Biotecnologia Aplicada à Saúde - Vol. 2, pt. 3

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Nesta coleção, a intenção foi reunir, em uma obra didática, sucinta e objetiva, os fatos mais recentes na literatura com os conhecimentos clássicos dos temas disponíveis em obras separadas. Para se ter todo o escopo de Biotecnologia Aplicada à Saúde e Biotecnologia Aplicada à Agro&Indústria, dividimos o primeiro tema em três volumes e o segundo em um, totalizando 4 volumes, sendo que todos os tópicos são abordados nos cursos de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, entre outros.

FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES

Seguindo essa direção e no sentido de produção de um livro que seja para o uso tanto de alunos de graduação como de pós-graduação e para aqueles profissionais que queiram se introduzir na área de biotecnologia utilizando técnicas modernas e qualquer tipo de modelo celular, disponibilizamos, em um tópico de cada capítulo, as metodologias e os procedimentos para a realização de experimentos. Um guia prático e simples para a bancada de experimentos complexos.

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organizador

RODRIGO RIBEIRO RESENDE

Neste segundo volume, você aprenderá a engenharia genética pela tecnologia do DNA recombinante. Descobrirá os mais recentes avanços na produção de linhagens celulares e vetores virais. Aprenderá a produzir proteínas recombinantes para uso em clínica médica, na produção de kits de diagnóstico, e anticorpos para uso médico, vacinas e mutações sítio-dirigidas, usando animais ou plantas como biorreatores. Aprenderá também a isolar, caracterizar, identificar e transformar células adultas em células-tronco embrionárias, a produzir animais transgênicos e a controlar expressão gênica no tempo e no espaço. É a terapia gênica mais perto de você, mais acessível e, de fato, funcionando.

organizador

colaborador

RODRIGO RIBEIRO RESENDE

CARLOS RICARDO SOCCOL

CAPÍTULO

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MODELOS DE TERAPIA GÊNICA BASEADOS NA EXPRESSÃO DE HORMÔNIO DE CRESCIMENTO EM CÉLULAS HUMANAS E NA ADMINISTRAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL EM CAMUNDONGOS ANÕES Cibele Nunes Peroni Cláudia Regina Cecchi Eliza Higuti Paolo Bartolini 23.1 INTRODUÇÃO

O hormônio de crescimento humano recombinante (do inglês, recombinant human growth hormone – r-hGH) foi uma das primeiras proteínas a ser

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sintetizada por técnicas de DNA recombinante e obteve aprovação para ser comercializado nos meados da década de 1980. A utilização do r-hGH foi impulsionada pelos casos da doença de Creutzfeld-Jacob (DCJ), advindos do tratamento convencional da deficiência de hormônio de crescimento (DGH) com o hormônio de extração hipofisária 1. A DCJ clássica se apresenta em diversas formas. Em sua forma adquirida, a proteína defeituosa é transmitida iatrogenicamente (isto é, como resultado de ação médica ao paciente), seja pela utilização de medicamentos (como hormônio de crescimento, por exemplo) ou de implantes (enxertos de córnea ou de dura-máter, por exemplo). Nesses caso, ocorre uma invasão do corpo do paciente por um príon externo a ele. A nova variante da DCJ foi descoberta em 1996, e esta forma da doença é causada pela transmissão de príons adquiridos através do consumo de carnes e vísceras bovinas provenientes de animais afetados pela encefalopatia espongiforme bovina, vulgarmente conhecida como doença da vaca louca. Outro fator estimulador para o r-hGH foi a disponibilidade praticamente ilimitada da proteína recombinante2,3. Por outro lado, essa tecnologia baseada em ferramentas da engenharia genética apresenta como desvantagens principais os trabalhosos e dispendiosos processos de purificação e controle de qualidade, inerentes à obtenção de uma proteína recombinante terapêutica para uso injetável3. No caso específico do hormônio de crescimento (GH), somam-se os inconvenientes das repetidas injeções e de um tratamento prolongado 4-6. Estes fatores, aliados ao fato de a real necessidade terapêutica do GH e da sua detecção por imunoensaios ser bem conhecida e sensível, propiciaram o posterior desenvolvimento de estudos de terapia gênica ex vivo e in vivo, já a partir do final dos anos 19803,7. Outra potencial vantagem da terapia gênica para o GH seria a possibilidade de liberação da proteína terapêutica de maneira mais similar à fisiológica, além da disponibilidade de modelos animais que reproduzem os efeitos fenotípicos da DGH em humanos. Entre tais modelos, destacamse os camundongos anões, mais conhecidos como lit/lit ou little, e os anões imunodeficientes (lit/scid), linhagens estas que podem ser adquiridas comercialmente do The Jackson Laboratories (Bar Harbor, Estados Unidos). O camundongo lit/lit apresenta uma mutação no receptor do gene liberador de GH (do inglês, growth hormone releasing hormone – GHRH), que confere uma deficiência semelhante à DGH tipo 1B em humanos6,8. Por sua vez, o lit/scid possui, além dessa mutação que origina o nanismo, uma segunda mutação, responsável por uma imunodeficiência severa9. O tratamento da DGH mediante protocolos de terapia gênica ainda não alcançou o estágio clínico para humanos, e a maior dificuldade é ainda a

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obtenção de níveis terapêuticos sustentáveis e reguláveis de GH7. Porém, muitos estudos interessantes e promissores têm sido realizados utilizando diversas estratégias de terapia gênica ex vivo e in vivo, metodologias de transferência gênica baseadas em vetores virais ou plasmidiais e modelos animais. Além disso, esses estudos, que utilizam o gene do GH como modelo, abrem também perspectivas para a utilização de outras proteínas terapêuticas que necessitam de liberação sistêmica. Neste capítulo, dentre os vários estudos de terapia gênica ex vivo para o GH, serão enfatizados os resultados obtidos com a utilização de queratinócitos humanos primários como células-alvo, inclusive devido à nossa própria experiência nesse campo2,3,9-11. Os queratinócitos são um alvo atrativo para esta finalidade por serem facilmente obtidos de biópsias de pele e seu cultivo já estar padronizado desde os trabalhos pioneiros do grupo do dr. Howard Green, do Instituto de Tecnologia de Massachusetts12, além de seu transplante também já ser bem estabelecido em pacientes com queimaduras 13 e da terapia poder ser revertida pela simples excisão do tecido transplantado. Será também discutida a administração de vetores plasmidiais (não virais) associada à eletrotransferência, uma estratégia prática e eficiente de terapia gênica in vivo, que tem fornecido resultados interessantes em nosso laboratório6,7,14,15. Em todos esses estudos foram utilizadas as linhagens de camundongos lit/lit e lit/scid, com as quais trabalhamos desde a década de 199016.

23.2 HISTÓRICO A definição da terapia gênica como a introdução de genes ausentes ou defeituosos em células somáticas para tratamento de doenças graves é basicamente a mesma desde o desenvolvimento dos primeiros protocolos clínicos para humanos no final da década de 1980 3,17,18. Até o ano de 2012, mais de 1.800 protocolos já tinham sido aprovados em mais de 31 países, com significativos resultados terapêuticos 19. Esses protocolos envolvem a utilização de vários tipos de genes, tais como antígenos, citocinas, supressores de tumor e fatores de crescimento, que em sua grande maioria estão relacionados ao câncer, a doença mais frequentemente tratada por terapia gênica, correspondendo a aproximadamente 55,3% dos estudos. Utilizamse também uma grande variedade de vetores e de técnicas de transferência gênica, destacando-se os vetores adenovirais (23,3% dos protocolos), retrovirais (19,7%) e o DNA plasmidial (18,3%), como recentemente revisado por Ginn e colaboradores19.

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Os primeiros protocolos clínicos de terapia gênica datam do início dos anos 1990 e foram direcionados para o tratamento de crianças com imunodeficiências severas, mais conhecidas como imunodeficiência severa combinada ligada ao cromossomo X (do inglês, X-linked severe combined immunodeficiency – SCID-X1) e deficiência de adenosina deaminase (do inglês, adenosine deaminase deficiency – ADA-SCID)20,21. Essas doenças são caracterizadas pela inabilidade das células progenitoras do sistema imune diferenciarem-se em células maduras, principalmente os linfócitos T e B. Os pacientes acometidos ficam então altamente suscetíveis a infecções bacterianas e virais, e na ausência de um tratamento efetivo necessitam de um ambiente estéril para sobreviver22. Infelizmente, 2 das 11 crianças tratadas por terapia gênica na França desenvolveram um tipo de leucemia devido à integração do vetor retroviral utilizado, em uma região próxima do promotor do proto-oncogene LMO2, o que levou a uma transcrição e expressão descontroladas do gene LMO223,24. Outro agravante da situação foi a morte trágica de um paciente de 18 anos nos Estados Unidos, em 1999, atribuída a uma severa inflamação sistêmica causada pela reação a um vetor adenoviral contendo o gene da ornitina transcarbamilase, uma enzima envolvida na síntese de ureia 25. Estes incidentes levaram a uma diminuição drástica dos protocolos de terapia gênica a partir de 2003, advinda do aumento da preocupação das agências regulatórias, principalmente, com a utilização de vetores virais, ocasionando o aumento do número de estudos voltados para a segurança dos protocolos3,26,27. Com relação à utilização dos queratinócitos em protocolos de terapia gênica ex vivo para o GH, em um dos primeiros trabalhos28 foram utilizados queratinócitos humanos primários, transduzidos com um vetor retroviral contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), e foi obtida uma expressão in vitro de apenas 0,072 µg hGH/10 6 células/dia. O epitélio formado por essas células foi implantado em camundongos atímicos, mas não foi detectado hormônio na circulação dos animais. Em um trabalho subsequente, foi utilizada uma linhagem estabelecida de queratinócitos derivados de um carcinoma facial escamoso, a qual foi transfectada com vetores plasmidiais contendo o gene do hGH controlado por promotores da metalotioneina ou da timidina quinase. Embora tenha sido obtida uma alta expressão in vitro de 5,3 µg hGH/106 células/dia, os níveis de hormônio secretados na circulação de camundongos atímicos foram de 0,6 ng/mL a 0,1 ng/mL a valores indetectáveis, após quatro semanas do implante29. Um nível mais alto de hGH na circulação, de até 2,6 ng/mL, foi obtido por Jensen e colaboradores30 em camundongos atímicos implantados com queratinócitos

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humanos primários transfectados por um vetor plasmidial, no qual o gene do hGH estava sob o controle do promotor do vírus de símio (SV40). Como a secreção de hGH durou apenas quatro dias, os autores atribuíram a causa à perda das células da camada basal, fato visualizado por meio da utilização de queratinócitos transfectados com o gene repórter da β-galactosidase. Outro tipo de estratégia foi utilizada pelo grupo de Vogt e colaboradores31, que infectaram queratinócitos porcinos com um vetor retroviral contendo o gene do hGH, e essas células foram transplantadas em feridas criadas em porcos, originando um tipo de sistema de cultura celular in vivo. O hormônio foi detectado no fluido da ferida durante dez dias com um pico de 0,35 ng/mL no sexto dia. Os autores relataram que a não detecção do hGH a partir do décimo dia coincidiu com o restabelecimento da barreira epitelial que impediria sua difusão. Foi sugerido, porém, que este modelo poderia ser útil na cura de feridas, em que é requerida apenas uma secreção temporária de fatores de crescimento ou proteínas terapêuticas. A tecnologia de camundongos transgênicos também foi utilizada para demonstrar a eficácia de modelos de terapia gênica baseados em queratinócitos. Wang e colaboradores32 produziram camundongos transgênicos pela microinjeção de um plasmídeo contendo o gene do hGH controlado pelo promotor da queratina 14 humana, e estes camundongos secretaram altos níveis de hGH, de até 50 ng/mL. Fragmentos de pele da cauda destes animais foram implantados no dorso de camundongos scid, obtendo-se níveis de hGH entre 0,15 ng/mL e 0,40 ng/mL na circulação durante catorze semanas. Esses valores correspondem a apenas um décimo dos níveis fisiológicos, e não foi observado, portanto, um aumento do peso corpóreo dos camundongos implantados. Esse tipo de estudo demonstrou, porém, que o implante de pele de camundongos transgênicos foi capaz de proporcionar níveis detectáveis de hGH na circulação por um longo período. Esses trabalhos serviram de base para que nosso grupo investisse esforços no desenvolvimento de uma metodologia de terapia gênica ex vivo, baseada na utilização de queratinócitos humanos primários, transduzidos por vetores retrovirais contendo os genes do hormônio de crescimento humano (hGH) ou de camundongo (mGH). As células modificadas geneticamente foram implantadas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid), e os principais resultados são relatados na próxima seção, juntamente com aqueles obtidos por outros grupos que também trabalham com terapia gênica de crescimento.

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23.3 TÉCNICAS DE TERAPIA GÊNICA APLICADAS A MODELOS ANIMAIS DE NANISMO 23.3.1 Estratégias ex vivo 23.3.1.1 Mioblastos Um grupo canadense 33 relatou que o defeito de crescimento de camundongos anões da linhagem Snell dwarf podia ser parcialmente corrigido mediante implantação de microcápsulas contendo mioblastos alogênicos geneticamente modificados capazes de secretar hormônio de crescimento de camundongo (mGH). A encapsulação destes mioblastos de camundongo e o implante nos Snell dwarf deficientes de GH proporcionou um sistema completamente homólogo. O plasmídeo pKL-mGH que codifica o mGHcDNA sob regulação do promotor de β-actina humana, contendo também o gene da resistência à neomicina, foi usado para transfectar a linhagem celular de mioblastos de camundongos C2C12. Clones resistentes à geneticina (G418) foram selecionados e escolhidos com base no conteúdo de mGH no meio de cultura. O clone Myo-45, que secretava 147 ng de mGH/106 células/dia, foi selecionado para encapsulação. As microcápsulas foram implantadas mediante um cateter na cavidade peritoneal e, ao final da terceira semana, o peso corporal dos camundongos anões tinha aumentado de aproximadamente 1,6 vezes, enquanto o comprimento corporal tinha dobrado com relação ao grupo controle. Houve aumento significativo nos níveis de ácidos graxos livres não esterificados (uma medida do efeito lipolítico do mGH), além de o peso dos órgãos periféricos e da espessura da tíbia resultarem significativamente maiores. Os autores levantaram a hipótese de que a maioria do mGH produzido tinha sido sequestrado pelos receptores de GH no fígado, induzindo a secreção do fator hepático insulino-similar IGF-I, que intermedia a maioria dos efeitos metabólicos sistêmicos dependentes do GH. Depois de cinco semanas, porém, a falta de posterior incremento de peso ou comprimento ficou evidente em todos os camundongos. De acordo com os autores, isto não se deveu à ausência da expressão transgênica pelas células encapsuladas, mas à falta de resposta ao hormônio em camundongos daquela idade (13 a 15 semanas). De fato, um segundo implante de cápsulas recém-preparadas, no dia 42, também não proporcionou ulterior incremento no crescimento. Além disso, células encapsuladas retiradas no

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final do experimento (178 dias) continuaram a secretar in vitro mais de 200 ng de mGH/106células/dia. É interessante observar que todos os grupos de camundongos anões apresentaram níveis de GH baixos ou indetectáveis no plasma (entre 1,32 ng/mL e 1,42 ng/mL no máximo), comparáveis ao limite de detecção menor ou igual a 0,62 ng/mL próprio do radioimunoensaio de mGH utilizado nesse estudo. Os autores, assim, levantaram a hipótese de que as cápsulas provavelmente liberavam níveis circulatórios de mGH abaixo do nível de detecção do ensaio. Contudo, tal estudo demonstrou a eficácia clínica de um sistema não autólogo e seu potencial para uma aplicação generalizada em terapias que requerem um fornecimento sistêmico do produto gênico recombinante.

23.3.1.2 Fibroblastos Os fibroblastos são também um tipo de célula potencialmente interessante para administração ex vivo de produtos gênicos, considerando sua fácil acessibilidade e cultura in vitro, seu sistema conveniente de reimplante e potencial de entrega de proteínas através da circulação. Em 1995, um grupo de pesquisa da Universidade Nacional de Taiwan empregou, portanto, ratos hipofisectomizados em modelo animal capaz de explorar o uso de fibroblastos geneticamente modificados para terapia gênica de crescimento34. Um vetor retroviral dicistrônico contendo o ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) do hormônio de crescimento porcino (pGH) sob controle do promotor de long terminal repeat (LTR) no primeiro cistron e o gene de resistência à neomicina no segundo, foi usado para infectar fibroblastos embrionários primários de rato. As células transduzidas proporcionaram um nível de expressão in vitro de até 1,18 µg de pGH/106 célula/dia, e 5 x 106 células/animal foram injetadas diretamente no peritônio de ratos hipofisectomizados, levando a um crescimento significativo da tíbia de acordo com testes realizados 15 e 57 dias após o implante. Alternativamente, 1 x 106 células foram introduzidas em matrizes (0,5 cm de diâmetro) de colágeno implantadas sob a pele, no dorso dos ratos. Uma reação da polimerase em cadeia em tempo real (RT-PCR) semiquantitativa confirmou que a expressão do pGH por parte dessas células durou até setenta dias. Infelizmente, um método de ensaio imunoenzimático (ELISA) suficientemente sensível não estava disponível, e o pGH não pôde ser detectado no soro dos animais. Por outro lado, o crescimento da tíbia em ratos hipofisectomizados ofereceu uma clara evidência da atividade in vivo do pGH diretamente em ensaio

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funcional, confirmando que os fibroblastos são realmente capazes de secretar persistentemente genes heterólogos. O mesmo grupo chinês usou posteriormente fibroblastos fetais porcinos primários, transduzidos com o vetor baseado em pGH descrito acima, para aumentar ainda mais o peso de suínos Tao-Yuan com retardo de crescimento. Trata-se de uma linhagem local de Taiwan, cuja característica é um lento crescimento e obesidade, mas cuja carne é saborosa35. O uso de fibroblastos imortalizados foi evitado por causa de seu potencial tumorigênico, mesmo tendo sido usados com sucesso em diversos estudos em camundongos. As células primárias transduzidas foram encapsuladas com o mesmo tipo de membrana alginato-poli-L-lisina-alginato já usada para mioblastos de camundongo33 e, posteriormente, implantadas na cavidade peritoneal do porco. Isto proporcionou um aumento significativo de peso já dezesseis dias após o implante, mesmo não sendo detectado incremento de pGH sérico. O uso de microcápsulas imunoprotetivas constitui-se, portanto, um método simples para administrar genes recombinantes in vivo e provou-se uma técnica válida para a melhora no crescimento desses animais. Como as microcápsulas não precisam de preparações ex vivo paciente-específicas e são produzidas em escala industrial, com controle de qualidade relativamente fácil, tal metodologia é também economicamente viável.

23.3.1.3 Queratinócitos Nosso grupo de pesquisa focou suas atividades ex vivo principalmente no uso de queratinócitos humanos primários que foram transduzidos, mediante vetores retrovirais, com os genes do GH humano (hGH) ou de camundongos (mGH), e posteriormente implantados em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid) 2,3,9,11. Queratinócitos da epiderme foram escolhidos como alvo da nossa metodologia de terapia gênica porque estão entre as células mais acessíveis do organismo e podem ser propagadas serialmente em cultura, seguindo trabalho pioneiro de Rheinwald e Green12. Estas células transduzidas estavelmente com o gene do hGH (sob controle do promotor retroviral LTR) propiciaram uma alta secreção in vitro de até 7 µg de hGH/106 células/dia2. Seu implante em camundongos lit/scid levou a níveis circulatórios de 0,2 ng/mL a 0,3 ng/mL de soro, durante ensaio de doze dias (valor do pico: 1,5 ng/mL após quatro horas). Os camundongos implantados mostraram também um incremento de peso (0,060 g/animal/dia) significativamente maior (significância estatística < 0,01, ou P < 0,01) daquele

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apresentado pelos controles (0,023 g/animal/dia), animais que receberam queratinócitos não transduzidos. Um diagrama esquemático deste procedimento com os principais resultados encontra-se na Figura 23.1 2. Esta foi a primeira vez que uma secreção contínua do hormônio e consequentes alterações fenotípicas devidas ao implante de queratinócitos humanos primários secretores de hGH foram demonstradas em camundongos lit/scid, um modelo animal conhecido por ser particularmente sensível a baixas concentrações de hGH10.

Figura 23.1 Diagrama esquemático mostrando os principais resultados da estratégia de terapia gênica ex vivo, utilizando o gene do hGH expresso em queratinócitos humanos primários que foram implantados em camundongos lit/scid.

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Membranas epidérmicas convencionais, formadas por queratinócitos secretores de mGH e preparadas por nós usando a técnica clássica de Barrandon e colaboradores36, mostraram uma queda na velocidade de secreção maior que 80%, simplesmente devido ao destacamento do epitélio do seu substrato. A substituição dessa metodologia de implante convencional por culturas “flutuantes” organotípicas do tipo raft resolveu totalmente o problema. O emprego de uma estratégia ex vivo similar e essa modificação no implante, proporcionaram uma secreção in vitro alta e estável de até 11 µg de mGH/106 células/dia. Além disso, o surpreendente valor de aproximadamente 26 µg de mGH/10 6 células/dia pôde ser alcançado mediante seleção clonal11, realizada semeando queratinócitos secretores de mGH em baixa densidade (aproximadamente 500 células/placa de 10 cm de diâmetro) e isolando colônias de aproximadamente 5 mm de diâmetro por meio de cilindros de clonagem. As células foram expandidas quatro vezes mediante passagens seriais (aproximadamente uma passagem/semana) e contadas, enquanto o meio foi coletado para determinação do mGH por radioimunoensaio. A seleção clonal revelou que, depois de quatro passagens seriais (equivalentes a mais de trinta duplicações cumulativas das células ou a mais de 107 células totais), aproximadamente 30% (7 a cada 24) dos clones isolados mantinha ou apresentava um incremento na expressão de mGH. Esta porcentagem representa a fração de células-tronco de queratinócitos humanos transduzidas presente em nossa cultura, um parâmetro muito importante para alcançar o persistente efeito terapêutico desejado. O implante estável e de longa duração dessas culturas nos camundongos lit/scid pôde ser acompanhado por mais de quatro meses, e um incremento significativo de peso foi observado nos primeiros quarenta dias. Níveis circulatórios de mGH alcançaram um pico de 21 ng/mL exatamente uma hora depois do implante, porém, como já mencionado, este nível caiu, em aproximadamente 24 horas, para valores basais9. No estudo mencionado, foi então desenvolvido um modelo animal de terapia gênica cutânea baseado em camundongos lit/scid e na implantação de culturas organotípicas “flutuantes”. Os queratinócitos humanos primários empregados apresentaram a maior secreção in vitro que já foi descrita para qualquer forma de GH nestas células. Infelizmente, a sustentabilidade desejada para a secreção in vivo do produto transgênico não foi alcançada. Diferentes hipóteses podem ser levantadas como possíveis causas dessa imediata supressão ou bloqueio do GH exógeno na circulação dos camundongos lit/scid após o implante. Elas incluem: (i) uma limitada meia-vida circulatória do GH em lit/scid; (ii) um rápido clearance (depuração) pela

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circulação sanguínea devido a ligações específicas ou à transferência seletiva do GH; (iii) impedimentos devidos à baixa vascularização, a um rápido processo inflamatório ou a uma barreira específica não identificada ao GH exógeno; (iv) a ocorrência de eventos apoptóticos extremamente eficientes, da inativação do transgene ou do seu promotor; (v) uma imunorreatividade parcial (leakiness) desenvolvida espontaneamente pelos camundongos imunodeficientes, que pode levar à produção de células B ou T. Mesmo podendo racionalmente ou até experimentalmente excluir vários desses hipotéticos mecanismos, até o presente momento não foi possível comprovar a existência de nenhum deles. Testes comparativos realizados injetando DNA plasmidial capaz de expressar mGH, seguido por eletroporação in vivo, aproximadamente no mesmo local da epiderme em que são normalmente implantados os queratinócitos, poderiam, portanto, ser informativos. Isto levou o nosso laboratório a realizar estudos sobre a administração in vivo de DNA plasmidial a camundongos lit/lit e lit/scid, a fim de comparar os níveis de hormônio circulante obtidos com este tipo de administração e aqueles obtidos após implantação de células secretoras de GH.

23.3.2 Estratégias in vivo 23.3.2.1 Adenovírus A utilização de adenovírus é uma maneira eficaz para administrar genes terapêuticos, sendo que eles podem ser produzidos e purificados de forma concentrada, o que facilita a transferência in vivo. Outra vantagem está no fato que potenciais efeitos oncogênicos resultantes da integração viral em regiões críticas do DNA são pouco prováveis, sendo que o adenovírus não se integra ao cromossomo do hospedeiro 37. Considerando que os adenovírus podem estimular respostas imunogênicas múltiplas depois de uma administração sistêmica, há muitas estratégias em estudo que podem evitar essa desvantagem. Tais estratégias incluem a modificação no desenho do mesmo vetor adenoviral, o uso de promotores tecido-específicos e de vias locais de administração e a utilização de drogas imunossupressivas ou de compostos específicos capazes de bloquear importantes caminhos imunológicos induzidos pelo adenovírus38. Com relação à deficiência de GH e modelos animais de nanismo, um vetor adenoviral contendo o cDNA de hormônio de crescimento de rato (rGH) foi

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usado em 1996 por um grupo de Houston para induzir a expressão constitutiva de GH em hepatócitos de camundongos lit/lit37. Quando o vetor adenoviral, com o gene do GH sob controle do promotor do fator de elongação humano 1-α (EF1α), foi administrado pela veia caudal em doses de 108 pfu (unidades formadoras de colônias), foram detectados altos níveis de GH no soro por pelo menos sete semanas. Esta dose viral proporcionou um pico extremamente alto de GH no soro (1,9 µg/mL), que depois desceu para aproximadamente 125 ng/mL nas duas semanas subsequentes, permanecendo neste nível por toda a duração do experimento (sete semanas). Uma dose de 109 pfu induziu níveis ainda maiores de GH (aproximadamente 35 µg/mL), que depois desceram para aproximadamente 2,5 µg/mL nas duas semanas subsequentes, estabilizando-se em 1 µg/mL durante todo o estudo. Os autores atribuíram a diminuição na expressão do GH em parte à habilidade do sistema imunitário do hospedeiro em reconhecer e subsequentemente eliminar as células transduzidas pelos vírus. Camundongos anões tratados com 108 pfu de rGH-adenovírus apresentaram um incremento nos níveis de fator de crescimento de insulina I (do inglês, insulin growth factor-I – IGF-I) circulatórios de 61 ng/mL para 238 ng/mL em três semanas. Mesmo com os níveis de GH aumentando de forma dramática, os de IGF-I não seguiram o mesmo padrão. Isso talvez se deva à presença reduzida de proteína 3 ligante de IGF (do inglês, IGF binding protein-3 – IGFBP-3), como já foi observado em animais e seres humanos deficientes de GH. Um rápido incremento de peso resultando em massa corpórea comparável àquela de camundongos normais heterozigotos (lit/+) da mesma idade foi alcançado após cinco semanas de tratamento. Após sete semanas de tratamento, o comprimento corporal total também não foi diferente daquele dos camundongos lit/+, mas a composição corpórea mostrou uma redução na porcentagem de gordura e um incremento no conteúdo de água e proteína. Os animais tratados com rGH-adenovírus mostraram um incremento modesto, porém significativo, no tamanho do fígado e dos rins, juntamente com uma tendência à elevação da glicemia e da insulina em jejum, respostas conhecidamente devidas a uma exposição prolongada a altos níveis de GH. Por outro lado, foi sugerido que a hiperplasia hepática e renal induzida mereceria uma maior investigação. De acordo com os autores, o fenótipo do nanismo foi corrigido, com efeitos colaterais mínimos, pela expressão constitutiva de GH alcançada mediante a administração in vivo de adenovírus recombinantes. Considerando que a correção da insuficiência de GH mediante transferência gênica pode representar no futuro uma válida alternativa ao tratamento convencional, a importância deste trabalho é inegável, sendo que foi o primeiro estudo que demonstrou

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uma completa correção fenotípica do nanismo mediante esta nova técnica terapêutica. De toda forma, a expressão constitutiva de GH em hepatócitos induzida por adenovírus, produzindo enormes quantidades de GH no soro, encontraria sérios obstáculos para sua aplicação em seres humanos. Em estudo sucessivo, realizado em 1999 por grupos do Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos (NIH), localizado em Bethesda, no estado de Maryland, um adenovírus que codifica o cDNA de mGH foi injetado no músculo quadríceps ou no ducto submandibular de camundongos anões da linhagem Snell para obter um sistema homólogo e assim evitar possíveis efeitos colaterais resultantes da administração do hormônio de uma espécie diferente39. Quando o vetor adenoviral foi usado in vitro para infectar células epiteliais submandibulares imortalizadas (SMIE), derivadas da glândula de rato adulto, o maior nível de expressão obtido in vitro foi de aproximadamente 184 ng de mGH/mL, 72 horas após a infecção de células com multiplicidade de infecção (MOI) de 300. Para testar sua eficácia in vivo, o vírus foi injetado no músculo quadríceps de camundongos anões Snell (5 x 10 9 pfu/animal), resultando em níveis séricos médios de 42 ± 29,7 ng de mGH/ mL, quatro dias após a infecção. A administração submandibular propiciou níveis séricos variáveis de 64,1; 3,4 e 11 ng de mGH/mL em três animais. O protocolo intramuscular foi mais eficiente, proporcionando um incremento médio de peso corpóreo do camundongo anão de 8%, em exatamente quatro dias, e de aproximadamente 100% trinta dias após o tratamento. Isto indica que o músculo esquelético proporcionou uma expressão do transgene relativamente estável e sugere que este pode ser um tecido útil para a administração sistêmica de proteínas. Para obter o soro necessário para determinar os vários parâmetros metabólicos, o vetor adenoviral foi administrado também em ratos jovens por via endovenosa. Os efeitos principais foram um incremento de aproximadamente 35% de IGF-I, de aproximadamente 60% de colesterol e de aproximadamente 40% de triglicérides no soro, todas alterações compatíveis com a ação sistêmica do mGH e com seus efeitos anabólicos. Os camundongos e os ratos utilizados nestes estudos receberam dexametasona para inibir a resposta imunológica desses animais imunocompetentes. Os autores concluíram que um vetor adenoviral poderá ser uma válida ferramenta para o estudo de modelos pré-clínicos murinos. Mesmo considerando que a administração intramuscular é mais suave que em outros tecidos (por exemplo, o fígado), acreditamos que a maioria das limitações típicas da terapia gênica adenoviral está ainda presente nesta estratégia.

