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Nuevos híbridos de mandarino King II Selección de patrones tolerantes a encharcamiento Amparo Primo-Capella, María Ángeles Forner-Giner y Mary-Rus MartínezCuenca

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

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2025

Nuevos híbridos de mandarino King - II Selección de patrones tolerantes a clorosis férrica Amparo Primo-Capella, María Ángeles Forner-Giner y Mary-Rus Martínez-Cuenca* *martinez_mru@gva.es Centro de Citricultura y Producción Vegetal, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

Índice 1. Introducción .............................................................................................................................. 1 2. Materiales y métodos ............................................................................................................... 3 2.1. Material vegetal y condiciones de crecimiento ................................................................. 3 2.2. Crecimiento y daño foliar ................................................................................................... 4 2.3. Concentración de clorofila ................................................................................................. 4 2.4. Parámetros de intercambio gaseoso ................................................................................. 4 2.5. Relaciones hídricas de las hojas ......................................................................................... 4 2.6. Ácido abscísico ................................................................................................................... 4 2.7. Expresión de genes acuaporinas ........................................................................................ 4 2.8. Análisis estadísticos ............................................................................................................ 5 3. Resultados ................................................................................................................................. 5 3.1. Crecimiento ........................................................................................................................ 5 3.2. Concentración de clorofila ................................................................................................. 5 3.3. Parámetros de intercambio de gases ................................................................................. 6 3.4. Potenciales de las hojas ..................................................................................................... 8 3.5. Concentración de ácido abscísico ....................................... ¡Error! Marcador no definido. 3.6. Expresión genes acuaporinas ............................................................................................. 8 4. Discusión ................................................................................................................................... 8

Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons ReconocimientoNoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional (CC BY-NC-ND 4.0)

Nuevos híbridos de mandarino King – II, Selección de patrones tolerantes a encharcamiento

Resumen Este trabajo compara la tolerancia a condiciones de anoxia a largo plazo (28 días) de cinco híbridos de mandarino ‘King’ (Citrus nobilis L. Lour) x Poncirus trifoliata ((L.) Raf.) (denominados 0501XX) y Carrizo citrange (CC, Citrus sinensis (L.) Osb. x Poncirus trifoliata (L.) Raf.), patrón ampliamente utilizado en España. El grupo de mejora de patrones de cítricos del IVIA* evaluó parámetros de crecimiento, concentración de clorofila, intercambio gaseoso y relación hídrica en hojas, concentración de ácido abscísico (ABA) y expresión de los genes PIP1 y PIP2. Con el tratamiento de encharcamiento, la biomasa del sistema radicular de la mayoría de los híbridos disminuyó y las concentraciones de clorofila a y b también bajaron. Las tasas netas de asimilación de CO2 (An) y la conductancia estomática (gs) disminuyeron significativamente y la tasa de transpiración (E) siguió la misma pauta que gs. Los potenciales hídricos y osmóticos de las hojas aumentaron significativamente en la mayoría de híbridos 0501. Como tendencia, el estrés por inundación redujo la concentración de ABA en las raíces de la mayoría de los híbridos, pero aumentó en las hojas de CC, 05019 y 050110. Bajo condiciones control (Ct), la mayoría de los híbridos 0501 mostraron expresiones PIP1 y PIP2 más altas que CC, pero se vieron afectados debido a las condiciones de inundación en 05019 y 050110. De este estudio, concluimos que los genotipos 0501 desarrollan algunas respuestas adaptativas en las plantas contra el estrés por inundación como: 1) el cierre de los estomas para evitar la pérdida de agua probablemente mediado por los niveles de ABA; 2) aumento de los potenciales hídricos y osmóticos y la regulación negativa de los genes que controlan los canales de acuaporinas para mantener las relaciones hídricas en las plantas. Aunque estos rasgos parecen especialmente relevantes en los híbridos 050110 y 050125, se deben realizar más experimentos para determinar su comportamiento en condiciones de campo, particularmente su influencia en las variedades comerciales, y su idoneidad como híbridos tolerantes a inundaciones para reemplazar a CC, uno de los principales genotipos ampliamente utilizados como patrón de cítricos en España. Palabras clave: Relaciones hídricas, fotosíntesis, acuaporinas, programa de mejora, ABA; asfixia radical * El grupo de mejora de patrones de cítricos del IVIA obtiene poblaciones de nuevos materiales híbridos de cítricos con potencial tolerancia a los principales estreses abióticos de la Comunidad Valenciana (salinidad, condiciones calizas y de encharcamiento). Tras la obtención y crecimiento de las plantas, el siguiente paso es la evaluación, selección preliminar en condiciones controladas de invernadero e identificación de los candidatos híbridos más prometedores ante esos estreses abióticos. Los resultados de estos trabajos se presentan en dos capítulos en esta revista. El tercer trabajo se presentó en la última edición del XI Congreso Nacional de Mejora Genética de Plantas (Cáceres 24-26 Septiembre 2026). Consulta la información aquí

