegüent producció de FAA, i d’aquesta manera es regula la hidratació i la flotabilitat dels ous (Thorsen et al., 1996). En segon lloc, els ous no flotants de peixos pelagòfils que es produeixen sovint quan s’indueix la reproducció mitjançant tractaments hormonals mostren un contingut menor de FAA i aigua que els ous flotants (p. ex., Seoka et al., 2003). Finalment, s’ha demostrat que la inhibició de la hidròlisi del vitel durant la maduració in vitro de l’oòcit bloca la producció de FAA i redueix la hidratació (Selman et al., 2001; Fabra et al., 2006) (vegeu la figura 3). No obstant això, cal assenyalar que generalment només la meitat de l’osmolaritat dels ous pelàgics pot ser atribuïda als

112 J. Cerdà

FAA i, per tant, l’acumulació d’altres compostos de baix pes molecular podria tenir també una funció osmòtica (vegeu més endavant). Processament de les proteïnes del vitel En teleostis, igual que en altres vertebrats ovípars, la vitel·logenina (Vg) és produïda en el fetge en resposta a estrògens, secretada a la circulació sanguínia i incorporada per l’oòcit mitjançant un procés d’endocitosi mitjançada per receptor, seguida del processament en proteïnes del vitel (revisat per Babin et al., 2007). La seqüència d’aminoàcids de les Vg pot dividir-se en una sèrie de dominis localitzats de manera lineal en la seqüència: NH2-cadena pesada de lipovitel·lina (LvH)-fosvitina (domini poliserina)-cadena lleugera de lipovitel·lina (LvL)-component β´(β´–C)–COOH (vegeu la figura 4a). Cadascun dels dominis de les Vg

correspon a les diferents proteïnes del vitel, lipovitel·lines (lipoproteïnes), fosvitines i fosvetes (proteïnes molt fosforilades) i el β´–C, les quals són emmagatzemades per l’oòcit en grànuls o glòbuls distribuïts pel citoplasma. Estudis recents indiquen que en teleostis i altres vertebrats inferiors existeixen almenys tres Vg diferents, una sense el domini fosvitina, i totes són incorporades per l’oòcit. Durant la maduració de l’oòcit de teleostis marins les proteïnes del vitel són processades una vegada més, i generen FAA i pèptids petits. Durant aquest procés els glòbuls de vitel es fusionen i formen eventualment una gran massa central de vitel líquid. Al mateix temps les estructures cristal·lines dels glòbuls de vitel es disgreguen, fet que confereix als oòcits madurs la característica transparència (vegeu la figura 1, estat 4). La hidròlisi de les proteïnes del vitel durant la maduració de l’oòcit, però, és diferent per a cada tipus de proteïna (Cerdà et

Figura 1. Fotografies de fol·licles ovàrics (oòcits envoltats de les cèl·lules fol·liculars) de teleostis durant la maduració. a) Fol·licles d’una espècie pelagòfila, l’orada (Sparus aurata) (barra: 200 μm); b) fol·licles d’una espècie bentòfila, el fúndul (Fundulus heteroclitus); la fletxa indica el nucli de l’oòcit (barra: 500 μm). 1: oòcits postvitel·logènics just abans de la maduració; 2-3: oòcits en maduració; 4: oòcits madurs abans de l’ovulació.

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins 113

al., 2007). En l’oòcit postvitel·logènic d’espècies pelagòfiles, existeixen dues molècules de LvH, LvH1 i LvH2, derivades de la Vg1

Figura 2. Perfil electroforètic de les proteïnes del vitel en oòcits i ous de fúndul (a) i orada (b). Les proteïnes del vitel han estat acolorides amb el colorant blau Coomassie i detectades mitjançant transferència western amb un anticòs antivitel· logenina. Les puntes de fletxa indiquen lipovitel·lines d’aproximadament 122 i 103 kDa en el fúndul i l’orada, respectivament. Les fletxes indiquen pèptids més petits que possiblement resulten de la hidròlisi de les lipovitel·lines. Els valors de massa molecular estan indicats a l’esquerra en kDa, i el volum dels oòcits i els ous (en mm 3) per a cada espècie apareixen sota cada panell.

i la Vg2 (també denominades VgA i VgB), respectivament (vegeu la figura 4b). Durant la maduració de l’oòcit la proteïna LvH2 és dissociada en dos monòmers, mentre que la LvH1 és hidrolitzada completament per produir FAA. Les fosvitines i el β–C són també molt degradats durant la maduració, mentre que les LvL1 i LvL2 són només hidrolitzades parcialment. D’aquesta manera, la degradació de la LvH1 contribueix fonamentalment a la disponibilitat de FAA emprats per a la hidratació de l’oòcit, mentre que les LvH2 i la LvL romanen emmagatzemades en l’oòcit, possiblement com a font de nutrients per al desenvolupament embrionari posterior. La Vg, que no té el domini fosvitina, solament s’hidrolitza lleugerament durant la maduració i, per tant, no sembla que contribueixi a la hidratació de l’oòcit o en la generació de nutrients. En espècies bentòfiles, com el fúndul, en què també s’han trobat dos Vg diferents, el model d’incorporació de Vg i el processament de les proteïnes derivades és diferent (vegeu la figura 4B). En aquesta espècie, els oòcits postvitel·logènics presenten dues LvH1 d’elevat pes molecular (de 122 i 103 kDa) derivades de la Vg1, mentre que la Vg2 sembla que s’incorpora molt poc en els oòcits. Durant la maduració, només la LvH1 de 122 kDa i les fosvitines són degradades, i la reserva de FAA augmenta només lleugerament. En peixos pelagòfils, les LvH1 i LvH2 cobreixen la mateixa regió dels seus corresponents precursors (Vg1 i Vg2), fet que indica que aquestes proteïnes poden estar subjectes als mateixos mecanismes de proteòlisi. No obstant això, com ja s’ha esmentat, durant la maduració i hidratació de l’oòcit la LvH1 es degrada completament, mentre que la LvH2 només es processa parcialment. Una situació similar ocorre en el fúndul, en què les dues LvH1 es processen de manera diferent. Aquesta hidròlisi

114 J. Cerdà

diferencial de les LvH podria estar relacionada amb diferències en la seqüència d’aminoàcids, en la seva estructura secundària, o amb una compartimentació diferent a l’interior dels glòbuls de vitel, fet que permetria a les proteases (catepsines) distingir entre les dues LvH (revisat per Cerdà et al., 2007). No obstant això, els mecanismes intracel·lulars específics per a l’activació de les catepsines i el processament diferencial de les LvH en l’oòcit dels peixos romanen encara desconeguts. Ions inorgànics i altres efectors osmòtics de baix pes molecular En espècies bentòfiles diversos estudis han proporcionat proves del paper dels ions inorgànics com a efectors osmòtics principals durant la hidratació de l’oòcit (Cerdà et al., 2007). En el fúndul, tant el K+ com el Na+ estan presents en concentracions relativament elevades, tant en fol·licles ovàrics just

després de la maduració com en ous no fertilitzats, i aquestes concentracions són més elevades que les de FAA. Experiments in vitro, però, han demostrat que en aquesta espècie la hidratació de l’oòcit és estrictament dependent de la concentració de K+ en el medi de cultiu, i això suggereix que aquest ió és el principal responsable de la hidratació. No obstant això, durant la maduració de l’oòcit d’altres espècies bentòfiles que es reprodueixen en aigua dolça o en àrees de baixa salinitat, com l’ayu (Plecoglossus altivelis), només s’observa un augment de Na+ durant la maduració (Chen et al., 2003). En espècies pelagòfiles, el K+ també s’ha relacionat amb l’augment de l’osmolaritat dels oòcits durant la hidratació. En dues espècies de reig, Micropogonias undulatus i Cynoscion nebulosus, LaFleur i Thomas (1991) van detectar un augment de K+ durant la maduració de l’oòcit, encara que també es va trobar un increment de Mg2+ i Ca2+. Igual que en el fúndul, la hidratació de l’oòcit in vitro en aquestes espècies és dependent de

Figura 3. Hidròlisi de les proteïnes del vitel, generació de FAA i hidratació de l’oòcit en teleostis pelagòfils. a) Transferència western de les proteïnes del vitel de l’orada. Fol·licles amb oòcits immadurs (carril 1) i fol·licles estimulats amb MIS en absència (carril 2) o presència d’1, 10 i 100 nM de bafilomicina A1 (BA1), un inhibidor de l’ATPasa vacuolar (V-ATPasa) (carrils 3, 4 i 5, respectivament). Les proteïnes del vitel són detectades utilitzant un anticòs anti-Vg. La punta de fletxa indica que la degradació d’una proteïna del vitel d’aproximadament 100 kDa, possiblement lipovitel·lina, és inhibida pel tractament amb BA1. La posició (barres) dels marcadors de pes molecular és indicat a l’esquerra (de dalt a baix: 200, 116, 97, 66, 45 i 29 kDa). b) Efecte de BA1 sobre la generació de FAA durant la maduració de l’oòcit induïda amb gonadotrofina coriònica humana (hCG) en Centropristis striata. c) El tractament de fol·licles amb BA1 i concanamicina A (ConA), un altre inhibidor de la V-ATPasa, inhibeix la hidratació dels oòcits de l’orada. Les dades en b i c són de Selman et al. (2001).

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins 115

la concentració de K+ en el medi de cultiu. En altres espècies també s’ha determinat que la quantitat absoluta de K+ en els oòcits madurs és de dues a sis vegades més elevada que la de Na+ (Selman et al., 2001; Fabra et al., 2006). No obstant això, estudis en l’ha-

libut atlàntic (Hippoglossus hippoglossus) demostren que no solament el K+ contribueix a l’augment de l’osmolaritat de l’oòcit, sinó també el Cl–, l’amoni total (NH4+) i el fòsfor inorgànic (Pi) (Finn et al., 2002). En aquesta espècie, i possiblement en altres teleostis

Figura 4. Processament de les vitel·logenines (Vg) 1 i 2, i de les proteïnes del vitel derivades de cadascuna, durant el creixement i maduració de l’oòcit. a) Esquema de l’organització dels diferents dominis en la seqüència de les Vg: cadena pesada de la lipovitel·lina (LvH), fosvitina (Pv), cadena lleugera de la lipovitel·lina (LvL), i component β´(β´–C). b) Dibuix amb les alteracions de Vg1, Vg2 i proteïnes del vitel en teleostis pelagòfils (dalt) i bentòfils (baix). Les línies de punts indiquen vies d’hidròlisi hipotètiques. La hidròlisi de les proteïnes del vitel produeix un augment dels aminoàcids lliures (FAA) en l’interior de l’oòcit, d’aproximadament dotze i tres ordres de magnitud en espècies pelagòfiles i bentòfiles, respectivament. Les masses moleculars aparents determinades amb electroforesi s’indiquen entre parèntesis (modificat de LaFleur et al., 2005).

116 J. Cerdà

pelagòfils, els FAA derivats de la hidròlisi del vitel contribueixen aproximadament al 50 % de l’osmolaritat de l’oòcit, mentre que els ions, com K+, Cl–, Pi i NH4+, completarien el 50 % restant. Els mecanismes de transport i acumulació d’ions en l’oòcit dels peixos són, però, molt desconeguts. En algunes espècies, mitjançant experiments in vitro amb inhibidors específics, s’ha suggerit la funció d’ATPases Na+ i K+, encara que la localització cel· lular d’aquests enzims o la seva regulació hormonal no ha estat encara demostrada (LaFleur i Thomas, 1991; Chen et al., 2003). En el fúndul, contràriament, no s’han obtingut evidències de l’acció d’ATPases Na+ i K+ durant la hidratació de l’oòcit (Wallace et al., 1992). En aquesta espècie, la comunicació intercel·lular entre l’oòcit i les cèl·lules fol· liculars a través de les unions gap s’ha demostrat que és essencial per a la hidratació, fet que suggereix que aquests canals són emprats per al transport de K+ cap a l’oòcit (Wallace et al., 1992; Cerdà et al., 1993). LES AQUAPORINES I EL SEU PAPER EN LA HIDRATACIÓ DE L’OÒCIT Durant molt temps s’ha assumit que el transport d’aigua a l’oòcit durant la maduració ocorria per simple difusió a través de les membranes lipídiques seguint el gradient osmòtic creat per l’acumulació d’ions i FAA. Tanmateix, el descobriment dels canals moleculars d’aigua, o aquaporines (AQP), en pràcticament tots els organismes vius (King et al., 2004) ha portat recentment a investigar amb més detall els mecanismes moleculars implicats en la hidratació de l’oòcit de teleostis marins.

Estructura i funció de les AQP Les AQP són proteïnes de la membrana cel·lular d’uns 250-300 aminoàcids, que transporten aigua segons la direcció del gradient osmòtic. Molt hidrofòbiques, aquestes proteïnes s’organitzen en sis segments d’estructura α-hèlix que travessen la membrana de costat a costat, units per cinc llaços connectors (A-E) (vegeu la figura 5). Dos dels llaços (un d’extracel·lular, E, i un altre d’intracel·lular, B) es pleguen cap a la membrana i s’aproximen per formar el canal per on passa l’aigua (King et al., 2004). Aquest particular plegament, en forma de rellotge de sorra, posa en contacte els triplets asparagina-prolina-alanina (NPA) per formar el lloc més estret del canal. En el llaç E, proper al triplet NPA, es troba una cisteïna, que és la responsable de la sensibilitat de moltes AQP a compostos de mercuri. Encara que cada AQP constitueix per si sola un canal, aquestes proteïnes poden acoblar-se en grups de quatre en la membrana cel·lular. Actualment es coneixen tretze AQP diferents en mamífers, mentre que les plantes presenten la major varietat, amb trenta-cinc representants (King et al., 2004; Chrispeels et al., 2001). Sobre la base de les propietats de permeabilitat de les AQP quan s’expressen artificialment en oòcits de la granota Xenopus laevis, es poden dividir en dos subgrups: les que són només permeables a l’aigua (AQP0, AQP1, AQP2, AQP4, AQP5 i AQP8), i les que són també permeables a la urea, el glicerol i altres soluts petits (AQP3, AQP7, AQP9 i AQP10), que es denominen aquagliceroporines (King et al., 2004). L’aquaporina-6 (AQP6) és una AQP particular, ja que, encara que transporta lleugerament l’aigua, també funciona com un canal iònic amb selectivitat per a anions. Algunes AQP són també permeables a altres soluts, com l’AQP9, que pot transportar arsenit i

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins 117

una varietat de soluts no carregats, l’AQP1, que pot transportar CO2, i l’AQP8, que pot transportar NH4+/NH3. Les AQP11 i AQP12 no presenten els típics triplets NPA i les seves propietats de permeabilitat no són ben conegudes, encara que almenys l’AQP11 sí que sembla que transporta aigua (Yakata et al., 2006). En mamífers, les AQP estan distribuïdes per tots els teixits i tipus cel·lulars, incloent-hi l’ovari (Takata et al., 2004). Estudis recents han mostrat que l’AQP1 i AQP2 són essencials per a la reabsorció d’aigua en el ronyó (Nielsen et al., 2002), mentre que l’AQP4 està implicada en el balanç hídric cerebral, la migració d’astròcits i la transfusió del senyal neuronal (Verkman et al., 2006), i l’AQP3 i l’AQP7 també sembla que tenen funcions importants en la hidratació de la pell i el metabolisme d’adipòcits (Hara-Chikuma i Verkman, 2006). No obstant això, la funció fisiològica de la majoria d’AQP de mamífers és desconeguda. En teleostis, l’anàlisi de la seqüència del genoma d’algunes espècies model, com el peix zebra, revela l’existència d’unes disset AQP diferents, i la majoria són funcionals quan s’expressen en oòcits de X. laevis (Calusinska, Tingaud-Sequeira i Cerdà, da-

des no publicades). En aquesta espècie no existeixen els gens d’AQP2, AQP5, AQP6 i AQP7, típics de mamífers. No obstant això, s’observen duplicacions d’alguns dels altres gens, les quals no han ocorregut en mamífers, fet que resulta en un nombre elevat d’AQP. La distribució similar d’AQP en el genoma de teleostis i mamífers pot suggerir l’existència de funcions equivalents, encara que les propietats específiques de les AQP de teleostis són encara molt desconegudes. En el fúndul, no obstant això, s’ha clonat l’AQP0, la qual s’expressa específicament en el cristal·lí de l’ull i mostra una elevada permeabilitat a l’aigua i certa permeabilitat al CO2, però no al glicerol o la urea (Virkki et al., 2001). En l’orada (Sparus aurata) s’ha aïllat una aquagliceroporina similar a l’AQP10 de mamífers, la qual és permeable a l’aigua, el glicerol i la urea, i s’expressa de manera elevada en l’intestí posterior i el ronyó (Santos et al., 2004). En l’anguila (Anguilla anguilla), s’han trobat dues AQP1 diferents (AQP1 i AQP1dup) i l’AQP3, les quals també es localitzen en òrgans osmoreguladors, com l’intestí posterior i les brànquies, i l’expressió de les quals sembla que es troba sota regulació osmòtica (Cutler i Cramb, 2002; Lignot et al., 2002; Aoki et al., 2003;

Figura 5. Estructura de les aquaporines i les aquagliceroporines. Els cilindres representen els sis dominis transmembranosos, i s’indiquen els dos triplets asparagina-prolina-alanina (NPA) en els llaços B i E, que formen el canal d’aigua o soluts. S’indiquen els aminoàcids que generalment es troben conservats entre aquaporines i aquagliceroporines al voltant del llaç E. Les posicions amb dos aminoàcids indiquen substitucions conservades.

118 J. Cerdà

Martínez et al., 2005). No obstant això, malgrat aquests estudis, la funció fisiològica de les AQP en òrgans osmoreguladors de teleostis és pràcticament desconeguda.

Funció de les aquaporines durant la hidratació de l’oòcit Recentment, el nostre grup va plantejar la hipòtesi que l’elevada hidratació de l’oòcit de l’orada (92 % d’aigua), que s’assoleix aproximadament en 2 h, podria estar facilitada per la presència d’AQP (Fabra et al., 2005). Per demostrar aquesta hipòtesi es van emprar tecnologies de PCR amb les quals es va aïllar el cDNA codificant d’una AQP en l’ovari. L’anàlisi de la seqüència d’aminoàcids d’aquesta proteïna indica la presència de sis segments transmembranosos i dos triplets NPA, que són les característiques típiques de les AQP. La seqüència d’aminoàcids d’aquest pèptid mostra una elevada homologia amb l’AQP1 de mamífers, així com els residus típicament conservats entre les AQP selectives d’aigua. D’acord amb això, es va veure que l’expressió del corresponent cRNA en oòcits de X. laevis conferia als oòcits permeabilitat específica a l’aigua, la qual podia ser inhibida amb HgCl2 i tetraetilamoni (TEA), de manera similar al que ocorre amb l’AQP1 de mamífers (Fabra et al., 2005). No obstant això, l’homologia de l’AQP de l’ovari de l’orada amb l’AQP1 de mamífers és relativament baixa (60 % idèntic). A més, a diferència de l’AQP1, l’AQP de Figura 6. Localització cel·lular i funció de l’Aqp1b en l’oòcit de l’orada. a-c) Imatges d’immunofluorescència (a i b) i de microscòpia electrònica amb anticossos (c), que indiquen la localització de la SaAQP1o sota la membrana d’oòcits postvitel·logènics (a) i posteriorment en els microvil·lis de l’oòcit durant la maduració (b i c). En a i b, els panells de l’esquerra mostren les imatges en contrast de fase, i a la dreta es mostren les imatges d’epifluorescència. Les fletxes indiquen reacció amb l’anticòs antiAqp1b. d) Inhibició sobre l’augment de volum dels oòcits d’orada durant la maduració meiòtica in vitro amb dosis creixents de HgCl 2. e) Inhibició de la hidratació amb HgCl 2 (barres blanques) i reversibilitat de l’efecte del mercuri mitjançant tractament amb β-mercaptoetanol (barres negres). Yg: vesícules de vitel; sc: cèl·lules fol·liculars; ve: zona pel·lúcida; pm: membrana plasmàtica (modificat de Fabra et al., 2005, 2006).

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins 119

l’orada s’expressa en molts pocs teixits i de manera predominant en l’ovari. Experiments d’immunocitoquímica amb un anticòs específic han demostrat que l’AQP ovàrica de l’orada es localitza exclusivament en l’oòcit, i es detecta per primera vegada en el citoplasma d’oòcits previtel· logènics (Fabra et al., 2005, 2006; vegeu la figura 6). A mesura que avança la vitel· logènesi, la proteïna apareix en la zona més perifèrica del citoplasma de l’oòcit. Durant la maduració i hidratació, just quan aparentment es crea la pressió osmòtica més elevada en l’oòcit com a resultat de l’acumulació d’ions i FAA, l’AQP és translocada a les microvellositats de l’oòcit que travessen la zona pel·lúcida, on pot actuar en el transport d’aigua (Fabra et al., 2006). Per demostrar, per tant, que aquesta AQP podria estar implicada en la hidratació de l’oòcit, es van dur a terme experiments in vitro en els quals els fol·licles ovàrics de daurada es van induir a la maduració i hidratació amb MIS en presència dels inhibidors HgCl2 i TEA. Els resultats d’aquests experiments indiquen que ambdós inhibidors redueixen la hidratació dels oòcits in vitro amb un efecte dependent de la dosi, i en el cas del HgCl2, la inhibició pot ser revertida amb β-mercaptoetanol (Fabra et al., 2005, 2006). Aquestes observacions, per tant, proporcionen proves de la funció de l’AQP ovàrica de l’orada durant el procés d’hidratació, en què possiblement facilita el flux d’aigua a l’interior de l’oòcit. El procés d’hidratació de l’oòcit apareix, doncs, com un mecanisme altament controlat basat en la interacció entre la proteòlisi del vitel, per a la creació d’un gradient osmòtic, i l’AQP, per al transport d’aigua (vegeu la figura 7).

IDENTIFICACIÓ DE LA SUBFAMÍLIA Aqp1b DE TELEOSTIS L’aïllament i caracterització molecular de l’AQP de l’ovari de l’orada va portar a cercar en aquesta espècie altres AQP més similars a l’AQP1 de mamífers. Mitjançant el cribratge d’una genoteca de cDNA de ronyó es va aïllar un nou cDNA que presentava una identitat elevada, pel que fa a la seva seqüència d’aminoàcids, amb les seqüències de l’AQP1 de mamífers (63-67 %) i d’altres peixos (88-94 %), i només era idèntica a l’AQP ovàrica en un 60 %. Aquest segon cDNA és també selectivament permeable a l’aigua i sensible al HgCl2 quan s’expressa en oòcits de X. laevis, i s’expressa en pràcticament tots els teixits de l’adult (Fabra et al., 2005, Raldúa et al., 2008). Per investigar les relacions entre les dues AQP de l’orada i amb altres AQP de vertebrats selectives d’aigua, es van cercar seqüències similars en diferents espècies de teleostis mitjançant clonatge per homologia i cerca en genomes seqüenciats. Aquesta recerca ha confirmat la presència en teleostis de dues isoformes similars estructuralment i funcionalment a l’AQP1 de mamífers, que s’han anomenat Aqp1a i Aqp1b (és a dir, l’AQP ovàrica). Aquestes isoformes coexisteixen exclusivament en peixos teleostis, ja que l’Aqp1b no ha estat identificada en altres vertebrats. La reconstrucció filogenètica d’AQP similars a l’AQP1 en vertebrats indica que l’Aqp1a i l’Aqp1b comparteixen un mateix origen i probablement han evolucionat a partir d’un avantpassat comú (vegeu la figura 8), ja que ambdues isoformes estan presents en espècies de teleostis que pertanyen a grups taxonòmics distants, des de grups basals (com els anguil·liformes) fins a més moderns (com gasterosteiformes, perciformes, pleuronectiformes i tetraodontiformes) (Inoue et al., 2003). Aquesta duplicació pot ser antiga i probablement ha afectat

120 J. Cerdà

la majoria de teleostis. Com s’ha suggerit per a molts gens duplicats de teleostis, l’origen de l’Aqp1b podria ser la duplicació sencera del genoma (whole genome duplication, WGD), que va ocórrer específicament en el llinatge dels actinopterigis després de separar-se del llinatge dels tetràpodes fa uns 350 milions d’anys (Meyer i Peer, 2005). No obstant això, en tots els teleostis examinats els locus aqp1a i aqp1b estan localitzats en tàndem en el genoma, fet que indica que el gen aqp1b possiblement va sorgir per duplicació local més que del cromosoma o del genoma. Actualment es pensa que els teleostis marins van colonitzar els oceans després d’aproximadament 250 milions d’anys d’evolució en aigua dolça, tal i com sugge-

reixen les dades de fòssils, la condició hipoosmòtica i la presència d’un ronyó glomerular en les espècies actuals (revisat per Finn i Kristoffersen, 2007). La radiació de teleostis en l’oceà va requerir molt probablement l’evolució de nous mecanismes osmoreguladors en ous i embrions per alleujar la pèrdua passiva d’aigua imposada per l’entorn hiperosmòtic. En aquest escenari, és possible que la duplicació del gen aqp1 de teleostis permetés a una de les còpies codificar una proteïna amb funcions noves mitjançant mutacions en seqüències estructurals o reguladores (com la neofuncionalització). Aquest sembla el cas per a l’Aqp1b de l’orada, la qual mostra una funció fisiològica especialitzada en la captació d’aigua durant la maduració meiòtica. En altres es-

Figura 7. Processos fisiològics durant la hidratació de l’oòcit en teleostis pelagòfils i model d’acció de l’Aqp1b. Durant la previtel·logènesi, les cèl·lules fol·liculars associades a l’oòcit sintetitzen 17β-estradiol (E2) en resposta a l’hormona fol· liculoestimulant (FSH), la qual estimularà la producció de vitel·logenines (Vg) en el fetge. Durant el creixement de l’oòcit (vitel·logènesi), les Vg s’incorporen en l’oòcit per un mecanisme d’endocitosi mediat per receptor. Les Vg s’hidrolitzen en l’oòcit i donen lloc a diverses proteïnes del vitel, que s’emmagatzemen en glòbuls. A l’inici de la vitel·logènesi, l’Aqp1b se sintetitza en l’oòcit i es transporta per l’interior de vesícules cap a la membrana plasmàtica de l’oòcit. Durant la maduració, les cèl·lules de la granulosa són estimulades per l’hormona luteïnitzant (LH) perquè produeixin l’MIS i s’iniciï la progressió de la meiosi. Durant aquest procés la vesícula germinal (VG) migra cap al pol animal de l’oòcit i es trenca, els glòbuls de vitel es fusionen i s’activa la hidròlisi de les proteïnes del vitel, fet que produeix aminoàcids lliures (FAA). Al mateix temps, alguns ions inorgànics, com el K+, s’acumulen en l’oòcit, i això fa augmentar encara més la pressió osmòtica a dins. En aquest moment, l’Aqp1b s’insereix en la membrana plasmàtica de l’oòcit, on pot actuar en el transport d’aigua (línies sòlides). El flux d’aigua cap a l’oòcit, però, també pot ocórrer per simple difusió a través de les membranes de les cèl·lules fol·liculars i de l’oòcit (línies de punts). Quan finalitza la hidròlisi del vitel, l’Aqp1b és retirada de la membrana de l’oòcit i finalitza la hidratació (modificat de Fabra et al., 2006).

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins 121

pècies marines i catàdromes (les que creixen en aigua dolça i es reprodueixen en el mar) que, igual que l’orada, també produeixen ous molt hidratats, com el llenguado i l’anguila, el gen aqp1b també codifica una proteïna funcional i el seu RNA s’acumula predominantment en l’ovari (vegeu la figura 9), i això suggereix una funció similar a la de l’Aqp1b durant la hidratació de l’oòcit. Contràriament, en el peix zebra, espècie d’aigua dolça en la qual no s’observa gairebé hidratació en l’oòcit (Cerdà et al., 2007), el patró d’expressió és completament diferent i la seqüència d’aminoàcids de la proteïna

presenta un índex de mutació més elevat. D’acord amb aquestes dades, hem suggerit que en teleostis marins que produeixen ous molt hidratats el gen aqp1b possiblement codifica un canal d’aigua neofuncionalitzat en els oòcits (Tingaud-Sequeira et al., 2008). Finn i Kristoffersen (2007) han proposat recentment que la neofuncionalització de gens de Vtg duplicats, que va permetre que un dels paràlegs fos hidrolitzat en FAA durant la maduració dels oòcits, va ser un esdeveniment clau en l’evolució i l’èxit dels teleostis en l’entorn oceànic. La duplicació i neofuncionalització del gen aqp1b pot haver

Figura 8. Relacions filogenètiques entre les AQP1 de vertebrats. L’arbre mostra l’existència de dues subfamílies d’AQP1 en teleostis. La longitud de les branques és proporcional al nombre de substitucions d’aminoàcids. El nombre d’accés del GenBank, la seqüència genòmica o el grup cromosòmic està indicat entre parèntesis per a cada seqüència (modificat de Tingaud-Sequeira et al., 2008).

122 J. Cerdà

ocorregut, doncs, en paral·lel a aquest mecanisme per facilitar el transport d’aigua en els oòcits. La isoforma Aqp1b de teleostis d’aigua dolça que produeixen ous no hidratats, com el peix zebra, podria haver estat desactivada per mutacions, o ser eventualment eliminada del genoma. A aquesta hipòtesi dóna suport l’absència del gen aqp1b en espècies d’aigua dolça més modernes, com el medaka (Tingaud-Sequeira et al., 2008). No obstant això, en altres teleostis d’aigua dolça que van sorgir més tard durant l’evolució, com Tetraodon nigroviridis, el gen aqp1b és retingut en el genoma. Les causes d’aquesta retenció són desconegudes, ja que sembla que en la majoria de genomes de teleostis mo-

derns s’ha donat una eliminació massiva de DNA després de la WGD, i això ha resultat en la conservació de només un subconjunt dels gens duplicats (Amores et al., 2004; Woods et al., 2005). És possible especular, però, que l’evolució recent dels tetraodontiformes no ha estat prou llarga per permetre la divergència específica del genoma i, per tant, del gen aqp1b. El relativament alt percentatge d’identitat (77 %) de la seqüència d’aminoàcids de l’Aqp1b entre el fugu (Takifugu rubripes), un tetraodontiforme que produeix ous hidratats, i T. nigroviridis, pot donar suport a aquesta idea. En tot cas, són necessaris més estudis sobre l’expressió i la distribució tissular de la proteïna Aqp1b en

Figura 9. Patró d’expressió i caracterització funcional de l’Aqp1b de teleostis. a) Anàlisi de l’expressió d’aqp1b (plafons superiors) i β-actina (bactin, plafons més baixos) en diferents teleostis mitjançant RT-PCR. El menys indica absència de RT durant la síntesi de cDNA. La mida (kb) dels marcadors moleculars s’indica a l’esquerra. b) Permeabilitat osmòtica a l’aigua (Pf ) i inhibició amb mercuri d’oòcits de Xenopus laevis que expressen l’Aqp1a o l’Aqp1b de teleostis. Alguns oòcits tractats amb HgCl 2 són incubats amb 5 mM de β-mercaptoetanol (βEM) 15 min abans de determinar-ne la permeabilitat. Els valors representen la mitjana ± SEM (n = 6-10 oòcits) d’un experiment representatiu (modificat de TingaudSequeira et al., 2008).

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins 123

espècies de teleostis d’aigua dolça per entendre l’evolució d’aquesta isoforma. Divergència estructural i funcional de l’Aqp1b L’estructura primària del dominis transmembranosos TM2 i TM5, així com dels bucles connectors B i E, de l’Aqp1a i l’Aqp1b, els quals estan implicats en la formació del

canal selectiu d’aigua, està molt conservada entre teleostis i mamífers. No obstant això, l’Aqp1a i l’Aqp1b mostren una eficiència diferent en la permeabilitat a l’aigua quan s’expressen oòcits de X. laevis; a més, l’Aqp1b mostra una marcada divergència estructural en l’extrem carboxiterminal de la proteïna respecte a l’Aqp1a i l’AQP1 de mamífers (Tingaud-Sequeira et al., 2008). Experiments funcionals amb oòcits de X. laevis amb l’expressió artificial de l’Aqp1a i l’Aqp1b d’orada intactes, així com de proteïnes quimèriques en les quals el C terminal de l’Aqp1a és substituït pel de l’Aqp1b, i viceversa, han revelat que l’extrem carboxiterminal de l’Aqp1b produeix la fosforilació de la proteïna i una retenció parcial en vesícules intracel·lulars (Tingaud-Sequeira et al., 2008). Aquestes observacions suggereixen, per tant, que l’Aqp1b ha adquirit independentment dominis específics de regulació en la regió carboxiterminal, potser dependents de fosforilació, per al control del trànsit intracel·lular d’Aqp1b. Per investigar les potencials regions reguladores en l’extrem carboxiterminal de l’Aqp1b, diversos residus seleccionats de l’Aqp1b de l’orada han estat mutats amb Ala Figura 10. Funció del C terminal de l’Aqp1b de l’orada per al trànsit intracel·lular en oòcits. a) Permeabilitat a l’aigua d’oòcits que expressen Aqp1b intacta (WT) o mutada en residus específics del C terminal: Aqp1b-T229A, Aqp1b-L234A/L235A, Aqp1b-S254A i Aqp1b-S254D. La permeabilitat és expressada en percentatge respecte als oòcits injectats amb WT. Els valors representen la mitjana ± SEM de 3-5 experiments (n = 10-15 oòcits per tractament). Els asteriscs indiquen diferències estadísticament significatives (*: p < 0,05; **: p < 0,01). b-e) Immunotransferències de proteïnes totals de membrana (TM) o només de membrana plasmàtica (PM) d’oòcits que expressen WT o Aqp1b mutada. La massa molecular aparent d’un marcador de 29 kDa s’indica a l’esquerra. f-j) Localització de l’Aqp1b intacta o mutada en oòcits. La membrana plasmàtica s’indica amb fletxes, i la retenció de l’Aqp1b-L234A/ L235A en el reticle endoplasmàtic s’indica amb puntes de fletxa (H) (barres: 100 μm) (modificat de Tingaud-Sequeira et al., 2008).

124 J. Cerdà

o Asp i les proteïnes resultants han estat expressades en oòcits per determinar la localització intracel·lular i les propietats de permeabilitat (vegeu la figura 10). Aquests experiments indiquen que el domini diLeu comú en l’extrem carboxiterminal de l’Aqp1b, comú en moltes espècies de teleostis i que podria estar implicat en el transport de proteïnes de membrana des de la xarxa trans-Golgi al compartiment lisosomalendosomal, és necessari per a la localització de l’Aqp1b en la membrana plasmàtica (vegeu les figures 10a, c i h). Més notablement, però, altres resultats revelen que els residus Thr229 i Ser254 poden estar implicats en la translocació de l’Aqp1b des de les vesícules intracel·lulars a la membrana plasmàtica. La probabilitat de fosforilació de la Thr229 és baixa i, consegüentment, el mutant Aqp1b-T229A no afecta l’estat de fosforilació de l’Aqp1b, tot i que inhibeix l’expressió de l’Aqp1b en la superfície de la cèl·lula i la permeabilitat de l’oòcit en l’aigua (vegeu les figures 10a, b i g). Ja que la Thr229 no coincideix amb cap domini de consens per a cinases, la funció específica d’aquest residu és, de moment, desconeguda. No obstant això, s’ha observat que el mutant Aqp1b-S254A inhibeix la fosforilació i augmenta el transport de l’Aqp1b des de les vesícules intracel· lulars a la membrana plasmàtica, mentre que el mutant Aqp1b-S254D, el qual imita un estat constant de fosforilació, manté l’Aqp1b en les vesícules intracel·lulars (vegeu les figures 10a, d, e, i i j). Aquests resultats suggereixen, doncs, que la desfosforilació de la Ser254 indueix el transport de l’Aqp1b a la superfície de la cèl·lula, mentre que la fosforilació pot retenir la proteïna en vesícules intracel·lulars. Aquest mecanisme és aparentment oposat al descrit fins ara per a l’AQP2 de mamífers i amfibis, en què la inserció de la proteïna en la membrana plasmàtica de les cèl·lules del conducte col· lector del ronyó o de les cèl·lules granuloses

de la bufeta urinària és activada mitjançant fosforilació de residus Ser en l’extrem carboxiterminal de la proteïna (Balkom et al., 2002; Hasegawa et al., 2005). Curiosament, en l’orada la Ser254 defineix un lloc de consens de fosforilació dirigida per Pro, el qual es troba conservat en teleostis marins més evolucionats que produeixen ous hidratats. Les cinases dirigides per Pro constitueixen una gran família de proteïnes, que inclou proteïnes cinases activades per mitògens (MAPK), algunes de les quals estan implicades en l’activació de l’MPF en oòcits d’amfibis, com la p38 MAPK (Perdiguero et al., 2003). En l’orada el transport de l’Aqp1b a la membrana plasmàtica de l’oòcit és un procés estretament regulat que sembla que té lloc després de l’activació de l’MPF, just abans de la hidròlisi completa de les proteïnes del vitel i l’acumulació màxima d’ions K+ (Fabra et al., 2006). Aquestes observacions suggereixen el possible paper de les cinases relacionades amb el cicle cel·lular, o d’altres cinases activades durant la maduració de l’oòcit, en la fosforilació de la Ser254 i el control del tràfic de l’Aqp1b, el qual està sent investigat actualment. CONCLUSIONS El recent descobriment de l’Aqp1b en l’orada ha provat un dels mecanismes moleculars clau en el procés d’hidratació de l’oòcit de teleostis marins. En aquesta espècie, les nostres observacions indiquen que el procés d’hidratació de l’oòcit és un mecanisme altament controlat basat en la interacció entre la proteòlisi del vitel, l’acumulació d’ions inorgànics i l’Aqp1b. Han estat identificades diverses AQP relacionades amb l’Aqp1b, sobretot en teleostis pelagòfils, i això suggereix que en aquestes espècies la isoforma Aqp1b està originada per un gen duplicat i neofuncionalitzat en oòcits per a

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins 125

la regulació del procés d’hidratació induït per hormones. La neofuncionalització de l’Aqp1b ha estat acompanyada de l’adquisició de dominis específics en l’extrem carboxiterminal de la proteïna per al control del trànsit intracel·lular. Seran necessaris estudis futurs per esbrinar la possible regulació transcripcional i posttranscripcional del gen aqp1b i el control del transport intracel· lular de la proteïna i la seva funció en oòcits de peixos. La recerca sobre aquests interrogants contribuirà indubtablement a un coneixement més profund dels mecanismes moleculars implicats en la producció d’ous viables en peixos marins, els quals poden tenir importants aplicacions biotecnològiques en aqüicultura i per a la conservació de la biodiversitat. AGRAÏMENTS Els treballs del nostre grup citats en aquesta revisió han estat finançats per projectes del Ministeri d’Educació i Ciència (AGL2001-0364 i AGL2004-00316), la Comissió Europea (Q5RS-2002-00784-CRYOCYTE i MRTN-CT-2006-035995-Aquaglyceroporins) i la Xarxa de Referència de Recerca i Desenvolupament en Aqüicultura de la Generalitat de Catalunya. BIBLIOGRAFIA Cutler, C. P.; Cramb, G. (2002). «Branchial expression of an aquaporin 3 (AQP3) homologue is downregulated in the European eel, Anguilla anguilla, following seawater acclimation». J. Exp. Biol., 205: 2643-2651. Chrispeels, M. J.; Morillon, R.; Maurel, C.; Gerbeau, P.; Kjellbom, P.; Johansson, I. (2001). «Aquaporins of plants: structure, function, regulation, and role in plant water relations». A: Hohmann, S.; Nielsen, S.; Agre, P. [ed.]. Aquaporins. Current topics in membranes, vol. 51. San Diego: Academic Press, 277334.

Fulton, T. W. (1898). «On the growth and maturation of the ovarian eggs of teleostean fishes». 16th Annu. Rep. Fish. Bd. Scotl., 3: 83-134. Amores, A.; Suzuki, T.; Yan, Y. L.; Pomeroy, J.; Singer, A.; Amemiya, C.; Postlethwait, J. H. (2004). «Developmental roles of pufferfish Hox clusters and genome evolution in ray-fin fish». Genome Res., 14: 1-10. Aoki, M.; Kaneko, T.; Katoh, F.; Hasegawa, S.; Tsutsui, N.; Aida, K. (2003). «Intestinal water absorption through aquaporin 1 expressed in the apical membrane of mucosal epithelial cells in seawateradapted Japanese eel». J. Exp. Biol., 206: 3495-3505. Babin, P. J.; Carnevali, O.; Lubzens, E.; Schneider, W. J. (2007). «Molecular aspects of oocyte vitellogenesis in fish». A: Babin, P. J.; Cerdà, J.; Lubzens, E. [ed.]. The fish oocyte: from basic studies to biotechnological applications. Dordrecht: Springer, 39-76. Balkom, B. W. van; Savelkoul, P. J.; Markovich, D.; Hofman, E.; Nielsen, S.; Sluijs, P. van der; Deen, P. M. (2002). «The role of putative phosphorylation sites in the targeting and shuttling of the aquaporin-2 water channel». J. Biol. Chem., 277: 4147341479. Cerdà, J.; Fabra, M.; Raldúa, D. (2007). «Physiological and molecular basis of fish oocyte hydration». A: Babin, P. J.; Cerdà, J.; Lubzens, E. [ed.]. The fish oocyte: from basic studies to biotechnological applications. Dordrecht: Springer: 349-396. Cerdà, J.; Petrino, T. R.; Wallace, R. A. (1993). «Functional heterologous gap junctions in Fundulus ovarian follicles maintain meiotic arrest and permit hydration during oocyte maturation». Dev. Biol., 160: 228-235. Craik, J. C. A.; Harvey, S. M. (1987). «The causes of buoyancy in eggs of marine teleosts». J. Mar. Biol. Ass. U. K., 67: 169-182. Chen, Y.-N.; Hsieh, S.-L.; Kuo, C.-M. (2003). «Changes in oocyte and blood plasma osmotic components of ayu, Plecoglossus altivelis Temminck & Schlegel during oocyte maturation». Aquaculture Res., 34: 859-867. Fabra, M.; Raldúa, D.; Bozzo, M. G.; Deen, P. M. T.; Lubzens, E.; Cerdà, J. (2006). «Yolk proteolysis and aquaporin-1o play essential roles to regulate fish oocyte hydration during meiosis resumption». Dev. Biol., 295: 250-262. Fabra, M.; Raldúa, D.; Power, D. A.; Deen, P. M. T.; Cerdà, J. (2005). «Marine fish egg hydration is aquaporin-mediated». Science, 307: 545. Finn, R. N.; Kristoffersen, B. A. (2007). «Vertebrate vitellogenin gene duplication in relation to the “3R hypothesis”: correlation to the pelagic egg and the oceanic radiation of teleosts». PLoS ONE, 2: e169.

126 J. Cerdà

Finn, R. N.; Ostby, G. C.; Norberg, B.; Fyhn, H. J. (2002). «In vivo oocyte hydration in Atlantic halibut (Hippoglossus hipoglossus): proteolytic liberation of free amino acids, and ion transport, are driving forces for osmotic water influx». J. Exp. Biol., 205: 211-224. Hara-Chikuma, M.; Verkman, A. S. (2006). «Physiological roles of glycerol-transporting aquaporins: the aquaglyceroporins». Cell. Mol. Life Sci., 63: 1386-1392. Hasegawa, T.; Suzuki, M.; Tanaka, S. (2005). «Immunocytochemical studies on translocation of phosphorylated aquaporin-h2 protein in granular cells of the frog urinary bladder before and after stimulation with vasotocin». Cell Tissue Res., 322: 407415. Inoue, J. G.; Miya, M.; Tsukamoto, K.; Nishida, M. (2003). «Basal actinopterygian relationships: a mitogenomic perspective on the phylogeny of the “ancient fish”». Mol. Phylogenet. Evol., 26: 110-120. King, L. S.; Kozono, D.; Agre, P. (2004). «From structure to disease: the evolving tale of aquaporin biology». Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 5: 687-698. LaFleur, G. J. Jr.; Thomas, P. (1991). «Evidence for a role of Na+, K+-ATPase in the hydration of atlantic croaker and spotted seatrout oocytes during final maturation». J. Exp. Biol. 258: 126-136. Lignot, J. H.; Cutler, C. P.; Hazon, N.; Cramb, G. (2002). «Immunolocalization of aquaporin-3 in the gill and the gastrointestinal tract of the European eel Anguilla anguilla (L.)». J. Exp. Biol., 205: 26532663. Martínez, A. S.; Cutler, C. P.; Wilson, G. D.; Phillips, C.; Hazon, N.; Cramb, G. (2005). «Cloning and expression of three aquaporin homologues from the European eel (Anguilla anguilla): effects of seawater acclimation and cortisol treatment on renal expression». Biol. Cell, 97: 615-27. Mellinger, J. (1994). «La flottabilité des oeufs des te léostéens». L’Anné Biologique, 33: 117-138. Meyer, A.; Peer, Y. van der (2005). «From 2R to 3R: evidence for a fish-specific genome duplication (FSGD)». Bioessays, 27: 937-945. Nielsen, S.; Frokiaer, J.; Marples, D.; Kwon, T. H.; Agre, P.; Knepper, M. A. (2002). «Aquaporins in the kidney: from molecules to medicine». Physiol. Rev., 82: 205-244. Nissling, A.; Müller, A.; Hinrichsen, H.-H. (2003). «Specific gravity and vertical distribution of sprat eggs in the Baltic sea». J. Fish Biol., 63: 280-299. Perdiguero, E.; Pillaire, M. J.; Bodart, J. F.; Hennersdorf, F.; Frödin, M.; Duesbery, N. S.; Alonso, G.; Nebreda, A. R. (2003). «Xp38gamma/SAPK3 promotes meiotic G(2)/M transition in Xenopus

oocytes and activates Cdc25C». EMBO J., 22: 57465756. Raldúa, D.; Otero, D.; Fabra, M.; Cerdà, J. (2008). «Differential localization and regulation of two aquaporin-1 homologs in the intestinal epithelia of the marine teleost Sparus aurata». Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 294: R993-R1003. Santos, C. R. A.; Estevao, M. D.; Fuentes, J.; Cardoso, J. C. R.; Fabra, M.; Passos, A. L.; Detmers, F. J.; Deen, P. M. T.; Cerdà, J.; Power, D. M. (2004). «Isolation of a novel aquaglyceroporin from a marine teleost (Sparus auratus): function and tissue distribution». J. Exp. Biol., 207: 1217-1227. Selman, K.; Wallace, R. A.; Cerdà, J. (2001). «Bafilomycin A1 inhibits proteolytic cleavage and hydration but not yolk crystal disassembly and meiosis during maturation of sea bass oocytes». J. Exp. Zool., 290: 265-278. Seoka, M.; Yamada, S.; Iwata, Y.; Yanagisawa, T.; Nakagawa, T.; Kumai, H. (2003). «Differences in the biochemical content of buoyant and non-buoyant eggs of the Japanese eel, Anguilla japonica». Aqua culture, 216: 355-362. Suwa, K.; Yamashita, M. (2007). «Regulatory mechanisms of oocyte maturation and ovulation». A: Babin, P. J.; Cerdà, J.; Lubzens, E. [ed.]. The fish oocyte: from basic studies to biotechnological applications. Dordrecht: Springer: 323-347. Takata, K.; Matsuzaki, T.; Tajika, Y. (2004). «Aqua porins: water channel proteins of the cell membrane». Prog. Histochem. Cytochem., 39: 1-83. Thorsen, A.; Kjesbu, O. S.; Fyhn, H. J.; Solemdal, P. (1996). «Physiological mechanisms of buoyancy in eggs from brackish water cod». J. Fish Biol., 48: 457477. Tingaud-Sequeira, A.; Chauvigné, F.; Fabra, M.; Lozano, J.; Raldúa, D.; Cerdà, J. (2008). «Structural and functional divergence of two fish aquaporin-1 water channels following teleost-specific gene duplication». BMC Evol. Biol. [En premsa] Verkman, A. S.; Binder, D. K.; Bloch, O.; Auguste, K.; Papadopoulos, M. C. (2006). «Three distinct roles of aquaporin-4 in brain function revealed by knockout mice». Biochim. Biophys. Acta, 1758: 1085-1093. Virkki, L. V.; Cooper, G. J.; Boron, W. F. (2001). «Cloning and functional expression of a MIP (AQP0) homolog from killifish (Fundulus heteroclitus) lens». Am. J. Physiol., 281: R1994-R2003. Wallace, R. A.; Begovac, P. C. (1985). «Phosvitins in Fundulus oocytes and eggs. Preliminary chromatographic and electrophoretic analyses together with biological considerations». J. Biol. Chem., 260: 11268-11274. Wallace, R. A.; Greeley, M. S. Jr.; McPherson, R.

Desxifrant la base molecular de la formació de l’ou en els peixos marins 127

(1992). «Analytical and experimental studies on the relationship between Na+, K+, and water-uptake during volume increases associated with Fundulus oocyte maturation in vitro». J. Comp. Physiol., 162B: 241-248. Wallace, R. A.; Selman, K. (1985). «Major proteins changes during vitellogenesis and maturation of Fundulus oocytes». Dev. Biol., 110: 492-498. Woods, I. G.; Wilson, C.; Friedlander, B.; Chang,

P.; Reyes, D. K.; Nix, R.; Kelly, P. D.; Chu, F.; Postlethwait, J. H.; Talbot, W. S. (2005). «The zebrafish gene map defines ancestral vertebrate chromosomes». Genome Res., 15: 1307-1314. Yakata, K.; Hiroaki, Y.; Ishibashi, K.; Sohara, E.; Sasaki, S.; Mitsuoka, K.; Fujiyoshi, Y. (2007). «Aqua porin-11 containing a divergent NPA motif has normal water channel activity». Biochim. Biophys. Acta, 1768: 688-693.

DOI: 10.2436/20.1501.02.62

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 129-139

CONSEQÜÈNCIES FISIOLÒGIQUES D’UNA ACTIVACIÓ DEL SISTEMA IMMUNITARI SOBRE LA REPRODUCCIÓ I EL CREIXEMENT EN PEIXOS D’INTERÈS EN AQÜICULTURA Nerea Roher,1,2 Diego Crespo,1 Yoryia Vraskou,1 Mònica Díaz,1 Simon MacKenzie 2 i Josep V. Planas 1 Departament de Fisiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona i Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona. 2 Unitat de Fisiologia Animal, Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona. 1

Adreça per a la correspondència: Josep Planas. Departament de Fisiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Av. Diagonal, 645, edifici Ramon Margalef. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: jplanas@ub.edu. RESUM En peixos teleostis, una activació del sistema immunitari comporta la producció de factors immunitaris que ajuden a combatre una infecció i estableixen una comunicació entre la resposta immunitària innata i l’adaptativa. A part d’aquesta funció estrictament immunitària, els factors immunitaris poden afectar el funcionament d’altres cèl·lules i teixits no immunitaris. Dos processos particularment importants, tant per l’estat biològic d’una població de peixos, com per aspectes més relacionats amb la productivitat d’espècies en cultiu, són la reproducció i el creixement. En aquest treball es descriuen estudis encaminats a investigar els efectes d’una activació del sistema immunitari, i dels factors produïts, sobre la reproducció i el creixement en peixos teleostis. Paraules clau: sistema immunitari, reproducció, creixement, infecció, peixos. PHYSIOLOGICAL CONSEQUENCES OF THE ACTIVATION OF THE IMMUNE SYSTEM ON REPRODUCTION AND GROWTH IN FISH SPECIES IMPORTANT FOR AQUACULTURE SUMMARY In teleost fish, an activation of the immune system entails the production of immune factors that are key to fighting an infeccion and establish a bridge between the innate and

130 N. Roher, D. Crespo, Y. Vraskou, M. Díaz, S. MacKenzie i J. V. Planas

the adaptive immune responses. In addition to this strictly immune function, immune factors can also affect the function of other non-immune cells and tissues. Reproduction and growth are two processes that are particularly important for the biological condition of a population of fish as well as for aspects more related to productivity of cultured species. In this paper, we describe studies designed to investigate the effects of an activation of the immune system, as well as of the factors produced, on reproduction and growth in teleost fish. Key words: immune system, reproduction, growth, infection, fish.

INTRODUCCIÓ El sistema immunitari en peixos, igual que en la resta de vertebrats, està encarregat principalment de la defensa de l’organisme contra factors biòtics externs, ja sigui en forma de bacteris, virus o fongs. Enfront d’aquestes amenaces externes, el sistema immunitari activa una complexa resposta humoral i cel·lular per destruir i eliminar de l’organisme els patògens infecciosos. Típicament, la resposta immunitària en vertebrats té dos components principals: a) la resposta innata i b) la resposta adaptativa. La resposta innata es caracteritza per l’atac per part de les cèl·lules immunitàries especialitzades (fagòcits) als patògens, i per l’activació amb l’alliberament de factors immunitaris (p. ex., citocines, quimiocines, factors bactericides) que actuen activant altres cèl· lules del sistema immunitari o sobre els patògens mateixos. D’altra banda, la resposta adaptativa es caracteritza per la producció d’anticossos i l’adquisició d’una «memòria» immunitària. Aquestes dues respostes no es produeixen independentment, sinó que tenen lloc de manera coordinada ja que, entre d’altres raons, la resposta innata és essencial per al desenvolupament de la resposta adaptativa posterior. En els peixos teleostis es presenten els dos tipus de resposta immunitària, però en aquest grup de vertebrats sembla que la resposta innata té un paper més rellevant que en vertebrats supe-

riors (Boshra et al., 2005; Li et al., 2006). Malgrat que encara és totalment especulatiu, es podria proposar que la major importància de la resposta innata en els peixos teleostis és deguda a la seva presència en un ambient aquàtic, en el qual els peixos podrien estar sotmesos a una major càrrega de patògens que els vertebrats terrestres (tetràpodes). En aquest sentit, seria interessant investigar si existeixen diferències entre tetràpodes que habiten ambients terrestres i aquàtics (aus aquàtiques i mamífers aquàtics) pel que fa a la resposta immunitària innata. La resposta immunitària innata, tal com s’ha descrit en els tetràpodes, consisteix en primer lloc en l’activació de cèl·lules immunitàries per contacte amb el patogen gràcies al reconeixement dels motius específics dels patògens (patrons moleculars associats a patògens o PAMP, pathogen-associated molecular patterns) o a la resposta fagocítica de la cèl·lula immunitària mateixa en ingerir el patogen i degradar-lo. Aquesta primera resposta comporta la producció d’una primera bateria de factors immunitaris, en la qual destaquen les citocines (les «hormones» del sistema immunitari), que actuaran de manera paracrina i sistèmica sobre altres cèl·lules i teixits immunitaris (Nicola, 1994), i les quimiocines, que són factors que senyalitzen a altres cèl·lules immunitàries l’existència d’una reacció immunitària innata i les atreuen o recluten cap al lloc d’infecció per ajudar a combatre-la. D’aques-

reproducció i creixement en peixos d’interès en aqüicultura 131

ta manera, s’inicia una autèntica cascada de producció de factors immunitaris que aconsegueix posar en funcionament de manera coordinada en el temps i en l’espai tots els components del sistema immunitari necessaris per combatre una infecció. En realitat, existeix una cascada d’activació de citocines enormement complexa, en la qual aquestes s’activen de manera seqüencial i amplificant-se a cada pas (Nicola, 1994). Ja que moltes d’aquestes citocines (p. ex., la interleucina 1 o IL-1, el factor de necrosi tumoral α o TNFα, etc.) tenen activitat proapoptòtica i proinflamatòria, és absolutament essencial que la resposta immunitària innata pugui ser totalment controlada per garantir l’homeòstasi de l’organisme. De fet, la major part de factors immunitaris només són produïts per activació transcripcional sota condicions d’estimulació amb patògens o PAMP, i la seva expressió retorna als valors basals un cop l’estímul s’ha eliminat. És precisament quan la producció de citocines al llarg d’una infecció és incontrolable que es presenta una situació crítica (sepsi) que pot conduir a la mort de l’individu. Tal com s’ha vist, una de les conseqüències importants d’una infecció és la producció massiva de citocines, bàsicament per part de les cèl·lules immunitàries. Un important problema fisiològic que es planteja en aquestes situacions d’activació del sistema immunitari innat és el dels possibles efectes de les citocines produïdes sobre les cèl·lules i teixits fora del sistema immunitari. En mamífers hi ha nombrosos estudis que donen suport a la idea que l’activació del sistema immunitari en un procés infecciós dóna lloc a la producció de factors immunitaris que poden afectar altres processos fisiològics, tals com la reproducció i el creixement. En el present treball es pretén donar informació sobre els efectes de l’activació del sistema immunitari innat i de determinats mediadors immunitaris so-

bre la reproducció i el creixement en peixos teleostis. Concretament, la major part de la informació disponible (obtinguda principalment pel nostre grup i els nostres col·laboradors) sobre les conseqüències fisiològiques d’una activació del sistema immunitari s’ha obtingut utilitzant la truita (Oncorhynchus mykiss) com a model experimental. Això és degut, com es reconeix freqüentment, al fet que aquesta espècie és de considerable interès econòmic a Catalunya (representa una de les espècies més cultivades) i, des d’un punt de vista científic, al fet que es disposa d’una quantitat considerable d’informació sobre el seu sistema immunitari i la seva regulació, sobre la seva reproducció i sobre els factors que determinen el seu creixement muscular. EL SISTEMA IMMUNITARI I LA REPRODUCCIÓ EN PEIXOS En els últims anys ha aparegut una quantitat important d’informació que indica que la capacitat reproductiva pot estar compromesa per processos infecciosos originats per patògens, principalment d’origen bacterià (Entrican i Wheelhouse, 2006; Sharara et al., 1998). En mamífers, una activació del sistema immunitari innat deguda a l’administració de lipopolisacàrid (LPS), el component actiu de la paret dels bacteris gramnegatius, també anomenat endotoxina, provoca efectes negatius sobre la funció de l’ovari, la fertilitat i la supervivència embrionària, entre altres causes, per un augment de l’apoptosi i una reducció en la producció d’esteroides ovàrics en resposta a una estimulació gonadotròfica (Besnard et al., 2001; Sancho-Tello et al., 1993; Shakil et al., 1994). En mamífers, també se sap que els efectes de l’LPS sobre la funció ovàrica estan mediats principalment per la citocina TNFα, la qual pot ser produïda de manera sistèmica

132 N. Roher, D. Crespo, Y. Vraskou, M. Díaz, S. MacKenzie i J. V. Planas

(per cèl·lules immunitàries circulants) o de manera local per macròfags residents o infiltrats en l’ovari. Per tant, sembla clar que els efectes negatius d’una infecció bacteriana sobre la reproducció són deguts, en gran part, a la producció i alliberació de citocines proinflamatòries i proapoptòtiques per part de les cèl·lules immunitàries. Malgrat això, cada cop sembla també més evident que les cèl·lules immunitàries i els factors que aquestes produeixen (incloent-hi les citocines) poden tenir un important paper fisiològic en la regulació de la funció gonadal (Wu et al., 2004). En el cas de l’ovari dels mamífers, se sap que el TNFα és un regulador essencial del creixement i diferenciació ovàrics (Spaczynski et al., 1999; Wang et al., 1992) i que en el procés de l’ovulació, que des de fa anys s’ha identificat com un fenomen inflamatori, es produeixen nombrosos factors immunitaris essencials per al trencament del fol·licle ovàric i l’expulsió de l’oòcit (Richards et al., 2008). És sorprenent, així doncs, que trobem en els teixits reproductors factors mediadors immunitaris tant en respostes immunitàries a infeccions amb patògens com en processos fisiològics normals. És possible que molts dels factors immunitaris produïts de manera fisiològica (és a dir, a concentracions fisiològiques baixes) al llarg de la reproducció passin a tenir accions negatives (p. ex., proapoptòtiques) quan la seva producció és enormement incrementada com a resultat de l’aparició d’estímuls patogènics. En peixos teleostis, existeix encara poca informació sobre els efectes d’una activació del sistema immunitari sobre el procés reproductiu. Ja que hi ha moltes espècies de peixos teleostis que es reprodueixen un cop a l’any, i que normalment produeixen i alliberen milers d’oòcits en el moment de l’ovulació, la incidència d’una infecció bacteriana en el moment de la posta pot posar en perill tot el conjunt de gàmetes que poden

donar lloc a una generació. Aquest problema és encara més patent en teleostis salmònids, en els quals, a causa del seu desenvolupament ovàric de tipus sincrònic, tots els fol·licles ovàrics presents dins dels ovaris es troben exactament en el mateix estat de desenvolupament. Fa alguns anys, el nostre grup de recerca va iniciar estudis per investigar els efectes d’una activació del sistema immunitari sobre la capacitat reproductiva en femelles de truita. Els estudis inicials van estar encaminats a estudiar els efectes de l’administració in vivo i in vitro de LPS sobre la funció ovàrica en femelles de truita en el període preovulatori (MacKenzie et al., 2006b). Com a paràmetres fisiològics es va examinar, en primer lloc, la capacitat de producció d’esteroides ovàrics (testosterona i 17α-hidroxiprogesterona) en resposta a l’hormona luteïnitzant (LH), gonadotrofina fisiològicament rellevant abans de l’ovulació (Planas i Swanson, 2007); en segon lloc, la capacitat de maduració oocitària en resposta a l’esteroide inductor de la maduració o MIS (17α,20β-dihidroxiprogesterona); en tercer lloc, la capacitat de contracció fol· licular; en quart lloc, la incidència d’apoptosi i, en últim lloc, els canvis d’expressió gènica en l’ovari. Aquests estudis van demostrar que l’administració de LPS, que en peixos s’ha vist que provoca una activació del sistema immunitari (Goetz et al., 2004; MacKenzie et al., 2006a, 2003), no altera la resposta esteroïdogènica dels fol·licles ovàrics, la capacitat de madurar dels oòcits en resposta al MIS ni la contracció fol·licular induïda per l’adrenalina. Malgrat això, l’administració de LPS va provocar un important augment de l’apoptosi en les cèl·lules fol·liculars que envolten l’oòcit, la qual cosa es va veure acompanyada per canvis en l’expressió de gens implicats en la regulació del cicle cel·lular i l’apoptosi (MacKenzie et al., 2006b). Ja que les cèl·lules fol·liculars afectades comprenen cèl·lules de la granulosa i

reproducció i creixement en peixos d’interès en aqüicultura 133

teca, responsables de la producció d’esteroides ovàrics i altres factors importants per al desenvolupament i maduració dels oòcits, és possible que l’administració de LPS tingui conseqüències negatives sobre l’ovari abans de l’ovulació en la truita. Per tant, podem dir que els peixos són sensibles, com els mamífers, als efectes proapoptòtics de LPS sobre l’ovari. Un altre resultat interessant obtingut en aquests estudis és el que fa referència a l’estimulació de la contracció en fol·licles incubats en presència de medi condicionat de macròfags de truita estimulats amb LPS in vitro. Això indica la presència d’algun factor(s) produït pels macròfags en resposta a l’LPS que estimula la contracció dels fol·licles ovàrics, la qual cosa suggereix que factors immunitaris podrien estar regulant el procés de contracció fol·licular, i en conseqüència l’ovulació, en peixos. En relació amb l’estimulació de la contracció fol·licular per factors immunitaris, sorgeix la qüestió si l’ovulació en peixos pot estar modulada pel sistema immunitari. Per tal d’abordar aquest problema, el nostre grup, en col·laboració amb Julien Bobe (SCRIBE-INRA, Rennes, França), ha començat estudis per conèixer concretament els efectes d’una activació del sistema immunitari (mitjançant el conegut tractament amb LPS in vivo) sobre l’ovulació. Així doncs, s’ha pogut determinar que l’administració de LPS en femelles de truita en el període periovulatori provoca un avanç de l’ovulació (Crespo et al., resultats no publicats) (vegeu la taula 1), la qual cosa concorda amb els resultats obtinguts in vitro amb medi condicionat de macròfags activats. Per tant, podem dir que l’activació del sistema immunitari per LPS, amb la conseqüent producció de citocines per part de les cèl·lules immunitàries, provoca el trencament de la paret fol·licular ovàrica i l’alliberament prematur dels oòcits (vegeu la figura 1). Tanmateix, s’ha examinat la viabilitat

i supervivència dels embrions que resulten d’oòcits ovulats prematurament com a resultat d’una immunoestimulació i s’ha observat que aquests embrions presenten una supervivència reduïda al voltant del 50 %, mesurada en els estadis d’aparició de l’ull (anglès, eyed-stage) i de reabsorció del sac vitel·lí (vegeu la taula 1). En resum, tenim per primer cop dades que indiquen clarament que una activació del sistema immunitari en femelles en el període ovulatori provoca un avanç de l’ovulació. Això comporta l’alliberament d’oòcits que no estan suficientment preparats per, un cop fertilitzats, donar lloc a embrions viables. Les conseqüències pràctiques d’aquests estudis són importants, ja que indiquen que qualsevol fenomen infecciós que tingui lloc en una població de reproductors al voltant del període de l’ovulació provocarà un avanç del mateix i una disminució important de la qualitat de la posta. En l’ovari dels mamífers i aus es creu que els efectes proapoptòtics i proinflamatoris de l’LPS estan mediats per la secreció de citocines proapoptòtiques i proinflamatòries com el TNFα (MacKenzie et al., 2003). En segon lloc, TNFα s’expressa en l’ovari de la truita (Bobe i Goetz, 2001) i la seva expressió és estimulada per l’administració de LPS in vivo (Crespo i Planas, resultats no publicats). En tercer lloc, en l’ovari de la truita s’ha identificat un receptor decoy de TNFα i la seva expressió és elevada en les cèl·lules de la granulosa de l’ovari postovulatori (Bobe i Goetz, 2000). Aquest tipus de receptor és del tipus soluble i té la capacitat d’unirse al TNFα i reduir la seva activitat biològica interferint amb la capacitat del TNFα d’unir-se als seus receptors de membrana. En el cas concret d’aquest receptor soluble de TNFα, el seu paper podria ser el de protegir el fol·licle postovulatori dels efectes proapoptòtics de la citocina. Per tal d’investigar el possible paper mediador de TNFα

134 N. Roher, D. Crespo, Y. Vraskou, M. Díaz, S. MacKenzie i J. V. Planas Taula 1. Efectes de l’administració de lipopolisacàrid (LPS) sobre la incidència de l’ovulació i la supervivència de la progènie en femelles de truita en estadi preovulatori Salí

LPS

Ovulació (%)

35,3

67,06

Supervivència a l’estadi ullat (%)

97,49 ± 0,9

41,59 ± 23,6

Supervivència a l’estadi de reabsorció del sac vitel·lí (%)

89 ± 4

52 ± 16

en la resposta ovàrica a l’LPS en la truita, hem generat TNFα recombinant de truita per examinar els seus efectes directes sobre els fol·licles ovàrics. Així doncs, hem observat que TNFα provoca una disminució en la viabilitat de les cèl·lules granuloses en fol·licles ovàrics exposats a aquesta citocina, i que aquest efecte és degut a un augment de l’apoptosi (Bonnet et al., 2008). Per tant, podem proposar que en la truita els efectes proapoptòtics de l’LPS in vivo en l’ovari poden estar mediats pel TNFα. Malgrat que no es coneixen els efectes de TNFα sobre la contracció fol·licular i l’ovulació, podem dir que, fins ara, els resultats existents suggereixen que una activació del sistema immunitari en resposta a patògens abans de l’ovulació podria promoure l’apoptosi mediada per TNFα en l’ovari, avançar l’ovulació i, com a resultat, provocar una important davallada en la qualitat de la posta. EL SISTEMA IMMUNITARI I EL CREIXEMENT I METABOLISME EN PEIXOS El múscul esquelètic és un dels compartiments cel·lulars més extensos en els vertebrats, i en peixos representa aproximadament un 60 % del pes corporal. El múscul esquelètic no solament és important per a la locomoció, sinó que té un paper essencial en l’homeòstasi metabòlica i nutricional de l’animal. En un procés infecciós com el que s’ha descrit abans, el múscul esquelè-

tic és una diana important per als factors immunitaris produïts com a resultat de l’activació del sistema immunitari. En mamífers, estats patològics greus com les infeccions cròniques o estats avançats de càncer, o els efectes metabòlics de la resposta inflamatòria sistèmica que es desenvolupa en resposta a estats patològics greus com infeccions cròniques o càncer, donen lloc molt freqüentment a un procés de destrucció tissular anomenat caquèxia. Aquest procés està caracteritzat típicament per elevats nivells de citocines en sang, i es pensa que les citocines són les responsables de la degradació de proteïnes del múscul esquelètic per proteòlisis (Rectenwald i Moldawer, 2002). Les proteïnes alliberades pel múscul esquelètic són utilitzades pel fetge per dur a terme la gluconeogènesi i pel sistema immunitari i pel tracte digestiu com a font d’energia. A part del fet que el múscul esquelètic és una diana important en processos infecciosos, cada vegada hi ha més dades que indiquen que aquest teixit té una capacitat immunològica pròpia, ja que pot participar en reaccions immunitàries locals i expressa una varietat sorprenent de factors immunitaris, tals com molècules de superfície, citocines i quimiocines, que confereixen un sistema protector a les fibres musculars (Nagaraju, 2001; Wiendl et al., 2005). En peixos teleostis, malauradament, no hi ha pràcticament informació disponible sobre les possibles conseqüències d’una infecció bacteriana sobre la funció del múscul esquelètic o sobre la possibilitat que aquest

reproducció i creixement en peixos d’interès en aqüicultura 135

teixit produeixi mediadors immunitaris. A causa de la importància del múscul esquelètic en el creixement i al fet que és la part de l’animal que es destina al consum humà, és important estudiar la resposta del múscul esquelètic en situacions d’immunoestimulació. Per aquest motiu, el nostre grup ha iniciat estudis per investigar els efectes d’una activació aguda del sistema immunitari sobre el múscul esquelètic de la truita mitjançant l’administració de LPS. En aquests estudis inicials s’ha abordat aquesta problemàtica des d’una perspectiva transcriptòmica i proteòmica per tal d’obtenir el patró de resposta global del múscul a

LPS Ronyó anterior

TNFα TNFα RI

OVA

b Inflamació

Ovulació

Quimiocines Citocines Factors bactericides

Proteases Inhibidors de proteases Remodelació tissular

TNFα OVULACIÓ

TNFα? Testosterona

Figura 1. Relació entre el sistema immunitari i la reproducció en la truita. a) L’administració de lipopolisacàrid bacterià (LPS), a través de l’estimulació de la producció de la citocina TNFα, té efectes sobre l’ovari. b) El TNFα és un factor important en el procés inflamatori que té lloc durant l’ovulació.

esquelètic en relació amb els gens i proteïnes expressades en aquest teixit que responen específicament a l’activació del sistema immunitari (Roher et al., 2007). L’anàlisi de metabòlits en sang i teixits en truites tractades amb LPS demostra que en la truita, com en els mamífers, hi ha una resposta metabòlica a l’LPS. Concretament, l’LPS provoca una mobilització de reserves energètiques, com es dedueix per la disminució del contingut de glicogen muscular i la disminució en plasma dels nivells de triglicèrids. Això indica que una activació del sistema immunitari per l’LPS implica una mobilització de reserves de glucosa en forma de glicogen i una utilització de triglicèrids per finançar el cost metabòlic de la infecció en l’hoste. Des del punt de vista del transcriptoma del múscul, podem distingir clarament dos tipus de resposta: una metabòlica i una altra immunitària (vegeu la figura 2). La resposta metabòlica a escala transcripcional està determinada per una disminució significativa de l’expressió de gens relacionats amb el metabolisme dels carbohidrats i amb el metabolisme oxidatiu en el múscul vermell, que és el múscul esquelètic de contracció lenta i aeròbica. Concretament, l’LPS disminueix l’expressió de gens implicats en la via glicolítica, com l’enolasa, l’hexocinasa, la fosfofructocinasa i la glucosa-isomerasa. D’altra banda, en el múscul blanc, de contracció ràpida i anaeròbic, hi ha un augment significatiu de l’expressió d’aquests gens metabòlics en resposta a l’LPS, la qual cosa concorda amb els canvis observats en l’expressió de les proteïnes corresponents (per anàlisi proteòmica) d’aquests enzims de la via glicolítica. El que resulta particularment interessant és l’aparició de gens immunitaris expressats en el múscul esquelètic de la truita i regulats diferencialment pel tractament in vivo amb LPS. D’especial interès són els gens implicats en la presentació d’antígens que, en general, aug-

136 N. Roher, D. Crespo, Y. Vraskou, M. Díaz, S. MacKenzie i J. V. Planas

menten la seva expressió en resposta a LPS. També són regulats de manera significativa per l’LPS gens implicats en la defensa contra patògens bacterians (p. ex., el precursor del lisozim C), i en la senyalització per citocines i quimiocines. Per tant, aquests resultats indiquen clarament que, com en els mamífers, el múscul esquelètic dels peixos teleostis està capacitat per presentar una resposta immunitària específica. Igual com s’ha vist anteriorment en el cas de l’ovari, l’activació d’una resposta immunitària local o sistèmica pot afectar la funcionalitat del múscul esquelètic a causa de la producció de mediadors immunitaris com, per exemple, les citocines. En mamífers és ben conegut el fet que la secreció de citocines proinflamatòries, com per exemple el a

LPS Ronyó anterior Múscul vermell

TNFα

Múscul blanc

b Efectes de LPS en múscul esquelètic: Ĺexpressió de gens de vía glicolítica en m. blanc ↓ expressió de gens de vía glicolítica en m. vermell ↑ expressió de gens immunitaris

Efectes del TNFα sobre cèl·lules musculars: Ĺcaptació de glucosa ↑ aparició de GLUT4 a la membrana plasmàtica

Figura 2. Relació entre el sistema immunitari i el creixement en la truita. a) L’administració de lipopolisacàrid bacterià (LPS), a través de l’estimulació de la producció de la citocina TNFα, té efectes sobre el múscul esquelètic. b) Efectes de l’LPS i el TNFα sobre el múscul esquelètic en la truita.