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23.3.2.2 Vírus adeno-associados Mais recentemente, em 2008, uma nova geração de vetores virais dupla fita adeno-associados (dsAAV), contendo o cDNA de mGH sob controle do promotor universal citomegalovírus (CMV), foram usados por um grupo coordenado pela Escola de Medicina da Universidade John Hopkins. Estes vetores foram empregados na preparação de partículas virais que foram injetadas em camundongos GHRHKO, um modelo de deficiência isolada de GH resultante da ablação generalizada (knockout, KO) do gene hipotalâmico liberador do GH (GHRH)40,41. Estes dsAAV geneticamente modificados podem infectar células em divisão e não, in vitro e in vivo, com expressão transgênica de longa duração (até um ano), causando menores toxicidade e resposta imunológica. São, portanto, considerados mais seguros que os vetores adenovirais. Em estudo inicial, camundongos GHRHKO foram injetados por via intraperitoneal com dose simples (baixa) ou dupla (alta) de 1 x 1011 partículas virais no 10º e no 11º dia de idade, sendo acompanhados até a 6ª ou 24ª semana de vida 40. Peso e comprimento corpóreo dos dois grupos tratados com vetores virais normalizaram com 6 meses de idade, sendo normalizados também os comprimentos do fêmur e da tíbia, a composição corpórea e o peso dos órgãos (fígado, baço, coração e rim). Na 6 a semana, os níveis de GH séricos foram maiores em camundongos que receberam dose viral dupla chegando à normalidade na 24ª semana. O uso de um promotor universal é obviamente uma limitação para qualquer aplicação clínica desta estratégia, sendo bem conhecidos os riscos em longo prazo associados com uma secreção de GH excessiva e não regulada. Os autores concluíram que, enquanto a aplicabilidade destes resultados ainda está bastante longe de qualquer teste clínico em humanos, os vetores adeno-associados (AAV) oferecem um bom ponto de partida para o desenvolvimento de novos sistemas de administração regulada de genes virais para o GH. Estes sistemas poderiam ser baseados no uso de promotores induzíveis, que podem ser regulados facilmente, ou de promotores tecido-específicos, capazes de proporcionar uma boa administração sistêmica juntamente com uma limitada expressão local. Em estudo sucessivo, o mesmo grupo utilizou dsAAV capazes de transcrever cDNA de mGH sob controle da sequência reguladora (expression cassette) de uma creatinoquinase muscular, para assegurar uma adequada administração sistêmica juntamente com uma expressão músculo-específica 41. Uma dose baixa (0,5 x 10 11 pfu) e uma alta (1 x 10 11 pfu) de vírus foram injetadas no músculo quadríceps direito de camundongos GHRHKO

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com 10 dias de idade. Estes camundongos GHD injetados com o vírus mostraram um incremento significativo (P < 0,05) de peso e comprimento corpóreo, sem, porém, alcançar plenamente a normalidade, juntamente com uma redução significativa (P < 0,05) de gordura visceral com 6 semanas de idade. RT-PCR quantitativa mostrou que a expressão do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA) de GH no músculo quadríceps dos animais tratados com doses altas do vírus foi significativamente maior que no gastrocnêmio, músculo cardíaco, rim ou fígado dos mesmos camundongos. Com 6 semanas de idade, os níveis séricos de GH e IGF-I, nos dois grupos tratados, não foram significativamente maiores que nos controles. O estudo mostrou que a estratégia da terapia gênica de crescimento mediada por vetores AAV não é ainda aplicável em nível clínico, mas que, ao mesmo tempo, a administração sistêmica de GH para animais DGH é possível mediante uma única injeção de partículas virais derivadas de dsAAV, usando uma estratégia que concentre a expressão de GH ao músculo esquelético. De fato, é bem conhecido que uma expressão gênica generalizada pode produzir alta toxicidade42.

23.3.2.3 Sistemas não virais, baseados em DNA livre (naked DNA) Uma estratégia alternativa para a administração gênica in vivo consiste na injeção de DNA livre (naked), ou plasmidial, ou a entrega de DNA livre de agentes que promovam a transfecção. Quando realizado em alguns tipos de tecidos, especialmente o músculo, é considerado um método bem prático, que pode proporcionar níveis de expressão gênica bem significativos, ainda que mais baixos do que aqueles obtidos com vetores virais. A simplicidade desta metodologia fez com que ela se tornasse o sistema não viral mais utilizado em testes clínicos de terapia gênica, representando aproximadamente 18% dos testes clínicos em andamento19. Um grupo de pesquisa ligado a uma empresa do Texas foi pioneira na administração de GH gênico mediante DNA livre. Eles desenharam um sistema terapêutico específico para músculo, composto por um plasmídeo capaz de expressar hGH e contendo o promotor esquelético de α-actina de galinha, complexado com um sistema de administração protetivo e interativo (protective, interactive, non-condensing delivery system – PINC TM), que foi usado para injeção intramuscular em ratos hipofisectomizados 43. Este sistema polimérico de administração gênica consiste em polivinilpirrolidona (PVP), que protege os plasmídeos da degradação por parte das

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nucleases extranucleares e facilita a incorporação do plasmídeo nas células musculares. Para testar a expressão do hGH in vitro, mioblastos C2C12 foram transfectados com este plasmídeo músculo-específico, obtendo uma secreção de 43 ng de hGH/mL. O plasmídeo, formulado em salina ou complexado com PVP, foi então injetado no músculo tibialis-cranialis de ratos normais e hipofisectomizados. Os níveis de hGH em músculo de rato normal injetado com 150 µg desse produto foram de aproximadamente 3 ng/g de músculo, ou seja, aproximadamente dez a quinze vezes maiores do que no controle (plasmídeo formulado em salina). Níveis comparáveis de hGH foram detectados em extratos musculares até catorze dias, mostrando um declínio 21 dias após a injeção. Em ratos hipofisectomizados uma dose intramuscular única, porém relativamente alta (1,8 mg de DNA/rato), do complexo plasmídeo hGH/PVP proporcionou aproximadamente 1,5 ng de hGH/g de músculo, 21 dias após a injeção. Os animais mostraram também um aumento significativo do crescimento, enquanto os níveis séricos de IGF-I alcançaram o valor de 145,4 ± 77 ng/mL (vs. 34,7 ± 2,0 ng/mL antes da injeção) aos 21 dias, declinando em seguida. É notável que, depois de uma única dose intramuscular deste gene terapêutico, o incremento no crescimento e nos níveis séricos de IGF-I foram comparáveis àqueles obtidos mediante injeções diárias de hGH recombinante. Anticorpos anti-hGH apareceram no soro catorze dias após a injeção, resposta esta que foi completamente bloqueada mediante administração de ciclosporina. O hGH não foi detectado no soro dos animais injetados, não obstante o incremento sérico do IGF-I e o crescimento alcançado. Os autores atribuíram este fato à possibilidade de que os níveis de hGH estivessem abaixo do limite de detecção do imunoensaio e/ou que o hormônio humano fosse rapidamente eliminado pela circulação devido à sua curta meia-vida circulatória em roedores. Esta terapia mostrou-se também eficaz durante várias semanas, após uma única administração intramuscular do gene. Os autores afirmaram que deverão dedicar mais trabalho ao aperfeiçoamento, seja do sistema de administração, seja do plasmídeo de expressão, para produzirem níveis sustentáveis da proteína terapêutica, que se tornam necessários para que tal terapia gênica possa ser aplicada em seres humanos. Outra técnica usada para administração in vivo do gene de GH por um grupo dinamarquês com o qual estamos colaborando é a transferência gênica hidrodinâmica. Esta estratégia é baseada numa rápida injeção pela veia caudal do DNA plasmidial contido em um volume de tampão correspondente a aproximadamente 10% do peso do animal. O mecanismo exato não é claro, mas a introdução rápida de uma grande quantidade de solução

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aquosa aparentemente produz uma falência congestiva transiente no lado direito do coração com retrofluxo para os vasos hepáticos. O fígado é, portanto, o órgão-alvo dessa terapia, e os vetores transferidos estão presentes, principalmente, de forma não integrada ao cromossomo (epissomal). Esta metodologia foi assim usada para transferir o gene do hGH em camundongos hipofisectomizados 44. A solução toda do plasmídeo pUC-UBI-hGH (40 µg a 50 µg de DNA/1,5 mL a 1,9 mL), contendo a sequência genômica do hGH sob controle do promotor de ubiquitina (UBI) C, foi assim injetada no animal dentro de três a nove segundos. Altos níveis de hGH foram obtidos na circulação dos camundongos, alcançando um pico de 67,1 ng/mL treze dias depois da injeção e permanecendo estáveis em 50 ng/mL durante todo o estudo (68 dias), com a concomitante normalização dos níveis de IGF-I circulante (com um máximo de 599 ng/mL no 13º dia) e da proteína IGFBP-3. Além disso, o crescimento longitudinal se normalizou em termos do comprimento da tíbia e da cauda, enquanto o peso corpóreo se estabilizou 4 g a 5 g abaixo do normal. Os pesos do fígado, baço e pulmões se normalizaram, ao passo que o do coração se normalizou parcialmente e o mRNA de hGH foi expresso somente no tecido hepático. Os níveis de hGH foram aproximadamente vinte vezes maiores que os basais fisiológicos, porém aqueles de IGF-I e de IGFBP-3 foram comparáveis àqueles encontrados em camundongos normais. Os autores sugeriram que uma modificação do procedimento hidrodinâmico, por exemplo, mediante a administração por cateter no fígado isolado, poderia fornecer um protocolo aplicável no futuro a seres humanos. Estes dados sugerem fortemente que a transferência gênica não viral poderia ser uma alternativa viável às injeções diárias em pacientes com DGH, mas ainda há sérios obstáculos que devem ser superados antes deste procedimento poder ser usado clinicamente. A transferência gênica hidrodinâmica também tem sido aplicada com sucesso em cães 45, mas, como indicado por vários autores, caminhos alternativos devem ser mais convenientes para os humanos. Nosso grupo, como já mencionamos, começou trabalhando com a administração de DNA livre e descreveu uma estratégia para terapia gênica in vivo baseada na injeção e eletroporação de um plasmídeo que contém o gene do hGH, no músculo quadríceps de camundongos lit/lit e lit/scid14. O tecido muscular foi escolhido para estabelecer a metodologia, visto que o vetor utilizado é mantido estavelmente nas fibras pós-mitóticas depois da injeção e que tal tecido pode propiciar uma liberação de longa duração da proteína terapêutica. A utilização da eletrotransferência deve ser enfatizada, sendo que, entre os métodos não virais, é considerado o mais eficiente, seguro,

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prático e barato para a administração de DNA, capaz também de diminuir a variabilidade interindividual. Usando o plasmídeo pUC-UBI-hGH (Figura 23.2) fornecido pelo mesmo grupo dinamarquês44, estabelecemos as condições ideais de eletroporação: pulsos de 150 V/cm, com vinte milissegundos de duração, em intervalos de meio segundo. Utilizando estas condições, várias quantidades (12,5 µg, 25 µg, 50 µg, 75 µg e 100 µg) do plasmídeo purificado foram administradas no músculo quadríceps direito. Níveis séricos de hGH, determinados três dias após a injeção do DNA, forneceram uma curva dose-resposta com correlação linear altamente significativa (P < 0,01) no intervalo de dose de 0 µg a 50 µg. Considerando que 50 µg de DNA produziram níveis circulatórios de hGH da ordem de 2 ng/mL a 3 ng/mL por pelo menos doze dias, foi realizado um ensaio de longa duração para determinar o incremento de peso em camundongos lit/scid. Depois de sessenta dias, com a comprovação da secreção contínua de hGH para a circulação (1,5 ng/mL a 3 ng/mL), o grupo tratado com DNA teve seu peso aumentado de um valor médio de 8,92 ± 1,29 para 11,87 ± 0,53 g/camundongo, o que corresponde a um incremento médio de 33,1% (P < 0,001). Por outro lado, o grupo controle (camundongos injetados com salina e também submetidos à eletroporação) apresentou um decréscimo de peso de 9,08 ± 0,95 para 8,70 ± 0,88 g/camundongo, correspondente a uma perda de peso, estatisticamente não significativa, de 4,2%.

Figura 23.2 Mapa ilustrativo do vetor de expressão pUC-UBI-hGH, mostrando o gene do hGH clonado entre os sítios de restrição Eco RI e Bam HI, sob o controle do promotor da Ubiquitina C humana. Outros elementos do vetor de origem pBR322 também estão representados.

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Os quadríceps injetados com DNA apresentaram um incremento de peso de 48,1% em comparação com os controles (P < 0,001), enquanto o incremento de peso dos quadríceps não injetados, dos mesmos animais tratados foi de 31,0% (P < 0,005). Os quadríceps injetados com DNA apresentaram, portanto, um incremento de 45,5% em comparação com os quadríceps não injetados dos mesmos animais tratados (P < 0,001). Estes dados comprovam a existência de efeitos locais (autócrinos e parácrinos) e sistêmicos (endócrinos) resultantes da injeção de DNA que codifica o hGH. Outro experimento de longa duração, realizado com camundongos anões imunocompetentes (lit/lit), não produziu o mesmo grau de significância estatística. O incremento de peso foi um pouco inferior (aproximadamente 21%), e o peso corpóreo deixou de aumentar após aproximadamente um mês. Até o 32º dia, a inclinação da curva de crescimento foi de 0,048 ± 0,038 g/camundongo/dia, e a diferença relativa à curva controle (inclinação = 0,038 ± 0,016) foi estatisticamente significativa (P < 0,01). Melhores resultados foram obtidos recentemente comparando o “velho” modelo relativo ao hGH em lit/lit com um novo modelo homólogo que utiliza mGH nos mesmos lit/lit, certamente mais apropriado para testes pré-clínicos6. O tratamento, com uma única injeção de 50 µg de pUC-UBI-hGH em lit/scid foi também comparado ao tratamento convencional com 10 µg/dia de hGH recombinante (2 x 5 µg/dia/animal), durante trinta dias. As duas diferentes estratégias proporcionaram uma resposta similar em termos de variação de peso: 0,094 g/camundongo/dia para o DNA e 0,095 g/camundongo/dia para a proteína, enquanto o controle (injeção de salina seguida por eletroporação) apresentou uma variação de 0,22 g/camundongo/dia. Neste estudo foi também dada uma ênfase particular à avaliação do crescimento linear (comprimento corpóreo, caudal e femoral) e ao incremento de IGF-I15. Foi, portanto, demonstrado que a administração intramuscular de um plasmídeo contendo DNA genômico de GH pode ser bem efetiva na promoção do crescimento do camundongo anão da linhagem little, um modelo único de deficiência isolada de GH. Estudos posteriores são necessários especialmente para obter níveis circulatórios sustentáveis da proteína terapêutica.

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23.4 POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS Até junho de 2012, 1.843 ensaios clínicos de terapia gênica já tinham sido realizados ou estavam em andamento em 31 países. Destes, 64,4% para o tratamento de diferentes tipos de câncer, 8,7% para doenças derivadas de alterações monogênicas, 8,3% para doenças cardiovasculares e 8% para doenças infecciosas. Após os adenovírus (23,3 %) e retrovírus (19,7 %), os vetores mais usados atualmente são aqueles baseados em DNA plasmidial (18,3 %), que, a nosso ver, representam a alternativa mais promissora para o futuro. Os maiores sucessos terapêuticos foram alcançados graças a terapias baseadas na administração de células autólogas geneticamente modificadas, capazes de expressar fatores específicos não suficientemente sintetizados pelo organismo. Trata-se de doenças como a deficiência de adenosina-deaminase (ADA-SCID), a adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD), o melanoma metastático, a leucemia linfocítica crônica (CLL) e a ß-talassemia19. No caso das doenças de tipo sistêmico, geralmente de derivação monogênica e entre as quais está incluída a DGH, destacamos testes clínicos para a hemofilia, a anemia e a deficiência de antitripsina46-48. Ressaltamos também que a grande maioria (aproximadamente 80%) de todos os testes clínicos realizados até agora estão na fase I ou I/II: o caminho, portanto, apesar de promissor, ainda é relativamente longo. Consideramos os estudos realizados por nós e outros autores relativamente a modelos animais de deficiência de GH interessantes, não somente para a futura introdução de uma nova forma de tratamento, mas também porque representam um modelo experimental que poderá ser aplicado a outros tipos de doenças dependentes da secreção in vivo de uma proteína enviada para a circulação, ou seja, de tipo sistêmico.

23.5 TÉCNICA PASSO A PASSO 23.5.1 Exemplo de metodologia ex vivo: cultura e transdução de queratinócitos humanos primários e ensaio biológico em camundongos anões Os queratinócitos humanos podem ser obtidos de fragmentos de pele derivados de prepúcio de neonato ou de mamoplastia. Após a extração, estas células são cultivadas em meio de cultura apropriado (meio de cultura para

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queratinócitos, ou, em inglês, keratinocyte growth medium – KGM), composto por 70% de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e 30% de meio Ham F-12. A este meio são adicionados soro fetal bovino (SFB) a 10%, tampão ácido etanossulfônico hidroxietilpiperazina (HEPES, 8 mM), toxina colérica (0,1 nM), penicilina-estreptomicina (100 UI/mL – 100 pg/ mL), adenina (1,8 x 10-4 mol/L), triiodotironina (20 pM), transferrina (5 µg/ mL), hidrocortisona (0,4 mg/mL), insulina (5 mg/mL) e fator de crescimento epidermal (EGF, 10 ng/mL), e mantidas em estufa a 37º C e 5% de CO2. Em um dos trabalhos de nosso laboratório 9, os queratinócitos foram transduzidos com o vetor retroviral pLmGHSN, que possui o cDNA do mGH e o gene de resistência à neomicina, seguindo protocolo que se baseia no contato célula-célula somado à adição de polibreno (um polímero catiônico) ao meio para aumentar a permeabilidade celular. Resumidamente, foram semeados 3 x 10 5 queratinócitos em uma placa de 10 cm de diâmetro, contendo uma camada de sustenção, constituída de 3 x 106 células anfotróficas produtoras de partículas virais secretoras de mGH e fibroblastos NIH-3T3-J2 irradiados na proporção 2:1. Ao meio de cultura foi adicionada uma solução de polibreno numa concentração de 8 µg/mL, seguido de incubação por dezesseis horas. O meio foi, então, trocado por meio KGM, e após sete dias de contato, os queratinócitos foram tripsinizados e semeados novamente sobre uma nova camada de sustentação, constituída somente de fibroblastos NIH-3T3-J2. Quando as células atingiram a semiconfluência, o meio foi trocado e coletado após 24 horas para determinação dos níveis de expressão in vitro de mGH por radioimunoensaio (RIA). A seleção dos queratinócitos transduzidos foi realizada com a adição do antibiótico geneticina (0,6 mg G418/mL) ao meio de cultura, devido à presença do gene da neomicina no vetor de expressão. A seguir, os queratinócitos transduzidos foram utilizados para o preparo das culturas organotípicas flutuantes do tipo raft. A metodologia de preparo deste tipo de cultura, utilizada por Kolodka e colegas 49, foi posteriormente modificada pelo mesmo grupo de pesquisa. A principal alteração consistiu na introdução de uma primeira camada acelular composta basicamente de colágeno tipo I obtido da cauda de rato (Upstate Biotechnology, Estados Unidos). Esta primeira camada acelular foi colocada sobre um inserto de plástico com poros de 0,22 µm (Anopore Membrane, Nalge Nunc International, Estados Unidos) para diminuir a possibilidade da segunda camada se destacar e sofrer um encolhimento. A primeira matriz (camada acelular) é, portanto, composta de meio de cultura DMEM, soro fetal bovino, NaOH 1M e colágeno, cuja mistura foi pipetada sobre o inserto

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de plástico de 2,5 cm de diâmetro, previamente colocado num poço de uma placa de cultura de seis poços. Esta mistura foi colocada na incubadora de CO2 a 37º C para polimerizar durante aproximadamente trinta minutos. A segunda matriz (camada celular) foi preparada com os mesmos reagentes, adicionando-se 2 x 105 fibroblastos humanos/inserto, e a mistura foi pipetada sobre a primeira camada seguida de polimerização por aproximadamente uma hora nas mesmas condições. Foram adicionados então 2 mL de KGM sobre as matrizes e 3 mL na placa de cultura. Seguiu-se uma incubação de sete dias na estufa a 37 ºC e 5% CO2 com uma troca de meio, antes da adição dos queratinócitos transduzidos ou controles (7 x 10 5 células/ inserto) sobre as matrizes. Após quatro dias dessa adição, os queratinócitos foram mantidos numa interface ar-líquido com apenas 2 mL de KGM na placa (debaixo do inserto), com trocas de meio a cada dois a três dias. As culturas organotípicas estavam prontas para serem implantadas nos camundongos lit/scid após dez a catorze dias. Camundongos lit/scid com 45 a 90 dias foram previamente anestesiados com 100 mL de uma mistura, preparada com 2 mL de cloridrato de cetamina (solução injetável a 10%) e 0,5 mL de cloridrato de xilazina (solução injetável a 2%) para 2,5 mL de solução salina estéril. A seguir, o pelo da região escapular dorsal foi retirado, e a pele do animal (um círculo de aproximadamente 1,2 cm de diâmetro) foi retirada para acomodar a cultura organotípica, que foi recoberta com um fragmento de gaze parafinada e curativo com band-aid durante uma ou duas semanas. Fotos deste procedimento de implante de cultura organotípica encontram-se na Figura 23.3. Em diferentes tempos após o implante, foram coletadas amostras de sangue para determinação dos níveis circulatórios de mGH por RIA. Como está mostrado na Figura 23.4, o peso dos animais foi acompanhado durante aproximadamente quatro meses e, nos primeiros quarenta dias, foi obtido um aumento significativo de peso do grupo que recebeu os queratinócitos transduzidos em comparação com o grupo controle, como já relatado anteriormente.

23.5.2 Exemplo de metodologia in vivo: injeção de plasmídeos associada à eletroporação e ensaio biológico em camundongos anões Num dos ensaios realizados por nosso grupo15, os camundongos lit/scid foram divididos em três grupos. Em dois deles, os camundongos foram

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Figura 23.3 Procedimento de implante de cultura organotípica contendo queratinócitos secretores de mGH em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid).

anestesiados, como no procedimento anterior, e o músculo quadríceps direito foi exposto. Foi injetada a enzima hialuronidase (20 U/50 µL de salina), que catalisa a hidrólise do ácido hialurônico, principal componente da matriz extracelular, aumentando a permeabilidade das fibras musculares. Após trinta minutos, os animais foram divididos em dois grupos: o primeiro (n = 10) recebeu a injeção de 50 µg do plasmídeo pUC-UBI-hGH, que possui a sequência genômica do gene do hGH sob o controle do promotor da ubiquitina-C humana, e o segundo (n = 8) recebeu injeção de 50 µL de salina. Os dois grupos foram submetidos à eletroporação, utilizando um eletroporador construído em nosso Instituto, sob condições preestabelecidas:

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Figura 23.4 Variação de peso dos camundongos lit/scid (n = 6 animais/grupo), implantados com queratinócitos transduzidos com o plasmídeo pLmGHSN (__●__) ou não transduzidos (__■__). Uma diferença significativa (P < 0,05) entre as duas curvas foi obtida nos primeiros quarenta dias de ensaio, com uma inclinação de 0,042 g/animal/dia para o grupo que recebeu os queratinócitos transduzidos e 0,016 g/animal/dia para o grupo controle.

oito pulsos de 150 V/cm com duração de vinte milissegundos e intervalo de meio segundo entre os pulsos14. Fotos que mostram a injeção do plasmídeo e o posicionamento dos eletrodos no músculo estão na Figura 23.5, assim como a ilustração do peso de um camundongo anão (aproximadamente 10 g) e a comparação do tamanho de um camundongo anão tratado com o DNA do hGH e um não tratado. O terceiro grupo (n = 11) recebeu injeções diárias de hGH recombinante (5 µg r-hGH/duas vezes ao dia/animal), durante 28 dias. O peso dos animais foi monitorado durante todo o ensaio, e foi calculada a variação diária de peso (Figura 23.6). É interessante observar as inclinações praticamente idênticas (P > 0,05) das curvas obtidas com o DNA (0,094 g/animal/dia) e com a proteína (0,095 g/animal/dia), além de uma

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Figura 23.5 Administração do plasmídeo pUC-UBI-hGH ou de salina no músculo quadríceps direito de camundongo anão e posicionamento dos eletrodos nesse músculo antes da eletroporação. O peso médio de um camundongo anão (aproximadamente 10 g) e a comparação de tamanho entre um camundongo anão tratado com o DNA do hGH e não tratado também são ilustrados.

leve inclinação positiva para a curva controle, devido provavelmente à recuperação da eletroporação. Nota-se também um decréscimo de peso dos animais tratados com DNA ou salina durante os primeiros dois a três dias, que pode ser atribuído a um efeito da cirurgia, com uma possível reação inflamatória e redução de ingestão de ração. Provavelmente, se não houvesse esse efeito, as duas curvas seriam sobrepostas.

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Figura 23.6 Variação de peso de camundongos lit/scid tratados somente uma vez com 50 µg do plasmídeo pUC-UBI-hGH (__●__) ou salina (__▲__), seguido de eletrotransferência, ou injetados com rGH recombinante (__■__) (5 µg r-hGH/duas vezes ao dia/ animal). As seguintes equações foram obtidas para cada tratamento: • pUC-UBI-hGH (DNA): y = 0,094x - 0,317 (n = 25; r = 0,965; P < 0,0001); • hGH recombinante (proteína): y = 0,095x – 0,707 (n = 30; r = 0,949; P < 0,0001); • salina: y = 0,022x – 0,318 (n = 25; r = 0,697; P < 0,0001).

23.6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS A utilização de queratinócitos humanos primários geneticamente modificados para tratamento ex vivo de doenças sistêmicas ainda é considerada bastante promissora, especialmente pelas vantagens que apresenta a terapia gênica de tipo cutâneo, por ser ligada ao órgão mais extenso e acessível do organismo. Esta técnica já está sendo utilizada em fases avançadas de testes clínicos ligados a doenças da pele, como a epidermólise bolhosa. No caso dos nossos modelos animais de crescimento, como já mencionado, apesar de resultados preliminares satisfatórios, não foi possível alcançar uma suficiente durabilidade da expressão transgênica in vivo ou pelo menos da presença circulatória da nossa proteína. Melhores resultados foram alcançados mediante injeção de DNA plasmidial, seguida por eletroporação. Esta modalidade de terapia gênica está, de fato, sendo estudada com sucesso por vários grupos para o tratamento de diferentes patologias, incluídas algumas de origem sistêmica, como a hemofilia, a anemia, o diabetes e diversas

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deficiências hormonais50-55. Poucos destes tratamentos, porém, estão na fase de ensaios clínicos. Destacamos a este respeito um dos poucos tratamentos realizados mediante terapia gênica de tipo sistêmico, que está na fase I de testes clínicos e que se refere a DNA plasmidial de um gene supressor tumoral encapsulado em nanopartículas56. Como mostrado no presente capítulo, a correção parcial ou total de defeitos do crescimento tem sido alcançada em diferentes modelos animais de terapia gênica usando várias metodologias ex vivo e in vivo, todas com bom potencial para futuros desenvolvimentos. Dentre estas, achamos que a administração intramuscular de DNA plamidial contendo o gene do hGH, seguida por eletroporação, é provavelmente a mais promissora devido a sua simplicidade, praticidade e segurança. O fato de o plasmídeo ser mantido em estado epissomal pode proporcionar uma menor expressão, oferecendo, porém, ao mesmo tempo a possibilidade de evitar indesejados altos níveis circulatórios do hormônio e perigosas integrações cromossômicas. Obviamente, muito deve ser feito ainda para obter uma expressão mais duradoura in vivo do transgene, juntamente com uma regulação precisa e eficaz dos níveis circulatórios de GH e IGF-I. Em nosso trabalho mais recente6, nos preocupamos especialmente em estudar modelos homólogos de terapia gênica, utilizando camundongos imunocompetentes com uma deficiência de GH cuja origem seja a mesma encontrada em seres humanos, como no caso dos mutantes lit/lit, tratados com DNA para o hormônio de crescimento murino (mGH). Também a avaliação do crescimento linear, com medição de comprimento corpóreo, da cauda e do fêmur, foi preferida à avaliação do incremento de peso; mais importância foi dada aos níveis de IGF-I circulante e à idade do camundongo em tratamento, sempre fazendo referência ao tratamento de crianças com deficiência de GH. A este respeito, achamos importante seguir as recomendações de diferentes autores e agências reguladoras, segundo os quais uma rigorosa eficácia e segurança testada em ensaios pré-clínicos são fundamentos imprescindíveis para um bom ensaio clínico.