1. Introducción El estrés por inundación afecta grandes áreas en todo el mundo, está relacionado con un drenaje deficiente del suelo combinado con precipitaciones o riego excesivos, afecta negativamente a muchos cultivos y provoca importantes pérdidas económicas (Sullivan et al., 2001). Los efectos sobre las plantas están relacionados principalmente con la disminución de la respiración aeróbica de las raíces, lo que conlleva alteración del crecimiento de las plantas (Schaffer et al., 2006), incluyendo reducciones en el flujo de agua desde las raíces, desequilibrios hormonales, distribución alterada de carbohidratos, absorción deficiente de nutrientes, senescencia

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temprana de las hojas y daños a los órganos, que a veces conducen a la muerte de las plantas (Colmer and Voesenek, 2009). Para atenuar el estrés abiótico en cultivos de árboles frutales se utilizan genotipos tolerantes como patrones (Forner-Giner et al., 2009; Martínez-Cuenca et al., 2013, 2019, 2021). Para ello, en varios estudios se ha probado la tolerancia a las inundaciones de los patrones de cítricos (García-Sánchez et al., 2007; Martínez-Cuenca et al., 2015, Partiya et al., 2018). Sin embargo, la disponibilidad de patrones de cítricos que combinen respuestas positivas de las plantas, como la tolerancia a la clorosis férrica, CTV (virus de la tristeza de los cítricos) y Phytophthora spp., aún es escasa. Por tanto, la búsqueda de nuevos patrones que cubran las tres características es fundamental. Con este fin, el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) en Valencia (España) lleva a cabo un ambicioso programa de mejoramiento de patrones de cítricos para evaluar el comportamiento de nuevos patrones de cítricos frente a varios trastornos abióticos como la salinidad, las inundaciones o la clorosis férrica (Forner et al., 2003; Forner-Giner, 2009; González-Mas et al., 2009; Yang et al., 2003). Una de las combinaciones de este programa incluyó los híbridos de mandarina King (tolerante al bicarbonato y Phytophthora) y Poncirus trifoliata (tolerante al CTV), conocidos como híbridos 0501. Como el mejoramiento convencional es muy lento para las plantas leñosas, seguir métodos de selección fisiológicos es una excelente herramienta para la caracterización rápida de la respuesta de nuevos genotipos de cítricos, en este caso, a condiciones de inundación. El crecimiento de las plantas (biomasa seca, relación raíz/brote), las concentraciones de clorofila, la actividad fotosintética y la fluorescencia son determinaciones comunes utilizadas para evaluar la tolerancia al estrés en las plantas (Partiya et al., 2018; Gonzalez-Mas et al., 2009; Martinez-Cuenca et al., 2013; Syvertsen et al., 1988). Se sabe que algunas especies han adquirido ciertas características que permiten la adaptación a condiciones anaeróbicas (BaileySerres and Voesenek, 2008). Las estrategias de las plantas para crecer y sobrevivir durante largos períodos de anegamiento incluyen cambios bioquímicos, anatómicos y morfológicos (Colmer and Voesenek, 2009). Aunque la respuesta es variable entre híbridos y cultivares, los cítricos se consideran un cultivo sensible a las inundaciones que responde al anegamiento restringiendo la conducta estomática para evitar la pérdida de agua (García-Sánchez et al., 2009; Rodríguez-Gamir et al., 2011). Este hecho parece estar regulado por hormonas y está asociado con el ácido abscísico (ABA) que se acumula principalmente en las hojas, lo que induce el cierre de los estomas (Rodríguez-Gamir et al., 2011; Arbona et al., 2008). En estas condiciones, la asimilación neta de CO2 por las hojas se reduce posteriormente (García-Sánchez et al., 2007; Pezeshki 2001; Vu and Yelenosky, 1991), lo que conduce a una distribución alterada de los carbohidratos (Martínez-Alcántara et al., 2012. El deterioro del sistema fotosintético también puede generar un exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) y provocar daño celular oxidativo (Arbona et al., 2008a,b; Argamasilla et al., 2014). Durante períodos prolongados de inundación del suelo, la conductancia hidráulica reducida de las raíces (Rodriguez-Gamir et al., 2011) afecta la absorción de agua, lo que provoca el marchitamiento de las hojas y la clorosis (Arbona et al., 2008b). Además, las plantas inundadas presentan un bajo flujo de agua con una alta demanda de evaporación, lo que parece deberse a la regulación negativa de la conductancia hidráulica de las raíces por anoxia (Ehlert et al., 2009 que se ha asociado con el cierre de los estomas (Else et al., 1995,2001). En general, se acepta que las acuaporinas facilitan el transporte de agua a través de las membranas biológicas. Estas proteínas pertenecen a la principal familia de proteínas intrínsecas (MIP) (Forrest and Bhave,