TNFα, pot afectar l’activitat de les cèl·lules del teixit muscular. En l’obesitat, que avui dia es considera una condició inflamatòria crònica (Dandona et al., 2004), els nivells plasmàtics de TNFα són elevats (Li i Reid, 2001) i hi ha molts estudis que apunten que el TNFα provoca resistència a la insulina, ja que actua sobre els teixits sensibles a la insulina, com són el múscul esquelètic, el teixit adipós i el fetge (Ruan et al., 2002), i té efectes importants sobre el metabolisme dels lípids, proteïnes i carbohidrats. De fet, el TNFα va ser anomenat inicialment caquectina, a causa dels seus efectes catabòlics quan el seus nivells en sang són elevats (en situacions patològiques com la sepsi o el càncer) i que, en casos extrems, resulten en una pèrdua de massa muscular important. Avui dia se sap que el TNFα pot actuar directament sobre les cèl·lules musculars i que aquestes presenten receptors funcionals per a aquest factor (Zhang et al., 2000). Un dels principals efectes d’aquesta citocina que condueixen a la resistència a la insulina és la seva capacitat per inhibir la captació de glucosa estimulada per la insulina a causa de la seva inhibició sobre el moviment del transportador de glucosa GLUT4 cap a la membrana plasmàtica, tal i com s’ha demostrat en cèl·lules musculars de rata (Alvaro et al., 2004) i en la línia cel·lular L6 (Bedard et al., 1997). Tanmateix, el TNFα té efectes sobre el creixement i diferenciació del múscul esquelètic, ja que inhibeix la diferenciació miogènica, bloqueja els efectes estimuladors de l’IGF-I sobre l’expressió de miogenina (Broussard et al., 2003) i inhibeix l’expressió de MyoD, un important regulador de la diferenciació del múscul esquelètic. Malgrat això, hi ha presents en la literatura diversos estudis que demostren que el TNFα no té efectes inhibidors sobre la captació de glucosa sinó que, al contrari, fins i tot pot arribar a incrementar la capacitat del múscul per captar glucosa. Per tant,

reproducció i creixement en peixos d’interès en aqüicultura 137

existeix avui dia la possibilitat que el TNFα no sigui per si sol el responsable de la resistència a la insulina en mamífers (Ciaraldi et al., 1998). En relació amb el possible paper del TNFα en peixos teleostis, hi ha multitud d’estudis que han caracteritzat els peixos teleostis, i concretament els salmònids, com a organismes intolerants a la insulina (Moon, 2001). Malgrat aquesta idea, estudis recents han demostrat que això no és totalment cert, i que la insulina, com en mamífers, incrementa, per un costat, la quantitat total (tant de proteïna com de mRNA) de GLUT4 en el múscul esquelètic (Capilla et al., 2002; Diaz et al., 2007b) i, per un altre costat, estimula l’aparició de GLUT4 a la membrana plasmàtica de manera ràpida (Diaz et al., 2007a). Aquests resultats indiquen que la regulació de la captació de glucosa per la insulina en peixos teleostis es realitza a traves del transportador de glucosa GLUT4 (Capilla et al., 2004; Diaz et al., 2007a). Per tant, un cop establert que els peixos teleostis no són realment resistents a la insulina, existeix la possibilitat que l’expressió i el moviment de GLUT4 cap a la membrana plasmàtica en les cèl·lules del múscul esquelètic en peixos teleostis estigui regulada per citocines produïdes pel sistema immunitari. Tal com s’ha indicat abans, els macròfags activats de truita produeixen TNFα en resposta a un estímul immunològic com és l’LPS (MacKenzie et al., 2003) i també s’ha demostrat que el TNFα actua sobre el teixit adipós de la truita mobilitzant lípids (Albalat et al., 2005). Per tal d’investigar sobre una possible acció del TNFα sobre el múscul esquelètic de la truita, el nostre grup ha utilitzat dos models cel·lulars per establir els efectes directes del TNFα. En primer lloc, s’ha utilitzat un cultiu primari de cèl·lules musculars de truita en el qual s’han descrit la presència de receptors d’insulina i IGF-I i els efectes metabòlics d’aquestes dues hormo-

nes (Castillo et al., 2004; Castillo et al., 2002). Utilitzant TNFα recombinant de truita en aquest model cel·lular, hem demostrat que el TNFα, a concentracions no patològiques, té efectes estimuladors sobre la captació de glucosa, igual com s’ha demostrat en la línia cel·lular muscular de rata L6 (Roher et al., 2008). En segon lloc, hem utilitzat una línia cel·lular L6 que expressa de manera estable el GLUT4 de truita (Diaz et al., 2007a) i hem demostrat també que els efectes estimuladors de TNFα sobre la captació de glucosa són deguts a l’estimulació per part del TNFα del moviment de GLUT4 de truita cap a la membrana plasmàtica. Per tant, la citocina proinflamatòria TNFα, a concentracions fisiològiques, pot potenciar la captació de glucosa per part del múscul esquelètic. Això suggereix, tal com s’ha indicat en mamífers, que TNFα possiblement és un factor immunitari amb un paper fisiològic rellevant quant a la regulació del metabolisme dels carbohidrats en peixos teleostis. Malgrat això, no es coneixen els efectes d’una alliberació massiva de TNFα sobre el múscul esquelètic en situacions d’una inflamació important. CONCLUSIONS Amb aquests estudis s’han descrit els efectes d’una activació del sistema immunitari sobre la funció ovàrica i la funció del múscul esquelètic en peixos teleostis. Aquests estudis poden establir la base per a futurs estudis destinats a examinar amb més detall les conseqüències reals d’una infecció sobre la reproducció i el creixement. Aquests estudis ens aportaran dades sobre els efectes patològics d’una infecció sobre aquests dos processos, però també provaran l’important paper que poden tenir factors típicament produïts pel sistema immunitari en la funció normal (fisiològica) en

138 N. Roher, D. Crespo, Y. Vraskou, M. Díaz, S. MacKenzie i J. V. Planas

teixits no immunitaris, com les gònades i el múscul esquelètic. BIBLIOGRAFIA Albalat, A.; Liarte, C.; MacKenzie, S.; Tort, L.; Planas, J. V.; Navarro, I. (2005). «Control of adipose tissue metabolism by tumor necrosis factor alpha in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)». J. Endocrinol., 184: 527-534. Alvaro, C.; Teruel, T.; Hernandez, R.; Lorenzo, M. (2004). «Tumor necrosis factor alpha produces insulin resistance in skeletal muscle by activation of inhibitor kappaB kinase in a p38 MAPK-dependent manner». J. Biol. Chem., 279: 17070-17078. Bedard, S.; Marcotte, B.; Marette, A. (1997). «Cytokines modulate glucose transport in skeletal muscle by inducing the expression of inducible nitric oxide synthase». Biochem. J., 325: 487-493. Besnard, N.; Horne, E. A. L.; Whitehead, S. A. (2001). «Prolactin and lipopolysaccharide treatment increased apoptosis and atresia in rat ovarian follicles». Acta Physiol. Scand., 172: 17-25. Bobe, J.; Goetz, F. W. (2000). «A tumor necrosis factor decoy receptor homologue is up-regulated in the brook trout (Salvelinus fontinalis) ovary at the completion of ovulation». Biol. Reprod., 62: 420-426. Bobe, J.; Goetz, F. W. (2001). «Molecular cloning and expression of a TNF receptor and two TNF ligands in the fish ovary». Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol., 129: 475-481. Bonnet, E.; Crespo, D.; Roher, N.; MacKenzie, S.; Goetz, F. W.; Bobe, J.; Planas, J. V. (2008). «Reproductive consequences of an immune challenge during the preovulatory period in trout: possible mediatory role of tumor necrosis factor α». Cybium. [En premsa] Boshra, H.; Wang, T.; Hove-Madsen, L.; Hansen, J.; Li, J.; Matlapudi, A.; Secombes, C. J.; Tort, L.; Sunyer, J. O. (2005). «Characterization of a C3a receptor in rainbow trout and Xenopus: the first identification of C3a receptors in nonmammalian species». J. Immunol., 175: 2427-2437. Broussard, S. R.; McCusker, R. H.; Novakofski, J. E.; Strle, K.; Shen, W. H.; Johnson, R. W.; Freund, G. G.; Dantzer, R.; Kelley, K. W. (2003). «Cytokinehormone interactions: tumor necrosis factor alpha impairs biologic activity and downstream activation signals of the insulin-like growth factor I receptor in myoblasts». Endocrinology, 144: 29882996.

Capilla, E.; Diaz, M.; Albalat, A.; Navarro, I.; Pessin, J. E.; Keller, K.; Planas, J. V. (2004). «Functional characterization of an insulin-responsive glucose transporter (GLUT4) from fish adipose tissue». Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 287: E348-357. Capilla, E.; Diaz, M.; Gutierrez, J.; Planas, J. V. (2002). «Physiological regulation of the expression of a GLUT4 homolog in fish skeletal muscle». Am. J. Physiol. Endocrinol Metab., 283: E44-49. Castillo, J.; Codina, M.; Martinez, M. L.; Navarro, I.; Gutierrez, J. (2004). «Metabolic and mitogenic effects of IGF-I and insulin on muscle cells of rainbow trout». Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 286: R935-941. Castillo, J.; Le Bail, P. Y.; Paboeuf, G.; Navarro, I.; Weil, C.; Fauconneau, B.; Gutierrez, J. (2002). «IGF-I binding in primary culture of muscle cells of rainbow trout: changes during in vitro development». Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 283: R647-652. Ciaraldi, T. P.; Carter, L.; Mudaliar, S.; Kern, P. A.; Henry, R. R. (1998). «Effects of tumor necrosis factor-alpha on glucose metabolism in cultured human muscle cells from nondiabetic and type 2 diabetic subjects». Endocrinology, 139: 4793-4800. Dandona, P.; Aljada, A.; Bandyopadhyay, A. (2004). «Inflammation: the link between insulin resistance, obesity and diabetes». Trends Immunol., 25: 4-7. Diaz, M.; Antonescu, C. N.; Capilla, E.; Klip, A.; Planas, J. V. (2007a). «Fish glucose transporter (GLUT)-4 differs from rat GLUT4 in its traffic characteristics but can translocate to the cell surface in response to insulin in skeletal muscle cells». Endocrinology, 148: 5248-5257. Diaz, M.; Capilla, E.; Planas, J. V. (2007b). «Physiological regulation of glucose transporter (GLUT4) protein content in brown trout (Salmo trutta) skeletal muscle». J. Exp. Biol., 210: 2346-2351. Entrican, G.; Wheelhouse, N. M. (2006). «Immunity in the female sheep reproductive tract». Vet. Res., 37: 295-309. Goetz, F. W.; Iliev, D. B.; McCauley, L. A. R.; Liar te, C. Q.; Tort, L. B.; Planas, J. V.; MacKenzie, S. (2004). «Analysis of genes isolated from lipopolysaccharide-stimulated rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) macrophages». Mol. Immunol., 41: 1199-1210. Li, J.; Barreda, D. R.; Zhang, Y. A.; Boshra, H.; Gelman, A. E.; Lapatra, S.; Tort, L.; Sunyer, J. O. (2006). «B lymphocytes from early vertebrates have potent phagocytic and microbicidal abilities». Nat. Immunol., 7: 1116-1124. Li, Y. P.; Reid, M. B. (2001). «Effect of tumor necrosis

reproducció i creixement en peixos d’interès en aqüicultura 139

factor-alpha on skeletal muscle metabolism». Curr. Opin. Rheumatol., 13: 483-487. MacKenzie, S.; Iliev, D.; Liarte, C.; Koskinen, H.; Planas, J. V.; Goetz, F. W.; Molsa, H.; Krasnov, A.; Tort, L. (2006a). «Transcriptional analysis of LPS-stimulated activation of trout (Oncorhynchus mykiss) monocyte/macrophage cells in primary culture treated with cortisol». Mol. Immunol., 43: 1340-1348. MacKenzie, S.; Montserrat, N.; Mas, M.; Acerete, L.; Tort, L.; Krasnov, A.; Goetz, F. W.; Planas, J. V. (2006b). «Bacterial lipopolysaccharide induces apoptosis in the trout ovary». Reprod. Biol. Endocrinol., 4: 46. MacKenzie, S.; Planas, J. V.; Goetz, F. W. (2003). «LPSstimulated expression of a tumor necrosis factoralpha mRNA in primary trout monocytes and in vitro differentiated macrophages». Develop. Comp. Immunol., 27: 393-400. Moon, T. W. (2001). «Glucose intolerance in teleost fish: fact or fiction?». Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 129: 243-249. Nagaraju, K. (2001). «Immunological capabilities of skeletal muscle cells». Acta Physiol. Scand., 171: 215223. Nicola, N. A. (1994). Guidebook to cytokines and their receptors. Nova York: Oxford University Press. Planas, J. V.; Swanson, P. (2007). «Physiological function of gonadotropins in fish». A: Rocha, M. J.; Arukwe, A.; Kapoor, B. G. [ed.]. Fish reproduction. Enfield: Science Publishers, 37-66. Rectenwald, J. E.; Moldawer, L. L. (2002). «Skeletal muscle and cytokines in sepsis and severe injury». A: Preedy, V. R.; Peters, T. J. [ed.]. Skeletal muscle: pathology, diagnosis and management of disease. Cambridge: Cambridge University Press, 301-310. Richards, J. S.; Liu, Z.; Shimada, M. (2008). «Immunelike mechanisms in ovulation». Trends Endocrinol. Metab., 19: 191-196. Roher, N.; Krasnov, A.; Mackenzie, S.; Planas, J. V. (2007). «Transcriptomic and proteomic analyses of skeletal muscle in LPS stimulated rainbow trout (Onchorhyncus mykiss)». Aquaculture, 272: S305S306. Roher, N.; Samokhvalov, V.; Diaz, M.; MacKenzie, S.;

Klip, A.; Planas, J. V. (2008). «The proinflammatory cytokine tumor necrosis factor-alpha increases the amount of glucose transporter-4 at the surface of muscle cells independently of changes in interleukin-6». Endocrinology, 149: 1880-1889. Ruan, H.; Hacohen, N.; Golub, T. R.; Parijs, L. van; Lodish, H. F. (2002). «Tumor necrosis factor-alpha suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNFalpha is obligatory». Diabetes, 51: 1319-1336. Sancho-Tello, M.; Tash, J. S.; Roby, K. F.; Terranova, P. F. (1993). «Effects of lipopolysaccharide on ovarian function in the pregnant mare serum gonadotropin-treated immature rat». Endocr. J., 1: 503512. Shakil, T.; Snell, A.; Whitehead, S. A. (1994). «Effects of lipopolysaccharide and cyclosporin on the endocrine control of ovarian function». J. Reprod. Fertil., 100: 57-64. Sharara, F. I.; Seifer, D. B.; Flaws, J. A. (1998). «Environmental toxicants and female reproduction». Fertil. Steril., 70: 613-622. Spaczynski, R. Z.; Arici, A.; Duleba, A. J. (1999). «Tumor necrosis factor-α stimulates proliferation of rat ovarian theca-interstitial cells». Biol. Reprod., 61: 993-998. Wang, L. J.; Brannstrom, M.; Robertson, S. A.; Norman, R. J. (1992). «Tumor necrosis factor alpha in the human ovary: presence in follicular fluid and effects on cell proliferation and prostaglandin production». Fertil. Steril., 58: 934-940. Wiendl, H.; Hohlfeld, R.; Kieseier, B. C. (2005). «Immunobiology of muscle: advances in understanding an immunological microenvironment». Trends Immunol., 26: 373-380. Wu, R.; Hoek, K. H. van der; Ryan, N. K.; Norman, R. J.; Robker, R. L. (2004). «Macrophage contributions to ovarian function». Hum. Reprod. Update, 10: 119-133. Zhang, Y.; Pilon, G.; Marette, A.; Baracos, V. E. (2000). «Cytokines and endotoxin induce cytokine receptors in skeletal muscle». Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 279: E196-205.

DOI: 10.2436/20.1501.02.63

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 141-150

BIOTECNOLOGIA REPRODUCTIVA EN PORCÍ: ESTAT ACTUAL I REPTES DE FUTUR Sergi Bonet, Maria Dolors Briz, Elisabeth Pinart, Silvia Sancho, Eva Bussalleu, Marc Yeste, Isabel Casas, Anna Fábregas, Marta Puigmulé, Estela García, Mónica Santos, Eva Torner i Sílvia Micaló TechnoSperm. Parc Científic i Tecnològic de la Universitat de Girona. Adreça per a la correspondència: Sergi Bonet. TechnoSperm. Parc Científic i Tecnològic de la Universitat de Girona, porta E, edifici Jaume Casademont. Pic de Peguera, 15. 17003 Girona. Adreça electrònica: sergi.bonet@udg.edu. RESUM La biotecnologia reproductiva en porcí inclou les diverses tècniques d’anàlisi de la qualitat seminal i les tècniques de reproducció assistida. Els objectius fonamentals són garantir la seguretat biològica, permetre’n la traçabilitat i incrementar (o estabilitzar) el rendiment reproductiu. Entre les tècniques d’anàlisi de la qualitat seminal destaquem les de determinació de qualitat espermàtica (concentració, motilitat, viabilitat, integritat de membranes i del DNA), les de control de l’estat sanitari (PCR-RT per a detecció de virus i bacteris) i les de determinació del poder fecundant i de la resistència osmòtica. Entre les tècniques de reproducció assistida es practiquen la inseminació artificial (cervical, postcervical i intrauterina), la fecundació in vitro, la injecció intracitoplasmàtica d’espermatozoides, la vitrificació embrionària, la transferència embrionària no quirúrgica, la criopreservació espermàtica, el sexatge d’espermatozoides i d’embrions, el clonatge reproductiu i terapèutic i la transgènesi. Paraules clau: reproducció assistida, semen, porcí, biotecnologia, Sus domesticus. REPRODUCTIVE BIOTECHNOLOGY IN PORCINE: THE CURRENT STATE AND CHALLENGES OF FUTURE SUMMARY Reproductive biotechnology in porcine includes several techniques of analysis of the seminal quality and techniques of assisted reproduction. The main goals are guaranteeing the biological security, allowing the traceability and increasing (or stabilizing) the repro-

142 S. Bonet et al.

ductive yield. Among the techniques of analysis of the seminal quality we highlight those of sperm quality (concentration, motility, viability, integrity of membranes and DNA), those of sanitary control (PCR-RT for the detection of virus and bacteria) and those of determination of fertilizing ability and osmotic resistance. Among the assisted reproduction techniques, there is artificial insemination (cervical, postcervical and intrauterine), in vitro fertilization, intracytoplasmic injection of spermatozoa, embryonic vitrification, non surgical embryonic transfer, sperm cryopreservation, spermatozoa and embryos sexing, reproductive and therapeutic cloning, and transgenity. Key words: assisted reproduction, semen, porcine, biotechnology, Sus domesticus.

INTRODUCCIÓ La recerca en biotecnologia de la reproducció porcina és objecte de l’activitat de nombrosos grups d’investigació estatals (Bonet et al., 2006), entre els quals destaquen els dirigits per Juan Carlos Domínguez, de la Universitat de Lleó, el d’Ignacio Badiola, de l’Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentària, el de Juan Enrique Rodríguez, de la Universitat Autònoma de Barcelona, el de Luis Jesús García i Fernando Juan Peña, de la Universitat d’Extremadura, el de Pedro García i Raúl Sánchez, de l’Instituto Nacional de Investigación Agraria y Alimentaria, el d’Emilio Martínez i Pilar Coy, de la Universitat de Murcia, el de Carles Soler, de la Universitat de València, i el de Sergi Bonet, de la Universitat de Girona. Aquests onze grups de recerca, juntament amb vint-i-una empreses del sector, han constituït la Red Temática de Reproducción Porcina, una estructura de dinamització del sistema ciència-tecnologia-empresa que va comptar amb un ajut procedent del Ministeri d’Educació i Ciència a partir del Programa de Acciones Complementarias (AGL2002-12277-E). La biotecnologia de la reproducció porcina compta també amb nombrosos grups de recerca de referència internacional; entre d’altres destaquen els dirigits per P. F Watson i W. V. Holt, del Royal Veterinary College de la Universitat de Londres (RU), i per L.

A. Johnson i V. G. Pursell, del Reproduction Laboratory of Beltsville (EUA). La R + D + i del sector porcí s’orienta en quatre àmbits d’actuació: a) la seguretat reproductiva (l’increment i estabilització del rendiment reproductiu en termes de fertilitat i prolificitat), b) la seguretat genètica (creació de reserves de material genètic i de bancs de germoplasma, semen i embrions), c) la seguretat sanitària (millora del control sanitari de les dosis seminals refrigerades o criopreservades), i d) la seguretat alimentària (traçabilitat a partir de la determinació de marcadors moleculars de la qualitat de la carn) (Pruneda et al., 2005; Bussalleu et al., 2005). El sector porcí s’organitza en nuclis de selecció (granges en les quals es milloren les races pures), centres de multiplicació (granges en les quals es duen a terme els encreuaments entre races pures), empreses de producció (granges en les quals té lloc la cria i engreix dels garrins) i escorxadors i sales d’especejament, que subministren a carnisseries i empreses de productes elaborats (assecadors de pernils, empreses d’embotits, empreses de cosmètica, etc.). Comercialment, el sector porcí es deu a la llei de l’oferta i la demanada. El producte final que prefereix el consumidor varia en funció dels costums gastronòmics del país (preferències organolèptiques, tradicions culinàries, creences religioses, etc) i del

Biotecnologia reproductiva en porcí: estat actual i reptes de futur 143

grau de desenvolupament econòmic del país. Legalment, el sector porcí es deu a les legislacions autonòmica, estatal i europea en els camps sanitari i del transport (importació i exportació intra i intercomunitària) d’animals vius, productes elaborats, gàmetes, embrions, etc. L’Estat espanyol és un dels països en què es consumeix més carn de porc (66 % del total de carn consumida). A la Xina el consum de carn de porc representa un 34 % del total de la carn consumida; a la Unió Europea representa el 44 %, als EUA el 31 %, al Regne Unit el 25 % i a Alemanya el 54 %. L’Estat espanyol, juntament amb Alemanya, són els països líders en la producció de carn de porcí. Les aproximadament 25.00026.000 truges (mares) presents als centres de multiplicació de cadascun d’aquests dos països contrasten amb el cens de mares a França (15.000), a Itàlia (9.000) i a Bèlgica (6.000). Així doncs, l’Estat espanyol és un dels principals consumidors i productors de carn de porc i, en aquest sentit és, juntament amb Alemanya, un dels principals exportadors de la Unió Europea. TÈCNIQUES D’ANÀLISI SEMINAL

tre velocitat curvilínia (VCL), velocitat lineal (VSL), velocitat mitjana (VAP), linealitat de la trajectòria (LIN = VSL/VCL), rectitud de la trajectòria (STR = VSL/VAP), oscil· lació de la trajectòria (WOB = VAP/VCL), freqüència de batuda de la cua (BCF) i desplaçament lateral del cap (ALH). La morfologia espermàtica, és a dir, la classificació i recompte percentual d’espermatozoides madurs, immadurs (amb gota proximal o distal) i aberrants (de cua o de cap), s’examina també al microscopi de contrast de fase i amb un CASA (vegeu la figura 1) (Bonet et al., 2000; Bassols et al., 2004, 2005). La viabilitat espermàtica, és a dir, el percentatge d’espermatozoides viables i no viables, sol determinar-se a partir de la coloració amb fluorocroms i l’anàlisi posterior mitjançant microscòpia òptica de fluorescència o citometria de flux. Especialment interessants són els resultats obtinguts amb els fluorocroms iodur de propidi i diacetat de carboxifluoresceïna amb microscòpia de fluorescència (vegeu la figura 2), i els fluorocroms iodur de propidi i SYBR-14 amb citometria de flux (vegeu la figura 3) (Bussalleu et al. 2008). La integritat de les membranes plasmàtica, acrosòmica i mitocondrial (vegeu la

Per a l’anàlisi de la qualitat espermàtica (concentració, morfologia i motilitat espermàtiques) s’utilitza un sistema automàtic d’anàlisi seminal (CASA, Computer Assisted Semen Analysis) (ISAS, Integrated Semen Analisis System). Diverses cases comercials (Microptic SL, Minitüb Ibèrica SL, IMV Technologies, etc.) ofereixen equipaments integrats, dotats d’un microscopi amb contrast de fases, d’una càmera de vídeo digital i d’un programa específic d’anàlisi d’imatge. Especialment interessant és la informació que ofereixen aquests sistemes pel que fa a la qualitat del moviment dels espermatozoides, que distingeixen en-

Figura 1. Anàlisi de la morfologia espermàtica al microscopi de contrast de fase i amb l’ajut del sistema CASA.

144 S. Bonet et al.

figura 4) és avaluada a partir de la múltiple tinció amb els fluorocroms bisbenzamida (DNA blau, cèl·lules viables), iodur de propidi (DNA vermell, cèl·lules no viables), Mitotracker Green FM (beina mitocondrial, verd intens, integritat) i Alexa Fluor 488 (acrosoma, verd poc intens, intacte) (Bussalleu et al., 2005; Pruneda et al., 2006). La resistència dels espermatozoides als xocs osmòtics (vegeu la figura 5) es posa de

manifest després de sotmetre les cèl·lules a medis hipoosmòtics i isoosmòtics i avaluar, per microscòpia de contrast de fases, la integritat funcional de la membrana plasmàtica (HOST, hypoosmotic swelling test) o de la membrana acrosòmica (ORT, osmotic resistance test) (Medrano et al., 2006). La 4integritat o fragmentació del DNA és FIGURA

MS MS

Figura 2. Anàlisi de vitalitat espermàtica al microscopi de fluorescència amb els fluorocroms iodur de propi-

N 3

2 4

Figura 3. Anàlisi de la vitalitat espermàtica al citòmetre de flux utilitzant els fluorocroms iodur de propidi (IP) i SYBR-14.

Figura 4. Anàlisi de la integritat de membranes al microscopi de fluorescència mitjançant el marcatge múltiple amb els fluorocroms bisbenzamida (DNA, blau, cèl·lules viables), iodur de propidi (DNA, vermell, cèl·lules no viables), Mitotracker Green FM (beina mitocondrial, verd in4 5 tens, integritat) i Alexa Fluor 488 (acrosoma, verd dèbil, intacte). 1) Espermatozoides viables amb l’acrosoma i la beina mitocondrial intactes. Els nuclis dels espermatozoides viables emeten una fluorescència blava intensa (1a), i els seus acrosomes i beines mitocondrials estan intactes i emeten una fluorescència verda dèbil i moderada (respectivament) (b). 2) Espermatozoide viable amb l’acrosoma intacte (A) i la beina mitocondrial intacta (MS). 3) Espermatozoide viable amb l’acrosoma reaccionat (A) i la beina mitocondrial intacta (MS). 4) Espermatozoide no viable amb l’acrosoma intacte i la beina mitocondrial intacta (MS). La intensa fluorescència vermella del nucli (N) emmascara la fluorescència verda i dèbil de l’acrosoma intacte. 5) Espermatozoide no viable amb l’acrosoma reaccionat (A), la beina mitocondrial alterada (MS) i el nucli amb fluorescència vermella (N).

Biotecnologia reproductiva en porcí: estat actual i reptes de futur 145

FIGURA 5

H–

H+

Figura 5. Test d’endosmosi (HOST o hypoosmotic swelling test) per mesurar la integritat funcional de la membrana plasmàtica.

Figura 6. Test SCD (sperm chromatin dispersion) a partir de la tinció Wright per a microscòpia òptica.

avaluada a partir del test SCD (sperm chromatin dispersion). Aquesta tècnica presenta dues possibles variacions en funció de si s’utilitza la tinció de Wright (vegeu la figura 6) per al microscopi òptic de camp clar o la tinció amb fluorocroms (CCF-RG) per al microscopi de fluorescència (vegeu la figura 7) (Flores et al., 2008). Per al control sanitari del semen, és dir, la determinació de contaminació vírica (virus d’Aujeszky, PRRS, etc.) o bacteriana (Escherichia, Brucella, etc.), s’utilitza la PCR convencional o la PCR-RT, perquè ofereixen, respecte d’altres mètodes d’anàlisi (cultius, serologia, etc.) més rapidesa i més precisió (vegeu la figura 8) (Bonet et al., 2006). La determinació de proteïnes solubilitzades (senyalització cel·lular) s’estudia a partir de tècniques electroforètiques d’alta especificitat, com la transferència western (immunoblotting) (vegeu la figura 9) (Bonet et al., 2006; Bassols et al., 2007; Sancho et al., 2007). El poder fecundant del semen sol determinar-se, in vitro, pel test de fecundació homòloga (o heteròloga) d’oòcits. En porcí s’ha demostrat que no hi ha una bona correlació entre el poder fecundant in vitro del

Figura 7. Test SCD (sperm chromatin dispersion) a partir de tinció amb fluorocroms (CCF-RG) per a microscopi de fluorescència (Sperm-Sus-Halomax).

146 S. Bonet et al.

semen i la fertilitat in vivo. En aquesta espècie, el test de penetració homòloga de la zona pel·lúcida d’oòcits immadurs s’utilitza en treballs de recerca bàsica relacionats amb els processos de reconeixement espermatozoide-oòcit, de reacció acrosòmica, de penetració de la zona pel·lúcida, etc. (Bonet et al., 2006). TÈCNIQUES DE REPRODUCCIÓ ASSISTIDA Les principals tècniques de reproducció assistida utilitzades en l’espècie porcina són: la inseminació artificial, la criopreservació espermàtica, la fecundació in vitro, la

fecundació assistida, la vitrificació embrionària, la transferència embrionària, el sexatge de semen i d’embrions, el clonatge reproductiu i terapèutic i la transgènesi. La inseminació artificial (IA) en porcí es pot practicar dipositant les dosis seminals a tres nivells: cervical, postcervical i intrauterí. Tradicionalment, la IA cervical (convencional) s’utilitza per a dosis de semen refrigerat i la IA intrauterina (profunda) es reserva per a dosis seminals descongelades o sexades (vegeu la figura 10). Recentment, es va estenent la pràctica de la IA postcervical, tant per a dosis seminals refrigerades com descongelades, pels avantatges que ofereix respecte a la IA convencional o la IA intraterina, respectivament. En la IA postcervical, en comparació de la IA convencional, es redueix el volum de la dosi seminal

Figura 8. PCR múltiple per a detecció de circovirus porcí (PCV).

Catèter cànula DUI Catèter cànula PCAI

Catèter SAI

Figura 9. Anàlisi de proteïnes solubilitzades amb transferència western (immunoblotting).

Figura 10. Esquema del lloc de deposició del semen a l’úter i dels diversos tipus de catèter (IA, convencional o SAI; IA, postcervical o PCAI; IA, intrauterina profunda o DUI).

Biotecnologia reproductiva en porcí: estat actual i reptes de futur 147

refrigerada (30 ml vs. 80-100 ml) i la concentració espermàtica (1 × 109 espermatozoides vs. 3 × 109 espermatozoides); és a dir, l’ús de la IA postcervical permet optimitzar costos i mantenir uns bons resultats en termes de fertilitat i prolificitat. La pràctica de la IA intrauterina per a semen descongelat presenta un punt feble que en limita l’ús rutinari: la complexitat anatòmica de l’úter d’una truja i la necessitat d’expertesa en el maneig del catèter utilitzat són dos factors limitants del seu ús. Tradicionalment, per a IA intrauterina una dosi seminal descongelada sol contenir unes 3-4 palletes de 0,5 ml amb 0,5 × 109 espermatozoides/palleta; actualment s’estan practicant inseminacions amb catèters postcervicals (IA postcervical) amb dosis seminals que contenen sis palletes de 0,5 ml amb 0,5 × 109 espermatozoides/palleta. Els bons resultants obtinguts, en termes de fertilitat, i la facilitat d’us del catèter postcervical, fan que una de les línies de recerca actualment més demanades pel sector porcí sigui l’optimització de la IA postcervical per a semen descongelat. La criopreservació espermàtica en porcí està especialment indicada per a l’exportació i importació de semen, per a la creació de bancs de germoplasma i per a la millora de la planificació de les inseminacions. Cal tenir present que la fertilitat i la prolificitat obtingudes amb semen descongelat i IA intrauterina són sensiblement inferiors a les que s’obtenen amb semen refrigerat i IA convencional. A més, s’observa una elevada variabilitat entre mascles reproductors pel que fa a la qualitat del semen descongelat, i es distingeix entre mascles bons congeladors de semen i mascles mals congeladors de semen. Les causes d’aquest empobriment del semen descongelat recauen en la característica composició del plasmalema de l’espermatozoide de porcí, molt ric en fosfolípids insaturats i pobre en colesterol. La criopreservació espermàtica provoca una pèrdua

de la permeabilitat selectiva, la formació de radicals ROS, la desorganització dels dominis de membrana, la disminució de la qualitat espermàtica (en termes de motilitat i viabilitat) i la criocapacitació prematura (reacció acrosòmica prematura i pèrdua de la capacitat de reconeixement espermatozoide-oòcit). Aquests efectes en el semen descongelat provoquen una disminució de les taxes de fecundació in vivo i, en conseqüència, una subfertilitat expressada en uns índexs baixos de fertilitat i prolificitat. Les investigacions actuals es dirigeixen envers la determinació de marcadors moleculars que puguin ser considerats com a indicadors de congelabilitat (Pruneda et al., 2007b). La fecundació in vitro (FIV), la injecció intracitoplasmàtica d’espermatozoides (ICSI), la vitrificació embrionària i la transferència embrionària (TE) són pràctiques reservades a la recerca i, actualment, no utilitzades com a tècniques reproductives de camp. La FIV és una tècnica molt ben adaptada en porcí i amb excel·lents resultats; es procedeix a la dissecció d’ovaris i a l’aspiració d’oòcits immadurs, a la maduració in vitro, al cocultiu d’oòcits i d’espermatozoides (38,5 °C, 5 % CO2 i 95-100 % d’humitat) i al cultiu dels embrions durant nou dies, abans de la transferència o vitrificació. La vitrificació embrionària es duu a terme segons el mètode de l’open pulled straw (OPS). La vitrificació permet la creació de bancs de germoplasma, facilita i minimitza els costos del transport d’animals i redueix el risc sanitari associat al transport d’animals vius entre països. Per contra, la vitrificació embrionària en porcí ha de millorar els resultats en termes de supervivència embrionària i d’èxit en la transferència embrionària no quirúrgica (la TE d’embrions frescos ofereix una taxa de part del 70,8 % i unes camades de 6,9 garrins, mentre que la TE d’embrions desvitrificats només assoleix una taxa de part del 42,9 % i unes camades de

148 S. Bonet et al.

5,4 garrins). La transferència embrionària es practica per via no quirúrgica, amb un catèter intrauterí i amb embrions en estadis de mòrula o blastocist (jove o expandit). Per al sexatge d’embrions s’aïllen alguns blastòmers i es determina la presència o absència del cromosoma Y amb tècniques citogenètiques (cariotip), PCR o tècniques d’hibridació in situ. El sexatge d’embrions ofereix una elevada eficiència i condueix a una desviació del 100 % de la proporció de sexes embrionària. Per contra, el sexatge d’embrions en porcí està associat a unes baixes eficiències de la vitrificació embrionària i de la TE. A més, la International Embryo Transfer Society ha recomanat no fer ús del sexatge d’embrions, pel risc sanitari que comporta la manipulació de la zona pel·lúcida. El sexatge de semen es fa a partir del diferent contingut de DNA dels espermatozoides portadors del cromosoma X i del cromosoma Y, tenyits amb Hoechst 33342. La separació física d’ambdues poblacions s’aconsegueix per citometria de flux associada a un sorter. El sperm sorting en porcí presenta, avui dia, rendiments situats entre el 75-80 % i una baixa velocitat de sortida, que dificulta l’ús de l’esperma sexat en la pràctica rutinària de la inseminacions artificials de les granges. El clonatge reproductiu en porcí es practica en treballs de recerca a partir de la separació de blastòmers en estadi de mòrula i l’evolució embrionària posterior dels blastòmers aïllats. Per al clonatge terapèutic es procedeix a la transferència d’un nucli procedent d’una cèl·lula donant a un ooplasma receptor, és a dir, a un oòcit enucleat prèviament. La transgènesi en porcí s’aconsegueix per: a) transferència directa mitjançant la microinjecció de DNA (transgèn) en oòcits o espermatozoides, b) per transferència indirecta mitjançant la infecció amb retrovi-

rus (RNA) (transgèn) a oòcits o espermatozoides, i c) per manipulació (eliminació o substitució) d’un gen en cèl·lules mare que donen lloc a porcs que no tenen un gen (genoanul·lat). Els porcs transgènics obtinguts per transferència de material genètic estrany (DNA o RNA) (transgèn) són creats, fonamentalment, per obtenir bioreactors (productors de proteïnes humanes). Els porcs transgènics genoanul·lats solen ser creats per a xenotrasplantaments o per obtenir models clínics per estudiar diverses malalties. L’empresa PPL Therapeutics, a Virginia (EUA), ha obtingut el 2007 porcs genoanul· lats per a xenotrasplantaments. Han obtingut porcs per transferència nuclear (de fibroblasts fetals a oòcits enucleats) que tenen desactivat el gen que provoca el rebuig d’implants d’òrgans de porc a éssers humans (xenotrasplantaments). Una vegada eliminat el gen que codifica l’α1-3-galactosil-transferasa s’obtenen porcs transgènics que no presenten residus de galactosa en els seus endotelis i, en conseqüència, són menys proclius al rebuig agut de xenotrasplantaments Els xenotrasplantaments presenten un risc de transmissió de virus de l’espècie porcina a la humana. Els minipigs o micropigs (Instituto Tecnológico de Desarrollo Agrario de Aranjuez) són especialment utilitzats per als xenotrasplantaments per la seva facilitat de maneig i menor cost de producció. La Universitat de Pittsburg (EUA) va crear el 2007 porcs transgènics amb àcids grassos omega-3. Després de la transferència d’un gen (transgèn) procedent del cuc Caenorhabditis elegans a cèl·lules fetals de porc i el clonatge posterior d’aquestes en oòcits (i la transferència embrionària), es van obtenir dotze porcs, dels quals sis eren portadors del gen capaç de sintetitzar àcids grassos omega-3. D’aquesta manera s’han creat uns porcs amb greix ric en omega-3, un

Biotecnologia reproductiva en porcí: estat actual i reptes de futur 149

àcid gras present en peixos i d’efectes beneficiosos per als pacients afectats de malalties cardiovasculars. Malgrat que actualment no és legal la producció d’animals transgènics per al consum humà, la FDA als EUA podria aprovar properament la comercialització d’aquesta modalitat de porcs transgènics si es demostra que el seu consum no és perjudicial per a la salut. La Universitat d’Agricultura Nord-oriental de Pequín (Xina) ha creat el 2008 porcs transgènics que emeten llum verda fluorescent. S’ha procedit a la introducció d’un fragment de DNA (transgèn) que codifica una proteïna fluorescent en cèl·lules fibroblàstiques d’un embrió. El nucli modificat d’aquestes cèl·lules ha estat transferit a un oòcit enucleat i, practicada la transferència embrionària d’aquest embrió transgènic, ha nascut una truja transgènica fluorescent. Aquesta truja transgènica ha estat encreuada amb un mascle normal i el resultat d’aquest aparellament han estat dos garrins que també emetem llum fluorescent. Els unglots, el morro i la llengua dels dos garrins (d’una camada d’onze) brillen en la foscor, igual com li passa a la seva mare (vegeu la figura 11). En definitiva, l’Estat espanyol és un dels cinc primers motors de la producció porcina mundial i ofereix una recerca de referència internacional en l’àmbit de la biotecno-

Figura 11. Porcs procedents d’una mateixa camada, un amb el morro verd fluorescent i l’altre amb el morro normal.

logia reproductiva en porcí. Els principals objectius de la recerca en aquest camp són: a) incrementar el rendiment reproductiu i estabilitzar-lo al llarg de la vida reproductiva dels mascles, i b) incrementar la seguretat sanitària i genètica. BIBLIOGRAFIA Bassols, J.; Bonet, S.; Dacheux, F.; Dacheux J. L. (2007). «Proteomic study of the establishment of boar epididymal cellcultures». Theriogenology, 68: 7686. Bassols, J.; Kádár, E.; Briz, M.; Pinart, E.; Sancho, S.; Garcia-Gil, N.; Badia, E.; Pruneda, A.; Bussa lleu, E.; Yeste, M.; Bonet, S. (2004). «In vitro culture of epithelial cells from caput, corpus and cauda epididymis of Sus domesticus». Theriogenology, 62: 929-942. Bassols, J.; Kádár, E.; Briz, M.; Pinart, E.; Sancho, S.; Garcia-Gil, N.; Badia, E.; Pruneda, A.; Bussalleu, E.; Yeste, M.; Casas, I.; Dacheux, J. L.; Bonet, S. (2005). «Evaluation of boar sperm maturation after co-incubation with caput, corpus and cauda epididymal cultures. Evaluation of boar sperm maturation in vitro». Theriogenology, 64: 1995-2009. Bonet, S.; Briz, M.; Pinart, E.; Sancho, S.; Garcia-Gil, N.; Badia, E. (2000). Morfología espermática en porcino (Morphology of boar spermatozoa) (Morfologia espermàtica en porcí). Barcelona: Institut d’Estudis Catalans. Bonet, S.; Martínez, E.; Rodríguez, J. E.; Barrera, X. (2006) Biotecnología de la reproducción porcina. Ma nual de técnicas de reproducción asistida en porcino. Barcelona: Universitat de Girona, Red Temática de la Reproducción Porcina. Bussaleu, E.; Pinart, E.; Rivera, M. M.; Arias, X.; Briz, M.; Sancho, S.; García-Gil, N.; Bassols, J.; Pruneda, A.; Yeste, M.; Casas, I.; Rigau, T.; RodríguezGil, J. E.; Bonet, S. (2008). «Effects of filtration of semen doses from subfertile boars through neuter Sephadex columns». Reproduction in Domestic Animals, 43: 48-52. Bussalleu, E.; Pinart, E.; Yeste, M.; Briz, M.; Sancho, S.; Garcia-Gil, N.; Badia, E.; Bassols, J.; Pruneda, A; Casas, I.; Bonet, S. (2005). «Development of a protocol for multiple staining with fluorochromes to asses the functional status of boar spermatozoa». Microscopy Research and Technique, 63: 277283. Flores, E.; Cifuentes, D.; Fernández-Novell, J. M.;

150 S. Bonet et al.

Medrano, A.; Bonet, S.; Briz, M. D.; Pinart, E.; Peña, A.; Rigau, T.; Rodríguez-Gil, J. E. (2008). «Freezing/Thawing induces alterations in the protamine-1/DNA overwall structure in boar sperm». Theriogenology, 69: 1083-1094. Medrano, A.; Garcia-Gil, N.; Ramió, L.; Rivera, M. M.; Fernández-Novell, J. M.; Ramírez, A.; Peña, A.; Briz, M. D.; Pinart, E.; Concha, I. I.; Bonet, S.; Rigau, T.; Rodríguez-Gil, J. E. (2006). «Hexosespecificity of hexokinase and ADP-dependence of pyruvate kinase play important roles in the control of monosaccharide utilization in freshly diluted boar semen». Molecular Reproduction and Development, 73: 1179-1194. Pruneda, A.; Pinart, E.; Bonet, S.; Yeung, C. H.; Cooper, T. (2006). «Study of the polyol pathway in the porcine epididymis». Molecular Reproduction and Development, 73: 859-865. Pruneda, A.; Pinart, E.; Briz, M.; Sancho, S.; Garcia-

Gil, N.; Badia, E.; Kádár, E.; Bassols, J.; Bussalleu, E.; Yeste, M.; Bonet, S. (2005).«Effects of a high semen-collection frequency on the quality of sperm from ejaculates and from six epididymal regions in boars». Theriogenology, 63: 2219-2232. Pruneda, A.; Yeung, C. H.; Bonet, S.; Pinart, E.; Cooper, T. G. (2007). «Concentrations of carnitine, glutamate, myo-inositol and sorbitol in epididymal fluid and spermatozoa from boars: comparison of two different semen collection frequencies». Animal Reproduction Science, 97: 344-355. Sancho, S.; Casas, I.; Rodríguez-Gil, J. E.; Ekwall, H.; Saravia, F.; Rodríguez-Martínez, H.; Flores, E.; Pinart, E.; Briz, M.; Garcia-Gil, N.; Bassols, J.; Pruneda, A.; Bussalleu, E.; Yeste, M.; Bonet, S. (2007). «Effects of cryopreservation on semen quality and the expression of membrane hexose transporters in the spermatozoa of Iberian pigs». Reproduction, 134: 111-121.

DOI: 10.2436/20.1501.02.64

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 151-163

PRODUCCIÓ IN VIVO VERSUS IN VITRO D’EMBRIONS CAPRINS María Teresa Paramio i Dolors Izquierdo Departament de Ciència Animal i dels Aliments, Universitat Autònoma de Barcelona. Adreça per a la correspondència: María Teresa Paramio. Departament de Ciència Animal i dels Aliments, Facultat de Veterinària, Universitat Autònoma de Barcelona. Campus de Bellaterra, edifici V. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: teresa.paramio@uab.es. RESUM Les tecnologies per a la reproducció assistida, com són la inseminació artificial i l’ovulació múltiple i la posterior transferència embrionària (MOET), s’han utilitzat en el cabrum per incrementar l’eficiència reproductiva dels mascles i accelerar el guany genètic de les femelles. No obstant això, el MOET presenta una sèrie de limitacions a causa de: a) variabilitat en la resposta de les femelles al tractament hormonal, b) fecundacions fallides i c) regressió prematura dels cossos lutis. La producció in vitro d’embrions (PIVE) permet superar les limitacions de la tecnologia MOET. La PIVE involucra tres processos: la maduració in vitro dels oòcits, la fecundació in vitro amb espermatozoides capacitats i el cultiu in vitro dels embrions fins a l’estadi de blastocist, moment en què poden ser transferits a cabres receptores o crioconservats per a futurs usos. A més, la recuperació d’oòcits de femelles vives selectes mitjançant laparoscòpia i la reproducció de femelles prepúbers permeten una elevada difusió de les cabres d’alt valor. Així, la PIVE en el cabrum és una font excel·lent i de baix cost d’embrions, que es podran utilitzar tant per a la recerca bàsica en la biologia del desenvolupament com per a aplicacions comercials per produir transgènics i clònics. Paraules clau: cabrum, inseminació artificial, MOET, PIVE, prepúber. IN VIVO VERSUS IN VITRO EMBRYO PRODUCTION IN GOATS SUMMARY Assisted reproductive technologies (ART) such as artificial insemination (AI) and multiple ovulation and embryo transfer (MOET) have been used to increase reproductive efficiency and accelerate genetic gain in male and females, respectively. The current limitations of MOET are due to: i) female variability response to hormonal treatment, ii) fertilization failures and iii) premature regression of corpora luteum. The in vitro produc-

152 M. T. Paramio i D. Izquierdo

tion (IVP) of embryos offers the possibility of overcoming MOET limitations. The method of IVP of embryos involves three mains steps: in vitro maturation of oocytes (IVM), in vitro fertilization of oocytes (IVF) with capacitated sperm and in vitro culture (IVC) of embryos until blastocyst stage that can be transferred to recipient females or cryopreserved for future use. Recovering oocytes from live selected females by laparoscopic ovum pick-up (LOPU), and breeding prepubertal females by juvenile in vitro embryo technology (JIVET) will allow a high diffusion of valuable goats. Also, IVP of goat embryos will provide an excellent source of low cost. Key words: goat, artificial insemination, MOET, IVP, prepubertal. INTRODUCCIÓ El desenvolupament en el cabrum de les tecnologies per alterar o manipular el material genètic i, així, millorar l’estructura genètica del animals, necessita les metodo logies que permeten produir embrions tant in vivo, mitjançant l’ovulació múltiple i la transferència embrionària (multiovulation embryo transfer, MOET), com in vitro (PIVE). Fins ara, la tècnica reproductiva més utilitzada per accelerar el guany genètic ha estat la inseminació artificial (IA). No obstant això, encara que la tècnica MOET no pot substituir la IA, si s’escullen correctament les femelles utilitzades, aquesta tècnica permet obtenir un guany genètic extra, via materna, que s’afegeix al dels mascles utilitzats per a la IA. Respecte a la producció in vitro d’embrions (PIVE), en el cabrum aquesta metodologia és important, tant pel que fa a la producció animal clàssica com en la producció de noves biotecnologies, ja que: a) La PIVE permet incrementar significativament la producció d’embrions a partir de femelles d’alt valor genètic i, a més, els oòcits poden ser recuperats de femelles prepúbers, prenyades o, fins i tot, mortes. b) És una font excel·lent i barata d’oòcits i d’embrions per a la recerca bàsica, la realització d’estudis biotecnològics (transferència nuclear, transgènesi, sexatge, cèl·lules mare...) i per a qualsevol tipus de recerca

que necessiti un gran nombre d’embrions per ser manipulats. c) A més, la PIVE és utilitzada com una estratègia per recuperar races o, fins i tot, espècies d’animals en perill d’extinció mitjançant la transferència interespecífica d’embrions. D’altra banda, la crioconservació d’embrions permet el moviment i la comercialització del germoplasma de cabrum, i fa més segur el moviment mundial de bestiar. PRODUCCIÓ IN VIVO D’EMBRIONS La producció in vivo d’embrions ja fa força anys que s’estudia. No obstant això, els resultats encara no són concloents, ja que hi ha una gran variabilitat tant en els tractaments hormonals com en la resposta de les cabres a aquests, i també problemes, com errades en la fecundació i la regressió prematura dels cossos lutis, que s’han de resoldre (Cognie et al., 2003). Els protocols tradicionals de superestimulació impliquen un tractament perllongat (de dotze a divuit dies) amb progestàgens i, quan manquen d’un a tres dies per acabar aquest tractament, l’administració de dues dosis diàries de FSH durant tres o quatre dies, normalment en dosis decreixents. Aquests tractaments proporcionen de mitjana entre vuit i setze ovulacions, encara que la variabilitat individual és immensa (revisat per Holtz,

Producció in vivo versus in vitro d’embrions caprins 153

2005). D’altra banda, s’han realitzat alguns estudis per reduir la laboriositat d’aquests protocols durant el període d’aplicació de la FSH. Així, Pintado et al. (1998) no han obtingut diferències entre els resultats obtinguts en subministrar sis dosis de FSH i els obtinguts quan se substitueixen les últimes tres dosis de FSH per una dosi única de 200 IU de gonadotrofina coriònica equina (eCG). Quan es realitza la inseminació a temps fix o es volen recollir oòcits o embrions en un estadi de desenvolupament determinat, és important que l’ovulació es produeixi en un moment concret. Això es pot aconseguir administrant a la femella LH, gonadotrofina coriònica humana (hCG) o un agonista de la GnRH. Normalment 12 h després de retirar l’esponja de progestàgens s’administra GnRH i 24 h després 3 mg de LH. No obstant això, per a la superovulació de les cabres, Baril et al. (1996) van observar que la GnRH no és eficient per sincronitzar l’ovulació, tret que l’administració vagi precedida d’un tractament previ amb un antagonista de la GnRH. L’antagonista suprimeix temporalment l’alliberació de la FSH i la LH i, així, prevé l’aparició d’un fol·licle dominant. Gonzalez-Bulnes et al. (2004), injectant antagonistes de la GnRH, van observar una disminució del creixement dels fol·licles dominants associada a un augment del doble en el nombre de fol·licles més petits. La presència d’un fol·licle molt gran al començament del protocol tradicional d’estimulació sembla que contribueix a la gran variabilitat dels resultats obtinguts amb els programes MOET en el cabrum. Algunes estratègies s’han centrat en el començament del tractament superovulatori, moment en què comença una ona de creixement i no existeix un fol·licle dominant. Rubianes i Menchaca (2003) recomanen iniciar el tractament de superovulació concomitant amb l’emergència de la primera ona de creixement fol·licular després de l’ovulació (dia 0).

Just després de l’ovulació, emergeix la primera ona de creixement i hi ha una cohort homogènia de petits fol·licles en creixement. Així, en el dia 0 del protocol, s’iniciaria el tractament amb FSH coincidint amb l’emergència de l’ona de creixement 1. Aquest protocol ha proporcionat majors taxes d’ovulació i d’embrions que el protocol tradicional (Menchaca et al., 2007). Finalment, l’èxit de la fecundació no depèn únicament de la sincronització de l’ovulació sinó també del protocol d’inseminació. La inseminació es realitza entre 40 i 50 h després de la retirada del tractament amb progestàgens. Quan s’utilitza semen fresc aquesta es realitza en el cèrvix via vaginal, mentre que si s’usa semen congelat, aquest es diposita dins l’úter mitjançant laparoscòpia. Respecte a la recollida dels embrions, es pot realitzar via laparotomia 6-8 dies després de la inseminació, rentant les banyes uterines amb medi per poder recuperar-los. Aquest procés permet fer de dues a tres recollides per cabra, ja que és freqüent l’aparició d’adherències a causa de la intervenció. La recuperació d’embrions via laparoscòpia és menys invasiva però comporta l’anestèsia total de l’animal i necessita un equipament sofisticat i una pràctica considerable de la tècnica. No obstant això, si s’utilitza aquesta via per realitzar la recuperació dels embrions les cabres es poden utilitzar com a donants fins a set vegades (Baril et al., 1996). Quan la recollida es realitza utilitzant un catèter rígid via cervical, 24 h abans de la recuperació es tracten les cabres amb una dosi luteolítica de prostaglandina F2α per facilitar la contractilitat uterina en el moment del rentatge uterí o flushing. Seguint el protocol descrit per Sohnrey i Holtz (2000), utilitzant aquest sistema de recollida es poden recuperar entre un 60 i un 80 % dels embrions existents. Resumint, en el cabrum, quan s’aplica un programa MOET amb èxit es pot aconseguir

154 M. T. Paramio i D. Izquierdo

una mitjana de sis a vuit embrions transferibles per donant (Baril et al., 1993; Cognie, 1999; Cognie et al., 2003). No obstant això, aquests resultats depenen de molts factors, incloent-hi el tipus de cria, l’edat i la nutrició de la femella, que proporcionen una elevada variabilitat en els resultats. Així, el nombre d’embrions transferibles es troba en un rang molt ampli que va de zero a trenta embrions per donant, amb un 25-50 % de les femelles en què no es recupera cap embrió a causa de problemes en la fecundació o una regressió precoç dels cossos lutis. PRODUCCIÓ IN VITRO D’EMBRIONS (PIVE) La PIVE inclou tres processos principals, com són: la maduració in vitro dels oòcits (MIV), la fecundació in vitro dels oòcits (FIV) amb espermatozoides capacitats i el cultiu in vitro (CIV) dels embrions fins a l’estadi de blastocist, etapa en la qual poden ser transferits a femelles receptores o crioconservats per a usos futurs. Recollida dels oòcits La recollida d’oòcits de bona qualitat és el primer pas per a la PIVE. Els mètodes utilitzats en el cabrum són: a) Recollida d’oòcits a partir de femelles d’escorxador: en aquest cas els oòcits són recuperats dels fol·licles per aspiració, slicing (talls repetits a la superfície de l’ovari fets amb una fulla de bisturí) o després de fer dissecció fol·licular. Quan els ovaris provenen de cabres adultes, els oòcits normalment es recuperen aspirant, amb una agulla de 18 a 20 g, el contingut dels fol·licles amb un diàmetre superior als 3 mm. En el cas dels ovaris de cabretes prepúbers s’ha vist que la tècnica utilitzada per a la reco-

llida dels oòcits afecta tant la quantitat com la qualitat dels oòcits obtinguts (Martino et al., 1994b). Així, la tècnica que proporciona un major nombre d’oòcits per ovari és el slicing (6,05), seguida de la dissecció fol·licular (1,71) i de l’aspiració (1,27). No obstant això, els oòcits recuperats per slicing conformen una població molt heterogènia i els resultats de fecundació que proporcionen són inferiors als produïts pels oòcits recuperats després de realitzar la dissecció dels fol·licles (Martino et al., 1994b). De totes maneres, com que la dissecció és una tècnica que comporta una gran despesa de temps i l’aspiració és difícil, ja que els ovaris de cabretes són tous i fràgils i la majoria del seus fol·licles fan menys de 2 mm de grandària, la tècnica d’elecció per recuperar els oòcits dels ovaris de cabres prepúbers és el slicing. b) Oòcits recuperats de cabres vives: en aquest cas els oòcits són aspirats dels fol· licles després d’exterioritzar els ovaris mitjançant una laparotomia o via laparoscòpia (laparoscopic ovum pick up, LOPU). Per poder aconseguir un major nombre d’oòcits, prèviament a la recollida se sincronitzen els zels de les cabres donants i s’estimulen amb gonadotrofines. La sincronització de zels normalment es realitza utilitzant esponges intravaginals impregnades amb 30 mg d’acetat de fluorogestona, que es col·locaran durant deu dies abans de la recollida, i l’administració de 125 μg de cloprostenol dos dies abans de la retirada de l’esponja. Per a l’estimulació ovàrica nosaltres utilitzem 125 UI de pFSH en quatre dosis decreixents administrades a intervals de 12 h. L’última injecció de pFSH s’administra 20 h abans de la retirada de l’esponja. Les esponges són retirades en el moment de la recollida dels oòcits. Baldassarre i Karatzas (2004) utilitzen un tractament d’estimulació amb una única injecció de 80 NIH-FSH-P1 i 300 IU d’eCG 36 h abans de realitzar la LOPU. En

Producció in vivo versus in vitro d’embrions caprins 155

cabres prepúbers, com és lògic, no es realitza el tractament de sincronització de zels i per promoure l’estimulació del creixement fol·licular s’utilitza el mateix tractament que en les adultes, però les dosis hormonals s’ajusten al pes viu de les femelles. Koeman et al. (2003) van observar que el nombre d’oòcits recuperats a partir d’ovaris de cabres prepúbers era major que en les adultes i els resultats depenien del nombre de sessions de recollida realitzades. En els petits remugants, l’ús de la laparotomia per a la recollida dels oòcits està sent progressivament substituït per la laparoscòpia, ja que aquesta tècnica és relativament simple i eficient. Aquest procés és més ràpid, menys costós i pot ser realitzat diverses vegades en el mateix animal sense les complicacions que té la laparotomia. En cabres superestimulades (Baldassarre i Karatzas, 2004), la laparoscòpia proporciona taxes de recuperació (oòcits/fol·licles) entre el 75 i el 85 % i el seu rendiment mitjà és de 13,5 oòcits per animal. El major problema d’aquesta tècnica, si es compara amb la recollida mitjançant laparotomia, és la pèrdua d’un major nombre de capes de cèl·lules del cúmulus, ja que, quan els oòcits són aspirats, aquests han de passar a través d’un tub conductor fins a arribar al tub de recollida. L’aspiració transvaginal guiada per ultrasonografia (transvaginal ultrasound-guided aspiration, TUGA) és una alternativa pràctica i segura a la recollida quirúrgica d’oòcits. Aquesta tècnica és utilitzada rutinàriament en les dones i el boví. La seva aplicació en el cabrum ha estat detalladament descrita per Graff et al. (1999), encara que no és una tècnica molt estesa.