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ANIMAIS TRANSGÊNICOS

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CAPÍTULO

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PRODUÇÃO DE ANIMAIS KNOCKOUTS E KNOCKINS Fabiana Louise T. Motta Vicencia Micheline Sales João Bosco Pesquero 24.1 INTRODUÇÃO

O uso de animais para o estudo de novos fármacos e para o entendimento de doenças humanas ainda é essencial. Apesar de haver inúmeras ferramentas alternativas de pesquisa, tais como modelos computacionais, matemáticos, cultura de células e tecidos, estes, porém, ainda não substituem os resultados obtidos com modelos in vivo. Muitas vezes, os resultados produzidos in silico ou in vitro são limitados, pois são modelos simplificados. Os animais ainda são os melhores modelos para testes de novas drogas, pois os resultados neles obtidos se aproximam mais das respostas alcançadas em humanos, principalmente devido à semelhança genética existente entre as espécies. Em todo o mundo, normas éticas para o desenvolvimento da pesquisa científica são discutidas permanentemente e aplicadas de forma rigorosa. O uso de animais no ensino e em protocolos de pesquisa é devidamente avaliado por comitês de ética em pesquisa multidisciplinares que prezam pelo respeito ao animal, seu uso racional, sempre buscando a redução do número

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de animais utilizados e o refinamento das técnicas aplicadas, sendo estes substituídos por modelos alternativos sempre que possível, como consta da Lei n. 11.79411, de 2008, a chamada Lei Arouca. No Brasil, são seguidas normas aceitas internacionalmente para o estudo de novos fármacos e conduta com animais. Esses estudos, por sua vez, precisam passar pela fase pré-clínica, composta pelo uso de modelos in vitro e in vivo, para, posteriormente seguir para a fase clínica, com participação de voluntários humanos nos testes. Os estudos pré-clínicos são importantes para testar efeitos de toxicidade reprodutiva, genotoxicidade, tolerância local e carcinogenicidade, como divulgado nos guias para a condução de estudos não clínicos publicados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa)1. Muitos modelos animais são usados em pesquisa científica. Entre eles estão organismos mais simples, como bactérias, leveduras, vermes e moscas, mas também são utilizados animais vertebrados, como peixes, répteis, aves e anfíbios, e até mamíferos, como roedores (camundongos e ratos) e primatas. Os camundongos são um bom modelo animal para doenças humanas, pois dos cerca de 30 mil genes presentes em humanos e em camundongos, apenas 1% deles é exclusivo de alguma dessas espécies2. Além disso, os camundongos são animais pequenos, que podem ser mantidos em ambientes controlados e podem ter genética idêntica entre indivíduos, limitando, assim, a influência de fatores de confusão no estudo de patologias. Os estudos iniciais de doenças genéticas em camundongos deram-se pelo uso de animais que sofreram mutações espontâneas, tais como os animais imunodeficientes (do inglês, severe combined immuno-deficiency – SCID), animais diabéticos não obesos (do inglês, non-obese diabetic – NOD) e animais obesos mutados para o gene da leptina (ob/ob) 3-5. Outra abordagem utilizada para a geração de animais mutados foi através do uso de agentes químicos como a radiação ou a etilnitrosureia (ENU) para a geração de mutações aleatórias no genoma e posterior genotipagem para a identificação das mutações e fenótipos6. O início do desenvolvimento da tecnologia para a geração de animais transgênicos aconteceu no início da década de 19807. Naquela época, diversos grupos dedicaram-se a entender os mecanismos necessários para a introdução de sequências de ácido desoxirribonucleico (DNA) codificantes no genoma de camundongos, sendo estas passíveis de herdabilidade8, 9. No Brasil, os primeiros animais transgênicos foram gerados no início dos anos 2000 9. Em 2002, nosso grupo participou da geração do primeiro animal transgênico por injeção pronuclear, o camundongo Vitor, com tecnologia

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Produção de Animais Knockouts e Knockins

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nacional pelo Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia (Cedeme), na Universidade Federal de São Paulo10. Os animais geneticamente modificados (OGM) ou transgênicos ainda são as melhores opções para o entendimento de doenças genéticas e vias de sinalização específicas. Entre os animais transgênicos, estão os modelos de deleção gênica, animais knockout (KO) e modelos de inserção genética sítio-dirigida, animais knockin (KI). Além disso, avanços mais recentes possibilitaram a deleção ou inserção gênica em tecidos específicos através do uso de promotores que direcionam a expressão gênica. Finalmente, foram gerados modelos de expressão gênica regulados por drogas ou moléculas inertes que limitam a expressão gênica a períodos específicos; e expressão gênica conjugada com moléculas fluorescentes, o que permite inclusive sua quantificação e acompanhamento temporal.

24.2 HISTÓRICO A criação de modelos animais transgênicos foi essencial para o avanço na área científica. Hoje, essa história tem sua importância reconhecida, uma vez que os desenvolvedores iniciais dessa técnica, Mario Capecchi (University of Utah, Salt Lake City, Estados Unidos), Oliver Smithies (Howard Hughes Medical Institute, University of North Carolina, Chapel Hill, Estados Unidos) e Martin Evans (Cardiff University, Cardiff, Reino Unido) receberam o Prêmio Nobel em Fisiologia e Medicina de 2007. Dois pontos foram essenciais para o desenvolvimento da técnica de transgenia: o isolamento de células embrionárias e a técnica de recombinação homóloga. As células embrionárias são isoladas da massa celular interna de blastocistos, oócitos 3,5 dias após a fertilização. Essa técnica de isolamento foi desenvolvida em 198110,11. As células embrionárias podem ser cultivadas e são pluripotentes. Fazendo uso dessas propriedades, em 1984 pesquisadores injetaram essas células em blastocitos e deram origem a animais quiméricos 7,12, que, por sua vez, puderam ser usados em cruzamentos, como exemplificado na Figura 24.1. Ainda em 1984, Lin e colaboradores demonstraram a possibilidade da realização de recombinação homóloga em células de camundongos 13. Em 1985, Smithies e colaboradores aprimoraram a técnica, utilizando a recombinação homóloga para modificar o gene da β-globulina pela introdução de um cassete de resistência à neomicina 14,15. Isto demonstrou a possibilidade da geração de alterações dirigidas, diferentemente da recombinação

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Figura 24.1 Esquema para obtenção de animais nocautes pela técnica de microinjeção de células tronco embrionárias modificadas no blastocisto.

aleatória de insertos ao genoma, como no caso da técnica de transgenia por adição. A maioria das linhagens de células embrionárias geradas são provenientes de animais 129 de pelagem agouti, porém são injetadas em animais de pelagem diferenciada, como o C57/Bl6, o que possibilita a geração de animais quiméricos com pelagem malhada8 (Figura 24.2). O gene da hipoxantina-guanosina fosforibosil tranferase (hrpt) foi o primeiro a ser excluído em células embrionárias de camundongos16.

24.3 DIFERENÇAS BÁSICAS ENTRE OS MODELOS CLÁSSICOS DE ANIMAIS GENETICAMENTE MODIFICADOS 24.3.1 Transgênico de adição São animais gerados através da introdução de um DNA exógeno (transgene), normalmente por microinjeção pronuclear. A integração do transgene ocorre de forma randômica, podendo ocorrer a integração de mais de uma cópia do transgene ao genoma do animal. Após essa integração, a modificação terá um caráter hereditário. Normalmente, a modificação resultará em um ganho de função/fenótipo (Figura 24.3).

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Produção de Animais Knockouts e Knockins

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Figura 24.2 Animais quiméricos com pelagem malhada obtidos a partir da injeção de células tronco embrionárias provenientes de animais 129 de pelagem agouti em animais de pelagem diferenciada, como o C57/Bl6.

Figura 24.3 Esquema para obtenção de animais transgênicos pela técnica de transgenia por adição, onde o DNA exógeno (transgene) é introduzido por microinjeção no pronúcleo do oócito fertilizado.

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24.3.2 Knockout (ou knockout constitutivo – KO) São animais que possuem uma região específica do DNA retirada do seu genoma ou interrompida por alguma sequência de DNA não relevante. Essa remoção ou interrupção está presente em todas as células do animal e é feita com o objetivo de anular um locus genético específico, normalmente anular a expressão de um gene-alvo e, portanto, causar uma perda de função de tal gene. Essa perda de função se dará quando a modificação genética estiver em homozigose. Esses animais são gerados pela manipulação sítio-dirigida de células-tronco embrionárias, por recombinação homóloga (Figura 24.4).

24.3.3 Knockin (KI) São animais gerados também por manipulação sítio-dirigida de célulastronco embrionárias, porém a região de interesse não é removida ou interrompida, e sim alterada. Essa alteração pode ter como objetivo gerar uma mutação cujo fenótipo se quer estudar, ou a introdução de um gene repórter em fusão ou para ser coexpresso com um gene-alvo, para avaliar em quais tecidos esse gene-alvo está sendo expresso (Figura 24.5).

24.3.4 Knockout condicional São animais com deleção de um determinado locus do genoma, normalmente parte de um gene ou ele inteiro, em tecido(s) específico(s). Esse animal, diferentemente de um knockout constitutivo, não possui todas as células do seu corpo com a deleção, já que apenas nos tecidos de interesse essa região genômica será removida. São animais gerados pelo cruzamento de dois diferentes animais, um knockin que possui elementos de reconhecimento de recombinase flanqueando a região que será removida e outro animal que possui a expressão de uma recombinase no(s) tecido(s) de interesse. Após o cruzamento, ocorrerá a recombinação tecido-específica, causando a remoção da região de interesse apenas no tecido que se quer estudar (Figura 24.6). Para maiores detalhes consultar Doyle (2012) 9, Hofker (2003) 17 e Nagy (2003)18.

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24.4 MODELOS DE MODIFICAÇÃO GENÉTICA DIRIGIDA 24.4.1 Knockout O knockout constitutivo, ou simplesmente knockout, é um modelo animal no qual o gene-alvo é permanentemente removido ou interrompido, em todas as células, gerando perda de expressão e atividade desse gene. As alterações fenotípicas desse animal são estudadas a fim de entender melhor qual é a função de tal gene. A inativação do gene-alvo ocorrerá em todas as fases de desenvolvimento animal, desde a fase embrionária até a idade adulta. Caso o gene inativado seja importante para o desenvolvimento embrionário e/ou fetal, essa inativação poderá ser letal e o animal poderá nem nascer. A base molecular da geração desse modelo animal é a recombinação homóloga entre o genoma da célula-tronco embrionária e um vetor de DNA construído estrategicamente para favorecer esse evento, resultando na substituição de parte do DNA endógeno por parte do DNA exógeno (vetor/construção) (Figura 24.4).

Figura 24.4 Esquema de recombinação homóloga entre o genoma da célula-­tronco embrionária e um vetor de DNA (vetor de recombinação), resultando na substituição de uma região do gene endógeno por parte do DNA exógeno.

A construção do vetor de recombinação geralmente tem como alvo a remoção de um ou mais exons de um determinado gene. Quando tal gene for expresso, produzirá uma proteína truncada e, provavelmente, sem efeito biológico. Para que essa recombinação ocorra, é necessário que o vetor possua

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dois braços de recombinação, isto é, duas regiões idênticas às regiões flanqueadoras do alvo que se pretende remover. Entre esses braços de recombinação é comumente inserido um gene de resistência a uma droga, como o gene neo (que expressa a enzima 3’-glicosil fosfotransferase, causador da resistência ao antibiótico neomicina), mas também pode ser inserido um gene repórter. Esse gene de resistência após a recombinação substituirá a região-alvo que se desejava remover. Como o tamanho dos braços de recombinação são cruciais para aumentar a frequência do evento, sugere-se que ao todo os braços de recombinação somados tenham entre 8 Kb e 12 Kb, sendo que o braço curto de recombinação não deve ser menor19 que 2 Kb (Figura 24.7). Além dos braços de recombinação e do gene de resistência, o vetor deve possuir um gene de seleção negativa, como explicado no item anterior, sendo que esse gene deve se localizar fora da região de recombinação, pois o objetivo é que ele não seja integrado ao genoma da célula quando a recombinação homóloga ocorrer de forma adequada19.

24.4.2 Knockin O modelo animal knockin é baseado na inserção de um gene ou sequência (DNA exógeno) em um local específico do genoma. Este modelo tornou-se uma alternativa mais segura para o modelo de transgênese de adição, porque na produção de animais de superexpressão/adição feito da forma tradicional o DNA exógeno é inserido de forma aleatória no genoma, podendo tal inserção ocorrer em uma região de baixa atividade transcricional ou mesmo interrompendo algum outro gene. Neste último caso, a geração de um animal homozigoto para a inserção pode apresentar fenótipos decorrentes da “deleção” do gene interrompido, e não da superexpressão do gene inserido17. Este modelo pode ser usado para modificar um locus específico do genoma, como por exemplo, a criação de uma mutação específica em um gene de interesse, bem como para a inserção de genes repórteres para se analisar a atividade promotora sem a interrupção do gene subsequente. Outra aplicação é a superexpressão de um gene pela inserção de diversas cópias suas em sequência em seu locus original, de forma que é aumentado o número de cópias de um determinado gene mantendo sua expressão sobre influência do promotor nativo, como é o caso do animal com múltiplas cópias da enzima conversora de angiotensina 20, como exemplificado na Figura 24.5.

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Figura 24.5 Esquema para obtenção de um animal knockin, baseado na inserção de um gene ou sequência de DNA exógeno em uma região específica do genoma.

Os camundongos humanizados também são uma forma de knockin. Neste tipo de modelo, um gene do camundongo é substituído pelo mesmo gene humano. Dessa forma, quando em homozigose, todas as células do camundongo que expressam essa determinada proteína passarão a expressar apenas a proteína humana. Esse tipo de animal muitas vezes é criado para realização de pesquisas pré-clínicas nas quais se testa a eficácia in vivo de um composto21. A produção desse tipo de animal geneticamente modificado é similar à produção de animais knockout. Entretanto, a diferença está no fato de que o evento de recombinação não causará a interrupção ou deleção de um gene, e sim a substituição de uma porção normal por uma mutada ou a inserção de um gene repórter. São exemplos dessa técnica a alteração genética em uma região não crucial do gene ou mesmo a inserção de sequências loxP em regiões intrônicas para a geração de knockouts condicionais, como veremos adiante22. O vetor de recombinação, que será inserido na célula-tronco embrionária, deve possuir dois braços de recombinação idênticos às regiões flanqueadoras da região que se pretende substituir. Entre esses braços de recombinação é inserido o DNA exógeno, que pode ser a mesma sequência que será recombinada, porém com uma mutação, ou então um trecho de DNA flanqueado por sequências loxP ou um gene repórter. É necessário também que haja um gene de resistência a uma droga (seleção positiva) entre os braços de recombinação e um gene de seleção negativa fora dos braços de recombinação (Figura

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24.6), como os vetores para produção de animais knockout. Em algumas situações, o gene de seleção positiva pode ser flanqueado por sequências loxP e, posteriormente removido pela Cre recombinase, como será explicado no item sobre knockout condicional (Figura 24.6)23. Depois das seleções adequadas, as células-tronco embrionárias serão injetadas dentro da cavidade de um blastocisto, e estes transferidos para uma mãe receptora, como descrito anteriormente (Figura 24.1).

24.4.3 Modificação genética condicional Muitas vezes, o gene de interesse de um estudo é essencial para o desenvolvimento e/ou fertilidade do animal, tornando inviável a geração de um teste com uma deleção total desse gene. Outras vezes, o que interessa é a ausência de expressão de um gene em um determinado tecido, e não de uma forma global. A solução para ambos os problemas é a geração de um animal knockout condicional. Animais knockouts condicionais são animais que possuem um gene removido ou interrompido em algumas células/tecidos do corpo. Em todos os outros tecidos, porém, o gene-alvo apresenta uma expressão funcional. Essa deleção condicionada ou seletiva normalmente não afeta o desenvolvimento embrionário e a gametogênese, garantindo assim a viabilidade do modelo. Esse modelo animal é produto do cruzamento de duas linhagens distintas de animais geneticamente modificados. Uma linhagem é um transgênico de adição que expressa a recombinase Cre em um tecido específico, e a outra linhagem é um animal knockin que possui sequências LoxP flanqueando a região que será removida (Figura 24.6). Essa sequência LoxP é inserida em regiões que não afetam a expressão do gene nem sua funcionalidade23, 24. A estratégia associada com a geração do knockout condicional é simples e elegante, aproveitando a ausência da via de recombinação mediada por recombinase Cre em mamíferos (Figura 24.6). A recombinase Cre, uma integrase sítio-específica isolada do bacteriófago P1, recombina duas regiões de DNA compostas por sequências específicas, chamadas LoxP, que a enzima reconhece. As sequências LoxP são formadas por 34 pares de bases, sendo duas regiões palindrômicas de 13 pares de bases flanqueando uma sequência de 8 pares de bases. Esses sítios LoxP não são recombinados na ausência da recombinase Cre23. A expressão da recombinase Cre está sob controle de um promotor tecido-específico. Dessa forma, o animal transgênico de adição só expressará essa enzima nas células nas quais o promotor estiver ativo e,

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consequentemente, a recombinação mediada por Cre só acontecerá nestes tecidos do animal knockout condicional (revisado por Zhang, 201223).

Figura 24.6 Estratégia para a geração de um knockout condicional. Esse modelo animal é produzido pelo cruzamento de duas linhagens distintas de animais geneticamente modificados: um transgênico de adição que expressa a recombinase Cre em um tecido específico e um animal knockin que possui sequências LoxP flanqueando a região que será removida.

24.5 OUTRAS ESTRATÉGIAS 24.5.1 Gene-trap Esta técnica foi criada com o objetivo de inativar genes do genoma do camundongo com alto rendimento, isto é, conseguir inativar facilmente todos os genes do genoma. Utilizando a técnica gene-trap, foi criado um banco de linhagens de células-tronco embrionárias com modificações em apenas um gene, para serem usadas na produção de animais geneticamente modificados. Os vetores de DNA usados na geração de animais knockouts por gene-trap além de inativarem o gene também reportam a expressão deste,

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proporcionando uma marcação molecular de identificação rápida. Diferentemente da estratégia clássica de inativação do gene (knockout constitutivo), que requer um conhecimento detalhado da estrutura do gene para a produção de um vetor de recombinação homóloga, a estratégia de gene-trap não é limitada pelas regiões do gene-alvo e pela eficiência do evento de recombinação homóloga, sendo que ela pode ser utilizada para modificar de um grande número de genes em uma manipulação de células-tronco embrionárias24. O vetor de gene-trap mais utilizado inicialmente é composto por um gene de seleção e/ou gene repórter flanqueado por um sítio aceptor de splicing a montante (upstream) e um sítio de poliadenilação a jusante (downstream). Quando esse DNA exógeno se insere no íntron de um gene, o vetor será expresso sob o comando de um promotor endógeno, que também comanda o gene modificado, resultando em um transcrito composto pelos primeiros exons do gene endógeno em fusão com a região codificante do gene de seleção ou repórter. Por causa do sítio de poliadenilação inserido no vetor, o transcrito se encerrará prematuramente. Portanto, quando esse transcrito for processado, produzirá uma espécie de proteína truncada e não funcional, fundida com uma proteína repórter ou de seleção à droga23. Como vários genes não são expressos nas células-tronco embrionárias, a estratégia apresentada anteriormente não permite a identificação das células modificadas, pois o DNA exógeno só será expresso se o gene modificado for naturalmente expresso naquele tipo celular. Para solucionar esse problema, criou-se uma segunda estratégia, na qual o gene repórter ou de seleção é flanqueado a montante por um promotor forte constitutivamente ativo e a jusante por um sítio doador de splicing. Dessa forma, o DNA exógeno poderá ser expresso independentemente do gene em que está inserido, usando o sítio de poliadenilação endógeno como indicativo do final da transcrição25. Normalmente, a entrada do vetor no núcleo da célula-tronco embrionária é feita por eletroporação ou infecção retroviral, e a inserção do DNA exógeno ao genoma da célula é um evento aleatório.

24.5.2 Nuclease em dedo de zinco (do inglês, zinc finger nuclease – ZFN) Os motivos dedo de zinco são proteínas compostas por cerca de trinta aminoácidos. Suas estruturas terciárias estabilizadas por um íon zinco são capazes de se ligar a uma sequência específica de três nucleotídeos. Existem

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várias proteínas em dedo de zinco diferentes, e estas são capazes de se ligar a diversas combinações de nucleotídeos diferentes. As nucleases em dedo de zinco são estruturadas de forma a conter uma sequência de domínios dedo de zinco, capazes de reconhecer uma sequência-alvo no DNA, fundidos com a endonuclease FokI com o domínio de clivagem não específico ativo. A dimerização de duas nucleases é necessária para quebrar o DNA dupla fita, sendo que cada enzima estará ligada a fitas opostas do DNA25 (Figura 24.7). Para se fazer um modelo animal geneticamente modificado utilizando esta técnica, é necessário inserir por microinjeção ou transfecção plasmídeos de DNA contendo as sequências codificadoras das nucleases em dedo de zinco específicas para sua sequência-alvo ou o mRNA dessas enzimas. Quando traduzidas, as enzimas se ligarão à sequência específica do DNA e o clivarão, sendo que cada nuclease se ligará a uma das fitas de DNA sempre em orientação oposta. Assim, um par de nucleases é necessário para a clivagem de uma sequência não palindrômica de DNA26. Após a clivagem, o DNA dupla fita será reparado. Uma das formas de reparo é a junção de extremidades de DNA não homólogas. Este mecanismo é propenso a erros, muitas vezes criando inserções ou deleções de alguns pares de bases na região reparada. Além disso, essas alterações podem causar uma mudança de fase de leitura, levando à produção de uma proteína truncada, por exemplo27. Outra via de reparo de DNA dupla fita em eucariotos é o reparo do DNA por homologia que usa como molde a sequência do cromossomo homólogo para reparar o material danificado. Baseado neste princípio, juntamente com a nuclease dedo de zinco, se cotransfecta uma molécula de DNA contendo sequências homólogas às regiões que flanqueiam a quebra e uma sequência interna diferente da original. O que se espera é que o sistema de reparo utilize como molde a sequência do DNA exógeno que foi transfectado, no lugar de usar como molde a sequência do cromossomo homólogo não danificado. Esta segunda estratégia, transfectando um DNA molde, pode ser usada para a geração de animais knockouts, bem como knockins, se entre as regiões homólogas flanqueadoras for inserido, por exemplo, um gene repórter 26,27 (Figura 24.7).

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Figura 24.7 Esquema de edição gênica (deleção, substituição, modificação) utilizando o sistema de nucleases em dedo de zinco.

24.5.3 Nucleases efetoras como ativador de transcrição (do inglês, Transcription activator-like effector nucleases – TALEN) Esta ferramenta semelhante à tecnologia ZFN é constituída de uma nuclease (enzima de restrição) FokI em fusão com o domínio de ligação ao DNA de efetores semelhantes a ativadores de transcrição (transcription activator-like effector, TALE). Esta tecnologia pode ser utilizada para modificar genomas através da indução de quebras de cadeia dupla (do inglês, double strand break – DSB) e posterior reparo por mecanismos celulares. O domínio de ligação ao DNA será projetado para hibridizar com uma região específica do DNA e, após a hibridização, a nuclease clivará o DNA dupla fita. O mecanismo de junção de extremidades não homólogas (do inglês, non homologous end joining – NHEJ) unirá as extremidades quebradas da dupla fita e, ao fazer isso, normalmente comete erros de deleção ou inserção de nucleotídeos, sendo que essa peculiaridade do sistema de reparo é aproveitada para modificar o DNA-alvo. Assim como no ZFN, o

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mecanismo de reparo de DNA por homologia também pode atuar, e um DNA exógeno semelhante à região que sofreu a quebra, porém contendo alguma modificação, pode servir de molde para o reparo. Dessa forma, ao consertar a quebra do DNA dupla fita as enzimas de reparo acabam inserindo uma modificação que não existia 27 (Figura 24.8). A sequência codificadora do TALEN normalmente é inserida em plasmídeos, e estes são transfectados em células-tronco embrionárias para que depois da transcrição possam atuar no núcleo da célula, causando a quebra do DNA.

Figura 24.8 Esquema de edição gênica (deleção, substituição, modificação) utilizando o sistema TALEN (transcription activator-­like effector nuclease).

Se a construção do TALEN não for muito específica para sua região-alvo ou se tiver como alvo uma região que não é única no genoma, a clivagem pode ocorrer em mais de um local. A grande quantidade de pontas quebradas de DNA dupla fita para serem reparadas poderá sobrecarregar a maquinaria de reparo e produzir rearranjos cromossômicos ou morte celular (revisado em Fontes, 201326).

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24.6 POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS E/OU INDUSTRIAIS Muitas espécies já foram usadas para a geração de transgênicos, tais como bovinos, ovinos e suínos. Tais animais de maior porte, quando comparados aos camundongos, são de especial interesse prático, apesar de seu uso ainda ser limitado por razões diversas, como seu alto custo26. Os animais de grande porte são de especial interesse como biorreatores para a produção de proteínas recombinantes naturais ou modificadas28. No caso dos porcos, estes são usados para a produção de órgãos para transplante16. Além disso, já existem animais modificados que são resistentes às doenças, como bovinos que possuem deleção do receptor para príons e são resistentes à encefalopatia espongiforme bovina29; e bovinos resistentes à mastite causada por Staphilococcus30. Animais de interesse alimentar, como ostras, peixes e mariscos, também já foram gerados31. Outra alternativa importante é a geração de ratos e camundongos humanizados16. Esses animais possuem proteínas ou sistemas específicos humanos que neles se desenvolvem. Isso implica grande potencial terapêutico, especialmente para testes farmacêuticos. Assim, a geração de modelos animais transgênicos pode aumentar a produção de alimentos através da geração de animais mais férteis e mais saudáveis; além de permitir a geração de insumos importantes, como as proteínas recombinantes de uso comercial em diferentes áreas e possibilitar a geração de órgãos para transplantes e melhores modelos para o estudo de patologias humanas.