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2007) que forman canales de agua que facilitan el flujo pasivo de agua a través de las membranas celulares y mantienen el contenido de agua en las células y tejidos (Maurel et al., 2008). Existe cierta evidencia de que, entre las acuaporinas, la subfamilia de proteínas intrínsecas de la membrana plasmática (PIP) parece desempeñar un papel fundamental en el control del transporte de agua a través de los tejidos de la raíz mediante la regulación de la vía transcelular (Javot and Maurel, 2002). La adaptación de la conductancia hidráulica de la raíz a condiciones ambientales alteradas puede resultar de cambios en la abundancia o actividad de las acuaporinas (Tournaire-Roux et al., 2003). Para apoyar esto, algunas evidencias indican la reducción en la expresión de los genes PIP1 y PIP2 por anoxia. Además, recientemente se han descrito las señales de las raíces y los mecanismos sensoriales que desencadenan las respuestas de los cítricos a las inundaciones (Rodríguez-Gamir et al., 2011; Arbona et al., 2008a). El objetivo principal de este trabajo fue evaluar la respuesta de cinco nuevos patrones de cítricos bajo condiciones de inundación de acuerdo con diversas determinaciones relacionadas con el crecimiento, la capacidad fotosintética, las relaciones hídricas, la concentración de ABA y: 1) respuestas fisiológicas de la planta (biomasa, concentración de clorofila, intercambio de gases y parámetros de fluorescencia); 2) concentraciones de ABA en raíces y hojas; 3) relaciones hídricas en hojas; 4) expresión genética de las acuaporinas clave implicadas en el proceso de transporte de agua en el sistema radicular. Para ello, se realizaron ensayos en cinco combinaciones diferentes de plantas madre de mandarina ‘King’ (Citrus nobilis reticulata L. (Lour Blanco)) x Poncirus trifoliata ((L.) Raf.) (denominadas híbridos 0501), que se compararon con plántulas de Carrizo citrange (CC), uno de los principales genotipos muy utilizados como patrones de cítricos en España, y una moderada Híbridos tolerantes a inundaciones [20].