Efecte de la grandària del fol·licle i de l’oòcit Diversos estudis en diferents espècies han conclòs que el diàmetre oocitari és directament proporcional al diàmetre del fol·licle. L’increment dels diàmetres fol·licular i oocitari milloren el desenvolupament embrionari (revisat per Gandolfi et al., 2005). En cabres adultes, Crozet et al. (1995) van obtenir diferències significatives en el percentatge de blastocists obtinguts a partir d’oòcits recuperats de fol·licles de 2-3 mm (6 %), de fol· licles de 3,1-5 mm (12 %), de fol·licles de més de 5 mm (26 %) i d’oòcits ovulats (41 %). En les cabretes prepúbers la majoria dels oòcits provenen de fol·licles entre 2 i 3 mm. En el nostre laboratori hem estudiat la relació entre el diàmetre fol·licular i la competència oocitària i hem observat que en cabres prepúbers, quan els oòcits provenen de fol· licles de menys de 3 mm, el percentatge de blastocists és del 3,85 %, mentre que quan els oòcits provenen de fol·licles de més de 3 mm aquest percentatge augmenta fins al 18,5 %. Com ja s’ha indicat anteriorment, en els ovaris de cabres prepúbers és difícil recuperar els oòcits mitjançant l’aspiració dels fol·licles, i per això aquesta recuperació es realitza fent slicing als ovaris i, posteriorment, els oòcits són seleccionats segons el seu diàmetre i la morfologia del cúmulus que l’envolta. Així, hem realitzat un estudi per definir quin és el diàmetre oocitari mínim per obtenir el major percentatge de desenvolupament embrionari i hem obtingut que, quan la fecundació es realitza mitjançant el protocol de FIV convencional, els oòcits amb una mida superior a les 135 μm proporcionen un percentatge de blastocists significativament superior als oòcits de grandària compresa entre 125 i 135 μm (12,5 % i 1,95 %, respectivament) (Anguita et al., 2007). No obstant això, quan els oòcits es fecunden per ICSI, les diferències

156 M. T. Paramio i D. Izquierdo

de desenvolupament entre aquestes dues categories d’oòcits desapareixen, i s’obté un 11,1 % de blastocists a partir dels oòcits majors de 135 μm i un 15,9 % amb els oòcits entre 125 i 135 μm de grandària (Jimenez-Macedo et al., 2006). Edat de la cabra donant Diversos estudis han observat que els oòcits procedents de femelles prepúbers proporcionen embrions amb una menor competència per al desenvolupament que els oòcits de femelles adultes (revisat per Armstrong, 2001). Aquest fet també ha estat descrit en el cabrum i, encara que no s’han observat diferències en els nivells de maduració nuclear entre els oòcits de cabretes prepúbers i els d’adultes (Martino et al., 1994a), sí que els resultats de desenvolupament obtinguts amb els oòcits d’adulta són superiors als obtinguts quan aquests són de prepúbers. Així, utilitzant oòcits de cabres adultes, Cognie et al. (2003) han obtingut un 36 % de blastocists, Crozet et al. (1995) un 26 % i Keskintepe et al. (1998) un 32 %, mentre que quan els oòcits procedeixen de cabretes prepúbers aquest desenvolupament s’ha vist dràsticament disminuït fins a un 10 % en obtenir els oòcits de cabretes de dos mesos d’edat sacrificades a l’escorxador (Izquierdo et al., 2002), o d’un 8 % quan els oòcits van ser recuperats per LOPU de cabretes de 2-5 mesos estimulades hormonalment (Koeman et al., 2003). A més, Baldassarre i Karatzas (2004) van fer un estudi comparant els oòcits de cabres adultes amb els de prepúbers, en ambdós casos recuperats mitjançant la tècnica de LOPU després d’un tractament d’estimulació fol·licular, i en aquest estudi els oòcits d’adulta van proporcionar nivells significativament superiors de producció d’embrions i de gestacions.

Com ja s’ha indicat en l’apartat anterior, l’equip de Crozet (1995) ha suggerit que només una petita proporció dels oòcits recuperats dels fol·licles amb 2-3 mm de diàmetre poden suportar el desenvolupament embrionari, ja que la capacitat de l’oòcit de completar la maduració citoplasmàtica es desenvolupa més enllà de l’adquisició de la competència meiòtica. Així, ells han vist que la producció de blastocists era del voltant del 6 % quan els oòcits de cabres adultes procedeixen de fol·licles de 2-3 mm de diàmetre. En els ovaris de les cabres prepúbers (Martino et al., 1994a), el nombre de fol· licles amb un diàmetre major de 3 mm és d’1,1 per ovari i pràcticament no existeixen fol·licles de més de 5 mm de grandària. En conclusió, no sabem si el baix desenvolupament embrionari obtingut amb els oòcits procedents de cabres prepúbers és de gut a les condicions fisiològiques d’aquestes femelles o si és la conseqüència del petit nombre d’oòcits recuperats de fol·licles de més de 3 mm. En el nostre laboratori hem realitzat estudis en què es comparen els oòcits de les cabres prepúbers amb els de les adultes i hem observat que els procedents de les prepúbers presenten una disminució en la formació del pronucli masculí (Mogas et al., 1997b) i proporcionen nivells més elevats tant de zigots haploides (Villamediana et al., 2001) com de poliploides, a causa de fecundacions polispèrmiques (Mogas et al., 1997b). A més, el patró de distribució dels grànuls corticals (Velilla et al., 2004) i dels mitocondris (Velilla et al., 2006) és diferent entre ambdós tipus d’oòcits. D’altra banda, l’addició de compostos tiols als medis de maduració in vitro (Rodriguez-Gonzalez et al., 2003b) i de fecundació in vitro (Urdaneta et al., 2004) han fet disminuir les anomalies en la fecundació i han millorat la formació del pronucli masculí i la producció d’embrions a partir dels oòcits de les prepúbers.

Producció in vivo versus in vitro d’embrions caprins 157

Maduració in vitro dels oòcits El desenvolupament embrionari està influït pels esdeveniments que succeeixen durant la maduració de l’oòcit. Perquè la MIV tingui èxit és necessari que l’oòcit maduri tant en el nucli com en el citoplasma. Normalment els oòcits de cabrum es maduren en medi TCM-199 tamponat, al qual s’afegeixen 146 µg/ml de L-glutamina, 275 μM de piruvat sòdic, 100 µM de cisteamina, 50 µg/ml de gentamicina, 10 % de sèrum fetal boví (FCS), 10 μg/ml de LH, 10 μg/ml de FSH i 1 μg/ml 17β d’estradiol. En aquestes condicions, el percentatge d’oòcits de cabrum que maduren nuclearment és elevat, i s’aconsegueix que entre el 70 i el 90 % arribin a l’estadi de metafase ii. Amb els oòcits de cabres prepúbers, l’addició de gonadotrofines (FSH i LH) i de 17β d’estradiol al medi de maduració millora els nivells de maduració i de divisió embrionària (Mogas et al., 1997a). A més, normalment s’afegeix un 10-20 % de sèrum desactivat amb calor (56 °C durant 30 min) als medis de MIV. El sèrum proporciona nutrients a les cèl·lules del complex cúmulus-oòcit (COC) i prevé l’enduriment de la zona pel·lúcida. En el cabrum, molts laboratoris utilitzen rutinàriament sèrum de cabra en zel (EGS) i sèrum d’ovella en zel (ESS) (Cognie et al., 2003). No obstant això, Tajik i Esfandabadi (2003) van comparar l’efecte de diversos tipus de sèrum i no van trobar diferències entre els resultats obtinguts en utilitzar EGS, ESS i FCS. En el nostre laboratori també hem comparat l’efecte de l’EGS (recuperat en diferents moments de l’estre), de l’FCS i del sèrum de mascle boví castrat (SS), i no hem trobat diferències significatives ni pel que fa a la maduració ni quant a la producció d’embrions. D’altra banda, s’ha descrit que l’addició al medi de maduració de fluid fol·licular (FF) procedent de fol·licles no atrèsics majors de 4 mm propor-

ciona bons resultats. No obstant això, tant el sèrum de femella en zel com el fluid fol· licular s’han de provar abans d’integrar-los en el protocol de PIVE, ja que ambdós productes s’han de preparar al laboratori i existeixen grans variacions entre la composició i l’efecte de les diferents mostres. Així, nosaltres utilitzem FCS i SS, ja que aquests sèrums es troben comercialment i són químicament més homogenis que els sèrums de femella en zel i l’FF. L’addició de diferents components del grup dels tiols (cistina, cisteïna, cisteamina, glutatió, β-mercaptoetanol) al medi de MIV incrementa la concentració intracitoplasmàtica de glutatió (GSH), protegeix les cèl·lules de l’estrès oxidatiu i millora la formació del pronucli masculí i la posterior producció d’embrions. En el cabrum, Zhou et al. (2008) han trobat una acció sinèrgica entre la cisteamina, la cistina i les cèl·lules del cúmulus, ja que la presència d’aquests tiols en el medi de MIV d’oòcits denudats de femelles adultes fa que aquests presentin nivells de GSH i una capacitat de desenvolupament similars als oòcits envoltats pel cúmulus, és a dir, no denudats. En el cas dels oòcits de cabres prepúbers, la cisteamina és el tiol que s’utilitza en la PIVE, ja que és el que proporciona el major increment del nivell de GSH intracel·lular (Rodriguez-Gonzalez et al., 2003b). Així, l’addició de 100 µM de cisteamina al medi de maduració millora la producció d’embrions, tant quan els oòcits provenen de cabres prepúbers (Rodriguez-Gonzalez et al., 2003a; Urdaneta et al., 2003) com d’adultes (Cognie et al., 2003). Respecte a les condicions de cultiu en la MIV, els oòcits de cabrum es mantenen durant 27 h a 38,5 °C en una atmosfera d’un 5 % de CO2 en aire i saturada d’humitat. Si la durada del cultiu és de 24 h en lloc de les 27 h, la proporció d’oòcits que arriba a la metafase ii disminueix (Rho et al., 2001).

158 M. T. Paramio i D. Izquierdo

Fecundació in vitro Abans de la fecundació s’han de preparar les ejaculacions de boc per poder inseminar els oòcits. Així, el primer pas que s’ha de realitzar, tant si s’utilitza semen fresc com descongelat, és la selecció dels espermatozoides més mòbils i viables. Per a això, les principals tècniques utilitzades són: el swim-up i la centrifugació en un gradient de densitat de Percoll o de Ficoll. Quan es comparen aquestes tres tècniques de selecció, el swim-up és la que proporciona una major quantitat d’espermatozoides mòbils, encara que no s’han obtingut diferències pel que fa a la penetració oocitària i a la divisió en seleccionar els espermatozoides d’ejaculacions fresques amb aquestes tres tècniques (Palomo et al., 1999). No obstant això, la tècnica de selecció convencionalment utilitzada quan s’usa semen congelat-descongelat és la centrifugació del semen en un gradient discontinu de Percoll (45-90 %) durant 10 min a 500 g i a temperatura ambient. El segon pas és la capacitació dels espermatozoides. En aquesta etapa s’intenten provocar en l’espermatozoide els canvis morfològics i bioquímics que es produeixen en el tracte genital femení. Així, després de seleccionar els espermatozoides més mòbils i viables, aquests es poden capacitar posant-los en un medi amb heparina o amb sèrum de femella en zel (20 % en el semen fresc i 2 % en el descongelat). Segons Cognie et al. (2003), els espermatozoides descongelats de boc es poden capacitar en medi SOF amb un 10 % (v/v) de sèrum d’ovella en zel i 0,5 µg/ml d’heparina, en el qual restaran durant 1 h. En el nostre laboratori, després de seleccionar els espermatozoides mòbils de les ejaculacions fresques de boc mitjançant la tècnica de swim-up, es recuperen els sobrenedants dels tubs i se centrifuguen a 170 g durant tres minuts. Després, el sediment es

resuspèn en medi mDM (1:1 v/v) amb heparina (50 µg/ml de concentració final) i s’incuba durant 45 min en una atmosfera amb un 5 % de CO2 en aire i humitat màxima a 38,5 °C. Transcorregut aquest temps, i coincidint amb la finalització de les 27 h de la MIV, els oòcits són transferits en grups de 20-25 a gotes de 100 µl de medi Tyrode modificat (TALP, Parrish et al., 1986) al qual s’ha afegit 1 µg/ml d’hipotaurina i 0,3 mg/ml de glutatió. Llavors es procedeix a inseminar la gota amb els espermatozoides capacitats, que es trobaran a una concentració final de 3 × 106 espermatozoides/ml (Urdaneta et al., 2004). Amb oòcits de cabres adultes, Cognie et al. (2003) utilitzen una concentració final d’1 × 106 espermatozoides/ml. Normalment la durada de la coincubació dels gàmetes és de 24 h, ja que coincubacions més curtes redueixen els nivells de fecundació (Mogas et al., 1997b). Respecte als medis de FIV, nosaltres hem provat diferents combinacions de medis per a la capacitació dels espermatozoides i la fecundació dels oòcits i els millors resultats els hem obtingut utilitzant medi DM per a la capacitació i TALP per a la fecundació (Izquierdo et al., 1999). Els laboratoris que treballen amb oòcits de cabrum utilitzen diversos medis de FIV, com per exemple el medi BO (Crozet et al., 1995; Ongeri et al., 2001), el SOF (Rho et al., 2001) i el TALP-fert (Katska-Ksiazkiewicz et al., 2004; Wang et al., 2002). D’altra banda, encara que la presència d’heparina en el medi de FIV millora la producció d’embrions, diversos estudis han observat que el desenvolupament embrionari i el percentatge de gestacions es veu disminuït a causa, possiblement, d’un increment en la taxa de fecundacions polispèrmiques (Katska-Ksiazkiewicz et al., 2004; Poulin et al., 1996). En conclusió, l’heparina és un bon agent capacitant dels espermatozoides però és necessari definir-ne la concentració i el temps d’incu-

Producció in vivo versus in vitro d’embrions caprins 159

bació per a cada mascle per evitar la polispèrmia. Injecció intracitoplasmàtica de l’espermatozoide (ICSI) Aquesta tècnica s’ha introduït com una alternativa a la FIV convencional. En la reproducció assistida dels animals, una de les principals aplicacions de la ICSI és la de garantir la producció d’animals, tant salvatges com domèstics, a partir dels gàmetes d’individus d’important valor genètic. A més, la ICSI es pot utilitzar per a la producció d’animals transgènics usant l’espermatozoide com a vector, i per fecundar oòcits amb espermatozoides immòbils i, fins i tot, liofilitzats. El 2003 Wang et al. van publicar el naixement del primer cabrit concebut mitjançant una ICSI. En el nostre laboratori el protocol d’ICSI utilitzat és el següent (Jimenez-Macedo et al., 2006, 2005): es col· loca un oòcit MIV, en el qual hem observat el primer corpuscle polar, en una gota de 5 ml de medi d’injecció (TCM 199) cobert d’oli mineral. S’afegeix un petit volum (1 µl) d’espermatozoides en suspensió a una gota de 5 ml de medi amb un 10 % de polivinilpirrolidona (PVP); llavors, s’immobilitza un espermatozoide per la cua mitjançant la pipeta d’injecció i s’aspira per injectar-lo posteriorment, amb un mínim volum de medi (< 5 pl), dins de l’ooplasma i com més allunyat possible de la localització del corpuscle polar. El diàmetre de la pipeta de subjecció ha de ser de 20 a 30 mm i el de la d’injecció de 7 a 9 mm. Quan l’espermatozoide utilitzat prové d’una ejaculació fresca i ha estat capacitat amb heparina hem vist que després de realitzar la ICSI és necessari activar l’oòcit posant-lo durant 5 min en medi TCM199 amb 5 mM de ionomicina i un 10 % de FBS, i després 4 h en medi TCM199 amb 2 mM 6-DMAP i un 10 % de

FBS. No obstant això, aquesta activació no és necessària quan els espermatozoides es capaciten amb heparina i ionomicina (concentració final de 10 µM i 200 nM, respectivament) i així s’evita la producció d’embrions partenogenètics. El percentatge de blastocists obtinguts utilitzant aquesta tècnica amb els oòcits de cabres prepúbers ha estat del 16 %, mentre que amb oòcits de cabres adultes Keskintepe et al. (1997) han obtingut un 18 % i Wang et al. (2003) un 32 % de blastocists. Cultiu in vitro dels embrions Quan els embrions de cabrum es cultiven in vitro en els medis de cultiu tradicionals, molts aturen el seu desenvolupament en l’estadi de 8-16 cèl·lules, període en el qual es produeix l’activació del genoma embrionari. Per prevenir aquest bloqueig se solen afegir cèl·lules o sèrum al medi de cultiu. En el cabrum, els presumptes zigots se solen passar al medi de cultiu a les 24 h de la inseminació (FIV o ICSI). El tipus d’atmosfera utilitzada condicionarà el sistema de cultiu emprat, i així, quan el cultiu es realitza en aerobiosi (5 % CO2 en aire) és important la presència de cèl·lules somàtiques, mentre que si aquest és anaeròbic (atmosfera amb un 5 % CO2, 5 % O2 i un 90 % N2 o amb percentatges similars) aquestes ja no són necessàries. Respecte a l’ús de cèl·lules en el medi de cultiu, la presència de cèl·lules de la granulosa en el medi de cultiu millora el desenvolupament dels embrions de cabrum si comparem els resultats amb els obtinguts en cultivar-los en medi sol. No obstant això, per cocultivar embrions de cabrum és millor utilitzar cèl·lules de l’epiteli de l’oviducte (CEO) que cèl·lules de la granulosa (Izquier do et al., 1999). A més, aquest efecte positiu de les CEO sobre el desenvolupament dels

160 M. T. Paramio i D. Izquierdo

embrions de cabra no és específic d’espècie, ja que no s’han trobat diferències entre l’ús de CEO de cabrum i bovins (Izquierdo et al., 1999) i entre les CEO de cabrum i les de búfal (Yadav et al., 1998). D’altra banda, s’han obtingut percentatges de blastocists similars a partir d’oòcits de cabres adultes i de prepúbers quan ambdós tipus d’embrions es cocultiven amb CEO de cabrum (Izquierdo et al., 2002). Respecte als oòcits de cabres adultes, amb embrions cultivats en un ambient aeròbic, Katska-Ksiazkiewicz et al. (2004) han obtingut una producció de blastocists del 37 % en cocultivar els embrions en medi B2 amb CEO de femelles no sincronitzades i Pawshe et al. (1996) un 40 % de blastocists utilitzant medi TCM199 amb CEO, insulina, transferrina, seleni i EGF. De totes maneres, la presència de cèl·lules somàtiques en el medi de CIV és una important font de contaminació i proporciona resultats no previsibles a causa del desconeixement de l’estat fisiològic de les cèl·lules. Així, actualment la majoria de laboratoris cultiven els embrions de cabrum en condicions anaeròbiques. Els medis més utilitzats poden ser seqüencials, com els medis G1.2/G2.2 (Jimenez-Macedo et al., 2005; Koeman et al., 2003; Wang et al., 2003) o un únic medi durant tot el període de cultiu, com per exemple el medi SOF (Anguita et al., 2007; Cognie et al., 2003; Jimenez-Macedo et al., 2006; Keskintepe i Brackett, 1996; Rodriguez-Dorta et al., 2007) i el TCM199 (Izquierdo et al., 1999). Rodriguez-Dorta et al. (2007) han obtingut un major percentatge de blastocists en cultivar embrions de cabrum en medi SOF (28 %) que en cocultivar els embrions amb CEO (20 %). No obstant això, després de vitrificar ambdós tipus d’embrions, els que havien estat cocultivats amb CEO van proporcionar nivells significativament superiors de supervivència embrionària, de gestacions i de naixements de cabrits sans.

Actualment, en el nostre laboratori el cultiu es realitza en gotes de medi SOF (1 µl per embrió), al qual s’afegeix 0,1 µl de SFB per embrió a les 48 h de la inseminació. Els embrions s’incuben durant 7-8 dies a 38,5 °C i en una atmosfera amb un 5 % CO2, 5 % O2 i 90 % N2. CONCLUSIONS Encara que s’han fet progressos recents en les metodologies MOET, és necessari que es realitzi més recerca per conèixer com és la resposta a les hormones exògenes de l’ovari segons el seu estat fol·licular i com afecten els tractaments hormonals al nivell d’ovulacions i al de recuperació d’embrions. El coneixement de l’estat fol·licular i les seves repercussions en les característiques moleculars dels oòcits és l’obstacle més gran per optimitzar tant els resultats del MOET com els de les metodologies de PIVE. En els darrers any la PIVE ha millorat significativament gràcies a l’important nombre de grups de recerca que treballen en aquest camp arreu del món. No obstant això, hi ha una gran diferència en els resultats de PIVE entre els laboratoris i, fins i tot, dins d’un mateix laboratori, que, moltes vegades, és deguda a la diferent qualitat dels oòcits utilitzats. L’optimització dels processos de PIVE ha de ser consolidada sobre els coneixements bàsics i profunds del material biològic que utilitzem, principalment l’oòcit, però també l’espermatozoide. Aquest coneixement és fonamental per millorar la productivitat en el cabrum, però sobretot serà vital per a la producció i propagació dels animals transgènics i clònics.

Producció in vivo versus in vitro d’embrions caprins 161

BIBLIOGRAFIA Anguita, B.; Jimenez-Macedo, A. R.; Izquierdo, D.; Mogas, T.; Paramio, M. T. (2007). «Effect of oocyte diameter on meiotic competence, embryo development, p34 (cdc2) expression and MPF activity in prepubertal goat oocytes». Theriogenology, 67: 526536. Armstrong, D. T. (2001). «Effects of maternal age on oocyte developmental competence». Theriogenology, 55: 1303-1322. Baldassarre, H.; Karatzas, C. N. (2004). «Advanced assisted reproduction technologies (art) in goats». Anim. Reprod. Sci., 82-83: 255-266. Baldassarre, H.; Wang, B.; Kafidi, N.; Keefer, C.; Lazaris, A.; Karatzas, C. N. (2002). «Advances in the production and propagation of transgenic goats using laparoscopic ovum pick-up and in vitro embryo production technologies». Theriogenology, 57: 275-284. Baril, G.; Leboeuf, B.; Saumande, J. (1993). «Synchronization of estrus in goats: The relationship between time of occurrence of estrus and fertility following artificial insemination». Theriogenology, 40: 621-628. Baril, G.; Pougnard, J.; Freitas, V.; Leboeuf, B.; Saumande, J. (1996). «A new method for controlling the precise time of occurrence of the preovulatory gonadotropin surge in superovulated goats». Theriogenology, 45: 697-706. Cognie, Y. (1999). «State of the art in sheep-goat embryo transfer». Theriogenology, 51: 105-116. Cognie, Y.; Baril, G.; Poulin, N.; Mermillod, P. (2003). «Current status of embryo technologies in sheep and goat». Theriogenology, 59: 171-188. Crozet, N.; Ahmed-Ali, M.; Dubos, M. P. (1995). «Developmental competence of goat oocytes from follicles of different size categories following maturation, fertilization and culture in vitro». J. Reprod. Fertil., 103: 293-298. Gandolfi, F.; Brevini, T. A.; Cillo, F.; Antonini, S. (2005). «Cellular and molecular mechanisms regulating oocyte quality and the relevance for farm animal reproductive efficiency». Rev. Sci. Tech., 24: 413-423. Gonzalez-Bulnes, A.; Santiago-Moreno, J.; GarciaGarcia, R. M.; Souza, C. J.; Lopez-Sebastian, A.; Mcneilly, A. S. (2004). «Effect of GnRH antagonists treatment on gonadotrophin secretion, follicular development and inhibin a secretion in goats». Theriogenology, 61: 977-985. Graff, K. J.; Meintjes, M.; Dyer, V. W.; Paul, J. B.; Denniston, R. S.; Ziomek, C.; Godke, R. A. (1999).

«Transvaginal ultrasound-guided oocyte retrieval following fsh stimulation of domestic goats». Theriogenology, 51: 1099-1119. Holtz, W. (2005). «Recent developments in assisted reproduction in goats». Small Rumin. Res., 60: 95110. Izquierdo, D.; Villamediana, P.; Lopez-Bejar, M.; Pa ramio, M. T. (2002). «Effect of in vitro and in vivo culture on embryo development from prepubertal goat IVM-IVF oocytes». Theriogenology, 57: 14311441. Izquierdo, D.; Villamediana, P.; Paramio, M. T. (1999). «Effect of culture media on embryo development from prepubertal goat IVM-IVF oocytes». Theriogenology, 52: 847-861. Jimenez-Macedo, A. R.; Anguita, B.; Izquierdo, D.; Mogas, T.; Paramio, M. T. (2006). «Embryo development of prepubertal goat oocytes fertilised by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) according to oocyte diameter». Theriogenology, 66: 1065-1072. Jimenez-Macedo, A. R.; Izquierdo, D.; Anguita, B.; Paramio, M. T. (2005). «Comparison between intracytoplasmic sperm injection and in vitro fertilisation employing oocytes derived from prepubertal goats». Theriogenology, 64: 1249-1262. Katska-Ksiazkiewicz, L.; Rynska, B.; Gajda, B.; Smo rag, Z. (2004). «Effect of donor stimulation, frozen semen and heparin treatment on the efficiency of in vitro embryo production in goats». Theriogenology, 62: 576-586. Keskintepe, L.; Brackett, B. G. (1996). «In vitro developmental competence of in vitro-matured bovine oocytes fertilized and cultured in completely defined media». Biol. Reprod., 55: 333-339. Keskintepe, L.; Morton, P. C.; Smith, S. E.; Tucker, M. J.; Simplicio, A. A.; Brackett, B. G. (1997). «Caprine blastocyst formation following intracytoplasmic sperm injection and defined culture». Zygote, 5: 261-265. Keskintepe, L.; Simplicio, A. A.; Brackett, B. G. (1998). «Caprine blastocyst development after in vitro fertilization with spermatozoa frozen in different extenders». Theriogenology, 49: 1265-1274. Koeman, J.; Keefer, C. L.; Baldassarre, H.; Downey, B. R. (2003). «Developmental competence of prepubertal and adult goat oocytes cultured in semidefined media following laparoscopic recovery». Theriogenology, 60: 879-889. Martino, A.; Mogas, T.; Palomo, M. J.; Paramio, M. T. (1994a). «Meiotic competence of prepubertal goat oocytes». Theriogenology, 41: 969-980. Martino, A.; Palomo, M. J.; Mogas, T.; Paramio, M. T. (1994b). «Influence of the collection technique

162 M. T. Paramio i D. Izquierdo

of prepubertal goat oocytes on in vitro maturation and fertilization». Theriogenology, 42: 859-873. Menchaca, A.; Vilarino, M.; Crispo, M.; Pinczak, A.; Rubianes, E. (2007). «Day 0 protocol: Superstimulatory treatment initiated in the absence of a large follicle improves ovarian response and embryo yield in goats». Theriogenology, 68: 1111-1117. Mogas, T.; Palomo, M. J.; Izquierdo, M. D.; Paramio, M. T. (1997a). «Developmental capacity of in vitro matured and fertilized oocytes from prepubertal and adult goats». Theriogenology, 47: 1189-1203. — (1997b). «Morphological events during in vitro fertilization of prepubertal goat oocytes matured in vitro». Theriogenology, 48: 815-829. Ongeri, E. M.; Bormann, C. L.; Butler, R. E.; Melican, D.; Gavin, W. G.; Echelard, Y.; Krisher, R. L.; Behboodi, E. (2001). «Development of goat embryos after in vitro fertilization and parthenogenetic activation by different methods». Theriogenology, 55: 1933-1945. Palomo, M. J.; Izquierdo, D.; Mogas, T.; Paramio, M. T. (1999). «Effect of semen preparation on IVF of prepubertal goat oocytes». Theriogenology, 51: 927-940. Parrish, J. J.; Susko-Parrish, J. L.; Leibfried-Rutledge, M. L.; Critser, E. S.; Eyestone, W. H.; First, N. L. (1986). «Bovine in vitro fertilization with frozenthawed semen». Theriogenology, 25: 591-600. Pawshe, C. H.; Palanisamy, A.; Taneja, M.; Jain, S. K.; Totey, S. M. (1996). «Comparison of various maturation treatments on in vitro maturation of goat oocytes and their early embryonic development and cell numbers». Theriogenology, 46: 971-982. Pintado, B.; Gutierrez-Adan, A.; Perez Llano, B. (1998). «Superovulatory response of murciana goats to treatments based on PMSG/anti-PMSG or combined fsh/pmsg administration». Theriogenology, 50: 357-364. Poulin, N.; Guler, A.; Pignon, P.; Cognie, Y. (1996). «In vitro production of goat embryos: Heparin in IVF medium affect development ability». Proceedings of the Conference on Goats: 838-840. Rho, G. J.; Hahnel, A. C.; Betteridge, K. J. (2001). «Comparisons of oocyte maturation times and of three methods of sperm preparation for their effects on the production of goat embryos in vitro». Theriogenology, 56: 503-516. Rodriguez-Dorta, N.; Cognie, Y.; Gonzalez, F.; Poulin, N.; Guignot, F.; Touze, J.; Baril, G.; Cabrera, F.; Alamo, D.; Batista, M. (2007). «Effect of coculture with oviduct epithelial cells on viability after transfer of vitrified in vitro produced goat embryos». Theriogenology, 68: 908-913. Rodriguez-Gonzalez, E.; Lopez-Bejar, M; Mertens, M. J.; Paramio, M. T. (2003b). «Effects on in vitro

embryo development and intracellular glutathione content of the presence of thiol compounds during maturation of prepubertal goat oocytes». Mol. Reprod. Dev., 65: 446-453. Rodriguez-Gonzalez, E.; Lopez-Bejar, M.; Izquierdo, D.; Paramio, M. T. (2003a). «Developmental competence of prepubertal goat oocytes selected with brilliant cresyl blue and matured with cysteamine supplementation». Reprod. Nutr. Dev., 43: 179-187. Rubianes, E.; Menchaca, A. (2003). «The pattern and manipulation of ovarian follicular growth in goats». Anim. Reprod. Sci., 78: 271-287. Sohnrey, B.; Holtz, W. (2000). «Transcervical embryo collection in boer goats». Small Rumin. Res., 36: 195200. Tajik, P.; Esfandabadi, N. S. (2003). «In vitro maturation of caprine oocytes in different culture media». Small Rumin. Res., 47: 155–158. Urdaneta, A.; Jimenez-Macedo, A. R.; Izquierdo, D.; Paramio, M. T. (2003). «Supplementation with cysteamine during maturation and embryo culture on embryo development of prepubertal goat oocytes selected by the brilliant cresyl blue test». Zygote, 11: 347-354. Urdaneta, A.; Jimenez, A. R.; Paramio, M. T.; Iz quierdo, D. (2004). «Cysteamine, glutathione and ionomycin treatments improve in vitro fertilization of prepubertal goat oocytes». Zygote, 12: 277284. Velilla, E.; Izquierdo, D.; Rodriguez-Gonzalez, E.; Lopez-Bejar, M.; Vidal, F.; Aramio, M. T. (2004). «Distribution of prepubertal and adult goat oocyte cortical granules during meiotic maturation and fertilisation: Ultrastructural and cytochemical study». Mol. Reprod. Dev., 68: 507-514. Velilla, E.; Rodriguez-Gonzalez, E.; Vidal, F.; Izquierdo, D.; Paramio, M. T. (2006). «Mitochondrial organization in prepubertal goat oocytes during in vitro maturation and fertilization». Mol. Reprod. Dev., 73: 617-626. Villamediana, P.; Vidal, F.; Paramio, M. T. (2001). «Cytogenetic analysis of caprine 2- to 4-cell embryos produced in vitro». Zygote, 9: 193-199. Wang, B.; Baldassarre, H.; Pierson, J.; Cote, F.; Rao, K. M.; Karatzas, C. N. (2003). «The in vitro and in vivo development of goat embryos produced by intracytoplasmic sperm injection using tail-cut spermatozoa». Zygote, 11: 219-227. Wang, B.; Baldassarre, H.; Tao, T.; Gauthier, M.; Neveu, N.; Zhou, J. F.; Leduc, M.; Karatzas, C. N. (2002). «Transgenic goats produced by DNA pronuclear microinjection of in vitro derived zygotes». Mol. Reprod. Dev., 63: 437-443. Yadav, P. S.; Saini, A.; Kumar, A.; Jain, G. C. (1998).

Producció in vivo versus in vitro d’embrions caprins 163

«Effect of oviductal cell coculture on cleavage and development of goat IVF embryos». Anim. Reprod. Sci., 51: 301-306. Zhou, P.; Wu, Y. G.; Li, Q.; Lan, G. C.; Wang, G.; Gao, D.; Tan, J. H. (2008). «The interactions between cy-

steamine, cystine and cumulus cells increase the intracellular glutathione level and developmental capacity of goat cumulus-denuded oocytes». Reproduction, 135: 605-611.

DOI: 10.2436/20.1501.02.65

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 165-176

UN MATEIX CAMÍ AMB DRECERES DIFERENTS EN FUNCIÓ DEL SEXE: GAMETOGÈNESI FEMENINA Raquel Garcia-Cruz,1 Ignasi Roig 2 i Montserrat Garcia1 Unitat de Biologia Cel·lular i Genètica Mèdica, Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Facultat de Medicina, Universitat Autònoma de Barcelona. 2 Molecular Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. 1

Adreça per a la correspondència: Montserrat Garcia Caldés. Unitat de Biologia Cel·lular i Genètica Mèdica, Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Facultat de Medicina, Universitat Autònoma de Barcelona. Campus de Bellaterra. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: montserrat.garcia.caldes@uab.es. RESUM En humans, les aneuploïdies s’originen principalment a causa d’errors en la gametogènesi femenina. Aquest fenomen fa de l’oogènesi un tema d’estudi atractiu, tot i que per la dificultat que comporta l’obtenció de mostres no existeixen molts estudis al respecte. En aquest treball, es resumeix l’estat actual del problema, i es para especial atenció a les diferències existents entre la gametogènesi masculina i femenina que puguin explicar l’origen d’aquest important problema per a la societat actual. Paraules clau: aneuploïdia, meiosi, oogènesi, recombinació, sinapsi. A SAME ROUTE WITH DIFFERENT PATHS DEPENDING ON THE SEX: FEMALE GAMETOGENESIS SUMMARY In humans, aneuploidy is mainly originated by errors produced during female gametogenesis. This phenomenon makes oogenesis such an attractive research topic, but due to the difficulties involving sample collection, not many studies have been performed in human oocytes. In this paper, a summary of the current knowledge about human female meiosis is provided, specially focusing on the differences between male and female gametogenesis that may explain the origin of such an important topic for Western society. Key words: aneuploidy, meiosis, oogenesis, recombination, synapsis.

166 R. Garcia-Cruz, I. Roig i M. Garcia

EL PERQUÈ DE TOT PLEGAT Les alteracions en el nombre de cromosomes d’una cèl·lula es coneixen amb el nom de aneuploïdies cromosòmiques. La majoria es caracteritzen per presentar un cromosoma de més (trisomies), però també podem trobar un cromosoma de menys (monosomies). Els cromosomes implicats poden ser tant autosomes com cromosomes sexuals. En l’espècie humana, les aneuploïdies cromosòmiques són la causa més freqüent d’avortaments espontanis i de problemes en el desenvolupament psicomotor en nadons. Diferents dades epidemiològiques fan pensar que almenys un 15 % de les concepcions són aneuploides, encara que en nadons la incidència baixa fins a un 0,3 % (vegeu una revisió a Hassold i Hunt, 2001). Els cromosomes implicats en les aneuploïdies varien segons el període de desenvolupament estudiat: en avortaments espontanis els cromosomes implicats amb més freqüència són el 16, el 21, el 22 i l’X; mentre que en nadons ho són el 13 el 18 i el 21, així com els cromosomes sexuals. L’origen de les aneuploïdies no és uniforme. La gran majoria procedeixen d’errors produïts en la gametogènesi, principalment en l’oogènesi. A tall d’exemple, tot i que les freqüències varien en funció del cromosoma implicat, es pot afirmar que més del 80 % dels casos de síndrome de Down (trisomia 21) tenen el seu origen en errors de la gametogènesi femenina. TOT FENT CAMÍ: GAMETOGÈNESI S’anomena gametogènesi el procés mitjançant el qual els organismes sexuats produeixen els seus gàmetes (vegeu una revisió a Garcia Caldés i Ponsa Arjona, 2005). En aquest procés, la proliferació mitòtica, l’existència d’una divisió cel·lular especial

(meiosi) que permet un repartiment equilibrat del material hereditari al mateix temps que facilita la seva reducció a la meitat, així com la diferenciació i maduració de les cèl·lules germinals, són etapes comunes en ambdós sexes. No obstant això, la seva seqüència, així com la durada de les etapes citades, varien en gran manera en funció del sexe, de manera que les diferències existents condicionen totalment l’enfocament de qualsevol problema reproductiu o d’anàlisi de risc genotòxic. En cap cas, doncs, és possible l’extrapolació mecànica de dades d’un sexe a l’altre (vegeu la taula 1 i la figura 1). En humans, tant en homes com en dones, la gametogènesi comença molt aviat. Als 20-22 dies de vida embrionària al voltant d’un miler de cèl·lules d’origen endodèrmic (extraembrionari) assentades en la paret del sac vitel·lí emigren de manera precisa vers les crestes genitals. L’emigració de les cèl·lules germinals primordials té lloc al voltant de la cinquena o sisena setmana de gestació, i està acompanyada de proliferació. Entre la vuitena i la desena setmana de gestació comencen a aparèixer les primeres cèl·lules germinals (oogònies i espermatogònies) en funció del sexe de l’embrió, del desenvolupament gonadal i dels senyals que proporciona l’ambient en el qual es troben les cèl·lules. En el fetus masculí la conversió de les cèl·lules germinals en espermatogònies significarà el final de l’etapa prenatal de l’espermatogènesi. L’espermatogènesi només tindrà continuïtat amb l’arribada de la pubertat i es farà de manera continuada durant tota la vida de l’adult fins a la seva mort (vegeu la taula 1). Cap a la novena o desena setmana de gestació d’un fetus femení es comencen a observar oogònies aïllades. La proliferació mitòtica d’aquestes permet l’aparició de grups d’oogònies que, de manera totalment asíncrona, al voltant de l’onzena o dotzena

gametogènesi femenina 167 Taula 1. Diferències més importants entre l’oogènesi i l’espermatogènesi Espermatogènesi

Oogènesi

Les espermatogònies proliferen a partir de la pubertat

Les oogònies perden la capacitat proliferativa durant el període fetal.

Es genera un nombre il·limitat d’espermatozoides.

Es genera un nombre màxim finit d’oòcits, fixat als 6-7 mesos de vida fetal.

La meiosi s’inicia en arribar a la pubertat.

La meiosi s’inicia durant la vida fetal però no es reprèn fins a la pubertat.

La meiosi és un procés continu.

La meiosi és discontínua: bloqueig en el dictiotè i en la metafase ii.

Un espermatòcit i genera quatre espermatozoides.

Un oòcit i genera un únic oòcit ii fecundable.

Les divisions cel·lulars són sincròniques, simètriques i incompletes (es formen sincicis).

Les divisions cel·lulars són asíncrones, asimètriques i completes.

setmana de gestació inicien la primera divisió meiòtica, i amb això la diferenciació en oòcits i. Serà més endavant, cap a les vinti-dues setmanes de gestació, que la interacció de l’oòcit i amb les cèl·lules de la pregranulosa donarà lloc als fol·licles primordials. Es tracta de l’inici de la fol·liculogènesi i del bloqueig de la profase meiòtica (vegeu la figura 1). D’un nombre aproximat de sis-centes mil cèl·lules germinals en el segon mes de gestació, es pot arribar a quasi 7 × 106 en el cinquè mes. Aquest nombre ja no serà superat. Els fenòmens d’atrèsia comencen a ser freqüents i la reserva d’oogònies deixa d’existir com a tal a partir del sisè mes de gestació. És per això que totes les gàmetes femenines en la vida adulta provenen necessàriament de la reserva d’oòcits establerta en aquest moment de la vida fetal. En la dona, a diferència del que passa en l’home, i malgrat que actualment el tema és motiu de controvèrsia, es pensa que no existeix una reserva de cèl·lules germinals que pugui ajudar a resoldre qualsevol problemàtica reproductiva conjuntural. Els fol·licles primordials, endocrinològicament inactius, són reclutats a fol·licles

primaris (uni i multilaminars) i secundaris preantrals. Aquest reclutament, que comporta creixement i diferenciació de les cèl· lules de la granulosa i de l’oòcit, no passa perquè sí. Les múltiples i variades connexions heteròlogues entre cèl·lules de la granulosa entre si i amb l’oòcit i permeten parlar del fol·licle com un tot i anomenar-lo unitat reproductiva de l’ovari. Es tracta d’un procés de creixement i de diferenciació sincrònica, continuada i independent de gonadotrofina, que comença abans del naixement, s’accentua en les nenes de manera progressiva a partir dels sis anys d’edat, s’incrementa amb la pubertat, s’alenteix amb l’embaràs i la lactància però no s’atura fins l’esgotament dels fol·licles primordials formats en l’etapa prenatal de l’oogènesi en la menopausa. La formació de la teca, l’adquisició d’irrigació capil·lar, l’aparició del líquid fol·licular i la reorganització del fol·licle ens porta al fol·licle preovulatori, que sí que és dependent de gonadotrofina. La seva formació quedarà, doncs, lligada a la menarquia. En els primers dies de cada cicle menstrual es porta a terme una selecció dels fol·licles preovulatoris envers la consecució d’un fol·

168 R. Garcia-Cruz, I. Roig i M. Garcia

licle dominant ovulatori capaç de proporcionar un gàmeta femení fecundable. El procés de creixement de l’oòcit en l’etapa de reclutament és equivalent a una etapa G2 del cicle mitòtic. Durant els 10-50 anys en els quals aquest fol·licle pot trigar a transformar-se en ovulatori, l’oòcit podrà créixer però no madurar. El voluminós nucli amb un nuclèol gran i ben estructurat s’anomena vesícula germinal, i s’utilitza com a indicador del seu estat de desenvolupament. Amb la formació dels fol·licles preovulatoris, així com en la selecció del fol·licle ovulatori, s’inicia la maduració, i amb aquesta el trencament de la vesícula germinal, que permetrà acabar la primera divisió meiòtica. Serà la unitat de fecundació (oòcit ii-primer corpuscle polar i cèl·lules del cúmulus) la que

3HUtRGH HPEULRQDUL L IHWDO 'HV GH OD YLGD IHWDO 'HV GH OD PHQDUTXLD ILQV D OD PHQRSDXVD

sortirà del fol·licle dominant i iniciarà el camí cap a les trompes de Fal·lopi en cada cicle menstrual, just després de l’estímul gonadotròfic menstrual (vegeu la figura 1). L’oòcit crescut i madur que inicia la segona divisió meiòtica és una cèl·lula que pràcticament ha quadruplicat el seu diàmetre i presenta un volum cent vegades superior al que tenia a l’inici de la seva vida fol· licular. En cas que sigui fecundat, tindrà capacitat per finalitzar la meiosi, així com per dirigir les primeres etapes de l’embriogènesi. Es tracta, doncs, d’una cèl·lula altament diferenciada que, malgrat aquesta gran especialització, manté intacta la totipotencialitat de les cèl·lules germinals primordials de les quals procedeix, a diferència dels espermatozoides (cèl·lules només altament

&qOāOXOHV JHUPLQDOV SULPRUGLDOV 2RJzQLHV SUROLIHUDFLy PLWzWLFD 2zFLW M U EORTXHLJ PHLzWLF 5HFOXWDPHQW &UHL[HPHQW GH O¶RzFLW 0DGXUDFLy GH O¶RzFLW 6HOHFFLy $GTXLVLFLy GH OD FRPSHWqQFLD PHLzWLFD D GLYLVLy PHLzWLFD DVLPqWULFD L FRPSOHWD 8QLWDW GH IHFXQGDFLy 2zFLW MM U FRUSXVFOH SRODU Q EORTXHLJ PHLzWLF 2YXODFLy 1R IHFXQGDFLy )HFXQGDFLy 'HJHQHUDFLy GH O¶RzFLW MM D GLYLVLy PHLzWLFD DVLPqWULFD L FRPSOHWD =LJRW Q FRUSXVFOH SRODU

Figura 1. Resum de l’oogènesi humana.

0(,26,

gametogènesi femenina 169

especialitzades). Això fa que l’oòcit sigui una cèl·lula difícilment catalogable: és capaç de presentar una divisió reduccional i de ser al mateix temps un gàmeta fecundable. En aquest sentit la seva capacitat de direcció i resolució durant les primeres etapes postfecundació, quan l’activitat del genoma embrionari es presenta sota mínims, és abso lutament imprescindible per a la correcta re solució del desenvolupament embrionari. UN CAMÍ AMB REVOLTS: PRIMERA I SEGONA DIVISIÓ MEIÒTICA Va ser a finals del segle xix quan es va comprovar l’existència d’un tipus de divisió cel·lular, diferent del conegut com a mitosi, capaç de portar a terme una reducció equilibrada en el nombre de cromosomes dels organismes de reproducció sexual que garantís el nombre de cromosomes de l’espècie després de la fecundació. El nom que se li va donar a aquesta divisió especialitzada va ser el de meiosi (vegeu la figura 2). Malgrat l’existència d’una relació específica d’espècie en alguna de les etapes de la meiosi, la divisió meiòtica és universal. D’altra banda, cal recordar que en mamífers el dimorfisme sexual en la meiosi és habitual, i l’espècie humana no és una excepció al respecte. Els dos sexes utilitzen diferents estratègies, superen la meiosi amb nivells d’eficàcia molt diferents i obtenen un resultat final absolutament dissimilar (vegeu una revisió a Garcia Caldés i Roig, 2007). PREPARATIUS PER A UN LLARG CAMÍ: ETAPA PREMEIÒTICA Per a una divisió reduccional és necessària l’existència d’una etapa preparatòria. Aquesta etapa es correspon amb la fase S del cicle cel·lular premeiòtic, en la qual,

igual que ocorre en la mitosi, es produeix una replicació del material hereditari (DNA). Amb la replicació del DNA es genera una còpia del genoma de la cèl·lula, de manera que s’obtenen quaranta-sis cromosomes, cada un amb dues cromàtides idèntiques (cromàtides germanes). Aquestes es mantenen unides gràcies, fonamentalment, a unes estructures proteiques anomenades genèricament cohesines. Les cohesines són un complex proteic compost de diferents subunitats que servirà de base per a l’establiment del complex sinaptinemal (estructura bàsica de la profase meiòtica), i que intervindrà en la correcta segregació tant dels cromosomes homòlegs com de les cromàtides germanes en la divisió cel·lular. En aquest sentit es pot afirmar que la meiosi és dependent de S, ja que el seu èxit es basa en gran part en esdeveniments que han tingut lloc en la fase S premeiòtica. UN CAMÍ AMB FESTEIG: APARELLAMENT I SINAPSI CROMOSÒMICA La profase meiòtica és l’etapa més llarga de la meiosi i clàssicament s’ha subdividit en subestadis en funció principalment de la dinàmica dels cromosomes: leptotè, zigotè, paquitè i diplotè. En el leptotè els cromosomes es compacten, s’individualitzen i donen lloc a estructures filamentoses que proporcionen al nucli una morfologia de cabdell; els centròmers es distribueixen a la perifèria del nucli i l’eix proteic de cohesines manté unides les cromàtides germanes. És sobre aquest eix on es dipositen altres proteïnes estructurals anomenades de manera genèrica SYCP, i es constitueixen en l’anomenat element axial entre les cromàtides germanes de cada cromosoma homòleg. És en aquest període que els cromosomes han d’iniciar un

170 R. Garcia-Cruz, I. Roig i M. Garcia

acostament que faciliti el seu posterior aparellament. Es tracta d’un moviment a gran escala en el qual la cèl·lula utilitza com a estratègia l’acumulació de telòmers en una petita zona de l’embolcall del nucli. Aquesta polarització, que es coneix amb el nom de bouquet, presenta una morfologia totalment estructurada en el zigotè, i en la gametogènesi femenina es manté fins als inicis de l’estadi de paquitè (vegeu la figura 3a i Roig et al., 2004). En la meiosi femenina el grau de compactació dels cromosomes

és molt menor que en el sexe masculí, de manera que s’afavoreix l’existència d’interrelacions heteròlogues, entrecreuaments, etc. És per això que, en el sexe femení, la cerca dels cromosomes homòlegs per poder alinear-se com a pas previ a l’aparellament és molt més llarga que en el masculí, i això provoca que l’estructura de bouquet duri més. En l’estadi de zigotè, els cromosomes homòlegs comencen el procés de sinapsi (vegeu la figura 3b), que comporta la unió física d’ambdós homòlegs mitjançant

Figura 2. Esquema on s’indiquen les etapes fonamentals de la meiosi. Es mostren els processos d’aparellament, sinapsi, recombinació, segregació de cromosomes homòlegs i segregació de cromàtides germanes d’una sola parella de cromosomes homòlegs, entre els quals es produeix un únic entrecreuament visualitzat posteriorment en un sol quiasma.

gametogènesi femenina 171

la formació del complex sinaptinemal, estructura tripartida formada per l’element axial de cada homòleg i un element central que serveix d’unió. L’estructuració del complex sinaptinemal, tal i com ja s’ha comentat, estabilitza la unió i facilita la sinapsi cromosòmica. En femelles de mamífer l’inici de l’aparellament cromosòmic és intersticial i subtelomèric, i la velocitat amb què aquest procés té lloc, tal i com s’ha assenyalat, és molt més lenta. De totes maneres, en l’estadi de paquitè tots els cromosomes estan, en condicions de normalitat, totalment aparellats al llarg de tota la seva longitud i la sinapsi és total. En el cas de la femella humana les dades que fan referència als cromosomes 13, 18, 21 i X indiquen clarament que el procés d’aparellament i sinapsi en l’oogènesi es pot considerar altament eficient i sense diferències significatives entre cromosomes segons la forma, la mida o el contingut de DNA (vegeu-ne una revisió a Robles et al., 2007). Així doncs, els cromosomes homòlegs d’origen matern i patern són capaços de resoldre l’aparellament i sinapsi amb total eficiència. En el diplotè els cromosomes homòlegs se separen i es mantenen units únicament per les zones on ha existit recombinació (que s’anomenen quiasmes). Els humans presenten una gametogènesi femenina discontínua. Aquesta discontinuïtat també afecta la meiosi: tal com ja s’ha fet esment, els oòcits que arriben al diplotè no continuen la primera divisió meiòtica i no reprenen el procés fins passat molt temps, que pot arribar a ser de cinquanta anys. Durant tot aquest període, anomenat dictiotè, l’oòcit inicia un nou període de desenvolupament íntimament lligat a la fol· liculogènesi: inicia una nova etapa G2 en la qual la seva mida es multiplica i fins i tot pot adquirir la capacitat de reiniciar i adquirir la competència meiòtica en determinades condicions. La configuració ober-

ta i de poca compactació que adquireix la cromatina en el dictiotè afavoreix la transcripció continuada i facilita l’acumulació de productes essencials per a la consecució de les següents etapes de la gametogènesi, fins i tot de les primeres etapes de l’embriogènesi. És amb els processos de reclutament i de formació de fol·licles ovulatoris que l’oòcit madura i es permet la finalització de la primera divisió meiòtica amb l’obtenció d’un oòcit en la metafase ii (vegeu la figura 1). INTERCANVIS DE PARELLA: RECOMBINACIÓ Un altre dels processos importants que té lloc durant la profase meiòtica és la recombinació. En aquest, l’intercanvi entre cromàtides homologues proporciona un increment de variabilitat de generació en generació. Però no solament això: també manté units els cromosomes homòlegs per tal d’aconseguir una bona disjunció d’aquests en la metafase i. En aquest sentit, des de fa molts anys, s’ha fet evident que els quiasmes, l’evidència citològica dels punts on hi ha hagut recombinació, tenen un paper central en la gènesi d’aneuploïdies. La recombinació meiòtica s’inicia amb l’aparició de trencaments de doble cadena en el DNA (double strand breaks, DSB). Es pensa que existeix una estreta correlació entre l’habilitat de portar a terme la replicació del DNA en l’etapa S premeiòtica i la de portar a terme els trencaments. En aquest sentit, la recombinació es considera dependent de l’etapa S premeiòtica. Aquests trencaments, múltiples i programats, són imprescindibles no solament per a una adequada recombinació, sinó també per a una correcta sinapsi cromosòmica, encara que no se sap gaire cosa de la possible relació d’ambdós processos. És més, respecte a la possi-

172 R. Garcia-Cruz, I. Roig i M. Garcia

ble relació de la recombinació amb l’aparellament i sinapsi no existeix consens. En humans, tal i com passa en la majoria d’espècies estudiades, s’ha vist que la recombinació s’inicia en els inicis de l’estadi de leptotè, abans que s’estableixi l’aparellament i la sinapsi cromosòmica, gracies a l’acció d’una endonucleasa (SPO11) que provoca els trencaments de doble cadena. L’evolució dels trencaments fins a l’establiment del quiasma és un procés que implica l’actuació de múltiples complexos proteics que intervenen en la reparació d’aquests trencaments. De totes maneres, es desconeix què és el que facilita la invasió d’una cromàtida paterna en la materna i com s’evita la invasió entre cromàtides germanes. Des d’un punt de vista molecular, tot sembla indicar que és en el paquitè quan es resolen les estructures que permeten la finalització de la recombinació i, per tant, la visualització citològica dels intercanvis, mitjançant la proteïna de reparació anomenada MLH1, que forma part d’un complex proteic que estabilitzaria el quiasma (vegeu la figura 3c). La recombinació sempre es porta a terme en zones no heterocromàtiques i, en el cas de la femella, fonamentalment en les zones intermèdies dels braços cromosòmics eucromàtics. La distribució dels punts d’intercanvi o la determinació en cap cas té lloc a l’atzar. És més, existeixen llocs específics que poden ser considerats com punts calents de recombinació, però que poden variar en funció del sexe i de l’espècie estudiada. Tot fa pensar que el control i determinació dels punts d’intercanvi és molt complex, variable, i es pensa que també heterogènic. Tot sembla indicar que en el procés de recombinació existeix un gran dimorfisme sexual, que es manifesta en el nombre i distribució dels punts de recombinació. Malgrat l’existència d’un nombre d’estudis molt limitat (vegeu-ne una revisió a Garcia-Cruz et al., 2008), de moment es pot concloure que en el

mascle existeix una gran concordança entre el nombre de quiasmes descrits, el nombre de punts de recombinació posats de manifest per la presència de MLH1 i els resultats en aquest sentit provinents d’estudis indirectes de lligament. Al mateix temps, també s’observa que, en el mascle humà, existeix una certa heterogeneïtat interindividual i intraindividual (calculada a partir dels coeficients de variació dels punts de recombinació, dels quiasmes i dels estudis indirectes d’enllaçament), que oscil·la entre un 3 % i un 12 %. En la femella humana, les dades que es tenen són encara més minses que les del mascle i molt més difícils de resumir. Primer de tot, és important tenir en compte que en oòcits no hi ha cap comptatge de quiasmes a causa de la gran complexitat de l’anàlisi mateixa. En segon lloc, hi ha molts pocs estudis que descriguin el nombre i distribució dels punts de MLH1 i, malauradament, aquests no acaben d’encaixar amb els resultats proporcionats pels estudis indirectes. De tota manera, malgrat aquestes contradiccions, tots els autors coincideixen en una dada: en la femella humana existeix una gran heterogeneïtat interindividual i intraindividual, molt superior a la de mascle. Si es té present que teòricament són necessaris com a mínim dos punts de recombinació per cromosoma metacèntric i submetacèntric, així com un de sol per cromosoma acrocèntric per assegurar que els homòlegs es mantinguin units fins a la metafase i (quaranta-un punts de recombinació), la gran heterogeneïtat descrita juga en contra de la salut, cromosòmicament parlant, dels oòcits. Les poques dades existents fins al moment ens indicarien que hi ha una gran quantitat d’oòcits, superior al 18 %, amb un comptatge de MLH1 per sota del valor mínim necessari per arribar en condicions adequades a la metafase i (Robles et al., 2009). Aquests oòcits fora del llindar

gametogènesi femenina 173

descrit (menys de quaranta-un punts de recombinació) podrien explicar la gran quantitat d’oòcits desequilibrats que s’han descrit en la metafase i. Amb la intenció d’entendre la possible implicació de la recombinació meiòtica en l’origen de l’autosomopatia més freqüent en nadons, la síndrome de Down, els treballs relacionats amb la recombinació en la meiosi humana s’han dirigit particularment al cromosoma 21. De les poques dades publicades al respecte es pot concloure que: a) Tant en mascle com en femella humana, el nombre de punts d’intercanvi que es produeixen en el bivalent 21 presenta molt poca heterogeneïtat. És a dir, la contribució del cromosoma 21 a l’heterogeneïtat global dels valors de MLH1 en oòcits humans és mínima. De fet, el cromosoma 21, entre tots els cromosomes estudiats fins al moment, és el que mostra l’heterogeneïtat més baixa. Tot fa pensar, doncs, que el bivalent 21 quasi sempre arribaria al mínim llindar que li assegurés una correcta disjunció. b) Tant en mascle com en femella no hi ha una distribució a l’atzar dels punts de recombinació, però el que sí que es fa evident és que hi ha una diferència de sexe en la seva posició relativa dins el bivalent (terminal en espermatòcits enfront d’intersticial en oòcits). En aquest sentit cal tenir present que, tradicionalment, s’ha considerat que els punts de recombinació intersticials asseguren un lligam més estable en el temps que els situats en posicions terminals. c) Les freqüències de bivalents 21 sense punts de recombinació són equivalents en mascle i femella. Per tant, el risc de no-disjunció per absència de quiasmes seria equivalent en ambdós sexes. d) En la femella hi ha un lleuger increment de punts de recombinació en el bivalent 21 (respecte als valors descrits en mascle), la qual cosa teòricament faria encara més estable la unió dels dos homòlegs.

Si tenim en compte, tal i com hem comentat, que l’eficiència de l’aparellament dels homòlegs 21 és molt alta, les dades comentades dels estudis de la recombinació en el bivalent 21 ens permetrien confirmar que la configuració quiasmàtica del cromosoma 21 és més estable en oòcits humans que en espermatòcits humans. Tot això permet concloure que l’origen, predominantment matern, de la trisomia 21, no pot correspondre a errors de sinapsi, a la presència de quiasmes inestables ni tampoc a l’absència de quiasmes en si mateixos. Pel que fa a les dades dels cromosomes 13 i 18, tot ens fa pensar que, tal com ja s’ha esmentat, la sinapsi cromosòmica és un procés també molt fiable i segur. De totes maneres, s’ha vist que la taxa d’homòlegs desaparellats en el diplotè és significativament superior a la que s’observa en el paquitè (1,3 % i 0,13 %, respectivament). Aquestes dades fan pensar en l’existència de problemes en la recombinació que, en aquests cromosomes, afavoririen que els bivalents respectius arribessin al diplotè sense la necessària connexió establerta pels quiasmes. En aquest cas, l’absència de recombinació o el processament inadequat es podria traduir en la formació d’univalents que, arribats a la metafase i, podrien segregar de manera independent i influir directament en l’aparició d’aneuploïdies. TOT S’ACABA: SEGREGACIÓ DE CROMOSOMES HOMÒLEGS I DE CROMÀTIDES GERMANES Preguntes com per què la no-disjunció materna és molt més freqüent que la paterna, per què existeix un efecte de l’edat materna i sembla que no de la paterna, fins a quin punt els esdeveniments que tenen lloc en la vida fetal poden influir en els resultats observats en l’edat adulta com a problemes

174 R. Garcia-Cruz, I. Roig i M. Garcia

de segregació, etc., estan, encara, sense resposta. La necessària segregació cromosòmica que permet l’arribada de l’oòcit a la segona divisió meiòtica presenta dos aspectes bàsics: el desplaçament i concentració dels cromosomes en l’equador del fus metafàsic, l’alineament dels bivalents amb els cinetocors dels dos cromosomes homòlegs orientats cap als pols oposats del fus i la separació d’aquests en pols oposats en la primera divisió meiòtica. Si els bivalents fallen en l’orientació, la segregació dels cromosomes donarà origen a oòcits desequilibrats. De totes maneres, la coorientació dels cinetocors cap a un mateix pol no és suficient: es necessita també que les cromàtides germanes continuïn unides per les cohesines i que els cromosomes homòlegs estiguin connectats, almenys, per un quiasma. Durant l’anafase, els cromosomes homòlegs se separen, i cadascun es dirigeix a un pol oposat. Aquest procés necessita l’eliminació dels complexos de cohesines dels braços dels cromosomes, de manera que només es mantinguin a les zones pericentromèriques de cada cromosoma. D’aquesta manera es possibilita la separació dels cromosomes homòlegs, però al mateix temps

s’impedeix la separació de les cromàtides germanes. Finalment, en la telofase, els cromosomes s’apleguen en cadascun dels pols de la cèl·lula i es produeix la citocinesi, completa i desigual: l’oòcit ii i el primer corpuscle polar. Ambdues cèl·lules són haploides, encara que cada cromosoma manté dues cromàtides germanes que probablement han recombinat. La transició envers la segona divisió és rapida i directa fins a la metafase ii (aquí no existeix interfase i, per tant, tampoc etapa S ni profase ii) (vegeu la figura 3d). La segona divisió meiòtica només acabarà si existeix la fecundació. En resum, existeixen quatre processos que són específics de la primera segregació cromosòmica: presència de quiasmes que uneixen els cromosomes d’origen matern amb els paterns, cosegregació dels centròmers de les cromàtides germanes en la meiosi i, preservació de la cohesió de les cromàtides germanes en la zona centromèrica i, d’alguna manera, bloqueig en la cèl· lula que acaba la meiosi i d’una nova replicació de DNA abans d’entrar en la meiosi ii. La segregació de cromàtides germanes que es porta a terme en la meiosi ii, en cas d’existir la fecundació, ho tindrà quasi tot

Figura 3. Algunes de les etapes fonamentals de la meiosi en oòcits humans (imatges obtingudes mitjançant immunofluorescència). a) Estructura de bouquet (en verd, proteïna SYCP3; en vermell, proteïna telomèrica TIN2). b) Sinapsi cromosòmica en l’etapa de zigotè (en verd, proteïna SYCP1; en vermell, cohesina REC8). c) Intercanvis en l’estadi de paquitè (en verd, proteïna MLH1; en vermell, proteïna SYCP3). d) Oòcit en metafase ii (en verd, proteïnes centromèriques; en blau, DNA).

gametogènesi femenina 175

en comú amb la segregació típica de la mitosi. ENVELLIMENT, UNA REALITAT MOLT INSISTENT: EFECTE DE L’EDAT MATERNA EN L’ORIGEN D’ANEUPLOÏDIES És sobradament coneguda la relació directa entre l’augment de l’edat materna amb l’increment de la taxa d’aneuploïdies. El procés de segregació depèn de maquinàries cel·lulars, com el fus meiòtic i les proteïnes de cohesió, per exemple, que de segur envelleixen i es deterioren. La relació existent entre problemes de segregació i edat materna continua, però, lluny de resoldre’s. De totes maneres, es comencen a saber coses: s’han descrit models murins deficients en una determinada cohesina que reprodueixen el patró observat en la dona (Hodges et al., 2005). És a dir, en les femelles d’aquests ratolins, el risc de tenir descendència amb aneuploïdies augmentaria, clarament, amb l’edat materna. Altres estudis, encara més recents, també relacionen l’exposició a determinades substàncies considerades genotòxiques amb l’increment de la taxa d’aneuploïdies (Hunt, 2006). També, tot sembla indicar que les dones amb embarassos trisòmics diagnosticats entren en menopausa de mitjana un any abans que les dones d’un grup control, independentment de la seva edat. És a dir, totes aquestes dades d’alguna manera indiquen que la fisiologia de l’ovari podria trobar-se en l’origen de l’efecte d’edat materna (que pot o no coincidir amb l’edat cronològica i que de moment no podem generalitzar a tots els cromosomes). En aquest sentit, podríem considerar que els sistemes que asseguren la segregació dels bivalents serien extremadament sensibles al medi en el qual han d’actuar i aquest,

és ben sabut, canvia dramàticament amb l’edat de la dona. Les dones amb condicions físiques perimenopàusiques presentarien un control menys precís de la maduració de l’oòcit, que desembocaria en aneuploïdia. Altrament, no podem oblidar que, independentment de l’edat materna, la producció d’aneuploïdies es troba clarament vinculada a l’oogènesi. De fet, s’ha considerat que els sistemes de control en els processos clau de la gametogènesi (sinapsi, recombinació i segregació), almenys en altres espècies de mamífers, són molt més estrictes en espermatòcits que en oòcits. És a dir, mentre que un espermatòcit amb errors en aquests processos seria eliminat, un oòcit que presentés els mateixos problemes podria tirar endavant encara que això comportés la presència d’alteracions. Per exemple, en l’espermatogènesi existeix un sistema de control en la transició metafase i/anafase i que alenteix, i fins i tot impedeix, la segregació, quan no es dóna una correcta alineació dels bivalents en la placa metafàsica o no existeix la connexió correcta, mitjançant els quiasmes, dels cromosomes homòlegs. Sorprenentment, les poques dades que existeixen d’aquest mecanisme de control en l’oogènesi indicarien que aquest sistema de control, en cas d’existir, no funciona correctament en oòcits. Tot i que no sabem fins a quin punt aquestes dades es poden extrapolar directament a l’espècie humana, el que sí que es podria dir és que l’aturada d’un oòcit que està cinquanta anys en dictiotè podria magnificar els efectes d’uns sistemes de control poc rigorosos. Així doncs, les particularitats especials que presenta la gametogènesi femenina, com són els dos bloqueigs meiòtics, l’estreta relació entre l’oòcit i les cèl·lules fol·liculars o la llarga durada del procés (que pot arribar a durar fins a cinquanta anys), fan que l’estudi de l’oogènesi en humans sigui complicat. Tot i això, gràcies als estudis directes

176 R. Garcia-Cruz, I. Roig i M. Garcia

i indirectes fets en oòcits humans, i també a la informació inferida dels models murins que s’han desenvolupat, s’ha començar a comprendre la naturalesa d’aquest fenomen. Malgrat tot, encara queden moltes qüestions sense resposta que hauran de ser estudiades per entendre millor aquest important problema per a la societat. A llarg termini, tenir un coneixement detallat de com es desenvolupa la gametogènesi femenina en humans podrà ser útil per aconsellar les parelles amb problemes de fertilitat o preveure possibles riscos derivats de la maternitat en edat avançada. BIBLIOGRAFIA Garcia Caldés, M.; Ponsa Arjona, I. (2005). «Introducción a las bases celulares y genéticas de la gametogénesis femenina». A: Cabero, L.; Cabri llo, E. [ed.]. Tratado de ginecología, obstetricia y medicina de la reproduccion. Tomo I. Madrid: Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia; Ed. Médica Panamericana, 50-57. Garcia Caldés, M.; Roig, I. (2007). «La gametogénesis femenina. Bases celulares y genéticas». A: Cabero, L. M.; Saldívar, D.; Cabrillo, E. [ed.]. Obstetricia y medicina materno-fetal. Madrid: Ed. Médica Panamericana, 107-115.