24.7 TÉCNICA PASSO A PASSO A produção de animais geneticamente modificados com alterações sítiodirigidas somente se tornou possível após o domínio da obtenção, cultivo e manipulação de células-tronco embrionárias pluripotentes. Essas células são derivadas da massa celular interna dos blastocistos e possuem a capacidade de se diferenciarem em linhagens celulares derivadas dos três folhetos embrionários, e consequentemente darem origem a qualquer célula do corpo22. Para a geração dos modelos clássicos de animais geneticamente modificados, como knockout, knockout condicional e knockin, uma construção de DNA, sequência de DNA especificamente montada para causar a alteração sítio-dirigida, é inserida no núcleo das células-tronco embrionárias por

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transfecção, normalmente. Essa construção sofre recombinação homóloga com o DNA genômico do animal, transferindo parte de seu conteúdo para esse genoma24. A recombinação homóloga ocorre porque a construção de DNA é composta por sequências idênticas (homólogas) às regiões flanqueadoras do locus de interesse (alvo da recombinação) (Figura 24.2). Entre as regiões homólogas da construção pode ainda haver uma sequência sem importância, um gene de resistência a drogas, um gene repórter ou mesmo uma região muito similar à endógena, porém com uma mutação pontual a qual se quer estudar, e isso depende do objetivo do modelo animal. Quando houver o pareamento entre as regiões homólogas da construção e do genoma das células, a recombinação poderá acontecer. Como consequência desse evento, parte do genoma da célula será substituído pelo conteúdo da construção de DNA17. Além das sequências homólogas, a construção de DNA que servirá para manipular geneticamente as células-tronco embrionárias normalmente possui dois genes de seleção. O primeiro é um gene de resistência a uma droga (por exemplo, um gene de resistência à neomicina – neoR), que será responsável pela seleção positiva, de modo que as células que integraram o DNA exógeno ao seu genoma sobreviverão ao receberem esta determinada droga24,32,33. O segundo é um gene de seleção negativa (por exemplo, o gene da timidina quinase do vírus Herpes simplex – HSV-tk), que confere sensibilidade a uma determinada droga chamada ganciclovir, um análogo de timidina. No caso de a inserção não ocorrer por recombinação homóloga, e sim de forma aleatória, esse gene de seleção negativa será integrado ao genoma da célula e será expresso. Na presença do ganciclovir, a timidina quinase produzida por esse gene irá inserir o análogo no DNA da célula, em vez da base timidina, pois sua afinidade pelo ganciclovir é muito maior que pela timidina. Ao ser inserido o ganciclovir no DNA, este não poderá mais ser elongado, consequentemente causando a morte dessa célula. Células que sofreram a recombinação homóloga não terão esse gene inserido em seu genoma, não terão a expressão da timidina quinase do vírus e, portanto, não morrerão com a presença da droga24. Depois que as células-tronco embrionárias são modificadas, elas passam por um processo de dupla seleção, uma positiva e outra negativa, como comentado anteriormente. Isto ocorre porque os eventos de recombinação são muito raros, e a grande maioria das células não consegue integrar o DNA exógeno ao seu genoma. Mesmo após vários ciclos de seleção, cada clone de célula-tronco embrionária é avaliado por Southern blot ou reação em cadeia da polimerase (PCR), com o objetivo de escolher os clones com

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integração correta do DNA exógeno (para informações detalhadas sobre o método, consultar Hall, 200924). As células-tronco embrionárias modificadas e selecionadas são inseridas na cavidade de um embrião hospedeiro (blastocele) em fase de blastocisto. Esse embrião, por sua vez, é transferido para o útero de uma fêmea receptora (mãe de aluguel). O esperado é que as células modificadas se integrem à massa celular interna desse embrião hospedeiro/receptor e ajude a formar um animal quimérico (formado por células de duas origens diferentes). Normalmente, as células-tronco embrionárias utilizadas são de linhagem diferente do embrião receptor, com cor de pelagem também diferente. Essa estratégia facilita a identificação de animais quiméricos, pois estes apresentam pelagem de duas cores24. Mesmo os animais sendo quiméricos na pelagem, isso não garante que suas gônadas tenham sido formadas pelos dois tipos de células ou totalmente pelas células modificadas. Como a intenção é que a modificação genética seja passada aos descendentes, é necessário colocar esse animal quimérico para acasalar e analisar seus filhotes quanto à presença da alteração. Caso haja algum filhote positivo para a modificação, este será considerado um fundador34. Para os estudos com modelos knockout e mesmo para os knockin, é importante que a modificação genética esteja em homozigose. Para isso, é necessário, ao menos no início, fazer o acasalamento de animais heterozigotos e genotipar seus filhotes a fim de detectar os homozigotos para a modificação34. Esses processos, descritos de forma resumida acima, são comuns aos modelos clássicos de alteração sítio-dirigidas. O que irá diferir de um modelo para outro é basicamente a construção do DNA exógeno que será utilizado na modificação das células-tronco embrionárias.

24.8 CONCLUSÕES Desde 1981, quando os primeiros estudos de transgenia foram publicados, o número e a eficácia destas técnicas evoluíram. Hoje, temos a possibilidade de geração de diversas espécies transgênicas, o que nos permite alcançar melhores resultados em nossas pesquisas. A facilidade para a geração de modelos transgênicos e o custo da técnica se reduziram muito com o passar dos anos. Em 1997, o primeiro consórcio internacional para a geração de camundongos mutados por agentes químicos

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foi iniciado19,35. Apenas em 2007 deu-se início ao Consórcio Internacional de Camundongos Knockouts usando a estratégia de recombinação homóloga em células embrionárias, com o intuito de gerar animais knockouts para cada um dos genes homólogos em humanos36. Essa iniciativa envolve diversos institutos em todo mundo e tem se mostrado bastante promissora. Assim, a geração dos modelos passa a não ser mais um fator limitante para a pesquisa.

24.9 PERSPECTIVAS FUTURAS As perspectivas na área de animais transgênicos são muitas. Devido ao desenvolvimento de novas técnicas de transgenia, como o uso de RNAi para deleção ou inativação de genes e a técnica de TALEN, abre-se a possibilidade da geração de novas espécies transgênicas. A aplicação de algumas espécies para a geração de transgênicos não foi tão bem-sucedida como em ratos e camundongos, mas o uso de novas metodologias poderá permitir isso. Assim, dado o rápido desenvolvimento da técnica, poderão ser gerados modelos melhores e mais semelhantes às doenças humanas que os camundongos utilizados hoje, como é o caso dos coelhos para doenças cardiovasculares. Esses fatos deverão propiciar também uma possível redução dos custos e rapidez na geração dos modelos animais. Finalmente, existe também a possibilidade da geração de modelos que possuam múltiplas mutações e/ou deleções, através de cruzamentos entre linhagens transgênicas diferentes ou combinação de técnicas de transgenia, como recombinação homóloga em conjunto com o uso da técnica de etilnitrosureia (ENU). O uso conjunto de técnicas deve possibilitar a geração de modelos mais próximos para doenças complexas e poligênicas, como é o caso, por exemplo, de inúmeras doenças psiquiátricas.

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Produção de Animais Knockouts e Knockins

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CAPÍTULO

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SISTEMA CRE-LOX: TRANSGÊNICOS TECIDO E TEMPO PROGRAMADOS Fernanda M. Policarpo Tonelli Anderson Kenedy Santos Rodrigo R. Resende 25.1 INTRODUÇÃO

Os avanços na química e biologia no século XX geraram um terreno fértil para a proposição de novas formas de estudar, utilizar e entender como os mecanismos biológicos funcionam. Hoje, na era pós-genômica, o genoma de vários organismos já foi decifrado e o volume de dados a serem analisados e anotados cresceu na mesma extensão. Seguindo a sequência de estudos, o próximo estágio é a atribuição de uma função biológica a cada gene ou região genômica anotados. Nesse contexto, animais transgênicos desempenham um papel importante na definição de função de genes, bem como na elaboração de modelos de estudo de doenças, além de poderem ser utilizados no desenvolver de terapêutica para as mesmas. O sequenciamento completo do genoma humano, em especial, pode ser considerado um fator importante para a utilização, desenvolvimento e adequação de sistemas de recombinação sítio-específica, como o Cre-Lox, em práticas na pesquisa biomédica e biotecnológica. A identificação de genes e regiões regulatórias depende da análise da expressão do gene ou do papel

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regulatório da sequência candidata com total correspondência ao in vivo; por isso, a sua alocação específica no genoma do organismo modelo se faz necessária, e por este motivo um sistema de recombinação homóloga tão específica é importante1. Este tipo de rearranjo genômico é amplamente utilizado para análise de linhagens celulares como modelos de doenças e organismos-modelo em procedimentos de knock-out, knock-in, terapias gênica e celular. A recombinação sítio-específica é um mecanismo empregado como uma nova ferramenta de manipulação de sequências de DNA para a engenharia genética com diversas aplicações e abordagens na pesquisa científica básica e aplicada 2. Utilizando recombinases de bacteriófagos, sendo a principal a Cre (do inglês, Cyclization recombination) recombinase, sequências inteiras podem ser inseridas em genomas procariotos e eucariotos 3. A transferência se dá de forma conservativa, isto é, sem alterar o gene ou sua sequência, durante o processo de recombinação. Sequências repetidas e invertidas, chamadas Lox (locus of crossover [x]), que flanqueiam a região a ser recombinada, pareiam-se em sítios de recombinação formando um intermediário de Holliday (uma junção ou intermediário de Holliday é uma junção móvel entre quatro cadeias de ácido desoxirribonucleico (DNA)). A estrutura foi nomeada em referência a Robin Holliday, que a propôs em 1964 para descrever um tipo particular de troca de informação genética em leveduras conhecida como recombinação homóloga (Figura 25.1A)4,5. A atividade da Cre recombinase é controlada pela sua expressão de forma transiente ou constitutiva em células/organismos modificados geneticamente para a técnica. Além disso, o gene cre pode ser expresso a partir da ação de uma região promotora tecido específica; assim, é possível controlar a recombinação Cre-Lox temporal e espacialmente6-9. Existem três formas alternativas pelas quais o Cre-Lox pode agir em um genoma: excisão ou deleção, inversão e translocação. Esta última pode promover a integração genômica e/ou troca de cassete mediada por recombinação (do inglês, recombination mediated cassete exchange – RMCE) quando a região flanqueada corresponde a um cassete de expressão (promotor + gene)1,10 (Figuras 25.1B, C e D). O sistema de recombinação foi inicialmente descrito em procariotos, e nas últimas décadas vários trabalhos o têm utilizado e adaptado para emprego em eucariotos. Para tanto, foi verificada a especificidade da Cre recombinase para sítios Lox nesses organismos, especialmente em mamíferos11,12. O sistema Cre-Lox é visto como uma poderosa ferramenta capaz de substituir a produção de animais transgênicos gerados rotineiramente por

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Figura 25.1 (A) Intermediário de Holliday. (B) Inversão genômica mediada por recombinação Cre-Lox: regiões flanqueadas por sequências Lox podem ser aproximadas e excisadas pela ação da Cre recombinase. A própria recombinase inverte a sequência e religa (atividade de DNA ligase) as extremidades na mesma região genômica, alterando a leitura da sequência invertida (na figura, demonstrado pelo sentido do gene). (C) Translocação: é promovida pela retirada de uma sequência genômica e inclusão em outra posição do genoma (na figura, do cromossoma A para o B). O processo é mediado pela Cre recombinase que necessita de duas sequências Lox, uma na posição de origem e uma na posição de destino no genoma. (D) Deleção: a Cre recombinase pode parear duas sequências flanqueadoras Lox e promover a excisão seguida de religação, como vista em inversão; no entanto, são formados dois produtos, um circular contendo um Lox e a região anteriormente flanqueada e outra contento apenas Lox, que configura a região que perdeu uma sequência original, ou seja, que foi deletada (Para visualizar as cores, acesse o site da Editora Blucher).

injeção pronuclear de DNA exógeno em zigoto fertilizado13. Por esta técnica, a integração genômica pode ocorrer ao acaso e, pelas mutações decorrentes desta, pode-se observar ganho ou perda de função relacionada ao transgene ou regiões adjacentes. Atualmente, é utilizada a Cre em camundongos que contêm alelos knock-out, sendo que um dos alelos é alterado pela inserção

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de sítios Lox entre dois íntrons ou nas extremidades opostas de um gene. A expressão da Cre, ativada de forma transiente, catalisa a recombinação entre os locais Lox e inativa o gene (Figura 25.1D). Assim, por se tratar de um mecanismo altamente específico, é mais seguro utilizar o Cre-Lox em vez de injeção pronuclear 1. A estabilidade do transgene no organismo hospedeiro também é um traço marcante e característico do Cre-Lox, que agrega ao sistema novas funcionalidades em experimentos transgênicos. Neste capítulo, abordaremos os princípios básicos do sistema de recombinação Cre-Lox, no que tange aos seus mecanismos e componentes. Em um segundo momento, trataremos das estratégias em voga que utilizam este sistema como ferramenta, bem como a sua aplicabilidade prática no estudo na área de ciências biológicas, biotecnológicas e engenharia genética.

25.2 PERSPECTIVA HISTÓRICA DO SISTEMA CRE-LOX 25.2.1 A descoberta A descoberta do sistema de recombinação Cre-Lox foi feita no final dos anos 1970 por Sternberg14. O bacteriófago P1 (colifago P1) possuía um sistema até então considerado incomum: um genoma circular e mapa genético linear (Figura 25.2). Inicialmente, a explicação para tal fato seria que as regiões terminais do mapa genômico de P1 continha um hotspot para recombinação e, por isso, marcadores em ambos os lados do hotspot frequentemente pareciam estar desconectados15. Estudos realizados posteriormente confirmaram essa ideia quando foi utilizada a enzima de restrição EcoRI-7 que possui um sítio na posição terminal do hotspot 17. O fragmento gerado da digestão foi então clonado em um vetor A, e logo após foi estimulada a recombinação entre vetores A. Mapeando a região da deleção feita pela enzima de restrição, foi verificado que a recombinação ocorria com maior frequência em um mesmo locus, o LoxP (locus de X-over em P1), e que o próprio bacteriófago P1 possui um fator promotor de recombinação chamado cre, gene que codifica a enzima Cre recombinase 5. A função desse sistema de recombinação para o bacteriófago P1 seria melhorar a infecção como uma forma alternativa de circularização do seu genoma, caso a recombinação com o hospedeiro falhasse. Uma segunda função seria a manutenção da capacidade de segregação do genoma do hospedeiro e formação da forma pró-vírus, cuja frequência é

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Figura 25.2 Ilustração esquemática da organização do material genético do bacteriófago P1. Ele pode se apresentar de duas formas: mapa genético linearizado (A) ou mapa genômico circular (B). O genoma do fago P1 possui genes que codificam para a maquinaria de replicação viral, processo que possui como origem de replicação a OriR, incluindo um segundo conjunto de genes que codificam as proteínas envolvidas no ciclo lítico viral, tendo a OriL como origem. O fago P1 possui ainda um par de sequências Lox em regiões terminais e o gene cre (situado próximo a uma sequência Lox), que codifica a Cre recombinase. Originalmente, as regiões terminais do genoma foram consideradas um hotspot para recombinação, verificando-se depois que se tratava das regiões Lox. A atividade da Cre recombinase é utilizada pelo vírus para a produção das duas formas alternativas, como meio de se manter o número de multímeros constante na forma infectante (lítica) ou integrada ao genoma (fase lisogênica) no hospedeiro16.

proporcionalmente mais baixa do que a forma de pró-fago, aumentando a estabilidade de P13,14.

25.2.2 Cre-Lox em eucariotos Em 1982, foi realizada a primeira tentativa de se adaptar o sistema Cre -LoxP para o genoma eucarioto por Hoess e Ziese18. Nesse estudo, foram analisados os sítios LoxP, LoxB, LoxL e LoxR. Em especial, LoxP foi confirmado como uma sequência repetida e invertida de 13 bp flanqueada de cada

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lado por uma sequência espaçadora assimétrica18 de 8 bp. Logo após, Hoess e Abremski19 identificaram os cofatores, substratos necessários e a definição de uma distância mínima de 82 bp entre os LoxP para que a recombinação se viabilize19. A levedura Saccharomyces cerevisae foi o modelo utilizado por Sauer 12 em 1987 para comprovar que o sistema Cre-Lox era funcional em sistema eucariótico e que demonstrava uma complexidade maior quando comparada à recombinação procariótica. Neste estudo foi confirmada a atividade da Cre recombinase como altamente específica, que não era apenas capaz de reconhecer sítios Lox, como também era capaz de coordenar a sinapse de recombinação - clivagem da dupla fita de DNA, a troca entre fitas e ligação final12,20. Células murinas da linhagem C-127 foram utilizadas pelo mesmo grupo no ano seguinte, e também o sistema Cre-Lox foi considerado aplicável à mamíferos2. Desde então, vários trabalhos utilizaram células de mamíferos e de leveduras para a inclusão de transgene em única cópia no genoma12. Células-tronco embrionárias de camundongo (murine embryonic stem cells – mESC) foram utilizadas para mutação em IgH pela inserção de LoxP entre o éxon terminal J H e o éxon inicial Cµ, pela atividade transiente da Cre, e inserção subsequente em blastocisto. O camundongo gerado foi considerado mutante para IgH pela deleção da região JH-Cµ21 (Figura 25.3). Este estudo merece destaque por ter confirmado a capacidade de criação de diferentes fenótipos em camundongos de forma altamente específica para um gene alvo e que a transmissão para a linhagem germinativa era permissível22. A primeira utilização de células humanas em ensaios de recombinação Cre-Lox em hESC foi realizada por Irion e colaboradores em 1999, o locus ROSA26 recebeu uma variação de LoxP, chamado Lox2272 (discutido à frente neste capítulo) seguido de gene de resistência a neomicina (sem região promotora) e proteína fluorescente vermelha repetida e em tandem (tandem-dimer red fluorescent protein – tdRFP)23. A expressão transiente foi acionada uma vez para cada Lox. Na região flanqueada por LoxP (termo também utilizado como região floxada, do inglês: floxed/flox = flanked by Lox) ocorreu a excisão do gene de resistência à neomicina, enquanto na região entre Lox2272 ocorreu a inversão de tdRFP, colocando o códon de iniciação em fase com o promotor endógeno da região, assim expressando a proteína responsável pela fluorescência avermelhada (Figura 25.4). Cre-Lox em células humanas foi considerada viável a partir desse trabalho e, nesta mesma linha, trabalhos utilizando camundongos e ROSA26 (similar à região

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Figura 25.3 Deleção de JH-Cµ de IgH de células-tronco de camundongo (murine embryonic stem cells – mESC). Retângulos pretos correspondem aos éxons que compõem o gene IgM, triângulos correspondem a sítios LoxP. A deleção baseou-se em dois passos: o primeiro (A) corresponde à recombinação homóloga na linhagem germinativa para inserção de dois sítios LoxP, um promotor timidina quinase de vírus herpes simplex (HSV-TK) induzível por ganciclovir e um gene de resistência à neomicina (Neo), para seleção das células recombinantes formando (B); e o segundo passo (C), à recombinação Cre-LoxP mediada pela Cre, promovendo a deleção de um fragmento circular JH-Cµ-HSV-TK-Neo e formação de um espécime IgH mutante em (D)22.

humana) mostraram os mesmo efeitos. Inclusive ROSA26 foi considerada uma região segura para inserção de transgenes em células-tronco pluripotentes, gerando as células-tronco pluripotentes induzíveis (do inglês, induced pluripotent stem cells – iPSC) já que alterações nessas regiões não afetam a pluriopotência da linhagem23,24. Em 2007, Livet e Weissman 26 inovaram ao propor uma estratégia de recombinação homóloga inicialmente em linhagem humana HEK293 (do inglês, human embryonic kydney cells, células de rim embrionário humano) e, posteriormente em mESC, que provocou uma combinação estocástica de proteínas fluorescentes nos subtipos celulares que compõe a rede neural de camundongo. Foram utilizados vetores plasmidiais contendo genes que codificam diferentes proteínas fluorescentes, invertidas ou não, flanqueadas por diferentes Lox sob controle do promotor citomegalovírus (CMV) ou antígeno de superfície celular Thy1. A atividade da Cre recombinase criou um perfil de cores nas linhagens neurais que possibilitava observar sinapses,

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Figura 25.4 Inserção de tdRFP (tandem-dimer red fluorescent protein, proteína fluorescente vermelha repetida e em tandem) em células tronco embrionárias humanas (human embryonic stem cells – hESC) utilizando recombinação Cre-Lox a partir de um cassete de expressão contendo o gene de resistência à neomicina sem região promotora 25. A Cre age em dois momentos por utilizar dois pares de sítios Lox não idênticos (LoxP e Lox2272): no primeiro, promove a inversão do gene colocando o códon ATG de tdRFP em sequência do promotor endógeno, presente em ROSA26 e, no segundo, promove a deleção do gene de resistência à neomicina.

morfologia e migração celular. Este trabalho diferenciado, sem precedentes, foi starter em uma área da engenharia celular e biologia celular, abrindo uma nova vertente de estudos e, por isso, será abordado com mais detalhes em outro capítulo deste livro.

25.3 ELEMENTOS DO SISTEMA CRE-LOX O sistema Cre-Lox é composto, basicamente, como o próprio nome sugere, de uma enzima recombinase chamada Cre e um par de sítios Lox.

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Estes se encontram naturalmente presentes no DNA do bacteriófago P1, sendo o gene da recombinase adjacente aos sítios de recombinação27. Esta enzima realiza a recombinação de DNA de maneira sítio-específica, ou seja, reconhece a sequência de DNA específica dos sítios Lox para promover a recombinação.

25.3.1 Os sítios Lox A Cre recombinase reconhece um sítio Lox natural de recombinação no material genético do bacteriófago P1, conhecido como28 LoxP. Este consiste em sequência de 34 bp de fita dupla de DNA palindrômica (exceto seus 8 pb mais internos da região espaçadora)29 (Figura 25.5A). Dentre os 34 bp, os treze primeiros e últimos pares são repetições invertidas (quadrados maiores da Figura 25.5A), contendo a região específica reconhecida pela enzima (delimitada pelos quadrados menores)31, e os 8 pb centrais (sublinhados na Figura 25.5A) são assimétricos e responsáveis por conferir um sentido ao sítio29, ou seja, fazem com que a sequência de 34 pb não seja um palíndromo completo, e sim apenas nos 13 pb de cada extremidade, sendo possível, dessa forma definir seu terminal 5’ e o 3’. Esta sequência de DNA, após ser reconhecida pela Cre recombinase, é clivada nas regiões indicadas pelas setas na Figura 25.5A; porém, para que a clivagem ocorra, enzima e substrato devem adquirir uma conformação de complexo produtivo, ou seja: dois sítios LoxP devem ser alinhados de maneira antiparalela, e cada uma de quatro subunidades idênticas de Cre, arranjadas em anel, deve ser capaz de contactar outras duas subunidades vizinhas e metade de um sítio LoxP (figuras 25.5B e C)29. A recombinação que ocorre com alta eficiência entre dois LoxP (recombinação esta responsável naturalmente por promover a circularização do bacteriófago P1), também pode ocorrer na natureza quando o plasmídeo (material genético do P1) contendo os sítios LoxP é integrado ao cromossomo bacteriano; porém, este último processo ocorre com menos eficiência, e o sítio no qual este ocorre no material genético da bactéria é chamado LoxB. Segundo Hoess e colaboradores, quando a recombinação entre os LoxP e B ocorre, surgem então os Lox híbridos 28 L e R, que flanqueiam o pró-fago integrado27. Estes quatro Lox, todos de existência natural, possuem entre si diferentes eficiências de recombinação via Cre, sendo LoxP e LoxL os mais eficientes para este evento32.

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A)

B)

C)

Figura 25.5 (A) Sítio LoxP com sua sequência de 34 pb. Nos quadrados maiores, a porção palindrômica do sítio, ou seja, repetições invertidas entre si. Nos quadrados menores, a região do palíndromo reconhecida pela enzima recombinase. A região central sublinhada é assimétrica e confere sentido ao sítio. As setas indicam os sítios de clivagem da recombinase. (B) Representação esquemática das duas fitas da dupla hélice do DNA, com os sítios LoxP representados pelas faixas grossas e seu sentido indicado pelas setas. Para que ocorra a clivagem, cada uma das quatro subunidades de Cre (representadas pelos círculos), deve ser capaz de contactar outras duas subunidades vizinhas de enzima e metade de um sítio LoxP (alinhados de maneira antiparalela). (C) Complexo sináptico com as quatro subunidades de Cre recombinase a as moléculas de DNA30.

No entanto, com o desenvolver de novas aplicações para o sistema Cre -Lox, e tentativas de elucidação do mecanismo de ação e conformações

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assumidas durante o processo, diferentes versões de sítios Lox mutados foram desenvolvidas.

25.3.2 Sítios Lox mutantes No ano de 1986, Hoess e colaboradores mencionaram a possibilidade de se gerar sequências Lox mutadas na região espaçadora entre as repetições invertidas das extremidades do LoxP. Em seu trabalho, utilizaram quatro mutantes produzidos (mutações sublinhadas na Tabela 25.1) e concluíram que, das mutações realizadas, a única que reduz drasticamente o potencial de recombinação é o LoxP 514; além disso, na utilização de região espaçadora simétrica a frequência de excisão e inversão é a mesma33. Tabela 25.1 Sítios Lox mutados na região espaçadora

SÍTIO

SEQUÊNCIA

Lox 511

ATAACTTCGTATAGTATACATTATACGAAGTTAT

Lox 514

ATAACTTCGTATAGCGTACATTATACGAAGTTAT

Lox512

ATAACTTCGTATAGCACACATTATACGAAGTTAT

Lox sym

ATAACTTCGTATAATGTACATTATACGAAGTTAT

Em 1995, Alberts e colaboradores reportaram a possibilidade de geração de sequências Lox mutadas em sua região de repetição invertida de nucleotídeos (em destaque nos quadrados maiores na Figura 25.5A) direita (RE) ou esquerda (LE); da recombinação entre estas se pode obter o Lox mutado, conhecido como mutante no elemento da esquerda / elemento da direita (mutante LE/RE, Left Element/Right Element)34. Estes pesquisadores obtiveram sequências contendo cinco nucleotídeos modificados no elemento repetitivo de 13 bp da esquerda (Lox71) (Figura 25.6A) e na direita (Lox66) (Figura 25.6B); utilizando-se dessas sequências foi possível a promoção de recombinação34. Araki e colaboradores, dois anos mais tarde, analisaram o potencial de promoção de recombinação destes sítios mutados e observaram que eles seriam muito úteis para a realização de knock-in de genes, visto que a frequência de integração de DNA sítio-específica oferecida pelos Lox mutados era máxima em 16%: valor bastante superior aos cerca de 0,2% do LoxP nativo35.

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Figura 25.6 (A) Sítio Lox71. No destaque dentro do retângulo, a porção correspondente à região palindrômica esquerda do sítio LoxP que se encontra mutada no Lox71 (os cinco nucleotídeos modificados encontram-se grifados). A região central sublinhada em preto é a correspondente à porção assimétrica do sítio LoxP, que permaneceu inalterada. (B) Sítio Lox66. No destaque dentro do retângulo, a porção correspondente à região palindrômica direita do sítio LoxP, que se encontra mutada no Lox66 (os cinco nucleotídeos modificados encontram-se grifados). A região central sublinhada em preto é a correspondente à porção assimétrica do sítio LoxP, que permaneceu inalterada.

Na tentativa de obtenção da estrutura cristalizada do complexo Cre-Lox, Guo e colaboradores obtiveram, ainda em 1997, o LoxA, que apresentava simetria, diferentemente do LoxP. Este foi desenvolvido pela mudança de três pares de bases do LoxP, substituindo-se a sequência CAT por TGC (região em destaque na Figura 25.7); dessa forma, foi possível obter dados de estrutura da Cre recombinase (por exemplo, detalhes da região de seu sítio ativo), do sítio Lox (por exemplo, o posicionamento ótimo do DNA durante a sinapse), e do complexo Cre-Lox (por exemplo, sua arquitetura e interações no complexo sináptico)36. Nesse mesmo ano, Bouhassira e colaboradores promoveram recombinação usando Lox heteroespecíficos, realizando a chamada troca de cassete mediada por recombinase (RMCE). Sabendo-se que a recombinação não é promovida entre sítios Lox, que diferem na região espaçadora, estes pesquisadores flanquearam, no DNA doador e no receptor, a região a ser permutada por dois Lox diferentes, que se recombinavam cada um com seu semelhante no DNA-alvo37 (Figura 25.4). Em 1998, Lee e Saito realizaram um estudo envolvendo 54 mutantes do LoxP na região espaçadora: 24 deles com apenas uma base alterada e 30 deles com duas bases substituídas. A eficiência de recombinação destes se mostrou inferior, exceto a observada para os mutantes 5171 e 2272, que recombinaram eficientemente com mutantes iguais, mas não com mutantes diferentes ou com o LoxP38. No ano seguinte, o LoxA, também chamado por Guo e colaboradores de LoxS (simétrico, Figura 25.7), foi utilizado na presença de duas recombinases mutadas (CreR173K e CreY324F) para obtenção de estrutura cristalizada de complexos sinápticos estáveis31.

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Figura 25.7 LoxA ou LoxS. Foram desenvolvidos para apresentar simetria, a partir da estrutura do LoxP (assimétrico). Em destaque, destacam-se os três pares de bases alterados no LoxP para originar o LoxA ou S: substituiu-se a sequência CAT por TGC.

Gopaul e colaboradores, por sua vez, desenvolveram o LoxS6 para determinar a estrutura do intermediário em forma de junção de Holliday, originado no processo de recombinação. O LoxS6, assim como o LoxA ou LoxS, é simétrico; mas diferentemente deles tem 34 bp, assim como o LoxP; as bases T desemparelhadas no terminal 5’ presentes no LoxS (Figura 25.8A, em destaque) não existem no LoxS6 (Figura 25.8B)39.

Figura 25.8 (A) Sequência de nucleotídeos do LoxS; este possui nucleotídeos T desemparelhados no terminal 5’ (destacados pelos círculos). (B) Sequência do LoxS6, que assim como o LoxA ou LoxS é simétrico. Este tem o mesmo número de pares de bases que o LoxP e é idêntico ao LoxS, exceto pelos nucleotídeos T desemparelhados no terminal 5’.

Santoro e Schultz desenvolveram oito variantes de sequência de sítios Lox (Lox M1 a M8, Tabela 25.2) para entender melhor as bases moleculares de reconhecimento das sequências Lox e gerar, por mutagênese randômica, recombinases com diferentes especificidades capazes de reconhecer variantes de sequência Lox. A recombinase selvagem Cre foi capaz de promover a recombinação nas variantes de sequência, exceto29 em M3, M5 e M7.