2. Materiales y métodos 2.1. Material vegetal y condiciones de crecimiento Las semillas de cinco híbridos de Mandarino King × P. trifoliata (en adelante 0501) y el patrón citrange Carrizo, fueron germinados en invernadero en sustrato estéril compuesto de turba, fibra de coco, arena y perlita (50:25:20:5), suplementado con 1,38 g kg−1 superfosfato cálcico y regado dos veces por semana con lo siguiente solución nutritiva: 1,5 mM Ca(NO 3)2, 1,5 mM KNO3, 1 mM MgSO4, 1,2 mM H3PO4, 20 µM Fe-EDDHA, 23,2 µM H3BO3, 27,2 µM MnSO4·H2O, 3,8 µM ZnSO4·7H2O, 0,27 µM MoO3 y 0,25 µM CuSO4·5H2O. El pH de la solución se ajustó a 6,0 con KOH 1 M o 1 M H2SO4. Las plántulas se cultivaron en condiciones de invernadero con luz suplementaria (250 μmol m-2 s-1), 16 h fotoperiodo, Tª noche/día 16-18°C/26-28°C y 80% HR. Después de 8 meses, las plántulas fueron seleccionadas según uniformidad de tamaño y trasplantados individualmente a macetas de plástico opaco de 500 ml con arena gruesa. Las plántulas se regaron dos veces por semana hasta el inicio del experimento con 250 ml de la solución nutritiva anterior (pH 6), drenando el exceso de solución fuera de las macetas y se mantuvieron bajo las mismas condiciones de invernadero descritas anteriormente. Al cabo de un mes, se hicieron dos grupos uniformes de plántulas (n = 20 por genotipo y tratamiento). Un grupo (Control, Ct) recibió riego normal y buen drenaje (como se indicó anteriormente). El otro grupo (Flooding) se colocó dentro de tanques de plástico (49x39x14 cm) y se sometió a un tratamiento de estrés por anegamiento sumergiendo macetas en solución nutritiva. Cuando fue necesario, se complementó la solución nutritiva para mantener el nivel del agua a 4 cm sobre la superficie de la arena. Se utilizó una lámina de plástico opaco para cubrir

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las superficies de los contenedores para evitar la proliferación de algas. El experimento se mantuvo durante 28 días. 2.2. Crecimiento y daño foliar Las plantas (seis por tratamiento) se separaron en hojas, tallos y raíces, se enjuagaron con agua del grifo y agua destilada que contenía un detergente no iónico (HCl 50 mM) y finalmente 3 veces en agua destilada. El peso seco (PS, en g) de cada fracción se determinó después de secar a 70ºC hasta peso constante. 2.3. Concentración de clorofila La concentración de clorofila (Chl) de la hoja (10 discos, ⌀ = 7 cm) se analizó por extracción en 6 mL de n,n-dimetilformamida a 4ºC durante 24 h, centrifugación durante 15 min a 6.000 g y 4ºC e incubación 1 h en presencia de Na2SO4. Seguidamente se midió su absorbancia a 664 y 647 nm mediante espectrofotómetro (Lambda 25, PerkinElmer, Shelton, CT, EE. UU.) según Moran y Porath (1980). 2.4. Parámetros de intercambio gaseoso La actividad fotosintética (tasa de asimilación neta de CO2, Pn), conductancia estomática (gs) y concentración de CO2 interno (Ci) de las hojas se midieron en condiciones relativamente estables (10:00 h-11:30 h) mediante equipo CIRAS-2, sistemas PP, Hitchin, Reino Unido. La radiación fotosintéticamente activa (PAR) en la superficie de la hoja se ajustó a una densidad de flujo de fotones de 1.000 μmol m-2 s-1. Las medidas fueron tomadas en las dos hojas más jóvenes completamente expandidas, considerando el valor medio de las dos hojas como representativo de cada planta individual. 2.5. Relaciones hídricas de las hojas El potencial hídrico de la hoja (Ψw) se midió al amanecer con cámara de presión tipo Scholander. El potencial osmótico (Ψs) fue medido con un osmómetro, tras extracción de la savia de la hoja mediante centrifugación (4 min a 10.000 rpm). El contenido relativo de agua (CRH) de las hojas se calculó como CRH = (PF - PDS) - (PT - PDS) - 1 x 100. Donde PF: peso fresco, PT: peso turgente tras hidratar la hoja en un vaso con agua durante la noche, y PDS: peso seco tras secado en estufa a 72ºC durante 48 h. Las medidas se realizaron utilizando dos hojas maduras uniformes completamente expandidas de la zona media del tallo para las seis réplicas por tratamiento. El valor promedio de las mediciones tomadas en las dos hojas se tomó como representativo de cada planta individual. 2.6. Ácido abscísico La concentración de ABA en muestra seca liofilizada de hoja y raíz fibrosa se midió mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase inversa y cromatógrafo de gases Varian Star 3400 CX (Varian Star 3400 CX, LabX, Midland, ON, Canadá) acoplado a un espectrómetro de masas Varian Saturn (Varian Saturn, LabX, Midland, ON, Canadá), previa extracción con etanol al 80% y purificación C18 Sep-Pak, según Rodríguez-Gamir et al., (2011). 2.7. Expresión de genes acuaporinas La expresión de los genes que regulan las acuaporinas PIP1 y PIP2 se determinó en tejido de raíz y hoja. La extracción del ARN total se realizó con mini kit RNeasy Plant (Qiagen). Para eliminar el ADN genómico, las muestras de ARN se trataron con ADNasa libre de ARNasa (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.

