Transformación de AFLATOXINA B1 Y ZEARALENONA mediante una lacasa avanzada de ALTO POTENCIAL REDOX
Jog Raj*1, Hunor Farkaš1, Miguel Alcalde2, Bernardo J. Gomez-Fernandez2, Jasna Bošnjak-Neumüller1 y Marko Vasiljević1 PATENT CO, DOO., Mišićevo, Serbia CSIC- Departamento de Biocatálisis - Instituto de Catálisis y Petroquímica, CSIC, Madrid, España *Autor correspondiente y presentador: jog.raj@patent-co.com 1
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The World Mycotoxins Forum (WMF) meets IUPAC, Belfast, Oct 14-16, 2019
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OBJETIVOS Las micotoxinas son el mayor desafío para los productores de alimentos para animales, siendo necesario el monitoreo y la remediación regular. Las micotoxinas pueden ser remediadas mediante varios
MATERIALES & MÉTODOS
1. INCUBACIÓN
métodos, pero las enzimas y los
El Desoxinivalenol (DON), la Aflatoxina B1
microorganismos para desactivar
(AFB1) la Zearalenona (ZEN), la toxina
las micotoxinas se están
T-2, la Ocratoxina A (OTA) y la Fumonisina B1 (FB1) (2 ppm) se incubaron
popularizando actualmente.
con 500 µl de la enzima DooKu (Lacasa) a 37°C; con siringaldehído (10mM) como Entre las enzimas que intervienen en
mediador redox durante 1 hora.
la degradación de las micotoxinas, las lacasas fúngicas de alto potencial son biocatalizadores prometedores debido a sus bajos requerimientos y a su amplia gama de sustratos.
2. CUANTIFICACIÓN Tras la incubación, las muestras se centrifugaron y analizaron mediante un método de multi-micotoxinas por LC-MS/ MS para la cuanti icación de todas las micotoxinas (A latoxina B1, Ocratoxina A,
Recientemente hemos diseñado una
Zearalenona, Deoxinivalenol, FB1 y toxina
lacasa de alto potencial redox mediante
T-2).
ADN recombinante para mejorar su termoestabilidad y rango de afinidad por los sustratos. En el presente estudio, hemos evaluado la transformación de micotoxinas usando la lacasa avanzada, la variante DooKu.
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RESULTADOS
Se examinaron diferentes variantes de Lacasas, estando la Lacasa 240 entre las mejores enzimas para la transformación de AFB1 y ZEN como se muestra en la Tabla 1. El siringaldehído demostró ser mejor cofactor en comparación con TEMPO.
Tabla 1. Análisis de diferentes variantes de lacasas utilizando diferentes cofactores a un pH de 6,5.
Nombre de la variante de la enzima
240 (MA) Chu-B (MA) OB-1 (MA) KyLo (MA) 9C1 (MA) Vader (MA)
Cofactor
Transformación (%)
DON
AFB1
FB1
T-2
ZEN
OTA
TEMPO, 10mM
14,1
7 ,4
1,7
16,2
100,3
11,5
Siringaldehído, 10mM
7,9
73,7
0,2
2,0
100,5
3,5
TEMPO, 10mM
10,1
5,1
3,3
2,1
92,4
4,4
Siringaldehído, 10mM
6,3
9,8
4,1
0,9
24,6
2,5
TEMPO, 10mM
6,4
1,3
2,3
4,2
100,0
1,8
Siringaldehído, 10mM
4,0
15,2
1,1
3,3
65,4
8,0
TEMPO, 10mM
1,3
0,8
6,8
1,6
5,1
0,5
Siringaldehído, 10mM
8,8
12,9
2,9
3,0
17,3
1,2
TEMPO, 10mM
3,3
5,8
2,1
4,3
74,5
5,4
Siringaldehído, 10mM
4,6
14,5
11,3
8,0
20,4
8,6
TEMPO, 10mM
1,0
8,4
4,1
5,2
58,0
6,3
Siringaldehído, 10mM
6,8
3,7
6,6
3,6
3,1
0,1
Tabla 2. Efecto de diferente pH en la actividad de la Lacasa 240.
Transformación (%)
A240G (PM1 laccase variant)
pH
DON
AFB1
FB1
T-2
ZEN
OTA
3
-0,3
7,2
-5,3
2,0
44,2
-0,3
4
9,0
6,9
-5,8
2,8
88,7
2,5
5
6,7
7,4
-7,6
2,2
99,0
3,7
6,5
13,2
73,2
-3,8
-1,2
70,4
1,2
3
El efecto del pH fue estudiado realizando ensayos a pH 3.0, 4.0, 5.0 y 6.5. La Lacasa 240 logró un 73% de transformación para AFB1 a pH 6.5 y un 99% de transformación de ZEN a pH 5.0 como se muestra en la Tabla 2.
Figura 1. Transformación de AFB1 y ZEN utilizando Lacasa 240 a lo largo del tiempo.
120 % Transformación
100 80 60
% Transformación de AFB1 a pH 6,5
40
% Transformación de ZEN a pH 5,0
20 0 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Tiempo en minutos
También se estudió el efecto del tiempo de incubación, como se muestra en la Figura 1. La ZEN se transformó en 2 horas, mientras que la AFB1 se transformó en 3 horas.
Se están llevando a cabo ensayos relacionados con los metabolitos derivados de AFB1 y ZEN y los resultados se actualizarán pronto. Esta enzima lacasa puede ser usada como solución de remediación de micotoxinas en los alimentos para animales.
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