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Tabela 25.2 Sequências LoxM1-M8 e potencial de promover recombinação

LOX

SEQUÊNCIA

CAPACIDADE DE PROMOVER RECOMBINAÇÃO VIA CRE

M1

ATAACTTCATATAGCATACATTATATGAAGTTAT

+

M2

ATAACTTCGTACAGCATACATTGTACGAAGTTAT

+

M3

ATAACTTCATACAGCATACATTGTATGAAGTTAT

-

M4

ATAACTTTGTATAGCATACATTATACAAAGTTAT

+

M5

ATAACTTCGTGCAGCATACATTGCACGAAGTTAT

-

M6

ATAACTCTGTATAGCATACATTATACAGAGTTAT

+

M7

ATAACTCTATATAGCATACATTATATAGAGTTAT

-

M8

ATAACTCTGTGTAGCATACATTACACAGAGTTAT

+

Ainda em 2002, Langer e colaboradores utilizaram os LoxM2, M3, M7 e M11 (Tabela 25.3) mutados na sequência espaçadora e observaram que todos eram incompatíveis com o LoxP nativo para recombinação, além de LoxM3 e M7 serem também incompatíveis entre si40. Nesse mesmo ano, Araki e colaboradores publicaram um importante trabalho no qual compararam a eficiência de inserção de sequências com LoxLE/RE mutantes e da estratégia RMCE. Esta última estratégia mostrouse mais eficiente que a primeira, e a combinação de ambas se mostrou vantajosa, pois apesar de a eficiência ser semelhante ao uso de RMCE, a estabilidade do produto recombinado é maior41. Tabela 25.3 Sequências LoxM2, M3, M7 e M11

LOX

SEQUÊNCIA

M2

ATAACTTCATATATGGTTTCTTATATGAAGTTAT

M3

ATAACTTCGTACATGGTATTATGTACGAAGTTAT

M7

ATAACTTCATACATGCTATCTTGTATGAAGTTAT

M11

ATAACTTTGTATATGGTATCGTATACAAAGTTAT

Em 2003, Thomson e colaboradores obtiveram (com regiões mutadas sublinhadas) os LoxJT15 (AATTATTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT)

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e Lox JTZ17 (ATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTAT) com taxa de integração no processo de recombinação (cerca de 1.500 vezes) muito superior à encontrada42 para Lox 71 e Lox 66. Araki e colaboradores concluíram que, assim como o LoxJTZ17, o LoxKR3 (ATAACTTCGTATAGCATACATTATACCTTGTTAT) produz, na recombinação com DNA contendo Lox71, duplos mutantes mais estáveis que os gerados43 por Lox66 versus Lox71.

25.3.3 A Cre recombinase A Cre recombinase é codificada por sequência de DNA presente no bacteriófago P1 e consiste em enzima de 38 KDa, membro da família das λ integrases. Catalisa a recombinação entre sítios de DNA dupla fita de sequência particular, os sítios Lox, que flanqueiam uma determinada região de interesse. Esta enzima é capaz de fazê-lo sem o auxílio de outras proteínas ou cofatores em uma ampla gama de ambientes celulares ou in vitro17,29. As funções originais desta enzima no bacteriófago P1 são: promover a ciclização do P1 após a infecção e resolver plasmídeos diméricos para manutenção de cópias fiéis a cada divisão bacteriana44. Além da simplicidade de utilização da Cre em ambientes celulares e não celulares diversos, esta enzima apresenta versatilidade de recombinação de segmentos de DNA, possibilidade de controle temporal do processo de recombinação e do tipo celular que realizará a expressão do gene. Quanto à versatilidade de recombinação de segmentos de DNA, esta permite o extenso uso do sistema Cre-Lox em experimentos de manipulação de cromossomos e genomas44-46. A enzima necessita da presença de dois sítios LoxP (ou suas versões mutadas) para promover a recombinação de sequências de DNA, e a depender da localização relativa entre estes, pode ocasionar inversão (da sequência entre sítios Lox em série e de orientação inversa, Figura 25.9A), excisão (da sequência entre sítios Lox em série e de mesma orientação, Figura 25.9B), substituição de fragmentos (Figura 25.9C) ou inserção de sequências (Figura 25.9D)29,46. Quanto ao controle temporal, Metzger e Chambon, por exemplo, desenvolveram uma Cre recombinase tamoxifeno dependente. Sob indução, esta enzima foi capaz de promover, com eficiência de cerca de 40%, a excisão de uma sequência-alvo em células da pele de camundongos47. Em relação ao tipo celular que deve expressar a enzima, Tsien e colaboradores utilizaram um promotor derivado do gene da α-calmodulina quinase

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II (αCaMKII) para dirigir a expressão da Cre recombinase em células piramidais CA1 do hipocampo48. Por evento de recombinação são necessárias quatro moléculas de Cre, pois para cada repetição invertida de 13 bp é necessária uma molécula (o que acarreta em duas moléculas por cada um dos dois Lox envolvidos)49. A elucidação de estrutura da Cre recombinase revelou que esta se dobra em dois domínios separados por um linker e possui cinco α hélices em seu N-terminal (A-E). Destas, as hélices A e E encontram-se envolvidas na formação do tetrâmero de Cre para a catálise, e as hélices B e D entram em contato com os sítios Lox. No C-terminal existe uma pequena folha β e nove hélices (F-N). Destas, a hélice N participa do contato intersubunidades36 (Figura 25.5C).

25.4 MECANISMO DE RECOMBINAÇÃO PELO SISTEMA CRE-LOX O mecanismo de recombinação pelo sistema Cre-Lox envolve, em primeira instância, o reconhecimento dos sítios e ligação das Cre recombinases ao DNA; a estereoquímica de ligação é de duas moléculas de Cre por sítio Lox. Depois de formado o tetrâmero, a sinapse de recombinação é originada, com a consequente aproximação dos sítios Lox em posição adequada 50. Ocorre então, a clivagem do DNA, seguida pela troca das fitas e de sua religação com a formação da junção de Holliday e sua resolução30. A recombinação ocorre na área espaçadora de 8 bp dos sítios Lox, originando, pós-recombinação, sítios híbridos de fragmentos complementares aos sítios pré-recombinação46.

25.4.1 Reconhecimento e ligação ao DNA Os primeiros passos para a catálise do processo de recombinação é o reconhecimento dos sítios Lox pela enzima e sua ligação ao DNA. Em cada sítio Lox associam-se duas moléculas Cre, cada uma delas estabelecendo contato com os 15 pb mais externos de uma das extremidades do sítio: isto inclui os 13 pb das repetições invertidas terminais e 2 pb da região central espaçadora que dita o sentido ao sítio36. A ligação das enzimas ao sítio de ligação de Cre ocorre com alto grau de cooperatividade51. A conformação de Cre para o reconhecimento de seu sítio de ligação e interação com o duplex de DNA é dita “gancho com formato em C”, pois

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A)

B)

C)

D)

Figura 25.9 A depender da localização relativa entre os sítios Lox, pode-se promover diferentes eventos envolvendo as sequências de DNA flanqueadas por estes. (A) Se dois sítios Lox encontram-se em série e orientação inversa, ocorre a inversão da sequência compreendida entre eles. (B) Se os sítios estiverem em série e com mesma orientação, ocorre a excisão da sequência compreendida entre eles. (C) Se existirem duas sequências de DNA distintas, flanqueadas cada uma pelos mesmos dois tipos de sítios Lox diferentes (as duas setas na segunda linha), o evento mediado pela Cre recombinase ocasionará substituição de fragmentos flanqueados. (D) Caso haja duas sequências de DNA diferentes precedidas de apenas um sítio Lox, o evento mediado pela Cre recombinase ocasionará inserção de uma das sequências em série com a outra, ficando ambas flanqueadas pelos sítios Lox.

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Figura 25.10 Cre reconhecendo seu sítio de ligação em forma de “gancho com formato em C”. Destacam-se suas hélices no N-terminal, das quais a B e a D são as responsáveis por interagir com os sítios Lox. As hélices A e E do N-terminal e a hélice N de seu C-terminal participam das interações proteína-proteína para a formação do tetrâmero53 de Cre.

a enzima se arranja em torno da dupla fita 52. Como já mencionado acima, no N-terminal da proteína encontram-se as hélices que interagem com o sítio Lox (B e D)36. Dessa forma, o elemento de ligação de Cre nos sítios é curvado apenas levemente, enquanto, como resultado dos contatos enzima -DNA, o sítio completo (34 pb) é curvado bruscamente, principalmente na região central espaçadora, onde ocorrerá a clivagem e troca das fitas durante a recombinação52 (Figura 25.10). Este posicionamento dos sítios pela recombinase permite que um resíduo conservado de aminoácido catalítico, a tirosina 324 (Tyr324), seja posicionado para a futura clivagem na região espaçadora dos sítios36 Lox.

25.4.2 A sinapse de recombinação Uma vez interagida cada recombinase com o seu sítio Lox no DNA, as hélices A e E do N-terminal de cada enzima e a hélice N de seu C-terminal

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Figura 25.11 Complexo sináptico de recombinação Cre-Lox em arranjo semelhante à junção de Holliday pseudoquadrado planar (modificada de Guo, Gopaul31).

participam das interações proteína-proteína para a formação do tetrâmero de Cre36 (Figura 25.10). A sinapse tetramérica de Cre consiste em um par de dímeros da enzima, com orientação antiparalela dos duplex de Lox, em um arranjo dito semelhante à junção de Holliday pseudoquadrado planar30 (Figura 25.11). Duas das quatro subunidades de Cre clivam então o DNA, conduzindo assim ao processo de permuta das fitas54.

25.4.3 A permuta de fitas de DNA Após a clivagem do DNA por duas das quatro subunidades de Cre no complexo sináptico, a Tyr324, cuja cadeia lateral atua como nucleófilo, permite a formação do intermediário 3’-fosfotirosina, de arranjo antiparalelo. A extremidade 5’-OH livre gerada pela quebra da ligação fosfodiéster pode então atuar como nucleófilo e promover a permuta de um par de fitas, ao atacar a fosfotirosina vizinha. Dessa maneira, tem-se o arranjo da junção de Holliday formado no intermediário36, 54 (Figura 25.12).

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Figura 25.12 (A) Complexo sináptico de recombinação Cre-Lox (modificada de Guo, Gopaul31). Nesta imagem, o arranjo que se tem é ainda semelhante à junção de Holliday, pois ainda não ocorreu quebra e permuta de fitas para a recombinação. (B) Complexo sináptico de recombinação Cre-Lox já em arranjo em junção de Holliday após a permuta de um par de fitas. As setas internas na cavidade central da Cre recombinase, na figura abaixo, indicam os locais onde já houve quebra de ligação fosfodiéster e ligação entre as fitas para recombinação (modificada de Gopaul, Guo39).

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Em seguida, ocorre um processo denominado isomerização, e na sequência ocorrem a segunda clivagem e a permuta do segundo par de fitas, a fim de que se forme o produto de recombinação 36 (Figura 25.13). O segundo par de fitas é clivado e permutado pelo segundo par de subunidades Cre, e o produto de recombinação forma-se apenas se houver identidade entre as sequências Lox utilizadas. Os pares de regiões espaçadoras devem apresentar homologia para que a barreira energética inerente ao processo de recombinação possa ser transposta, e a catálise, ocorrer55.

Figura 25.13 Permuta do primeiro par de fitas, seguido de isomerização, clivagem do segundo par de fitas e formação do produto de recombinação.

25.5 ESTRATÉGIAS DE INTEGRAÇÃO SÍTIO-ESPECÍFICA DE GENES POR RECOMBINAÇÃO CRE-LOX 25.5.1 Atividade da Cre recombinase: entrega e expressão A Cre recombinase é uma enzima tipicamente procariótica, e por isso, para que haja a possibilidade de recombinação em eucariotos, é crucial seu direcionamento para o núcleo celular, que pode ser garantido pela inclusão de uma sequência de localização nuclear (nuclear localization signal – NLS), frequentemente de antígeno T, SV40 T21. A expressão de Cre pode ser feita através de vetores plasmidiais, cuja expressão é transiente e logo silenciada com o vetor sendo degradado. A taxa de células transfectadas é relativamente baixa e, por isso, em alternativa

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aos vetores plasmidiais, os vetores virais, adenovirais em sua maioria, são muito utilizados. Adenovírus possuem uma alta taxa de infecção em células eucariotas e uma expressão estável, o que garante o tempo necessário para que ocorra a recombinação Cre-Lox com eficiência e precisão11,56,57. A expressão pode ainda ser condicionada a um tecido localizado, utilizando um promotor tecido-específico para a Cre recombinase. Assim, a recombinação é limitada a um determinado grupo de células, e o estudo pode ser restringido a uma área. Nesse contexto, as ESC foram transfectadas e, consequentemente, todos os animais-modelo conterão o gene 1,58-60 cre. No entanto, o gene estará em sua forma dormente, somente será expresso no tecido que possuir o conjunto de fatores e elementos de transcrição que agem na região promotora específica, promovendo a expressão constitutiva ou induzida (discutido a seguir)13,61. A fim de minimizar sucessivas remoções e inserções das sequências flanqueadas por Lox, sobre a expressão da Cre e os efeitos causados pela superexpressão da mesma, que afetam a integridade do cariótipo, foi proposta por Hashimoto e Taniguchi 62 a fusão da Cre com HIV-TAT (transativador da transcrição da proteína TAT de HIV). HIV-TAT é um domínio de transdução, que permite a transdução de Cre recombinase diretamente na célula.

25.5.2 Células repórteres para Cre-Lox Com o objetivo de permitir o monitoramento de eficiência de recombinação mediada por Cre, existem células repórteres para o sistema Cre-Lox. As células HEK293-LoxP-GFP-RFP, LoxP-lacZ e Cre-GFP são exemplos comerciais existentes. A primeira delas foi desenvolvida por Pfannkuche e colaboradores e contém em seu genoma uma sequência de DNA constituída de um promotor, seguido de um sítio LoxP, gene da proteína fluorescente verde (green fluorescent protein – GFP) com um stop códon, outro LoxP, e o gene da proteína fluorescente vermelha (red fluorescente protein – RFP) com um stop códon (Figura 25.14). Assim, na ausência da Cre recombinase, as células mostram-se verdes sob microscopia de fluorescência; porém, se a recombinase está presente, a porção que contém o stop códon da GFP, assim como o gene desta proteína, são removidos (por estarem compreendidos entre os sítios Lox), e a RFP é expressa, fazendo com que a célula se apresente vermelha na microscopia de fluorescência63.

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A linhagem de células TE671 humana LoxP-LacZ possui na região flanqueada pelos sítios Lox um stop códon que impede a síntese da β-galactosidase do LacZ; dessa forma, somente após a expressão de Cre estas células poderão expressar a β-galactosidase e serem coradas de azul na presença de XGal (As linhagens podem ser obtidas como HiTiter Cre/LoxP Reporter Cell Lines LoxP-RFP Human Fibroblast (Allele Biotecnhology)). As células Cre-GFP expressam a recombinase com sinal de localização nuclear, e fusionada à GFP. Assim, estas células aparecem verdes quando analisadas por microscopia de fluorescência, indicando a expressão de Cre64.

25.5.3 Condicionamento da recombinação O sistema de recombinação Cre-Lox pode ser empregado para a expressão de genes-alvo em camundongos com uma menor chance de perda de função, deleção e/ou inserção aleatória no genoma. São necessários, basicamente dois passos para o emprego da recombinação Cre-LoxP em mESC: o primeiro passo é referente à inserção de sítios LoxP utilizando uma construção específica e uma tecnologia padronizada de direcionamento gênico, e o segundo passo é o isolamento e seleção dos recombinantes1. Para a recombinação, a Cre recombinase pode ser utilizada in vitro em células tronco embrionárias (ESCs) ou realizada a expressão transiente, logo em seguida as células são inseridas em blastocistos e transmitidas para a linhagem germinativa no desenvolvimento embrionário. Outro modo, ou em adição ao anterior: a Cre pode ser expressa como um transgene, de modo que depois as células contendo regiões flanqueadoras Lox possam ser introduzidas. É uma possibilidade para se controlar em qual estágio do desenvolvimento embrionário deseja-se que ocorra a recombinação, a chamada mutação condicional. A ativação condicionada temporalmente de Cre possibilita o estudo de mutações em genes-alvo, cuja letalidade é uma possibilidade com elevadas chances de ocorrer 65. Mesmo que a meta inicial seja simplesmente o knock-out de um gene, a incorporação de Cre-Lox para um experimento com gene-alvo, existem benefícios para direcionamento convencional na medida em que, se os resultados experimentais validarem a necessidade, as abordagens potenciais para examinar a função gênica são expandidas para além do simples knock-out66. Modificações restritas a certos tipos de células em determinado estágio de desenvolvimento é reconhecido como condicionamento do gene-alvo. O uso de Cre-LoxP com este intuito requer uma linhagem de camundongos que

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Figura 25.14 Sequência que torna a HEK293-LoxP-GFP-RFP uma célula repórter do sistema Cre-Lox.

possuam o gene-alvo floxado e uma segunda linhagem que expresse a Cre recombinase de forma constitutiva ou induzida. Um mutante condicionado é gerado pelo cruzamento destas duas linhagens, de modo que a alteração do gene alvofloxado é restringido de maneira espacial e temporal, de acordo com o padrão de expressão de Cre na linhagem particular utilizada (Figura 25.15). Estas linhagens duplo-transgênicas devem ser criadas homozigoticamente para o alelo floxado66. Como uma alternativa, a Cre também pode ser expressa em tecidos somáticos por meio da infecção viral, utilizando vetores de expressão virais contendo11,56,57,67 cre. Além disso, linhagens transgênicas portadoras de um alelo floxado podem ser convertidas para um mutante convencional, pela eliminação do alelo na sua linha germinativa, pelo cruzamento de uma das linhagens deletoras que expressam Cre em mESCs, ou nas células do embrião em fases iniciais do desenvolvimento68. A vantagem é oferecer não só economia de tempo, mas também abrir um novo caminho para estudar genes tendo-se o local específico de sua expressão, condicional ou temporal, que será desencadeada no momento desejado, e a deleção do gene em células específicas.

25.5.4 Indução e controle da recombinação O controle do processo de recombinação pode ser realizado a partir de sistemas de indução (exemplos na Tabela 25.4). A indução pode ser realizada por meio de ligantes do receptor de glicocorticoide, tamoxifeno, RU-486 ou tetraciclina e seus análogos.

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Figura 25.15 Estratégia para a inativação do gene condicional in vivo.

Tabela 25.4 Estudos com expressão induzida de forma tecido/condição específica

PROMOTOR

TECIDO

INDUTOR

REFERÊNCIA

Hsp70

Vários tecidos

Choque térmico

Dietrich, et al, 200069

SM22

Músculo liso

Tamoxifeno

Kuhbandner, et al, 200070

Transtiretina

Fígado

Tamoxifeno

Tannour-Louet, et al, 200171

Subunidade do GluR NMDA

Células do grânulo cerebelar

Antiprogestinas

Tsujita, et al, 199972

WAP

Glândula mamária

Tetraciclina

Utomo, et al, 199973

GluR = Receptor de glutamato. Hsp70 = proteína de choque térmico 70. NMDA = N-metil D-Aspartato. SM22 = Proteína músculo liso-específica 22. WAP = Proteína acídica do soro.

Em 1998, Brocard e colaboradores desenvolveram uma Cre quimérica fundida a uma versão mutada do domínio de ligação do receptor de glicocorticoide humano; a recombinação pode ser induzida em células F9 de carcinoma embrionário murino com o uso de ligantes como dexametasona e RU38486, mas não era notada nenhuma atividade de recombinase na ausência destes74.

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No ano seguinte, Kellendonk e colaboradores associaram-na a uma versão truncada do domínio de ligação do receptor de progesterona. Nesse trabalho, foi possível a indução de recombinação, no cérebro, pelo esteroide sintético60 RU486. Em 2001, Metzger e Chambon desenvolveram uma versão de Cre fusionada a uma versão mutada do domínio de ligação do receptor de estrógeno, podendo, dessa forma, ser ativada pelo tamoxifeno47. Nos exemplos acima citados, o domínio de ligação foi mutado para que o ligante natural do receptor não pudesse ativar a recombinase de forma constitutiva; dessa maneira, apenas de forma controlada, com a exposição a ligantes não normalmente presentes no meio celular, torna-se possível a ativação da enzima. Quanto à tetraciclina e seus análogos, em 1992, Gossen e Bujard fundiram repressor Tet e domínio de ativação de uma proteína do herpes vírus simples, obtendo o transativador tetraciclina controlável (tTA) 75. O gene da Cre recombinase pode então ser inserido sob domínio de um promotor que é ativado na presença de tTA. Na presença de tetraciclina ou seu análogo, pode-se prevenir a ligação de tTA ao promotor e, por consequência, a expressão de Cre – sistema Tet-Off 44. Existe ainda a possibilidade de utilização do sistema Tet-On, no qual é a presença de tetraciclina que ativa a expressão gênica; este sistema utiliza o transativador trancricional tetraciclina controlável (rtTA). A tetraciclina liga-se ao rtTA e possibilita que este se ligue ao promotor para que a expressão gênica ocorra59.

25.5.5 Deleção do gene repórter A construção de cassetes de expressão flanqueados por Lox são constituídos, além do gene-alvo, por um gene repórter que viabiliza o acompanhamento e o rearranjo e fixação genômica deste. No entanto, para a prática biomédica, esses genes repórteres necessitam ser retirados do locus endógeno, pois já foi examinado que a presença do repórter pode afetar a expressão, não somente do gene-alvo, mas de locis a mais de 100 Kb de distância 76. Uma das principais interferências do gene repórter é no processo de processamento do RNA mensageiro (mRNA) – splicing de RNA –, gerando variantes que podem possuir uma função diferente da original ou, até mesmo, não possuir função.

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25.6 APLICAÇÕES DE USO DO SISTEMA CRE-LOX A maioria dos estudos envolvendo recombinação Cre-Lox em eucariotos utiliza camundongos como modelo experimental. O principal motivo para esta tendência é o fato de que este é o animal com maior histórico de utilização na pesquisa médica, modelo de desenvolvimento embrionário de mamíferos, de resposta imunológica (em especial em histocompatibilidade) e de doenças de fundo genético como câncer, em condições que muito se assemelham às do ser humano77. No entanto, com a descoberta das hESCs, houve uma tendência de se utilizar linhagens pluripotentes humanas em complemento ou em substituição às células e modelos murinos. Apesar da grande similaridade genômica, hESCs e mESCs não respondem no mesmo grau de eficiência a procedimentos de recombinação homóloga, por isso, em ensaios que visam à aplicação clínica, as hESCs são requeridas. Cre-LoxP pode ser utilizado para a construção de bibliotecas de expressão, como, por exemplo, biblioteca de RNA de interferência (RNAi). Tomimoto e Yamakawa 78 utilizaram a estratégia que produzia enzimaticamente uma biblioteca de longo grampo de RNA (do inglês, long hairpin of RNA – lhRNA) a partir de uma biblioteca de DNA complementar (cDNA), usando uma endonuclease BcaBEST DNA polimerase, e a Cre recombinase sem remoção do fragmento de DNA inserido a partir do plasmídeo de expressão.

25.7 PROTOCOLO GERAL DE PRODUÇÃO DE UM CAMUNDONGO FLUORESCENTE UTILIZANDO O SISTEMA CRE-LOX * 25.7.1 Animais Utilizam-se camundongos C57BL/6J e BDF1 (Clea Japan Inc., Tóquio, Japão). Estes animais heterozigotos expressam a Cre recombinase sobre controle do promotor CAG (Cre-GAG) e queratina 5 (Cre-K5), respectivamente, e devem ser mantidos em ambientes livres de patógenos com água e alimentação ab libitum. *

Baseado em Kawamoto, Niwa79.

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25.7.2 Construção de plasmídeo repórter e geração de camundongos O plasmídeo repórter pCAG-CAT-EGFP (Figura 25.16) podem ser obtidos a partir de duas inserções em pCAG-CAT-Z: um fragmento BamHI -EGFP-EcoRI (contendo o cDNA de EGFP, obtido da digestão de pEGFP (Clontech, Palo Alto, Estados Unidos)); e um segundo fragmento BamHI -poliA-SacI (contendo a sequência do sinal de poliadenilação de β-globina de coelho) em substituição ao LacZ, de modo que a poliA entre em sequência à EGFP. O gene CAT (cloranfenicol acetil-transferase) é floxado por sítios LoxP.

25.7.3 Injeção pronuclear em embriões murinos A transferência do plasmídeo repórter pode ser realizada por injeção pronuclear em embriões. Inicialmente é feita excisão do CAG-CAT-EGFP do plasmídeo pCAG-CAT-EGFP, seguida da microinjeção em embriões BDF1×BDF1. Os embriões são selecionados pela resistência ao cloranfenicol e transferidos para C57BL/6J fêmeas (como na Figura 25.15).

Figura 25.16 pCAG-CAT-GFP produzido a partir da inserção de EGFP seguido de poliA de β-globina de coelho e dois sítios LoxP floxando CAT. Promotor GAG na primeira fita espessa à esquerda, CAT na fita espessa ao centro, poliA de CAT à direita da fita espessa ao centro, EGFP na fita espessa à direita e poliA de β-globina de coelho no início, à direita da fita espessa à direita, triângulos vermelhos correspondem ao sítio LoxP.

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25.7.4 Indução à recombinação por Cre recombinase e ativação do transgene Os animais utilizados produzem constitutivamente a Cre recombinase em queratinócitos (promotor tecido-específico para K5). A ativação do transgene ocorre pelo promotor GAG, que é ubíquo. No entanto, apenas as células que expressarem Cre são capazes de recombinar e aproximar EGFP do promotor GAG, de modo que a fluorescência gerada pela EGFP ocorrerá exclusivamente na epiderme dos camundongos mutantes condicionais induzidos (como demonstrado na Figura 25.15). A expressão de EGFP é resultado da deleção do gene CAT e, consequentemente, aproximação da região EGFP ao promotor GAG (Figura 25.17).

Figura 25.17 A expressão constitutiva da linhagem C57BL/6J de Cre em queratinócitos (promotor específico K5) provoca a recombinação do cassete microinjetado em embriões que resulta na deleção do gene CAT (cloranfenicol acetil-transferase) liberando o fragmento na forma circularizada. Neste processo, o gene EGFP é aproximado ao promotor GAG permitindo a expressão da proteína fluorescente verde exclusivamente nas células dérmicas que recombinaram por Cre. Promotor GAG na primeira fita espessa à esquerda, CAT fita espessa ao centro, poliA de CAT à direita da fita espessa ao centro, EGFP na fita espessa à direita e poliA de β-globina de coelho em cinza claro; triângulos vermelhos correspondem ao sítio LoxP.

25.7.5 Análise da prole recombinante A análise do DNA integrado ao genoma de camundongos recombinantes pode ser feita utilizando os sítios de restrição presentes originalmente no cassete retirado do CAG-CAT-EGFP como EcoRI e BamH1. Outra

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possibilidade é utilizar citometria de fluxo para identificação da expressão de GFP pós-atividade Cre recombinase, bem como western-blotting e microscopia de fluorescência ou confocal.

25.8 PERSPECTIVAS FUTURAS: AVANÇOS E INTEGRAÇÃO DE METODOLOGIAS A tecnologia Cre-Lox, combinada com sistemas de indução, tem sido amplamente utilizada para gerar modelos animais com expressão de genes -alvo espacial e temporalmente regulados, tanto para ativação quanto para inativação. Estudos em camundongos mutantes não só são um avanço para o conhecimento sobre a função genética, como aqueles envolvidos na tumorigênese e carcinogênese, mas também aumentam grandemente o número de informações sobre como poderia ser a intervenção em terapia gênica/celular em doenças de base genética, ou controle das de base ambiental. É justamente o que vem ocorrendo nos últimos anos, mas alguns problemas, como a estrutura da cromatina, variações na recombinação homóloga e até a geração de linhagens celulares, são entraves que devem ser sobrepujados. Apesar desses empecilhos, a descoberta e aplicação do sistema de recombinação Cre-Lox ainda são consideradas marcos na biologia molecular. Com a difusão da técnica e o aprofundamento dos estudos sobre os mecanismos deste sistema, bem como a incorporação de sistemas de indução localizada e programada (espaço-temporal) será possível que a gama de aplicações de Cre-Lox seja estendida, auxiliando a definição de funções gênicas e genômicas, diagnóstico de doenças animais e humanas, bem como a produção e desenvolvimento de produtos de interesse terapêutico e biotecnológico.

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CAPÍTULO

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SISTEMA DUPLO-HÍBRIDO EM LEVEDURA: CONCEITOS E APLICAÇÕES Aline Maria da Silva Daniela C. Gonzalez-Kristeller Jörg Kobarg Carla Columbano de Oliveira 26.1 INTRODUÇÃO

A maioria das proteínas, se não todas, exerce suas funções como integrante de complexos não covalentes, estáveis ou transitórios, mantidos através de interações específicas entre seus constituintes1-3. Dessa forma, a identificação e a caracterização de interações proteína-proteína (do inglês, protein protein interactions – PPI), é um pré-requisito para compreendermos detalhadamente as funções biológicas de complexos multiproteicos. Tais estudos também fornecem pistas sobre a função de proteínas através da descoberta de quais são seus parceiros proteicos in vivo com função já conhecida, partindo da premissa “culpado por associação”4. Além disso, conhecer a arquitetura de redes de interações proteicas celulares ou “interactomas” é fundamental para o entendimento integrado e completo de mecanismos fisiológicos e patológicos5, 6.