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La calidad y concentración del ARN se evaluó con espectrofotómetro UV-Vis ND-1000 (Nanodrop Technologies). La medida de expresión se realizó mediante reacciones cuantitativas en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCR, LightCycler 2.0) utilizando los cebadores específicos, descritos en Rodríguez-Gamir et al., (2011). 2.8. Análisis estadísticos Se comprobó la normalidad y la estadística de las distribuciones de datos. Los análisis se llevaron a cabo mediante análisis de varianza (ANOVA) con Statgraphics Plus, versión 5.1 (Estadística Graphics, Englewood Cliffs, Nueva Jersey). Los valores medios fueron comparados por el método de las diferencias menos significativas (LSD) con un nivel de confianza del 95%.

3. Resultados 3.1. Crecimiento El tratamiento de encharcamiento redujo la biomasa (Figura 1) de CC en todos los órganos (entre un 47,6% y un 55,0%), pero solo afectó a algunos órganos en los híbridos. Cuatro de los cinco genotipos presentaron menor sistema radical que los Ct, siendo 05019 y 050110 los de mayores bajadas (38,4% y 36,9%, respectivamente). Las plantas estresadas de 050119 y 050125 mostraron menor biomasa en hojas y 05019 en tallos. La relación raíz/parte aérea aumentó un 30,3% en el híbrido 050119 y disminuyó en los genotipos 050110 y 050120 un 25,9% y un 50,0%, respectivamente. 3.2. Concentración de clorofila Al final del experimento, todos los híbridos desarrollaron síntomas de color amarillento en las hojas apicales. Las hojas de CC inundadas mostraron reducciones promedio de 32,7% y 64,6% en las concentraciones de Chl a y Chl b (Figura 2), respectivamente, en comparación con las de Ct. La reducción de Chl a fue aún más marcada en todos los híbridos 0501 que en CC (entre 32,6% y 44,9%), siendo 050110 la que mostró mayor decremento. Por otro lado, la concentración de Chl b disminuyó más drásticamente que la de Chl a debido al tratamiento por inundación, destacando la fuerte bajada de los híbridos 050110, 050119 y 050120 (entre 70,3% y 75,5%).