Garcia-Cruz, R.; Roig, I.; Garcia-Caldés, M. (2009). «Maternal origin of the human aneuploidies. Are homologue synapsis and recombination to blame? Notes (learned) from the underbelly». A: Benavente, R.; Volff, J. N. [ed.]. Genome dynamics. Meiosis. Basilea: Karger Publishers, 128-136. Hassold, T.; Hunt, P. (2001). «To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy». Nature Reviews Genetics, 2: 280-291. Hodges, C. A.; Revenkova, E.; Jessberger, R.; Hassold, T. J.; Hunt, P. A. (2005). «SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction». Nature Genetics, 37: 1351-1355. Hunt, P. (2006). «Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment». Biochemical Society Transactions, 34: 574-577. Robles, P.; Roig, I.; Garcia, R.; Brieño, M.; Martín, M.; Barbero, J. L.; Cabero, L.; Garcia Caldés, M. (2009). «Analysis of the recombination process along chromosome 21 during human female pachytene stage». Reproductive Biomedicine Online. [En premsa] Robles, P.; Roig, I.; Garcia, R.; Egozcue, J.; Garcia, M. (2007). «Pairing and synapsis in oocytes from female fetuses with euploid and aneuploid chromosome complements». Reproduction, 133: 899-907. Roig, I.; Liebe, B.; Egozcue, J.; Cabero, L.; Garcia, M.; Scherthan, H. (2004). «Female-specific features of recombinational double-stranded DNA repair in relation to synapsis and telomere dynamics in human oocytes». Chromosoma, 113: 22-33.

DOI: 10.2436/20.1501.02.66

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 177-184

ANÀLISI CITOGENÈTICA D’ESPERMATOZOIDES HUMANS Zaida Sarrate,* Ester Anton,* Joan Blanco i Francesca Vidal Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Unitat de Biologia Cel·lular, Universitat Autònoma de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Francesca Vidal. Unitat de Biologia Cel·lular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona. Campus de Bellaterra. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: francesca.vidal@uab.cat. * Les autores han contribuït igualment a la realització d’aquest treball. RESUM Les anomalies cromosòmiques són una de les principals causes d’esterilitat en l’espècie humana. A les anomalies del cariotip, molt més freqüents en individus que consulten per problemes reproductius que en la població general, s’afegeixen les anomalies meiòtiques, limitades a la línia germinal, observades en pacients que presenten un cariotip somàtic normal. En ambdues situacions, s’ha descrit que en poden resultar espermatozoides portadors d’anomalies cromosòmiques. La producció d’aquests espermatozoides pot ser avaluada mitjançant la utilització de metodologies basades en la hibridació in situ fluorescent (FISH), i els estudis de FISH en espermatozoides s’han incorporat ràpidament als protocols d’estudi dels pacients amb problemes de fertilitat. En aquest article es revisen els resultats obtinguts en individus portadors d’anomalies numèriques per als cromosomes sexuals, en portadors d’anomalies cromosòmiques estructurals i en individus amb cariotip somàtic normal que consulten per problemes d’infertilitat; es fa també esment a la significança clínica d’aquest tipus d’estudi. Paraules clau: citogenètica, cromosoma, espermatozoides, FISH, infertilitat. CYTOGENETIC STUDIES OF HUMAN SPERMATOZOA SUMMARY Chromosome abnormalities are one of the major causes of human infertility. In infertile males, abnormal somatic karyotypes are more frequent than in the general population. Furthermore, meiotic disorders affecting the germ-cell line have been observed in men with normal somatic karyotypes consulting for infertility. In both cases, the production of unbalanced spermatozoa has been described. Basically addressed to establish re-

178 Z. Sarrate, E. Anton, J. Blanco i F. Vidal

productive risks, fluorescence in situ hybridization (FISH) on decondensed sperm nuclei has become the most frequently used method to study the chromosomal constitution of spermatozoa. This paper reviews the information obtained through sperm FISH studies in carriers of numerical sex chromosome anomalies, carriers of structural chromosome reorganizations and infertile males with normal karyotypes emphasizing on its clinical significance. INTRODUCCIÓ En la gran majoria d’espècies animals, i molt especialment en humans, hi ha una clara relació entre anomalies genètiques i problemes reproductius. Es considera que hi ha una causa genètica en el 15 % dels pacients que consulten per problemes d’esterilitat o infertilitat (Küpker et al., 1999). Així doncs, les anàlisis genètiques, de tipus citogenètic o bé dirigides a la detecció de mutacions gèniques específiques, s’inclouen en la majoria de protocols d’estudi de l’esterilitat masculina i els resultats obtinguts són rellevants per al consell reproductiu de les parelles. Pel que fa als estudis citogenètics o cromosòmics, l’anàlisi del cariotip forma part de l’avaluació clínica bàsica. L’elevada incidència d’anomalies cromosòmiques constitucionals en pacients estèrils o infèrtils en relació amb la població general justifica la seva aplicació i permet diagnosticar al voltant del 7 % dels casos. A més, els estudis citogenètics del procés meiòtic adreçats a la detecció d’anomalies que afecten exclusivament la línia germinal, i que, per tant, no poden ser diagnosticats mitjançant l’anàlisi del cariotip somàtic i es duen a terme a partir de teixit testicular, també s’han incorporat als protocols d’estudi (Egozcue et al., 2005). Aquest darrer tipus d’anàlisi ha provat que al voltant del 6 % dels pacients amb un cariotip somàtic normal que consulten per problemes d’esterilitat presenten anomalies en el procés de la meiosi (Egozcue et al., 2000), i aquesta incidència pot ar-

ribar fins al 17,5 % en el cas d’individus que presenten oligoastenoteratozoospèrmia severa (Vendrell et al., 1999). Les anomalies citogenètiques descrites (somàtiques i germinals) interfereixen en el procés d’espermatogènesi, i s’han considerat responsables tant de la disminució en el nombre final d’espermatozoides produïts com de donar lloc a espermatozoides portadors d’anomalies cromosòmiques en els pacients afectats. La producció d’espermatozoides portadors d’anomalies cromosòmiques pot ser avaluada mitjançant la utilització de metodologies basades en la hibridació in situ fluorescent (FISH). La tècnica consisteix en l’aplicació de sondes de DNA específiques, que reconeixen determinats cromosomes o regions cromosòmiques, precedida per un protocol de descondensació de la cromatina espermàtica (Vidal et al., 1993). L’anàlisi de les mostres a través d’un microscopi de fluorescència permet inferir el genotip de cada espermatozoide a partir del nombre, el color i la distribució dels senyals d’hibridació. Aquesta tècnica ha ampliat notablement les possibilitats de valorar la dotació cromosòmica dels espermatozoides. Els estudis de FISH en espermatozoides s’han incorporat ràpidament als protocols d’estudi dels pacients amb problemes de fertilitat, molt especialment en els candidats a tècniques de reproducció assistida (Egozcue et al., 2003; Sarrate et al., 2005), ja que permeten obtenir dades fidedignes sobre la freqüència d’anomalies cromosòmiques en els

Anàlisi citogenètica d’espermatozoides humans 179

espermatozoides i una valuosa informació per orientar el consell reproductiu de cada cas. En aquest article es revisen els resultats obtinguts a partir de l’aplicació de les metodologies de FISH en espermatozoides en individus amb fertilitat reduïda i el seu paper en el consell genètic reproductiu. INDIVIDUS PORTADORS D’ALTERACIONS DEL CARIOTIP SOMÀTIC Portadors d’anomalies numèriques Les anomalies numèriques en els cromosomes sexuals són les anomalies més freqüents en els pacients estèrils que presenten alteracions en el seu cariotip. La presència de línies cel·lulars 47,XXY origina la síndrome de Klinefelter, que generalment està associada a una incompetència meiòtica dels espermatòcits primaris i a un bloqueig dràstic de l’espermatogènesi que, com a conseqüència, provoca l’esterilitat dels individus. Tot i que la gran majoria

dels pacients amb la síndrome de Klinefelter són azoospèrmics, en alguns individus s’observa algun focus d’espermatogènesi que dóna lloc a una discreta producció d’espermatozoides. En el 87 % dels individus analitzats, els estudis de FISH en espermatozoides mostren increments en la incidència de gàmetes amb disomies per als cromosomes sexuals (Sarrate et al., 2005). En individus Klinefelter aparentment no mosaics, la incidència mitjana és del 6,3 % (rang de 0-25 %) (vegeu la figura 1), valors clarament superiors al 0,2 % observat en individus de la població control (fèrtils i amb cariotip normal). En individus mosaics 46,XY/47,XXY aquest percentatge se situa al voltant del 2,5 % (rang de 0-7 %). La presència d’espermatozoides diploides en l’ejaculació també ha estat descrita per diversos grups d’investigació amb nombres que varien entre el 0,03 % i el 4,2 % (Sarrate et al., 2005). Els homes amb cariotip 47,XYY presenten graus de fertilitat molt variables i el nombre d’espermatozoides produïts oscil·la entre la normozoospèrmia i l’azoospèrmia. En aquests casos, un 3,7 % (rang de 0,1-14,4 %) dels espermatozoides analitzats en aquests

Figura 1. Incidència de disomies per als cromosomes sexuals en individus amb la síndrome de Klinefelter.

180 Z. Sarrate, E. Anton, J. Blanco i F. Vidal

individus presenten un cromosoma sexual extra (vegeu la figura 2). A totes les dades anteriors cal afegir que en aquests pacients l’anàlisi d’altres cromosomes a banda dels cromosomes sexuals ha posat de manifest l’existència de freqüències elevades d’espermatozoides portadors d’anomalies cromosòmiques numèriques. En concret, les anomalies del cromosoma 21 són de les més rellevants, i en pacients amb la síndrome de Klinefelter poden afectar el 6,2 % dels espermatozoides (Hennebicq et al., 2001). Així doncs, la producció d’espermatozoides portadors d’aneuploïdies per als cromosomes sexuals i per a altres cromosomes, així com d’espermatozoides amb dotacions diploides, són característiques força comunes en els individus 47,XXY i 47,XYY. No deixen de sorprendre, però, les grans diferències observades pel que fa a la producció d’espermatozoides amb anomalies cromosòmiques entre els individus estudiats (Blanco et al., 2001; Sarrate et al., 2005) Aquestes diferències s’atribueixen a la variabilitat genètica, especialment al grau de

mosaïcisme del teixit gonadal que puguin presentar aquests pacients. Aquesta variabilitat justificaria la realització d’estudis de FISH en espermatozoides en els individus orientats a la utilització de tècniques de reproducció assistida, i faria evident la necessitat d’oferir un consell reproductiu adient a aquests pacients. Portadors d’anomalies estructurals Els portadors de reorganitzacions cromosòmiques estructurals presenten una major producció de gàmetes amb desequilibris cromosòmics respecte a la resta de població. En aquest context, la tècnica de FISH en espermatozoides, juntament amb el desenvolupament de noves sondes de DNA, ha permès analitzar els percentatges d’espermatozoides cromosòmicament desequilibrats produïts per portadors de translocacions (robertsonianes i recíproques) i inversions (pericèntriques i paracèntriques). Aquests estudis han mostrat que els resultats de la segregació d’aquestes reor-

Figura 2. Incidència de disomies per als cromosomes sexuals en individus 47,XYY.

Anàlisi citogenètica d’espermatozoides humans 181

ganitzacions depenen del tipus i, en alguns casos, de les seves característiques. Els estudis de segregació realitzats en por tadors de translocacions robertsonianes durant els darrers anys han descrit freqüències de gàmetes desequilibrats que oscil·len entre el 7 i el 40 %. Tot i això, la majoria de valors se situen al voltant de la mitjana (84 %) i no s’han detectat factors cromosòmics que influeixin en aquesta reduïda variabilitat (revisat per Roux et al., 2005; Anahory et al., 2005; Brugnon et al., 2006; Hatakeyama et al., 2006; Moradkhani et al., 2006a, 2006b; Ogur et al., 2006; Chen et al., 2007; Kekesi et al., 2007). Els estudis de segregació realitzats en portadors de translocacions recíproques han mostrat freqüències de gàmetes desequilibrats més heterogènies que en el cas anterior (37,2-81,4 %). En aquest grup d’individus s’han descrit factors citogenètics relacionats amb les configuracions meiòtiques adoptades per aquestes reorganitzacions, que poden influir en els resultats de segregació obtinguts (Anton et al., 2008). En portadors d’inversions, les dades publicades han descrit freqüències de gàmetes desequilibrats que oscil·len entre el 0,4 i el 54,3 %. En aquests individus, s’ha observat que la producció de gàmetes amb aneusomies de recombinació està directament cor-

Figura 3. Relació entre la proporció del segment invertit i el percentatge de gàmetes recombinants produïts per portadors d’inversions cromosòmiques.

relacionada amb la proporció del segment invertit de cada cas (revisat per Anton et al., 2005) (vegeu la figura 3). D’altra banda, la presència de reorganitzacions estructurals també s’ha relacionat amb l’ocurrència del fenomen conegut amb el nom de efecte intercromosòmic (ICE), que es caracteritza per l’aparició d’anomalies cromosòmiques numèriques com a resultat de la reorganització en la segregació correcta d’altres cromosomes. Diversos estudis han avaluat l’existència d’aquest fenomen mitjançant la valoració d’aneuploïdies en portadors de translocacions robertsonianes (revisat per Douet-Guilbert et al., 2005; Baccetti et al., 2005; Machev et al., 2005; Hatakeyama et al., 2006; Chen et al., 2007; Kekesi et al., 2007), en portadors de translocacions recíproques (revisat per Douet-Guilbert et al., 2005; Anton et al., 2004; Machev et al., 2005; Kekesi et al., 2007; Wiland et al., 2007; Anton et al., 2008; Vozdova et al., 2008), i en portadors d’inversions (revisat per Anton et al., 2005; Mikhaail-Philips et al., 2005; Anton et al., 2006; Vialard et al., 2007). Els resultats obtinguts posen de manifest que gairebé la meitat dels portadors de reorganitzacions estructurals produeixen una quantitat de gàmetes amb anomalies cromosòmiques numèriques, no relacionades amb la reorganització, més elevada que la resta de la població. Entre aquests, els portadors de translocacions robertsonianes semblen els més susceptibles de presentar increments d’aneuploïdies/diploïdies (54 %), seguits pels portadors de translocacions recíproques (46 %) i, finalment, pels portadors d’inversions, amb una incidència del 18 % (vegeu la figura 4). Així doncs, els estudis de FISH en espermatozoides realitzats en aquests individus ajuden a inferir el comportament meiòtic dels cromosomes estudiats. En conjunt, la realització d’estudis cromosòmics en espermatozoides permeten

182 Z. Sarrate, E. Anton, J. Blanco i F. Vidal

Figura 4. Incidència de casos amb ICE positiu entre els portadors de translocacions robertsonianes, recíproques i inversions.

dur a terme una valoració exhaustiva del risc reproductiu en portadors de reorganitzacions cromosòmiques. L’aplicació en el consell genètic d’aquests individus ha d’estar vinculada tant al tipus de reorganització cromosòmica com a l’estratègia reproductiva establerta. INDIVIDUS INFÈRTILS AMB CARIOTIP SOMÀTIC NORMAL La majoria dels individus infèrtils tenen un cariotip somàtic normal, però sovint presenten seminogrames alterats. Des d’un punt de vista clínic, s’ha observat que la incidència d’aneuploïdies en els espermatozoides està directament relacionada amb la qualitat del semen (revisat per Egozcue et al., 2003; Sarrate et al., 2005), especialment amb un baix recompte espermàtic (revisat per Miharu, 2005). Diversos autors descriuen, d’una banda, freqüències significativament elevades d’espermatozoides aneuploides en individus oligozoospèrmics i, d’altra banda, una correlació directa entre un baix recompte espermàtic i els increments en les anomalies cromosòmiques dels espermatozoides (revisat per Miharu, 2005). En canvi,

la relació entre aneuploïdies en els gàmetes masculins i les característiques de motilitat o morfologia espermàtica no s’ha establert d’una manera tan clara (revisat per Rives, 2005; revisat per Sun et al., 2006; Collodel et al., 2007; Strassburger et al., 2007). L’origen d’aquestes anomalies cromosòmiques pot trobar-se en errors en el procés meiòtic, ja sigui en l’aparellament dels cromosomes homòlegs durant la profase i, o en els processos d’intercanvi del material genètic (Pearson et al., 1970; Egozcue et al., 1983, 2005). Aquestes anomalies sinàptiques s’han relacionat amb mutacions de gens propis de la meiosi involucrats tant en mecanismes de sinapsi i recombinació com en la reparació del DNA (revisat per Baarends et al., 2001). L’elevada heterogeneïtat entre els diferents estudis publicats, tant pel nombre d’individus analitzats, pels criteris de classificació dels pacients, per les característiques de la població control utilitzada, pels criteris de valoració de les mostres, pels cromosomes analitzats i, fins i tot, per les comparacions estadístiques realitzades, fa difícil una estimació fidedigna de les incidències d’espermatozoides aneuploides i diploides en aquest grup. Tot i així, cal destacar que són nombrosos els estudis que mostren increments significatius principalment en els percentatges de disomies per als cromosomes sexuals i diploïdies (Finkelstein et al., 1998; Templado et al., 2002; Martin et al., 2003; Tempest et al., 2004; Sarrate et al., 2005; Collodel et al., 2007; Faure et al., 2007). En aquest sentit, un estudi recent realitzat en el nostre laboratori en el qual s’han analitzat 245 individus infèrtils amb cariotip somàtic normal, mostra increments significatius en el 14 % dels individus (34/245), que majoritàriament impliquen disomies dels cromosomes sexuals (rang: 0,78-4,92 % respecte el 0,19 % de la població control) i diploïdies (rang: 0,54-2,67 % respecte el 0,22 %).

Anàlisi citogenètica d’espermatozoides humans 183

És en aquest grup d’individus infèrtils amb cariotip somàtic normal, notablement heterogeni, en què un estudi combinat de diferents tècniques de FISH (Multi-FISH en nuclis interfàsics i M-FISH en espermatòcits primaris i secundaris) proporcionaria una informació més útil de com evoluciona el procés espermatogènic, i permetria la caracterització citogenètica de les cèl·lules des dels espermatogonis fins als espermatozoides. BIBLIOGRAFIA Anahory, T.; Hamamah, S.; Andreo, B.; Hedon, B.; Claustres, M.; Sarda, P.; Pellestor, F. (2005). «Sperm segregation analysis of a (13;22) «Robertsonian translocation carrier by FISH: a comparison of locus-specific probe and whole chromosome painting». Hum. Reprod., 20: 1850-1854. Anton, E.; Blanco, J.; Egozcue, J.; Vidal, F. (2005). «Sperm studies in heterozygote inversion carriers: a review». Cytogenet. Genome Res., 111: 297-304. Anton, E.; Vidal, F.; Blanco, J. (2008). «Reciprocal translocations: tracing their meiotic behaviour». Genet. Med., 10: 730-738. Baarends, W. M.; Laan, R. van der; Grootegoed, J. A. (2001). «DNA repair mechanisms and gametogenesis». Reproduction, 121: 31-39. Baccetti, B.; Collodel, G.; Marzella, R.; Moretti, E.; Piomboni, P.; Scapigliati, G.; Serafini, F. (2005). «Ultrastructural studies of spermatozoa from infertile males with Robertsonian translocations and 18, X, Y aneuploidies». Hum. Reprod., 20: 22952300. Blanco, J.; Egozcue, J.; Vidal, F. (2001). «Meiotic behaviour of the sex chromosomes in three patients with sex chromosome anomalies (47,XXY, mosaic 46,XY/47,XXY and 47,XYY) assessed by fluorescence in-situ hybridization». Hum. Reprod., 16: 88792. Brugnon, F.; Assche, E. van; Verheyen, G.; Sion, B.; Boucher, D.; Pouly, J. L.; Janny, L.; Devroey, P.; Liebaers, I.; Steirteghem, A. van (2006). «Study of two markers of apoptosis and meiotic segregation in ejaculated sperm of chromosomal translocation carrier patients». Hum. Reprod., 21: 685-693. Collodel, G.; Capitani, S.; Baccetti, B.; Pammolli, A.; Moretti, E. (2007). «Sperm aneuploidies and low progressive motility». Hum. Reprod., 22: 1893-1898.

Chen, Y.; Huang, J.; Liu, P.; Qiao, J. (2007). «Analysis of meiotic segregation patterns and interchromosomal effects in sperm from six males with Robertsonian translocations». J. Assist. Reprod. Genet., 24: 406-411. Douet-Guilbert, N.; Bris, M. J.; Amice, V.; Marchet ti, C.; Delobel, B.; Amice, J.; Braekeleer, M. D.; Morel, F. (2005). «Interchromosomal effect in sperm of males with translocations: report of 6 cases and review of the literature». Int. J. Androl., 28: 372-379. Egozcue, J.; Blanco, J.; Anton, E.; Egozcue, S.; Sarra te, Z.; Vidal, F. (2003). «Genetic analysis of sperm and implications of severe male infertility—a review». Placenta, 24: S62-65. Egozcue, J.; Sarrate, Z.; Codina-Pascual, M.; Egozcue, S.; Oliver-Bonet, M.; Blanco, J.; Navarro, J.; Benet, J.; Vidal, F. (2005). «Meiotic abnormalities in infertile males» Cytogenet. Genome Res., 111: 337-342. Egozcue, S.; Vendrell, J. M.; Garcia, F.; Veiga, A.; Aran, B.; Barri, P. N.; Egozcue, J. (2000). «Increased incidence of meiotic anomalies in oligoasthenozoospermic males preselected for intracytoplasmic sperm injection». J. Assist. Reprod. Genet., 17: 307-309. Faure, A. K.; Aknin-Seifer, I.; Frérot, G.; Pelletier, R.; Robertis, C. de; Cans, C.; Levy, R.; Jimenez, C.; Lejeune, H.; Terrier, N.; Bergues, U.; Hennebicq, S.; Rousseaux, S. (2007). «Predictive factors for an increased risk of sperm aneuploidies in oligo-astheno-teratozoospermic males». Int. J. Androl., 30: 153-162. Finkelstein, S.; Mukamel, E.; Yavetz, H.; Paz, G.; Avi vi, L. (1998). «Increased rate of nondisjunction in sex cells derived from low-quality semen». Hum. Genet., 102: 129-137. Hatakeyama, C.; Gao, H.; Harmer, K.; Ma, S. (2006). «Meiotic segregation patterns and ICSI pregnancy outcome of a rare (13;21) Robertsonian translocation carrier: a case report». Hum. Reprod., 21: 976979. Hennebicq, S.; Pelletier, R.; Bergues, U.; Rousseaux, S. (2001). «Risk of trisomy 21 in offspring of patients with Klinefelter’s syndrome». Lancet, 357: 2104-2105. Kekesi, A.; Erdei, E.; Torok, M.; Dravucz, S.; Toth, A. (2007). «Segregation of chromosomes in spermatozoa of four Hungarian translocation carriers». Fertil. Steril., 88: 212.e5-212.e11. Küpker, W.; Schwinger, E.; Hiort, O.; Ludwig, M.; Nikolettos, N.; Schlegel, P. N.; Diedrich, K. (1999). «Genetics of male subfertility: consequences for the clinical work-up» Hum. Reprod., 14: 24-37. Machev, N.; Gosset, P.; Warter, S.; Treger, M.; Schil

184 Z. Sarrate, E. Anton, J. Blanco i F. Vidal

linger, M.; Viville, S. (2005). «Fluorescence in situ hybridization sperm analysis of six translocation carriers provides evidence of an interchromosomal effect». Fertil. Steril., 84: 365-373. Martin, R. H.; Rademaker, A. W.; Greene, C.; Ko, E.; Hoang, T.; Barclay, L.; Chernos, J. (2003). «A comparison of the frequency of sperm chromosome abnormalities in men with mild, moderate, and severe oligozoospermia». Biol. Reprod., 69: 535-539. Miharu, N. (2005). «Chromosome abnormalities in sperm from infertile men with normal somatic karyotypes: oligozoospermia». Cytogenet. Genome Res., 111: 347-351. Mikhaail-Philips, M. M.; McGillivray, B. C.; Hamilton, S. J.; Ko, E.; Chernos, J.; Rademaker, A.; Martin, R. H. (2005). «Unusual segregation products in sperm from a pericentric inversion 17 heterozygote». Hum. Genet., 117: 357-365. Moradkhani, K.; Puechberty, J.; Bhatt, S.; Lespinasse, J.; Vago, P.; Lefort, G.; Sarda, P.; Hamamah, S.; Pellestor, F. (2006a). «Rare Robertsonian translocations and meiotic behaviour: sperm FISH analysis of t(13;15) and t(14;15) translocations: a case report». Hum. Reprod., 21: 3193-3198. Moradkhani, K.; Puechberty, J.; Bhatt, S.; Vago, P.; Janny, L.; Lefort, G.; Hamamah, S.; Sarda, P.; Pel lestor, F. (2006b). «Meiotic segregation of rare Robertsonian translocations: sperm analysis of three t(14q;22q) cases». Hum. Reprod., 21: 1166-1171. Ogur, G.; Assche, E. van; Vegetti, W.; Verheyen, G.; Tournaye, H.; Bonduelle, M.; Steirteghem, A. van; Liebaers, I. (2006). «Chromosomal segregation in spermatozoa of 14 Robertsonian translocation carriers». Mol. Hum. Reprod., 12: 209-215. Pearson, P. L.; Ellis, J. D.; Evans, H. J. (1970). «A gross reduction in chiasma formation during meiotic prophase and a defective DNA repair mechanism associated with a case of human male infertility». Cytogenetics, 9: 460-467. Rives, N. M. (2005). «Chromosome abnormalities in sperm from infertile men with normal somatic karyotypes: asthenozoospermia». Cytogenet. Genome Res., 111: 358-362. Roux, C.; Tripogney, C.; Morel, F.; Joanne, C.; Fellmann, F.; Clavequin, M. C.; Bresson, J. L. (2005). «Segregation of chromosomes in sperm of Robertsonian translocation carriers». Cytogenet. Genome Res., 111: 291-296. Sarrate, Z.; Blanco, J.; Anton, E.; Egozcue, S.; Egozcue, J.; Vidal, F. (2005). «FISH studies of chromosome abnormalities in germ cells and its relevance in reproductive counseling». Asian J. Androl., 7: 227-236.

Strassburger, D.; Reichart, M.; Kaufman, S.; Kasterstein, E.; Komarovsky, D.; Bern, O.; Friedler, S.; Schachter, M.; Ron-El, R.; Raziel, A. (2007). «Morphology assessment and fluorescence in situ hybridization of the same spermatozoon using a computerized cell-scanning system». Hum. Reprod., 22: 201-209. Sun, F.; Ko, E.; Martin, R. H. (2006). «Is there a relationship between sperm chromosome abnormalities and sperm morphology?». Reprod. Biol. Endocrinol., 25: 1. Tempest, H. G.; Homa, S. T.; Dalakiouridou, M.; Christopikou, D.; Wright, D.; Zhai, X. P.; Griffin, D. K. (2004). «The association between male infertility and sperm disomy: evidence for variation in disomy levels among individuals and a correlation between particular semen parameters and disomy of specific chromosome pairs». Reprod. Biol. Endocrinol., 14: 82. Templado, C.; Hoang, T.; Greene, C.; Rademaker, A.; Chernos, J.; Martin, R. (2002). «Aneuploid spermatozoa in infertile men: teratozoospermia». Mol. Reprod. Dev., 61: 200-204. Vendrell, J. M.; Garcia, F.; Veiga, A.; Calderon, G.; Egozcue, S.; Egozcue, J.; Barri, P. N. (1999). «Meiotic abnormalities and spermatogenic parameters in severe oligoasthenozoospermia». Hum. Reprod., 14: 375-378. Vialard, F.; Delanete, A.; Clement, P.; Simon-Bouy, B.; Aubriot, F. X.; Selva, J. (2007). «Sperm chromosome analysis in two cases of paracentric inversion». Fertil. Steril., 87: e411-415. Vidal, F.; Moragas, M.; Català, V.; Torelló, M. J.; Santaló, J.; Calderón, G.; Giménez, C.; Barri, P. N.; Egozcue, J.; Veiga, A. (1993). «Sephadex filtration and human serum albumin gradients do not select spermatozoa by sex chromosomes: a fluorescent in situ hybridization study». Hum. Reprod., 10: 1740-1743. Vozdova, M.; Oracova, E.; Horinova, V.; Rubes, J. (2008). «Sperm fluorescence in situ hybridization study of meiotic segregation and an interchromosomal effect in carriers of t(11;18)». Hum. Reprod., 23: 581-588. Wiland, E.; Midro, A. T.; Panasiuk, B.; Kurpisz, M. (2007). «The analysis of meiotic segregation patterns and aneuploidy in the spermatozoa of father and son with translocation t(4;5)(p15.1;p12) and the prediction of the individual probability rate for unbalanced progeny at birth». J. Androl., 28: 262-272.

DOI: 10.2436/20.1501.02.67

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 185-191

FRAGMENTACIÓ DEL DNA ESPERMÀTIC Marga Esbert,¹ Alberto Pacheco,2 Mireia Florensa,1 Marissa Riqueros,1 Marta Martín,1 Agustín Ballesteros 1 i Gloria Calderón ¹ 1 2

IVI Barcelona. IVI Madrid.

Adreça per a la correspondència: Marga Esbert. IVI Barcelona. General Mitre, 14. 08017 Barcelona. Adreça electrònica: mesbert@ivi.es. RESUM La fragmentació del DNA és la conseqüència final de l’apoptosi. En el testicle és ben sabut que el camí utilitzat per controlar el nombre adequat de cèl·lules germinals mitjançant cèl·lules de Sertoli depèn de la via Fas. Tot i això, hi ha espermatozoides que han estat assenyalats per prendre la via de l’apoptosi, que s’escapen d’aquest procés. Altres fonts possibles de dany al DNA espermàtic poden ser l’estrès oxidatiu, provocat per radicals lliures d’oxigen (sovint produïts per leucòcits presents en l’ejaculació, però també per part d’altres espermatozoides), i també processos naturals, com ara la recombinació i l’empaquetament de la cromatina, que impliquen la formació de fragments en les cadenes de DNA. La relació entre la fragmentació del DNA espermàtic i l’esterilitat masculina sembla clara, però, en qualsevol cas, encara hi ha controvèrsia sobre l’efecte d’aquesta fragmentació quan se segueixen processos de reproducció assistida, ja que hi ha passos naturals que són esquivats i també hi ha un efecte oocitari molt important. Paraules clau: espermatozoides, esterilitat, fragmentació del DNA. SPERM DNA DAMAGE SUMMARY DNA fragmentation is the last phenomenon occurred during apoptosis. It is known that Fas-mediated apoptosis is the way used in testes to control the number of germ cells that are excessive with the supportive capacity of the Sertoli cells. Even dough, spermatozoa that have been earmarked to undergo apoptosis escape this process. Other potential source of sperm DNA damage is oxidative stress due to reactive oxygen species (produced by leukocytes present in ejaculate, but also by other spermatozoa) and deficiencies in natural processes such as recombination and chromatin packaging that involves the induction

186 M. Esbert et al.

of DNA strand breaks. It seems clear that DNA damage on sperm is related to male fertility but it is still controversial if this DNA fragmentation has an effect when Assisted Reproduction Techniques are performed, due to natural steps are bypassed and there is also an oocyte effect that can not be forgotten. Key words: DNA fragmentation, infertility, spermatozoa. INTRODUCCIÓ L’apoptosi, o mort cel·lular, és un fenomen fisiològic necessari per a un desenvolupament, manteniment de l’estructura tissular i reciclatge cel·lular correctes. Aquest procés està associat a diferents canvis en la cèl·lula, tant bioquímics com físics, que afecten el citoplasma, la membrana plasmàtica i, finalment, el nucli, que es fragmenta mitjançant endonucleases (Lawen, 2003). La mort cel·lular passa espontàniament en el cicle de l’epiteli seminífer, i aquest procés s’esdevé en estadis específics de l’espermatogènesi per tenir un control sobre la producció d’espermatozoides. S’ha observat que l’apoptosi (determinada com a fragmentació del DNA mitjançant anàlisi ultraestructural) és anormalment freqüent en els espermatozoides ejaculats de pacients estèrils (Irvine et al., 2000). LA CROMATINA DE L’ESPERMATOZOIDE Les dues principals diferències entre el nucli de l’espermatozoide i el de qualsevol cèl·lula somàtica són la ploïdia i l’organització. La meiosi té com a finalitat la reducció de la càrrega genètica a la meitat, de manera que quan es produeixi la fecundació es torni a la dotació diploide dels organismes. El nucli de cada espermatozoide conté només un joc de cromosomes complet, mentre que en el nucli de les cèl·lules somàtiques n’existeixen dues còpies.

El DNA espermàtic s’organitza d’una manera específica, tot mantenint la cromatina compacta i estable. Aquesta organització permet, no tan sols el manteniment de la informació genètica que es transferirà a l’oòcit, sinó també assegurar que el DNA arribi en bon estat físic i químic perquè l’embrió tingui un accés fàcil a la informació genètica. El major grau de compactació s’aconse gueix amb la unió del DNA a proteïnes de transició en els espermatòcits, que són subs tituïdes per protamines en les espermà tides. Els espermatozoides d’homes fèrtils tenen el DNA estable i es pot descondensar fàcilment, en el moment adequat, durant el procés de la fecundació. FONTS DE FRAGMENTACIÓ DEL DNA ESPERMÀTIC Empaquetament anormal de la cromatina L’activitat endonucleasa (per part de la topoisomerasa ii) durant el canvi d’histones per protamines és imprescindible. Aquests enzims han de tallar i després unir correctament el DNA, perquè s’alliberi l’estrès de torsió. Si hi ha alguna alteració en el control d’aquest procés, poden existir ruptures de DNA que no siguin reparades (McPherson i Longo, 1992).

Fragmentació del DNA espermàtic 187

Radicals lliures d’oxigen Fisiològicament, els ROS són necessaris tant per a la hiperactivació espermàtica, que permet a l’espermatozoide moure’s pel tracte genital femení i travessar les cèl·lules del cúmul, com per a la peroxidació lipídica, necessària per la fusió amb la zona pel· lúcida. L’estrès oxidatiu és originat per una excessiva generació de radicals lliures per part dels espermatozoides mateixos o els leucòcits. L’efecte pel que fa a l’esperma és molt gran, a causa de la seva poca capacitat de defensa antioxidant en els espermatozoides (Lamirande i Cagnon, 1995) i també de la gran quantitat d’àcids grassos poliinsaturats de la seva membrana (Alvarez i Storey, 1995). Els radicals lliures actuen sobre mecanismes que inclouen la peroxidació de la membrana plasmàtica, i pel que fa a la integritat de la cromatina espermàtica, són l’origen de ruptures de cadena simple i doble de DNA i també de modificació i deleció de bases. Apoptosi abortiva Durant l’espermatogènesi, tal com ja hem dit, l’apoptosi limita l’excés del nombre d’espermatozoides que poden mantenir les cèl· lules de Sertoli mitjançant la síntesi de FasL. Quan hi ha una falta de sincronització, els espermatozoides acaben l’espermatogènesi, tot i que en realitat haurien d’acabar el procés de mort cel·lular. S’ha observat que en pacients amb paràmetres seminals per sota del que marca la normalitat, hi ha una major presència de fragmentació de DNA en els espermatozoides que arriben a ser ejaculats. Aquest fenomen ha estat explicat per la teoria de l’apoptosi abortiva (Sakkas et al., 1999). L’apoptosi abortiva tindria com a conse-

qüència el fet de que espermatozoides que han estat marcats per ser eliminats (possiblement per eliminar cèl·lules germinals defectuoses pel que fa al pool genètic) apareixerien en la població d’espermatozoides ejaculats. TÈCNIQUES PER QUANTIFICAR EL DANY EN EL DNA ESPERMÀTIC S’han desenvolupat diferents tècniques per a la detecció i quantificació de dany en el DNA, algunes àmpliament utilitzades en l’estudi de cèl·lules somàtiques, i d’altres pensades exclusivament per a cèl·lules espermàtiques. A continuació es descriuen les quatre més utilitzades. SCSA: sperm chromatin structure assay (Evenson et al., 1980) És una de les tècniques més emprades, tot i tenir com a limitació el fet de mesurar la susceptibilitat del DNA a ser desnaturalitzat in situ (després de ser exposat a un pH àcid) i no específicament ruptures en el DNA. Si la cromatina de l’espermatozoide és normal no s’ha de descondensar. Després es tenyeix amb taronja d’acridina, que és un fluorocrom metacromàtic que emet llum verda quan s’intercala en cadenes de DNA dobles (DNA intacte) i en vermell si són cadenes senzilles (DNA fragmentat). Amb l’ajuda d’un citòmetre de flux equipat amb un làser d’argó, i després de la preparació i tinció, es compten 5.000-10.000 cèl·lules en cinc minuts. Les dades del citòmetre es bolquen en una base de dades, i un programa informàtic determina la proporció d’espermatozoides amb nivells de fluorescència vermella (DNA fragmentat) i fluorescència verda (espermatozoides immadurs). D’aquestes dades es pot obtenir el

188 M. Esbert et al.

DFI (índex de fragmentació del DNA). Tot i que l’SCSA és una mesura indirecta de ruptura de cadena de DNA, hi ha estudis que troben bona correlació entre el DFI i la proporció de cèl·lules positives amb l’assaig del TUNEL i del cometa.

gistra la longitud de la cua, el moment i el percentatge de DNA de la cua amb programes informàtics (vegeu la figura 1).

TUNEL: Tdt-mediated-dUTPnick-end labelling (Gorczyca et al., 1993)

Està basat en la capacitat que té el DNA intacte d’expandir-se sota condicions en què s’eliminen les proteïnes que li donen la seva estructura. Els espermatozoides amb el DNA fragmentat, un cop immersos en una matriu d’agarosa i exposats a solucions de lisi, no poden formar un halo. Un DNA intacte sí que és capaç de formar un halo. Un cop tenyits els nuclis es podran classificar en quatre categories: halo gran, halo mitjà, halo petit, i cèl·lules sense halo. El principal avantatge d’aquest mètode és el poc cost econòmic i temporal; la subjectivitat a l’hora de classificar la mida de l’halo és un dels seus inconvenients.

Quantifica la incorporació de trifosfat de desoxiuridina (dUTP) a ruptures 3´-OH de cadena senzilla o doble en una reacció catalitzada per un enzim transferasa. El senyal augmentarà amb el nombre de fragments, i podrà ser quantificat tant amb citometria de flux com amb microscòpia fluorescent. Per crear controls negatius, cal que es prepari una solució de reacció sense la terminal transferasa, i per crear controls positius, les mostres es tracten amb DNAasa i durant 30 min i després es marquen amb la fluorescència. Assaig del cometa (Hughes et al., 1996) També és conegut com electroforesi de cèl· lules aïllades, i és una tècnica àmpliament utilitzada per determinar dany en el DNA de cèl·lules somàtiques. En l’estudi de fragmentació del DNA espermàtic, se submergeixen les cèl·lules en una capa d’agarosa molt fina, es lisen i se sotmeten a electroforesi. Posteriorment es tenyeixen i es marquen amb tinció fluorescent. Els fragments de cadenes de DNA migren cap a l’ànode i tenen l’aparença d’un cometa, i el dany serà quantificat mesurant el material genètic que s’ha desplaçat del nucli a la cua. La visualització del DNA es realitza utilitzant un microscopi de fluorescència. Les mesures de l’halo es realitzen mitjançant l’anàlisi amb ordinador de la imatge, i es re-

SDC: sperm chromatin dispersion test (Fernández, 2003)

RELACIÓ ENTRE LA FRAGMENTACIÓ DEL DNA ESPERMÀTIC I L’ESTERILITAT Per ara no hi ha consens a l’hora de donar un valor pronòstic al percentatge de fragmentació en el DNA espermàtic sobre les possibilitats d’aconseguir un embaràs. Tot i que sembla que hi ha evidències en la literatura que demostren que el dany influeix en la fertilitat, no està clar en quina mesura. Tampoc no hi ha consens a l’hora de decidir quina tècnica cal utilitzar per determinar el dany genètic dels espermatozoides, ni tampoc hi ha un protocol estàndard que es pugui seguir. La comunitat científica sembla que té ganes d’integrar el test en la rutina clínica, però els estudis publicats sobre aquest tema

Fragmentació del DNA espermàtic 189

compten amb els problemes de qualsevol nova prova que es vol introduir, com, per exemple, poca població analitzada, diferents dissenys segons els diferents estudis i conclusions que entren en conflicte. La nostra experiència A l’IVI Barcelona s’han realitzat tres estudis amb la fragmentació del DNA espermàtic com a motiu principal. Sempre s’analitza el dany utilitzant la tècnica del TUNEL, fent servir el kit de Roche In Situ Cell Death Detection Kit, fluoresceïna i, seguidament, citometria de flux per quantificar aquest dany. En primer lloc vam analitzar l’efecte de la tècnica de capacitació espermàtica (Esbert et al., 2007a), que és imprescindible a l’hora de realitzar un tractament de reproducció assistida, pel que fa al dany que presentaven els espermatozoides en el DNA. Estudiant cent sis mostres seminals abans i després de ser sotmeses a gradients de densitat vam observar una menor taxa de fragmentació després de preparar la mostra (17,58 %, 95 % CI 15,02-20,15 %) respecte de la mostra abans de capacitar (25,31 %, 95 % CI 22,3428,28 %) (p < 0,001). Es va trobar una correlació directa entre el percentatge de dany després de la capacitació i el total d’espermatozoides mòbils progressius recuperats (r = –0,32, p = 0,001) i, a més, quan aconseguíem una bo-

na recuperació d’espermatozoides progressius (≥ 75 % AB) la fragmentació era significativament menor (14,84 % 11,82-17,87 %) que quan no havíem recuperat aquest percentatge (24,21 % 95 % CI 20,03-28,38 %) (p < 0,001). També ens va interessar saber l’efecte de l’edat sobre el dany genètic dels espermatozoides (Esbert et al, 2007b). Vam analitzar cent dinou mostres seminals de pacients, i vam observar una clara relació positiva entre l’edat i el dany genètic quan s’analitzaven les mostres ejaculades (r = 0,21, p = 0,023). Aquesta correlació desapareixia quan les mostres eren capacitades (r = 0,14, p = 0,14), possiblement per la selecció que és capaç de fer aquesta tècnica sobre els espermatozoides més funcionals. El darrer estudi (Esbert et al., 2007c) ha estat realitzat per valorar l’efecte de la fragmentació del DNA quant a l’èxit que tindrà un cicle de fecundació in vitro. Es van incloure cent setanta-cinc cicles de FIV, en vuitanta-dos s’utilitzaven òvuls propis de la pacient, i en els noranta-tres cicles restants es van utilitzar òvuls de donants sanes. La fragmentació en el DNA espermàtic es mesurava en una alíquota de la mostra seminal utilitzada pel cicle de FIV mateix. No vam observar correlació entre la fragmentació en el DNA espermàtic i la capacitat dels espermatozoides de fecundar amb FIV convencional (r = 0,02, p = 0,88) ni microinjecció intracitoplasmàtica (r = –0,15, p = 0,12). No es van trobar diferències en la

Figura 1. Imatges d’espermatozoides després de l’assaig del cometa, amb un 0 %, un 10 % i un 45 % de DNA que ha migrat cap a l’ànode quan han estat sotmesos a electroforesi.

190 M. Esbert et al.

fragmentació present en pacients embarassades respecte de les no embarassades. El percentatge de fragmentació de DNA en parelles que van patir un avortament va ser significativament major (29,71 %, 95 % CI 19,02-40,42 %) que en les parelles que no en van tenir cap (17,82 %, 95 % CI 14,42-21,22 %) (p = 0,015); l’edat mitjana de les dones era similar en els dos grups. Les revisions recents (Zini i Libman, 2006) i els estudis amb gran població estudiada (Lin, 2008) deixen clar que no és possible arribar encara a un consens en les publicacions científiques: mentre alguns autors troben una menor taxa de fecundació, d’embaràs i d’implantació quan hi ha un nivell de fragmentació, d’altres no en troben. Aquests resultats també varien en funció de la prova utilitzada per mesurar el dany. CONCLUSIONS Els radicals lliures i de l’apoptosi tenen com a conseqüència la fragmentació del DNA espermàtic. El possible valor pronòstic d’aquest dany genètic no resulta tan satisfactori, probablement perquè les mostres es capaciten abans de ser utilitzades i perquè el paper de l’òvul també és important a l’hora de reparar el dany. El temps i les publicacions amb una gran població analitzada seran els que donaran el valor real a l’estudi d’aquesta fragmentació en el DNA espermàtic. BIBLIOGRAFIA Alvarez, J. G.; Storey, B. T. (1995). «Differential incorporation of fatty acids into and peroxidative loss of fatty acids from phospholipids of human spermatozoa». Mol. Reprod. Dev., 42: 334-346. Esbert, M. A.; San Celetino, M.; Vidal, F.; Ballesteros, A.; Calderón, G. (2007b). «Impact of sperm

DNA fragmentation on embryo quality, pregnancy and miscarriage rate in IVF cycles of patients and oocytes recipients» Fertil. Steril., 88, S31. Esbert, M.; Pacheco, A.; Florensa, M.; Riqueros, M.; San Celestino, M.; Vernaeve, V.; Vidal, F.; Ballesteros, A.; Calderon, G. (2007a). «Relationship between male age and sperm DNA fragmentation». II Congrés IVI Internacional (Barcelona). [Pòster] Esbert, M.; Pacheco, A.; Florensa, M.; Riqueros, M.; San Celetino, M.; Vernaeve, V.; Vidal, F.; Ballesteros, A.; Calderón, G. (2007c). «Importancia dela técnica de capacitación espermática en la fragmentación del DNA del espermatozoide». IV Congrés Nacional de l’Associació Espanyola de Biòlegs de la Reproducció (Bilbao). [Pòster] Evenson, D. P.; Darzynkievicz, Z.; Melamed, M. R. (1980). «Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility». Science, 210: 1131-1133. Fernandez, J. L.; Muriel, L.; Rivero, M. T.; Goyanes, V.; Vazquez, R.; Alvarez, J. G. (2003). «The sperm chromatin dispersion test: a simple method for the determination of sperm DNA fragmentation». J Androl., 24: 59-66. Gorzyca, W.; Traganos, F.; Jesionowska, H.; Darzn kievicz, Z. (1993). «Presence of DNA strand breaks and increased sensitivity of DNA in situ to denaturation in abnormal human sperm cells: analogy to apoptosis of somatic cells». Exp. Cell. Res., 207: 202-205. Hughes, C.; Lewis, S.; Mckelvey-Martin, V.; Thompson, W. (1996). «A comparison of baseline and induced DNA damage in human spermatozoa from fertile and infertile men, using a modified comet assay». Mol. Hum. Reprod., 2: 613-619. Irvine, D. S.; Twigg, J.; Gordon, E.; Fulton, N.; Milne, P.; Aitken, R. J. (2000). «DNA integrity in human spermatozoa: relationship with semen quality». Journal of Andrology, 21: 33-44. Lamirande, E. de; Cagnon, C. (1995). «Impact of reactive oxygen species on spermatozoa: a balancing act between beneficial and detrimental effects». Hum. Reprod., 10: 15-21. Lawen, A. (2003) «Apoptosis: an introduction». Bio Essays, 25: 888-896. Lin, M. H.; Kuo-Kuang, L. R.; Li, S. H.; Lu, C. H.; Sun, F. J.; Hwu, Y. M. (2008). «Sperm chromatin structure assay parameters are not related to fertilization rates, embryo quality, and pregnancy rates in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection, but might be related to spontaneous abortion rates» Fertil. Steril., 90: 352-359. Mcpherson, S. M. G.; Longo, F. J. (1992). «Localization of DNase I-hypersensitive regions during rat spermatogenesis: stage-dependent patterns and

Fragmentació del DNA espermàtic 191

unique sensitivity of elongating spermatids». Mol. Reprod. Dev., 31: 268-279. Sakkas, D.; Mariehoz, E.; Manicardi, G.; Bizzaro, D.; Bianchi, P. G.; Bianchi, U. (1999). «Origin of DNA damage in ejaculated human spermatozoa». Reviews of Reproduction, 4: 31.

Zini, A.; Libman, J. (2006). «Sperm DNA damage: clinical significance in the era of assisted reproduction». CMAJ, 175: 495-500.

DOI: 10.2436/20.1501.02.68

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 193-209

ESTUDI I DIAGNÒSTIC D’ANEUPLOÏDIES EN OÒCITS HUMANS Mariona Rius, Albert Obradors, Maria Oliver, Jordi Benet i Joaquima Navarro Unitat de Biologia Cel·lular i Genètica Mèdica, Facultat de Medicina, Universitat Autònoma de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Joaquima Navarro. Unitat de Biologia Cel·lular i Genètica Mèdica, Facultat de Medicina, Universitat Autònoma de Barcelona. Campus de Bellaterra, edifici M. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: joaquima.navarro@uab.cat. RESUM La disponibilitat de material biològic descartat de cicles de fecundació in vitro (FIV) ha estat molt valuós per a l’estudi d’aneuploïdies en els primers estadis del desenvolupament embrionari. L’estudi citogenètic d’oòcits humans requereix l’anàlisi per separat de l’oòcit en estadi de meiosi ii i el corresponent primer corpuscle polar amb dotació cromosòmica complementària. La hibridació in situ fluorescent i les seves variants, com el cariotipatge espectral, l’encebador in situ o la FISH de centròmers multicolor, han estat molt útils, tot i que requereixen la fixació prèvia de la cèl·lula. Com a alternativa, la hibridació genòmica comparada no requereix la fixació de la cèl·lula i, a més, permet estudiar el complement cromosòmic sencer. La freqüència d’aneuploïdia dels oòcits humans és força variable segons els autors. Bàsicament és degut al fet que s’analitzen amb diferents tècniques diferents tipus d’oòcits: els resultats amb CGH en oòcits (envellits o no) de dones incloses en cicles de FIV i en oòcits frescos de donants oscil·len entre el 22 % i el 65 %. Els mecanismes d’origen proposats són principalment alteracions produïdes a l’anafase i, com la no-disjunció d’homòlegs o la separació precoç de cromàtides germanes, encara que també s’han vist fallades en la segregació mitòtica d’oogònies en etapes inicials del desenvolupament embrionari. L’aplicació translacional dels estudis ha afavorit el desenvolupament del diagnòstic genètic preimplantacional, mitjançant FISH o CGH, per al diagnòstic d’aneuploïdies d’origen femení. Un dels reptes actuals és incrementar la taxa d’implantació dels embrions transferits. Paraules clau: aneuploïdia, DGP, primer corpuscle polar, FISH, CGH.

194 M. Rius, A. Obradors, M. Oliver, J. Benet i J. Navarro

STUDY AND DIAGNOSTIC OF ANEUPLOIDIES IN HUMAN OOCYTES SUMMARY The availability of biologic material discarded from IVF cycles has been pretty valuable for the study of aneuploidies in the first stages of embryonic development. The cytogenetic study of human oocytes requires the analysis of the MII oocyte and the corresponding 1rstPB separately. Fluorescent in situ hybridization and its variants, such as SKY, PRINS or cenM-FISH, have been very useful, although these techniques require a previous cell fixation. As an alternative, CGH does not require cell fixation and furthermore, it allows for the study of the whole chromosomal complement. Aneuploidy rate from published CGH results show a great variability. It ranges from 22% to 65%. This variability is mainly due to the use of different material: oocytes from women undergoing IVF and fresh oocytes from donors The mechanisms proposed for aneuploidy production are mainly alterations produced in anaphase I, such as homologous non-disjunction and premature separation of sister chromatids. Mitotic segregation failure in the oogonies produced during the early stages of embryonic development has also been reported. The translational application of studies has favoured the development of PGD, by means of FISH or CGH, for the aneuploidy diagnostic of female origin. At this moment, one of the challenges is to increase the implantation rate of the transferred embryos. Key words: aneuploidy, PGD, first polar body, FISH, CGH. Llistat d’abreviacions 1rCP: primer corpuscle polar. AS: cribratge d’aneuploïdies (aneuploidy screening). CenM-FISH: FISH de centròmers multicolor. CGH: hibridació genòmica comparada (comparative genome hybridisation). DGP: diagnòstic genètic preimplantacional. DGP-BL: DGP en blastòmer. DGP-1rCP: DGP en primer corpuscle polar. DF-DGP: DGP per a doble factor de risc genètic. DOP-PCR: PCR amb encebadors degenerats (degenerated oligonucleotide primer-primed chain reaction). FIV: fecundació in vitro. FISH: hibridació in situ fluorescent (fluorescent in situ hybridisation). ICSI: injecció citoplasmàtica d’esperma (intracitoplasmatic sperm injection). MII: oòcit en estadi de meiosi ii. MDA: mètode isotèrmic d’amplificació de múltiple desplaçament (multiple displacement amplification). ND: no-disjunció de cromosomes homòlegs. PRINS: encebador in situ (primer in situ). PSSC: separació prematura de cromàtides germanes (premature separation of sister chromatids). SKY: cariotipatge espectral (spectral karyotyping). TRA: tècniques de reproducció assistida.

Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans 195

INTRODUCCIÓ L’aneuploïdia és un fenomen extremament freqüent en l’espècie humana. Amb les tècniques de reproducció assistida (TRA) i de diagnòstic genètic preimplantacional (DGP) s’ha vist que el 90 % dels embrions aneuploides, o amb dotacions cromosòmiques anòmales, ho són a causa d’errors de segregació en la meiosi i materna (Nicolaidis i Petersen, 1998). Això concorda amb el fet que la primera divisió meiòtica materna comença en els estadis prenatals i no es completa fins al moment de l’ovulació, durant el període fèrtil femení, que s’inicia als onze anys i finalitza uns quaranta anys més tard (Hassold et al., 1996). El coneixement de l’origen femení de la majoria de les aneuploïdies ha fet que l’estudi citogenètic dels oòcits hagi adquirit una considerable importància. De fet, gràcies al desenvolupament de les TRA i el DGP s’ha generat la disponibilitat de material biològic descartat (gàmetes i embrions humans no aptes per transferir a l’úter matern), que és molt valuós per a l’estudi de la freqüència d’aneuploïdies en els primers estadis del desenvolupament embrionari. El material d’anàlisi habitual en el DGP és un o dos blastòmers (DGP-BL) de l’embrió en estadi de 6-8 cèl·lules o bé el primer corpuscle polar (1rCP) de cada oòcit (DGP1rCP). Recentment també s’han començat a estudiar les cèl·lules del trofectoderma d’embrions en estadi de blastocist. Els resultats de l’aplicació del DGP per al cribratge d’aneuploïdies (aneuploidy screening, AS) són compilats periòdicament per la Societat Europea de Reproducció Humana (European Society of Human Reproduction, ESHRE). L’últim recull de l’ESHRE (Goossens et al., 2008) inclou un total de 9.153 cicles de DGPAS realitzats fins a l’octubre de 2006, en

1.007 dels quals s’estudia el 1rCP, i en 7.816 un o dos blastòmers. D’un total de 109.832 complexos oòcit-cúmulus (COC) obtinguts, 90.501 van ser inseminats i 64.086 (70,8 %) es van fecundar. El diagnòstic citogenètic es va obtenir en 46.589 (92 %) de 50.622 cèl·lules biopsiades amb èxit. D’un total de 12.131 embrions transferits es van aconseguir 2.165 embarassos bioquímics i 2.165 embarassos detectats per batec cardíac, fet que representa una taxa d’implantació del DGP-AS (embaràs bioquímic/transferits) del 17,8 %. El desenvolupament del DGP-1rCP va sorgir com un repte per detectar anomalies genètiques en els gàmetes, és a dir, abans de la fecundació. Això només és possible plantejar-ho quan el risc genètic prové de la mare i es deu a les característiques diferencials que existeixen en la gametogènesi femenina. Mentre que els espermatozoides són cèl·lules haploides que resulten de dues divisions meiòtiques, els oòcits en el moment de l’ovulació no han completat la meiosi ii i queden aturats en la metafase de la segona divisió meiòtica (vegeu la figura 1). D’aquesta manera, el gàmeta femení està format per dues cèl·lules: l’oòcit en metafase ii (MII), que conté tot el citoplasma de l’oogònia predecessora, i el 1rCP, que conté quasi exclusivament una dotació cromosòmica haploide, que és complementària a la de l’oòcit en MII. Només l’oòcit en MII té capacitat reproductiva per desenvolupar un embrió en cas de ser fecundat per un espermatozoide. El 1rCP, sense funció reproductiva, i que degenera, pot ser extret per biòpsia sense que això representi cap efecte negatiu en la capacitat fecundant del corresponent oòcit. El resultat obtingut de l’anàlisi del 1rCP permet conèixer, de manera indirecta, la dotació cromosòmica del corresponent oòcit en MII.

196 M. Rius, A. Obradors, M. Oliver, J. Benet i J. Navarro

METODOLOGIES D’ESTUDI DE LES ANEUPLOÏDIES EN OÒCITS HUMANS: ANÀLISI CITOGENÈTICA DEL PRIMER CORPUSCLE POLAR I LA METAFASE II DE L’OÒCIT Per estudiar la incidència d’aneuploïdies d’origen femení s’ha d’estudiar tant el complement cromosòmic del 1rCP com el de la MII. És més, el resultat de l’anàlisi del 1rCP constitueix un control intern de la segregació dels cromosomes, la qual cosa és essencial. Els mètodes més àmpliament utilitzats per a l’estudi d’aneuploïdies en 1rCP i MII requereixen fixar sobre un portaobjectes cada cèl·lula. Tot i que es poden fixar les dues cèl·lules conjuntament, és molt recomanable fixar-les per separat. En aquest cas se separen eliminant la zona pel·lúcida amb àcid de Tyrode o bé perforant la zona pel·lúcida. El 1rCP es pot obtenir, sense malmetre l’oòcit en MII, per diferents procediments de biòpsia, com el sistema mecànic, pel qual amb una pipeta punxeguda es talla la zona pel·lúcida i s’extreu el 1rCP amb una pipeta de biòpsia, o un sistema físic, basat en un làser que perfora la zona pel·lúcida (Mal-

ter i Cohen, 1989; Durban et al., 2001) (vegeu la figura 2). Un cop aïllada cada cèl·lula, es procedeix a la fixació per obtenir extensions cromosòmiques de bona qualitat en un portaobjectes. Els mètodes de fixació més utilitzats són: el de Tarkowsky, que utilitza una solució fixadora d’etanol i àcid acètic, 1:1 v/v, i el de Mikamo i Kamiguchi, que es tracta d’una fixació gradual. Per al 1rCP, els dos mètodes de fixació aplicats són el de Tarkowsky i el de Durban (Durban et al., 1998). Aquest últim és especialment indicat per a la fixació del 1rCP i es realitza sota control estereomicroscòpic. El 1rCP, prèviament hipotonitzat, és fixat en un portaobjectes tractat amb trimetoxisilà. El fixador s’addiciona creant un flux suau de solució fixadora (etanol i àcid acètic, 1:1 v/v) dirigit cap al 1rCP, que dissol la membrana citoplasmàtica. Aquest mètode, aplicat als 1rCP d’oòcits frescos, en el 88 % dels casos aconsegueix extensions de bona qualitat i ha proporcionat la millor concordança entre el complement cromosòmic del 1rCP i la MII després de l’aplicació de les tècniques d’hibridació Sistema mecànic

Sistema físic

Làser

Sistema químic

Àcid de Tyrode

Figura 1. Oòcit en MII i primers estadis del desenvolupament embrionari. a) oòcit, b) embrió en estadi de dues cèl·lules, c) embrió en estadi de quatre cèl·lules, d) embrió en estadi de vuit cèllules i e) blastocist.

Figura 2. Mètodes de biòpsia del 1rCP.

Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans 197

in situ fluorescent (fluorescent in situ hibridization, FISH) (vegeu la figura 3). Després de la fixació alguns grups apliquen les tècniques de tinció per aconseguir bandes cromosòmiques, com les bandes R (Pellestor et al., 2003), però les tècniques d’identificació cromosòmica més recomanables són les de FISH. Amb la FISH es poden emprar sondes fluorescents per pintar els cromosomes sencers o bé sondes puntuals com les específiques de locus, centromèriques o telomèriques, entre d’altres. En un principi, es va començar analitzant dos cromosomes, 18 i X (Dailey et al., 1996) i posteriorment en més d’una ronda d’hibridació s’ha anat augmentant el nombre final de cromosomes predeterminats que s’estudien, fins a tres cromosomes per ronda, amb nou cromosomes (1, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22 i X) (Pujol et al., 2003a). Aquests inclouen els cromosomes implicats en les aneuploïdies viables. A més, alguns d’aquests cromosomes estan implicats en aneuploïdies causants d’avortaments espontanis; a més, en blastòmers d’embrions de dones d’edat avançada (Bahce et al., 1999; Gianaroli et al., 1999; Egozcue et al., 2002) podrien també estar implicats en la reducció de la taxa d’im-

Figura 3. Mètode de fixació del 1rCP.

plantació (Dailey et al., 1996; Verlinsky et al., 1999; Mahmood et al., 2000; Cupisti et al., 2003; Pujol et al., 2003a). Una variant de la FISH és el cariotipatge espectral (spectral karyotyping, SKY) (Márquez et al., 1998; Sandalinas et al., 2002; Clyde et al., 2003), que permet l’estudi de tot el complement cromosòmic. Aquest sistema utilitza vint-i-quatre sondes de pintura específiques per a cada cromosoma. Cada sonda està marcada amb una proporció diferent de cinc fluorocroms separats que, en ser observats mitjançant el sistema d’imatge espectral amb el programari adient, mostren colors diferents per a cada cromosoma, cosa que permet identificar correctament cada parella de cromosomes en el cariotip. Una altra variant de la FISH és la CenMFISH, o una FISH multicolor en què s’empren sondes específiques per a centròmers marcades directament o indirectament amb un, dos, tres o quatre fluorocroms diferents (Nietzel et al., 2001). Aquest sistema, quan s’aplica a bones extensions cromosòmiques d’oòcits en MII suposa un bon sistema d’anàlisi, ja que en una sola ronda d’hibridació es poden analitzar tots els centròmers del complement cromosòmic. Una altra tècnica anomenada encebador in situ (primer in situ, PRINS), s’ha testejat amb èxit en extensions cromosòmiques de 1rCP fixats. Es tracta d’un mètode ràpid i poc costós que permet el marcatge dels cromosomes 13, 16, 21 o X, implicats freqüentment en aneuploïdies (Petit et al., 2000). En una PCR sobre portaobjectes, els cromosomes es marquen mitjançant la unió in situ d’encebadors oligonucleòtids específics per a cada cromosoma, seguit de l’extensió amb nucleòtids marcats, feta per l’enzim TaqDNA-polimerasa. Cada extensió cromosòmica del 1rCP passa per tres reaccions successives de marcatge doble i en menys de 40 min s’obtenen senyals intensos, la qual cosa

198 M. Rius, A. Obradors, M. Oliver, J. Benet i J. Navarro

és de gran interès en l’aplicació del DGP per al cribratge d’aneuploïdies. Però totes les metodologies esmentades anteriorment tenen la mateixa limitació: s’apliquen en extensions cromosòmiques de cèl·lules fixades en portaobjectes i, per tant, mai no és possible descartar que les hipohaploïdies detectades siguin pèrdues artefactuals produïdes durant el procés de fixació. La hibridació genòmica comparada (comparative genomic hybridisation, CGH) aplicada a cèl·lules aïllades (Voullaire et al., 1999; Wells et al., 1999) és una alternativa molt favorable per a l’estudi d’aneuploïdies en oòcits humans. Aquest mètode permet l’estudi simultani de tots els cromosomes de cada cèl·lula per separat (1rCP i el corresponent oòcit en MII). La possibilitat de pèrdues cromosòmiques artefactuals no existeix, ja que les cèl·lules, senceres i aïllades, s’introdueixen en tubs de PCR i es lisen i processen ja dins del tub. Aquest sistema requereix amplificar el material genètic cel· lular, ja que una cèl·lula té una quantitat limitada de DNA (6 pg). La tècnica aplicada per a l’amplificació és la DOP-PCR (degenerated oligonucleotide primer-primed chain reaction) (Telenius et al., 1992). Amb el DNA producte de l’amplificació ja es pot realitzar la CGH. Aquest mètode es basa en una hibridació competitiva sobre extensions de limfòcits euploides entre el DNA de la cèl·lula test (marcada amb fluorocrom vermell) i el DNA d’una cèl·lula control (euploide) (marcada amb fluorocrom verd), que es troben en quantitats equimolars. Les pèrdues cromosòmiques de la cèl·lula test es visualitzen al microscopi de fluorescència en verd, mentre que els guanys cromosòmics es veuen en vermell. Les regions que presenten igual proporció de cada sonda es visualitzen en groc-taronja. La limitació d’aquesta metodologia és que no és informativa per les regions d’heterocromatina i telomèriques i alguns cops els cromosomes 17,

19 i 22 poden mostrar perfils difícils d’interpretar. RESULTATS DE L’ESTUDI D’ANEUPLOÏDIES EN EL PRIMER CORPUSCLE POLAR I EN METAFASE II D’OÒCITS HUMANS La disponibilitat dels oòcits descartats dels cicles de FIV, com hem dit, ha permès un avenç considerable en el coneixement de les anomalies de l’oòcit i de l’embrió i els mecanismes que les produeixen. En el millor dels casos, tot i que es dóna poques vegades, s’han pogut estudiar oòcits frescos que no han estat inseminats, però generalment es tracta d’oòcits no fecundats un cop inseminats in vitro o oòcits immadurs madurats in vitro. En les dues últimes opcions, com que s’analitzen oòcits ja envellits, els resultats no es podrien considerar totalment representatius dels oòcits de la població general. Els resultats publicats de l’estudi de l’aneuploïdia en oòcits humans són força variables a causa, bàsicament, del fet que s’analitzen amb diferents tècniques diferents tipus d’oòcits. En una revisió de l’any 2005 (Pellestor et al., 2005), la freqüència mitjana d’alteracions cromosòmiques vistes en estudis del cariotip que empren la tècnica de fixació de Tarkowsky és del 35,98 %, xifra que inclou un 26,5 % d’aneuploïdies (15,5 % d’hipohaploïdies, 7,3 % d’hiperhaploïdies i 3,6 % d’aneuploïdies complexes) i un 6,02 % d’alteracions estructurals (delecions, fragmentacions cromosòmiques de fragments acèntrics). Però, globalment, s’ha vist una gran variabilitat en la incidència d’aneuploïdies, del 2 % al 59,6 %, així com resultats contradictoris en l’efecte de l’edat materna. En aquesta revisió les divergències van ser

Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans 199

atribuïdes a la reduïda mida de la mostra d’oòcits analitzada i a la dificultat d’analitzar cromosomes en els oòcits en MII, ja que la majoria dels estudis utilitzen únicament la tinció uniforme o bé, en un nombre menor (Martin et al., 1986; Djalali et al., 1988; Pellestor i Sele, 1988; Kola et al., 1990), tècniques de bandeig de dubtosa qualitat. No s’han vist diferències significatives entre els resultats citogenètics d’oòcits inseminats descartats de cicles de FIV i els no inseminats, o bé els obtinguts sense estimulació hormonal (Gras et al., 1992). Tampoc no s’han vist diferències entre els oòcits inseminats mitjançant la injecció intracitoplasmàtica d’esperma (intracitoplasmatic sperm injection, ICSI) i els inseminats in vitro de manera convencional (Edirisinghe et al., 1997; Gutiérrez-Mateo et al., 2004a). La freqüència d’aneuploïdies varia enormement segons els diversos estudis: entre el 4,7 % i el 47,5 %, amb una mitjana del 27,7 %, incloent-hi els estudis de bandes R (Pellestor, 1991; Pellestor et al., 2003), els de FISH amb sondes per a nou cromosomes (Dailey et al., 1996; Verlinsky et al., 1999; Mahmood et al., 2000; Cupisti et al., 2003; Pujol et al., 2003a), els de SKY i els de FISH multicolor (M-FISH) (Cheng et al., 1998). Mentre que alguns autors (Zenzes et al., 1992; Nakaoka et al., 1998; Pellestor et al., 2003) observen que el 16 % dels oòcits són aneuploides, la taxa d’aneuploïdia trobada mitjançant els sistemes de SKY (Márquez et al., 1998; Sandalinas et al., 2002) o bé M-FISH (Clyde et al., 2003) varia entre el 16,7 % i el 39 %, amb un valor mitjà del 31,3 %. De la mateixa manera, els estudis de FISH amb un nombre limitat i predeterminat de sondes mostren encara més variació: mentre que alguns grups troben freqüències de 3,2 %, 9,5 % i 4,3 % analitzant dos, sis i set cromosomes, respectivament (cromosomes 18 i X; 9, 13, 16, 18, 21 i 22, o 1, 9, 13, 16, 18, 21 i X) (Dyban et al., 1996; Anahory et al., 2003;

Cupisti et al., 2003), altres grups troben freqüències més altes d’aneuploïdia. Analitzant cinc, sis o nou cromosomes (13, 16, 18, 21 i 22; 1, 7, 13, 18, 21 i X o 1, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22 i X) s’ha trobat freqüències del 41,7 %, 44 % i 47,5 %, respectivament (Martini et al., 2000; Kuliev et al., 2003; Pujol et al., 2003a). La taxa d’aneuploïdia està clarament lligada a l’edat materna. En aquest sentit, s’han estimat taxes d’aneuploïdia del 4 %, 9 %, 11,5 % i 29,8 % en oòcits de dones de 25-34, 35-39 i 40-45 anys, respectivament. De la mateixa manera, en una sèrie de 3.042 oòcits no fecundats procedents de 792 pacients amb edats compreses entre els dinou i els quaranta-sis anys, incloses en un programa de FIV, es van correlacionar les alteracions cromosòmiques originades per fenòmens de no-disjunció de la parella de cromosomes homòlegs amb l’edat materna avançada (Pellestor et al., 2003). Tot i que s’ha pogut establir que únicament el 25 % de les hipohaploïdies observades quan s’aplica FISH sobre complements cromosòmics de 1rCP podrien correspondre a artefactes produïts pel procés de fixació o bé per fallades de la tècnica (Pujol et al., 2003a), quan s’analitza una sola cèl·lula (1rCP o MII) és difícil saber si l’absència d’un cromosoma hauria de ser considerada real o no. Així, en general, la taxa d’aneuploïdies és calculada de manera conservativa, com el doble de la d’hiperhaploïdies (Mahmood et al., 2000; Cupisti et al., 2003). La taxa d’aneuploïdies observada aplicant una combinació de mètodes, com per exemple CGH en el 1rCP i FISH per a nou cromosomes en el corresponent oòcit en MII, és del 57,1 % (Gutiérrez-Mateo et al., 2004a). Aquesta elevada freqüència podria estar relacionada amb el fet que emprant aquestes tècniques s’analitza un gran nombre de cromosomes (tots en el cas de la CGH) i també perquè l’edat materna de les pacients d’aquest estudi estava al voltant dels trenta-cinc anys. Una

200 M. Rius, A. Obradors, M. Oliver, J. Benet i J. Navarro

freqüència molt similar, el 57,2 %, s’ha estimat per als vint-i-tres cromosomes del complement a partir dels resultats obtinguts amb la FISH de nou cromosomes (Pujol et al., 2003a). Considerant els resultats obtinguts amb l’anàlisi de 1rCP amb CGH (Gutiérrez-Mateo et al., 2004a, b) i el corresponent oòcit en MII amb FISH en seixantaset parelles 1rCP-MII, la freqüència d’aneuploïdies trobada és del 53,7 %, amb una incidència del 30,5 % en dones de menys de trenta-cinc anys, i del 69,5% en dones de trenta-cinc o més anys. La fiabilitat de l’estudi d’aneuploïdies mitjançant les diverses variants de la FISH podria estar limitada per la qualitat de l’extensió de cromosomes i l’existència de superposicions. Per aquesta raó la utilització de la CGH i la FISH per a l’estudi d’aneuploïdies en 1rCP i MII és un mètode molt adequat per al càlcul correcte d’alteracions cromosòmiques numèriques. Encara però, aplicant la CGH (en 1rCP o la MII) els valors d’aneuploïdia darrerament publicats són força variables: des d’un valor del 65 % en oòcits de quaranta donants de vint-i-tres a vint-i-nou anys (Sher et al., 2007) fins a valors del 22 % en oòcits immadurs madurats in vitro de quaranta-sis pacients de divuit a quaranta-dos anys, i valors del 43,5 % en oòcits no fecundats de quinze pacients de vint-i-nou a trenta-nou anys (Fragouli et al., 2006a, b). Aquests resultats mostren encara una gran variabilitat en les taxes d’aneuploïdia trobades. Tot i que l’edat de les pacients influeix en la incidència d’alteracions, es troben aneuploïdies en pacients de totes les edats. Pel que fa als cromosomes implicats en les aneuploïdies, s’ha pogut comprovar que tots els grups cromosòmics hi estan representats. I pràcticament tots els cromosomes del cariotip humà s’han trobat implicats en aneuploïdies (Gutiérrez-Mateo et al., 2004a, b). Els més freqüentment implicats són l’1 i el 4, seguits del 22 i l’X, després el 15, 16 i 21,

després el 2, 3, 6, 7, 8, 9, 13 i 19 i, finalment, el 10, 14, 17, 18 i 20. Tot i que la resta de cromosomes no s’ha trobat en aquestes sèries, sí que s’han vist alterats en alguns casos de DGP-AS (Wells et al., 2002; Gutiérrez-Mateo et al., 2005; Obradors et al., 2008). L’estudi d’aneuploïdies amb la CGH ha permès identificar fins a un 38,1 % més d’alteracions de les que s’haurien identificat mitjançant la FISH per a nou cromosomes (1, 13, 15, 16, 17, 18, 21 i X). Cal tenir en compte que la resta d’aneuploïdies en els cromosomes 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 14, i 19 haurien quedat sense identificar. Si bé els oòcits amb múltiples aneuploïdies potser s’haurien identificat com a tals amb la FISH amb nou sondes, si fossin aneuploides per a un sol dels cromosomes no analitzats amb la FISH, un 28 % dels oòcits (1rCP/MII) passaria desapercebut (Gutiérrez-Mateo et al., 2004a). Aquests resultats concorden amb el fet que el 25 % dels blastòmers aneuploides identificats amb la CGH haurien estat erròniament diagnosticats com a normals amb la FISH estàndard (Wilton et al., 2003). Els cromosomes 16 i 22 s’han trobat freqüentment involucrats en aneuploïdies en 1rCP i oòcits en MII, així com en embrions (Sandalinas et al., 2002; Kuliev et al., 2003; Pujol et al., 2003a; Gutiérrez-Mateo et al., 2004a; Munné et al., 2004). De fet, s’ha vist que els cromosomes 14, 15, 16 i 22 estan implicats en avortaments espontanis (Munné et al., 1998a; Munné et al., 1998b). També els cromosomes 1, 4 i 7 mostren una taxa d’aneuploïdia força important (Gutiérrez-Mateo et al., 2004b). Les aneuploïdies en cromosomes que no estan involucrats en trisomies viables en la descendència o en avortaments espontanis (Simpson, 1990) són probablement freqüents en les etapes més inicials després de la fecundació i podrien ser responsables de la manca d’implantació o viabilitat d’aquests embrions.

Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans 201

Mecanismes de producció d’aneuploïdies D’acord amb les dades d’aneuploïdia recollides en la literatura, els oòcits humans semblen particularment predisposats als errors de segregació meiòtica, i s’han proposat diversos mecanismes que portarien a aquestes alteracions. El primer mecanisme descrit va ser la no-disjunció (ND) de cromosomes homòlegs (Pellestor, 1991; Zenzes et al., 1992). En la ND els dos cromosomes homòlegs del bivalent meiòtic no se separen. Durant la primera divisió meiòtica, en segregar junts ambdós homòlegs, una de les cèl·lules té un guany cromosòmic, mentre que l’altra té una pèrdua per al mateix cromosoma. Ja amb l’anàlisi de tinció uniforme de complements cromosòmics d’extensions de MII i 1rCP d’oòcits humans es va poder identificar un altre mecanisme de producció d’anomalies: la separació prematura de cromàtides germanes (premature separation of sister chromatids, PSSC). Aquest es produiria durant la primera divisió meiòtica, amb una freqüència força elevada (Angell, 1991, 1997). La PSSC pot ser equilibrada o bé desequilibrada. En la PSSC equilibrada no hi ha ni guany ni pèrdua de cromàtides i, per tant, no es considera responsable d’aneuploïdies, tot i que s’ha considerat indicativa d’una major predisposició a la ND (Pellestor, 1991; Munné et al., 1995; Sandalinas et al., 2002). En la PSSC no equilibrada hi ha guanys i pèrdues de cromàtides, és a dir, s’ha produït separació prematura de cromàtides i segregació desequilibrada d’aquestes en un o més cromosomes i, per tant, constitueix una anomalia citogenètica numèrica. Mentre en alguns estudis s’ha observat gairebé exclusivament el mecanisme de PSSC, en altres en què s’ha utilitzat la tècnica de FISH per a alguns cromosomes (Pellestor, 1991; Munné et al., 1995; Ver-

linsky et al., 1999; Pujol et al., 2003a) o bé la CGH (Gutiérrez-Mateo et al., 2004a; Gutiérrez-Mateo et al., 2004b), que analitza simultàniament tots els cromosomes, s’ha descrit que tant la PSSC com la ND són mecanismes responsables d’aneuploïdia. D’altra banda, alguns treballs que analitzen oòcits no fecundats i oòcits madurats in vitro suggereixen que la PSSC i la ND no augmenten significativament durant el temps de cultiu (Munné et al., 1995; Gutiérrez-Mateo et al., 2004b), però altres estudis suggereixen el contrari (Pickering et al., 1988; Pellestor, 1991). Un estudi de 1.397 oòcits, fixats mitjançant el mètode gradual, va fer evident un augment significatiu de les PSSC respecte les ND (Pellestor et al., 2002), i s’han obtingut resultats similars emprant diferents mètodes d’anàlisi (Sandalinas et al., 2002; Gutiérrez-Mateo et al., 2004b). Al mateix temps, en oòcits frescos no inseminats i en no fecundats de dones de trenta-cinc anys o més, el fenomen de PSSC és més freqüent que la ND (Sandalinas et al., 2002). Els autors van observar en aquestes dones, respecte a les de 24-34 anys, una freqüència superior de PSSC equilibrada respecte a la no equilibrada. Aquest estudi, a més, mostrava que en la PSSC hi ha implicats més cromosomes de mida petita. La PSSC podria ser conseqüència d’una degradació prematura, abans de l’anafase i, de les cohesines, proteïnes que mantenen unides les cromàtides germanes (Michaelis et al., 1997). Alguns autors han relacionat la presència de PSSC en l’edat materna avançada (Sandalinas et al., 2002; Pellestor et al., 2003). Les dones d’edat avançada tindrien una acumulació de mutacions en el DNA mitocondrial no solament dels oòcits, sinó també de les cèl·lules fol·liculars (Bartmann et al., 2004). Aquest fet podria reduir la funció mitocondrial (Schon et al., 2000) i, ja que la funció de les cohesines depèn de l’ATP

202 M. Rius, A. Obradors, M. Oliver, J. Benet i J. Navarro

(Uhlmann, 2004), una deficiència en el metabolisme energètic oxidatiu podria resultar en un increment de PSSC en dones d’edat avançada. També s’ha suggerit (Hunt et al., 1995; Cheng et al., 1998) que la presència de tres cromàtides durant la primera divisió podria afectar la segregació d’altres cromosomes. El 1996 es va interpretar que els errors produïts durant la segona divisió meiòtica podien ser conseqüència d’anomalies en la primera divisió meiòtica, degudes a l’increment en la taxa de recombinació, fet que podria portar a errors en la separació dels bivalents (Lamb et al., 1996). Però, de fet, es creu també que una reducció de la recombinació de focus en cromosomes petits podria resultar en un risc incrementat de disjunció inadequada i, per tant, en la producció d’oòcits aneuploides (Koehler et al., 1996; Hassold et al., 2000; Martini et al., 2000). Tant la recombinació alterada com l’edat materna avançada han estat identificats com a factors etiològics essencials, però els mecanismes causants d’errors en la segregació meiòtica es coneixen poc. Finalment, s’ha descrit un tercer mecanisme causant d’aneuploïdies en oòcits gràcies a l’estudi simultani amb FISH del 1rCP i l’oòcit en MII. Aquest estudi provava la presència d’oòcits aneuploides procedents d’oogònies amb trisomies, en ovaris de dones amb cariotip normal (46, XX) (Mahmood et al., 2000; Pujol et al., 2003a). Aquest fet, posat de manifest per l’absència de complementarietat entre el 1rCP i la MII, s’ha detectat en un 10 % d’oòcits descartats de cicles de FIV, combinant l’anàlisi del 1rCP amb CGH i la MII amb FISH (GutiérrezMateo et al., 2004b). El mecanisme s’ha explicat per la presència d’un mosaïcisme gonadal (Moore et al., 1997; Mahmood et al., 2000; Pujol et al., 2003a; Gutiérrez-Mateo et al., 2004a). El seu origen estaria lligat a l’etapa mitòtica de proliferació de les oogòni-

es, que té lloc en les primeres setmanes del desenvolupament embrionari. Una segregació mitòtica errònia podria originar oogònies amb guanys per a un cromosoma i amb pèrdua per al mateix cromosoma, que coexistirien amb oogònies euploides, citogenèticament normals. Aquest comportament, dependent d’individu i impredictible, fa necessari realitzar el diagnòstic prenatal en cas d’embaràs obtingut després de realitzar DGP. DGP EN PRIMER CORPUSCLE POLAR EN EL CRIBRATGE D’ANEUPLOÏDIES El DGP dels oòcits mitjançant l’estudi del corresponent 1rCP, proposat com una variant del DGP en blastòmers l’any 1990, sembla molt adequat, ja que el 90 % dels errors cromosòmics s’originen en la meiosi i materna. A més, aquesta anàlisi no es veu afectada per l’existència de mosaïcisme que, en canvi, és molt freqüent durant les primeres divisions embrionàries i dificulta el DGP realitzat en blastòmers (Munné et al., 1994; Munné et al., 2002). Un altre avantatge que cal remarcar és que la interpretació dels senyals de FISH sobre el 1rCP no presenta les dificultats que s’han fet evidents en blastòmers, ja que no és una cèl·lula proliferant sinó aturada en MII. De totes maneres, l’anàlisi del 1rCP té algunes limitacions, i la principal és el fet que no proporciona informació de la contribució paterna. Aquest problema, però, pot ser solucionat analitzant també un o dos dels blastòmers de l’embrió de 6-8 cèl·lules generat després de la inseminació del corresponent oòcit (Pujol et al., 2003b; Magli et al., 2004). El DGP amb l’anàlisi d’aneuploïdies (aneuploidy screening, AS) s’aplica en diversos casos en què hi ha una indicació clara, com és l’edat materna avançada, avortaments

Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans 203

de repetició, fallades de FIV o bé infertilitat masculina severa. El DGP en 1rCP aplicat a dones d’edat avançada és la indicació més útil, ja que s’estudia la contribució materna, que és la que comporta el major risc d’aneuploïdia a la descendència. Una de les primeres aplicacions del DGP en 1rCP per AS es va portar a terme en deu pacients amb risc d’aneuploïdia en la descendència a causa de l’edat materna i per raons ètiques (Munné et al., 2000). Es van analitzar, mitjançant FISH, els cromosomes 13, 16, 18, 21 i 22. De noranta-tres 1rCP analitzats, vuitanta-tres van donar resultats positius de FISH i d’aquests, cinquanta-quatre oòcits van ser euploides i vint-i-nou aneuploides per a algun dels cromosomes analitzats. Tots els oòcits euploides més dotze no diagnosticats es van inseminar i finalment es van transferir vint-i-vuit embrions, que van donar lloc a embaràs. Tres dels embarassos van acabar en avortament i un es va interrompre a causa de la detecció del cariotip 45, XO (síndrome de Turner) en el diagnòstic prenatal. D’altra banda, des de 1995, un grup de Chicago (Magli et al., 2004) aplica el DGP analitzant simultàniament el 1rCP i el 2nCP, que es forma després de la fecundació, en la segona divisió meiòtica. Això permet detectar aneuploïdies originades en les dues divisions meiòtiques. En aquest DGPAS s’estudien cinc cromosomes mitjançant FISH (13, 16, 18, 21 i 22). La taxa d’aneuploïdia trobada és similar en el 1rCP (41,8 %) i el 2nCP (37,3 %), a diferència d’altres estudis, que proposen una major taxa d’aneuploïdia en la primera divisió que en la segona (Sherman et al., 1994). Aquest mateix grup (Kuliev et al., 2003) ha compilat 1.551 cicles de DGP per a 1.027 pacients d’edat mitjana 38,5 anys. Els seus resultats mostren que un 48 % dels 8.293 oòcits analitzats eren citogenèticament normals per als cromosomes analitzats. En

cent deu dels cicles de FIV es van transferir un total de 2.587 embrions, i es va aconseguir finalment el naixement de 176 nadons sans, de manera que la taxa d’embaràs és del 21,9 %. Un fet a tenir en compte és que en alguns països com Alemanya o Suïssa el DGP en blastòmers d’embrions està legalment prohibit. El DGP, doncs, només es pot portar a terme en el 1rCP, ja que aquest mètode està considerat com un diagnòstic preconceptiu. El 2004 es va publicar un estudi amb naixements després del DGP amb sondes per als cromosomes 13, 16, 18, 21 i 22 (Imthurn et al., 2004). La majoria de grups que fan el DGP-1rCP per AS analitzen un nombre limitat de cromosomes, fet que suposa una limitació important. L’aplicació l’any 2002 de la CGH en 1rCP d’una pacient de quaranta anys (Wells et al., 2002) va representar un avenç considerable en l’avaluació de les aneuploïdies. En aquest estudi es van diagnosticar deu oòcits, dels quals nou van mostrar guanys o pèrdues per a un o dos cromosomes, i tan sols un va ser euploide. Els cromosomes involucrats en aneuploïdies eren el 2, 5, 14, 16, 20, 21 i 22, dels quals quatre (2, 5, 14 i 20) no s’analitzen normalment per FISH. Es va transferir l’embrió procedent de l’oòcit euploide, però no es va obtenir embaràs. Les aneuploïdies es van confirmar mitjançant FISH en els nou embrions restants. Recentment, el nostre grup està aplicant una variant de DGP que pretén incrementar la taxa d’implantació del embrions transferits després d’un DGP per a malalties monogèniques hereditàries. Es realitza de manera combinada en un mateix cicle de FIV l’anàlisi de les aneuploïdies d’origen matern mitjançant la CGH en 1rCP i l’anàlisi de mutacions familiars de malalties monogèniques greus incurables com la FQ (Obradors et al., 2008) o la síndrome de VHL (Obradors et al., 2009. L’anomenem

204 M. Rius, A. Obradors, M. Oliver, J. Benet i J. Navarro

DF-DGP (doble factor de risc genètic) (vegeu la figura 4). Amb aquest procediment, encara que amb un nombre reduït de casos realitzats, ja s’ha aconseguit incrementar la taxa d’embaràs i de naixements fins a un 33,3 %, fet que representa doblar la taxa d’embaràs descrita fins ara (Harper et al., 2008). FUTUR DEL DGP EN PRIMER CORPUSCLE POLAR L’aplicació de la CGH és una eina molt

potent per al diagnòstic d’aneuploïdies, que pot ser aplicada a l’estudi del 1rCP, però de moment encara no en blastòmers sense evitar la criopreservació i transferència en el cicle següent. A més, aquesta tècnica requereix la dedicació extensa d’un especialista i la disponibilitat d’un bon equip de citogenètics moleculars ben coordinat amb un equip d’embriòlegs. Recentment, però, s’han aconseguit avenços metodològics que podrien ajudar a escurçar el temps requerit per a aquest procediment. S’ha proposat la utilització de variants de DOP-PCR amb diferents Taq-polimerases i mètodes de mar-

Figura 4. Esquema de la CGH-1rCP aplicada al DF-DGP. En l’esquema es mostra el procediment de la CGH-1rCP coordinat amb el cicle de FIV en un cas de DF-DGP.

Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans 205

catge que, més que escurçar el procediment, permeten obtenir un producte de DOP-PCR de millor qualitat. (Wells, 2004). Una de les últimes propostes per a l’anàlisi d’aneuploïdies és el xip CGH. Està basat en el mateix principi que la CGH sobre metafases, però difereix en el fet que s’utilitza un suport on hi ha enganxats clons genòmics de regions seleccionades en lloc de cèl· lules en metafase com a DNA diana. Aquest mètode té una resolució molt més elevada i permet l’automatització. De moment, el xip CGH s’ha portat a terme majoritàriament amb DNA procedent d’una reserva cel·lular (Solinas-Toldo et al., 1997; Pinkel et al., 1998). Les proves per reduir la quantitat de DNA necessari per al xip CGH han resultat en la detecció acurada de les variacions del nombre de còpies en 1 ng de DNA (GuillaudBataille et al., 2004). Per passar a l’aplicació d’aquesta tècnica en cèl·lules aïllades s’afegeix la dificultat de l’amplificació del material genètic sense biaix en la seqüència. Recentment, s’han pogut amplificar mostres petites de DNA amb un mètode isotèrmic d’amplificació de múltiple desplaçament (multiple displacement amplification, MDA) amb una mínima representació de biaix en la seqüència. En els últims anys s’han pogut amplificar limfoblasts, fibroblasts i blastòmers aïllats individualment, amb un mètode isotèrmic d’amplificació de múltiple desplaçament (multiple displacement amplification, MDA) amb una mínima representació de biaix en la seqüència (Le Caignec et al., 2006). La primera aplicació clínica del xip CGH amb embarassos s’ha fet el 2008 (Hellani et al., 2008), utilitzant aquesta tècnica en el DGP per al cribratge d’aneuploïdies de blastòmers. Així doncs, de moment existeixen diverses aproximacions encoratjadores que poden obrir les portes d’una nova era en el PGD.

AGRAÏMENTS Projecte FIS-ISCIII: PI 051395; ajut SGR de la Generalitat de Catalunya: 2005SGR00 495; beca FPU del Ministeri d’Educació i Ciència: AP2006-02211 i Càtedra de Recerca Eugin 2008. BIBLIOGRAFIA Anahory, T.; Andreo, B.; Regnier-Vigouroux, G.; Soulie, J. P.; Baudouin, M.; Demaille, J.; Pellestor, F. (2003). «Sequential multiple probe fluorescence in-situ hybridization analysis of human oocytes and polar bodies by combining centromeric labelling and whole chromosome painting». Mol. Hum. Reprod., 9: 577-585. Angell, R. (1991). «Predivision in human oocytes at meiosis I: a mechanism for trisomy formation in man». Hum. Genet., 86: 383-3877. — (1997). «First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes». Am. J. Hum. Genet., 61: 23-32. Bahce, M.; Cohen, J.; Munné, S. (1999). «Preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy: were we looking at the wrong chromosomes?». J. Assist. Reprod. Genet., 16: 176-181. Bartmann, A. K.; Romao, G. S.; Ramos Eda, S.; Ferriani, R. A. (2004). «Why do older women have poor implantation rates? A possible role of the mitochondria». J. Assist. Reprod. Genet., 21: 79-83. Clyde, J. M.; Hogg, J. E.; Rutherford, A. J.; Picton, H. M. (2003). «Karyotyping of human metaphase II oocytes by multifluor fluorescence in situ hybridization». Fertil. Steril., 80: 1003-1011. Cupisti, S.; Conn, C. M.; Fragouli, E.; Whalley, K.; Mills, J. A.; Faed, M. J.; Delhanty, J. D. (2003). «Sequential FISH analysis of oocytes and polar bodies reveals aneuploidy mechanisms». Prenat. Diagn., 23: 663-668. Cheng, E. Y.; Chen, Y. J.; Bonnet, G.; Gartler, S. M. (1998). «An analysis of meiotic pairing in trisomy 21 oocytes using fluorescent in situ hybridization». Cytogenet. Cell. Genet., 80: 48-53. Dailey, T.; Dale, B.; Cohen, J.; Munné, S. (1996). «Association between nondisjunction and maternal age in meiosis-II human oocytes». Am. J. Hum. Genet., 59: 176-184. Djalali, M.; Rosenbusch, B.; Wolf, M.; Sterzik, K. (1988). «Cytogenetics of unfertilized human oocytes». J. Reprod. Fertil., 84: 647-652.

206 M. Rius, A. Obradors, M. Oliver, J. Benet i J. Navarro

Durban, M.; Benet, J.; Boada, M.; Fernandez, E.; Calafell, J. M.; Lailla, J. M.; Sanchez-Garcia, J. F.; Pujol, A.; Egozcue, J.; Navarro, J. (2001). «PGD in female carriers of balanced Robertsonian and reciprocal translocations by first polar body analysis». Hum. Reprod. Update., 7: 591-602. Durban, M.; Benet, J.; Sarquella, J.; Egozcue, J.; Na varro, J. (1998). «Chromosome studies in first polar bodies from hamster and human oocytes». Hum. Reprod., 3: 583-587. Dyban, A.; Freidine, M.; Severova, E.; Cieslak, J.; Ivakhnenko, V.; Verlinsky, Y. (1996). «Detection of aneuploidy in human oocytes and corresponding first polar bodies by fluorescent in situ hybridization». J. Assist. Reprod. Genet., 13: 73-78. Edirisinghe, W. R.; Murch, A.; Junk, S.; Yovich, J. L. (1997). «Cytogenetic abnormalities of unfertilized oocytes generated from in-vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection: a double-blind study». Hum. Reprod., 12: 2784-2791. Egozcue, J.; Santalo, J.; Gimenez, C.; Durban, M.; Benet, J.; Navarro, J.; Vidal, F. (2002). «Preimplantation genetic screening and human implantation». J. Reprod. Immunol., 55: 65-72. Fragouli, E.; Wells, D.; Thornhill, A.; Serhal, P.; Faed, M. J.; Harper, J. C.; Delhanty, J. D. (2006a). «Comparative genomic hybridization analysis of human oocytes and polar bodies». Hum. Reprod., 21: 2319-2328. Fragouli, E.; Wells, D.; Whalley, K. M.; Mills, J. A.; Faed, M. J.; Delhanty, J. D. (2006b). «Increased susceptibility to maternal aneuploidy demonstrated by comparative genomic hybridization analysis of human MII oocytes and first polar bodies». Cytogenet. Genome. Res., 114: 30-38. Gianaroli, L.; Magli, M. C.; Ferraretti, A. P.; Munné, S. (1999). «Preimplantation diagnosis for aneuploidies in patients undergoing in vitro fertilization with a poor prognosis: identification of the categories for which it should be proposed». Fertil Steril., 72: 837-844. Goossens, V.; Harton, G.; Moutou, C.; Scriven, P. N.; Traeger-Synodinos, J.; Sermon, K.; Harper, J. C. (2008). «ESHRE PGD Consortium data collection VIII: cycles from January to December 2005 with pregnancy follow-up to October 2006». Hum. Reprod., 23: 2629-2645. Gras, L.; McBain, J.; Trounson, A.; Kola, I. (1992). «The incidence of chromosomal aneuploidy in stimulated and unstimulated (natural) uninseminated human oocytes». Hum. Reprod., 7: 396401. Guillaud-Bataille, M.; Valent, A.; Soularue, P.; Perot, C.; Inda, M. M.; Receveur, A.; Smaili, S.; Roest

Crollius, H.; Benard, J.; Bernheim, A.; Gidrol, X.; Danglot, G. (2004). «Detecting single DNA copy number variations in complex genomes using one nanogram of starting DNA and BAC-array CGH». Nucleic. Acids. Res., 32: e112. Gutiérrez-Mateo, C.; Benet, J.; Wells, D.; Colls, P.; Bermudez, M. G.; Sanchez-Garcia, J. F.; Egozcue, J.; Navarro, J.; Munné, S. (2004a). «Aneuploidy study of human oocytes first polar body comparative genomic hybridization and metaphase II fluorescence in situ hybridization analysis». Hum. Reprod., 19: 2859-2868. Gutiérrez-Mateo, C.; Gadea, L.; Benet, J.; Wells, D.; Munné, S.; Navarro, J. (2005). «Aneuploidy 12 in a Robertsonian (13;14) carrier: Case report». Hum. Reprod., 20: 1256-1260. Gutiérrez-Mateo, C.; Wells, D.; Benet, J.; SanchezGarcia, J. F.; Bermudez, M. G.; Belil, I.; Egozcue, J.; Munné, S.; Navarro, J. (2004b). «Reliability of comparative genomic hybridization to detect chromosome abnormalities in first polar bodies and metaphase II oocytes». Hum. Reprod., 19: 2118-2125. Hassold, T.; Abruzzo, M.; Adkins, K.; Griffin, D.; Merrill, M.; Millie, E.; Saker, D.; Shen, J.; Zaragoza, M. (1996). «Human aneuploidy: incidence, origin, and etiology». Environ. Mol. Mutagen., 28: 167175. Hassold, T.; Sherman, S.; Hunt, P. (2000). «Counting cross-overs: characterizing meiotic recombination in mammals». Hum. Mol. Genet., 9: 2409-2419. Hellani, A.; Abu-Amero, K.; Azouri, J.; El-Akoum, S. (2008). «Successful pregnancies after application of array-comparative genomic hybridization in PGS-aneuploidy screening». Reprod. Biomed. Online, 17: 841-847. Hunt, P.; LeMaire, R.; Embury, P.; Sheean, L.; Mroz, K. (1995). «Analysis of chromosome behavior in intact mammalian oocytes: monitoring the segregation of a univalent chromosome during female meiosis». Hum. Mol. Genet., 4: 2007-2012. Imthurn, B.; Achermann, J.; Klug Arter, M.; Macas, E. (2004). «Preimplantation diagnosis in Switzerland–birth of a healthy child after polar body biopsy». Swiss Med. Wkly., 134: 254-258. Koehler, K. E.; Hawley, R. S.; Sherman, S.; Hassold, T. (1996). «Recombination and nondisjunction in humans and flies». Hum. Mol. Genet., 5: 1495-1504. Kola, I.; Lacham, O.; Jansen, R. P.; Turner, M.; Trounson, A. (1990). «Chromosomal analysis of human oocytes fertilized by microinjection of spermatozoa into the perivitelline space». Hum. Reprod., 5: 575-577. Kuliev, A.; Cieslak, J.; Ilkevitch, Y.; Verlinsky, Y. (2003). «Chromosomal abnormalities in a series of

Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans 207

6,733 human oocytes in preimplantation diagnosis for age-related aneuploidies». Reprod. Biomed. Online, 6: 54-59. Lamb, N. E.; Freeman, S. B.; Savage-Austin, A.; Pettay, D.; Taft, L.; Hersey, J.; Gu, Y.; Shen, J.; Saker, D.; May, K. M.; Avramopoulos, D.; Petersen, M. B.; Hallberg, A.; Mikkelsen, M.; Hassold, T. J.; Sherman, S. L. (1996). «Susceptible chiasmate configurations of chromosome 21 predispose to non-disjunction in both maternal meiosis I and meiosis II». Nat. Genet., 14: 400-405. LeCaignec, C.; Spits, C.; Sermon, K.; Rycke, M. de; Thienpont, B.; Debrock, S.; Staessen, C.; Moreau, Y.; Fryns, J. P.; Steirteghem, A. van; Liebaers, I.; Vermeesch, J. R. (2006). «Single-cell chromosomal imbalances detection by array CGH». Nucleic. Acids. Res., 34: e68. Magli, M. C.; Gianaroli, L.; Ferraretti, A. P.; Toschi, M.; Esposito, F.; Fasolino, M. C. (2004). «The combination of polar body and embryo biopsy does not affect embryo viability». Hum. Reprod., 19: 1163-1169. Mahmood, R.; Brierley, C. H.; Faed, M. J.; Mills, J. A.; Delhanty, J. D. (2000). «Mechanisms of maternal aneuploidy: FISH analysis of oocytes and polar bodies in patients undergoing assisted conception». Hum. Genet., 106: 620-626. Malter, H. E.; Cohen, J. (1989). «Partial zona dissection of the human oocyte: a nontraumatic method using micromanipulation to assist zona pellucida penetration». Fertil. Steril., 51: 139-148. Márquez, C.; Cohen, J.; Munné, S. (1998). «Chromosome identification in human oocytes and polar bodies by spectral karyotyping». Cytogenet. Cell. Genet., 81: 254-258. Martin, R. H.; Mahadevan, M. M.; Taylor, P. J.; Hildebrand, K.; Long-Simpson, L.; Peterson, D.; Yamamoto, J.; Fleetham, J. (1986). «Chromosomal analysis of unfertilized human oocytes». J. Reprod. Fertil., 78: 673-678. Martini, E.; Flaherty, S. P.; Swann, N. J.; Matthews, C. D.; Ramaekers, F. C.; Geraedts, J. P. (2000). «FISH analysis of six chromosomes in unfertilized human oocytes after polar body removal». J. Assist. Reprod. Genet., 17: 276-283. Michaelis, C.; Ciosk, R.; Nasmyth, K. (1997). «Cohesins: chromosomal proteins that prevent premature separation of sister chromatids». Cell, 91: 35-45. Moore, D. H., 2nd; Pallavicini, M.; Cher, M. L.; Gray, J. W. (1997). «A t-statistic for objective interpretation of comparative genomic hybridization (CGH) profiles». Cytometry, 28: 183-190. Munné, S.; Alikani, M.; Tomkin, G.; Grifo, J.; Cohen, J. (1995). «Embryo morphology, developmental

rates, and maternal age are correlated with chromosome abnormalities». Fertil. Steril., 64: 382-391. Munné, S.; Bahce, M.; Sandalinas, M.; Escudero, T.; Márquez, C.; Velilla, E.; Colls, P.; Oter, M.; Alikani, M.; Cohen, J. (2004). «Differences in chromosome susceptibility to aneuploidy and survival to first trimester». Reprod. Biomed. Online, 8: 81-90. Munné, S.; Cohen, J.; Sable, D. (2002). «Preimplantation genetic diagnosis for advanced maternal age and other indications». Fertil. Steril., 78: 234-236. Munné, S.; Grifo, J.; Cohen, J.; Weier, H. U. (1994). «Chromosome abnormalities in human arrested preimplantation embryos: a multiple-probe FISH study». Am. J. Hum. Genet., 55: 150-159. Munné, S.; Magli, C.; Bahce, M.; Fung, J.; Legator, M.; Morrison, L.; Cohert, J.; Gianaroli, L. (1998a). «Preimplantation diagnosis of the aneuploidies most commonly found in spontaneous abortions and live births: XY, 13, 14, 15, 16, 18, 21, 22». Prenat. Diagn., 18: 1459-1466. Munné, S.; Márquez, C.; Magli, C.; Morton, P.; Morrison, L. (1998b). «Scoring criteria for preimplantation genetic diagnosis of numerical abnormalities for chromosomes X, Y, 13, 16, 18 and 21». Mol. Hum. Reprod., 4: 863-870. Munné, S.; Sepulveda, S.; Balmaceda, J.; Fernandez, E.; Fabres, C.; Mackenna, A.; Lopez, T.; Crosby, J. A.; Zegers-Hochschild, F. (2000). «Selection of the most common chromosome abnormalities in oocytes prior to ICSI». Prenat. Diagn., 20: 582-586. Nakaoka, Y.; Okamoto, E.; Miharu, N.; Ohama, K. (1998). «Chromosome analysis in human oocytes remaining unfertilized after in-vitro insemination: effect of maternal age and fertilization rate». Hum. Reprod., 13: 419-424. Nicolaidis, P.; Petersen, M. B. (1998). «Origin and mechanisms of non-disjunction in human autosomal trisomies». Hum. Reprod., 13: 313-319. Nietzel, A.; Rocchi, M.; Starke, H.; Heller, A.; Fied ler, W.; Wlodarska, I.; Loncarevic, I. F.; Beensen, V.; Claussen, U.; Liehr, T. (2001). «A new multicolor-FISH approach for the characterization of marker chromosomes: centromere-specific multicolor-FISH (cenM-FISH)». Hum. Genet., 108: 199204. Obradors, A.; Fernandez, E.; Oliver-Bonet, M.; Rius, M.; Fuente, A. de la; Wells, D.; Benet, J.; Navarro, J. (2008). «Birth of a healthy boy after a double factor PGD in a couple carrying a genetic disease and at risk for aneuploidy: case report». Hum. Reprod., 23: 1949-1956. Obradors, A.; Fernández, E.; Rius, M.; Oliver-Bonet, M.; Martínez-Fresno, M.; Benet, J.; Navarro, J. (2009). «Outcome of twin babies free of Von Hip-

208 M. Rius, A. Obradors, M. Oliver, J. Benet i J. Navarro

pel-Lindau disease after a double-factor preimplantation genetic diagnosis: monogenetic mutation analysis and comprehensive aneuploidy screening». Fertil. Steril. [En premsa] Pellestor, F. (1991). «Frequency and distribution of aneuploidy in human female gametes». Hum. Genet., 86: 283-288. Pellestor, F.; Anahory, T.; Hamamah, S. (2005). «The chromosomal analysis of human oocytes. An overview of established procedures». Hum. Reprod. Update, 11: 15-32. Pellestor, F.; Andreo, B.; Arnal, F.; Humeau, C.; Demaille, J. (2002). «Mechanisms of non-disjunction in human female meiosis: the co-existence of two modes of malsegregation evidenced by the karyotyping of 1397 in-vitro unfertilized oocytes». Hum. Reprod., 17: 2134-2145. — (2003). «Maternal aging and chromosomal abnormalities: new data drawn from in vitro unfertilized human oocytes». Hum. Genet., 112: 195-203. Pellestor, F.; Sele, B. (1988). «Assessment of aneuploidy in the human female by using cytogenetics of IVF failures». Am. J. Hum. Genet., 42: 274-283. Petit, C.; Martel-Petit, V.; Fleurentin, A.; MonnierBarbarino, P.; Jonveaux, P.; Gerard, H. (2000). «Use of PRINS for preconception screening of polar bodies for common aneuploidies». Prenat. Diagn., 20: 1067-1071. Pickering, S. J.; Johnson, M. H.; Braude, P. R.; Houliston, E. (1988). «Cytoskeletal organization in fresh, aged and spontaneously activated human oocytes». Hum. Reprod., 3: 978-989. Pinkel, D.; Segraves, R.; Sudar, D.; Clark, S.; Poole, I.; Kowbel, D.; Collins, C.; Kuo, W. L.; Chen, C.; Zhai, Y.; Dairkee, S. H.; Ljung, B. M.; Gray, J. W.; Albertson, D. G. (1998). «High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays». Nat. Genet., 20: 207-211. Pujol, A.; Boiso, I.; Benet, J.; Veiga, A.; Durban, M.; Campillo, M.; Egozcue, J.; Navarro, J. (2003a). «Analysis of nine chromosome probes in first polar bodies and metaphase II oocytes for the detection of aneuploidies». Eur. J. Hum. Genet., 11: 325336. Pujol, A.; Durban, M.; Benet, J.; Boiso, I.; Calafell, J. M.; Egozcue, J.; Navarro, J. (2003b). «Multiple aneuploidies in the oocytes of balanced translocation carriers: a preimplantation genetic diagnosis study using first polar body». Reproduction, 126: 701-711. Sandalinas, M.; Márquez, C.; Munné, S. (2002). «Spectral karyotyping of fresh, non-inseminated oocytes». Mol. Hum. Reprod., 8: 580-585.

Schon, E. A.; Kim, S. H.; Ferreira, J. C.; Magalhaes, P.; Grace, M.; Warburton, D.; Gross, S. J. (2000). «Chromosomal non-disjunction in human oocytes: is there a mitochondrial connection?». Hum. Reprod., 15: 160-72. Sher, G.; Keskintepe, L.; Keskintepe, M.; Ginsburg, M.; Maassarani, G.; Yakut, T.; Baltaci, V.; Kotze, D.; Unsal, E. (2007). «Oocyte karyotyping by comparative genomic hybridization [correction of hybrydization] provides a highly reliable method for selecting “competent” embryos, markedly improving in vitro fertilization outcome: a multiphase study». Fertil. Steril., 87: 1033-1040. Sherman, S. L.; Petersen, M. B.; Freeman, S. B.; Hersey, J.; Pettay, D.; Taft, L.; Frantzen, M.; Mikkelsen, M.; Hassold, T. J. (1994). «Non-disjunction of chromosome 21 in maternal meiosis I: evidence for a maternal age-dependent mechanism involving reduced recombination». Hum. Mol. Genet., 3: 15291535. Simpson, J. L. (1990). «Incidence and timing of pregnancy losses: relevance to evaluating safety of early prenatal diagnosis». Am. J. Med. Genet., 35: 165173. Solinas-Toldo, S.; Lampel, S.; Stilgenbauer, S.; Nickolenko, J.; Benner, A.; Dohner, H.; Cremer, T.; Lichter, P. (1997). «Matrix-based comparative genomic hybridization: biochips to screen for genomic imbalances». Genes Chromosomes Cancer, 20: 399-407. Telenius, H.; Carter, N. P.; Bebb, C. E.; Nordenskjold, M.; Ponder, B. A.; Tunnacliffe, A. (1992). «Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer». Genomics, 13: 718-725. Uhlmann, F. (2004). «The mechanism of sister chromatid cohesion». Exp. Cell. Res., 296: 80-85. Verlinsky, Y.; Cieslak, J.; Ivakhnenko, V.; Evsikov, S.; Wolf, G.; White, M.; Lifchez, A.; Kaplan, B.; Moise, J.; Valle, J.; Ginsberg, N.; Strom, C.; Kuliev, A. (1999). «Prevention of age-related aneuploidies by polar body testing of oocytes». J. Assist. Reprod. Genet., 16: 165-169. Voullaire, L.; Wilton, L.; Slater, H.; Williamson, R. (1999). «Detection of aneuploidy in single cells using comparative genomic hybridization». Prenat. Diagn., 19: 846-851. Wells, D. (2004). «Advances in preimplantation genetic diagnosis». Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., 115: S97-101. Wells, D.; Escudero, T.; Levy, B.; Hirschhorn, K.; Delhanty, J. D.; Munné, S. (2002). «First clinical application of comparative genomic hybridization and polar body testing for preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy». Fertil. Steril., 78: 543-549.

Estudi diagnòstic d’aneuploïdies en oòcits humans 209

Wells, D.; Sherlock, J. K.; Handyside, A. H.; Delhanty, J. D. (1999). «Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification and comparative genomic hybridisation». Nucleic Acids Res., 27: 1214-1218. Wilton, L.; Voullaire, L.; Sargeant, P.; Williamson, R.; McBain, J. (2003). «Preimplantation aneuploidy screening using comparative genomic hybridi-

zation or fluorescence in situ hybridization of embryos from patients with recurrent implantation failure». Fertil. Steril., 80: 860-868. Zenzes, M. T.; Wang, P.; Casper, R. F. (1992). «Evidence for maternal predisposition to chromosome aneuploidy in multiple oocytes of some in vitro fertilization patients». Fertil. Steril., 57: 143-149.

DOI: 10.2436/20.1501.02.69

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 211-223

CULTIU I DESENVOLUPAMENT IN VITRO D’EMBRIONS HUMANS Mark Grossmann i Maria Carme Pons Unitat de Reproducció Assistida, Centre Mèdic Teknon. Adreça per a la correspondència: Mark Grossmann. Centre Mèdic Teknon. Vilana, 12. 08022 Barcelona. Adreça electrònica: ura@cmteknon.com. RESUM En gairebé trenta anys les tècniques de reproducció humana assistida s’han universalitzat i alhora s’ha aconseguit augmentar-ne l’èxit gràcies a millores tant en l’aspecte clínic com en el del laboratori. Tradicionalment, s’ha utilitzat el criteri morfològic (avaluació de les característiques morfològiques de l’embrió) per seleccionar els millors embrions per transferir. No obstant això, el valor predictiu d’aquest criteri és força limitat i, amb vista a augmentar les taxes de gestació, les transferències de més d’un embrió són les més habituals, amb el conseqüent risc de gestació múltiple. Així, el repte actual en reproducció humana assistida és aconseguir la gestació única mitjançant la reducció del nombre d’embrions transferits a un. Caldrà, doncs, millorar els medis de cultiu per permetre seleccionar embrions en estadis més avançats i alhora disposar de criteris d’avaluació que correlacionin eficaçment les característiques de l’embrió amb la seva viabilitat. Actualment, els esforços s’encaminen en dues direccions: la primera, el desenvolupament del criteri morfològic, amb la tendència a un sistema d’avaluació seqüencial de l’embrió en diferents estadis, i la segona, molt més nova, la recerca de noves tècniques no invasives basades en l’anàlisi dels constituents de l’embrió i del seu metabolisme. Paraules clau: embrió, desenvolupament, cultiu in vitro, viabilitat, no invasiu. CULTURE AND IN VITRO DEVELOPMENT OF HUMAN EMBRYOS SUMMARY During the past three decades the practice of clinical assisted reproduction have grown world-wide and moreover the success rate has increased thanks to clinical and laboratory improvements. Tradicionally, the morphological criteria has been applied to select embryos to transfer. However, the predictive value of this criteria is limited so that the multiple-embryo transfers are very common leading to a higher risc of multiple pregnancy. The goal in assisted reproduction is achieving a single pregnancy through the reduction of the

212 M. Grossmann i M. C. Pons

number of embryos used in transfer to one. Single embryo transfer requires culture media to improve in order to allow the embryo selection in more advanced stages as well as having a reliable method to evaluate the embryo viability. Nowadays, strategies are carrying out in two different fields: the first one, continuing in morphometric criteria, it tends to use a sequencial scoring system from the oocyte through to the cleavage-stage embryo to allow selecting the most viable embryo in a cohort and the second one, in the research field, the development of new techniques based on the analysis of the embryo constitution and its metabolism. Key words: embryo, development, in vitro culture, viability, non-invasive. FASES DEL DESENVOLUPAMENT EMBRIONARI EN HUMANS El desenvolupament embrionari s’inicia amb la fecundació, quan el gàmeta masculí, l’espermatozoide, es fusiona amb el femení, l’oòcit, i es forma el zigot. Es caracteritza per la presència de dos corpuscles polars (CP) i de dos pronuclis (un de femení i un de masculí) que es troben junts, juxtaposats i alineats respecte dels CP. Malgrat que és un punt encara controvertit, es creu que aquesta disposició podria marcar ja l’establiment de la polaritat del futur embrió (Edwards i Beard, 1997). Els dos pronuclis no arriben a fusionar-se en un sol nucli, sinó que la cromatina de cadascun es condensa directament en cromosomes i a partir d’aquí es produirà la primera divisió cel·lular i, com a resultat, dues cèl·lules filles. La durada d’aquest primer cicle cel·lular és d’unes 24 h, mentre que els següents són més curts, i cada 18-20 hores es produirà un nou cicle de divisió. El desenvolupament embrionari es caracteritza per una sèrie de cicles de divisió cel· lular sense creixement de les cèl·lules filles. És a dir, en cada divisió cel·lular es duplica el nombre de cèl·lules alhora que es redueix a la meitat la mida de cadascuna. Es passa d’una cèl·lula gegant, com és el zigot, a un conjunt de cèl·lules de mida similar a la d’altres tipus cel·lulars. Les cèl·lules de l’embrió reben el nom específic de blastòmers.

Les tres primeres divisions embrionàries (durant dos dies i mig) es realitzen a càrrec del material de reserva (RNA, proteïnes, aminoàcids...) fabricat i emmagatzemat en l’oòcit durant la maduració en el fol·licle ovàric. Fins aquest moment es considera que cadascun dels blastòmers és totipotent. És en l’estadi de 4-8 cèl·lules quan es produeix l’activació del genoma embrionari; en aquests dos dies i mig s’han sintetitzat els RNA i les proteïnes pròpies de l’embrió absolutament necessaris per poder continuar el seu desenvolupament. En els següents estadis de desenvolupament, a més d’haver-hi divisió, hi ha canvis en la relació entre els blastòmers i, per tant, en l’aparença de l’embrió. Es produeix el fenomen de la compactació, és a dir, les cèl·lules augmenten la superfície de contacte entre si i es creen unions molt fortes, que culminen en l’estadi de mòrula, on hi ha unes cèl·lules situades en la part més externa i unes altres en la més interna. Aquesta disposició implica ja una certa diferenciació, i així, els gairebé trenta blastòmers que constitueixen la mòrula són considerats pluripotents. Les cèl·lules situades externament comencen a bombejar líquid des de l’exterior, de manera que es crea una cavitat en l’interior que anirà augmentant de volum. Es tracta de la cavitat blastocèlica, i defineix el darrer estadi del desenvolupament embrionari preimplantacional, anomenat blastocist.

Cultiu i desenvolupament in vitro d’embrions humans 213

Les cèl·lules més externes (cèl·lules del trofectoderma) van adquirint un aspecte epiteloide, ja que la pressió del líquid en la cavitat les aplana contra la zona pel·lúcida. Mentrestant, les cèl·lules més internes s’agrupen formant la massa cel·lular interna, una mena de pilota ancorada parcialment en el trofectoderma. Com podem veure a la figura 1, en cinc dies es poden observar totes les fases del desenvolupament embrionari, des del zigot fins al blastocist, estadi en el qual es formen les dues línies cel·lulars diferenciades, el trofectoderma (TF) i la massa cel·lular interna (MCI). Aquest darrer grup de cèl·lules originarà l’embrió pròpiament dit i algunes membranes extraembrionàries, mentre que les cèl·lules del trofectoderma només produiran teixits extraembrionaris. Entre el 5è i el 7è dia de desenvolupament embrionari el blastocist eclosiona, s’allibera de la zona pel·lúcida i s’implanta en l’endometri matern. QUALITAT EMBRIONÀRIA En tècniques de reproducció humana assistida, els zigots generats en un cicle de fecundació in vitro (FIV) es mantenen entre dos i sis dies en cultiu in vitro fins al moment de la transferència (dipòsit dels embrions dins l’úter de la dona). El desenvolupament embrionari descrit anteriorment, les etapes i les característi-

ques de l’embrió en cadascuna d’aquestes, correspon al desenvolupament ideal. Volem dir amb això que a través del cultiu dels embrions in vitro s’ha constatat que un gran nombre d’embrions no arriba a desenvolupar-se fins a l’estadi de blastocist i, per tant, no té possibilitats d’implantar-se a l’úter matern, en part a causa de condicions de cultiu encara subòptimes i, en part, al baix potencial de desenvolupament propi d’alguns embrions. Per això, durant aquests dies de cultiu in vitro és molt important poder esbrinar quins embrions són els que tenen més probabilitats de desenvolupar-se correctament i implantar-se, per tal de seleccionar-los per a la transferència. Molts estudis, ja des de l’inici de la FIV, demostren que les possibilitats de gestació depenen, entre d’altres factors (edat de la dona, nombre d’embrions transferits, receptivitat endometrial...), de la qualitat dels embrions transferits, és a dir, que quan es transfereixen embrions de bona qualitat les taxes de gestació aconseguides són superiors a quan els embrions transferits no són de bona qualitat (Royen et al., 1999). La situació ideal seria la transferència d’un únic blastocist viable, embrió amb un gran potencial d’implantació (Gardner, 1998) que originaria una gestació única. Però la realitat és que el cultiu in vitro no està suficientment optimat per permetre el desenvolupament fins a l’estadi de blastocist d’embrions que sí que ho farien

+5 'ia +6 'ia 1 'ia 2 'LD 'ia +4 'La +3, 7 44 67 94 1 136 140 Figura 1. Desenvolupament embrionari preimplantacional: del zigot al blastocist. Desenvolupament ideal corresponent als dies de cultiu in vitro i a les hores d’observació postinseminació (HPI).

214 M. Grossmann i M. C. Pons

in utero, i, el que és més important, encara no existeix cap mètode totalment fiable que permeti distingir entre embrions viables i no viables, de manera que el més habitual és transferir més d’un embrió en els estadis més primerencs del desenvolupament. Aquesta estratègia porta implícit el risc de gestació múltiple, amb les greus complicacions que comporten per als fetus i per a la mare. Fa deu anys la transferència de tres o quatre embrions era una pràctica molt generalitzada, mentre que actualment la transferència més comuna és la de dos embrions. Malgrat aquesta tendència a reduir el nombre d’embrions, liderada pels països del nord d’Europa, la incidència de gestació de bessons encara continua elevada. Des d’un punt de vista legal, alguns estats de la Unió Europea han limitat el nombre d’embrions que es poden transferir, com és el cas de l’Estat espanyol, on la Llei 14/2006, de 26 de maig, sobre tècniques de reproducció humana assistida, limita el nombre a tres. En altres països on no està regulat per llei són organismes especials, o bé les societats científiques, les que elaboren recomanacions al respecte. L’objectiu primordial dels professionals de la reproducció humana assistida és aconseguir una gestació, però no qualsevol tipus de gestació, sinó una gestació única. Tanmateix, els resultats indiquen que aquest és un objectiu difícil d’acomplir, ja que el panorama real amb el qual ens trobem sovint és paradoxal: o no s’obté la gestació o bé s’obté una gestació múltiple. Per aproximar-nos a l’objectiu cobejat és indispensable disposar de criteris d’avaluació dels embrions que correlacionin eficaçment la qualitat de l’embrió amb la seva capacitat de generar un embaràs. Tradicionalment, l’eina emprada per a la selecció embrionària ha estat el criteri morfològic, mètode no invasiu que consisteix

en la simple observació dels embrions al microscopi invertit per avaluar les seves característiques i classificar-los en una escala de qualitat. Els paràmetres morfològics en els quals es basa l’avaluació són el ritme de desenvolupament, el percentatge de fragmentació, la mida dels blastòmers, la multinucleació i l’aspecte del citoplasma. Així, un embrió de bona qualitat reuneix les següents característiques: el ritme de desenvolupament adequat (4-5 cèl·lules el 2n dia i 7-8 cèl·lules el 3r dia), presenta un percentatge de fragmentació inferior al 20-25 %, els blastòmers que el constitueixen tenen una mida igual o semblant i cap d’aquests no mostra multinucleació (més d’un nucli en un blastòmer) (Royen et al, 1999; ASEBIR, 2008). Està documentat que el potencial d’implantació dels embrions es redueix quan el ritme de divisió és lent (Desai et al., 2000; Hardanson et al., 2001; Royen et al., 2001), quan el percentatge de fragmentació és superior al 25 % o quan predominen fragments de mida gran (Alikani et al., 2000; Antczak i Blerkom, 1999), quan hi ha una evident desigualtat en la mida dels blastòmers (Hardanson, et al., 2001) o quan observem blastòmers multinucleats (Pelinck et al., 1998; Moriwaki et al., 2004). L’avaluació de les característiques de l’oòcit també té gran importància, ja que anomalies severes en el citoplasma de l’oòcit tenen un efecte en detriment de la viabilitat de l’embrió (Balaban et al., 2008) i, d’altra banda, les anomalies en la zona pel·lúcida dificultaran el procés d’eclosió (Calderon et al., 2002). En els darrers anys, diversos estudis proposen la incorporació de nous criteris per determinar la qualitat embrionària basats en l’avaluació de paràmetres morfològics en estadis més primerencs del desenvolupament embrionari. Alguns autors postulen l’avaluació exhaustiva del zigot (mesura i polarització dels pronuclis, nombre i mida

Cultiu i desenvolupament in vitro d’embrions humans 215

dels nuclèols), ja que les seves dades relacionen la morfologia pronuclear dels zigots amb la seva capacitat implantatòria (Scott i Smith, 1998; Tesarik et al., 2000; Scott et al., 2000). Altres estudis proposen l’observació de la primera divisió mitòtica la tarda del 1r dia, entre les 25-27 hores postinseminació (Lundin et al., 2001) com a eina per detectar els embrions més competents. La majoria de publicacions recomanen la utilització d’aquests nous paràmetres com a criteri addicional al convencional, per establir un sistema seqüencial que pugui ajudar a diferenciar embrions de la mateixa qualitat. Però, malgrat l’experiència acumulada en més de vint anys de FIV i de l’aplicació cada cop més exhaustiva del criteri morfològic, l’eficiència de la FIV pel que fa a nens nascuts continua baixa. Es calcula que només la meitat dels embrions de bona qualitat en el 3r dia arriben a desenvolupar-se fins a l’estadi de blastocist (Rijnders i Jansen, 1998) i, en les millors condicions, no-

més la meitat dels blastocists s’implanten (Gardner et al., 1998). Dit d’una altra manera, al voltant del 85 % dels embrions transferits no s’implanten (Sakkas, 2008). Lògicament, es dedueix que el valor predictiu del criteri morfològic és limitat; la manca d’estàndards explica, en part, aquesta limitació, ja que cada centre té un criteri i una classificació embrionària propis. De fet, l’acord entre diferents centres és màxim en la definició d’embrió de molt bona qualitat i en la d’embrió de mala qualitat, però el consens disminueix a l’hora de classificar embrions de qualitat intermèdia. En aquest sentit, l’Associació per a l’Estudi de la Biologia de la Reproducció (ASEBIR), que aplega als professionals de la reproducció assistida, ha estat pionera en l’estandardització d’un criteri en proposar una classificació embrionària aplicable en tots els centres de l’Estat espanyol. ASEBIR ha optat, com a primer pas, per la valoració de la qualitat embrionària en una clas-

Figura 2. Classificació ASEBIR: exemples d’embrions del 3r dia corresponents a cada categoria.

216 M. Grossmann i M. C. Pons

sificació per categories (a, b, c i d) enfront d’un sistema de puntuació en què es fa molt més difícil la correcta ponderació dels diferents paràmetres (ASEBIR, 2008). L’aplicació d’aquesta classificació per part del major nombre de centres de reproducció assistida i l’anàlisi posterior de les dades permetrà afinar la classificació i augmentar el seu valor predictiu amb vista a la implantació. A la figura 2 es mostren imatges d’alguns embrions classificats en les quatre categories. Diversos autors demostren que les aneuploïdies cromosòmiques són una de les causes de la fallada en la implantació (Giannaroli, 1997; Munné i Cohen, 1998; Harper i Delhanty, 2000). Troben aneuploïdies en embrions de mala qualitat, en embrions procedents de dones majors de trenta-set anys d’edat (Gianaroli et al., 1999), en embrions procedents de parelles amb historial previ d’avortaments i, el que és més remarcable, també s’observen aneuploïdies en embrions de bona qualitat. Aquests autors proposen seleccionar els embrions cromosòmicament normals mitjançant les tècniques de diagnòstic genètic preimplantacional (DGP), per tal d’incrementar la taxa d’implantació dels embrions transferits. De tota manera, els resultats publicats no mostren una millora substancial en la taxa de «nen-a-casa», que és el que, en definitiva, vol una parella estèril. Per aquest motiu, el DGP no es considera actualment una tècnica de rutina per a la selecció dels embrions més competents i, a més, no hem d’oblidar que es tracta d’un mètode invasiu que implica la manipulació de l’embrió i l’extracció d’una cèl·lula, amb el conseqüent perjudici sobre el desenvolupament i viabilitat posteriors. En els darrers anys, en l’àmbit de la recerca, s’estan desenvolupant noves tècniques no invasives per a l’avaluació de la viabilitat embrionària que en el futur puguin ser alternatives als mètodes descrits i aplicats fins avui dia. Totes es duen a terme en

l’àrea de les «-òmiques», i es basen en l’anàlisi dels constituents de l’embrió viable, el seu genoma (genòmica), els seus RNA missatgers (transcriptòmica), la seva expressió proteica (proteòmica) i, finalment, els metabòlits que utilitza l’embrió (metabolòmica). Mentre que l’anàlisi del material genètic s’ha de fer de manera invasiva, prenent mostres de l’embrió i, per tant, minvant-ne el potencial de desenvolupament, l’anàlisi de les proteïnes i dels metabòlits és ideal, ja que es realitza de manera no invasiva. Conceptualment es pot considerar que la informació que pot aportar l’anàlisi metabòlica és el reflex més real de com és un embrió en un moment determinat, ja que són els metabòlits els que caracteritzaran les funcions de l’embrió. Així, com millor puguem definir quins metabòlits estan correlacionats amb la viabilitat embrionària, més fiable serà el valor de predicció del mètode. L’estudi de les vies metabòliques utilitzades en les diferents etapes del desenvolupament embrionari per a la millora dels medis de cultiu ha permès desenvolupar treballs que suggereixen que embrions amb gran activitat glucolítica tenen poc potencial de desenvolupament (Gardner et al., 2001; Leese, 2002). Altres autors proposen mesurar el turnover d’alguns aminoàcids per predir el potencial de desenvolupament in vitro d’un embrió per esdevenir blastocist (Houghton et al., 2002) o bé per generar una gestació evolutiva (Brison et al., 2004). Recentment, s’ha publicat un estudi molt interessant (Vergouw et al., 2008) en el qual, analitzant canvis en el metabolisme oxidatiu, s’obté un resultat amb un valor de predicció de la gestació superior en un 15 % al valor de predicció del criteri morfològic. Des d’un altre vessant tècnic, estudis de mesures de consum d’oxigen realitzats en bovins semblen indicar que embrions amb un índex de respiració superior o inferior al rang mitjà tenen menys probabilitats de

Cultiu i desenvolupament in vitro d’embrions humans 217

generar un embaràs (Lopes et al., 2007) i la mateixa tecnologia aplicada a oòcits suggereix resultats en la mateixa línia: les taxes de respiració altes o baixes es correlacionen amb la subsegüent atrèsia o amb anomalies en els oòcits (Scott et al., 2007). En definitiva, la majoria d’aquests estudis destil·len la idea que els embrions que s’implanten modifiquen el seu entorn in vitro de manera diferent a com ho fan els que no s’implanten i, a més, aquest comportament metabòlic és independent de la seva morfologia. Tots aquests assaigs tenen, com a denominador comú, la utilització de tecnologia altament especialitzada (cromatografia líquida d’alta resolució, espectroscòpia, microfluorimetria...) que, ara per ara, no està a l’abast de la majoria de laboratoris de reproducció assistida. En la mesura en què se simplifiquin i s’avaluï l’eficàcia d’aquestes tecnologies en l’aplicació clínica, descobrirem la seva potencialitat com a eina en el camí envers la transferència d’un únic embrió. CULTIU IN VITRO D’EMBRIONS HUMANS La idea de fer créixer embrions humans en condicions artificials extrauterines es va publicar, sembla que per primera vegada, l’any 1944 a la revista Science, en un treball signat pels científics Rock i Menkin. De totes maneres, no fou fins tres dècades després que Steptoe i Edwards (els mateixos que tindrien el primer naixement in vitro) publicaren dades de creixement in vitro d’embrions humans fins a l’estadi de blastocist (Steptoe et al., 1971). I avui, trenta-vuit anys després d’aquella fita, encara es considera que les condicions de cultiu in vitro d’embrions són subòptimes, és a dir, millorables.

De fet, els primers medis emprats per al cultiu in vitro d’embrions eren senzillament els mateixos medis pensats i descrits per al cultiu cel·lular, per exemple el medi Ham’s F-10 (originàriament descrit per al cultiu de cèl·lules d’ovari de hàmster), el medi Dulbecco’s MEM (minimum essential medium), o lleugeres variacions d’aquests medis. Els requeriments nutricionals de les cèl· lules somàtiques en cultiu són constants al llarg del temps, però no ho són els requeriments dels embrions, que mostren diferents exigències en funció del seu estadi de desenvolupament abans i després de la compactació. Per això, un medi de cultiu apropiat per al desenvolupament in vitro d’embrions hauria de considerar la particular fisiologia dels embrions i els seus requeriments nutricionals a l’hora d’establir la seva composició. En els seus primers estadis de desenvolupament, els embrions precompactació creixen tan ràpidament que no tenen oportunitat de respondre als canvis ambientals externs: tot allò que necessiten per a aquestes primeres divisions abans de l’activació del genoma embrionari ja s’hauria de trobar en l’oòcit i, per tant, atès que l’embrió és força autònom, medis senzills pel que fa a la composició suportarien bé aquestes primeres divisions. Avui se sap que l’embrió en l’estadi de zigot majoritàriament usa piruvat com a font energètica principal i lactat en menor grau, mentre que manté molt baix el consum de glucosa i el d’oxigen. Amb l’activació del genoma, en l’estadi de quatre a vuit cèl·lules, i les primeres diferenciacions cel·lulars, els blastòmers cada vegada s’assemblen més a les cèl·lules somàtiques i ajusten més la seva activitat a les condicions ambientals, fins a assolir el moment de la implantació, que depèn completament de la interacció entre l’embrió eclosionat i el seu entorn, l’endometri (Weima, 1996).