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Há uma grande variedade de metodologias bioquímicas, biofísicas, genéticas e computacionais que possibilitam o estudo de PPI sob diferentes aspectos. Contudo, as duas abordagens mais empregadas para identificação e análise de interações proteicas são o sistema duplo-híbrido em leveduras (do inglês yeast two-hybrid system – Y2H) 7 e a purificação de complexos por afinidade acoplada à espectrometria de massas (AP-MS) 8. Neste capítulo iremos detalhar os conceitos, as variações e as aplicações do sistema Y2H, um método da genética molecular, simples e versátil, para detecção de interações proteicas binárias através da ativação da expressão de genes indicadores do sucesso da interação (genes repórteres). Ensaios de complementação de fragmentos proteicos (do inglês protein-fragment complementation assays – PCA)9 também serão brevemente descritos. O sistema duplo híbrido é um ensaio genético para detecção in vivo da interação de duas proteínas utilizando-se a levedura Saccharomyces cerevisiae 10,11. Para realização do ensaio, as proteínas de interesse, denominadas no ensaio de isca e presa, são expressas como proteínas híbridas, sendo uma delas fusionada ao domínio de ligação ao DNA (do inglês DNA binding domain – DBD) e a outra fusionada ao domínio de ativação (do inglês activation domain – AD) de um fator de transcrição. Se o par de proteínas híbridas interagir no núcleo da levedura, DBD e AD são aproximados, a atividade do fator de transcrição é reconstituída, possibilitando o reconhecimento do promotor e início da transcrição do gene repórter adjacente, como esquematizado na Figura 26.1. A ativação de genes repórteres indica o sucesso da interação in vivo. Os genes repórteres geralmente codificam enzimas necessárias para o crescimento em meio seletivo ou enzimas cuja atividade pode ser detectada pela mudança de cor da colônia da levedura. Além de possibilitar a verificação da ocorrência de interação entre duas proteínas conhecidas, os ensaios de duplo-híbrido são também úteis para a identificação de domínios proteicos e aminoácidos envolvidos na interação, através da realização de ensaios com variantes mutantes das duas proteínas em estudo. Um exemplo desta abordagem foi a identificação de aminoácidos essenciais para interações que ocorrem no heterotrímero da proteína fosfatase humana 12 do tipo 2A. Outro exemplo é o estudo que mostrou a existência de múltiplos contatos entre a subunidade catalítica da serina/treonina fosfatase do tipo 1 e seu inibidor proteico13. Ensaios de duplo-híbrido são predominantemente utilizados para a descoberta de parceiros moleculares de uma proteína-alvo 14. Tal proteína fusionada ao DBD serve de “isca” para “capturar” parceiros moleculares (denominados de “presas”) através da varredura de bibliotecas de genes, em que

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Figura 26.1 Sistema duplo híbrido em levedura. As proteínas de interesse, isca e presa, são expressas em fusão com o domínio de ligação ao DNA (DBD) e com o domínio de ativação da transcrição (AD) de um fator de transcrição, respectivamente. A interação entre a isca e a presa no núcleo da levedura resulta na reconstituição funcional do fator de transcrição, com consequente ativação da maquinaria de transcrição. A RNA polimerase II transcreve o gene repórter, e o mRNA resultante será traduzido no citoplasma. A atividade da proteína codificada pelo gene repórter é uma medida do sucesso da interação entre as duas proteínas híbridas.

proteínas completas, ou seus fragmentos, estão fusionadas ao AD, como mostra a Figura 26.2. Essas bibliotecas podem ser geradas a partir de fragmentos de DNA genômico produzidos aleatoriamente por quebra mecânica ou por digestão enzimática ou, então, construídas com preparações de DNA complementar (cDNA). Bibliotecas representativas do conjunto completo ou subconjuntos de fases abertas de leitura (do inglês, open reading frames – ORF) codificadas em um dado genoma são também uma ótima alternativa para triagens. Como exemplo desta abordagem, citamos o estudo que identificou a proteína Nop17 como um novo componente do exossomo (complexo proteico envolvido no processamento de RNAs eucarióticos) através de varreduras de bibliotecas de cDNA de levedura, utilizando-se como isca uma das subunidades desse complexo15. Outro exemplo dessa estratégia é o estudo que revelou novos componentes do sistema de secreção de efetores de virulência de Xanthomonas axonopodis citri, através de varreduras de uma biblioteca de DNA genômico com diferentes iscas16.

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Figura 26.2 Varredura da biblioteca no sistema duplo híbrido em levedura. A proteína de interesse que será utilizada como isca é expressa em fusão com o domínio de ligação ao DNA (DBD). A biblioteca de genes contendo as sequências clonadas em fusão com o domínio de ativação da transcrição (AD) é utilizada na transformação de células da linhagem que expressa a isca. A interação bemsucedida entre a isca e uma das proteínas híbridas da biblioteca (presa) é detectada pela atividade da proteína codificada pelos genes repórteres, neste caso HIS3 e lacZ, que, respectivamente, proporcionam crescimento na ausência do aminoácido histidina e coloração azul na presença do substrato X-GAL. Os plasmídeos codificando as presas são recuperados dos clones positivos e identificados por sequenciamento de DNA.

Se por um lado ensaios de duplo-híbrido realizados em pequena escala detalham, uma por vez, as interações de pares de proteínas pré-escolhidas, ensaios realizados em grande escala (high-throughput) buscam identificar todas as interações binárias potenciais do proteoma, completo ou parcial, de uma célula ou organismo. Nesse caso, o objetivo almejado é o mapeamento das redes de interações proteicas ou interactomas 5. As triagens em larga escala utilizando sistema duplo-híbrido são pioneiras na proposição de redes de interação proteica em organismos modelo como S. cerevisiae e Caenorhabditis elegans, além de células humanas17,18. Variações do sistema duplo-híbrido foram desenvolvidas, possibilitando ensaios de interação proteica no citoplasma da levedura, e também em bactérias ou em células de mamífero em cultura7,19. Além disso, ajustes metodológicos no ensaio originalmente proposto foram cruciais para reduzir a detecção de interações falsas, tornando o sistema duplo-híbrido mais robusto e confiável. Assim como outros métodos, o sistema Y2H também apresenta limitações, e metodologias alternativas e complementares (abordagens

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ortogonais) devem ser utilizadas para comprovar PPI identificadas através do Y2H 5. Porém, é inquestionável a contribuição do Y2H para descoberta de interações proteicas relevantes em processos fisiológicos e patológicos7, várias dessas sugeridas como potenciais alvos terapêuticos20-22.

26.2 ORIGEM E EVOLUÇÃO DO SISTEMA DUPLO-HÍBRIDO EM LEVEDURA O sistema duplo-híbrido em levedura foi desenvolvido em meados da década de 1980, no laboratório de Stanley Fields na State University of New York e primeiramente descrito em um artigo publicado em 1989 na revista Nature10. A inspiração fundamental para o delineamento do sistema duplo-híbrido foi a natureza modular de muitos fatores de transcrição eucarióticos, os quais apresentam dois domínios funcionalmente distintos: um que reconhece e liga uma sequência específica de DNA no promotor do gene-alvo e outro que interage com a maquinaria de transcrição, ativando a síntese do RNA mensageiro (mRNA). A natureza modular e flexível dos fatores de transcrição foi evidenciada a partir de estudos realizados em meados da década de 1980 pelos grupos liderados por Mark Ptashne e por Kevin Struhl, ambos na Harvard University. Estes pesquisadores investigaram as proteínas GAL4 e GCN4, a primeira um potente ativador da transcrição em leveduras quando estas crescem em meio contendo galactose, e a segunda um fator de transcrição que reconhece promotores de genes relacionados à biossíntese de aminoácidos. Tanto para GAL4 23 como para GCN424 foi identificada a existência de dois domínios funcionalmente independentes: um domínio de ligação ao DNA (DBD) e outro de ativação da transcrição (AD). A independência funcional dos domínios foi comprovada pela verificação de que proteínas híbridas, tais como LexA-GAL4 (fusão do DBD do repressor transcricional LexA de Escherichia coli ao AD de GAL4), ativavam a transcrição somente quando o operador lexA (sequência reconhecida por LexA) estava presente no promotor do gene repórter25. De fato, os domínios DBD e AD de GAL4 podem ser fisicamente separados e podem funcionar como unidades independentes26, mas a ativação da transcrição é dependente de certa proximidade entre esses domínios. Resultados desses trabalhos embasaram a construção do conceito de que o domínio de ativação de fatores de transcrição prescinde da interação direta com o DNA para exercer sua função, isto é, o AD não estabelece contato direto com o DNA, o que é feito pelo DBD. Um ativador transcricional

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poderia, portanto, ser composto de duas proteínas que se associam, não covalentemente, uma delas responsável pela ligação a uma sequência específica de DNA e a outra responsável por, efetivamente, ativar a maquinaria de transcrição. Na versão original do sistema Y2H foram utilizados domínios de GAL4 para a produção de proteínas híbridas10. Esse ativador transcricional possui 881 aminoácidos, sendo que seu DBD reside na porção aminoterminal de 147 aminoácidos e é responsável pelo reconhecimento de uma sequência específica de DNA, denominada UASGAL, que é encontrada em promotores de genes GAL (genes relacionados ao metabolismo de galactose). O AD de GAL4 com 113 aminoácidos carboxiterminais, predominantemente ácidos, é responsável por recrutar e ativar a maquinaria de transcrição para iniciar a expressão do gene-alvo, porém não interage diretamente com a sequência de DNA. Para demonstrar a funcionalidade do sistema Y2H, o DBD de GAL4 foi fusionado a uma proteína de interesse X (no ensaio, a proteína SNF1) enquanto o domínio AD de GAL4 foi fusionado à proteína de interesse Y (no ensaio, a proteína SNF4). Caso as proteínas X e Y interagissem in vivo, os domínios de ligação ao DNA e de ativação da transcrição de GAL4 seriam suficientemente aproximados para ativar a transcrição de um gene controlado pelo fator de transcrição GAL4. Nesse ensaio, tal gene era lacZ, um gene da bactéria E. coli que codifica a enzima β-galactosidase, clonado na vizinhança do promotor GAL. Através da verificação da atividade enzimática, foi possível inferir que ocorreu ativação da transcrição do gene repórter lacZ, como consequência da interação de SNF1 e SNF4, como esquematizado na Figura 26.3. Muitos estudos utilizaram o sistema Y2H tal como originalmente proposto para investigar a ocorrência de interação entre pares de proteínas conhecidas, e para os quais a possibilidade de interação era postulada. Uma vez detectada a interação no ensaio de Y2H, os domínios de interação passaram então a ser mapeados através da análise sistemática das proteínas X (denominada isca) e Y (denominada presa), portando deleções e/ou substituições em seus aminoácidos11. A premissa de que a atividade transcricional medida no ensaio de Y2H é positivamente correlacionada com a afinidade da interação valorizou ainda mais esta metodologia na caracterização de PPI. Contudo, a precisão desse tipo de estudo exige que as proteínas mutantes comparadas apresentem estabilidades similares e concentração equivalente no núcleo da levedura. Com o sucesso do ensaio original de Y2H, foi então proposto que tal metodologia seria aplicável para identificação de novas interações através

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Figura 26.3 Esquema do sistema Y2H em seu delineamento original. Nos experimentos foi utilizada uma linhagem de levedura como uma deleção do gene GAL4 e contendo o gene LacZ integrado em seu cromossomo sob controle do promotor GAL. Essa linhagem foi transformada com plasmídeos para expressão de: proteína GAL4 íntegra, da proteína SNF1 fusionada ao DBD de GAL4 e/ou proteína SNF4 fusionada ao AD de GAL4. Como esperado a expressão de GAL4 íntegra resultou na máxima ativação da transcrição. A expressão dos dois híbridos, SNF1/GAL-DBD e SNF4/GAL-AD, restaurou a transcrição de LacZ, verificada pela medida da atividade da enzima βgalactosidade como 180 unidades.

da varredura de bibliotecas de proteínas fusionadas com AD. Tal aplicação foi demonstrada com a utilização da proteína SIR4 fusionada ao DBD de GAL4 na varredura de uma biblioteca de fragmentos de DNA genômico de levedura expressando proteínas fusionadas ao AD de GAL4. Diversos outros trabalhos se seguiram com o intuito de identificar parceiros moleculares para proteínas selecionadas, tais como proteínas envolvidas em vias de sinalização celular em células normais ou tumorais. Entre as primeiras proteínas que

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tiveram seus parceiros moleculares identificados com o sistema Y2H está a proteína Ras, que interage in vivo com a proteína quinase Raf 27. Com esta abordagem, os parceiros moleculares de muitas proteínas começaram a ser rapidamente identificados, e redes de interação foram traçadas. Vale ressaltar a importante contribuição do grupo de Stephen Elledge no Baylor College of Medicine, que desenvolveu vetores para facilitar a construção de bibliotecas de cDNA fusionados ao AD de GAL4, as quais eram construídas no bacteriófago l e convertidas em bibliotecas plasmidiais usando recombinação sítio-específica. Além disso, esta nova versão de vetores possibilitava a expressão da isca fusionada ao DBD e também a um domínio de hemaglutinina (HA), para detecção da expressão com anticorpo anti-HA. Outra modificação foi a inclusão de HIS3 (imidazol glicerol fosfato desidratase) como mais um gene repórter além de lacZ28,29. A primeira utilização do Y2H em escala genômica investigou o mapa de interações das 55 proteínas expressas pelo bacteriófago T7 de E. coli 30. Alguns anos mais tarde, todas as interações potenciais do proteoma completo da levedura S. cerevisae foram investigadas por diferentes grupos31-34, que exploraram a habilidade de linhagens haploides de levedura de tipos sexuais opostos formarem células diploides. A biblioteca de clones de levedura de um tipo sexual expressando cada uma de suas 6 mil ORF fusionadas ao AD de GAL4 foi triada com linhagens de tipo sexual oposto expressando as 6 mil ORF individualmente fusionadas ao DBD de GAL4. Após a seleção de clones diploides positivos para a ocorrência de interação, os plasmídeos eram recuperados, sequenciados para identificação do par de proteínas que interagiu no ensaio. A esses estudos seguiu-se a elucidação dos interactomas completos da bactéria patogênica Helicobacter pylori 35 e de organismosmodelo com Drosophila melanogaster 36,37 e Caenorhabditis elegans 38. Os primeiros resultados de estudos para elucidar o interactoma humano foram publicados em 200539,40 e identificaram cerca de 3 mil potenciais interações. Além destas, dezenas de triagens já foram realizadas para mapear PPI de diversos vírus, micro-organismos, plantas e proteínas envolvidas com doenças humanas41. Entre as razões que rapidamente popularizaram a utilização do sistema duplo-híbrido em levedura está o fato de que essa metodologia possibilita o estudo in vivo de interações entre proteínas de qualquer organismo, através de ensaios relativamente simples e acessíveis para um laboratório convencional de biologia molecular. Uma característica relevante do ensaio de Y2H reside na sua alta sensibilidade para detecção de interações nem sempre evidenciadas por outros métodos, como a coimunoprecipitação. O acúmulo

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do transcrito do gene repórter e da proteína correspondente amplifica e estabiliza o sinal, garantindo que interações de menor afinidade ou transientes possam ser detectadas. Esta é mais uma das vantagens do sistema Y2H, uma vez que metodologias que envolvem etapas de purificação de complexos proteicos requerem PPI bem mais estáveis11. Outra razão para o sucesso do Y2H reside no fato de que seu desenvolvimento antecedeu o fantástico avanço de métodos baseados na purificação por afinidade de complexos proteicos e identificação de seus constituintes por espectrometria de massa8. Ainda hoje, o Y2H apresenta o diferencial de avaliar interações proteicas in vivo, enquanto a AP-MS requer a manipulação in vitro de extratos celulares e equipamentos bem mais sofisticados, dispendiosos e inacessíveis para a maioria dos grupos de pesquisa. Curiosamente, não foi o interesse científico em se buscar os parceiros moleculares de uma proteína em estudo que motivou o desenvolvimento do sistema duplo-híbrido, mas sim a demanda na época por um novo método com potencial comercial para a indústria de biotecnologia e que pudesse ser útil para a pesquisa em ciências biomédicas. O caminho trilhado no desenvolvimento do sistema duplo-híbrido foi, portanto, bastante incomum e diferente do que se observa para a maioria das biotecnologias disponíveis, as quais foram desenvolvidas para responder a problemas biológicos específicos42. O sistema Y2H evoluiu do uso de vetores e linhagens de levedura trocadas entre grupos de pesquisas para a utilização de sistemas completos, atualmente comercializados na forma de kits que incluem sofisticados vetores plasmidiais que facilitam as etapas de clonagem e linhagens de levedura aprimoradas e que conferem maior confiabilidade a detecção das interações proteicas. Ademais, as opções hoje disponíveis incluem vetores com características que facilitam ensaios subsequentes para confirmação das interações detectadas através do sistema Y2H. Bibliotecas com conjuntos ou subconjuntos de ORF humanas ou de alguns organismos modelos também estão disponíveis comercialmente. Além disso, há empresas que oferecem serviços de triagem de bibliotecas gênicas utilizando o sistema Y2H.

26.2.1 Detalhamento metodológico do sistema Y2H Desde sua concepção em 1989, muitos foram os melhoramentos na tecnologia de Y2H, incluindo a possibilidade de utilização de mais do que um gene repórter 7. Além de lacZ, que permite uma avaliação semiquantitativa

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da interação em um ensaio de atividade de β-galactosidade de E.coli, os genes repórteres mais frequentemente utilizados são MEL1 (α-galactosidase secretada de S. cerevisae), HIS3, URA3 e ADE2 (que conferem prototrofia a histidina, uracila e adenina, respectivamente). Também tem sido utilizado como repórter da interação produtiva, o gene que codifica a proteína fluorescente verde (do inglês green fluorescent protein – GFP), ou melhor, o gene yEGFP (do inglês, codon-optimized yeast enhanced green fluorescent protein), em que foi realizada a otimização de códons para adequada expressão em levedura43. A expressão do gene repórter possibilita a separação de clones positivos com a utilização do separador de células ativado por fluorescência (do inglês, fluorescence-activated cell sorting – Facs). A resistência ao antifúngico aureobasidina A (gene AUR1-C, variante mutante da inositol fosforil ceramida sintase) também é mais um repórter disponível44. A Tabela 26.1 lista os genes repórteres mais usados no Y2H e os fenótipos observados. Tabela 26.1 Genes repórteres usados no sistema Y2H e os respectivos fenótipos da levedura resultantes da sua ativação GENE REPÓRTER

PRODUTO PROTEICO

lacZ (E. coli)

β-galactosidase

HIS3 (S. cerevisae) URA3 (S. cerevisae) ADE2 (S. cerevisae)

Imidazol glicerol fosfato desidratase

Crescimento em meio sem histidina.

Orotidina 5-fosfota descarboxilase

Crescimento em meio sem uracila. Sensibilidade ao 5-ácido fluorótico (5-FOA).

Fosforibosil aminoimidazol carboxilase

Crescimento em meio sem adenina.

α-galactosidase secretada

Colônias com coloração azulada pela hidrólise do substrato cromogênico X-α-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-α-D-galactopiranosídeo).

Mutante da subunidade catalítica da sintase de inositol fosfoceramida (proteínda de resistência à aureobasidina A)

Resistência ao antifúngico aureobasidina A.

Proteína fluorescente verde

Células fluorescenes após exposição à luz UV (366 nm).

Proteína fluorescente verde intensa (com otimização de códons para levedura)

Células estavelmente fluorescentes para separação por Facs.

MEL1 (S. cerevisae) AUR1-C (Aureobasidium pullulans) GFP (Aequorea victoria) yEGFP

FENÓTIPO Colônias com coloração azulada pela hidrólise do substrato cromogênico X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo).

Quanto ao domínio de ligação ao DNA, além do DBD de GAL4 utilizado no sistema duplo-híbrido original10, alternativas também já foram empregadas7. Uma delas é a proteína repressora LexA de E. coli que liga o sítio operador cognato 45. O AD de GAL4 ainda é o mais utilizado, mas há opção do AD da proteína VP16 do vírus de herpes simplex27 ou do domínio

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de ativação B42 de E. coli45, respectivamente um domínio de ativação mais forte e outro mais fraco do que GAL4. Em sua aplicação mais simples (Figura 26.1), em que se deseja verificar se duas proteínas interagem in vivo, as células de levedura são transformadas com dois vetores plasmidiais, um deles contendo a sequência codificadora da proteína de interesse X (isca) fusionada ao DBD (por exemplo, DBD de GAL4), e o outro contendo a sequência codificadora da proteína de interesse Y (presa) fusionada ao AD (por exemplo, AD de GAL4). A expressão epissomal das fusões está, geralmente, sob o controle de um promotor constitutivo como o ADH1 (álcool desidrogenase 1), truncado ou íntegro para garantir, respectivamente, menor ou maior nível de expressão. O ensaio parece ser mais eficaz quando as fusões são aminoterminais, isto é DBD e AD são fusionados ao aminoterminal da proteína X ou Y, embora se recomende testar também fusões carboxiterminais 46. É fundamental que as proteínas fusionadas aos domínios DBD e AD sejam direcionadas para o núcleo da célula a fim de ativar a transcrição dos genes repórteres, sendo que o sinal de localização nuclear está na porção aminoterminal dessas construções. Além dos elementos que permitem sua propagação em bactéria, importantes na etapa de clonagem, os vetores devem conter genes para a seleção dos clones em levedura. Os vetores mais populares contêm TRP1 (codifica fosforibosil antranilato isomerase), que possibilita o cultivo das células em meio sem triptofano, ou LEU2 (codifica β-isopropil malato desidrogenase), que possibilita o cultivo das células na ausência de leucina. Desse modo, células de levedura hospedando ambos os plasmídeos (isca e presa) crescem na ausência de leucina e triptofano. Assumindo que as duas proteínas híbridas serão colocalizadas no núcleo, é plausível supor que, caso interajam, os domínios de ligação ao DNA e de ativação da transcrição serão aproximados e o ativador transcricional será reconstituído funcionalmente. Como resultado, a RNA polimerase II será recrutada e os genes repórteres serão transcritos (por exemplo, HIS3 e lacZ) (Figura 26.2). Como afirmado acima, para o sucesso do sistema Y2H é necessário que as proteínas híbridas que potencialmente interagem sejam expressas no núcleo, preferencialmente em níveis equivalentes. Alguns vetores adicionam um epítopo à proteína híbrida, o qual possibilita o monitoramento de sua expressão através de Western blotting com anticorpo específico. Nos ensaios de Y2H é importantíssimo avaliar se as proteínas híbridas (isca e presa) não ativam os genes repórteres independentemente da ocorrência de interação, um artefato referido como “ativação independente de interação”. Para isso, é necessário avaliar se há expressão dos genes repórteres

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nos transformantes, hospedando cada uma das construções separadamente. Muitas vezes a proteína X fusionada ao DBD exibe “ativação independente de interação”, e a solução está em refazer as construções, fusionando X ao AD e Y ao DBD ou utilizando-se fragmentos ou domínios da proteína isca. Entretanto, segmentos proteicos ricos em aminoácidos carregados, em particular resíduos negativos, devem ser evitados, visto que frequentemente resultam em “ativação independente de interação”. Citamos aqui o exemplo da proteína reguladora FEZ1. Uma vez que o domínio N-terminal de FEZ1 confere ativação independente de interação, a alternativa foi utilizar como isca sua região carboxiterminal na varredura de uma biblioteca de cDNA humano47. Nesse estudo, foram identificadas proteínas de função conhecida que interagem com FEZ1, o que possibilitou confirmar sua participação no desenvolvimento neuronal e sugerir um papel para FEZ1 também no controle transcricional. Outro ponto relevante é a verificação da seletividade da interação entre X e Y, o que pode ser avaliado realizando-se ensaios de interação de X ou Y com proteínas não relacionadas. Mas, uma vez descartada a “ativação independente de interação” e verificada a especificidade da associação, a habilidade das proteínas X e Y e de suas variantes mutantes interagirem pode ser sistematicamente ensaiada, visando à identificação dos domínios envolvidos. É importante ressaltar que as linhagens da levedura S. cerevisae empregadas no sistema Y2H são linhagens geneticamente modificadas para que seja possível a seleção de clones que hospedam as construções plasmidiais contendo, respectivamente, isca e presas, bem como a pronta detecção de um ou mais genes repórteres. Em um ensaio como o descrito acima, as linhagens utilizadas portam as marcas auxotróficas, TRP1 e LEU2, apresentando, portanto, dependência dos aminoácidos triptofano e leucina para o crescimento. Os genes repórteres estão integrados em cópia única no cromossomo da levedura, e precedidos pelo promotor com a sequência reconhecida pelo domínio de ligação fusionado à isca. Frequentemente são utilizadas linhagens de levedura que apresentam genes repórteres com promotores com diferentes afinidades pelo DBD, que geram maior ou menor expressão de cada um dos genes repórteres48. O gene repórter HIS3 codifica a imidazol glicerol fosfato desidratase, uma enzima da via de biossíntese de histidina e essencial para o crescimento da levedura na ausência desse aminoácido. URA3 codifica orotidina 5-fosfato descarboxilase, uma enzima da via de síntese de uracila, o qual é essencial para o crescimento da levedura na ausência de uracila ou uridina. Várias linhagens de levedura desenvolvidas para o sistema duplo-híbrido são

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deficientes na expressão de HIS3 e URA3, sendo que clones com altos níveis de expressão de HIS3 podem ser evidenciados pela adição do inibidor 3-AT (3-aminotriazol) ao meio de cultura, o que evita a detecção de interações fracas (falsos positivos) que resultam em expressão basal de HIS3. A expressão de lacZ pela levedura pode ser facilmente detectada com a utilização do substrato cromogênico X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo), que quando hidrolisado pela β-galactosidase gera um composto de coloração azulada (Figura 26.2). De modo geral, a utilização de dois genes repórteres (HIS3 e lacZ) é suficiente. Porém, algumas linhagens de leveduras contêm três genes repórteres sob o controle de promotores ligeiramente diferentes, ampliando a faixa de seletividade e sensibilidade, como é o caso da linhagem PJ69-4A48, que contém os repórteres HIS3, lacZ e ADE2, este último mais rigoroso. A utilização de linhagens contendo o repórter URA3 pode ser útil nos casos de interações mais difíceis de avaliar, ou quando se deseja realizar uma contrasseleção com 5-ácido fluorótico (5-FOA), um composto que é metabolizado em composto tóxico pela enzima URA3. Outra opção é a utilização da resistência ao antifúngico aureobasidina-A, como já mencionado.

26.2.2 Análise de interactomas através do sistema Y2H A aplicação mais frequente do sistema duplo-híbrido é a triagem por interações que envolvem uma ou mais proteínas de interesse ou a triagem por interações possíveis de um proteoma completo ou quase completo. Para tal é necessário dispor de bibliotecas de fragmentos genômicos, bibliotecas de cDNA ou de bibliotecas de DNA com todas as sequências codificadoras de proteínas (ORF) de um organismo, construídas em vetores apropriados para Y2H. Uma estratégia que pode ser utilizada é a transformação de uma linhagem de levedura com o vetor plasmidial codificando a isca de interesse fusionada ao DBD e seleção em meio restritivo. O clone selecionado é então submetido à transformação com a biblioteca de escolha, em que as sequências serão expressas em fusão ao AD (Figura 26.2). Os clones são selecionados em meio restritivo, e as interações positivas são avaliadas através da expressão dos genes repórteres. A primeira etapa na caracterização dos clones que exibem ativação dos genes repórteres é a verificação de que essa ativação deve-se à interação produtiva entre isca e presa, e não a uma mutação que eventualmente tenha ocorrido na levedura. Isto é feito pela reintrodução do

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plasmídeo correspondente à presa (selecionada na varredura) na linhagem original que expressa a isca para recapitular a ativação dos genes repórteres. Um segundo teste importante é mostrar que as presas selecionadas interagem especificamente com a proteína de interesse, e não com o DBD de LexA ou GAL4 fusionado à isca. Isto é feito pela reintrodução da biblioteca de plasmídeos em linhagem expressando outras iscas para confirmar interação específica apenas com a isca de interesse. Em seguida, o plasmídeo codificando a presa revelada em cada um dos clones positivos é recuperado e submetido a sequenciamento para verificação da identidade da presa (Figura 26.2). A expressão da isca é, geralmente, epissomal; contudo, há possibilidade de integração da construção DBD-isca no cromossomo da levedura, gerando uma linhagem estável, menos suscetível a variações no nível de expressão da isca, o que parece reduzir de modo importante resultados falso-positivos e falso-negativos na triagem de bibliotecas49. Outra estratégia para triagem no sistema Y2H consiste na expressão da isca em uma linhagem de um tipo sexual (tipo a), e a construção da biblioteca de “presas” em uma linhagem de tipo sexual oposto (tipo α), como esquematizado na Figura 26.4A. A varredura consiste no cruzamento das linhagens e seleção em meio seletivo para interação positiva. Da mesma maneira que na estratégia anterior, é necessário recapitular a interação e verificar identidade da presa pelo sequenciamento do plasmídeo recuperado do clone diploide positivo. Para análise do interatoma completo, uma estratégia é a varredura cruzada em todas as combinações possíveis de arranjos de conjuntos de clones de levedura expressando iscas ou presas 50. Para isso, todas as ORF são individualmente clonadas em fusão com o domínio de ligação ao DNA (iscas) e expressas em uma linhagem de levedura de um tipo sexual. As ORF são também clonadas em fusão com o domínio de ativação (presas) e expressas em uma linhagem de levedura do tipo sexual oposto. Os diferentes clones são organizados em arranjos de 96 clones, e cada clone de isca e presa é sistematicamente cruzado seguindo-se a seleção nutricional e verificação da ativação de genes repórteres (Figura 26.4B). Um requerimento para esta abordagem é a disponibilidade do ORFeoma, isto é, o conjunto de todas as sequências codificadoras identificadas no genoma de interesse, sendo que cada ORF deve estar fusionada ao domínio de ativação (AD), para compor a biblioteca de presas, ou ao domínio de ligação ao DNA, para compor a biblioteca de iscas 50. Esta estratégia tem uma vantagem óbvia: a possibilidade da eliminação prévia de clones de iscas ou presas que exibam ativação

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Figura 26.4 Análise do interactoma completo. Varredura de arranjos ordenados de conjuntos de clones de levedura expressando diferentes presas. No esquema mostrado em A, uma ORF que será utilizada como isca é individualmente clonada em fusão ao DBD e expressa em uma linhagem de levedura de um tipo sexual. Esta linhagem é utilizada na varredura de linhagens de levedura do tipo sexual oposto, organizados em arranjos de 96 clones (biblioteca de presas), cada uma expressando uma presa fusionada ao AD. Após o cruzamento, segue-se a seleção nutricional e verificação da ativação de genes repórteres como lacZ e HIS3. A varredura pode ser repetida individualmente para as iscas de interesse. No esquema mostrado em B, arranjos ordenados de linhagens expressando iscas fusionadas ao DBD (biblioteca de iscas) é cruzado com a biblioteca de presas, em todas as possibilidades possíveis. O resultado de cada cruzamento é transferido para placas de 96 poços para seleção nutricional dos diploides e verificação da ativação dos genes repórteres. A varredura em grande escala pode ser totalmente automatizada.

independente de interação. Utilizando esta abordagem, milhares de interações foram identificadas para mais de 70% do proteoma da levedura31,51. Uma crítica frequente ao sistema Y2H, em particular para ensaios realizados em grande escala, é a detecção de um aparente alto número de falsas interações ou de interações não plausíveis biologicamente, ou ainda a não detecção de interações verdadeiras17. A detecção de falsos positivos pode ser minimizada com a utilização de pelo menos três genes repórteres para evidenciar uma interação. Por outro lado, uma forma de aumentar a cobertura das interações nas triagens é a utilização simultânea de variantes de vetores plasmidiais do sistema Y2H, com ori CEN ou 2 µ (respectivamente, menor ou maior número de cópias) que permitem fusões amino ou carboxiterminais das iscas e presas com DBD ou AD. Em um estudo recente, 92 interações foram avaliadas em 10 configurações diferentes quanto ao tipo de vetor e orientação da fusão, e foi verificado que cada variante do sistema Y2H

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detectou um subconjunto de interações. Nenhuma das 92 interações foi detectada pelas 10 configurações, e 14 foram detectadas apenas por uma. Dessa forma, sugere-se que projetos para avaliar interactomas incorporem múltiplas configurações do sistema Y2H para que um maior número de interações seja revelado52.