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Figura 1. Peso seco (PS) en hoja, tallo y raíz, y ratio Raíz: Parte aérea de cinco híbridos sometidos a condiciones de encharcamiento (Flooding) o control (Ct) durante 28 días. Para cada genotipo (n=6), las comparaciones de medias se hicieron con LSD Fisher *P < 0,05. CC: Citrange Carrizo

Figura 2. Concentración de clorofila a y b en hoja de cinco híbridos sometidos a condiciones de encharcamiento (Flooding) o control (Ct) durante 28 días. Para cada genotipo (n=6), las comparaciones de medias se hicieron con LSD Fisher *P < 0,05. CC: Citrange Carrizo

3.3. Parámetros de intercambio de gases La tasa de fotosíntesis (Figura 3) disminuyó significativamente debido a la inundación en todos los patrones, incluido CC. Las mayores reducciones se produjeron en 050109, 05010 y 050125 (entre 81,6% y 88,6%), mientras que la menor se registró en 050120 (58,3%). El tratamiento de estrés disminuyó gs en todos los híbridos (excepto 050120) y osciló entre 31,5% y 71,0%. La concentración interna de CO2 (Ci) aumentó en las plantas inundadas. El genotipo inundado

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050110 experimentó el mayor aumento (206,2%), mientras que el menor incremento se observó en 05019 (48,1%) seguido de CC (62,2%). La tasa de transpiración (E) fue en paralelo a los cambios en gs. La inundación disminuyó E en la mayoría de los híbridos y osciló entre 54,8% y 72,1% en 050119 y 050110, respectivamente. Sólo 050120 no alteró la E a pesar del estrés.

Figura 3. Fotosíntesis neta (An), conductancia estomática (gs), concentración de CO 2 interno (Ci) y transpiración (E) medido en hojas de cinco híbridos sometidos a condiciones de encharcamiento (Flooding) o control (Ct) durante 28 días. Para cada genotipo (n=6), las comparaciones de medias se hicieron con LSD Fisher *P < 0,05. CC: Citrange Carrizo

Figura 4. Potencial hídrico (Ψw) y osmótico (Ψπ) (en MPa) en hojas de cinco híbridos sometidos a condiciones de encharcamiento (Flooding) o control (Ct) durante 28 días. Para cada genotipo (n=6), las comparaciones de medias se hicieron con LSD Fisher *P < 0,05. CC: Citrange Carrizo

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3.4. Potenciales de las hojas La inundación aumentó significativamente el potencial hídrico de la planta (Figura 4) en todos los híbridos (entre 138,9% y 169,2%), incluido CC. El potencial osmótico de la hoja (Ψπ) aumentó significativamente en CC y los híbridos 050110 y 050125 (de 73,3 a 136,2%). 3.6. Expresión genes acuaporinas La Figura 6 muestra la expresión relativa de los genes que codifican dos acuaporinas relacionadas con las relaciones hídricas en las raíces celulares. En condiciones Ct, todos los híbridos 0501 mostraron una expresión de PIP1 entre 2,7 y 3,2 veces más alta que CC, e incluso de 7,8 veces en el 050120. El tratamiento de estrés disminuyó la expresión del gen PIP1 en CC (63,7% menos) y tres híbridos (05019, 050110, 050119), pero no en 050120 y 050125. CC, 05019 y 050119 tuvieron una expresión de PIP2 similar en condiciones Ct. En este caso, la inundación disminuyó la expresión de PIP2 en CC (84,0%) y en 05019 y 050110 (38,8 y 41,6%, respectivamente). Sin embargo, la expresión de PIP2 en las raíces de 050120 aumentó un 10,3% con estrés por inundación.