218 M. Grossmann i M. C. Pons

De fet, en estadis precompactació els embrions creixen de la mà del genoma matern, i tenen una única línia cel·lular que consumeix preferentment piruvat i aminoàcids no essencials, amb una baixa activitat biosintètica i també amb baix consum d’O2. A mesura que l’embrió es desenvolupa augmenta el consum energètic i la síntesi proteica, de manera que en estadis postcompactació els embrions funcionen amb el seu propi genoma, en dues línies cel·lulars diferents que requereixen glucosa com a font principal d’energia, així com aminoàcids, tant essencials com no essencials, amb una alta activitat biosintètica i un alt consum d’O2 (per a una revisió, vegeu Gardner i Lane, 2003). Els nutrients que aporta el tracte reproductiu femení haurien de ser un reflex d’aquestes necessitats energètiques variables. Mitjançant tècniques de perfusió s’ha estudiat àmpliament la composició i distribució dels diversos nutrients presents. Hi ha molts treballs publicats que demostren l’enorme complexitat i variació (entre espècies i durant el cicle menstrual) en aquesta composició (per a una revisió, vegeu Aguilar i Reyley, 2005; Tay et al., 1997). Així, al llarg del trànsit per l’aparell reproductor, l’embrió humà es troba amb nivells decreixents de piruvat i lactat i nivells creixents de glucosa, ja que en les trompes hi ha nivells alts de lactat i piruvat i nivells baixos de glucosa (que les cèl·lules de la granulosa que acompanyen l’embrió metabolitzen a lactat i piruvat), mentre que a l’úter és a l’inrevés. Malgrat que es coneixia la complexitat de composició del fluids oviductals, el medi anomenat HTF (human tubal fluid) es formulà com un medi senzill, amb només electròlits i amb la glucosa com a font d’energia. Atès que l’absència d’aminoàcids provoca l’endarreriment de l’expressió gènica, les formulacions posteriors d’aquest medi ja n’incorporen.

De totes maneres, afegir aminoàcids a un medi de cultiu no és tan fàcil com sembla, ja que no tots són estables a 37 °C i en la seva descomposició alliberen amoni, un potent agent embriotòxic (Gardner i Lane, 1993) que in vivo és constantment metabolitzat, però que en cultiu in vitro s’acumula en el medi. Per lluitar contra l’excés d’amoni hi ha dues opcions: d’una banda, els embrions es poden cultivar en grans volums de medi (0,5-1 ml), que no cal renovar al llarg dels dies de cultiu, però en els quals qualsevol efecte autocrí resultant del creixement dels embrions queda diluït en aquest excés de volum. D’altra banda, els embrions es poden cultivar en gotes de menys volum de medi (20-100 µl), encara que això comporta a) cobrir les gotes amb oli mineral o de parafina perquè es mantinguin estables, b) allargar el temps que es triga a fer la valoració dels embrions i c) canviar periòdicament el medi de cultiu, de manera que en renovar el medi s’extreuen els metabòlits que els embrions mateixos generen amb efecte autocrí. Potser el sistema de cultiu en gotes amb oli mineral o de parafina és el més estès perquè la capa d’oli ofereix una protecció física que evita que certes micropartícules presents en l’ambient assoleixin el medi, i a la vegada manté estables durant més temps les condicions de CO2 i de temperatura quan les plaques de cultiu es treuen dels incubadors per observar o manipular els embrions. Atès que en el seu trànsit al llarg del tracte genital femení els embrions tenen a l’abast només petites quantitats de fluid (microlitres) sobre les quals poden influir abocanthi factors que ells mateixos produeixen, hi ha la tendència de cultivar els embrions en gotes de poc volum (20-50 µl). I per tal de contrarestar aquest efecte advers de la dilució dels factors embrionaris

Cultiu i desenvolupament in vitro d’embrions humans 219

alliberats al medi del cultiu in vitro, cada vegada que es renova el medi hi ha la possibilitat, òbvia, d’agrupar quatre o cinc embrions en una mateixa gota de medi. Amb aquesta estratègia s’aconsegueix potenciar l’efecte autocrí i, fins i tot, tenir un cert efecte paracrí, ja que factors que embrions de mal desenvolupament no podrien produir els rebrien dels altres embrions amb els quals comparteixen medi. L’inconvenient d’aquesta estratègia està en la legislació vigent: les directives europees sobre cèl·lules i teixits (Directives UE 2004/23/CE i 2006/17/ CE, transposada a l’Estat espanyol pel Reial Decret 1301/2006) exigeixen la completa traçabilitat de les cèl·lules i teixits, incloenthi les cèl·lules reproductores. Malgrat que, a l’hora d’escriure aquest capítol, l’administració espanyola encara no ha nomenat interlocutors responsables per consultar-los la implementació d’aquesta norma, sembla que els embrions haurien de cultivar-se individualment, tal com mostra la imatge de la figura 3. De manera similar, si fa uns anys era possible que un centre de reproducció humana assistida (RHA) es fabriqués els seus propis medis de cultiu, amb l’actual legislació hi ha tantes exigències i controls de qualitat que sembla que només sigui rentable la produc-

Figura 3. Detall que mostra les gotes de medi de cultiu cobertes per l’oli de parafina en placa de Petri, que permeten el cultiu in vitro individualitzat.

ció pròpia en quantitats enormes. És per això que pràcticament tots els centres consumeixen medis comercials. Sorprenentment hi ha força variabilitat entre lots, de manera que es recomana establir controls de toxicitat a pesar de tots els controls de qualitat que han de tenir els medis comercials. Una de les causes de variabilitat dels medis comercials prové de les macromolècules que contenen com a font de proteïnes. Inicialment els medis se suplementaven amb sèrum matern desactivat en concentracions entre el 5 i el 10 %, fet que suposava una càrrega extra de feina amb l’agreujant d’introduir en el medi molècules no controlades o agents infecciosos. Ara tots els medis comercials incorporen albúmina sèrica humana (HSA, ultrapura o recombinant), o sèrum substitut (SSS), que garanteixen molta més definició en la composició i eviten el risc d’infecció. Els medis de cultiu poden o no incorporar antibiòtics (generalment gentamicina) per prevenir les contaminacions bacterianes. Per una raó similar, la del risc de contaminació heteròloga, s’han abandonat les estratègies de cocultiu amb cèl·lules VERO (derivades de ronyó de la mona verda) o de l’endometri (derivades d’un grup concret de pacients), que s’havien establert per millorar el desenvolupament embrionari postcompactació, amb la idea que fossin les cèl·lules del cocultiu les que aportessin els factors de creixement que els medis de cultiu no contenien. Avui dia l’únic sistema de cocultiu que es manté utilitza cèl·lules de la pacient mateixa. Finalment, cap a on han d’evolucionar, en les seves característiques, els medis de cultiu in vitro per a embrions humans? Atès que els medis acumulen ROS (radicals lliures derivats de l’oxigen, com O2–; H2O2 i OH–, fins i tot provocats per la mateixa llum ambiental) i amoni, però en canvi són deficients en polipèptids, com els factors de

220 M. Grossmann i M. C. Pons

creixement, sembla que les properes generacions de medis de cultiu seran medis més estables, amb agents antioxidants i macromolècules que promoguin la implantació. Amb tota aquesta informació s’ha d’afrontar el dilema del cultiu in vitro: quin sistema s’escull? Hi ha dues estratègies: una es fixa en els requeriments nutricionals dels embrions i presenta formulacions diferents per a cada estadi, de manera que els embrions s’han de canviar de medi periòdicament; és el sistema de cultiu en medis seqüencials. L’altra estratègia considera que els embrions disposen de diverses rutes metabòliques i que n’usen una o una altra en funció del seu estadi, de manera que es poden cultivar embrions en un mateix medi de composició complexa des de l’estadi de zigot fins al de blastocist. Hi ha dades a favor i en contra de totes dues estratègies, encara que s’ha de dir que la majoria de centres de RHA usen medis seqüencials. En les condicions de cultiu in vitro apropiades no és necessari eliminar la glucosa de la composició del medi en estadis primerencs de desenvolupament, però s’ha de combinar amb la presència d’aminoàcids i EDTA (un agent quelant) per suprimir l’activitat glucolítica. Evidentment, la

Figura 4. Pantalla d’un incubador, on s’indiquen les condicions estàndard de cultiu in vitro.

glucosa és imprescindible en la composició de medis per al cultiu in vitro fins a l’estadi de blastocist. L’elecció del medi de cultiu no es pot considerar com una decisió aïllada en el laboratori de RHA, sinó que s’ha de pensar en tot el sistema de cultiu in vitro. Una decisió important en el sistema de cultiu que s’esculli és la composició gasosa de l’atmosfera en què es cultiven els embrions, i de la qual dependrà el pH del medi i l’aparició o no de ROS. En condicions normals la composició gasosa atmosfèrica té com a elements principals un 78 % de N2 i el 20 % d’O2, mentre que la presència d’O2 en el tracte genital femení és escassa, especialment en l’úter. Per això, i per evitar l’aparició de molècules reactives, es proposa el cultiu in vitro en atmosferes artificials amb concentracions d’O2 tan baixes com el 5 %. En aquestes condicions s’aconsegueixen blastocists amb moltes més cèl·lules (Gardner i Lane, 2001), però aquest sistema resulta molt costós econòmicament i no està gens estès al nostre país. En relació amb l’atmosfera de cultiu in vitro, també és fonamental establir quina concentració de CO2 és l’adequada perquè el pH del medi es mantingui a l’entorn de 7,4 (però no més alt d’aquest valor), sobretot si els medis de cultiu triats usen bicarbonat com a tampó. Atès que la ubicació mateixa del laboratori de RHA s’ha de tenir en compte (l’alçada respecte al nivell del mar influencia la pressió gasosa parcial), cada centre ha d’establir els seus estàndards, que de tota manera oscil·laran entre el 5 i el 6,5 % de CO2. Tradicionalment els medis d’elaboració pròpia incorporaven roig de fenol com a indicador de pH. Alguns medis comercials mantenen aquesta substància com una ajuda a l’importantíssim control de pH. Finalment, s’ha d’establir quina és la temperatura de cultiu adequada (a l’entorn de

Cultiu i desenvolupament in vitro d’embrions humans 221

37 °C) perquè el medi i els embrions estiguin realment a 37 °C. Tot això en atmosfera humida i foscor. A la figura 4 es mostra la pantalla d’un incubador amb les condicions considerades adequades per al cultiu d’embrions. Totes aquestes decisions no tenen sentit si no es disposa de prou incubadors per cultivar els embrions generats en els cicles de FIV. Cada vegada que s’obre la porta d’un incubador, les condicions de temperatura, concentració gasosa i humitat prefixades per a aquesta cambra canvien i cal un temps llarg (que depèn de cada marca i del temps que hagi estat obert) per recuperar les condicions d’equilibri. Les recomanacions ASEBIR (2001) sobre la relació incubadors/nombre de casos de FIV indiquen que un centre de RHA hauria de disposar, com a mínim, de dos incubadors, amb una relació d’un incubador per cada tres-cents casos, i amb un màxim de cinc casos alhora per incubador. En conclusió, no hi ha un sistema universalment acceptat per al cultiu in vitro d’embrions humans preimplantacionals, però s’accepta que com més llarg sigui el període de cultiu, més s’han d’ajustar els medis a les necessitats metabòliques dels embrions. I si bé és cert que els embrions humans presenten una plasticitat que els capacita per desenvolupar-se mínimament bé en un ampli ventall de medis i de condicions de cultiu in vitro, també és cert que el que es pretén en reproducció humana assistida no és pas un desenvolupament de mínims, sinó el millor desenvolupament amb vista a aconseguir les més altes taxes d’implantació possibles dels embrions transferits. En aquest sentit, i com a conclusió, cal una visió holística del procés, de manera que l’èxit de les tècniques de reproducció assistida estarà directament lligat a l’avaluació acurada dels embrions cultivats en gotes individuals amb metodologies no in-

vasives que ens permetin caracteritzar de manera fiable la viabilitat de l’embrió, però lògicament també dependrà de la qualitat de l’estimulació ovàrica, ja que d’uns oòcits d’escassa qualitat rarament es derivaran embrions viables i, per descomptat, dependrà de la col·locació atraumàtica i neta de l’embrió seleccionat dins l’úter per part del ginecòleg. Tots els esforços dedicats a seleccionar l’embrió viable que acabi amb el naixement d’una criatura sana hauran valgut la pena. AGRAÏMENTS És de justícia aprofitar aquestes línies per agrair als companys de la Unitat de Reproducció Assistida de Centre Mèdic Teknon el seu entusiasme, col·laboració i bon humor, trets fonamentals per al bon funcionament de l’equip. BIBLIOGRAFIA Aguilar, J.; Reyley, M. (2005). «The uterine tubal fluid: secretion, composition and biological effects». Anim. Reprod., 2: 91-105. Alikani, M.; Calderon, G.; Tomkin, G.; Garrisi, J.; Kokot, M.; Cohen, J. (2000). «Cleavage anomalies in early human embryos and survival after prolonged culture in-vitro». Hum. Reprod., 15: 26342643. Antczak, M.; Blerkom, J. van (1999). «Temporal and spatial aspects of fragmentation in early human embryos: possible effects on developmental competence and association with the differential elimination of regulatory proteins from polarized domains». Hum. Reprod., 14: 429-447. ASEBIR (2001). Cuadernos de embriología clínica. Vol. 1. Recomendaciones sobre recursos humanos y físicos para el laboratorio de RHA. Madrid: ASEBIR. — (2008). Cuadernos de embriología clínica. Vol 2. Criterios ASEBIR de valoración morfológica de oocitos, embriones tempranos y blastocistos humanos. Madrid: ASEBIR. Balaban, B.; Ata, B.; Isiklar, A.; Yakin, K.; Urman, B. (2008). «Severe cytoplasmic abnormalities of the

222 M. Grossmann i M. C. Pons

oocyte decrease cryosurvival and subsequent embryonic development of cryopreserved embryos». Hum. Reprod., 23: 1778-1785. Boletín Oficial del Estado (2006). Ley 14/2006, de 26 de mayo, sobre técnicas de reproducción humana asis tida (9292). — (2006). Real Decreto 1301/2006, de 10 de noviembre, por el que se establecen las normas de calidad y seguridad para la donación, la obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación, el almacenamiento y la distribución de células y tejidos humanos y se aprueban las normas de coordinación y funcionamiento para su uso en humanos (19625). Brison, D. R.; Houghton, F. D.; Falconer, D.; Roberts, S. A.; Hawkhead, J.; Humpherson, P. G.; Lieberman, B. A.; Leese, H. J. (2004). «Identification of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover». Hum. Reprod., 19: 23192324. Calderon, G.; Prados, N.; Caligara, C.; Mantrana, E.; Navarro, J.; Pellicer, A. (2002). «Calidad embrionaria. Indicadores predictivos de vitalidad». A: Remohí, J.; Pellicer A.; Simón, C.; Navarro, J. [ed.]. Reproducción humana. 2a ed. Madrid: McGraw-Hill, 463-468. Desai, N.; Goldstein, J.; Rowland, D. Y.; Goldfarb, J. M. (2000). «Morphological evaluation of human embryos and derivation of an embryo quality scoring system specific for day 3 embryos: a preliminary study». Hum. Reprod., 15: 2190-2196. Edwards, R. G.; Beard, H. K. (1997). «Oocyte polarity and cell determination in early mammalian embryos». Hum. Reprod., 3: 863-905. Gardner, D. K; Vella, P; Lane, M. (1998). «Culture and transfer of human blastocysts increases implantation rates and reduces the need for multiple embryo transfers». Fertil. Steril., 69: 84-88. Gardner, D. K.; Lane, M. (1993). «Amino acids and ammonium regulate mouse embryo development in culture». Biol. Reprod., 48: 377-385. — (2001). «Embryo culture». A: Gardner, D. K.; Weissman, A.; Howles, C. M.; Shohan, Z. [ed.]. Textbook of asssisted reproductive techniques. Londres: Martin Dunitz, 203-222. — (2003). «Matabolic requirements during preimplantation development and the formulation of culture media». A: Veeck, L. L.; Zaninovic, N. [ed.]. An atlas of human blastocysts. Londres: The Parthenon Publishing Group, 41-60. Gianaroli, L.; Magli, M. C.; Munne, S.; Fiorentino, A.; Montanaro, N.; Ferraretti, P. (1997). «Will preimplantation genetic diagnosis assist patients with a poor prognosis to achieve pregnancy?». Hum. Reprod., 12: 1762-1767.

Gianaroli, L.; Plachot, M.; Magli, M. C. [ed.]. (2000). Atlas of embryology. Hum. Reprod., 15 (supl. 4). Hardarson, T.; Hanson, C.; Sjögren, A.; Lundin, K. (2001). «Human embryos with unevenly sized blastomeres have lower pregnancy and implantation rates: indications for aneuploidy and multinucleation». Hum. Reprod., 16: 313-318. Harper, J.; Delhanty, J. (2000). «Preimplantacional genetic diagnosis». Curr. Opin. Obstet. Gynecol., 12: 67-72. Houghton, F. D.; Hawkhead, J. A.; Humpherson, P. G.; Hogg, J. E.; Balen, A. H.; Rutherford, A. J.; Leese, H. J. (2002). «Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity». Hum. Reprod., 17: 999-1005. Lopes, A. S.; Madsen, S. E.; Ramsing, N. B.; Løvendahl, P.; Greve, T.; Callesen, H. (2007). «Investigation of respiration of individual bovine embryos produced in vivo and in vitro and correlation with viability following transfer». Hum. Reprod., 22: 558-566. Lundin, K.; Bergh, C.; Hardarson, T. (2001). «Early embryo cleavage is a strong indicator of embryo quality in human IVF». Hum. Reprod., 16: 26522657. Moriwaki, T.; Suganuma, N.; Hayakawa, M.; Hibi, H.; Katsumata, Y.; Oguchi, H.; Furuhashi, M. (2004). «Embryo evaluation by analysing blastomere nuclei». Hum. Reprod., 19: 152-156. Munné, S.; Cohen, J. (1998). «Chromosome abnormalities in human embryos». Hum. Reprod. Update, 4: 842-855. Pelinck, M. J.; Vos, M. de; Dekens, M.; Elst, J. van der; Sutter, P. de; Dhont, M. (1998). «Embryos cultured in vitro with multinucleated blastomeres have poor implantation potential in human in-vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection». Hum. Reprod., 13: 960-963. Rijnders, P. M.; Jansen, C. A. M. (1998). «The predictive value of day 3 embryo morphology regarding blastocyst formation, pregnancy and implantation rate after day 5 transfer following in-vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection» Hum. Reprod., 13: 2869-2873. Rock, J.; Menkin, M. F. (1944). «In vitro fertilization and cleavage of human ovarian eggs». Science, 100: 105-107. Royen, E. van; Mangelschots, K.; Neubourg, D. de; Laureys, I.; Ryckaert, G.; Gerris, J. (2001). «Calculating the implantation potential of day 3 embryos in women younger than 38 years of age: a new model». Hum. Reprod., 16: 326-332. Royen, E. van; Mangelschots, K.; Neubourg, K. de; Valkenburg, M.; Meerssche, M. van de; Ryckaer,

Cultiu i desenvolupament in vitro d’embrions humans 223

G.; Masterminds, W.; Gerris, J. (1999). «Characterization of a top quality embryo, a step towards single-embryo transfer». Hum. Reprod., 14: 2345-2349. Sakkas, D. (2008) «Objective embryo quality assessment: From morphology to the “omics”». Hum. Reprod., 23(supl. 1): 35. Scott, L. A.; Smith, S. (1998). «The successful use of pronuclear embryo transfers the day following oocyte retrieval». Hum. Reprod., 13: 1003-1013. Scott, L.; Alvero, R.; Leondires, M.; Miller, B. (2000) «The morphology of human pronuclear embryos is positively related to blastocyst development and implantation». Hum. Reprod., 15: 2394-2403. Scott, L.; Delegge, K.; O’Leary, T.; Berntsen, J.; Plougsgard, H.; Ramsing, N. (2007). «Respiration rates of human oocytes are stage specific and correlate with in vitro development: A potential noninvasive selection method». Hum. Reprod., 22(supl. 1): 144-145. Steptoe, P. C.; Edwards, R. G.; Purdy, J. M. (1971) «Human blastocysts grown in culture». Nature, 229: 132-133. Tay, J. I.; Rutherford, A. J.; Killick, S. R.; Maguiness, S. D.; Partridge, R. J.; Leese, H. J. (1997) «Human tubal fluid: production, nutrient composition and response to adrenergic agents». Hum. Reprod., 12: 2451-2456.

Tesarik, J.; Junca, A. M.; Hazout, A.; Aubriot, F. X.; Nathan, C.; Cohen-Bacrie, P.; Dumont-Hassan, M. (2000). «Embryos with high implantation potential after intracytoplasmic sperm injection can be recognised by a simple, non-invasive examination of pronuclear morphology». Hum. Reprod., 15: 1396-1399. Unió Europea (2006). Directiva 2006/17/CE de la Comisión de 8 de febrero de 2006 por la que se aplica la Directiva 2004/23/CE del Parlamento Europeo y del Consejo en lo relativo a determinados requisitos técnicos para la donación, la obtención y la evaluación de células y tejidos humanos. Vergouw, C. G.; Botros, L. L.; Roos, P.; Lens, J. W.; Schats, R. P.; Hompes, G. A.; Burns, D. H.; Lambalk, C. B. (2008). «Metabolomic profiling by nearinfrared spectroscopy as a tool to assess embryo viability: a novel, non-invasive method for embryo selection». Hum. Reprod., 23: 1499-1504. Weima, S. M. (1996) «The culture of embryos». A: Bras, M.; Lens, J. W.; Piederiet, M. H.; Rijnders, P. M.; Verveld, M.; Zeilmaker, G. H. [ed.]. IVF lab: Laboratory aspects of in-vitro fertilization. Àmsterdam: NV Organon.

DOI: 10.2436/20.1501.02.70

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 225-232

DIAGNÒSTIC GENÈTIC PREIMPLANTACIONAL EN ESTADIS EMBRIONARIS TARDANS Mònica Parriego,1 Anna Veiga 1,2 i Francesca Vidal 3 Servei de Medicina de la Reproducció, Institut Universitari Dexeus. Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona. 3 Unitat de Biologia Cel·lular, Universitat Autònoma de Barcelona. 1 2

Adreça per a la correspondència: Mònica Parriego i Beltran. Departament d’Obstetrícia, Ginecologia i Reproducció, Institut Universitari Dexeus. Gran Via Carles III, 71-75. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: monpar@dexeus.com. RESUM La incorporació de la biòpsia de blastocist en la pràctica clínica pot ser considerada com una alternativa vàlida per als cicles de diagnòstic genètic preimplantacional (DGP). La disponibilitat d’un major nombre de cèl·lules obre la possibilitat de realitzar diagnòstics múltiples en paral·lel en el mateix embrió, i es poden detectar teòricament malalties multigèniques o bé combinar diversos tipus de diagnòstic mitjançant FISH i PCR. Els embrions transferits en estadi de blastocist estan subjectes a una doble selecció: genètica i mitjançant el cultiu, i això es veu reflectit en elevades taxes d’implantació, fet que permet reduir el nombre d’embrions a transferir per tal d’evitar gestacions múltiples. Tot i que l’aplicació clínica de la biòpsia de blastocist per al DGP és encara limitada i recent, els bons resultats obtinguts pel que fa a taxes d’implantació i d’embaràs, així com les possibilitats diagnòstiques que obre, suggereixen que es tracta d’una tècnica que esdevindrà més freqüent en el futur. Paraules clau: biòpsia embrionària, blastocist, diagnòstic genètic preimplantacional. PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS AT THE BLASTOCYST STAGE SUMMARY The incorporation of blastocyst biopsy into clinical practice can be considered as a valid alternative when performing PGD. The fact that it makes more material available for analysis is of particular value in those cases where the aim is to diagnose monogenic diseases. The availability of a greater number of cells opens the possibility of performing multiple

226 M. Parriego, A. Veiga i F. Vidal

diagnoses in parallel on the same embryo; these could be used to detect multigenic diseases or for the combined diagnosis of different disorders through diagnostic approaches based on both FISH and PCR. Embryos transferred at the blastocyst stage are subjected to a dual selection process (genetic and through culture) and this is reflected in their greater implantation potential, thus enabling a lower number of embryos to be transferred, which in turn reduces the risk of multiple pregnancy. Although the clinical application of blastocyst biopsy for PGD remains a limited and recent development, the good results in terms of implantation and pregnancy rates obtained so far, as well as the diagnostic possibilities it opens up, suggest that this technique can become more widely used in the early future. Key words: embryo biopsy, blastocyst, preimplantation genetic diagnosis. INTRODUCCIÓ Divuit anys després de la seva primera aplicació clínica (Handyside et al., 1990) el diagnòstic genètic preimplantacional (DGP) s’ha consolidat i afermat. Actualment, la gran majoria de centres de reproducció assistida situats en països en els quals la legislació ho permet han incorporat el DGP com una opció a oferir a les parelles amb elevat risc de transmetre una malaltia genètica a la seva descendència. L’aplicació del DGP permet seleccionar per a la transferència els embrions lliures de la malaltia analitzada amb l’objectiu d’evitar gestacions afectes de la malaltia familiar. Des d’aleshores les indicacions per a les quals s’ofereix el DGP no han fet més que augmentar i el desenvolupament de noves metodologies per millorar i optimitzar les possibilitats diagnòstiques és constant. Una de les innovacions més recents consisteix a realitzar el DGP a partir de biòpsies cel·lulars obtingudes de blastocists. Aquest canvi implica que l’embrió es biopsiï en un estadi avançat del desenvolupament (dia +5 o dia +6), i és necessària una modificació important en la tècnica de biòpsia mateixa. Aquesta nova metodologia comporta associats una sèrie d’avantatges (i també alguns inconvenients) que es discutiran en aquest article, alhora que es descriurà detalladament la tècnica.

Les cèl·lules que s’obtenen durant la biòpsia de blastocist corresponen al trofectoderma. Cal tenir en compte que en l’estadi de blastocist es troben diferenciats per primer cop dos llinatges cel·lulars diferents: trofectoderma (TE) i massa cel·lular interna (MCI). Mentre que el botó de cèl·lules de la MCI ha de donar lloc a l’embrió en si, les cèl· lules del TE són les encarregades de formar les cobertes extraembrionàries. L’ús de les cèl·lules del TE com a font de material per al diagnòstic preimplantacional ja va ser suggerit fa més d’una dècada (Dokras et al., 1990; Carson et al., 1993) amb la intenció d’obtenir un nombre superior de cèl·lules per a l’anàlisi i així superar les dificultats associades als diagnòstics basats en l’anàlisi d’una sola cèl·lula. Aquesta possibilitat resulta especialment interessant en aquells casos en què el diagnòstic genètic es realitza basant-se en la tècnica de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), més sensible als problemes derivats de la poca quantitat de DNA disponible. Les fallades d’amplificació i el fenomen de allele drop out (ADO), observat després de l’anàlisi de cèl· lules úniques (ja siguin blastòmers o CP) en els cicles de DGP-PCR, comporten que un cert percentatge d’embrions restin sense un diagnòstic concloent i, per tant, que no puguin ser considerats per a la transferència. A més, la biòpsia d’un nombre superior de cèl·lules hauria de permetre diag-

Diagnòstic genètic preimplantacional en estadis embrionaris tardans 227

nosticar més d’una malaltia, o bé combinar diversos tipus de diagnòstic. Malgrat els aspectes positius esmentats, la biòpsia de blastocist ha estat incorporada a la pràctica clínica de manera molt recent (Boer et al., 2004; Kokkali et al., 2005) i, avui dia, en la gran majoria de centres el DGP encara es basa en l’anàlisi de biòpsies obtingudes d’embrions primerencs (D+3) o bé d’oòcits (biòpsia de corpuscle polar) (Goo sens et al., 2008). L’objectiu d’aquest treball és presentar el DGP basat en la biòpsia de blastocist, els aspectes tècnics i metodològics que el caracteritzen i les opcions que ens ofereix actualment.

ASPECTES TÈCNICS: BIÒPSIA EMBRIONÀRIA La micromanipulació dels blastocists resulta complexa i l’ús de la tecnologia làser durant el procés de biòpsia (Veiga et al., 1997) ha estat un punt clau per superar moltes de les limitacions tècniques que es presentaven. Els principals beneficis de l’ús del làser són la rapidesa, la precisió i la no-acidificació del medi, que conjuntament faciliten el procés de biòpsia i esdevenen essencials per obtenir una escissió ràpida, fàcil i eficient de les cèl·lules del TE. La primera part del procés de biòpsia implica la realització d’una obertura a la zona pel·lúcida (ZP) de l’embrió mitjançant l’ús un làser de tipus near-infrared 1.48-µm diode non-contact. El temps d’exposició, així com la intensitat del pols a aplicar, s’ha d’ajustar de manera individualitzada per a cada

Figura 1. Diagrama que mostra les dues aproximacions possibles de la biòpsia de blastocist. Les fletxes indiquen el polsos de làser. a) Obertura de la zona pel·lúcida en un embrió en el tercer dia de desenvolupament, b) obertura de la zona pel·lúcida en un blastocist, c) hèrnia de les cèl·lules del trofectoderma, d) biòpsia de les cèl·lules herniades i e) cèl·lules biopsiades.

228 M. Parriego, A. Veiga i F. Vidal

embrió per tal d’aconseguir una obertura de 10-30 µm, i estarà determinat pel gruix de la zona pel·lúcida (Veiga et al., 1997; McAr thur et al., 2005). Hi ha dues opcions per realitzar l’obertura de la ZP (vegeu la figura 1). La primera aproximació es realitza en embrions primerencs en el seu tercer dia de desenvolupament (McArthur et al., 2005) (vegeu la figura 1a). L’obertura de la ZP es realitza en tots els embrions disponibles en el tercer dia de desenvolupament. El motiu de realitzar l’obertura en aquesta etapa és intentar minimitzar el risc de danyar les cèl·lules adjacents, ja que en l’estadi de blastocist, l’espai perivitel·lí és quasi inexistent. Els embrions es mantenen en cultiu fins que assoleixen l’estadi de blastocist. En el moment en què el blastocist s’expandeix, les cèl·lules més properes a l’obertura tendeixen a herniar i són biopsiades. L’altra possibilitat consisteix a realitzar l’obertura directament en l’estadi de blastocist, en el dia 5 o 6 del desenvolupament (vegeu la figura 1b). L’àrea de la ZP triada per a la dissecció és la directament oposada on es troba la MCI. Després d’unes hores de cultiu (4-10 h) i la subseqüent hèrnia d’algunes cèl·lules del TE, pot realitzarse la biòpsia. En ambdós casos, les biòpsies s’obtenen immobilitzant el blastocist amb una pipeta de subjecció (diàmetre intern: 20-30 µm), amb les cèl·lules herniades col·locades en la posició de les tres (vegeu la figura 1c). Les cèl·lules herniades del TE (2-9 cèl·lules) són aspirades suaument dins la pipeta de biòpsia (diàmetre intern: 30 µm), i a continuació s’apliquen 3-5 polsos de làser per separar les cèl·lules a biopsiar de la resta del blastocist (vegeu la figura 1d). Finalment, les cèl· lules obtingudes són alliberades de la pipeta de biòpsia i queden a disposició per ser processades per a l’anàlisi (vegeu les figures 1e i 2). Fins al moment, tot i que els casos publi-

cats són pocs, els grups que apliquen aquesta metodologia descriuen una gran eficiència en el procés, ja que es manté la viabilitat dels embrions i s’observa la reconstitució de la cavitat blastocèlica el dia després de la biòpsia (Mc Arthur et al., 2005; Kokkali et al., 2007). ELS EMBRIONS: BLASTOCISTS Tal i com s’ha comentat, realitzar el DGP en aquest estadi del desenvolupament requereix que els embrions assoleixin l’estadi de blastocists i que el nombre que hi arribi ens ofereixi possibilitats realistes de dur a terme una transferència embrionària després de l’anàlisi genètica. Els avenços en el coneixement dels requeriments metabòlics dels embrions en els diferents estadis de desenvolupament (Leese et al., 1991) han permès desenvolupar medis i sistemes de cultiu in vitro cada cop més eficients (medis seqüencials) (Ménézo et al., 1999). No obstant això, el nombre d’embrions que assoleixen l’estadi de blastocist és encara relativament baix; només la meitat dels zigots cultivats in vitro arriben a blastocist i en aproximadament un 20 % dels cicles iniciats no és podrà dur a terme el DGP per manca d’embrions (McArthur et al., 2005). Aquest percentatge és superior al descrit quan el DGP es fa en embrions primerencs (Goosens et al., 2008). No obstant això, també és cert que molts dels embrions que no aconsegueixen assolir l’estadi de blastocist són cromosòmicament anormals (Sandalinas et al., 2001; Clouston et al., 2002), i possiblement aquestes anomalies són les responsables que els embrions no progressin. Després de la biòpsia de blastocist, sovint hi ha menys embrions transferibles; no obstant això, això es veu compensat pel potencial d’implantació superior d’aquests embrions. Aquest fet permet reduir el nom-

Diagnòstic genètic preimplantacional en estadis embrionaris tardans 229 Taula 1. Resultats del DGP per biòpsia de blastocist (experiència clínica) McArthur et al. (2005)

Kokkali et al. (2007)

Nre. cicles iniciats

231

Nre. blastocists biopsiats

1050

Nre. cicles sense embrions disponibles per a la biòpsia (%)

48 (21)

0 (0)

Nre. embrions diagnosticats (%)

974 (93)

50 (94,3)

Nre. cicles amb transferència (%)

119 (52)

10 (100)

Nre. embrions transferits (mitjana per transferència)

127 (1,1)

21 (2,1)

Taxa d’implantació

47,6

Taxa d’embaràs per transferència

Nre. embrions congelats

146

5+7

bre d’embrions a transferir sense disminuir la taxa de gestació i minimitzar el percentatge de gestacions múltiples (McArthur et al., 2005; Kokkali et al., 2007). MATERIAL D’ESTUDI: CÈĿLULES DEL TROFECTODERMA A més de l’avantatge que ens ofereix poder disposar de 2-9 cèl·lules d’un mateix embrió per a l’anàlisi genètica, un altre aspecte que es considera positiu de biopsar blastocists és el tipus de cèl·lules que es retiren de l’embrió. Les cèl·lules del blastocist que estan destinades a formar part del futur l’embrió són les de la massa cel·lular interna (ICM), i les cèl·lules del trofectoderma (TE), que són les que s’obtenen amb la biòpsia, estan destinades a participar en la formació de les cobertes extraembrionàries; per tant, la seva retirada no implica una reducció de la massa embrionària. Les biòpsies d’embrions primerencs impliquen una reducció de la massa embrionària i, si es considera que un embrió no

biopsiat té un potencial d’implantació del 20 %, aquest es veuria reduït a un 17 % després de la biòpsia d’una cèl·lula (Cohen et al., 2006). Ja que amb la biòpsia de blastocists la ICM queda intacta, aquest possible efecte negatiu s’evitaria. El mosaïcisme observat en embrions obtinguts in vitro és l’alteració cromosòmica més freqüent observada en embrions humans primerencs de dones menors de quaranta anys. Aquest fenomen, degut a errors mitòtics, és una de les limitacions del DGP, ja que pot comportar que la cèl·lula analitzada no resulti representativa de la resta de l’embrió. Diversos estudis que analitzen el contingut cromosòmic en l’estadi de blastocist han mostrat que en molts (90 %) coexisteixen línies cel·lulars diferents (Veiga et al., 1999; Ruangvutilert et al., 2000; Bielanska et al., 2002a, b, 2005; Derhaag et al., 2003), tot i que el percentatge de cèl·lules anormals observat és menor (< 30 %) que en estadis embrionaris anteriors (Ruangvutilert et al., 2000; Bielanska et al., 2002a). S’ha suggerit que la possible localització preferencial de cèl·lules aneuploides al trofectoderma podria donar lloc a errors di-

230 M. Parriego, A. Veiga i F. Vidal

agnòstics, ja que les cèl·lules biopsiades no serien representatives del contingut cromosòmic de l’embrió. De totes maneres, aquestes suposades diferències quant a continguts cel·lulars diferents dels dos llinatges dels blastocists no han estat confirmades en els estudis que s’han dut a terme fins ara (Evsikov i Verlinsky, 1998; Magli et al., 2000; Derhaag et al., 2003). La presència de cèl·lules poliploides (principalment tetraploides) és un fet freqüent en blastocists (Munné et al., 1994; Delhanty et al., 1997; Bielanska et al., 2002a, b; Ruang vutilert et al., 2000), i sembla que es tracta d’un fenomen normal, probablement relacionat amb la implantació. S’ha observat que les cèl·lules poliploides tendeixen a localitzar-se en el TE. Els percentatges de cèl·lules tetraploides presents en el TE varien entre el 23 i el 74 %, i es troben en menys proporció en blastocists de bona qualitat (Bielanska et al., 2002a); aquest fet s’ha de tenir en consideració en fer el DGP. MARGE DE TEMPS PER A L’ANÀLISI El temps disponible per a l’anàlisi és un altre punt important a tenir en compte quan

fem DGP basada en l’anàlisi de blastocists, ja que queda reduït a un màxim de 24 h si volem dur a terme la transferència dels embrions en el mateix cicle, i obliga a establir una coordinació molt acurada entre les diferents unitats que intervenen en el procés. El fet que no tots els embrions d’una mateixa cohort assoleixin l’estadi de blastocist de manera sincrònica pot implicar que les biòpsies hagin de realitzar-se en diferents moments, i això afecta el procés de l’anàlisi genètica de les mostres. Fins i tot, si el nombre final d’embrions a analitzar és baix, aquest aspecte complica l’organització al laboratori de DGP. Com a alternativa, el grup de Kokkali i col·laboradors opta per congelar (sense DGP) els embrions que assoleixen l’estadi de blastocist més tardanament (el dia 6è), i els mantenen per a una anàlisi en el cicle següent. No obstant això, aquesta aproximació només seria vàlida en els casos en què es disposés de blastocists biopsiats el dia +5 que haguessin estat diagnosticats com a normals per a la transferència. Pel que fa a la durada dels procediments diagnòstics, la realitat és que la majoria de protocols d’anàlisi en DGP que s’utilitzen actualment es poden dur a terme en menys de 24 h, i el temps només representaria una limitació en els casos en què fos necessari confirmar o repetir alguna anàlisi. CRIOPRESERVACIÓ

Figura 2. Hibridació in situ fluorescent (FISH) en cèl· lules biopsiades.

La criopreservació d’embrions biopsiats continua sent un dels punt febles del DGP, sigui quin sigui l’estadi embrionari en què es dugui a terme. Els embrions amb una obertura a la ZP són més sensibles al procés de congelació, fet que es reflecteix en una reduïda taxa de supervivència i desenvolupament d’aquests embrions quan són congelats i descongelats (Joris et al., 1999; Magli et al., 1999). Aquest impacte negatiu del

Diagnòstic genètic preimplantacional en estadis embrionaris tardans 231

procés de congelació es fa palès tant en embrions primerencs com en blastocists sense la ZP intacta. El procés de vitrificació com a alternativa a les tècniques clàssiques de congelació ha estat introduït en nombrosos programes de congelació a causa de la seva simplicitat i, sobretot, dels seus excel·lents resultats, no solament en oòcits, sinó també en embrions primerencs i blastocists (Vanderzwalmen et al., 2002; Zheng et al., 2005). Els resultats obtinguts fins ara amb la vitrificació dels embrions biopsiats (Parriego et al., 2007) fan que es presenti com l’opció de preferència després d’un DGP. APLICACIÓ CLÍNICA L’experiència clínica del DGP en blastocists és, fins al moment, poc extensa, i només han estat publicades sèries procedents de dos grups (McArthur et al., 2005; Kokkali et al., 2007). Les dades disponibles (vegeu la taula 1) mostren que el nombre mitjà de blastocists biopsiats per pacient és de cinc (4,5 en el cas de McArthur et al. (2005) i 5,3 en el de Kokkali et al., (2007). S’observen diferències entre els dos grups, tant pel que fa als cicles en què no va poder-se realitzar el DGP per manca d’embrions, com pel que fa al nombre d’embrions disponibles per a la transferència. No obstant això, les eficiències diagnòstiques descrites en les dues sèries són similars (93 i 94,3%) i són clarament superiors a les descrites en la literatura per als cicles PGD-PCR mitjançant biòpsia de blastòmer de dia +3 (Goosens et al., 2008). A més, ambdós grups descriuen elevades taxes d’implantació i embaràs després de la transferència d’aquests embrions.

AGRAÏMENTS Aquest treball ha estat realitzat sota els auspicis de la Càtedra d’Investigació en Obstetrícia i Ginecologia del Departament d’Obstetrícia, Ginecologia i Reproducció, Institut Universitari Dexeus, Universitat Autònoma de Barcelona, amb el suport del Projecte 2005SGR 00437 (Generalitat de Catalunya). Els autors agraeixen a Marta Parriego la preparació de les il·lustracions. BIBLIOGRAFIA Bielanska, M.; Jin, S.; Bernier, M.; Tan, S. L.; Ao, A. (2005). «Diploid-aneuploid mosaicism in human embryos cultured to the blastocyst stage». Fertility and Sterility, 84: 336-342. Bielanska, M.; Tan, S. L.; Ao, A. (2002a). «High rate of mixoploidy among human blastocysts cultured in vitro». Fertility and Sterility, 78: 1248-1253. — (2002b). «Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome». Human Reproduction, 17: 413-419. Boer, K. A. de; Catt, J. W.; Jansen, R. P.; Leigh, D.; McArthur, S. (2004). «Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF». Fertility and Sterility, 82: 295-298. Carson, S. A.; Gentry, W. L.; Smith, A. L.; Buster, J. (1993). «Trophectoderm microbiopsy in murine blastocysts: comparison of four methods». Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 10: 427-433. Clouston, H. J.; Herbert, M.; Fenwick, J.; Murdoch, A. P.; Wolstenholme, J. (2002). «Cytogenetic analysis of human blastocysts». Prenatal Diagnosis, 22: 1143-1152. Cohen, J.; Wells, D.; Munné, S. (2007). «Removal of 2 cells from cleavage stage embryos is likely to reduce the efficacy of chromosomal tests that are used to enhance implantation rates». Fertility and Sterility, 87: 496-503. Delhanty, J. D.; Harper, J. C.; Ao, A.; Handyside, A. H.; Winston, R. M. (1997). «Multicolour FISH detects frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal preimplantation embryos from fertile patients». Human Genetics, 99: 755-760. Derhaag, J. G.; Coonen, E.; Bras, M.; Bergers Janssen, J. M.; Ignoul-Vanvuchelen, R.; Geraedts, J.

232 M. Parriego, A. Veiga i F. Vidal

P.; Evers, J. L.; Dumoulin, J. C. (2003). «Chromosomally abnormal cells are not selected for the extra-embryonic compartment of the human preimplantation embryo at the blastocyst stage». Human Reproduction, 18: 2565-2574. Dokras, A.; Sargent, I. L.; Ross, C.; Gardner, R. L.; Barlow, D. H. (1990). «Trophectoderm biopsy in human blastocysts». Human Reproduction, 5: 821815. Evsikov, S.; Verlinsky, Y. (1998). «Mosaicism in the inner cell mass of human blastocysts». Human Reproduction, 13: 3151-3155. Goossens, V.; Harton, G.; Moutou, C.; Scriven, P. N.; Traeger-Synodinos, J.; Sermon, K.; Harper, J. C. (2008) «ESHRE PGD Consortium data collection VIII: cycles from January to December 2005 with pregnancy follow-up to October 2006». Hum Reprod. DOI: 10.1093/humrep/den238. Handyside, A. H.; Kontogianni, E. H.; Hardy, K.; Winston, R. M. (1990). «Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification». Nature, 344: 768-770. Joris, H.; Abbel, E. van der; Vos, A. de; Steirteghem, A. van (1999). «Reduced survival after human embryo biopsy and subsequent cryopreservation». Human Reproduction, 14: 2833-2837. Kokkali, G.; Traeger-Synodinos, J.; Vrettou, C.; Stav rou, D.; Jones, G. M.; Cram, D. S.; Makrakis, E.; Trounson, A. O.; Kanavakis, E.; Pantos, K. (2007). «Blastocyst biopsy versus cleavage stage biopsy and blastocyst transfer for preimplantation genetic diagnosis of beta-thalassaemia: a pilot study». Human Reproduction, 22: 1443-1449. Kokkali, G.; Vrettou, C.; Traeger-Synodinos, J.; Jones, G. M.; Cram, D. S.; Stavrou, D.; Trounson, A. O.; Kanavakis, E.; Pantos, K. (2005). «Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major». Human Reproduction, 20: 1855-1859. Leese, H. J.; Humpherson, P. G.; Hardy, K.; Hooper, M. A.; Winston, R. M.; Handyside A. H. (1991). «Profiles of hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase and adenine phosphoribosyl transferase activities measured in single preimplantation human embryos by high-performance liquid chromatography». Journal of Reproduction and Fertility, 91: 197-202. Magli, M. C.; Gianaroli, L.; Fortini, D.; Ferraretti, A. P.; Munné S. (1999). «Impact of blastomere biopsy and subsequent cryopreservation». Human Reproduction, 14: 770-773. Magli, M. C.; Jones, G. M.; Gras, L.; Gianaroli, L.; Korman, I.; Trounson, A. O. (2000). «Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid embryos that devel-

op to morphologically normal blastocysts in vitro». Human Reproduction, 15: 1781-1786. McArthur, S. J.; Leigh, D.; Marshall, J. T.; Boer, K. A. de; Jansen, R. P. (2005). «Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts». Fertility and Sterility, 84: 1628-1636. Menezo, Y. J. R.; Chouteau, J.; Torelló, M. J.; Girard, A.; Veiga, A. (1999). «Birth weight and sex ratio after transfer at the blastocyst stage in humans». Fertility and Sterility, 72: 221-224. Munné, S.; Grifo, J.; Cohen, J.; Weier, H. U. (1994). «Chromosome abnormalities in human arrested preimplantation embryos: a multiple-probe FISH study». American Journal of Human Genetics, 55: 150159. Parriego, M.; Solé, M.; Aurell, R.; Barri, P. N.; Veiga, A. (2007). «Birth alter transfer of frozen-thawed vitrified blastocysts». Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 24: 147-149. Ruangvutilert, P.; Delhanty, J. D.; Serhal, P.; Simopoulou, M.; Rodeck, C. H.; Harper, J. C. (2000). «FISH analysis on day 5 post-insemination of human arrested and blastocyst stage embryos». Prenatal Diagnosis, 20: 552-560. Sandalinas, M.; Sadowy, S.; Alikani, M.; Calderon, G.; Cohen, J.; Munné, S. (2001). «Developmental ability of chromosomally abnormal human embryos to develop to the blastocyst stage». Human Reproduction, 16: 1954-1958. Vanderzwalmen, P.; Bertin, G.; Debauche, C.; Standaert, V.; Roosendaal, E. van; Vandervorst, M.; Bollen, N.; Zech, H.; Mukaida, T.; Takahashi, K.; Schoysman, R. (2002). «Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification». Human Reproduction, 17: 744-751. Veiga, A.; Gil, Y.; Boada, M.; Carrera, M.; Vidal, F.; Boiso, I.; Menezo, Y.; Barri, P. N. (1999). «Confirmation of diagnosis in preimplantation genetic diagnosis (PGD) through blastocyst culture: preliminary experience». Prenatal Diagnosis, 19: 12421247. Veiga, A.; Sandalinas, M.; Benkhalifa, M.; Boada, M.; Carrera, M.; Santalo, J.; Barri, P. N.; Menezo, Y. (1997). «Laser blastocyst biopsy for preimplantation diagnosis in the human». Zygote, 5: 351-354. Zheng, W. T.; Zhuang, G. L.; Zhou, C. Q.; Fang, C.; Ou, J. P.; Li, T.; Zhang, M. F.; Liang, X. Y. (2005). «Comparison of the survival of human biopsied embryos after cryopreservation with four different methods using non-transferable embryos». Human Reproduction, 20: 1615-1618.

DOI: 10.2436/20.1501.02.71

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 233-248

CRIOPRESERVACIÓ I TÈCNIQUES DE REPRODUCCIÓ ASSISTIDA Miquel Solé,1 Montse Boada 1 i Anna Veiga1,2 1 2

Departament d’Obstetrícia, Ginecologia i Reproducció,.Institut Universitari Dexeus. Banc de Línies Cel·lulars, Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona.

Adreça per a la correspondència: Miquel Solé. Departament d’Obstetrícia, Ginecologia i Reproducció,.Institut Universitari Dexeus. Gran Via Carles III, 71-75. 08028 Barcelona. Adreça electrònica: miqsol@dexeus.com. RESUM La criopreservació és la preservació de la funcionalitat de les cèl·lules o teixits mitjançant la reducció de la temperatura per sota del punt on les reaccions químiques poden tenir lloc. D’aquesta manera es poden mantenir durant llargs períodes de temps mantenint la seva viabilitat, encara que aquesta pot estar compromesa per l’efecte negatiu que causa el descens de temperatura i també durant el retorn a la normotèrmia. És una part essencial de les tècniques de reproducció assistida. La criopreservació de semen facilita en gran mesura la planificació dels cicles de fecundació in vitro i la utilització de semen de donant i ha donat lloc a milers de nens nascuts sans, ja que augmenta les taxes d’embaràs acumulat per punció fol·licular. Actualment els embrions sobrants són criopreservats rutinàriament en els laboratoris de fecundació in vitro. Els naixements a partir d’embrions criopreservats representen al voltant del 8 % del total de nens nascuts amb les tècniques reproducció assistida. La criopreservació d’oòcits i teixit ovàric està adquirint un paper protagonista en els últims anys i està centrant tots els esforços per a l’optimització dels procediments, ja que ofereix grans possibilitats per als pacients que volen preservar la fertilitat. Paraules clau: bioseguretat, criopreservació, crioprotector, oncofertilitat, vitrificació. CRYOPRESERVATION AND ASSISTED REPRODUCTION TECNIQUES SUMMARY Cryopreservation is the preservation of the viability of cells and tissues by means of temperature reduction of the under the point where chemical reactions take place. Their viability can be preserved during long time although this state can be involved by the negative effect caused by temperature decrease and also by the return to normotermia. Semen and embryo cryopreservation has been an essential techniques of reproduction attended. Se-

234 M. Solé, M. Boada i A. Veiga

men cryopreservation facilitates in great measure the planning of the cycles of fertilization in vitro mainly when donor semen is used. Embryo cryopreservation of embryos has given rise to thousands of healthy born children, enlarging accumulated rates of pregnancies by follicular puncture. Today, the surplus embryos are routinely cryopreserved in IVF laboratories. Births from cryopreserved embryos represents 8% of born children by using assisted reproduction techniques. Actually oocyte and ovarian tissue cryopreservation are acquiring high relevance and are centering all the efforts for protocol optimization since offer large possibilities for patients who want to preserve their fertility. Key words: biosecurity, cryopreservation, cryoprotectants, oncofertility, vitrification.

INTRODUCCIÓ La criobiologia és l’aplicació de baixes temperatures en materials biològics, l’objectiu del qual és la conservació de las cèl· lules vives amb el manteniment de la seva funcionalitat. Es tracta d’una ciència pluridisciplinària que estudia el comportament de les cèl·lules i teixits a baixes temperatures (< 0 °C). El metabolisme cel·lular disminueix críticament i així permet preservar durant llargs períodes de temps la seva viabilitat potencial. La criobiologia i les tècniques de reproducció assistida (TRA) han evolucionat en gran mesura de manera paral·lela durant els últims cinquanta anys. El tret de sortida el va donar el descobriment del glicerol com a agent crioprotector. Va ser l’any 1949 quan es va aconseguir criopreservar amb èxit semen d’au mitjançant la introducció del glicerol (Polge et al., 1949). Aquest fet va suposar un gran impuls per a la comprensió dels efectes biològics de la criopreservació i va donar lloc a una sèrie d’importants descobriments durant els anys posteriors. Es van estudiar els danys cel·lulars deguts a la formació de gel intracel·lular i extracel·lular, a la citotoxicitat dels diferents crioprotectors i a canvis d’osmolaritat. En els inicis de la dècada dels setanta es va introduir el dimetilsulfòxid (DMSO) com a crioprotector en la criopreservació d’embrions de rato-

lí (Wilmut et al., 1972), molt utilitzat actualment en la tècnica de vitrificació. A partir d’aquest moment molts investigadors van aprofundir en l’estudi dels protocols de congelació/descongelació i dels diferents crioprotectors. El primer naixement a partir d’embrions de ratolí criopreservats es va aconseguir el mateix any (Whittingham et al., 1972). El mètode descrit per Whittingham tenia una durada d’unes 2-3 hores, per minimitzar la formació de gel en l’interior de les cèl·lules. Aquest protocol originari és el que va ser emprat durant anys en la criopreservació lenta per a embrions primerencs humans, en el quals s’aplicaven taxes de refredament de 0,3 °C/min fins a assolir la temperatura de –100 °C. Als pocs anys es va descobrir que si s’aplicaven taxes de descongelació ràpida (350 °C/min) la taxa de refredament podia accelerar-se a partir dels –30 °C. En la dècada dels vuitanta ja es va incorporar en humans la criopreservació d’embrions com a procediment habitual en les TRA. El 1983 Trounson i Mohr van publicar el primer embaràs en humans a partir d’embrions primerencs criopreservats. El primer naixement es va publicar l’any següent (Zeilmaker et al., 1984). En anys posteriors es va aprofundir en el coneixement dels crioprotectors presents també en insectes com a sistema de defen-

Criopreservació i tècniques de reproducció assistida 235

sa contra els canvis extrems de temperatura (Pegg et al., 1987). El mètode alternatiu a la congelació lenta és conegut amb el nom de vitrificació, terme utilitzat per a la solidificació de sistemes sense formació de gel. Ja l’any 1934, Luyet va estudiar la possibilitat de vitrificar el material biològic per evitar així l’efecte negatiu que suposa la formació de gel durant la congelació/descongelació. Aquesta tècnica es basa en l’aplicació d’altes taxes de refredament amb l’ús de solucions altament tòxiques, amb altes concentracions de crioprotector. Aquest mètode va caure en l’oblit fins que Rall i Fahy van disminuir la citotoxicitat de les solucions crioprotectores modificant també els temps d’exposició. Van vitrificar amb èxit embrions de ratolí centrant la seva atenció a escurçar el temps d’exposició a les solucions amb altes concentracions de crioprotector. L’any 1990 es van desenvolupar solucions crioprotectores amb menor citotoxicitat basades en tampó fosfat, etilenglicol (EG), ficol i sacarosa. La presència de macromolècules no permeables a la membrana de les cèl·lules disminuïa la toxicitat de les solucions. Van arribar a la conclusió que el temps òptim d’equilibrament amb la solució de vitrificació era dependent de la temperatura a la qual es realitzava el procés (Kasai et al., 1990). En el context de la reproducció assistida tant les cèl·lules (espermatozoides, oòcits i embrions) com els teixits (teixit ovàric i gonadal) poden ser criopreservats amb èxit amb els dos mètodes. Pel que fa als oòcits, ha estat en els últims anys quan s’han aconseguit optimitzar els protocols i s’han millorat significativament els resultats.

PRINCIPIS BÀSICS DE LA CRIOPRESERVACIÓ Independentment de la metodologia utilitzada per a la criopreservació, com a conseqüència del refredament es produeixen uns efectes deleteris en els gàmetes i embrions que en poden comprometre la supervivència i la viabilitat. Durant la criopreservació, les cèl·lules s’exposen a un gran estrès mecànic, tèrmic i químic (Fuller et al., 2004). Els punts principals del procés, que són comuns als diferents mètodes de criopreservació, són el següents: — Incorporació de crioprotectors prèviament al refredament. — Descens de temperatura fins a la immersió en nitrogen líquid (–196 °C). — Escalfament de la mostra fins a la temperatura fisiològica (36,8-37 °C). — Extracció del crioprotector de l’interior de les cèl·lules. Aigua i formació de gel És conegut des de fa molts anys l’efecte que té el descens de la temperatura en les cèl·lules. Es produeix un descens de les reaccions químiques i disminueix el metabolisme cel·lular fins que queden totalment inactives. L’estat sòlid de l’aigua, el gel, es produeix per la formació de ponts d’hidrogen entre les molècules d’aigua. És un enllaç intermolecular que forma una estructura semblant a un rusc d’abelles. L’aigua arriba a la seva densitat màxima a una temperatura de 4 °C i es va expandint a mesura que es congela. La seva energia cinètica és molt baixa i les molècules estan gairebé immòbils. Tot i així, es pot aconseguir un estat de sobrerefredament, és a dir, pot romandre en estat líquid fins a una temperatura de –25 °C.

236 M. Solé, M. Boada i A. Veiga

El punt de congelació d’una solució és inversament proporcional a la concentració de soluts. En una suspensió cel·lular l’inici de la formació de nuclis de gel s’inicia aleatòriament en el medi extracel·lular entre els –5 i –15 °C; aquest fenomen es coneix amb el nom de nucleació. Inicialment es dóna en el medi extracel·lular, ja que és on hi ha més quantitat d’aigua lliure. Posem com a exemple una solució aquosa isotònica (300 mOsm/kg); la formació de gel en aquesta solució es produeix a –10 °C. Això produeix un augment d’osmolaritat en el medi, que es manté líquid i promou la deshidratació de les cèl·lules per la sortida d’aigua a través de la membrana al medi extracel·lular. La part de la solució que es manté en estat líquid es va tornant cada cop més viscosa per augment de la concentració de soluts. A –130 °C el poc medi que resta en estat líquid i les cèl·lules vitrifiquen conjuntament. La temperatura a la qual es produeix la cristal·lització/vitrificació dependrà dels soluts dissolts a la solució. El punt eutèctic d’una solució reflecteix la màxima concentració de soluts a la qual pot arribar la solució abans que solidifiqui. Paper dels crioprotectors Els crioprotectors són substàncies utilitzades per a la protecció de cèl·lules i teixits del dany que es produeix durant la congelació, principalment a causa de la formació de gel. Hi ha molts éssers vius (entre els quals trobem alguns insectes, peixos, amfibis i rèptils) que produeixen aquestes substàncies en els seus organismes com a protecció enfront de condicions ambientals extremes, com les baixes temperatures o la deshidratació. En el cas dels insectes, aquests normalment utilitzen sucres com a agents crioprotectors; les granotes de l’Àrtic utilitzen

glucosa i les salamandres de l’Àrtic sintetitzen glicerol en el fetge. No es coneix molt bé el funcionament dels crioprotectors, per la dificultat que suposa l’estudi a baixes temperatures. Els crioprotectors alteren les propietats fisicoquímiques de les solucions on es troben les cèl·lules o teixits. Es tracta de molècules hidrosolubles i de baixa toxicitat. Disminueixen el punt eutèctic de les solucions. Això suposa assolir una concentració de soluts a una temperatura menor i fa que la cèl·lula estigui més deshidratada i sotmesa a un gradient osmòtic menor. Disminueixen la temperatura a la qual es produeix la transició de l’aigua d’estat líquid a sòlid i interaccionen amb les molècules d’aigua, i redueixen la capacitat de formar ponts entre aquestes. També estableixen ponts d’hidrogen amb molècules biològiques i desplacen les molècules d’aigua, de manera que impedeixen que les proteïnes o el DNA perdin la seva estructura terciària, és a dir, la seva estructura fisiològica nativa i la seva funcionalitat. La barreja de dos o més crioprotectors implica una disminució de la citotoxicitat i n’augmenta l’efectivitat. La utilització de dos crioprotectors és comuna en la tècnica de vitrificació. Els crioprotectors es poden classificar en dos grups en funció de la permeabilitat a la membrana cel·lular: permeables i no permeables. El crioprotectors permeables són de baix pes molecular, i són capaços de travessar la membrana de les cèl·lules. Entre aquests, els més comuns són els glicols (alcohols amb dos grups hidroxils com a mínim), entre els quals es troben l’etilenglicol (EG), el propandiol (PROH) i el glicerol. El dimetilsulfòxid (DMSO) és actualment un crioprotector molt utilitzat. Aquests crioprotectors actuen amb diferents mecanismes: baixen el punt de congelació de la solució, interac-

Criopreservació i tècniques de reproducció assistida 237

cionen amb la membrana mantenint la seva estructura i prevenen l’exposició a altes concentracions d’electròlits tant intracel· lulars com extracel·lulars, ja que són capaços d’unir-se a aquests. Els crioprotectors no permeables són compostos d’alt pes molecular que normalment s’utilitzen associats amb els agents crioprotectors permeables. No es tracta pròpiament de crioprotectors, sinó que exerceixen el seu efecte crioprotector promovent una ràpida deshidratació cel·lular i augmentant el gradient osmòtic. Els més comuns són els sucres com la sacarosa o la glucosa, però també s’utilitzen altres macromolècules com la polivinilpirrolidona (PVP), el ficol i proteïnes d’alt pes molecular. BIOSEGURETAT I EMMAGATZEMATGE EN NITROGEN LIQUID La bioseguretat és l’aplicació de coneixements, tècniques i equipament per prevenir l’exposició a agents potencialment perillosos, considerats de risc biològic. També cal tenir en compte els possibles efectes negatius del nitrogen líquid en el personal de laboratori si no es fa una bona manipulació del mateix. Risc físic i químic El nitrogen líquid és un producte potencialment perillós a causa de les seves característiques fisicoquímiques: és extremadament fred, a pressió atmosfèrica bull a –196 °C, genera grans quantitats de vapor de nitrogen i produeix una disminució de la concentració d’oxigen en l’ambient. Com que és inodor, incolor i insípid, es respira normalment com si es tractés d’aire a concentracions normals d’oxigen. Per aquest

motiu és important que la sala criogènica estigui ben ventilada. És recomanable disposar d’un oxiòmetre que permeti monitoritzar el nivell d’oxigen en l’ambient. Si no hi ha una ventilació adequada la intoxicació per vapors de nitrogen pot provocar mareig, debilitació o desmais en el personal de laboratori. Cal evitar-ne la manipulació sense una protecció adient, ja que amb el contacte amb la pell pot produir cremades. Risc de contaminació creuada El nitrogen és utilitzat per a la criopreservació de gàmetes, embrions i teixits. Pot constituir una font de contaminació en si mateix o de contaminació creuada (entre diferents mostres criopreservades) si no es manipula adequadament. En l’àmbit de la reproducció assistida, tot i que no s’ha publicat cap cas de contaminació creuada i la probabilitat que es produeixi és molt baixa, el risc no és nul. És important seguir les normes de bioseguretat i bona pràctica. La contaminació creuada pot produir-se en els següents casos: — A partir de mostres contaminades com en el cas del semen. S’han de manipular les mostres amb precaució per no contaminar exteriorment el suport. — La utilització de medis de cultius contaminats. — Fractura de l’envàs ja emmagatzemat en el nitrogen líquid. — Tancament o segellament dels suport de manera errònia. — Utilització de nitrogen líquid contaminat durant el procés de congelació o per una mala gestió de la font de nitrogen per part dels proveïdors. — La mala qualitat de l’aire en la zona de congelació pot ser una possible font de contaminació.

238 M. Solé, M. Boada i A. Veiga

— El personal de laboratori per via aèria o per descamació de la pell durant el processament de les mostres, o durant la manipulació del contingut dels tancs criogènics. Existeixen diversos microorganismes com fongs (Aspergillus), virus (hepatitis, VIH, papovavirus, virus herpes símplex i adenovirus) i bacteris, que poden sobreviure a l’exposició directa al nitrogen líquid i ser els causants d’una contaminació. Per evitar una contaminació originada a partir del nitrogen líquid s’han proposat diferents mètodes d’esterilització amb mètodes d’ultrafiltració o mitjançant la radiació ultraviolada. Aquests mètodes són objecte d’investigació avui dia, per l’alt cost que tenen. Una estratègia que s’està estenent actualment, és la utilització de vapors de nitrogen (VNL) per a la criopreservació i emmagatzematge. Tot i que s’han aconseguit aïllar alguns patògens en els VNL, la possibilitat de contaminació creuada disminueix enormement. Cal tenir en compte que és més probable que es produeixin fluctuacions de temperatura que podrien afectar la preservació de les mostres, però recentment s’han desenvolupat tancs que han demostrat mantenir una temperatura adequada i homogènia. Pel que fa al suport de les mostres de semen, oòcits i embrions, l’any 1995 es van introduir al mercat palletes d’alta seguretat fetes amb resina ionomèrica, material irrompible a –196 °C. També es van comercialitzar segelladores específiques de calor que oferien la màxima seguretat, ja que eren resistents a pressions de 150 kg/cm. Els estudis amb aquests sistemes han revelat que no existeix possibilitat de contaminació vírica o bacteriana en cap sentit. Aplicat a la tècnica de vitrificació també s’han comercialitzat alguns suports que garanteixen la bioseguretat.