26.2.3 Limitações do método Y2H O sistema 2YH tem algumas limitações, sendo a principal delas a detecção de um alto número de interações falsas (falsos positivos). Outras limitações incluem a “não detecção” de todas as interações verdadeiras (falsos negativos) e o fato da metodologia ser pouco informativa quanto à cinética e à dinâmica da interação proteína-proteína 7, 53. Estas limitações têm sido minimizadas com o aprimoramento da tecnologia nos últimos 25 anos, consolidando o sistema Y2H com a metodologia de escolha para análise de PPI. A Tabela 26.2 resume os principais problemas e as soluções que podem ser aplicadas para contornar limitações do sistema Y2H. Tabela 26.2 Principais limitações do Y2H e soluções possíveis

LIMITAÇÃO

POSSÍVEL SOLUÇÃO

Proteína isca é tóxica para levedura

Testar um fragmento menor da proteína

Proteína isca ativa os genes repórteres independentemente da ativação (ativação independente de interação)

Testar um domínio separado/fragmento menor da proteína ou usar o sistema duplo-híbrido alternativo

Interação proteína-proteína envolve a porção N-terminal da isca a qual está fusionada ao DBD

Inverter a configuração da isca

Triagem para interações que dependem de PTM (ex.: fosforilação em resíduo de tirosina)

Utilizar uma linhagem de levedura que expresse a enzima envolvida na PTM (ex.: tirosina quinase)

A proteína isca é uma proteína integral de membrana (não é transportada para o núcleo)

Usar uma variação do sistema Y2H como split-ubiquitin

A interação requer um terceiro parceiro

Usar um sistema Y2H que permita a expressão de uma terceira proteína solúvel, não fusionada a DBD ou AD

Suspeita de clones falsos positivos

Ensaios confirmativos da interação

Falta de clones: suspeita de falso negativo

Mudar a biblioteca de cDNA usada

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LIMITAÇÃO

POSSÍVEL SOLUÇÃO

Cepa repórter de levedura mostra “vazamento” do gene repórter HIS

Usar 3-AT para inibição da expressão background

Poucos clones

Aumentar o número de clones triados ou usar múltiplas bibliotecas/configurações de iscas/coexpressar fator atuando em “trans” (ex.: uma quinase, adaptador etc.)

Sistema não é contexto-dependente (proteínas que não são expressas no mesmo compartimento/ tecido/tempo que interagem)

Ensaios confirmatórios da possível interação

Os falsos positivos podem ser divididos em técnicos e biológicos. Os técnicos refletem problemas que resultam na indução dos genes repórteres na ausência de interação. Este artefato (ativação independente de interação), na maior parte das vezes, deve-se a proteínas que apresentam capacidade intrínseca de ativar a transcrição independentemente da interação com outra proteínas fusionada ao AD ou ainda, iscas que interagem com muitas presas de modo não específico. Entre as possíveis soluções para este problema, está a remoção do domínio da isca responsável pela ativação independente de interação ou pela interação inespecífica. Uma solução bastante utilizada é aumentar a concentração de 3-AT se o gene repórter utilizado for HIS3, de tal maneira que somente células expressando altos níveis da proteína His3 sejam capazes de sobreviver na ausência de histidina. Outra estratégia para contornar o artefato da “ativação independente de interação” é fusionar a isca ao AD e conduzir a triagem em bibliotecas nas quais as presas são fusionadas ao DBD. Alternativamente, existe a possibilidade de se utilizar sistemas Y2H que utilizam promotores reconhecidos pela RNA polimerase III54 para o controle dos genes repórteres cuja maquinaria pode eventualmente não ser alvo da ativação independente de interação de certas iscas. Para a triagem de proteínas que interagem com ativadores transcricionais como c-Myc 55, os quais podem ativar a expressão do repórter independente de interação, há a opção de se utilizar o ensaio do transativador reprimido (do inglês repressed transactivator assay – RTA), que utiliza o gene repórter URA3 e fusões da isca com DBD de GAL4 e da presa com um domínio do repressor transcricional TUP1 56. Se a interação ocorrer, a expressão de URA3 é bloqueada e as colônias positivas podem ser selecionadas pela sobrevivência em meio contendo 5-FOA. Se não houver interação, ocorre expressão de URA3 e letalidade celular na presença de 5-FOA. Este

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composto é convertido em 5-fluorodeoxiuridina monofosfato, que é um inibidor competitivo da timidilato sintase e que causa bloqueio da síntese de DNA. Fatores tais como variações no número de cópias dos plasmídeos ou mutações espontâneas nos promotores dos genes repórteres podem contribuir para detecção de falsos positivos. Um detalhe importante para a realização dos ensaios de Y2H é o cuidado na preparação dos meios para o cultivo e seleção dos clones de levedura, pois contaminação residual de quaisquer dos compostos utilizados como marcadores auxotróficos (leucina, triptofano, histidina, adenina, uracila etc.) pode resultar na seleção de clones não prototróficos para estes compostos (falsos positivos). Os falsos positivos biológicos correspondem às interações que ocorrem no contexto do sistema Y2H, mas que não são plausíveis no contexto celular original. Por exemplo, proteínas expressas em compartimentos subcelulares distintos, ou em condições fisiológicas diferentes, podem eventualmente interagir quando coexpressas no núcleo da levedura. Algumas características das iscas e presas podem explicar a não detecção de interações biologicamente relevantes. Por exemplo, proteínas que não assumem sua estrutura tridimensional correta, geralmente proteínas de membrana e proteínas extracelulares, que, apesar de “ganharem” um sinal de localização nuclear quando fusionadas ao DBD ou AD, nem sempre são transportadas para o núcleo, ou que são tóxicas quando expressas na levedura, são fontes de falsos negativos. Uma alternativa para contornar esses falsos negativos é realizar a expressão de domínios ou versões truncadas destas proteínas. Outra possibilidade é utilizar sistemas que detectam interações citoplasmáticas como o ensaio de complementação de fragmentos de proteínas (PCA). Se a interação envolver a região aminoterminal da proteína, existe a possibilidade de que a fusão com o DBD ou AD seja um complicador. Nesse caso, uma alternativa é testar fusões carboxiterminais ou inverter a fusão, isto é, obter a isca fusionada ao AD e presa fusionada ao DBD. Outra fonte relevante de falsos negativos são interações dependentes de modificações pós-tradução, que ou não ocorrem na levedura (por exemplo, fosforilação em resíduos de tirosina), ou não são estáveis no núcleo da levedura. A detecção de interações que envolvem ligantes exógenos também está incluída dentre as limitações do sistema Y2H convencional. Ciente dos artefatos do sistema Y2H, particularmente aqueles geradores de falsos positivos, é fundamental avaliar cuidadosamente cada interação observada e utilizar metodologias alternativas para validá-la.

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A ocorrência de falsos positivos ou falsos negativos em ensaios de Y2H pode explicar a significativa ausência de superposição entre PPI detectadas em estudos distintos para um mesmo organismo. Dessa forma, é importante ressaltar que as interações identificadas através do sistema Y2H são referidas como interações potenciais, e a sua confirmação exige metodologias complementares. Vale observar que interações evolutivamente conservadas entre espécies também são mais prováveis de serem biologicamente relevantes. Assim, a integração de potenciais PPI reveladas experimentalmente (através de Y2H ou de outras metodologias) e ou preditas computacionalmente em bases de dados públicas é fundamental para refinar mapas de interação34,53,57.

26.2.4 Vantagens do sistema Y2H Sensibilidade, seletividade, flexibilidade e excelente relação custo-benefício estão entre as vantagens do sistema Y2H. A alta sensibilidade do sistema Y2H para detecção de PPI deve-se a uma combinação de fatores que incluem a abundante expressão das proteínas híbridas graças à expressão dirigida por promotores fortes em vetores com alto número de cópias. Além disso, a detecção do repórter é amplificada pela tradução de muitas moléculas de enzimas estáveis por mRNA que é transcrito. Soma-se a isto o fato de que os fenótipos resultantes do sucesso da interação são também muito sensíveis. De modo geral, o ensaio Y2H detecta interações com constantes de afinidade da ordem de aproximadamente 10 µM. Ademais, a estabilidade do complexo entre as proteínas híbridas é aumentada pela interação do AD com proteínas do complexo de iniciação da transcrição, que também estão associadas ao promotor. Por outro lado, métodos de coimunoprecipitação exigem interações com afinidades bem mais altas, uma vez que os complexos devem resistir aos vários passos de lavagens da metodologia. A grande flexibilidade do sistema Y2H permite a detecção de interações entre proteínas derivadas de quaisquer organismos, desde que se disponha de suas respectivas sequências codificadoras. A ressalva que deve ser feita é que, neste caso, a potencial interação será avaliada fora do seu contexto biológico, pois não está sendo analisada no organismo de origem, e sim na levedura. Não existe um tamanho mínimo ou máximo para uma proteína ser testada, o que permite uma detalhada investigação dos domínios envolvidos na interação com seus parceiros. Além disso, variações do sistema

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Y2H permitem analisar interações também no citoplasma, além do método convencional que detecta interações no compartimento nuclear da levedura. A implementação do sistema Y2H exige apenas equipamentos comuns de um laboratório de biologia molecular, treinamento em procedimentos convencionais de microbiologia e habilidade para realização de clonagens de DNA. Outrossim, é um método que pode ser também automatizado para estudos em grande escala.

26.2.5 Variações do sistema Y2H clássico Algumas das limitações do Y2H já discutidas motivaram o desenvolvimento de tecnologias alternativas aplicáveis não só para o estudo de PPI, mas também para detecção de inibidores de interação proteína-proteína e para análise da associação entre proteínas e RNA, DNA ou pequenas moléculas. Entre as tecnologias variantes do Y2H clássico, está o sistema duplo-híbrido reverso (Figura 26.5) que tem sido utilizado na triagem de inibidores de interação proteína-proteína em uma biblioteca de pequenas moléculas. A adição de uma substância (por exemplo, um peptídeo ou uma molécula pequena) que iniba a interação entre duas proteínas-alvo (devidamente fusionadas a DBD e AD) previne a expressão do gene tóxico (URA3), e a linhagem cresce em meio contendo 5-FOA. Por outro lado, se a substância adicionada não inibir a interação, a expressão de URA3 é ativada e as colônias não sobrevivem no meio seletivo. Esta abordagem tem sido uma estratégia valiosa na caracterização de PPI terapeuticamente relevantes e abre novos caminhos para a busca de moléculas que bloqueiem essas interações22,58. Como já mencionado, uma limitação relevante do sistema Y2H convencional é a análise de potenciais interações de proteínas de membrana ou secretadas. Uma série de variações do sistema de Y2H foi desenvolvida e está disponível para o estudo dessas classes de proteínas que, via de regra, não são adequadamente expressas no núcleo da levedura. Alguns destes métodos mantêm a expressão da isca associada à membrana e possibilitam a expressão da presa fusionada a uma proteína que é membro de uma cascata de sinalização celular (por exemplo, proteínas Sos, Ras, Gg). Na presença da interação, a presa é recrutada para o contexto celular adequado (por exemplo, membrana plasmática) resultando na ativação da via de sinalização de que participa a proteína à qual está fusionada7. Para o estudo de interação de proteínas secretadas também foram desenvolvidos variantes do Y2H que possibilitam a expressão de tais proteínas ancoradas na membrana

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Figura 26.5 Sistema duplo-híbrido reverso utilizado na triagem de inibidores de interação proteína-proteína. A adição de uma substância (por exemplo, um peptídeo ou uma molécula pequena) que iniba a interação entre duas proteínas-alvo (devidamente fusionadas a DBD e AD) previne a expressão do gene tóxico (URA3), e a linhagem cresce em meio contendo 5’-FOA. Por outro lado, se a substância adicionada não inibir a interação, a expressão de URA3 é ativada e as colônias não sobrevivem no meio seletivo.

do retículo endoplasmático59 ou do complexo de Golgi60 fusionadas às proteínas encontradas nestes compartimentos. Para o estudo de interações de proteínas extracelulares foram desenvolvidas tecnologias de duplo-híbrido na superfície de leveduras (YS2H, do inglês yeast surface two-hybrid). Um exemplo é o método em que a isca é expressa fusionada tanto a uma proteína secretada que permanece associada à membrana como ao fragmento de GFP, enquanto a presa é fusionada ao fragmento complementar de GFP. A interação entre isca e presa na superfície da levedura reconstitui a GFP, e a fluorescência pode ser detectada61. O sistema Y2H tem sido adaptado para triagem de interações entre pares de proteínas que envolvem um terceiro componente que pode ser uma pequena molécula, um RNA ou uma terceira proteína que fará a ponte entre a isca e a presa, estabelecendo um complexo ternário 7. Esta variação é denominada sistema triplo-híbrido em levedura (Y3H). Entre várias aplicações, o Y3H é uma abordagem promissora para a caracterização de drogas, apresentando potencial para revelar novos alvos terapêuticos 62. Neste tipo de ensaio, a isca é uma proteína capaz de ligar um composto de interesse, o qual é fornecido para as células da levedura. Se uma presa fusionada ao AD, expressa a partir de uma biblioteca de genes, interagir com a molécula do composto de interesse, o gene repórter é ativado. Os conceitos que embasam o Y2H também são aplicados ao sistema do híbrido único (Y1H). Nesta abordagem sequências de DNA regulatórias

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atuantes em cis são utilizadas para identificar proteínas que ligam tais sequências especificamente, iniciando a transcrição do gene repórter. Tais proteínas são triadas em uma biblioteca plasmidial codificando proteínas fusionadas ao AD. O Y1H é extremamente popular e há diversos exemplos de sua aplicação na identificação de interações DNA-proteína63. Há também os ensaios de complementação de fragmentos proteicos (PCA) em levedura7. Diferentemente do Y2H, nestes ensaios a interação entre proteínas pode ocorrer em outros compartimentos celulares além do núcleo. Além disso, as tecnologias baseadas em PCA podem ser facilmente transferidas para outros organismos, ao contrário do Y2H, desenvolvido para ser realizado apenas em leveduras. Como exemplo de PCA citamos o sistema Split-ubiquitin, desenvolvido como um sistema sensor de interações proteína-proteína64. A ubiquitina pode ser separada em duas metades estáveis, amino e carboxiterminal, denominadas, respectivamente, Nub e Cub. Quando fusionadas a duas proteínas que interagem, estas metades são aproximadas, reconstituindo a molécula de ubitiquina, a qual pode ser reconhecida por enzimas citossólicas que removem a ubiquitina de proteínas. Quando uma proteína integral de membrana (isca) é expressa em fusão com C ub ligada a um fator de transcrição, este fator é retido no citoplasma. Entretanto, quando ocorre a interação da isca com uma presa fusionada a N ub, a ubitiquina é reconstituída e o fator de transcrição é clivado e então direcionado para o núcleo, onde promove ativação da transcrição de um gene repórter. Utilizando este sistema, foram detectadas centenas de interações de 536 proteínas integrais de membrana de S. cerevisae65. Em um sistema Split-ubiquitin alternativo, a proteína repórter da interação entre duas proteínas fusionadas a Nub e Cub é URA3. Nesse caso, URA3 tem seu aminoácido terminal alterado para arginina e está fusionada a outra extremidade de Cub. A interação entre isca e presa, reconstitui a ubiquitina, recrutando a protease que promove a desubiquitinação de URA3, que irá exibir arginina como aminoterminal, um aminoácido que tende a promover a degradação da proteína. A enzima livre é então degradada, e o fenótipo das leveduras é convertido a um fenótipo dependente de uracila para o crescimento, porém resistente a 5-FOA66. Finalmente, é importante ressaltar que existem variações do sistema duplo-híbrido desenvolvidas para outros organismos tais como bactérias e células de mamíferos 7. Para células de mamíferos, o mais simples consiste na interação de proteínas fusionadas ao DBD de Gal4 e à proteína VP16 do vírus da herpes simplex (um transativador transcricional em células de mamíferos), resultando na ativação transcricional de um gene repórter, por

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exemplo, o gene codificador da luciferase, ou um gene codificador de uma proteína fluorescente 67. Outros métodos são baseados no conceito da complementação proteica, em que proteína fluorescente é dividida em dois domínios, e quando uma PPI ocorre entre proteínas fusionadas a cada um destes domínios, a atividade da proteína repórter é reconstituída (por exemplo, emissão de fluorescência). Células exibindo fluorescência podem ser então separadas utilizando Facs67. Apesar do desenvolvimento espetacular nos últimos anos, estas metodologias ainda não superam a versatilidade do sistema Y2H. No entanto, o sistema duplo-híbrido em células de mamíferos é muito útil para validação de interações de proteínas identificadas no Y2H por oferecer o contexto celular apropriado para proteínas de mamíferos.

26.2.6 Passo a passo do sistema Y2H Ao planejar um ensaio no sistema Y2H, vale a pena considerar as etapas propostas no fluxograma apresentado na Figura 26.6. Se a intenção é utilizar esta metodologia para avaliar a interação entre duas proteínas de interesse, é importante definir se as proteínas que serão utilizadas como isca e presa consistirão de sua sequência completa ou de segmentos (domínios). A utilização da sequência completa pode ser vantajosa por aumentar a chance da detecção de interações, mas pode resultar em maior taxa de falsos-positivos. Por outro lado, a utilização de domínios proteicos como iscas tem a vantagem de revelar diretamente domínios de interação, mas pode ser insuficiente para detecção de interações que envolvam a proteína correspondente completa. Outra importante decisão a ser tomada é sobre as estratégias que serão utilizadas para clonagem da sequência codificadora da isca, incluindo características do vetor para expressão da fusão com DBD e método de clonagem. Podem ser utilizados plasmídeos que se propagam em menor número de cópias/célula ou plasmídeos que resultam em maior número de cópias e, consequentemente, níveis mais elevados de expressão. Outra definição é sobre o promotor que controlará a expressão da fusão DBD-isca, sendo geralmente utilizado o promotor ADH1 ou variantes deste. Com relação à clonagem, pode-se optar pela clonagem convencional baseada na utilização de enzimas de restrição ou clonagem utilizando sistemas de recombinação (por exemplo, sistema Gateway) para o caso de um maior número de iscas a serem clonadas.

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Decisões semelhantes fazem parte da escolha da estratégia de clonagem e do vetor para expressão da presa fusionada ao AD. A expressão da fusão AD-presa está, geralmente, sob o controle do promotor ADH1, truncado ou íntegro para garantir, respectivamente menor ou maior nível de expressão. No caso da triagem de bibliotecas gênicas, há que se decidir se serão utilizadas bibliotecas de cDNA de alta complexidade (preparadas de organismos inteiros ou resultante da combinação de diferentes tecidos ou órgãos) ou coleções de ORF (bibliotecas sintéticas contendo todas as ORF codificadas no genoma do organismo de interesse). Tais coleções de ORF clonadas no vetor AD estão comercialmente disponíveis apenas para alguns organismos e oferecem a vantagem de que um menor número de clones precisa ser triado, visto que as diferentes ORF estão igualmente representadas na biblioteca. No caso da biblioteca de cDNA, genes menos expressos serão menos representados, exigindo a varredura de um número bem maior de clones. Os protocolos de ensaios do sistema Y2H contemplam controles negativo e positivo na tentativa de minimizar algumas das fontes de artefatos. Um destes é a inclusão nos ensaios de construções que expressam pares de proteínas que sabidamente interagem (controle positivo) para atividade dos genes repórteres. Outro tipo de controle muito empregado é a realização de ensaios-controle com uma proteína “grudenta” como isca para descartar interações inespecíficas das presas recuperadas. Artigos recentes da literatura e manuais de laboratório descrevem minuciosamente as linhagens de levedura e os vetores plasmidiais que podem ser utilizados, bem como os protocolos para realização de ensaios convencionais de Y2H ou varreduras completas para elucidação de interações de um proteoma48,50,52,53,68-70. Há diversas opções comerciais de kits, tais como Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System™ (Clontech), ProQuest™ Two-Hybrid System with Gateway® Technology (Life Technologies) e HybriZap™ (Agilent Technologies), entre outros. Além disso, é possível encomendar a construção de bibliotecas e a realização de varreduras utilizando Y2H em empresas como a Hybrigenics Services. Caso o leitor deste capítulo queira aplicar esta fantástica metodologia em seus estudos, recomendamos a leitura das referências aqui citadas para definição da estratégia que melhor se aplique. Buscar o apoio de um grupo de pesquisa que utilize esta metodologia rotineiramente e que possa compartilhar vetores e linhagens seguramente aumenta as chances de sucesso.

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Figura 26.6 Fluxograma das etapas envolvidas na varredura de uma biblioteca de presas com uma isca. Vetores plasmidiais e linhagens de leveduras adequados para Y2H além de bibliotecas de presas já prontas e/ou kits para construção de bibliotecas de presas estão comercialmente disponíveis em variadas configurações.

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26.3 MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO DAS INTERAÇÕES IDENTIFICADAS NO SISTEMA DUPLO-HÍBRIDO O sistema de duplo-híbrido pode ser visto como um método de triagem inicial para identificar PPI. Ensaios confirmatórios são essenciais para validar as interações proteicas detectadas, caracterizar domínios envolvidos na interação e entender seus desdobramentos funcionais. Os métodos classicamente utilizados para confirmação das interações incluem: • Expressão das proteínas isca e presa em sistema heterólogo (por exemplo, em E . coli) para realização de ensaios de coprecipitação (pull-down) a partir de extratos proteicos e/ou teste de interação in vitro seguido de copurificação do complexo. Os plasmídeos isolados no sistema Y2H podem servir como moldes para obtenção das sequências codificadoras das presas, as quais podem representar sequências completas ou domínios específicos. As sequências de interesse são subclonadas em vetores para expressão no sistema heterólogo fusionadas a marcadores (tags), tais como seis resíduos de histidina (6x HisTag) ou polipeptídeo glutationa S-transferase (GST) para facilitar a coprecipitação e/ou copurificação pela ligação a resinas de afinidade. A detecção das proteínas coprecipitadas ou copurificadas é realizada por Western blot com anticorpos específicos para os marcadores, de maneira análoga aos estudos em que foi investigado o interactoma das proteínas quinases humanas NEK1 e NEK671,72 . • Excepcionalmente, a confirmação pode ser realizada utilizando-se o próprio sistema de duplo-híbrido. Esta abordagem tem sido aplicada no caso de famílias de proteínas isca e/ou presa que conhecidamente interagem ou que formam heterodímeros ou multímeros. A realização de ensaios de Y2H com os membros de uma família de proteínas como isca ou como presa pode trazer informações sobre a especificidade das interações. Um exemplo desta abordagem é a triagem de interações que foi realizada para onze septinas, proteínas humanas que se associam como hexâmeros formando hetero-filamentos. As septinas humanas podem ser agrupadas em quatro famílias, e o hexâmero sempre tem um arranjo característico de modo a incluir representantes destas famílias. Independente da configuração isca-presa, as triagens com as septinas humanas sempre pescam as septinas esperadas pela regra do arranjo no hexâmero73.

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• Confirmação in vivo da interação através de ensaios de coimunoprecipitação de proteínas endógenas e/ou de proteínas de fusão recombinantes expressas ectopicamente em células humanas74,75. • Demonstração da colocalização subcelular das proteínas interatoras através de técnicas de microscopia74,75. • Realização de ensaios biológicos que confirmem a importância da interação para funções preditas. Para exemplificar esta abordagem confirmatória, citamos o estudo que demonstrou a interação de uma proteína chamada Ki-1/57 com proteínas relacionadas ao splicing de pré-mRNA e confirmou seu envolvimento neste processo celular através de ensaios de splicing in vivo 76 . Outro exemplo é o estudo que confirmou a já mencionada proteína Nop17 como um componente estrutural e funcional do exossomo de leveduras15.

26.4 APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS A identificação de interações proteína-proteína envolvidas em processos fisiopatológicos abre caminho para exploração do enorme, e ainda pouco conhecido, potencial dessas interações como alvos terapêuticos. Porém, a triagem rotineira de compostos com ação farmacológica geralmente não identifica moléculas que atuem nas interfaces de contato de complexos proteicos, visto que a busca focaliza inibidores enzimáticos ou ligantes de receptores proteicos 20. Por outro lado, é crescente o número de exemplos de sucesso de compostos farmacológicos cujo alvo é a interface de interação entre proteínas 21,77. Dois compostos que inibem interações proteicas já se encontram em ensaios clínicos: ABT-263, um inibidor da interação entre proteínas da família Bcl-2 e Nutlin-3, um inibidor da interação entre p53 e MDM2, ambos drogas promissoras contra alguns tipos de câncer22. Abordagens que incluem desenho racional de drogas, predições computacionais e ensaios bioquímicos variados estão sendo utilizadas na identificação de inibidores de PPI. Neste cenário, o sistema Y2H, em particular algumas de suas variantes metodológicas, emerge não só como uma estratégia promissora para identificação e validação de PPI como alvos terapêuticos, mas também como método para triagem de pequenas moléculas que inibam PPI 22. Ensaios utilizando o sistema duplo híbrido reverso (Figura 26.5) possibilitam a triagem de pequenas moléculas que interfiram na interação entre duas proteínas parceiras. Tais ensaios requerem, contudo, controles rigorosos, pois as

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bibliotecas de pequenas moléculas podem conter substâncias tóxicas para a levedura. Além do potencial para a descoberta de compostos que inibam PPI, o sistema Y2H pode ser também empregado na triagem de compostos que promovam interações entre proteínas62. Neste caso, como já mencionamos, o sistema recebe a denominação Y3H. Em resumo, o potencial de aplicações biotecnológicas do sistema Y2H é surpreendente, principalmente por oferecer vantagens em relação a ensaios de interação proteína-proteína in vitro, entre as quais estão o fato de dispensar grandes quantidades de proteínas purificadas e a possibilidade de identificar pequenas moléculas que atravessam a membrana para modular a PPI alvo.