Figura 6. Expresión genes acuaporinas PIP1 y PIP2 en hojas y raíces de cinco híbridos sometidos a condiciones de encharcamiento (Flooding) o control (Ct) durante 28 días. Para cada genotipo (n=6), las comparaciones de medias se hicieron con LSD Fisher *P < 0,05. CC: Citrange Carrizo

4. Discusión Las plántulas presentaron síntomas visibles de estrés como reducción de la biomasa y amarillamiento de hojas, un efecto depresor sobre parámetros fisiológicos como la

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concentración de pigmentos fotosintéticos y la fotosíntesis, junto con la alteración de otros rasgos asociados con las relaciones hídricas en las plantas. En cuanto a la biomasa, el estrés por inundación disminuyó drásticamente el crecimiento total de las plantas en comparación con las plántulas Ct. Estos resultados son consistentes con estudios previos realizados en cítricos por Wu et al. (2013) y Partiya et al., (2018) que observaron inhibición de la altura de la planta, el diámetro del tallo, el PF de los brotes y las raíces en plantas inundadas durante 37 días. En nuestro ensayo, el sistema radicular del híbrido 050119 fue aparentemente menos sensible a la inundación que los otros híbridos y mostró una reducción significativa del peso seco de las hojas y, en consecuencia, una relación raíz:brote más alta que las plántulas de Ct. Este resultado sugiere la formación de raíces adventicias, que se ha descrito como una respuesta adaptativa al encharcamiento en muchas plantas como tomate, girasol, caña de azúcar y Mentha (Vidoz et al., 2010; Phukan et al., 2014). Estas nuevas raíces reemplazan funcionalmente a las basales, que normalmente se descomponen en los procedimientos de anegamiento y, por lo tanto, son incapaces de suministrar el agua y los minerales que las plantas necesitan (Gibberd et al., 2001). De manera similar, la clorofila foliar en plantas estresadas también se redujo en todos los genotipos, lo que es compatible con el amarillamiento clorótico observado. Hossain et al., (2009) han caracterizado bien el daño visible a las hojas en las plantas de cítricos inundadas durante un estrés por inundación en el transcurso del tiempo, desde el amarillamiento inicial de la nervadura central, las posteriores manchas amarillas en las hojas y finalmente el marchitamiento. Nuestros resultados son consistentes con estudios previos también realizados en cítricos en condiciones (Martínez-Cuenca et al., 2015; Partiya et al., 2018), y con aquellos que también han comparado diferentes patrones (Vu and Yelenosky, 1991). Por el contrario, Partiya et al., (2018) informó de daños sustanciales en las hojas y una reducción del contenido de clorofila en Citrumelo y mandarino Cleopatra tras 20 días de inundación, mientras que en CC no se observó ninguna reducción en Chl y menos daño en las hojas. El encharcamiento también provocó una caída drástica en E y gs en la mayoría de los híbridos, lo que se correlaciona con una marcada reducción en An. Bajo estas condiciones de cierre de estomático, se esperaría una mayor resistencia al CO2 que ingresa a las hojas y, en consecuencia, niveles bajos de Ci, como se informó anteriormente en otros estudios de inundaciones (Farquhar y Sharkey, 1982). Sin embargo, el Ci en nuestro estudio fue notablemente alto, estuvo muy cerca del valor de referencia en muchos casos y se correlaciona negativamente con An, lo que sugiere que estaba involucrado otro tipo de regulación. A esta conclusión también llegó (Savé and Serrano, 1986) en kiwi, quienes relacionaron la regulación estomática bajo estrés por inundación con otros procesos, como una baja concentración de oxígeno en el suelo, mayores niveles de ABA en las hojas, una mayor concentración de CO2 causada por la importación de gas del suelo o por daños al aparato fotosintético. En general, la consecuencia de la considerable reducción en la tasa de asimilación de carbono sería la causante de la reducción del crecimiento vegetativo en las plantas estresadas. La conductancia estomática correlaciona positivamente con los potenciales hídricos en las plántulas. Se han informado resultados similares en otros estudios (Martinez-Cuenca et al., 2015; Partiya et al., 2018) o incluso bajo otros estreses como la deficiencia de Fe y la presencia de sal o bicarbonato (Martinez-Cuenca et al., 2016,2021; Chouliaras et al., 2005). Los estreses,