Tancs de nitrogen líquid S’han comercialitzat tancs de diferents mides i característiques que garanteixen el manteniment de les mostres a temperatures adequades. Estan fabricats amb una doble camisa aïllant amb un espai on s’ha aplicat el buit. Contenen al seu interior uns sistemes d’acer inoxidable per dipositar els vials o suports amb les mostres biològiques. L’emmagatzematge de les mostres requereix temperatures inferiors a –130 °C, temperatura de transició del gel en aigua, que assegura, així, l’absència de reaccions químiques. El sistema més senzill i segur existent actualment és el nitrogen líquid. Les úniques reaccions que es poden produir són la lenta acumulació de radiacions ionitzants, però aquesta acumulació probablement només és significativa si es manté durant segles (Mazur et al., 1984). MÈTODES DE CRIOPRESERVACIÓ Actualment existeixen dos mètodes àmpliament utilitzats pels centres de reproducció assistida: la congelació lenta i la vitrificació. A diferència de la vitrificació, en la congelació lenta s’equilibren les cèl·lules amb la solució crioprotectora. El principis fonamentals que determinen la supervivència són comuns per als dos mètodes, i existeixen múltiples factors que influeixen en l’èxit de la criopreservació. Congelació lenta o convencional Les mostres, prèviament al refredament, s’exposen a la solució crioprotectora (12 M), que és hiperosmòtica (> 300 mOsm) i aquestes cèl·lules responen al canvi osmòtic deshidratant-se amb la pèrdua d’aigua a través de la membrana, i incorporant al ma-

Criopreservació i tècniques de reproducció assistida 239

teix temps el crioprotector. La taxa de deshidratació i d’incorporació del crioprotector dependrà de les propietats de la membrana, dels crioprotectors i de la temperatura. El coeficient de permeabilitat de membrana varia per als diferents estadis embrionaris, i també són diferents per a l’oòcit i els altres tipus cel·lulars. Els crioprotectors no són citotòxics en si mateixos, sinó que el dany cel·lular pot produir-se per un xoc osmòtic per una pressió osmòtica excessivament elevada entre la solució intracel·lular i extracel·lular. Aquest fenomen es pot donar tant durant l’equilibrament previ o després de la descongelació. Just abans de començar la congelació l’embrió ha d’arribar a una situació d’equilibri dins i fora de la cèl·lula, i s’ha d’igualar la pressió osmòtica entre el citoplasma i la solució on es troba en suspensió. En la descongelació l’aigua pot entrar més ràpidament que la sortida del crioprotector, i el volum pot augmentar fins que es produeixi la lisi de la cèl·lula. El temps necessari perquè es produeixi l’equilibrament i la dilució del crioprotector dependrà de la permeabilitat als crioprotectors, la temperatura a la qual es realitza el procés, la concentració de crioprotector i el tipus cel·lular. Actualment en els protocols utilitzats amb congeladors programables les taxes de refredament inicials són de 0,3 °C/min fins que s’assoleix una temperatura de –30 °C, temperatura a la qual ja es pot incrementar la taxa de refredament fins a 50 °C/min fins a la temperatura de -150 °C. A aquesta temperatura els embrions ja se submergeixen en nitrogen líquid. Unes taxes de refredament massa elevades poden lisar les cèl·lules, per la formació de gel intracel·lular. Contràriament, amb unes taxes massa lentes de refredament la mort cel·lular es produeix per una exposició prolongada a condicions hiperosmòtiques. La taxa òptima de refredament depèn dels

següents factors: la relació superfície/volum de la cèl·lula, la permeabilitat de membrana, el tipus de crioprotector i la seva concentració. Per evitar la formació de gel intracel·lular s’indueix la formació de gel en el medi extracel·lular a –7 °C, fenomen conegut amb el nom de seeding. Es promou també un augment en la concentració de soluts en la solució que no solidifica, i d’aquesta manera es facilita la deshidratació de les cèl·lules i s’evita la formació de gel en el seu interior. La temperatura òptima per al seeding es va determinar experimentalment tenint en compte la temperatura a la qual s’inicia la formació de gel espontàniament. Es va arribar a la conclusió que la temperatura òptima es troba entre els –5 °C i –7,5 °C. Es fa per contacte directe, amb un material extremadament fred, sobre una part de la solució propera a la mostra. La taxa de recuperació de temperatura durant la descongelació depèn de la taxa de refredament durant la congelació. Unes taxes baixes de refredament durant la congelació fins a –30 °C requereixen altes taxes d’escalfament (200-350 °C/min). Si la congelació lenta és fins a –60°C la velocitat d’escalfament ha de ser també més lenta, per sota dels 25 °C/min. Finalment, un altre aspecte molt important durant la descongelació és la dilució dels crioprotectors. La utilització de crioprotectors no permeables permet accelerar el procés i evita que es produeixi el xoc osmòtic. El suports més utilitzats en la congelació lenta són les palletes de 0,5 ml. Originàriament estaven fetes de policlorur de vinil (PVC), però el 1998 es van descartar perquè no es podien esterilitzar adequadament. Actualment es fabriquen amb glicol de tereftalat de polietilè (GTP). Són més fràgils que els criotubs (utilitzats en la criopreservació de semen), i per això s’han de mani-

240 M. Solé, M. Boada i A. Veiga

pular amb molta cura un cop congelades, per la rigidesa que adquireixen. El sistema més segur de segellament és per calor. Vitrificació És un mètode alternatiu a la congelació lenta, i està adquirint un paper protagonista en els últims anys. El seu principi bàsic és evitar la formació de gel tant en el citoplasma com en la solució extracel·lular mitjançant l’aplicació d’altes taxes de refredament juntament amb la utilització de solucions amb altes concentracions de crioprotector. A diferència de la congelació lenta, la deshidratació de les cèl·lules es produeix just abans de la baixada de temperatura exposant les cèl·lules a altes concentracions de crioprotector. La vitrificació es pot definir com la solidificació d’una solució per un augment extrem de la viscositat. L’inconvenient principal és la necessitat d’exposar les cèl·lules a concentracions elevades de crioprotector (4-8 M), concentracions que poden resultar citotòxiques. La investigació en aquest camp ha fet possible limitar la toxicitat utilitzant dos crioprotectors permeables simultàniament. Això permet disminuir la concentració necessària de cadascun i el temps d’exposició. També permet poder utilitzar-los a temperatures inferiors, cosa que en disminueix la toxicitat. La combinació de dos crioprotectors augmenta la velocitat a la qual la cèl·lula els pot incorporar. Entre els crioprotectors permeables més utilitzats trobem el DMSO, l’etilenglicol i el propilenglicol. Entre els no permeables, la sacarosa. Els medis de vitrificació també se suplementen normalment amb altres macromolècules, com la PVP o el ficol. Per prevenir la formació de gel és molt important la taxa de refredament, i depèn en gran mesura del suport utilitzat per a

la vitrificació. És necessari vitrificar en volums molt baixos per assolir taxes de refredament elevades. Actualment existeixen molts suports, i es poden classificar en sistemes tancats i oberts. Tots els sistemes estan concebuts per poder aconseguir altes taxes de refredament minimitzant el volum de medi en el qual es vitrifica. Els més utilitzats són els sistemes oberts, que impliquen el contacte directe amb el nitrogen líquid i garanteixen així unes taxes de refredament adequades. El principal problema és una possible contaminació de les mostres. Entre els sistemes més utilitzats trobem: l’open pulled straw (OPS), la reixa de coure utilitzada en microscòpia electrònica, el cryoloop i el cryotop. L’OPS es basa en l’escalfament d’una palleta convencional, que permet estirar-la i disminuir-ne així el diàmetre i conseqüentment, el volum en el qual es vitrifiquen les mostres (Vatja et al., 1998). La reixa de microscòpia electrònica va ser descrita per primer cop el 1992. Es va aplicar en embrions de Drosophila i es van obtenir unes taxes de refredament tres cops superior que amb les palletes convencionals (Mazur et al., 1992). En els últims anys s’ha aplicat majoritàriament en la vitrificació de blastocists. El cryoloop consisteix en un bucle de niló de 0,5-0,7 mm de diàmetre el qual, un cop submergit en nitrogen líquid, s’introdueix en un vial prèviament refredat (Kasai et al., 2002). El sistema més nou, recentment comercialitzat, és el cryotop, que s’ha estès molt pels bons resultats publicats quan s’aplica tant a oòcits com a embrions (Kuwayama et al., 2006). Recentment s’han desenvolupat sistemes tancats que impedeixen possibles contaminacions com el High Segurity Vitrification kit (HSV, CBS) i el Cryotip. S’evita el contacte directe amb el nitrogen líquid, però la taxa de refredament disminueix, i això pot comprometre’n la viabilitat, sobretot en

Criopreservació i tècniques de reproducció assistida 241

el cas dels oòcits, que són cèl·lules més termosensibles. Resulta necessari optimitzar aquests sistemes, ja que són el únics que garanteixen el compliment complet de les normes de bioseguretat. CRIOPRESERVACIÓ DE SEMEN O TEIXIT TESTICULAR El primer embaràs registrat en humans amb semen congelat fou l’any 1953 (Sherman et al., 1953). La criopreservació de semen i la utilització posterior va causar un gran impacte en la reproducció humana i de mamífers. La primera congelació es va realitzar amb gel sec. Uns anys més tard es va posar a punt la tècnica amb vapors de nitrogen líquid i es va aconseguint descendència sana. La primera vitrificació de semen es va realitzar l’any 1938. Va ser en granotes, però en aquests primers passos es van obtenir baixes taxes de supervivència. No s’aconseguien unes taxes de refredament adequades, i calia afegir quantitats de crioprotector no tolerades pels espermatozoides. El primer banc de semen es va crear a Califòrnia el 1977. Fins a mitjan anys vuitanta va haver-hi una gran expansió en l’establiment de bancs de semen als EUA i França. Fins a la segona meitat dels vuitanta no es va establir la necessitat de mantenir en quarantena les mostres per evitar la transmissió del virus de la immunodeficiència adquirida (VIH). Existeixen dos tipus de bancs de semen: el que conserven mostres provinents de pacients que requereixen els serveis de reproducció assistida per diferents motius, i els bancs de semen de donants. Aquests últims s’encarreguen de la selecció, criopreservació i distribució de les mostres de semen de donants. Actualment existeixen cinquanta-tres

bancs de semen autoritzats a Espanya per a ús reproductiu (MSC, registre de centres, 2003). L’acceptació per part dels centres depèn del resultat d’una exploració física i l’anamnesi completa, incloent-hi la història familiar. Els donants són testejats per als antígens de l’hepatitis B, anticossos antihepatitis C, anticossos anti-HIV1/2, Clamidia, anticossos antiherpesvirus, sífilis, gonorrea i citomegalovirus. Indicacions Els bancs de semen estan indicats en els casos següents: — Congelació per la dificultat d’obtenció de la mostra el dia de la punció fol·licular. — Per la possibilitat de no poder estar presents el dia de l’obtenció dels oòcits. — Pacients inclosos en les llistes d’espera en els programes de donació d’oòcits. — Prèviament a tractaments de quimioteràpia o radioteràpia. — Per la mala qualitat de la mostra. — En els casos en els quals és necessari realitzar biòpsia testicular o aspiració de l’epidídim per a l’obtenció d’espermatozoides és recomanable criopreservar la polpa testicular. Metodologia La supervivència de les suspensions d’espermatozoides no està molt influïda per les taxes de refredament. Els diferents protocols ofereixen unes taxes de supervivència molt similars. Tots els mètodes requereixen els passos següents: — Dilució de la mostra o disgregament de teixit amb una solució crioprotectora. — Congelació amb diferents mètodes (vapors de nitrogen líquid, formació de perles en gel sec o congelador programable).

242 M. Solé, M. Boada i A. Veiga

— Identificació i emmagatzematge en recipients adequats. — Descongelació i rentatge de la mostra amb l’extracció del crioprotector. En el cas de la criopreservació de polpa testicular és necessària la disgregació prèvia del teixit; el procediment posterior és similar a la criopreservació de mostres de semen. La solució crioprotectora ha de ser isosmòtica respecte al plasma seminal, amb un pH proper a la neutralitat. Han d’incorporar nutrients amb aport energètic, com glucosa, fructosa o manosa. També conté un antibiòtic d’ampli espectre per prevenir possibles contaminacions. Els crioprotectors més utilitzats són el glicerol i el rovell d’ou. El procés de congelació/descongelació produeix alteracions cel·lulars que produeixen una disminució de la fertilitat del semen. El paràmetre que ens serveix per determinar l’eficiència de la criopreservació és la motilitat. Els efectes mecànics negatius que es produeixen són deguts a la formació de gel i també per l’efecte osmòtic (col·lapse cel·lular). També es produeix un dany físic i químic per canvis en la fase dels lípids de membrana i un augment en la peroxidació. Se sap que aquest fenomen està relacionat amb la pèrdua de mobilitat. La majoria dels danys es produeixen durant la descongelació, ja que hi ha una pèrdua de la capacitat antioxidant durant la congelació. Recentment s’estan desenvolupant mètodes per a la vitrificació de mostres de semen o teixit testicular que, contràriament al que es pensava, es pot dur a terme amb èxit sense la utilització de crioprotectors. Com que el semen no pot tolerar altes concentracions de crioprotector, s’han intentat desenvolupar mètodes de vitrificació amb taxes molt elevades de refredament i escalfament de les mostres amb volums molt petits de mostra. El mètode de congelació més adequat és

el de perles en gel sec. El semen o teixit, diluït amb el crioprotector, es diposita en els orificis fets prèviament en una peça de gel sec. Les gotes dipositades es congelen en un espai molt curt de temps. Eficiència Els factors que estan més relacionats amb les taxes de concepció són: el mètode de criopreservació, la qualitat de la mostra i el tipus de suport utilitzat. Durant la criopreservació es perd al voltant del 50 % de la població inicial d’espermatozoides a causa de l’alteració de la membrana, citosquelet, nucli espermàtic i aparell motor. Aquests efectes es poden minimitzar amb una preparació adequada de la mostra, la finalitat de la qual és la selecció dels espermatozoides mòbils. Recentment s’ha demostrat que és possible vitrificar amb èxit el semen sense afegir crioprotectors permeables, submergint la mostra directament en nitrogen líquid. CRIOPRESERVACIÓ D’EMBRIONS L’estimulació ovàrica per a l’obtenció d’un gran nombre d’oòcits i, conseqüentment, d’embrions, és una pràctica generalitzada en les TRA. Fent referència al registre de la Societat Espanyola de Fertilitat (SEF), en un 20 % del cicles de fecundació in vitro (FIV) s’obtenen embrions sobrants per a la criopreservació. S’ha investigat molt en aquest camp, ja que és indiscutible que l’èxit en la congelació de zigots i embrions té uns gran efectes beneficiosos, i possibilita l’augment de les taxes d’embaràs acumulat (transferència d’embrions en fresc més transferències d’embrions descongelats obtinguts en el mateix cicle de FIV). El cost del cicle de criotransferència és ⅕ del d’un cicle com-

Criopreservació i tècniques de reproducció assistida 243

plet de FIV. L’augment de les taxes d’embaràs acumulat està influït per les variables següents: l’eficiència del protocol de congelació/descongelació d’embrions, la qualitat dels embrions congelats i els criteris de selecció dels embrions a criopreservar. A mitjan anys vuitanta es va generalitzar la criopreservació d’embrions, i això va donar lloc a milers de nens nascuts fins avui dia. El primer naixement a Espanya es va aconseguir quatre anys més tard (Veiga et al., 1987) del primer naixement al món (Trounson et al., 1983). Des de llavors les diferents tècniques han anat evolucionant i han donat lloc lloc a la consecució d’embarassos a partir d’embrions en diferents estadis embrionaris: zigots, embrions primerencs i blastocists. S’han obtingut embarassos a partir dels diferents estadis embrionaris, tant amb la congelació lenta com amb la vitrificació. Per dur a terme la criopreservació dels embrions és necessari el consentiment dels dos membres de la parella, i han de definir el destí dels embrions criopreservats. Indicacions — La preservació per a futures transferències. — Criopreservació de la totalitat dels embrions pel risc de desenvolupar la síndrome d’hiperestimulació ovàrica (SHO). — La congelació de la totalitat dels embrions o zigots en programes de donació d’oòcits quan no és possible sincronitzar la donant i la receptora. Eficiència La criopreservació d’embrions i zigots permet decidir la transferència en fresc d’un nombre adequat d’embrions, i ofereix

al mateix temps la possibilitat de fer nous intents si hi ha embrions sobrants, sense la necessitat de realitzar un nou cicle complet de FIV. L’eficiència en els cicles de criotransferència és determinant per obtenir bones taxes d’embaràs acumulat per cicle. El mètode de fecundació (FIV o ICSI) sembla que no influeix en els resultats de la criotransferència, independentment de l’estadi embrionari. Zigots La congelació de pronuclis no és habitual en els centres de reproducció assistida, ja que no permet la selecció morfològica dels millors embrions el dia de la transferència en fresc. A l’Institut Universitari Dexeus la criopreservació de pronuclis es realitza en les donacions d’oòcits en les quals no és possible sincronitzar la donant i la receptora. Fent una revisió dels resultats del centre entre els anys 2002 i 2007, les taxes de supervivència se situen en el 86,5 %, amb unes taxes d’embaràs per transferència del 41,7 %. Se situen un 10 % per sota de les taxes d’embaràs en cicles de donació d’oòcits, en què la transferència es realitza en fresc (registre SEF 2004). En les transferències de zigots congelats/descongelats és importantíssima l’avaluació dels embrions després del cultiu overnight. En el moment de la transferència s’avaluen morfològicament amb els mateixos criteris que es tenen amb embrions en fresc en el D+2. Embrions primerencs S’han publicat nombrosos articles (Edgar et al., 2007; Salumets et al., 2006) en els quals s’evidencia la influència de diferents factors embriològics en el potencial d’implantació: — La qualitat de l’embrió en fresc abans

244 M. Solé, M. Boada i A. Veiga

de la criopreservació. Sobretot el temps i el ritme de divisió i la simetria de les cèl·lules. — El percentatge de cèl·lules supervivents. — La reactivació de la mitosi després del cultiu overnight. No s’ha demostrat cap relació entre el dia de desenvolupament (D+2 vs. D+3) i les taxes de supervivència o embaràs. En el registre de SEF de 2004 les taxes d’embaràs se situen en el 27,5 %, enfront del 37,3 % dels cicles en fresc. En una metaanàlisi publicada recentment s’obtenen unes taxes de supervivència embrionària molt superiors amb la vitrificació respecte a la congelació lenta (Loutradi et al., 2008). És necessari realitzar estudis prospectius per poder determinar quin és el millor mètode per a la criopreservació d’embrions primerencs. Blastocists Hi ha poca casuística al respecte. Els factors més determinants en la supervivència són l’estadi en el qual es troba el blastocist (inicials, expandits o hatched) i la seva qualitat morfològica. Com més expandit és el blastocist més possibilitats hi ha que es formi gel al seu interior, fet que es tradueix en una menor supervivència. Actualment està molt generalitzat l’ús de la vitrificació per criopreservar aquests embrions. Recentment, alguns grups apunten la possibilitat de col·lapsar el blastocist prèviament a la vitrificació per prevenir la formació de gel en la cavitat blastocèlica (Mukaida et al., 2006). Va reportar unes taxes de supervivència de quasi el 90 % i un 45 % d’embaràs per transferència. La supervivència s’avalua amb un mínim de quatre hores de cultiu per observar si s’ha produït la reexpansió del blastocists. En una publicació recent es comparen els

dos mètodes de criopreservació en blastocists (Liebermann et al., 2006). No troben diferències entre la vitrificació i la congelació lenta en les taxes de supervivència (96,5 % i 92,1 %) ni en les taxes d’embaràs (51,9 % i 53,1 %). Sí que obtenen taxes d’embaràs més elevades transferint blastocist de D+5 enfront dels criopreservats en el D+6, sense que les diferències siguin significatives (31,3 % i 45,4 %). Els blastocists procedents de cicles de diagnòstic genètic preimplantacional (DGP) mostren una major sensibilitat al procés de criopreservació. La causa més probable és la manipulació prèvia a la qual s’han sotmès per poder realitzar l’extracció d’un o més blastòmers. La dificultat d’obtenir embrions genèticament normals i aptes per a la criopreservació en els cicles de DGP fa que sigui de gran importància tenir un bon programa de criopreservació que ens ajudi a augmentar la taxa d’embaràs acumulat. S’han reportat resultats molt pobres en criopreservació d’embrions biopsiats, tant en estadis primerencs com en estadis de blastocist, mitjançant la tècnica de congelació lenta. En els últims anys s’han obtingut bons resultats aplicant la tècnica de vitrificació. Hi ha poques publicacions sobre vitrificació d’embrions biopsiats. El primer naixement a partir d’un blastocist vitrificat després d’un DGP va ser publicat l’any 2007 (Parriego et al., 2007). Una sèrie més llarga ha estat publicada poc temps més tard, en què es mostren unes taxes de supervivència que romanen baixes, però amb unes taxes d’embaràs per transferència del 44 % (Escribá et al., 2007). La vitrificació és la tècnica escollida en la majoria de centres, tot i que s’han d’optimitzar els protocols per millorar, sobretot, les taxes de supervivència.

Criopreservació i tècniques de reproducció assistida 245

CRIOPRESERVACIÓ D’OÒCITS L’aplicació clínica de la criopreservació d’oòcits no s’ha generalitzat fins ben entrat el segle xxi, pel baix rendiment que oferien els diferents protocols. Diferents factors han estat claus per centrar l’interès dels científics a millorar la tècnica. D’una banda, les lleis restrictives d’alguns països com Itàlia, on només es permet inseminar un màxim de tres oòcits, amb l’única alternativa de criopreservació dels oòcits restants. D’altra banda, la possibilitat de crear bancs d’oòcits tant per a donació com per a les pacients que tenen compromesa la seva fertilitat (edat, càncer, etc.). La criopreservació d’oòcits en ratolí es remunta a l’any 1977, any el qual es va poder obtenir descendència sana. No es va aplicar en humans fins a mitjan anys vuitanta. Inicialment la tècnica tenia una baixíssima eficiència. No solament per mancances de la tècnica mateixa: l’enduriment de la zona pel·lúcida feia que les taxes de fecundació fins a l’aparició de l’ICSI fossin molt baixes. En els primers deu anys, des del primer embaràs el 1986 (Chen et al., 1987), només es van obtenir cinc nens nascuts sans a partir d’oòcits criopreservats. En els primers anys la tècnica de criopreservació utilitzada era la congelació lenta. El primer naixement amb vitrificació va ser el 1999 (Kuleshova et al., 1999). Indicacions — Prèviament a determinats tractaments de malalties oncològiques. Els agents alquilants i la radiació ionitzant poden produir una fallida ovàrica prematura i deixar la pacient estèril. També s’inclouen algunes cirurgies. — En els casos en els quals la criopreservació d’embrions representa un problema

ètic per a la parella. En aquests casos l’única solució és la inseminació d’un nombre determinat d’oòcits. — Casos esporàdics en els quals no és possible disposar de la mostra d’esperma en el dia de la punció fol·licular. — La creació de bancs d’oòcits simplifica en gran mesura els programes de donació i facilita les tasques de selecció de la donant i l’assignació de donant/receptora. També permet garantir i estandarditzar el nombre d’oòcits. — Dóna la possibilitat de planificar la maternitat posposant-la fins al moment desitjat. Aquesta nova opció permetria conciliar el desig reproductiu amb les necessitats socials. Aquest punt genera debat en la societat actual. Eficiència Les característiques de l’oòcit fan que sigui una cèl·lula difícil de criopreservar adequadament. Els oòcits són extremadament fràgils i sensibles a les baixes temperatures a causa d’una mida molt gran, la forma esfèrica (baixa superfície i gran volum), l’alt contingut d’aigua, l’efecte deleteri en les gotes lipídiques, mitocondris i citosquelet, i la presència de la placa meiòtica. El problema de la presència de la placa metafàsica s’ha intentat resoldre criopreservant els oòcits immadurs, però la dificultat està, llavors, en la maduració in vitro. Actualment es tendeix a criopreservar els oòcits madurs, en metafase ii. Recentment s’han publicat nombrosos articles amb resultats encoratjadors que han fet que la tècnica es generalitzi com a pràctica clínica habitual, tot i que de moment en cap cas hauria de substituir la criopreservació d’embrions sempre que aquesta sigui possible. Les dades publicades en els últims anys

246 M. Solé, M. Boada i A. Veiga

mostren que el procés de criopreservació d’oòcits és viable, amb el resultat d’un gran nombre de nens sans (> 200) sense que s’hagi atribuït cap malaltia derivada de la tècnica. En l’única metaanàlisi publicada fins al moment (Oktay et al., 2006) queda palès que els resultats en la criopreservació d’oòcits encara no són comparables als resultats dels cicles amb oòcits en fresc ni amb la criopreservació d’embrions. En la metaanàlisi es compara l’eficiència de la criopreservació d’oòcits amb la congelació lenta i la vitrificació. Pel que fa a la congelació lenta, en estudis publicats als EUA les taxes d’implantació presentades mostren un 15,9 %. La taxa d’embaràs per oòcit congelat es manté baixa, un 3,2 %. Mitjançant la tècnica de vitrificació els resultats mostren una millora significativa a partir de l’any 2005 a causa d’una sèrie de modificacions que es van introduir en els protocols. La taxa d’implantació va passar del 8,8 % a un 20,5 %, i l’eficiència per oòcit vitrificat es va situar en el 6 % (el doble que en la congelació lenta). Hi ha altres revisions que mostren també una eficiència superior en la utilització de la vitrificació enfront dels diferents protocols emprats per la congelació lenta (Gook et al., 2007).

càncer urgentment. En conseqüència, l’única opció possible en aquests casos seria la criopreservació de teixit ovàric, mentre que la pràctica d’un cicle de fecundació in vitro (FIV) amb criopreservació d’oòcits queda relegada únicament a pacients sense aquestes limitacions. L’objectiu de la tècnica és la preservació de la fertilitat en pacients oncològiques, amb malalties autoimmunitàries o per la necessitat d’una cirurgia. Els tractaments antineoplàsics, sobretot els alquilants i la radiació ionitzant, produeixen gonadotoxicitat i donen lloc a una fallada ovàrica prematura. La gonadotoxicitat està relacionada amb l’edat, l’agent terapèutic i la dosi. Presenta diversos avantatges respecte a la congelació d’oòcits: — Hi ha una gran quantitat de fol·licles primordials en el còrtex ovàric. — És probable que els fol·licles primordials siguin menys sensibles a la criopreservació, pel seu baix metabolisme. — En descongelar i reintroduir en el cos de la pacient està demostrada la restauració de la funció endocrina. — No es depèn del cicle menstrual ni requereix l’estimulació ovàrica.

CRIOPRESERVACIÓ DE TEIXIT OVÀRIC

És una tècnica realitzada amb èxit en diferents models animals, però existeixen resultats molt limitats en humans. La tècnica consisteix en la criopreservació de petits segments del còrtex ovàric per poder-lo descongelar posteriorment i trasplantarlo en el mateix ovari (ortotòpic) o en una altra localització (heterotòpic). La part utilitzada per a la criopreservació és el còrtex, ja que conté un major nombre de fol·licles primordials. Perquè sigui possible l’accés dels crioprotectors al teixit, és important fer talls fins del còrtex amb una mida de 2 mm

L’estimulació hormonal permet obtenir un nombre elevat d’oòcits madurs i augmenta les probabilitats futures d’aconseguir un embaràs. No obstant això, en moltes pacients oncològiques, l’estimulació hormonal pot estar contraindicada, ja que existeixen un gran nombre de tumors dependents d’hormones, o no es disposa del temps suficient per dur-la a terme, ja que hi ha la necessitat d’instaurar el tractament contra el

Metodologia

Criopreservació i tècniques de reproducció assistida 247

de gruix. Una petita mostra del teixit a criopreservar ha de ser analitzada per un especialista, per detectar la presència de cèl· lules canceroses. Eficiència La supervivència del teixit dependrà del procés de criopreservació i també d’una revascularització correcta del teixit un cop trasplantat. Un dels principals problemes és la pèrdua de fol·licles primordials després del trasplantament. Aquesta pèrdua és deguda al procés de congelació/descongelació (al voltant del 7 %) i a la hipòxia pel retard que es produeix fins a la revascularització. En la literatura es fan referència a valors entre el 50 % i més del 90 % (Nisolle et al., 2000), fet que es veu reflectit pels nivells de l’hormona fol·liculoestimulant (alts) i la inhibina B (baixos). La restauració endocrina és de curta durada, i per això s’aconsella que el trasplantament es faci just en el moment en el qual es tingui desig reproductiu. Només s’han reportat quatre embarassos a partir de teixit ovàric criopreservat (Oktay et al., 2004). En un dels quatre casos la concepció va ser espontània. A més de la baixa casuística existent, és important tenir en compte el perill potencial que suposa la possible reintroducció de teixit cancerigen en la pacient. Per aquest motiu, també s’estan desenvolupant mètodes de maduració dels oòcits trasplantant el teixit entre espècies (xenotrasplantaments). BIBLIOGRAFIA Chen, C. (1986). «Pregnancy after human oocyte cryopreservation». Lancet, 1: 884-886. Edgar, D.; Archer, J.; Mcbain, J.; Bourne, H. (2007). «Embryonic factors affecting outcome from single

cryopreserved embryo transfer». Reproductive BioMedicine Online, 14: 718-723. Escribá, M. J.; Zulategui, J. F.; Galán, A.; Mercader, A., Remohí, J.; Santos, M. J. de los (2008). «Vitrification of preimplantation genetically diagnosed human blastocysts and its contribution to the cumulative ongoing pregnancy rate per cycle by using a closed device». Fertil. Steril., 89: 840-846. Fuller, B.; Paynter, S. (2004). «Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine». Reproductive BioMedicine Online, 9: 680-691. Gook, D. A.; Edgar, D. H. (2007). «Human oocyte cryopreservation». Human Reprodution Update, 13: 591605. Kasai, M. (2002). «Advances in the cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: development of ultra rapid vitrification». Reprod. Med. Biol., 1: 1-9. Kasai, M.; Komi, J. H.; Takakamo, A.; Tsudera, H.; Sakurai, T.; Machida, T. (1990). «A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability». J. Reprod. Fertil., 89: 91-97. Kuleshova, L.; Gianaroli, L.; Magli, C.; Ferraretti, A.; Trounson, A. (1999). «Birth following vitrification of a small number of human oocytes: case report». Human Reproduction, 14: 3077-3079. Kuwayama, M. (2006). «Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method». Theriogenology, 67: 73-80. Loutradi, K. E.; Kolibianakis, E. M.; Venetis, C. A.; Papanikolaou, E. G.; Pados, G.; Bontis, I.; Tarlatzis, B. C. (2008). «Cryopreservation of human embryos by vitrification or slow freezing: a systematic review and meta-analysis». Fertil. Steril., 90: 186-193. Luyet, B. J. (1934). «Working hypotheses on the nature of life». Biodynamica, 1: 1-7. Mazur, P. (1984). «Freezing of living cells: mechanisms and implications». Am. J. Physiol., 247: C12542. Mazur, P.; Cole, K. W.; Hall, J. W.; Schreuders, P. D.; Mahowald, A. P. (1992). «Cryobiological preservation of Drosophila embryos». Science, 258: 19321935. Nisolle, M.; Casanas-Roux, F.; Qu, J.; Motta, P.; Donnez, J. (2000). «Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian xenografts in nude mice». Fertil. Steril., 74: 122-129. Oktay, K.; Cil, A. P.; Bang, H. (2006). «Efficiency of oocyte cryopreservation: a meta-analysis». Fertil. Steril., 86: 70-80. Oktay, K.; Tilly, J. (2004). «Livebirth after cryopre-

248 M. Solé, M. Boada i A. Veiga

served ovarian tissue autotransplantation». Lancet, 364: 2091-2092. Parriego, M.; Solé, M.; Aurell, R.; Barri, P. N.; Veiga A. (2007). «Birth after transfer of frozen-thawed vitrified biopsied blastocysts». J. Assist. Reprod. Genet., 24: 147-149. Pegg, D. E. (1987). «Mechanisms of freezing damage». Symp. Soc. Exp. Biol, 41: 363-378. Polge, C.; Smith, A. U.; Parkes, A. S. (1949). «Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures». Nature, 164: 666. Salumets, A.; Suikkari, A. M.; Mäkinen, S.; Karro, H.; Roos, A.; Tuuri, T. (2006). «Frozen embryo transfers: implications of clinical and embryological factors on the pregnancy outcome». Human Reprodution, 21: 2368-2374. Shaw, J. M.; Jones, G. M. (2003). «Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos». Human Reproduction Update, 9: 583-605. Sherman, J. K.; Bunger, R. G. (1953). «Observations on preservation of human spermatozoa at low temperatures». Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 82: 686-688. Trounson, A.; Mohr, L. (1983). «Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo». Nature, 305: 707-709. Tucker, M. J.; Liebermann, J. (2007). Vitrification in assisted reproduction. Londres: Informa Healthcare. US Department of Health & Human Services (1999).

Laboratory biosafety manual. 4a ed. Washington: National Institute of Health. Vatja, G.; Holm, P.; Kuwayama, M.; Booth, P. J.; Jacobsen, H.; Greve, T.; Callesen, H. (1998). «Open Pulled Straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos». Mol. Reprod. Dev., 51: 53-58. Vatja, G.; Nagy, Z. P. (2006). «Are programmable freezers still needed in the embryo laboratory? Review on vitrification». Reproductive BioMedicine Online, 12: 779-796. Veiga, A.; Calderon, G.; Barri, P. N.; Coroleu, B. (1987) «Pregnancy after the replacement of a frozen-thawed embryo with less than 50% intact blastomeres». Human Reproduction, 2: 321-323. Whittingham, D. G.; Leibo, S. P.; Mazur, P. (1972). «Survival of mouse embryos frozen to –196 degrees and –269 degrees C». Science, 178: 411-414. Wilmut, I. (1972). «The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing». Life Sci. I. I., 11: 1071-1079. Woodruff, T. K.; Snyder, K. A. (2007). Oncofertility, fertility preservation for cancer survivors. Nova York: Springer. Zeilmaker, G. H.; Alberda, A. T.; Gent, I. van; Rijkmans, C. M.; Drogendijk, A. C. (1984). «Two pregnancies following transfer of intact frozen-thawed embryos». Fertil. Steril., 42: 293-296.

DOI: 10.2436/20.1501.02.72

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 249-261

DERIVACIÓ DE LÍNIES DE CÈĿLULES MARE EMBRIONÀRIES A PARTIR DE BLASTÒMERS AÏLLATS Sheyla González, Nuno Costa-Borges, Elena Ibáñez i Josep Santaló Departament de Biologia Cel·lular, Fisiologia i Immunologia, Unitat de Biologia Cel·lular, Universitat Autònoma de Barcelona. Adreça per a la correspondència: Sheyla González. Unitat de Biologia Cel·lular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona. Campus de Bellaterra. 08193 Bellaterra. Adreça electrònica: sheyla.gonzalez@uab.cat. RESUM La derivació de cèl·lules mare embrionàries (ESC) s’ha fet tradicionalment a partir de la massa cel·lular interna (ICM) de l’embrió en estadi de blastocist. Però aquesta estratègia, que comporta la destrucció de l’embrió, ha generat un intens debat ètic en el cas de l’espècie humana. En aquest sentit, diferents grups han intentat establir ESC a partir de blastòmers aïllats d’estadis embrionaris previs al blastocist. Però les dades són encara escasses i les freqüències de derivació fins al moment són relativament baixes. En aquest treball es pretén fer una revisió de l’estat de l’establiment de línies d’ESC a partir de cèl·lules aïllades i presentar els resultats de la comparació de tres mètodes de derivació. En el nostre estudi s’han derivat ESC a partir de blastòmers procedents d’embrions de ratolí 129/SV × C57Bl/6 F1 en estadis de quatre i vuit cèl·lules. També es van fer servir embrions en estadi de mòrula i blastocist, aquest últim emprat com a control positiu. Els resultats obtinguts han permès determinar que el mètode de derivació més eficient és el mètode de cultiu en medi definit, i que existeix una important influència de l’estadi embrionari i del nombre de blastòmers aïllats en cadascun dels mètodes emprats. Paraules clau: ESC, massa cel·lular interna, blastocist, blastòmers. DERIVATION OF EMBRYONIC STEM CELL LINES FROM ISOLATED BLASTOMERES SUMMARY Embryonic stem cells (ESC) are usually derived from the inner cell mass (ICM) of an embryo at the blastocyst stage. However, this strategy involves the destruction of the embryo

250 S. González, N. Costa-Borges, E. Ibáñez i J. Santaló

and has generated a great controversy in the case of the human species. In this sense, different groups have tried to derive ESC from isolated blastomeres of embryonic stages previous to blastocyst. But there is still very few data and the frequencies of ESC derivation obtained until now are low. In this study we present a review about the status of ESC derivation from isolated blastomeres and we report the results obtained with three methods of derivation. ESC lines have been derived from 4- and 8-cell SV129 × C57Bl/6 F1 mouse blasto meres. Morula and blastocyst stages were also used, the later as a positive control. Results obtained have allowed us to determine that the most efficient method is the culture in defined medium and that there is an important influence of the embryonic stage and the number of isolated blastomeres on the derivation of ESC by the three methods applied. Key words: ESC, inner cell mass, blastocyst, blastomeres. INTRODUCCIÓ S’ha proposat que les cèl·lules mare (stem cells, SC) poden tenir un paper crucial per reconstituir teixits o òrgans danyats, per produir fragments d’òrgans o fins i tot òrgans sencers ex vivo. Existeixen diferents tipus de SC, que es distingeixen segons el seu potencial de diferenciació. En els mamífers es considera que el zigot i els blastòmers dels estadis embrionaris més primerencs són totipotents, és a dir, tenen la capacitat de generar tots els tipus cel·lulars de l’organisme, incloent-hi teixit extraembrionari. Per contra, les cèl·lules mare embrionàries (ESC) de ratolí derivades a partir de la massa cel·lular interna (ICM) de l’embrió en estadi de blastocist es consideren pluripotents, ja que poden donar lloc a teixits de l’embrió in vivo i in vitro, però no poden produir teixit extraembrionari. Aquest fet s’ha demostrat en experiments de formació de quimeres per la incapacitat de les ESC de ratolí, a diferència de les humanes, per colonitzar el trofectoderma en ser injectades en el blastocist, i és que el trofectoderma en ratolí es forma simultàniament o fins i tot abans que la ICM del blastocist. D’altra banda, les cèl·lules mare adultes (ASC) poden ser multipotents o unipotents. Les ASC multipotents tenen l’habilitat de formar múltiples tipus cel·lulars

provinents d’un llinatge cel·lular amb una funció específica, ja sigui endoderma, mesoderma o ectoderma. En són un exemple les cèl·lules mare hematopoètiques. En canvi, les cèl·lules mare unipotents només poden donar lloc a un tipus cel·lular concret d’un llinatge cel·lular, com per exemple les cèl·lules epitelials intestinals. La utilització de cèl·lules somàtiques indiferenciades com a font d’ASC s’ha considerat com a possible substitució a l’ús d’embrions per a la producció d’ESC. Però existeixen substancials problemes amb la manipulació de les ASC. Les SC de teixits adults són difícils d’aïllar, de caracteritzar i tenen una plasticitat o potencialitat limitada, és a dir, no poden donar lloc a tots els teixits de l’embrió. A causa de la seva elevada capacitat d’autorenovació i del gran potencial regeneratiu, les ESC, en especial, han generat molt interès com a model en biologia del desenvolupament i, a més, es consideren una nova alternativa en el camp de la medicina regenerativa. El fet que tinguin una capacitat il·limitada d’autorenovació fa que puguin proliferar indefinidament sense entrar en senescència. Són cèl·lules sense funcions especialitzades i que, per tant, es troben en un estat indiferenciat i, a més, poden donar lloc a diferents tipus cel·lulars de les tres capes embrionàries i fins i tot a teixit extraem-

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries a partir de blastòmers aïllats 251

brionari, en el cas de les ESC humanes, en un procés anomenat diferenciació. A començaments dels anys vuitanta es va desenvolupar la primera tècnica d’establiment d’ESC pluripotents a partir d’embrions de ratolí (Evans i Kaufman, 1981; Martin, 1981). Aquesta tècnica consistia a cocultivar les cèl·lules de la ICM de l’embrió amb fibroblasts de ratolí de la línia STO inactivats amb mitomicina C (feeder cells). Des de llavors hi ha hagut nombrosos grups que han aconseguit derivar ESC a partir de la ICM d’embrions de ratolí (Brook i Gardner, 1997) i humans (Thomson et al., 1998) en estadi de blastocist, però aquesta pràctica produeix ESC que no són totipotents. A més, ha generat una gran controvèrsia ètica, ja que per obtenir-les és necessari destruir l’embrió a partir del qual deriven. Paral·lelament es va iniciar l’establiment de les línies d’ESC a partir d’estadis embrionaris previs al blastocist. Així, Eistetter (1989) va desenvolupar línies d’ESC de ratolí a partir de l’estadi embrionari de mòrula. Delhaise et al. (1996) també van establir línies d’ESC de ratolí, però en aquest cas a partir d’embrions en estadi de vuit cèl·lules. Tesar (2005) va derivar ESC de ratolí a partir de diferents estadis embrionaris previs al blastocist, i va introduir una variació en el mètode de derivació. Finalment, pel que fa a ESC humanes, Strelchenko et al. (2004) van aconseguir desenvolupar per primer cop línies d’ESC a partir d’embrions en estadi de mòrula. D’altra banda, diferents grups han intentat derivar ESC a partir de blastòmers aïllats (Chung et al., 2005, 2008; Klimanskaya et al., 2006; Wakayama et al., 2007). Ara bé, encara no se sap quin és el nombre mínim de blastòmers que s’han d’aïllar per tenir una eficàcia raonable d’obtenció de línies estables d’ESC, ja que en la majoria d’estudis les freqüències encara són relativament baixes. A més, també seria necessari determinar quin

és l’estadi embrionari més eficient i les condicions tècniques i de cultiu més adients. Generació d’ESC a partir de blastòmers aïllats La producció d’ESC a partir de blastòmers aïllats sorgeix en resposta al debat ètic i moral suscitat arran de la utilització d’embrions sencers per derivar ESC i es basa en els coneixements sobre les tècniques de diagnòstic genètic preimplantacional. En aquest tipus d’estudis es retiren un o dos blastòmers de l’embrió de 6-8 cèl·lules per a l’anàlisi, i la resta de l’embrió es desenvolupa in vitro normalment fins a la transferència (Veiga et al., 1994). És un fet ben conegut que la retirada d’un nombre reduït de blastòmers de l’embrió preimplantacional humà no n’afecta la viabilitat ni la capacitat d’implantació, sempre que aquest nombre es mantingui dins d’uns límits raonables (Parriego et al., 2003). D’altra banda, se sap que l’embrió humà és viable i capaç de portar a terme un embaràs normal sempre que es mantingui com a mínim la meitat de l’embrió intacte (Veiga et al., 1987). Atès que l’eficiència de derivació de les ESC a partir de blastòmers aïllats és més baixa que a partir d’embrions sencers, en els darrers anys s’ha intentat determinar quines són les condicions més favorables perquè aquestes línies es mantinguin en un estat indiferenciat in vitro, de manera que es pugui incrementar així la seva eficiència de derivació. Concretament, s’han introduït variacions en el cultiu i en la tècnica de derivació respecte al mètode tradicional de cultiu d’ESC en un medi suplementat amb FCS i factor inhibidor de la leucèmia (LIF), que impedeix la diferenciació espontània de les ESC (Eistetter, 1989). Així, l’any 2005 Chung et al. van descriure un mètode consistent a agrupar els

252 S. González, N. Costa-Borges, E. Ibáñez i J. Santaló

blastòmers aïllats d’embrions de ratolí amb ESC preexistents marcades amb proteïna fluorescent verda (green fluorescent protein, ESC-GFP). Posteriorment, Klimanskaya et al. (2006) van derivar línies d’ESC humanes a partir de blastòmers aïllats en un medi condicionat per factors procedents d’ESC preexistents però sense que es produïssin contactes entre aquests. Wakayama et al. (2007) han derivat ESC de ratolí amb una altra variació en el mètode de cultiu que fa més eficient la derivació. Concretament, substitueixen el sèrum fetal boví (FCS) per knockout serum replacement (KSR) al medi de cultiu, ja que el primer conté factors diferenciadors, com per exemple el complement, que fan perdre la pluripotència de les ESC. També introdueixen l’hormona adenocorticòtropa (ACTH), que afavoreix el cultiu a partir d’un únic blastòmer i d’una sola ESC sense perdre la pluripotència. Aquest mètode ha donat eficiències de derivació fins i tot més elevades que l’agregació amb ESC preexistents. Recentment, Chung et al. (2008) han comparat l’eficiència de derivació de línies d’ESC humanes a partir de l’agregació de blastòmers amb ESC-GFP i a partir de blastòmers aïllats cultivats en un medi que conté laminina i fibronectina. Arriben a la conclusió que en la derivació de les línies és més important l’addició de laminina i que, per tant, el cocultiu amb ESC-GFP no és essencial. Es considera que la laminina interromp les unions estretes i despolaritza les cèl·lules, de manera que fa que les ESC que s’estan formant assumeixin un fenotip d’ICM, i s’evita així la derivació envers trofectoderma. Una altra alternativa introduïda recentment és la utilització de medis definits que, a més, eliminen la necessitat d’emprar feed er cells en cocultiu amb les ESC (Ying et al., 2003). Aquests nous medis també permetrien eliminar la variabilitat de factors aportats per les feeder cells que no podem contro-

lar i que podrien estar afavorint la diferenciació. Un altre aspecte important en la derivació a partir de cèl·lules aïllades i que encara és poc conegut és la competència dels blastòmers individuals procedents d’estadis embrionaris primerencs. Diferents estudis semblen indicar que només un dels dos blastòmers de l’embrió de dues cèl·lules de ratolí és capaç de portar a terme un desenvolupament normal i donar lloc a un nou individu (Papaioannou et al., 1989). Durant molts anys s’han considerat els blastòmers d’estadis embrionaris primerencs com a pluripotents, i no com a totipotents. La qüestió actual és si el desenvolupament d’un blastòmer concret dóna lloc a massa cel·lular interna o trofectoderma. Se sap que en l’estadi de dues cèl·lules una contribueix més a la part embrionària del blastocist i l’altra cèl·lula a la part extraembrionària (Gardner, 2001; Fujimori et al., 2003). A més, la localització dels blastòmers en l’estadi de quatre cèl·lules també s’ha determinat com a un factor important en el destí envers la ICM o el trofectoderma (Piotrowska-Nitsche et al., 2005). Així, diferències en la posició dels blastòmers en l’estadi de dues i quatre cèl· lules podrien estar indicant el futur destí dels blastòmers envers ICM o trofectoderma ja en estadis primerencs del desenvolupament. Tenint en compte que només una part dels blastòmers poden contribuir a la derivació, les freqüències de derivació a partir d’embrions en estadis primerencs són baixes. La recent derivació de línies d’ESC a partir de l’estadi de dues cèl·lules per part de Wakayama et al. (2007), amb una eficiència d’aproximadament el 50 %, suggereix que només un dels dos blastòmers contribueix a l’establiment. Així, concretament en l’estadi de dues cèl·lules, és molt important determinar si la biòpsia a l’atzar d’un blastòmer per derivar les línies d’ESC pot com-

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries a partir de blastòmers aïllats 253

prometre la viabilitat de l’embrió del qual procedeix, o si, per contra, tots els blastòmers són equivalents pel que fa al seu potencial de desenvolupament. En el nostre laboratori estem treballant en el desenvolupament d’ESC de ratolí a partir de blastòmers aïllats d’estadis embrionaris previs a blastocist utilitzant tres mètodes diferents de derivació que combinen variacions en les condicions i en la tècnica de cultiu. Amb això pretenem incrementar la pluripotencialitat, millorar el rendiment i les capacitats regeneratives de les línies obtingudes i evitar la destrucció d’embrions, fet especialment important en parlar d’embrions humans. A més, també volem estudiar la influència del nombre de blastòmers aïllats i de l’estadi embrionari en l’establiment de les línies d’ESC.

Figura 1. a-b) Biòpsia embrionària d’un blastòmer en l’estadi de quatre cèl·lules. c-d). Grups de blastòmers a partir dels quals es va portar a terme la derivació de les ESC en l’estadi de quatre i vuit cèl·lules, respectivament.

COMPARACIÓ DE TRES MÈTODES DE DERIVACIÓ D’ESC La derivació de les ESC es va portar a terme a través d’embrions procedents de l’encreuament de femelles 129/Sv amb mascles C57Bl/6, que van ser cultivats in vitro fins que van assolir els estadis de quatre i vuit cèl·lules, moment en el qual es va procedir a aïllar els blastòmers mitjançant biòpsia embrionària per micromanipulació (vegeu la figura 1). La derivació també es va portar a terme a partir d’embrions sencers en estadi de mòrula i blastocist, aquest últim emprat com a control positiu de la derivació. En el primer mètode de derivació, el mètode estàndard, es van emprar les condicions estàndards de cultiu d’ESC. Els blastòmers aïllats, mòrules o blastocists, se sembraren sobre una monocapa de feeder cells procedents de la inactivació de la línia STO de fibroblasts de ratolí amb mitomicina C i es van cultivar en Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), suplementat amb FCS i LIF. A partir d’aquest mètode s’han establert un total de vint-i-sis colònies d’ESC amb cent setanta-tres embrions (15 %). En tots els mètodes les ESC han estat caracteritzades en primera instància morfològicament, i, posteriorment, per immunofluorescència mitjançant la detecció dels marcadors d’indiferenciació Oct4, Sox2 i Nanog. Entre les colònies amb una morfologia típica d’ESC obtingudes amb el mètode estàndard, un 81,3 % van resultar positives per als tres marcadors (vegeu la figura 2). Pel que fa a la influència de l’estadi embrionari en aquest mètode de derivació, s’ha vist que existeixen diferències estadísticament significatives en comparar l’eficiència de derivació de les ESC procedents de l’estadi de quatre cèl·lules respecte de les que provenen de l’estadi de vuit cèl·lules (P = 0,025, test de la χ2; valors significatius,

254 S. González, N. Costa-Borges, E. Ibáñez i J. Santaló

P < 0,05). A més, s’ha pogut observar que la derivació és més eficient a partir de l’estadi de mòrula en comparació d’estadis previs a la compactació (P = 0,004 per a la comparació amb l’estadi de quatre cèl·lules i P = 0,016 amb l’estadi de vuit cèl·lules). En canvi, no s’han observat diferències significatives en comparar l’estadi de vuit cèl·lules o de mòrula amb el de blastocist, emprat com a control positiu en la derivació de les ESC. Quant al nombre de blastòmers aïllats, en l’estadi de quatre cèl·lules no s’han observat diferències significatives en aïllar una o dues cèl·lules. En l’estadi de vuit cèl· lules, en canvi, s’observa que a mesura que augmenta el nombre de blastòmers aïllats, incrementa significativament l’eficiència de derivació fins a arribar al grup de 3/8 (P = 0,05 respecte el grup de 2/8). Els resultats d’aquest mètode es mostren a la figura 3. El segon mètode de derivació emprat va ser el mètode d’adhesió prèvia de blastòmers, en el qual els blastòmers aïllats, mòrules o blastocists van ser adherits a la placa de cultiu mitjançant una incubació amb

Figura 2. a-b) Exemples de colònies d’ESC derivades a partir dels grups de 2/8 i 4/8 respectivament. c-d) ESC positives per a la detecció de Sox2 i Oct4, respectivament.

una solució sense proteïnes, i posteriorment es va introduir la suspensió de feeder cells. El medi de cultiu emprat per a aquest mètode va ser el mateix que per al mètode anterior. Amb aquest mètode s’han establert un total de dinou colònies a partir de cent trenta-vuit embrions (13,8 %). Per immunofluorescència han resultat positives un 82,6 % d’aquestes colònies. A diferència de l’anterior mètode, no es van detectar diferències significatives en l’eficiència de derivació fins a l’estadi de mòrula, de manera que no s’observa un efecte tan progressiu en l’augment de l’eficiència de derivació a partir de l’estadi de quatre o vuit cèl·lules. Així, veiem com apareixen diferències significatives en comparar l’eficiència en quatre cèl·lules respecte de mòrula i blastocist (P = 0,0431 i P = 0,0117, respectivament) i el mateix per a l’estadi de vuit cèl·lules (P = 0,0234 i P = 0,0052, respectivament). Com en el mètode anterior, l’estadi de mòrula tampoc no ha mostrat una eficiència significativament diferent de l’estadi control de blastocist. Pel que fa al nombre de blastòmers aïllats, no s’han trobat diferències en aïllar un o dos blastòmers d’embrions de quatre cèl·lules ni tampoc en comparar els diferents grups de blastòmers en l’estadi de vuit cèl·lules. Malgrat això, es pot veure que tant en l’estadi de quatre com en el de vuit cèl·lules, en els grups amb un nombre de cèl· lules més reduït apareixen diferències significatives en comparar els percentatges de derivació respecte l’estadi de mòrula i l’estadi control de blastocist (1/4 vs. mòrula, P = 0,018; 1/4 vs. blastocist, P = 0,004; 1/8 vs. mòrula, P = 0,025; 1/8 vs. blastocist, P = 0,007; 2/8 vs. mòrula, P = 0,04; 2/8 vs. blastocist, P = 0,032). Els resultats d’aquest mètode es poden observar a la figura 4. L’últim mètode d’establiment de línies d’ESC provat va ser el mètode de cultiu en

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries a partir de blastòmers aïllats 255

ra de derivar les línies d’ESC. En canvi, la derivació es torna més eficient en emprar embrions a l’estadi de mòrula, ja que existeixen diferències en comparar aquest estadi amb el de quatre cèl·lules (P = 0,032) i amb el de vuit cèl·lules (P = 0,008). No s’observa un increment en l’eficiència de derivació de les línies en fer servir embrions en l’estadi control de blastocist respecte a l’estadi de mòrula. Pel que fa al nombre de cèl·lules aïllades, no es detecten diferències significatives en aïllar un o dos blastòmers en l’estadi de quatre cèl·lules. Tampoc no s’han trobat diferències significatives en comparar els diferents grups d’aïllament en l’estadi de vuit cèl·lules, malgrat que s’observa una tendèn-

medi definit. Aquest mètode va ser desenvolupat de la mateixa manera que el mètode estàndard, però es van introduir canvis en les condicions de cultiu per tal d’augmentar l’eficiència de derivació de les ESC. Concretament, el medi DMEM es va suplementar amb LIF, KSR i l’hormona ACTH. Amb aquest mètode s’han establert un total de cinquanta-cinc colònies a partir de cent cinquanta embrions (36,7 %). Per immunofluorescència han resultat positives un 98,2 % de les colònies amb una morfologia típica d’ESC. Respecte a la influència de l’estadi embrionari en aquest mètode, no s’han observat diferències significatives en comparar l’estadi de quatre cèl·lules amb el de vuit a l’ho-

Mètode estàndard

% colònies

4 cèl·lules

8 cèl·lules

Estadi 4 cèl·lules

Estadi 8 cèl·lules

% colònies

Mòrula

8 3/

8 4/

Blastocist

u òr

is oc

t as

Figura 3. Resultats del mètode estàndard. Influència de l’estadi embrionari (a) i del nombre de blastòmers aïllats (b) en l’eficiència de derivació de les ESC. L’asterisc indica diferències significatives respecte a la derivació a partir d’embrions sencers (mòrula i blastocist).

256 S. González, N. Costa-Borges, E. Ibáñez i J. Santaló

cia a l’augment de l’eficiència de derivació amb un major nombre de blastòmers aïllats. Així, tant en l’estadi de quatre com de vuit cèl·lules, en comparar els grups amb menys nombre de blastòmers amb els estadis embrionaris de mòrula i blastocist apareixen diferències que en alguns casos són extremadament significatives (1/4 vs. mòrula, P = 0,012; 1/4 vs. blastocist, P = 0,012; 1/8 vs. mòrula, P = 0,0008; 1/8 vs. blastocist, P = 0,0008; 2/8 vs. mòrula, P = 0,003; 2/8 vs. blastocist, P = 0,003). Els resultats d’aquest mètode es poden observar a la figura 5. Així, a partir d’aquest treball es confirma la possibilitat de desenvolupar línies d’ESC de ratolí a partir de blastòmers aïllats d’estadis embrionaris previs a la formació del

blastocist fent servir els tres mètodes d’establiment d’ESC descrits. L’excepció la constituiria el grup d’1/8 en el mètode estàndard, en el qual no s’ha aconseguit obtenir cap línia i que, en general, té una eficiència baixa de derivació. S’han establert línies d’ESC en estadis premòrula amb eficiències relativament elevades, que oscil·len entre l’1,9 % i el 48 %. Des que a mitjan dècada dels anys noranta Delhaise et al. (1996) van descriure per primera vegada l’establiment d’una línia d’ESC de ratolí a partir de blastòmers aïllats, diferents grups han intentat establir línies per incrementar el rendiment del procés. Aquests autors van aconseguir establir una única línia a partir de l’estadi de

Mètode d’adhesió prèvia de blastòmers

% colònies

4 cèl·lules

8 cèl·lules

Estadi 4 cèl·lules

Estadi 8 cèl·lules

% colònies

Mòrula

Blastocist

ula òr

cis

las

Figura 4. Resultats del mètode d’adhesió prèvia de blastòmers. Influència de l’estadi embrionari (a) i del nombre de blastòmers aïllats (b) en l’eficiència de derivació de les ESC. L’asterisc indica diferències significatives respecte a la derivació a partir d’embrions sencers (mòrula i blastocist).

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries a partir de blastòmers aïllats 257

vuit cèl·lules separant els blastòmers per disgregació amb una eficiència de derivació d’un 1,9 %. La línia, però, no va contribuir a la línia germinal dels animals quimèrics obtinguts per injecció de les ESC a la cavitat del blastocist. Això va posar de manifest, ja en aquell any, que l’establiment de línies d’ESC a partir de blastòmers aïllats no era senzill. En el nostre treball no s’ha aconseguit derivar cap línia a partir del grup d’1/8 pel mètode estàndard, que constituiria l’equivalent als experiments de Delhaise et al.. És més, en general la tendència per a aquest grup és d’obtenir unes eficiències de derivació baixes (3 % per al mètode d’adhesió prèvia i 4 % per al mètode de cultiu en medi definit).

Malgrat això, s’ha observat que en augmentar el nombre de blastòmers aïllats incrementa de cop l’eficiència de derivació, i ja amb dos blastòmers aïllats (2/8) s’arriba fins a un 11,1 %, molt superior a la trobada de Delhaise et al.. S’hauran de portar a terme més experiments per determinar el perquè de la baixa eficiència del grup d’1/8, ja que sembla que només el fet del nombre baix de blastòmers no sigui suficient per explicar-ho, tenint en compte que el grup d’1/4 mostra una eficiència relativament elevada amb un únic blastòmer. Els factors que podrien estar-hi involucrats podrien ser, entre d’altres, l’adhesió (Chung et al., 2008) i la comunicació (Todorova et al., 2008) entre blastòmers. Relacionat amb això, els resul-

Mètode de cultiu en medi definit

% colònies

4 cèl·lules

8 cèl·lules

Estadi 4 cèl·lules

Estadi 8 cèl·lules

% colònies

Mòrula

Blastocist

a ul òr

t as

ist

Figura 5. Resultats del mètode de cultiu en medi definit. Influència de l’estadi embrionari (a) i del nombre de blastòmers aïllats (b) en l’eficiència de derivació de les ESC. L’asterisc indica diferències significatives respecte a la derivació a partir d’embrions sencers (mòrula i blastocist).

258 S. González, N. Costa-Borges, E. Ibáñez i J. Santaló

tats preliminars al nostre laboratori mostren que el grup d’1/8 té una eficiència de derivació més baixa, ja que la majoria dels blastòmers aïllats no són capaços de dividir-se en cultiu. L’any 2005 Tesar va introduir un nou mètode d’establiment de línies d’ESC de ratolí, amb el qual va aconseguir augmentar molt l’eficiència de derivació, en especial a partir de l’estadi de mòrula, mitjançant l’adhesió prèvia al substrat. Quan les mòrules s’adherien, l’eficiència augmentava fins al 48 %, molt superior a la tècnica estàndard de cocultiu dels blastocists amb les FSTO (25 %). Tesar suggereix que l’adhesió inicial de les mòrules al substrat fa que el contacte posterior amb les FSTO es produeixi més ràpidament, de manera que la influència indiferenciadora de les FSTO es veuria potenciada abans. Malgrat tot, Tesar només va poder aplicar la seva nova tècnica a l’estadi de mòrula, mentre que per als estadis de quatre i vuit cèl·lules va observar que no s’adherien fins que no assolien l’estadi equivalent a mòrula. A diferència de Tesar, utilitzant el mètode d’adhesió prèvia de blastòmers nosaltres hem aconseguit fixar els blastòmers del estadis embrionaris de quatre i vuit cèl·lules a la placa de cultiu, i hem obtingut eficiències de derivació variables en funció de l’estadi embrionari i del nombre de blastòmers emprat (3-15 %). A més, també hem adherit mòrules però, en aquest cas, amb una eficiència de derivació inferior a la trobada per Tesar (23,8 %), tot i que superior a l’eficiència de la tècnica estàndard de cocultiu dels blastocists amb les FSTO (18,1 %). Per tant, emprant aquest mètode de derivació hem aconseguit augmentar l’eficiència de derivació d’alguns grups, però aquestes diferències no són significatives per a cap dels grups analitzats, i això suggereix que aquesta adhesió prèvia dels blastòmers no aportaria grans beneficis. No ha estat fins recentment que Waka

yama et al. (2007) han desenvolupat el nou mètode de cultiu d’ESC en un medi definit. Van obtenir freqüències elevades de derivació a partir d’un blastòmer en estadis de dues cèl·lules (69 %), quatre cèl·lules primerenc (40 %) i tardà (22 %) i vuit cèl·lules (14 %). Cal destacar que en els nostres experiments a partir del mètode de cultiu en medi definit no s’han derivat ESC a partir de l’estadi de dues cèl·lules. En canvi, en l’estadi de quatre cèl·lules, l’eficiència trobada per al grup d’1/4 ha estat d’un 12 %. No s’ha tingut en compte si l’estadi de quatre cèl·lules era de fases primerenques o més tardanes en el desenvolupament, la qual cosa pot haver fet disminuir l’eficiència global tenint en compte que els autors, com es pot observar, troben l’eficiència més gran en estadis més primerencs. En l’estadi de vuit cèl·lules, Wakayama et al. obtenen una eficiència del 14 %, mentre que en els nostres experiments ha estat del 4 %, eficiència que continua sent baixa en coherència amb la trobada amb la resta de mètodes de derivació emprats. Wakayama et al., a partir de l’anàlisi dels seus resultats, troben una eficiència major de derivació d’ESC en estadis més primerencs del desenvolupament. Ja que alguns autors apunten al fet que la diferenciació en el procés d’embriogènesi comença ja en l’estadi de 2-4 cèl·lules (Gardner, 2001), seria lògic pensar que els estadis més primerencs tindrien una major eficiència a l’hora de produir ESC, mentre que els estadis més tardans tindrien una major tendència a diferenciar i, per tant, l’obtenció de línies d’ESC es produiria menys eficientment. De tota manera, la tendència en tots els experiments d’establiment de línies d’ESC és obtenir la major eficiència de derivació en l’estadi de blastocist i, per tant, aquesta premissa només seria certa per als estadis previs a la compactació; a més, s’ha de tenir en compte que la visió tradicional sempre havia estat que el primer succés de di-

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries a partir de blastòmers aïllats 259

ferenciació es posava de manifest a partir dels estadis de 8-16 cèl·lules. Per tant, aquest és un aspecte encara desconegut i d’actiu debat en el camp de la derivació d’ESC. La tendència trobada per Wakayama et al. és contrària a la dels nostres experiments amb el mètode de cultiu en medi definit i, també, a la resta de mètodes de derivació emprats en el treball. Malgrat que no s’han trobat diferències significatives entre els estadis de quatre i vuit cèl·lules, en l’estadi de mòrula es pot apreciar com el percentatge de derivació incrementa substancialment. Això podria estar suggerint que l’eficiència augmenta a mesura que avança el desenvolupament embrionari, malgrat que no es pot descartar que sigui l’efecte d’utilitzar embrions sencers en l’estadi de mòrula i blastocist per a la derivació. Així, nosaltres proposem que existeix una forta influència del nombre de blastòmers aïllats, ja que per a grups de derivació equivalents pel que fa al percentatge del volum embrionari, com 1/4 vs. 2/8 i 2/4 vs. 4/8, en general, tenen més eficiència els grups en els quals se sembren més blastòmers, malgrat que, com s’ha apuntat, també existeix influència de l’estadi, que és major en estadis més avançats. Aquest augment en l’eficiència amb un nombre major de blastòmers podria ser conseqüència de fenòmens d’adhesió o de comunicació entre blastòmers adjacents. Pel que fa a la comparació dels tres mètodes de derivació descrits, s’ha pogut observar que el mètode que aporta una major eficiència a l’hora de derivar les línies d’ESC és el mètode de cultiu en medi definit. Concretament, hem trobat diferències significatives entre mètodes per als estadis de quatre, vuit cèl·lules i blastocist, i per als grups de blastòmers de 2/4 i 4/8. La resta de grups no han experimentat diferències significatives; per tant, per derivar ESC a partir d’aquests grups es podria fer ser-

vir indistintament qualsevol dels mètodes descrits. En resum, pel que fa a la influència de l’estadi embrionari en la derivació de les línies d’ESC a partir de blastòmers aïllats, en el mètode estàndard s’observa que l’eficiència augmenta a mesura que avança el desenvolupament embrionari. No obstant això, en els altres dos mètodes de derivació emprats no s’observa un efecte tan progressiu com en el mètode anterior, sinó que només existeixen diferències significatives entre estadis pre i postcompactació. Pel que fa a la influència que comporta el nombre de blastòmers aïllats, s’observa que, per als tres mètodes de derivació emprats, l’eficiència augmenta a mesura que s’incrementa el nombre de blastòmers aïllats, tant en l’estadi de quatre com en el de vuit cèl·lules. Es considera que com més blastòmers se sembren més contactes i comunicació s’estableixen entre aquests, i això podria afavorir l’establiment de les línies d’ESC, tal com s’ha comentat anteriorment. En qualsevol cas, serà necessària més recerca per confirmar aquest fet. AGRAÏMENTS Aquest treball s’ha realitzat amb el finançament dels projectes MEC #BIO 200504341 i #BIO2006-11792, el projecte DGR #2005SGR-0047 i les beques MEC FPU AP2006-02038 i FCT portuguesa. BIBLIOGRAFIA Alarcón, V. B.; Marikawa, Y. (2003). «Deviation of the blastocyst axis from the first cleavage plane does not affect the quality of mouse postimplantation development». Biology of Reproduction, 69: 1208-1212. Allegrucci, C.; Young, L. E. (2007). «Differences be-

260 S. González, N. Costa-Borges, E. Ibáñez i J. Santaló

tween human embryonic stem cell lines». Human Reproduction, 13: 103-120. Bahia, A.; Takeuchi, T.; Tanaka, N.; Neri, Q. V.; Rosenwaks, Z.; Palermo, G. D. (2005). «Examination of individual blastomeres as a source of stem cells». Human Reproduction, 20: 16-17. Biggers, J.; Mcguinnis, L. K.; Raffin, M. (2000). «Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM». Biology of Reproduction, 63: 281-293. Bongso, A. (2004). «History and perspective of stem cell research». Best Practice and Research Clinical Obstetrics and Gynaecology, 18: 827-842. Bradley, A.; Evans, M.; Kaufman, M. H.; Robertson, E. (1984). «Formation of germline chimeras from embryo-derived teratocarcinoma cell-lines». Nature, 309: 255-256. Brook, F. A.; Gardner, R. L. (1997). «The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse». Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 94: 5709-5712. Chambers, I. (2004). «The molecular basis of pluripotency in mouse embryonic stem cells». Cloning and stem cells, 6: 386-391. Chung, Y.; Klimanskaya, I.; Becker, S.; Li, T.; Mase rati, M.; Lu, S. J.; Zdravkovic, T.; Ilic, D.; Genbacev, O.; Fisher, S.; Krtolica, A.; Lanza, R. (2008). «Human embryonic stem cell lines generated without embryo destruction». Cell Stem Cell Correspondence. [En premsa] Chung, Y.; Klimanskaya, I.; Becker, S.; Marh, J.; Lu, S. J.; Johnson, J.; Meisner, L.; Lanza, R. (2005). «Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres». Nature, 439: 216-219. Delhaise, F.; Bralion, V.; Schuurbiers, N.; Dessy, F. (1996). «Establishment of an embryonic stem cell line from 8-cell stage mouse embryos». European Journal of Morphology, 34: 237-243. Edwards, B.; Hansis, C. (2005). «Initial differentiation of blastomeres in 4-cell human embryos and its significance for early embryogenesis and implantation». Reproductive Biomedicine Online, 11: 206-218. Eistetter, H. R. (1989). «Pluripotent embryonal stem cell lines can be established from disaggregated mouse morulae». Developmental Growth & Differentiation, 31: 275-282. Evans, M. J.; Kaufman, M. H. (1981). «Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos». Nature, 292: 154-156. Fong, C. Y. (2006). «Unsuccessful derivation of human embryonic stem cell lines from pairs of human blastomeres». Reproductive Biomedicine Online, 13: 295-300.

