ANÁLISIS DE 36 MICOTOXINAS EN DIFERENTES MATRICES AGRÍCOLAS Y ALIMENTARIAS/PIENSOS MEDIANTE LC-MS/MS
Hunor Farkaš, Svetlana Ćujić, Jog Raj*, Zdenka Jakovčević, Jovana Dubajić y Marko Vasiljević PATENT co. DOO., Mišićevo, Serbia. *Autor correspondiente jog.raj@patent-co.com
1
OBJETIVO En este trabajo se describe un método multimicotoxinas basado en la extracción sólido-líquido (SLE) para el análisis de 36 micotoxinas utilizando Agilent 6460c UHPLC-MS/MS. Las 36 micotoxinas incluidas fueron: Micotoxinas reguladas y relacionadas por la Unión Europea (UE) Aflatoxinas (AFB1, AFB2, AFG1, AFG2) Deoxinivalenol (DON)
Otras micotoxinas
Fumonisinas (FB1, FB2, FB3, FB4)
15-acetil deoxinivalenol (15-ADON)
Toxina HT-2 (HT-2)
3-acetil deoxinivalenol (3-ADON)
Ocratoxina A (OTA)
Deoxinivalenol-3-glucosido (D3G)
Toxina T-2 (T-2)
Citrinina (CIT)
Zearalenona (ZEN)
Alternariol (AOH) Diacetoxiscirpenol (DAS)
Micotoxinas emergentes Ergosina (ES) Beauvericina (BEA) Ergocriptina (ECR) Enniatinas (ENNA, ENNA1, ENNB, ENNB1) Neosolaniol (NEO) Ácido fusárico (FA) Nivalenol (NIV) Moniliformina (MON) Patulina (PAT) Ácido tenuazonico (TeA) Fusarenon-X (FX) Zearalanona (ZAN) α-zearalenol (α-ZEL) β-zearalenol (β-ZEL)
2
MATERIALES & MÉTODOS El método sigue el principio de diluir e inyectar, en el que las muestras se extraen con un disolvente orgánico y los extractos resultantes se centrifugan. Para minimizar los efectos de matriz durante la ionización por electrospray, los extractos centrifugados se combinan con patrones internos marcados isotópicamente (ISTD) específicos para cada grupo de micotoxinas. Esta adición se lleva a cabo directamente en la aguja del inyector automático, inmediatamente antes de la inyección en el sistema UHPLC-MS/MS, lo que garantiza una cuantificación precisa.
5,00 g de muestra homogeneizada Extracción con 20 ml de ACN/agua/ácido fórmico = 80:19:1; 60 min; temperatura ambiente Centrifugación a 4.200 rpm durante 5 min Se diluyó 450 µl de extracto de muestra con 750 µl de agua ultrapura Filtrado de la muestra diluida utilizando un filtro de jeringa de nailon de 0,22 µm Pretratamiento del muestreador: mezcla ISTD en la aguja y la muestra
Sistema 6460C UHPLC-MS/MS: LC/MS de triple cuadrupolo con tecnología Jet Stream de Agilent
3
Micotoxina AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 α-ZEL β-ZEL ZAN ZEN DAS HT-2 T-2 3-ADON 15-DON DON NIV FB1 FB2 FB3 FB4 FA MON OTA
Columna HPLC
Columna analítica Waters CORTECS UPLC® 18 2,1 x 100 mm 1,6 μm
Columna de protección HPLC
Columna guardadora Waters CORTECS® UPLC C18 VanGuard™ 2,1 x 5 mm 1,6 μm
Fase móvil
A: Ácido fórmico al 0,1 %, formiato de amonio 5 mM en agua B: Ácido fórmico al 0,1 %, formiato de amonio 5 mM en metanol/ acetonitrilo
Programa de gradiente
Tiempo (min)
A (%)
B (%)
0,00 3,00 3,1 4,00 9,00 15,00 17,00 18,00 21,00 22,00
95 95 82 80 80 20 20 0 0 95
5 55 18 20 20 80 80 100 100 5
Tasa de flujo
0,300 ml/min
Volumen de inyección
5 μL
ISTO
Rango de calibración (ng/ml)
[13C17] AB1
0,05 - 5
[13C18] ZEN
1,25 - 125 0,62 - 62,0 0,38 - 37,5
[13C24] T-2
1,20 - 120
13C17] 15-ADON
2,5 - 250
13C15] DON [13C15l NIV
2,5 - 250 2,5 - 250
[13C34] FB1
3,13 - 250
[13C20] OTA Matrix match [13C20] OTA
0,38 - 37,5 0,38 - 37,5 0,2 - 20,0
4
Micotoxina BEA ENNA ENNA1 ENNB ENNB1 CIT PAT FX NEO ES ECR AOH D3G TeA
ISTO
Rango de calibración (ng/ml)
[13C18] ZEN
0,13 - 12,5
[13C13] CIT Matrix match Matrix match [13C24] T-2
5 - 500 1 - 100 4 - 400 1 - 100
Matrix match
0,1 - 10
Matrix match [13C151 DON [13C10] TeA
2 - 200 3 - 300 3 - 300
RESULTADOS & CONCLUSIONES Las recuperaciones de 36 micotoxinas en matrices de alimentos, piensos y cereales contaminados oscilaron entre el 67,4 % y el 121,1 % tras la corrección del patrón interno, con desviaciones estándar relativas (RSD) inferiores al 14,9 %.
Estos resultados demuestran que el método de dilución e inyección ofrece un enfoque sólido para el análisis simultáneo de 36 micotoxinas mediante LC-MS/MS.
5