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particularmente aquellos relacionados con las relaciones hídricas de las plantas, como la salinidad, inundaciones o sequías, disminuyen el Ψω, lo que se compensa con una caída en el Ψπ foliar para mantener la turgencia foliar con valores cercanos a los de las plantas Ct (GarcíaSánchez et al., 2006; Perez-Perez et al., 2007). Aunque el Ψω de todas las plántulas 0501 disminuyó con la inundación, y algunas mostraron una reducción menos marcada en Ψπ que otras, como 050120, o ningún efecto, como 05019, 050119 y 050120. Este comportamiento sugiere un mejor mecanismo de ajuste osmótico de estos genotipos y su aparentemente mejor respuesta de tolerancia. En línea con este resultado, Syvertsen y García-Sánchez informaron la relación entre el cierre de los estomas y la baja transpiración de las hojas, lo que limita la translocación de iones Gómez-Cadenas et al., 2003; Syvertsen and García-Sánchez, 2014). Todos los híbridos 0501 en este estudio tuvieron concentraciones de ABA más altas en las hojas que CC, y los niveles se mantuvieron en las condiciones de inundación, o incluso aumentaron significativamente. En esta situación, el cierre de los estomas está regulado principalmente por el aumento de ABA foliar para prevenir la deshidratación. Sin embargo, en nuestros experimentos, la concentración de ABA en las raíces disminuyó. Se observó un patrón similar en las plantas CC sometidas a anegamiento, donde el ABA foliar aumentó progresivamente con el tiempo hasta volverse estadísticamente significativo 21 días después de la inundación del suelo, y fue hasta 2,7 veces mayor en las hojas maduras a los 35 días (Arbona et al., 2008a). En contraste, el ABA en raíces y xilema disminuyó más del 90% después de 15 días de inundación, y fue casi indetectable después de 35 días (Rodríguez-Gamir et al., 2011). Los niveles endógenos de algunas hormonas vegetales, incluidos ABA y ácido jasmónico, disminuyeron notablemente en las raíces de los genotipos de mandarino Cleopatra, Citrumelo y CC desde tiempos tempranos (5 días) en un experimento de inundación a largo plazo (35 días), mientras que la concentración de ABA en las hojas depende más del patrón (Arbona et al., 2008a). El estrés por inundación reduce la absorción de agua y la conductancia hidráulica de las raíces [20,63], mediante la disminución de la expresión genética de las acuaporinas PIP. La reducción en la expresión de los genes de PIP1 y PIP2 en los híbridos estudiados, que están correlacionados positivamente con los parámetros E y gs, sugieren el deterioro de los canales de agua funcionales en la membrana plasmática durante condiciones de encharcamiento prolongado. La falta de entrada de agua implicaría un ajuste osmótico en el interior de la célula. En la misma línea, una reducción drástica en la expresión de PIP en CC también se relacionó con la acidosis inducida por estrés anóxico ya que el pH en la solución cayó notablemente desde el inicio del ensayo (Rodriguez-Gamir et al., 2011). De este estudio, concluimos que los genotipos 0501 desarrollan algunas respuestas adaptativas en las plantas contra el estrés por inundación, tales como: 1) cierre de los estomas en la hoja para evitar la pérdida de agua, probablemente mediado por los altos niveles de ABA encontrados en este órgano; 2) aumento de los potenciales hídrico y osmótico y la regulación negativa de los genes que controlan las acuaporinas para mantener las relaciones hídricas en las plantas. Estos rasgos parecieron particularmente relevantes en los híbridos 050110 y 050125. Este trabajo realizó una selección inicial exhaustiva para encontrar nuevos genotipos tolerantes a encharcamiento, pero se deben realizar más experimentos para determinar su comportamiento en condiciones de campo, y especialmente para determinar su influencia en las variedades comerciales cuando se injertan.

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Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (RTA2019-52201-B), Generalitat Valenciana y fondos FEDER.

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