Friel, R.; Sar, S. van der; Mee, P. (2005). «Embryonic stem cells: understanding their history, cell biology and signalling». Advanced Drug Delivery Reviews, 57: 1894-1903. Fujimori, T.; Kurotaki, Y.; Miyazaki, J.; Nabeshima, Y. (2003). «Analysis of cell lineage in two- and four-cell mouse embryos». Development, 130: 51135122. Gardner, R. L. (2001). «Specification of embryonic axes begins before cleaveage in normal mouse development». Development, 128: 839-847. Ginis, I.; Luo, Y.; Miura, T.; Thies, S.; Brandenberger, R.; Gerecht-Nir, S.; Amit, M.; Hoke, A.; Carpenter, M. K.; Itskovitz-Eldor, J.; Rao, M. S. (2003). «Differences between human and mouse embryonic stem cells». Developmental Biology, 269: 360380. Handyside, A. H.; Lesko, J. G.; Tarín, J. J.; Winston, R. M. L.; Hughes, M. R. (1992). «Birth of a normal girl after in vitro fertilization and preimplantation diagnostic testing for cystic fibrosis». New England Journal Medicine, 327: 905-909. Hogan, B.; Costantini, F.; Lacy, E. (1994). Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual. 2a ed. Nova York: Cold Spring Harbour Laboratory. Hovatta, O.; Mikkola, M.; Gertow, K. (2003). «A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells». Human Reproduction, 7: 14041409. Katkov, I.; Kim, S.; Bajpai, R.; Altman, S.; Mercola, M.; Loring, F.; Terskikh, V.; Snyder, Y.; Levine, F. (2006). «Cryopreservation by slow cooling with DMSO diminished production of Oct4 pluripotency marker in human embryonic stem cells». Cryobiology, 53: 194-205. Klimanskaya, I.; Chung, Y.; Becker, S.; Lu, S. J.; Lanza, R. (2006). «Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres». Nature, 444: 481485. Li, M.; Zhang, D.; Hou, Y.; Jiau, L. (2003). «Isolation and culture of embryonic stem cells from porcine blastocysts». Molecular Reproduction Development, 4: 429-434. Marshak, D. R.; Gardner, R. L.; Gottlieb, D. (2001). Stem cell biology. Nova York: Cold Spring Harbour Laboratory. Martin, G. R. (1981). «Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells». Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 78: 7634-7638. Niwa, H.; Miyazaki, J.; Smith, A. G. (2000). «Quantitative expression of Oct3/4 defines differentiation,

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries a partir de blastòmers aïllats 261

dedifferentiation or self-renewal of ES cells». Nature genetics, 24: 372-376. Papaioannou, V. E.; Mkandawire, J.; Biggers, J. D. (1989). «Development and phenotypic variability of genetically identical half mouse embryos». Development, 106: 817-827. Parriego, M.; Solé, M.; Vidal, F.; Boada, M.; Santaló, J.; Egozcue, J.; Veiga, A.; Barri, P. N. (2003). «One or two cell biopsy: does it affect implantation potential in PGD?». 4th Biennal Alpha Conference. 8th Meeting of Andrology in the 2000’s Twin-Meeting. Anvers (24-27 setembre 2003). Piotrowska-Nitsche, K.; Zernicka-Goetz, M. (2005). «Spatial arrangement of individual four-cell stage blastomeres and the order in which they are generated correlate with blastocyst pattern in the mouse embryo». Mechanism of Development, 122: 487-500. Rossant, J. (2001). «Stem cells from the mammalian blastocyst». Stem Cells, 19: 477-482. Smith, A. G. (2001). «Embryo-derived stem cells: of mice and men». Annual Review of Cell and Developmental Biology, 17: 435-462. Tesar, P. J. (2005). «Derivation of germ-line-competent embryonic stem cell lines from preblastocyst mouse embryos». Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 102: 8239-8244. Thomson, J. A.; Itskovitz-Eldor, J.; Shapiro, S. S.; Waknitz, M. A.; Swiergiel, J. J.; Marshall, V. S.; Jones, J. M. (1998). «Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts». Science Reports, 282: 1145-1147. Thomson, J. A.; Kalishman, J.; Golos, T. G.; Durning, M.; Harris, C. P.; Becker, R. A.; Hearn, U. P. (1995). «Isolation of a primate embryonic stem cells line». Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 94: 7844-7848. Todorova, M. G.; Soria, B.; Quesada, I. (2007). «Gap junctional intercellular communication is required to mantein embryonic stem cells in a non-

differentiated and proliferative state». Journal of Cellular Physiology, 214: 354-362. Tolkunova, E.; Cavaleri, F.; Eckardt, S.; Reinbold, R.; Christenson, L. K.; Schöler, H. R.; Tomilin, A. (2005). «The caudal-related protein Cdx2 promotes trophoblast differentiation of mouse embryonic stem cells». Stem Cells, 24: 139-144. Veiga, A.; Calderón, G.; Barri, P. N.; Coroleu, B. (1987). «Pregnancy alter the replacement of a frozen-thawed embryo with less than 50 % intact blastomeres». Human Reproduction, 2: 321-323. Veiga, A.; Santaló, J.; Vidal, F.; Calderón, G.; Gimé nez, C.; Boada, M.; Egozcue, J.; Barri, P. N. (1994). «Twin pregnancy after preimplantation diagnosis for sex selection: case report». Human Reproduction, 9: 2156-2159. Wakayama, S.; Hikichi, T.; Suetsugu, R.; Sakaide, Y.; Bui, H. T.; Mizutani, E.; Wakayama, T. (2007). «Efficient establishment of mouse embryonic stem cells from single blastomeres and polar bodies». Stem Cells, 25: 986-993. Weber, R. J.; Pedersen, R. A.; Wianny, F.; Evans, M. J.; Zernicka-Goetz, M. (1999). «Polarity of the mouse embryo is anticipated before implantation». Development, 126: 5591-5598. Yates, A.; Chambers, I. (2005). «The homeodomein protein Nanog and pluripotency in mouse embryonic stem cells». Biochemical Society Transactions, 33: 1518-1521. Ying, Q. L.; Nichols, J.; Chambers, I. (2003). «BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3». Cell, 115: 281-292. Zavos, P. (2006). «In-vitro developmental potential of individual mouse blastomeres cultured with and without zona pellucida: future implications for human assisted reproduction». Reproductive Biomedicine Online, 13: 284-294.

DOI: 10.2436/20.1501.02.73

Biologia de la reproducció (Mercè Durfort i Francesca Vidal, ed.) Treballs de la SCB. Vol. 59 (2008) 263-275

DERIVACIÓ DE LÍNIES DE CÈĿLULES MARE EMBRIONÀRIES HUMANES Begoña Aran,1 Ignasi Rodriguez,1 Angel Raya,1 Yolanda Muñoz,1 Pere N. Barri,2 Juan Carlos Izpisúa 1 i Anna Veiga1, 2 Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona. Servei de Medicina de la Reproducció, Departament d’Obstetrícia, Ginecologia i Reproducció, Institut Universitari Dexeus.

1 2

Adreça per a la correspondència: Begoña Aran. Banc de Línies Cel·lulars, Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona. Dr. Aiguader, 88. 08003 Barcelona. Adreça electrònica: baran@cmrb.eu. RESUM Les cèl·lules mare embrionàries (CME) representen una font potencial de cèl·lules per a ús terapèutic en algunes malalties produïdes per la pèrdua de la funció cel·lular. Normalment, aquestes cèl·lules procedeixen d’embrions donats per les parelles sotmeses a tècniques de reproducció assistida (TRA). Es presenten els resultats obtinguts en el Banc de Línies Cel·lulars del Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona (CMRB), on s’han descongelat 254 embrions donats per parelles sotmeses al programa de fecundació in vitro (FIV) de l’Institut Universitari Dexeus. La taxa de supervivència va ser del 51,9 %. S’han obtingut cinc línies de CME. Tres d’aquestes línies procedeixen d’embrions de mala qualitat i presenten la capacitat d’autorenovació, pluripotència i diferenciació característiques d’aquestes cèl·lules. Els embrions de mala qualitat, sovint descartats en els centres de RA, poden ser una font útil per a la derivació de CME. Paraules clau: donació d’embrions, qualitat embrionària, cèl·lules mare embrionàries. HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS DERIVATION SUMMARY Human embryonic stem cells (hESC) represent a potential source for cell therapy for many degenerative diseases. Usually hESC lines are derived from surplus embryos donated from couples undergoing In Vitro Fertilisation (IVF). We here present the results obtained in the Stem Cell Bank at the Center of Regenerative Medicine in Barcelona. 254

264 B. Aran, I. Rodriguez, A. Raya, Y. Muñoz, P. N. Barri, J. C. Izpisúa i A. Veiga

embryos have been thawed. The embryos were donated from couples from the IVF programme at the Institut Universitari Dexeus. The embryo survival rate was 51.9%. Five ESC lines were obtained. Three of these lines came from poor quality embryos. The cell lines present self-renewal, pluripotency, and differentiation properties characteristic of these cells Poor quality embryos, usually discarded in assisted reproduction centres, could be useful for ESC derivation. Key words: embryo donation, embryo quality, embryonic stem cells. INTRODUCCIÓ La recerca amb embrions viables humans està permesa al nostre país des de l’aprovació de la Llei 45/2003, per la qual es modifica la Llei 35/1988 sobre tècniques de reproducció assistida, que va permetre la utilització dels embrions humans congelats existents en aquell moment en els centres de reproducció assistida. Amb la promulgació de la Llei 14/2006, sobre tècniques de reproducció assistida, qualsevol parella amb embrions congelats, independentment del moment de la congelació, pot decidir el futur dels seus embrions entre quatre opcions: la utilització per la dona mateixa o la seva parella, la donació amb fins reproductius, la donació per a recerca o la destrucció sense altres fins. La congelació d’embrions humans als centres de reproducció assistida va començar a Espanya en la dècada dels anys vuitanta (Veiga et al., 1987) i s’estima que actualment hi ha més de cinquanta mil embrions congelats en aquests centres. L’interès en la recerca amb embrions humans es deu principalment al fet que el model animal no sempre és aplicable a l’espècie humana. La recerca amb embrions és necessària per ampliar els coneixements sobre els processos de fecundació, desenvolupament embrionari i implantació per poder millorar els resultats dels tractaments de reproducció assistida. Un dels objectius més importants en la recerca amb embrions és la derivació de cèl·lules mare embrionàries. Des que l’any 1998, Thomson et al. van pu-

blicar la derivació de la primera línia de cèl· lules mare embrionàries (CME) humanes a partir de l’aïllament de la massa cel·lular interna (MCI) d’un embrió humà, es va veure que els embrions humans podien representar una font potencial de cèl·lules per a ús en la recerca i, en un futur, per a ús terapèutic. Les dues característiques principals d’aquestes cèl·lules, la capacitat d’autorenovació i la capacitat de diferenciar-se en les tres línies germinals (Thomson et al., 1998; Reubinoff et al., 2000), les fan candidates especials per al tractament d’algunes malalties produïdes per la pèrdua de la funció cel· lular. La malaltia de Parkinson, la fallada cardíaca, la diabetis mellitus o els accidents vasculars són algunes de les malalties possiblement tractables amb el trasplantament de cèl·lules procedents de cèl·lules mare embrionàries (Hoffman et al., 2003; Trounson et al., 2005). Però la medicina regenerativa és nomes una part del potencial de les CME. Les CME humanes són una eina molt important per a l’estudi de la biologia del desenvolupament, l’expressió gènica, el desenvolupament de nous fàrmacs i nous tractaments (Pera et al., 2004), així com per a la recerca en malalties monogèniques (Pickering et al., 2003; Verlinsky et al., 2005; Mateizel et al., 2006). Des d’aquestes primeres derivacions, s’han produït nombroses línies de CME humanes (Allegrucci et al., 2007; ISCI, 2007) a partir d’embrions supernumeraris procedents dels programes de fecundació in vitro (FIV), que són donats per les parelles que

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries humanes 265

no desitgen usar-los per a la seva pròpia transferència o per a altres parelles (Bjuresten et al., 2003; Lacey, 2007; Lyerly et al., 2006, 2007). Aquests embrions normalment han estat sotmesos a un procés de congelació, i després de la seva donació han de ser descongelats i cultivats fins a l’estadi de blastocist. (Menezo et al., 1992; Veiga et al., 1995). Aproximadament un 35 % dels embrions cultivats in vitro arriben a l’estadi de blastocist, però no tots presenten una bona qualitat morfològica; alguns presenten un desenvolupament retardat, es bloquegen o presenten fragments o una morfologia anormal a causa de divisions cel·lulars irregulars (Menezo et al., 1998; Gardner et al., 2000). La metodologia de derivació de CME actualment és encara empírica. S’utilitzen diferents protocols en els diversos punts del procés, incloent-hi o no l’aïllament previ de la MCI, les fases inicials de la derivació i el cultiu amb la utilització o no de cèl·lules de suport (feeders), de la línia establerta. De fet, l’objectiu final és la derivació de CME en cultius lliures de feeders (Amit et al., 2004; Klimanskaya et al., 2005), de components d’origen animal (Genbacev et al., 2005; Li et al., 2005; Elleström et al., 2006; Rajala et al., 2007) i en condicions químicament definides (Li et al., 2005; Lu et al., 2006; Ludwig et al., 2006). Aquestes condicions, juntament amb la derivació en condicions GMP (de l’anglès good manufactured practice) són necessàries per un ús segur de les CME en la terapèutica clínica (Crook et al., 2007). Alguns autors han publicat derivacions de CME a partir d’embrions descartats (Mitalipova et al., 2003), de mala qualitat (Chen et al., 2005; Cowan et al., 2004; Aran et al., 2007; Raya et al., 2008) i a partir d’embrions bloquejats (Zhang et al., 2006). En aquest treball descrivim els resultats obtinguts en el Banc de Línies Cel·lulars del Centre de Medicina Regenerativa (CMRB),

amb la utilització dels embrions donats per a la derivació de línies de CME, fet que demostra que els embrions de mala qualitat també poden ser útils per obtenir CME. MATERIAL I MÈTODES Origen dels embrions Els embrions van ser donats per a la recerca per parelles sotmeses a FIV a l’Institut Universitari Dexeus de Barcelona. Les parelles que van comunicar la seva voluntat de donar els embrions per a recerca van ser informades dels aspectes ètics i legals relacionats, així com del projecte d’investigació al qual van ser destinats els seus embrions, que porta per títol Derivación de líneas de células madre embrionarias humanas en condiciones libres de xenobióticos y la caracterización in vivo de su pluripotencialidad. Es va facilitar a les parelles el consentiment informat per ratificar per escrit la seva donació. Es va iniciar el projecte després d’obtenir l’aprovació del Comitè Clínic d’Investigació del centre i de la Comisión de Seguimiento y Control de la Donación de Células y Tejidos Humanos de l’Instituto de Salud Carlos III. Els embrions van ser descongelats utilitzant els medi de descongelació Vitrolife Thaw-kit 1 o el Thaw-kit Blast (Vitrolife, Gotemburg, Suècia), segons l’estat de l’embrió d’acord amb les instruccions del fabricant. S’han analitzat els resultats referents a la descongelació dels embrions, supervivència embrionària, taxa de blastocist i obtenció de línies de CME.

266 B. Aran, I. Rodriguez, A. Raya, Y. Muñoz, P. N. Barri, J. C. Izpisúa i A. Veiga

Derivació de línies de CME humanes S’ha utilitzat la tècnica de congelació lenta i descongelació ràpida per a la congelació i descongelació dels embrions (Testart et al., 1986). Els embrions descongelats en estadis primerencs van ser cultivats en medi G1.2 (Vitrolife, Göteborg, Suècia) fins al dia 3 i cultivats en G2.2 (Vitrolife, Göteborg, Suècia) fins a l’estadi de blastocist. Els blastocists van ser classificats d’acord amb la classificació proposada per Stephenson et al. (2006), tenint en compte el grau d’expansió, el nombre de cèl·lules i l’aparença de la massa cel·lular interna (MCI) i el nombre de cèl· lules i la cohesió del trofectoderma (TE). Es van agrupar en tres grups d’acord a la seva qualitat: bona, intermèdia i mala qualitat. Els blastocists de mala qualitat presentaven un baix nombre de cèl·lules a la MCI i al TE, així com àrees de degeneració. Es va eliminar la zona pel·lúcida amb 5 mg/ml de Pronasa (Roche) o amb àcid Tyrode (Medicult), i es van eliminar també els fragments i les cèl·lules mortes amb

una pipeta Pasteur esmolada al foc (Humagen Fertility Diagnosis). En una fase inicial es va aïllar la MCI dels blastocists de bona qualitat mitjançant immunocirurgia. En una segona fase es va deixar d’utilitzar l’aïllament per evitar l’ús d’anticossos i complements d’origen animal i, per tant, es van sembrar els blastocists sencers (Heins et al., 2004; Suss-Toby et al., 2004) sobre fibroblasts humans (HFF-1, CCD1112Sk ATCC) irradiats (55 Gy) i sembrats (7 × 104/cm2) sobre plaques d’un sol pou cobertes de gelatina (Falcon, Becton Dickinson) i van ser cultivats a 37 °C i 5 % CO2 en medi hES (medi Knockout Dulbecco’s modified Eagle’s suplementat amb 2 mmol/l GlutaMAX (Gib co, InVitrogen corporation), 0,05 mmol/l 2-mercaptoetanol (Gibco, InVitrogen corporation), 8 ng/ml de factor bàsic de creixement del fibroblast (bFGF) (Invitrogen), 1 % d’aminoàcids no essencials (Cambrex), 20 % Knockout Serum Replacement (InVitrogen) i 0,5 % de penicil·lina-estreptomicina (Gibco, InVitrogen corporation). Desprès de 4-5 dies de cultiu, va aparèi-

S0 d4 (10î)

S0 d7 (10î)

S0 d7 (20î)

S0 d9 (20î)

Figura 1. Creixement inicial durant la derivació d’una línia de CME, els dies 4, 7 i 9.

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries humanes 267

xer un petit grup de cèl·lules amb morfologia de CME (colònia compacta i amb vores llises, alta relació nucli/citoplasma i nuclèols prominents) (Thomson et al., 1998; Reubinoff et al., 2000) entre altres tipus cel· lulars de creixement inespecífic (vegeu la figura 1). Al voltant dels dies 10-12, aquesta colònia inicial és dissociada mecànicament en diferents fragments amb una pipeta de plàstic, els quals van ser tornats a sembrar sobre una nova monocapa de feed ers. A partir d’aquest moment, les colònies de cèl·lules indiferenciades són dissociades i passades cada 5-7 dies. També són congelades periòdicament en 90 % FBS (Invitrogen) i 10 % DMSO (Sigma) i emmagatzemades en nitrogen líquid. Algunes colònies van ser descongelades i sembrades per valorar la supervivència després de la congelació i descongelació. Caracterització de CME humanes Per determinar si aquestes línies es componen de CME, es va dur a terme una caracterització exhaustiva, incloent-hi cariotip, HLA, valoració de l’expressió de marcadors

Figura 2. Blastocist del qual procedeix la línia ES[5]. Classificat com de bona qualitat.

de pluripotencialitat i diferenciació in vivo i in vitro. Es van valorar els marcadors de pluripotencialitat Oct-4 (Santa Cruz Biotechnology), Sox2 (Chemicon), Nanog (Abcam), SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-80 (Chem icon), seguits de DAPI (Sigma-Aldrich) mitjançant immunocitoquímica. L’activitat fosfatasa alcalina es va mesurar utilitzant el kit Alkaline Phosphatase Red Membrane Substrate (Sigma) després de fixar-ho amb paraformaldehid (PFA) al 4 %. El cariotip es va realitzar incubant les colònies 30 min amb 2μl/ml de colcemid (Invitrogen) i la tinció de bandes G. Es van analitzar un mínim de quinze metafases per línia. L’activitat telomerasa es va detectar mitjançant el kit TRAPeze Detection Kit (Chemicon International) seguint les instruccions del fabricant. Els antígens HLA van ser analitzats per determinar la histocompatibilitat mitjançant el kit AlleleSEQR HLA Sequencing Kit (Atria Genetics). L’anàlisi de microsatèl· lits es va fer amb PCR multiplex de nou microsatèl·lits amb AmplFlSTR Profiler Plus Kit (Applied Biosystems). Per a la diferenciació in vitro es van generar cossos embrioides (EB) dissociant

Figura 3. Blastocist del qual procedeix la línia ES[4]. Classificat com de mala qualitat.

268 B. Aran, I. Rodriguez, A. Raya, Y. Muñoz, P. N. Barri, J. C. Izpisúa i A. Veiga Taula 1. Resultats obtinguts en el CMRB a partir dels embrions donats per a recerca

Fase

Embrions congelats en 2PN (D+1)

Embrions congelats en D+2/D+3

Embrions congelats en estadi de blastocist

Total

Descongelats

141

254

Sobreviuen

30 (60 %)

68 (48,2 %)

34 (53,9 %)

132 (51,9 %)

Taxa de blastocist

8 (26,7 %)

12 (17,6 %)

Sembrats

Inici de creixement

5 (10,6 %)

Línies

mecànicament les colònies senceres després de cultivar-les 10 min a 37 °C amb col· lagenasa (Invitrogen). Aquestes colònies es van cultivar en plaques no adherents durant 3-4 dies en medi hES. Després es van sembrar en portaobjectes (chamber slides, LabTek, Nunc). Per induir la diferenciació a mesoderma, es van cultivar els EB amb àcid ascòrbic durant 12-28 dies. La diferenciació a neurones es va obtenir cocultivant amb cèl·lules de l’estroma PA6 durant 3-5 setmanes. Per mostrar l’expressió de marcadors associats a la diferenciació de les tres capes embrionàries es van tenyir les cèl·lules amb anticossos anti-α-actinina (Sigma), anti-β-tubulina (Covance) i anti-α-fetoproteina (Dako) com a marcadors de mesoderma, ectoderma i endoderma, respectivament. La pluripotència in vivo es va demostrar mitjançant la inducció de teratomes injectant intramuscularment un milió de cèl· lules, aproximadament, en ratolins SCID (severe combined immunodeficient). Vuit setmanes més tard els ratolins van ser sacrificats i els tumors analitzats mitjançant les tècniques d’histologia i d’immunohistoquímica convencionals. Els detalls de la caracterització han estat descrits anteriorment (Raya et al., 2008).

RESULTATS Es van descongelar un total de 254 embrions amb una taxa de supervivència del 51,9 %, (60 % en els embrions congelats en estadi de pronuclis, 68 % en els embrions congelats el dia 2r i 3r, i 53,9 % dels blastocists). Els resultats es presenten a la taula 1. La taxa de desenvolupament fins a blastocist dels embrions congelats en estadis primerencs va ser del 20,4 %. Es van sembrar quaranta-set blastocists, que van ser classificats d’acord amb la proposta de Stephenson (Stephenson et al., 2006, 2007) i van ser inclosos en tres grups de bona, intermèdia o mala qualitat. Vuit dels blastocists sembrats eren de bona qualitat. Es tractava de blastocists expandits amb una MCI compacta i amb TE que formava una capa contínua o quasi contínua. Vint blastocists van ser classificats com a intermedis perquè presentaven una MCI amb poques cèl·lules o poc compactades. En el grup de mala qualitat es van incloure dinou blastocists. Era impossible diferenciar entre TE i MCI, o no presentaven morfologia de blastocist i tenien únicament algunes cèl·lules supervivents (vegeu les figures 2 i 3). Es van observar set creixements inicials, dels quals cinc es van consolidar com a lí-

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries humanes 269 Taula 2. Caracterització de les cinc línies de CME derivades en el Banc de Línies Cel·lulars del CMRB ES[2]

ES[3]

ES[4]

ES[5]

ES[6]

46, XY + + fet

SSEA-3 SSEA-4 TRA-1-60 TRA-1-81 Oct-4 NANOG SOX-2 SSEA-1

+ + + + + + + –

Congelació/descongelació

+ + +

Cariotip Fosfatasa alcalina Telomerasa HLA Marcadors de pluripotència

Pluripotència In vitro (formació EB) In vivo (teratomes) Endoderma Ectoderma Mesoderma

nies de cèl·lules mare embrionàries estables, fet que suposa una eficiència del 10,6 %. Una d’aquestes línies (ES[5]) deriva d’un embrió de bona qualitat, una altra d’un de qualitat intermèdia (ES[3]), i tres línies procedeixen de tres blastocists de mala qualitat (ES[2], ES[4] i ES[6]). Les eficiències de derivació segons la qualitat embrionària van ser del 12,5 %, 5 % i 15,8 %, per als grups de bona, intermèdia i mala qualitat, respectivament. Les cinc línies han estat caracteritzades i registrades en el Banco Nacional de Líneas Celulares (http://www.isciii.es/htdocs/terapia/ terapia_bancocelular.jsp). El resum de la caracterització de les línies es presenta a la taula 2. Les cinc línies són positives per a tots els marcadors de pluripotencialitat testejats. Expressen fosfatasa alcalina (vegeu la figura 4) Oct4, Nanog,

SOX2, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 i TRA-181 (vegeu la figura 5). També són positives per a l’activitat telomerasa. S’han generat EB a partir de totes les línies que expressen marcadors d’ectoderma (β-tubulina), endoderma (α-fetoproteïna) i mesoderma (α-actinina) després de cultivar-los in vitro. També s’han generat teratomes en ratolins SCID amb presència de teixits de les tres línies germinals, com cartílag, epiteli respiratori i teixit neuronal . Les cinc línies presentaren cariotips normals (46, XY) (vegeu la figura 5). DISCUSSIÓ Al nostre país, els embrions donats per a recerca són sempre congelats, i sovint fa bastants anys que estan criopreservats.

270 B. Aran, I. Rodriguez, A. Raya, Y. Muñoz, P. N. Barri, J. C. Izpisúa i A. Veiga

S’ha de tenir en compte que els protocols de cultiu i de congelació utilitzats fa uns anys no estaven optimitzats com els d’ara. A més, en la majoria dels casos es congelaven tots els embrions que no es transferien, independentment de la seva qualitat, sovint deficient. Això podria explicar els pobres resultats obtinguts quant a la taxa de supervivència (51,9 %) i la taxa de blastocist. (20,4 %) i també la mala qualitat morfològica de molts dels blastocists. Amb una bona selecció abans de congelar, l’eficiència de derivació podria ser més elevada (Söjgren et al., 2004). Esta ben documentat que la taxa d’embaràs millora quan es transfereixen embrions de bona qualitat, i això mostra la relació entre la qualitat embrionària i la viabilitat i la capacitat de desenvolupament posterior. Els embrions de mala qualitat sovint són descartats en els programes de fecundació in vitro (FIV), a causa al seu baix potencial de desenvolupament (Alikani et al., 2000). Tot i així, els nostres resultats demostren que embrions de mala qualitat po-

Figura 4. Activitat fosfatasa alcalina de la línia ES[3].

den ser utilitzats per a la derivació de CME amb eficiències similars a les obtingudes amb embrions de bona morfologia. Molts autors presenten el nombre d’embrions i metodologia utilitzada per a la derivació però pocs informen sobre la qualitat embrionària. Els nostres resultats (eficiència de derivació: 10,6 %) són molt similars als presentats per Chen et al. (2005) a partir de cent trenta embrions del dia 3 de baixa qualitat: obtingueren dinou blastocists que van donar lloc a dues línies de CME amb una eficiència del 10,5 %. Cowan et al. (2004) van derivar disset línies a partir de noranta-set blastocists (17,5 %). Tres d’aquestes línies procedien de tres blastocists que haurien estat descartats per a ús clínic a causa de les seves característiques morfològiques. Quatre línies procedien d’embrions de qualitat intermèdia. Aquests autors suggereixen una major eficiència de derivació amb embrions congelats que en frescos. Mitalipova et al. (2003) van publicar una eficàcia de derivació més elevada (21 %),

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries humanes 271

amb quatre línies aconseguides a partir de dinou embrions descartats perquè eren de mala qualitat. S’ha de tenir en compte que es tractava d’embrions en fresc. Zhang et al. (2006) van derivar vuit línies a partir de cent seixanta-un embrions bloquejats —els embrions bloquejats són aquells en els quals no es divideix cap blastòmer després de 24-48 h en cultiu. Tot i així, els resultats són millors amb blastocists del dia 6 que amb embrions bloquejats (35,7 % vs. 4,9 %). Aquests embrions bloquejats no es poden desenvolupar en les condicions estàndards de cultiu per a FIV i probablement són incapaços de donar lloc a un embaràs. Però aquests embrions podrien reiniciar la seva divisió i continuar el seu desenvolupament en cultivar-los amb medis més complexos, com els que requereixen les CME i, per tant, poden donar lloc a CME. Laundry i Zucker (2004) defineixen els embrions bloquejats com embrions morts, per justificar les qüestions ètiques que pot comportar l’ús d’embrions humans. Lerou et al. (2008) descriuen els resultats obtinguts en utilitzar embrions de mala

qualitat (tant en estadis primerencs com en blastocists) no aptes per a la transferència o per a congelació. Presenten eficiències de derivació del 0,6 % amb embrions de dia 3 de desenvolupament (1 línia/171 embrions) i de 4,1 % amb embrions del dia 5 (10 línies/242 embrions). Aquests autors demostren un cop més que es poden obtenir CME d’embrions de mala qualitat en diferents estadis de desenvolupament, i que l’eficàcia de derivació es correlaciona amb l’estadi de desenvolupament de l’embrió. Altres autors presenten línies derivades a partir d’embrions en estadis previs. Strelchenko et al. (2004) obtingué vuit línies de quaranta-sis embrions en estadi de mòrula. Alguns autors, però, sostenen que la derivació de CME és més eficient amb embrions de bona qualitat (Oh et al., 2005; Simon et al., 2005). Stoijkovic et al. (2004) aconseguí augmentar el nombre de cèl·lules de la MCI, prèviament a la derivació, utilitzant embrions del dia 8 en lloc dels del dia 6 cultivats amb un sistema de cultiu en tres etapes, i va augmentar així l’eficiència de derivació.

Figura 5. Expressió de marcadors de pluripotencialitat per a les línies ES[2] i ES[3].

272 B. Aran, I. Rodriguez, A. Raya, Y. Muñoz, P. N. Barri, J. C. Izpisúa i A. Veiga

S’ha demostrat que una sola cèl·lula d’un embrió del dia 2 és capaç de donar lloc a un embaràs (Veiga et al., 1987). De fet, s’han obtingut CME humanes i murines a partir de blastòmers aïllats (Chung et al., 2006; Klimanskaya et al., 2006; Wakayama et al., 2007), i amb això es demostra que un únic blastòmer és suficient per derivar CME. És necessari arribar a un consens amb la informació mínima que necessiten reportar els grups de recerca per poder establir uns estàndards i poder comparar i intercanviar informació entre els equips (Stephenson et al., 2006, 2007). Aquests autors han proposat una classificació morfològica i una informació mínima de dades per unificar les dades reportades pels investigadors. Aquesta informació inclou nombre d’embrions, qualitat dels mateixos, dia i estadi de desenvolupament, metodologia de l’aïllament de la MCI i derivació, etc. En reproducció assistida s’han establert paràmetres de qualitat embrionària que es correlacionen amb la capacitat d’implantació, que haurien de ser aplicats al camp de la derivació de CME. És important descriure en detall les fases inicials del procés de derivació per establir una correlació entre morfologia embrionària i eficiència de derivació per optimar el procés. Allegrucci et al. (2007) descriuen diferències entre línies de CME relacionades amb l’ambient al qual han estat exposades durant el seu cultiu des del moment de la derivació. Es tracta de diferències quant a la pluripotencialitat, perfils de transcripció i estabilitat genètica i epigenètica. És necessari establir correlacions entre morfologia embrionària, condicions de cultiu i característiques de les línies per provar diferències. L’estandardització de la classificació d’embrions i l’optimització dels protocols per obtenir CME millorarà l’eficiència del procés. A més, la implantació d’estàndards de qualitat afavorirà la possible apli-

cació clínica (Allegrucci et al., 2007; Sousa et al., 2006). Amb la idea de recollir i estandarditzar la informació de totes les línies creades a Europa i a fora d’Europa, s’ha creat recentment el Registre Europeu de Cèl·lules Mare Embrionàries Humanes (hESCreg, www. hescreg.eu) (Borstlap et al., 2008). Es tracta d’un projecte finançat per la Comissió Europea dins del 6è Programa Marc (FP6), cocoordinat pel Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona i el Charité-Universitätsmedizin de Berlín. El principal objectiu d’aquest registre és proporcionar als investigadors, als legisladors i a la societat en general tota la informació existent sobre les línies de CME que existeixen actualment pel que fa a derivació, mètode de cultiu, caracterització, etc. hESCreg també facilita una visió de tots els projectes de recerca que s’estan duent a terme amb línies de CME. Per tant, aquest registre europeu constitueix una eina molt útil d’interacció entre investigadors, projectes de recerca, bancs de línies cel·lulars i legisladors, i contribueix a l’estandardització en aquest camp. BIBLIOGRAFIA Alikani, M.; Calderon, G.; Tomkin, G.; Garrisi, J.; Kokot, M.; Cohen, J. (2000). «Cleavage anomalies in early human embryos and survival after prolonged culture in-vitro». Hum. Reprod., 15: 26342643. Allegrucci, C.; Young, L. E. (2007). «Differences between human embryonic stem cell lines». Hum. Reprod. Update, 13: 103-120. Amit, M.; Shariki, C.; Margulets, V.; Itskovitz-Eldor, J. (2004). «Feeder layer- and serum-free culture of human embryonic stem cells». Biol. Reprod., 70: 837-845. Aran, B.; Rodríguez, I.; Raya, A.; Luna, M.; Barri, P.; Izpisúa, J. C.; Veiga, A. (2007). «Derivation of human embryonic stem cells from poor quality blastocysts». 23th Annual Meeting of the European Society Human Reproduction and Embryology, Lió.

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries humanes 273

Bjuresten, K.; Hovatta, O. (2003). «Donation of embryos for stem cell research: how many couples consent?». Hum. Reprod., 18: 1353-1355. Boletín Oficial del Estado (2003). Ley 45/2003, de 21 de noviembre, por la que se modifica la Ley 35/1988, de 22 de noviembre sobre técnicas de reproducción asistida. BOE, 126. — (2006). Ley 14/2006, de 26 de Mayo, sobre técnicas de reproducción humana asistida. BOE, 126. Borstlap, J.; Stacey, G.; Kurtz, A.; Elstner, A.; Damaschun, A.; Arán, B.; Veiga, A. (2008). «First evaluation of the European hESCreg» Nature. Biotech., 26: 859-860. Cowan, C. A.; Klimanskaya, I.; McMahon, J.; Atienza, J.; Witmyer, J.; Zucker, J. P.; Wang, S.; Morton, C. C.; McMahon, A. P.; Powers, D.; Melton, D. A. (2004). «Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts». N. Engl. J. Med., 350: 1353-1356. Crook, J.; Peura, T.; Kravets, L.; Bosman, A.; Buzzard, J.; Horne, R.; Hentze, H.; Dunn, N.; Zweigerdt, R.; Chua, F. (2007). «The generation of six clinical-grade human embryonic stem cell lines» Cell Stem Cell, 1: 490-494. Chen, H.; Qian, K.; Hu, J.; Liu, D.; Lu, W.; Yang, Y.; Wang, D.; Yan, H.; Zhang, S.; Zhu, G. (2005). «The derivation of two additional human embryonic stem cell lines from day 3 embryos with low morphological scores». Hum. Reprod., 20: 22012206. Chung, Y.; Klimanskaya, I.; Becker, S.; Marh, J.; Lu, S. J.; Johnson, J.; Meisner, L.; Lanza, R. (2006). «Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres». Nature, 439: 216-219. Ellerstrom, C.; Strehl, R.; Moya, K.; Andersson, K.; Bergh, C.; Lundin, K.; Hyllner, J.; Semb, H. (2006). «Derivation of a xeno-free human embryonic stem cell line». Stem Cells, 24: 2170-2176. Gardner, D. K.; Lane, M.; Stevens, J.; Schlenker, T.; Schoolcraft, W. B. (2000). «Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer». Fertil. Steril., 73: 11551158. Genbacev, O.; Krtolica, A.; Zdravkovic, T.; Brunette, E.; Powell, S.; Nath, A.; Caceres, E.; McMaster, M.; McDonagh, S.; Li, Y.; Mandalam, R.; Lebkowski, J.; Fisher, S. J. (2005). «Serum-free derivation of human embryonic stem cell lines on human placental fibroblast feeders». Fertil. Steril., 83: 1517-1529. Heins, N.; Englund, M. C.; Sjoblom, C.; Dahl, U.; Tonning, A.; Bergh, C.; Lindahl, A.; Hanson, C.; Semb, H. (2004). «Derivation, characterization, and dif-

ferentiation of human embryonic stem cells». Stem Cells, 22: 367-376. Hoffman, D. I.; Zellman, G. L.; Fair, C. C.; Mayer, J. F.; Zeitz, J. G.; Gibbons, W. E.; Turner, T. G. Jr. (2003). «Cryopreserved embryos in the United States and their availability for research». Fertil. Steril., 79: 1063-1069. Hoffman, D.; Zellman, G.; Fair, C.; Mayer, J.; Zeitz, J.; Gibbons, W.; Turner, T. (2003). «Cryopreserved embryos in the United States and their availability for research». Fertil. Steril., 79: 1063-1069. Klimanskaya, I.; Chung, Y.; Becker, S.; Lu, S. J.; Lanza, R. (2006). «Human embryonic stem cell lines deriv ed from single blastomeres». Nature, 444: 481-485. Klimanskaya, I.; Chung, Y.; Meisner, L.; Johnson, J.; West, M. D.; Lanza, R. (2005). «Human embryonic stem cells derived without feeder cells». Lancet, 365: 1636-1641. Lacey, S. de (2007). «Decisions for the fate of frozen embryos: fresh insights into patients’ thinking and their rationales for donating or discarding embryos». Hum. Reprod., 22: 1751-1758. Landry, D. W.; Zucker, H. A. (2004). «Embryonic death and the creation of human embryonic stem cells». J. Clin. Invest., 114: 1184-1186. Lerou, P.; Yabuuchi, A.; Huo, H.; Takeuchi, A.; Shea, J.; Cimini, T.; Ince, T.; Ginsburg, E.; Racowsky, C.; Daley, G. (2008). «Human embryonic stem cell derivation from poor-quality embryos» Nature Biotech. [En premsa] Li, T.; Zhou, C. Q.; Mai, Q. Y.; Zhuang, G. L. (2005). «Establishment of human embryonic stem cell line from gamete donors». Chin. Med. J. (Engl.), 118: 116122. Lu, J.; Hou, R.; Booth, C. J.; Yang, S. H.; Snyder, M. (2006). «Defined culture conditions of human embryonic stem cells». Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 5688-5693. Ludwig, T. E.; Levenstein, M. E.; Jones, J. M.; Berggren, W. T.; Mitchen, E. R.; Frane, J. L.; Crandall, L. J.; Daigh, C. A.; Conard, K. R.; Piekarczyk, M. S.; Llanas, R. A.; Thomson, J. A. (2006). «Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions». Nat. Biotechnol., 24: 185-187. Lyerly, A. D.; Faden, R. R. (2007). «Embryonic stem cells. Willingness to donate frozen embryos for stem cell research». Science, 317: 46-47. Lyerly, A. D.; Steinhauser, K.; Namey, E.; Tulsky, J. A.; Cook-Deegan, R.; Sugarman, J.; Walmer, D.; Faden, R.; Wallach, E. (2006). «Factors that affect infertility patients’ decisions about disposition of frozen embryos». Fertil. Steril., 85: 1623-1630. Mateizel, I.; Temmerman, N. de; Ullmann, U.; Cauffman, G.; Sermon, K.; Velde, H. van der; Rycke, M.

274 B. Aran, I. Rodriguez, A. Raya, Y. Muñoz, P. N. Barri, J. C. Izpisúa i A. Veiga

de; Degreef, E.; Devroey, P.; Liebaers, I.; Steirteghem, A. van (2006). «Derivation of human embryonic stem cell lines from embryos obtained after IVF and after PGD for monogenic disorders». Hum. Reprod., 21: 503-511. Menezo, Y.; Hazout, A.; Dumont, M.; Herbaut, N.; Nicollet, B. (1992). «Coculture of embryos on Vero cells and transfer of blastocysts in humans». Hum. Reprod., 7: 101-106. Menezo, Y.; Veiga, A.; Benkhalifa, M. (1998). «Improved methods for blastocyst formation and culture». Hum. Reprod., 13: 256-265. Mitalipova, M.; Calhoun, J.; Shin, S.; Wininger, D.; Schulz, T.; Noggle, S.; Venable, A.; Lyons, I.; Robins, A.; Stice, S. (2003). «Human embryonic stem cell lines derived from discarded embryos». Stem Cells, 21: 521-526. Oh, S. K.; Kim, H. S.; Ahn, H. J.; Seol, H. W.; Kim, Y. Y.; Park, Y. B.; Yoon, C. J.; Kim, D. W.; Kim, S. H.; Moon, S. Y. (2005). «Derivation and characterization of new human embryonic stem cell lines: SNUhES1, SNUhES2, and SNUhES3». Stem Cells, 23: 211-219. Pera, M. F.; Trounson, A. O. (2004). «Human embryonic stem cells: prospects for development». Development, 131: 5515-5525. Pickering, S. J.; Braude, P. R.; Patel, M.; Burns, C. J.; Trussler, J.; Bolton, V.; Minger, S. (2003). «Preimplantation genetic diagnosis as a novel source of embryos for stem cell research». Reprod. Biomed. Online, 7: 353-364. Rajala, K.; Hakala, H.; Panula, S.; Aivio, S.; Pihlajamaki, H.; Suuronen, R.; Hovatta, O.; Skottman, H. (2007). «Testing of nine different xeno-free culture media for human embryonic stem cell cultures». Hum. Reprod., 22: 1231-1238. Raya, A.; Rodríguez-Pizà I.; Aran, B.; Consiglio, A.; Barri, P. N.; Veiga, A.; Izpisúa, J. (2008). «Generation of cardiomyocytes from new human embryonic stem cell lines derived from poor-quality blastocysts». Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. [En premsa] Reubinoff, B. E.; Pera, M. F.; Fong, C. Y.; Trounson, A.; Bongso, A. (2000). «Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro». Nat. Biotechnol., 18: 399-404. Simon, C.; Escobedo, C.; Valbuena, D.; Genbacev, O.; Galan, A.; Krtolica, A.; Asensi, A.; Sanchez, E.; Esplugues, J.; Fisher, S.; Pellicer, A. (2005). «First derivation in Spain of human embryonic stem cell lines: use of long-term cryopreserved embryos and animal-free conditions». Fertil. Steril., 83: 246-249. Sjogren, A.; Hardarson, T.; Andersson, K.; Caisander, G.; Lundquist, M.; Wikland, M.; Semb, H.;

Hamberger, L. (2004). «Human blastocysts for the development of embryonic stem cells». Reprod. Biomed. Online, 9: 326-329. Sousa, P. A. de; Galea, G.; Turner, M. (2006). «The road to providing human embryo stem cells for therapeutic use: the UK experience». Reproduction, 132: 681-689. Stephenson, E. L.; Braude, P. R.; Mason, C. (2006). «Proposal for a universal minimum information convention for the reporting on the derivation of human embryonic stem cell lines». Regen. Med., 1: 739-750. Stephenson, E. L.; Braude, P. R.; Mason, C.; Rowland, K. (2007). «International community consensus standard for reporting derivation of human embryonic stem cell lines». Regen. Med., 2: 349-362. Stojkovic, M.; Lako, M.; Stojkovic, P.; Stewart, R.; Przyborski, S.; Armstrong, L.; Evans, J.; Herbert, M.; Hyslop, L.; Ahmad, S.; Murdoch, A.; Strachan, T. (2004). «Derivation of human embryonic stem cells from day-8 blastocysts recovered after threestep in vitro culture». Stem Cells, 22: 790-797. Strelchenko, N.; Verlinsky, O.; Kukharenko, V.; Verlinsky, Y. (2004). «Morula-derived human embryonic stem cells». Reprod. Biomed. Online, 9: 623-629. Suss-Toby, E.; Gerecht-Nir, S.; Amit, M.; Manor, D.; Itskovitz-Eldor, J. (2004). «Derivation of a diploid human embryonic stem cell line from a mononuclear zygote». Hum. Reprod., 19: 670-675. Testart, J. [et al.] (1986). «High pregnancy rate after early human embryo freezing». Fertil. Steril., 46: 268-272. The International Stem Cell Initiative. (2007). «Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative» Nature Biotech., 25: 803-816. Thomson, J. A.; Itskovitz-Eldor, J.; Shapiro, S. S.; Wak nitz, M. A.; Swiergiel, J. J.; Marshall, V. S.; Jones, J. M. (1998). «Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts». Science, 282: 1145-1147. Trounson, A. (2005). «Human embryonic stem cell derivation and directed differentiation». Ernst. Schering. Res. Found. Workshop, 27-44. Veiga, A.; Calderon, G.; Barri, P. N.; Coroleu, B. (1987). «Pregnancy after the replacement of a frozen-thawed embryo with less than 50% intact blastomeres». Hum. Reprod., 2: 321-323. Veiga, A.; Torello, M. J.; Boiso, I.; Sandalinas, M.; Busquets, A.; Calderon, G.; Barri, P. N. (1995). «Optimization of implantation in the in-vitro fertilization laboratory». Hum. Reprod., 10: 98-106. Verlinsky, Y.; Strelchenko, N.; Kukharenko, V.; Rechitsky, S.; Verlinsky, O.; Galat, V.; Kuliev, A. (2005). «Human embryonic stem cell lines with ge-

Derivació de línies de cèĿlules mare embrionàries humanes 275

netic disorders». Reprod. Biomed. Online, 10: 105110. Wakayama, S.; Hikichi, T.; Suetsugu, R.; Sakaide, Y.; Bui, H. T.; Mizutani, E.; Wakayama, T. (2007). «Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies». Stem Cells, 25: 986-993.

Zhang, X.; Stojkovic, P.; Przyborski, S.; Cooke, M.; Armstrong, L.; Lako, M.; Stojkovic, M. (2006). «Derivation of human embryonic stem cells from developing and arrested embryos». Stem Cells, 24: 2669-2676.netic disorders». Reprod. Biomed. Online, 10: 105-110.

ÍNDEX D’AUTORS Amor, M. J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Anton, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 Aran, B. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Ausió, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Ballesteros, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Barri, P. N. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Benet, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 Blanco, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 Boada, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233 Bonet, S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Bozzo, M. G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Briz, M. D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Bussalleu, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Calderón, G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Casas, I. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Cerdà, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 Costa-Borges, N. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 Crespo, D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Chiva, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13, 71 Díaz, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Durfort, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7, 51, 59 Esbert, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Fábregas, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Florensa, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 García, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Garcia, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Garcia-Cruz, R. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 González, S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 Grossmann, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 Ibáñez, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 Izpisúa, J. C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Izquierdo, D. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 Kurtz, K. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13, 71 MacKenzie, S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Maldonado, F. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Martín, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Mechaly, A. S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 Micaló, S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Muñoz, Y. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263

Navarro, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 Obradors, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 Oliver, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 Pacheco, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Paramio, M. T. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 Parriego, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225 Piferrer, F. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 Pinart, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Planas, J. V. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Pons, M. C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211 Poquet, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Puigmulé, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Ramón, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Raya, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Ribes, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 Richter, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 Riesgo, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Riqueros, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185 Rius, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 Rodriguez, I. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263 Roher, N. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Roig, I. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165 Rotllant, G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 Sagristà, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Sancho, S. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Santaló, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249 Santos, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Saperas, N. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Sarrate, Z. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 Simeó, C. G. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 Solé, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233 Subirana, J. A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 Torner, E. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141 Veiga, A. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225, 233, 263 Vidal, F. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7, 177, 225 Viñas, J. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 Vraskou, Y. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129 Yeste, M. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Consell Directiu President Vicepresident 1r Vicepresidenta 2a Secretària general Vicesecretari Tresorera Vocal de lexicografia Vocal de sessions Vocal d’acció territorial Vocal de publicacions Vocal de comunicació Vocal d’ensenyament Vocal d’estudiants Delegat de l’IEC

Jaume Reventós i Puigjaner Ferran Azorín i Marín Lluís Tort i Bardolet Josep Clotet i Erra Arcadi Navarro i Cuartiellas Carme Segarra i Robert Ricard Roca i Pascual Àurea Navarro i Sabaté Jordi Bermúdez Francesc Piferrer i Circuns Hèctor Ruiz i Martín Rosa Pérez Joan Duran Ricard Guerrero i Moreno

SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Seccions especialitzades Aqüicultura Biofísica Biologia del desenvolupament Biologia evolutiva Biologia i indústria Biologia molecular Biologia molecular del càncer Biologia de la reproducció Biologia i societat Ecologia marina Ecologia terrestre Ensenyament Fisiologia vegetal Genòmica i proteòmica Microbiologia Neurobiologia experimental Senyalització cel·lular i metabolisme Virologia Estudiants SCB a Alacant SCB a les Balears SCB a Lleida SCB al Pallars SCB a València SCB a Vic

Lluís Tort Pere Garriga Jordi Garcia-Fernández Montserrat Papaceit Ramon Roca Maribel Geli Gabriel Capellà Francesca Vidal Cristina Junyent Ramon Masana Josep Maria Espelta Rosa Pérez Josep M. Torné Francesc Xavier Avilés Mercè Berlanga Josep Saura Francesc Vinyals Miguel À. Martínez i Ana Angulo Joan Duran Ivan Quesada Balbina Nogales M. Ángeles de la Torre Xavier Castells Helena Mira Jordi Planas

ACTIVITATS DEL CURS 2007-2008

I. SESSIÓ INAUGURAL 13 de febrer Sessió inaugural de la SCB Sala Prat de la Riba, IEC «Grans reptes ètics de la biologia» Jordi Pujol, expresident de la Generalitat de Catalunya II. CONGRESSOS I SIMPOSIS 6, 7 i 8 de febrer I Simposi d’aqüicultura de Catalunya Sala Joan i Pere Coromines, IEC Organitza: Secció d’Aqüicultura 6 i 7 de març I Simposi polar Aula Magna, Fac. de Biologia, UB Organitza: Secció d’Estudiants 1-4 d’abril Reunió internacional de la Secció d’Aqüicultura Sala Pere i Joan Coromines, IEC Organitza: Secció d’Aqüicultura II. CURSOS 17 i 18 de setembre Seminari de biologia del desenvolupament Hotel Cap Roig, Platja d’Aro Organitza: Secció de Biologia del desenvolupament 14 de desembre 4th Workshop for Biomedical Genomics and Proteomics Aula Pi i Sunyer, Fac. de Medicina, Hospital Clínic, UB Organitza: Secció de Genòmica i proteòmica 14-18 d’abril Curs de gestió de projectes de recerca i desenvolupament Sala Pi i Sunyer, IEC Organitza: Secció de Biologia i indústria

282

27, 28 i 29 de maig i 3 i 4 de juny Curs pràctic d’anàlisi i interpretació estadística de les dades experimentals a la indústria Sala Pi i Sunyer, IEC Organitza: Secció de Biologia i indústria 8-18 de juliol Curs de postgrau: «Filogènies i genealogies de DNA. Reconstrucció i aplicacions» Organitza: Secció de Biologia evolutiva III. JORNADES 6 i 7 d’octubre Jornades sobre gestió dels boscos de ribera Sort Organitza: Lo Pi Negre, Secció de la SCB al Pallars i Depana 26 d’octubre Jornada sobre la poda mecànica en fruiters Departament d’Hortofruticultura de la Universitat de Lleida Organitza: SCB, Institució Catalana d’Estudis Agraris i Departament d’Hortofruticultura 5 de novembre VII Jornada de virologia Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Virologia 6 de novembre V Jornada de fisiologia vegetal Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Fisiologia vegetal 16 de novembre IV Jornada d’avenços en ecologia Centre d’Estudis Avançats de Blanes Organitza: Secció d’Ecologia terrestre 3 de desembre Jornada CREAF-SCB-ICHN: «Fragmentació del territori i biodiversitat» Sala d’Actes, Fac. de Ciències, UAB.

283

13 de desembre II Jornada de ciència i societat: «On volem arribar?» Sala d’Actes, Escola Massana Organitza: Secció de Biologia i Societat i Biocat 19 de desembre II Jornada de Biofísica Sala Turró, Reial Acadèmia de Medicina Organitza: Secció de Biofisica 14 de març Jornada sobre cèl·lules mare i càncer Sala d’actes, Biblioteca, Campus de Burjassot, UV Ariel Ruiz i Altaba, Universitat de Ginebra, Suïssa Organitza: Secció de la SCB a València 27 i 28 de març II Jornades de biologia humana Aula Magna, Fac. de Biologia, UB Organitza: Secció d’Estudiants 19 de maig I Jornada de ciència i poesia Claustre de l’IEC Organitza: Secció de Biologia i societat; activitat emmarcada dins del programa de la Setmana de la Poesia de Barcelona 19 i 20 de juny XVI Jornades de biologia molecular Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Biologia molecular i Secció de Biologia i indústria 7 de juliol VIII Jornada de biologia evolutiva Sala Prat de la Riba, IEC Organitza: Secció de Biologia evolutiva IV. ALTRES / SESSIONS EXTRAORDINÀRIES 18 i 25 d’octubre i 1, 8 i 15 de novembre IV Cicle de cinema i ciència Aula Magna, Fac. de Biologia, UB Organitza: Secció d’Estudiants

284

27, 28 i 29 de novembre II Gimcana forestal Serra de Castelltallat, Bages Organitza: Consell Directiu de la SCB i CREAF 12 de desembre Conferència sobre el Premi Nobel de fisiologia o medicina Sala Prat de la Riba, IEC «Manipulacions genètiques amb cèl·lules mare embrionàries que obren camí a la teràpia gènica» Jaume Reventós, Grup de Recerca Biomèdica de l’Hospital Vall d’Hebron i President de la SCB 20 de febrer Presentació del volum 56 de Treballs de la SCB, «Endocrinologia experimental» Sala Pi i Sunyer, IEC 20 de febrer Dia de Darwin. Cicle de seminaris d’evolució i complexitat Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biologia Evolutiva, UV Organitza: Secció de la SCB a València 3, 4 i 5 d’abril IX Exporecerca Jove Cosmocaixa

Interior 59 Soc Cat Bio

2/3/2009

14:19

Página 1

NORMES DE PUBLICACIÓ DE TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA Abast. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publica: a) monografies i revisions sobre temes de ciències de la vida encarregades per la Societat, i b) comunicacions presentades a les sessions ordinàries i extraordinàries organitzades per la Societat o les seves seccions especialitzades. Els temes poden ser proposats pels membres del Consell Directiu o per socis que desitgin ocupar-se de la preparació d’un volum de la revista fent d’editors. El Consell Directiu decideix si un tema és apropiat per dedicar-hi un volum de Treb. Soc. Cat. Biol. Idioma. Els originals seran redactats en català, excepte en casos justificats per als quals el Consell Directiu pugui acceptar una altra llengua. Lliurament dels originals. La submissió implicarà que el material és original i que no ha estat enviat, acceptat o publicat en cap altre lloc. Els originals els lliurarà l’editor del volum per correu electrònic (scb@iecat.net), adreçat al president del Consell de Redacció. Cal enviar els següents arxius, preferentment empaquetats amb ZIP: — Un arxiu únic en format RTF o MS Word anomenat Text_TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el text del volum, incloent-hi, en aquest ordre: coberta, índex, presentació, els capítols en l’ordre desitjat i les seves taules, si n’hi ha. Les pàgines hauran d’anar numerades consecutivament començant per la núm. 1, que serà la de la coberta. Tot el text serà escrit íntegrament amb Times New Roman de cos 12 amb interlineat d’1,5. L’arxiu amb el text no podrà contenir figures ni objectes incrustats. — Un arxiu per cada figura anomenat Figura_[número de figura]_[cognom del primer autor]. Les figures, si no contenen text (a part del peu), es poden remetre en qualsevol dels formats gràfics habituals (PNG, JPEG, TIFF); si contenen text, s’han d’enviar en un format que permeti editar-lo (EPS, PDF, Powerpoint). — Cal enviar també una còpia impresa electrònica en format PDF de tot el volum, anomenada TSCB_[cognom de l’editor], amb tot el contingut, incloent-hi les figures. Aquest arxiu es farà servir com a text imprès de referència durant el procés de tractament del text. Per aquest motiu, els autors i l’editor han de tenir cura personalment que en aquesta còpia hi hagi tot el contingut imprès correctament, incloent-hi sobretot els símbols o caràcters especials, equacions, etc. Cada article o, en un volum monogràfic, cada capítol, incloent-hi la bibliografia, taules i figures, hauria de tenir una extensió entre quinze i vint fulls DIN A4, escrits amb el tipus, mida i interlineat esmentats abans. Només es podrà ultrapassar aquest límit amb l’acord previ del Consell de Redacció de Treballs de la SCB. Els volums monogràfics haurien de contenir un mínim d’uns deu capítols. El Consell de Redacció consultarà especialistes, els quals recomanaran si un article pot publicar-se immediatament, necessita revisió, o bé és rebutjat. Els autors rebran notificació de la decisió. Si el treball requereix revisió, es facilitaran als autors els comentaris escrits dels especialistes que l’hagin revisat. Estructura dels originals. Els originals que no s’ajustin a aquestes instruccions seran retornats als autors perquè els modifiquin abans de la seva tramitació. Dintre de cada capítol o article se seguirà el següent ordre pel que fa als diferents components:

— Títol, escrit en majúscules i negreta. — Nom i primer cognom de l’autor. Si n’hi ha més d’un, els seus noms aniran separats amb una coma. L’autor per a la correspondència s’identificarà amb un asterisc posat al final del seu cognom. — Adreça postal completa de tots els autors. Telèfon, fax i correu electrònic de l’autor per a la correspondència — Resum en català, d’un màxim de dues-centes paraules. — Paraules clau en català, màxim de cinc. — Resum en anglès (que, òbviament, haurà d’ésser traducció fidel del resum en català i haurà d’anar precedit de la traducció del títol del manuscrit). — Paraules clau en anglès, màxim de cinc. — Text, que, si és una revisió, podrà estar dividit fins a dos nivells en els apartats (no numerats) que es creguin més oportuns. Si es tracta d’un article de recerca, el manuscrit haurà d’incloure Introducció, Materials i mètodes, Resultats i Discussió. No es podran fer servir notes a peu de pàgina ni text subratllat. — Agraïments, si escau. — Referències, segons el format indicat més endavant. — Taules. Portaran un títol descriptiu breu i aniran numerades correlativament amb números àrabs. Una taula per full. — Text de peus de figures. Il·lustracions. Les il·lustracions cal que siguin de bona qualitat i contrast, tenint en compte la possible reducció, ja que, a causa del format de la revista, un cop publicades poden ésser, com a màxim, de 14 cm d’ample per 19 cm d’alt. Totes les il·lustracions seran en blanc i negre, excepte en cas que el color sigui essencial per a comprendre’n el significat. Atès que la publicació de fotografies en color encareix molt el procés editorial, els autors que desitgin incloure alguna fotografia en color hauran de pagar les despeses extra. En cas que les taules o figures hagin estat publicades anteriorment, caldrà indicar-ne la procedència i, si escau, el copyright. Referències. Totes les referències, tant publicades com en premsa, citades al text, hauran d’ésser incloses a la llista de referències, ordenades alfabèticament. En el text s’indicaran els noms dels autors i l’any de publicació per ordre cronològic; en el cas que una referència tingui més de dos autors, se citarà el primer seguit d’et al. A continuació hi ha exemples de l’estil que s’ha de seguir per a citar articles, capítols o monografies. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Proves d’impremta i extrets. De tots els originals acceptats, l’autor de correspondència en rebrà unes proves d’impremta per a corregir-les, i aquestes proves hauran d’ésser retornades, per correu urgent, a: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/ Maria Aurèlia Capmany, 14-16, 08001 Barcelona (tel. 933 248 584; fax 932 701 180; a/e: scb@iec.cat) dins el termini màxim d’una setmana. En les proves no podran ésser introduïdes correccions d’estil, i només hi seran admeses les de caràcter ortogràfic i tècnic. Un cop publicat l’article, es lliuraran a l’autor vint extrets sense càrrec.

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA INSTRUCTIONS FOR AUTHORS Scope. Treballs de la Societat Catalana de Biologia (Treb. Soc. Cat. Biol.) publishes: a) monographs and reviews on life sciences topics commissioned by the Society; and b) lectures presented at both ordinary and extraordinary sessions organized by the Society or their specialized sections. Submission of originals. Submission implies that the material is original and that has not been submitted, accepted or published elsewhere. Originals will be submitted by the editor of the volume to the following e-mail address scb@iecat.net addressed to the President of the Publications Board. The following files will be provided, preferably ZIP-compressed: — A single file in format RTS or MS Word named Text_TSCB_ [editor’s last name], containing all the text of the volume, including, in this order, the following parts: cover page, table of contents, presentation, the chapters in the order that they should appear and their corresponding tables. Pages should be consecutively numbered, staring with page 1, which will be the cover page. All text should be written in Times New Roman, pt 12 with 1.5 spaces between lines. The text file cannot contain figures and incrustated objects. — One file for each figure named Figure_[figure number]_ [last name of the first author]. Figures that do not contain text characters can be submitted in standard graphic format (PNG, JPEG, and TIFF); figures that do contain text have to be submitted in an editable format (EPS, PDF, Powerpoint). — A single PDF file named TSCB_[editor’s last name] containing all text plus all figures. Authors and the editor are responsible that in this file, all contents appear correctly printed, in particular special symbols and equations. Each article or, in a monograph, each chapter, including text plus references, tables and figures, should be between fifteen and twenty DIN A4 sheets long, written with the font type and spaces between lines specified above. The maximum length can be surpassed only with prior approval from the Treballs de la SCB Publications Board. Monographs should have a minimum of 10 chapters. The Publications Board will contact specialists who will recommend immediate publication, acceptance after modifications or rejection of the submitted originals. Authors will be notified in due course. If revision is required, authors will receive the corresponding written comments for modifications. Structure of manuscripts. Manuscripts that do not conform to these instructions will be returned to the authors for modifications before their processing. Each chapter or manuscript should have the following structure: — Title, written in capitals and bold case. — Name and last name of author. If there is more than one author, their names will be separated with commas. The corresponding author will be identified with an asterisk placed after their last name.

— Full postal address of all authors. Phone, fax and e-mail address of the corresponding author. — Abstract, maximum two hundred words. — Keywords, maximum five — Text of manuscript. In the case of review articles, a maximum of two (not numbered) subheadings will be accepted. In the case of research articles, the manuscript will include the following sections: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion. Footnotes or underlined text will not be accepted. — Acknowledgments, if appropriate — References (see format below) — Tables. They will be preceded with a brief, descriptive title and will be numbered with Arabian numerals. One table per page — Figure legends Figure. Figures should be of good quality and contrast, taking into account that they can be reduced in size, and that once published they can be at most 14 cm width x 19 cm height. All figures will be in black and white, unless the use of color is essential to understand their meaning. The authors will pay extra costs of publishing color figures. If tables or figures have been previously published elsewhere, the original source must be indicated and it will be the responsibility of authors to deal with possible copyrights. References. All references published and in press cited within the text will have to be included in the reference list arranged in alphabetical order by the last name of the first author. In the text, the name of the authors and the publication year should be used in chronological order. If there are more than two authors, only the name of the first author followed by «et al.» will be used. The following examples represent the appropriate manner in which to cite articles, book chapters and books, respectively. CODINA, C.; VILADOMAT, F.; BASTIDA, J.; LLABRÉS, J. M. (1989). «Potencial biotecnològic del cultiu de cèl·lules vegetals per a l’obtenció de productes farmacèutics». Treb. Soc. Cat. Biol., 40: 47-70. MELLADO, R. P. (1987). «Vectores utilizados para la manipulación y expresión de genes». A: VICENTE, M.; RENART, J. Ingeniería genética. Madrid: CSIC, 21-30. WOLFFE, A. (1995). Chromatin structure and function. Londres: Academic Press. Galleyproofs and reprints. Once a manuscript has been accepted, the corresponding author will receive the galleyproofs. Galleyproofs will be returned by courier to: Secretaria de la Societat Catalana de Biologia, c/Maria Aurèlia Capmany, 1416, 08001 Barcelona (tel. +34-933 248 584; fax +34-932 701 180; e-mail: scb@iec.cat) within one week. Style corrections cannot be accepted in galleyproofs. Only typographic and technical corrections will be accepted. Once published, authors will receive 20 reprints free of charge.

14:07

Página 1

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA

VOLUM 59, 2008

ÍNDEX

7 9 13 29

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

2/3/2009

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

VOLUM 59, 2008

51 59 71

95 109 129

FILIAL DE L’INSTITUT D’ESTUDIS CATALANS

141 151 165 177 185 193 211 225 233 249 263

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 59, 2008

Cub. 59 Soc Cat Bio

BARCELONA 2009

12:09

Página 1

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

03/03/09

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 59, 2008

Sobrecob 59 Soc Cat Bio

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ MERCÈ DURFORT I FRANCESCA VIDAL EDITORES Il·lustració de la sobrecoberta

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 59, 2008

12:09

Página 1

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ

03/03/09

TREB. SOC. CAT. BIOL., VOL. 59, 2008

Sobrecob 59 Soc Cat Bio

BIOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓ MERCÈ DURFORT I FRANCESCA VIDAL EDITORES Il·lustració de la sobrecoberta

TREBALLS DE LA SOCIETAT CATALANA DE BIOLOGIA VOLUM 59, 2008