26.5 CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS O sistema Y2H é uma metodologia que oferece uma marcante contribuição à proposição de redes ou mapas de interação proteína-proteína. Após 25 anos de seu desenvolvimento, são mais de 130 mil PPI desvendadas em diferentes organismos com a utilização dessa metodologia, correspondendo a aproximadamente 60% do total de PPI identificadas. O Y2H continua sendo constantemente aprimorado, em particular para aumentar sua precisão e desempenho, sendo que a utilização do sistema Y2H acoplado a metodologias ortogonais para desvendar redes de interação proteína-proteína ou interactomas completos é uma forte tendência nas ciências biológicas. A expectativa é que a integração destes dados aumente significativamente o conhecimento dos mecanismos fisiológicos e patológicos e possibilite a identificação de PPI como novos alvos terapêuticos e de diagnóstico. Também extremamente promissoras são as possibilidades de utilização de metodologias derivadas do sistema Y2H na triagem de moléculas que interferem em interações proteína-proteína, as quais podem já ter sido, ou não, propostas como alvos terapêuticos em patologias humanas.

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CAPÍTULO

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ESTRATÉGIAS TRANSGÊNICAS PARA A EXPRESSÃO COMBINATÓRIA DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES Anderson Kenedy Santos Katia Neves Gomes José Luiz da Costa Emerson Alberto da Fonseca Luiz Orlando Ladeira Alexandre H. Kihara Mauro Cunha Xavier Pinto Rodrigo R. Resende

27.1 INTRODUÇÃO Ao estudar um sistema, qualquer que seja ele, começamos por desvendar os aspectos que nos saltam aos olhos para aprofundar nas minúcias escondidas do universo diminuto dos “mícrons”. Gregor Mendel chegou, em 1865, à teoria da hereditariedade ao observar ervilhas e suas características fenotípicas visíveis ao olho nu. Ou seja, sem poder enxergar a estrutura responsável pela hereditariedade (cromossomos), Mendel trabalhou com o que podia “enxergar” –

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as ervilhas. Menos de duas décadas depois, em 1882, Walther Flemming, através de técnicas de coloração, foi capaz de visualizar a estrutura à qual Mendel se referia e que jamais viu – os cromossomos. Passado mais de um século, graças a uma imagem feita a partir da difração de raios-X pela célebre Rosalind Franklin, foi que Watson e Crick conseguiram formular a estrutura de dupla hélice do ácido desoxirribonucleico (DNA). Partimos quase sempre do naturalmente visível para o naturalmente invisível, e é graças à capacidade de se conseguir reproduzir ou expor as estruturas biológicas que a biologia celular conseguiu evoluir ao ponto de podermos descrever de quais estruturas uma célula é composta ou de quais células um órgão é formado, e mais, como essas estruturas e entidades biológicas relacionam-se fisicamente entre si. Quanto mais aprofundamos o estudo de um sistema, menor fica a escala, mais sensível se torna o sistema às intervenções e manipulações e maior é a dificuldade de se obter riqueza de detalhes, ou mesmo de observar estruturas e suas delimitações. Um marco da histologia e na neuroanatomia foi o reverenciado trabalho de Santiago Ramón y Cajal (1852-1934) que, através de coloração de nitrato de prata, impregnou alguns neurônios em sua totalidade, revelando, assim, elementos celulares do circuito neuronal. Cajal usou uma técnica de coloração histológica desenvolvida por seu contemporâneo Camillo Golgi. Golgi, por sua vez, descobriu que conseguia escurecer algumas células cerebrais tratando o tecido do cérebro com uma solução de nitrato de prata. Isto permitiu que resolvesse em detalhe a estrutura dos neurônios individuais e levou-o a concluir que o tecido nervoso era um retículo contínuo (ou teia) de células interligadas, como aquelas que constituem o sistema circulatório. Usando o método de Golgi, Ramón y Cajal chegou a uma conclusão muito diferente. Postulou que o sistema nervoso é composto por bilhões de neurônios distintos e que estas células encontram-se polarizadas. Cajal sugeriu que os neurônios, em vez de formarem uma teia contínua, comunicam-se entre si através de ligações especializadas chamadas sinapses. Esta hipótese transformou-se na base da "doutrina do neurônio", que indica que a unidade individual do sistema nervoso é o neurônio. A microscopia eletrônica mostrou anos mais tarde que uma membrana plasmática envolve completamente cada neurônio, reforçando a teoria de Cajal, e enfraquecendo a teoria reticular de Golgi. Contudo, com a descoberta das sinapses elétricas (junções diretas entre células nervosas), alguns autores argumentaram que Golgi estava ao menos parcialmente correto. Por esse trabalho, Ramón y Cajal e Golgi compartilharam o Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1906. Ramón y Cajal propuseram também que a maneira como

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os axônios crescem é através de um cone de crescimento nas suas extremidades. Compreendeu-se que as células neuronais poderiam detectar sinais químicos e mover-se no sentido apropriado para o crescimento. Durante anos, a histologia foi o método mais precioso para se estudar a biologia celular, as interações entre células, morfologia externa e arquitetura micrométrica dos órgãos e tecidos para o entendimento de sistemas celulares1. A pesquisa básica beneficiou-se sobremaneira da possibilidade de se observar em tempo real, in vitro ou in vivo, interações entre células e expressão de proteínas de superfície usando colorações artificiais com fluoróforos, quais sejam, anticorpo conjugado com corantes (dye) fluorescentes que podem ser visualizados em microscópio de fluorescência. Mas foi com a aplicação de proteínas fluorescente (proteínas de cor X, ou, em inglês, X-fluorescent proteins – XFP) e sua expressão heteróloga que se deu um salto no estudo da fisiologia e biologia celular. Com o recente advento da técnica de expressão combinatória de XFP, conhecida inicialmente por Brainbow na neurociência, os pesquisadores são capazes de construir mapas específicos do circuito neural e melhor investigar as múltiplas atividades neuronais e a consequência delas no comportamento. Assim, é possível obter informações sobre as interconexões entre os neurônios e suas interações subsequentes que afetam a funcionalidade do cérebro como um todo2,3. Mais do que isso: novas aplicações para a técnica de expressão combinatória têm surgido através de modificações nas construções genéticas dos vetores de expressão, principalmente considerando o padrão de recombinação sítio-específica. Neste capítulo, trataremos da técnica de expressão combinatória de XFP, iniciando com as primeiras abordagens para expressão e criação de cobaias transgênicas para as XFP até a mais inovadora técnica – brainbow –, analisando todos os elementos necessários para sua utilização, bem como sua aplicação prática na pesquisa científica e adaptações do brainbow original a diferentes modelos de estudo.

27.2 A PRIMEIRA PROTEÍNA FLUORESCENTE: GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP) As proteínas fluorescentes têm uma história científica que antecede os anos de 1960, mas foi com a edição da revista Science de 11 de fevereiro de 1994 que foram consideradas um marco revolucionário para a ciência. A imagem da capa foi o trabalho de Chalfie e Tu4, que mostrava os neurônios

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sensoriais verde-brilhantes de Caenorhabditis elegans. O grupo também expressou em Escherichia coli esta mesma revolucionária proteína derivada da água-viva – Aequorea victoria –, a proteína fluorescente verde (green fluorescent protein – GFP) (Figura 27.1). A GFP é uma proteína de 238 aminoácidos5, sendo o principal gerador do efeito de fluorescência o tripeptídeo Serina-Tirosina-Glicina (Ser65-Tyr66Gly67). A excitação deste peptídeo em torno de 395 nm ou 475 nm provoca sua cliclização logo após a desidrogenação do resíduo de tirosina, emitindo uma fluorescência em 598 nm, aproximadamente. A partir de substituições dos resíduos de aminoácidos que compõem o tripeptídeo, seguidas de alterações dos resíduos que interagem com ele, foi possível gerar as primeiras variantes de GFP em cor (emissão) e intensidade de fluorescência6. O processo de alteração conformacional é promovido pela interação de resíduos de aminoácidos que circundam o tripeptídeo no estado neutro ou ionizado. Contudo, nem todos os resíduos são necessários para promover a fluorescência, o que torna possível diminuir o tamanho através de deleção para melhor incorporação e expressão dela. O provável mecanismo que inicia o processo de emissão de fluorescência é a transferência de prótons via ligações de hidrogênio da Ser205 para Glu222 em solução6. A possibilidade de promover uma expressão constante in vitro ou in vivo, de maneira estável, permanente ou induzível, permitiu ampla aplicação da proteína fluorescente. Tornou-se possível visualizar e acompanhar em tempo real alguns eventos celulares jamais observados7,8. Podemos citar pelo menos quatro características que fizeram a GFP especialmente útil: • GFP é uma proteína, sendo então possível a célula produzí-la pela introdução de um cassete de DNA complementar (cDNA) a fim de que este seja utilizado pela maquinaria da própria célula para sua leitura e transcrição. Isto pode ser feito de maneira a tornar-se, além de estável, hereditário; • O cromóforo de GFP é derivado inteiramente a partir da cadeia de polipeptídeo (por ciclização e oxidação espontânea), portanto, não há necessidade de cofatores exógenos ou substratos para induzir a fluorescência nas células que expressam GFP, evitando, assim, flutuações nos níveis de expressão; • A GFP pode ser expressa em fusão com outras proteínas ou com sequência de peptídeos-sinal para expressão em compartimentos específicos da célula, sem que isso cause perda da fluorescência;

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• Através de engenharia genética, a GFP pode receber mutações para obtenção de variantes com alteração das propriedades espectrais e maior eficiência de tradução, estabilidade térmica e rendimento quântico;

Figura 27.1 Estrutura monomérica da proteína fluorescente verde de Aequorea victoria em (A), visão lateral, e em (B), visão inferior do barril-β que forma a estrutura (PDB ID 1GFL). Em (C), a sequência de 238 aminoácidos que compõem a proteína, com destaque para o tripeptídeo Ser65-Tyr66-Gly67, no centro da estrutura. Quando excitado, ocorre uma ciclização deste peptídeo que pode absorver energia e emitir parte desta na forma de fluorescência, típica dessa proteína5,9.

• Propriedade de não ser citotóxica. Uma miríade de trabalhos foi feita usando a GFP como proteína repórter, ou seja, tendo a sequência dela seguida pela de uma proteína de interesse para que a fluorescência de uma indique a expressão da outra. Em meados da década de 1990, trabalhos usando camundongos transgênicos expressando GFP constitutivamente abriram as portas para o uso dessa ferramenta no estudo in vivo. A tecnologia das proteínas fluorescentes chegou aos anos

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2000 trazendo mais uma abordagem que fez dela uma ferramenta indispensável para o estudo de biologia e fisiologia celulares: a possibilidade de expressar várias proteínas fluorescentes em um mesmo órgão e ao mesmo tempo. Animais transgênicos são produzidos por meio da metodologia de Cre-Lox para expressão combinatória de proteínas fluorescentes, expressando um mosaico de cores em órgãos específicos e possibilitando, assim, o estudo de interações celulares como nunca antes se imaginou possível.

27.2.1 A diversidade de proteínas fluorescentes – XFP Variantes da proteína GFP foram produzidas ou descobertas por diversos estudos, sendo o principal o realizado por Tsien10, que valeu a seu grupo o prêmio Nobel de Química de 2008. Hoje é possível encontrar diversos trabalhos que empregam proteínas fluorescentes de diversos espectros, como vermelho (red fluorescent protein – RFP), ciano (cyan fluorescent protein – CFP), amarelo (yellow fluorescent protein – YFP), laranja (orange ƒluorescent protein – OFP)11,12. Em outro capítulo desta coleção apresentamos a diversidade e uso das várias proteínas fluorescentes disponíveis comercialmente.

27.3 A PRODUÇÃO DE UM ANIMAL FLUORESCENTE O primeiro camundongo GFP foi produzido pelo grupo de Ikawa e Kominami13em 1995. Oócitos fecundados de camundongos B6C3F1, coletados do oviduto, foram transfectados com um plasmídeo GFP e reimplantados em outro camundongo. A prole transgênica apresentou frequência mendeliana do fenótipo GFP, que pôde ser visualizado por método histológico. Estava então introduzido o modelo murino GFP. Embora não tivesse sido avaliado o potencial citotóxico da expressão da proteína fluorescente, a simples concepção da prole, sem aparente distúrbio, dava indício da propriedade inerte da GFP nas células que a expressam. Outros trabalhos que se seguiram vieram a confirmar isso. No mesmo ano, Mashall e sua equipe clonaram o promotor do receptor de glutamato N-metil-D-aspartato (N-methyl-D-aspartate – NMDA) fundido com a GFP e o expressaram em uma cultura de células de rim embrionário humano (HEK293 - human embryonic kidney 293 cells) 14. Dois anos depois, Zhuo clonou também, a partir de um plasmídeo, a GFP, fundindo-a com um promotor específico de uma proteína que é expressa por células da glia, a

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Figura 27.2 Substituição do gene LacZ por GFP. O plasmídeo phGFAP-LacZ possui o promotor do gene que codifica GFP humana e o gene da que codifica a β-lactamase, LacZ. O LacZ pode ser substituído pelo GFP utilizando digestão por enzimas de restrição, seguido de ligação por uma DNA ligase. Ao final deste processo, obtém-se o plasmídeo phGFAP-GFP que expressa GFP em células comprometidas com a linhagem glial.

proteína ácida fibrilar da glia (Glial Fibrillary Acidic Protein – GFAP) 15. Para tanto, o gene LacZ (β-galactosidase) do plasmídeo, que serve como indicação de que o inserto foi inserido no plasmídeo, foi retirado para inserção do gene da GFAP humana (Figura 27.2). Camundongos transgênicos também foram obtidos pela técnica de microinjeção pronuclear do DNA recombinante (contendo a sequência promotor GFAP + GFP) diretamente em oócitos fecundados. Neste caso, o transgene só expressou a GFP na micróglia, uma vez que o cassete contendo a sequência foi incorporado em virtualmente todas ou quase todas as células da prole, mas apenas as células da glia são responsivas para expressão dessa proteína, já que o promotor do gene GFAP está ativo somente nessas células. Nesse sentido, é possível então fazer observações por fluorescência célula-específica usando promotores específicos (Figura 27.2). O estudo de interações celulares, principalmente na neurobiologia, sempre teve o percalço da dificuldade de se observar da forma mais fidedigna possível, in vivo ou in vitro, a íntima relação entre estruturas celulares. E se fosse possível ter um animal transgênico expressando mais de uma proteína fluorescente? Ou que expressasse diferentes proteínas fluorescentes em tipos

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celulares diferentes? Este tipo de abordagem traz consigo a possibilidade de estudar a interação de redes de células, seus prolongamentos e contatos célula-célula, dando início a uma nova era para o estudo da biologia celular e anatomia dos sistemas celulares.

27.4 EXPRESSÃO COMBINATÓRIA DE XFP – BRAINBOW Algumas estruturas celulares da rede neural não são muito bem visualizadas pelos métodos de coloração mais utilizados, como a injeção de corante e coloração de Golgi. Estas técnicas apresentam limitações, como uma capacidade limitada de corar as células com uma gama restrita de cores, o que trazia um volume de informação limitado no que diz respeito às estruturas neuronais1. Assim, como alternativa para facilitar o estudo de conexões entre neurônios, a técnica brainbow foi desenvolvida. Brainbow é uma técnica de neuroimagem desenvolvida em 2007 pelo grupo do Prof. Dr Jeff W. Lichtman da Harvard Medical School, nos Estados Unidos 3. A construção baseia-se em dois passos básicos: uma construção genética específica obtida através de recombinação sítio-específica dos genes de três ou quatro cores de XFP e sua clonagem em plasmídeos de expressão, que são, então, introduzidos em células. O resultado é a expressão aleatória e em diferentes proporções de XFP, subsequentemente, fazendo com que as células exibam uma variedade de tons fluorescentes16. Foi lançando mão de variações de proteínas fluorescentes que foi possível obter camundongos expressando uma variedade delas (GFP, CFP, OFP, RFP e YFP) e sua superposição no sistema nervoso central (SNC)17 (Figura 27.3). O promotor de Thy1 (ou CD90, Cluster of Differentiation 90) de camundongo “neurônio-específico” foi usado para dirigir a expressão específica de proteínas no cérebro. Os genes ligados a Thy1 são expressos em projeções neuronais de muitas partes do SNC, e por isso as XFPs foram clonadas junto ao promotor Thy1, formando o cassete contendo um único promotor Thy1 seguido das XFP. O processo de recombinação Cre-Lox promoveu a combinação à frente deste promotor, gerando um padrão de cores característico. Os camundongos transgênicos foram obtidos pela mesma técnica de microinjeção. Surgiu, então, um animal expressando neurônios de várias cores, de forma aleatória. Para essa metodologia, o padrão de cores chega a ter a capacidade de diferenciar neurônios fluorescentes individualmente com aproximadamente cem tons diferentes, o que permite a diferenciação clara e robusta de estruturas

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Figura 27.3 Padrão de expressão combinatória de XFP – brainbow – proposto e desenvolvido por Livet e Weissman 3. Durante o desenvolvimento do cérebro dos animais que tiveram sequências XFP recombinadas por Cre-Lox, células comprometidas com a linhagem neuronal expressam diferentes XFP e diferentes intensidades de fluorescência. Neste esquema, uma representação de um estágio de migração e maturação de células nervosas expressando cinco XFP (Para visualizar as cores veja o material de apoio no site da Editora Blucher): amarela (YFP), alaranjado (OFP), ciano (CFP), vermelho (RFP) e verde (GFP).

extremamente pequenas, como processos dendríticos e axonais. Como vários cassetes são integrados em um único local do genoma, e a escolha de cada cassete é realizada de forma independente, a expressão combinatória pode produzir os neurônios individuais com diferentes intensidades e tipos de cores, proporcionando aos neurônios próximos identidades espectrais distintas19. Como visto nesse caso, alguns elementos de controle epigenético podem influenciar na expressão do transgene, como a conformação da cromatina próxima ao sítio de integração, que pode afetar no reconhecimento do transgene pelos fatores de transcrição. Outra possibilidade levantada é que a cromatina adjacente ao sítio de inserção possa silenciar o transgene em algumas células, fenômeno conhecido como variegação por efeito de posição (position-effect variegation – PEV), um efeito de silenciamento estocástico de um gene em uma proporção de células que se esperava que expressasse tal gene ou uma variegação causada pela inativação de um gene em algumas células através da sua justaposição anormal com a heterocromatina.

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A decisão de ativar ou silenciar um gene ocorre no início do desenvolvimento. Outra suspeita é que, em função da inserção de várias cópias do transgene em tandem, essas são preferencialmente silenciadas por “mimetizarem” a heterocromatina. Como resultado, o transgene presente em múltiplas cópias pode ser menos eficientemente expresso que aqueles presentes em uma ou poucas cópias17,20.

27.4.1 Produzindo camundongos multifluorescentes Vários trabalhos mostraram o feito de se produzir cobaias portando mais de uma proteína fluorescente em seu genoma. O método de se fazer esses animais diferiram com o passar dos anos. Com base nas leis mendelianas e com um pouco de engenharia genética, foi possível criar camundongos expressando neurônios de cores variadas. Podemos citar três principais técnicas usadas para tanto.

27.4.1.1 Cruzamento entre mutantes Vetores de expressão portando gene de XFP, normalmente precedido de um promotor tecido-específico, são usados para transfectar um conjunto de células-tronco embrionárias (embryonic stem cells – ESC). Assim, tem-se que cada conjunto de ESC transfectadas por eletroporação, lipossomos ou transdução viral terá uma ou mais cópias do gene de uma determinada proteína fluorescente. Os núcleos dessas ESC são retirados e inseridos em oócitos fecundados anucleados de camundongos e, então, estes são transplantados em outro camundongo para a geração de uma prole transgênica, portando o gene de uma XFP. As proles transgênicas podem ser cruzadas entre si para a geração de um híbrido. Se o progenitor tiver sido produzido a partir de ESC contendo GFP e a progenitora a partir de ESC contendo CFP, a prole consequentemente portará os dois genes17,21 (Figura 27.4).

27.4.1.2 ESC transgênicas Outro método de produção de animais multifluorescentes é através de modificações genéticas de ESC pela inserção dos cassetes com promotores e

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Figura 27.4 Desenho esquemático de produção de camundongo transgênico expressando proteína fluorescente verde e amarela (GFP e YFP): ESC são retiradas, e uma sequência de XFP é inserida nestas células. Em seguida, estas são transferidas para um óocito fecundado anucleado e transplantado em um camundongo para geração da prole fluorescente para uma XFP. Posteriormente, as proles de duas linhagens fluorescentes diferentes podem ser cruzadas para a produção de uma segunda prole, desta vez bifluorescente.

XFP (ao menos duas variantes). Por um processo de fusão dos blastocistos, estes são cultivados com ESC, transplantados no interior de blástulas e transferidos para um animal para dar início ao desenvolvimento embrionário22. O resultado esperado é a reorganização das células contendo as diferentes XFP no interior e na superfície da blástula. Com o decorrer do desenvolvimento,

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Figura 27.5 Produção de quimera expressando XFP pelo método de agregação embrionária. Blastocistos são transfectados com genes de XFP. Os blastocistos são fundidos por eletrofusão, cultivados com as ESC-YFP e ESC-GFP e transplantados para a formação do embrião. As células fluorescentes irão se redistribuir e formarão diferentes padrões de fluorescência em órgãos e tecidos.

órgãos e tecidos diferenciados apresentarão um perfil fluorescente distinto ou até mesmo interseccionado entre XFP, típicos de uma quimera (Figura 27.5).

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27.4.1.3 Recombinação mitótica intercromossômica O conhecimento sobre as bases mecanísticas de recombinação genômica foi incorporado a fim de se obter uma nova ferramenta para a expressão de proteínas fluorescentes. Pelo método de Cre-Lox é possível obter organismos que expressam genes de maneira induzida e controlada (assunto discutido no capítulo 25 deste livro). Além disso, é possível produzir cobaias expressando mais de uma proteína heteróloga no seu repertório proteico. Através da recombinação direcionada pela enzima Cre recombinase é possível substituir um gene por seu adjacente em uma sequência de DNA. Um método utilizado é a recombinação homóloga sítio-específica. Neste método, sítios Lox flanqueiam duas sequências parciais de XFP23, e o alelo que contém a continuação das sequências da XFP também é flanqueado pelos sítios Lox. O animal transgênico tem no seu repertório genômico o gene da Cre recombinase fundido a um domínio de ligação para tamoxifeno do receptor de estradiol (Cre/RE). Dessa maneira, a recombinase pode ser ativada pela administração de tamoxifeno, um agonista do receptor de estradiol 2 (Figura 27.6). A indução também pode ser feita de outras maneiras, com o vetor plasmidial contendo um domínio de ligação à droga ou promotor específico seguido do gene cre que provoque a expressão induzível da Cre recombinase24-26.

Figura 27.6 Ativação de Cre recombinação pela ligação de tamoxifeno ao domínio de ligação à droga do receptor de estradiol fundido a Cre. Uma das maneiras de se controlar temporalmente a atividade da Cre recombinase é fundi-la à um domínio proteico que a ativa na presença de um indutor (neste exemplo, o tamoxifeno) que é administrado no momento em que se deseja a recombinação. Com a Cre recombinase ativa haverá recombinação de sequências flanqueadas por sítios Lox – a recombinação Cre-Lox.

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Figura 27.7 Recombinação mitótica intercromossômica mediada por Cre recombinase16. Duas sequências exônicas que codificam diferentes XFP são separadas por Lox, que impede a produção de uma XFP funcional. Essas sequências truncadas são inseridas em um óocito fertilizado e transferido para o animal. A prole, quando na presença de Cre, terá as XFP inicialmente truncadas e recombinadas e poderão ter quatro possibilidades fenotípicas diferentes: expressar o primeiro tipo de XFP (um dos produtos da recombinação aproximou éxons da mesma XFP e por isso a tornou funcional), expressar o segundo tipo de XFP, expressar as duas XFP e não expressar nenhuma das XFP (os produtos da recombinação permaneceram truncados).

A Cre recombinase substitui a sequência downstream (a jusante), do promotor pelo seu alelo correspondente no cromossomo homólogo. Por crossing over, as sequências são truncadas, tornando-as completas. Ainda que o sítio Lox continue no meio da sequência das XFP, ocorre o splicing alternativo ou processamento alternativo do RNA mensageiro (mRNA), não interferindo na expressão da XFP (Figura 27.7).

27.4.1.4 Expressão multivariada de XPF – camundongo brainbow Uma abordagem ainda mais inovadora é a obtenção de animais transgênicos com expressão de matizes de cores pela combinação de GFP, RFP e BFP

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(blue fluorescent protein – cuja cor aproxima-se da CFP), tratadas como “XFP”. Uma boa analogia citada é o monitor de TV, que combina diferentes intensidades de três canais (vermelho, verde e azul) para formar todo o espectro de cores possível. Pela combinação aleatória das três proteínas em um mesmo animal e no mesmo tecido, as células desse tecido irão diferir umas das outras pelas diferentes intensidades de cores possíveis. Usando o sistema Cre-Lox induzível é possível fazer um tecido que contenha todos os elementos necessários (GFP, RFP, BFP, sequência Lox, gene Cre/ER), e podese promover a recombinação pela ativação da Cre recombinase. O resultado é um espectro que não só depende das possíveis combinações das três cores, mas também do número de cópias que a célula carrega, o que aumenta grandemente o repertório de cores (Figura 27.8).

Figura 27.8 Expressão combinatória de XFP mediada por Cre-Lox. Um vetor de expressão contendo um promotor (quadrado preto P) seguido de XFP (CFP, YFP e RFP) flanqueadas por sítios Lox (pares de triângulos – tons de cinza – referem-se a diferentes sequências de Lox incompatíveis). As três possibilidades de cores – ciano, amarela e vermelha (CFP, YFP e RFP, respectivamente) – combinam-se durante o processo Cre-Lox, formando uma gama de tonalidades espectrais para cada célula16.

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27.4.2 LOLLIbow para Drosophila O estudo do desenvolvimento de um animal requer técnicas e protocolos que garantam a intactabilidade da estrutura estudada. Mudanças provocadas pelas metodologias aplicadas em um meio celular podem eventualmente mascarar o perfil de desenvolvimento visto in vivo 27. Um dos métodos de visualização mais utilizados, a imunocitoquímica, rotineiramente sujeita as amostras de fixação a outros tratamentos que podem também alterar a arquitetura celular, virtualizando uma condição de um organismo vivo. Foi pensando dessa forma que a técnica de brainbow foi expandida para outros organismos, como Drosophila melanogaster, espécie para a qual recebeu o nome de LOLLIbow. O sistema ofereceu marcadores fluorescentes permanentes que revelam detalhes morfológicos de células individuais, sem a necessidade de fixação das amostras. Através desta adaptação de brainbow é possível identificar e acompanhar a maquinaria que controla as interações entre as células em diferentes estágios do desenvolvimento. O método também usa um meio não invasivo para controlar o momento que ocorre a recombinação genética e consequente padrão estocástico de três cores (vermelha, amarela e azul) utilizando um pulso de luz. Esse pulso de luz é capaz de ativar a Cre recombinase foto-induzível, a Split-Cre28, no estágio específico do desenvolvimento do embrião de Drosophila que se quer estudar27,29. O desenvolvimento do animal, incluindo a adaptação do desenvolvimento sensorial do cérebro, é finamente orquestrado entre os diversos tipos de células, na forma com que migram, se desenvolvem, transformam e interagem uns com outros. Dessa forma, o LOLLIbow 27, no caso dos embriões de D. melanogaster, é considerado uma importante aplicação do brainbow, como o grupo de Akira Chiba da Universidade de Miami fez em cultura de células e células de D. melanogaster, para estudar o desenvolvimento e organização de redes celulares complexas27.

27.4.3 Zebrabow para Zebrafish Zebrabow é a versão de brainbow desenvolvida para o peixe-zebra (Danio rerio-conhecido por zebrafish) pelo grupo do professor Alexander F. Schier, da Universidade de Harvard, nos Estados Unidos30. Eles relataram que existem vantagens únicas no uso do brainbow em zebrafish em comparação aos

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outros organismos-modelo. A primeira delas é que o animal é transparente durante o desenvolvimento inicial. Quando um grande número de células é marcado, a identificação de células individuais muitas vezes se torna difícil. No sistema nervoso, em especial, a sobreposição de axônios e dendritos não pode ser resolvida com a microscopia de fluorescência convencional, dificultando o rastreamento da conectividade precisa de neurônios individuais. Células fluorescentes de embriões e larvas de zebrafish podem ser visualizadas diretamente usando até mesmo microscopia óptica, o que contorna o problema de identificação de estruturas pequenas e viabiliza utilizar este animal como modelo de desenvolvimento neuronal31. Em segundo lugar, a geração de peixes transgênicos zebrabow por injeção de DNA é eficiente temporalmente, uma vez que os embriões submetidos à técnica começam imediatamente a expressar um mosaico de cores. Assim, os recombinantes podem ser analisados usando o zebrabow sem a necessidade de várias gerações de reprodução30. Para a indução da recombinação, é utilizado um animal transgênico que expressa a Cre recombinase sob controle do promotor Hsp (do inglês, heat shock protein, proteína de choque térmico), produzindo três tonalidades de fluorescência: amarela, vermelha e azul (devido a YFP, RFP e CFP, respectivamente). O zebrafish tem uma vantagem adicional para sua utilização com brainbow: o número reduzido de neurônios comparado a camundongos, animais para os quais a técnica foi originalmente proposta. Em linhas gerais, isto facilita a observação de interconexões neurais em diferentes regiões do cérebro e do corpo do animal30,32.

27.5 EXEMPLO DE PROTOCOLO DE PRODUÇÃO DE ORGANISMO MULTIFLUORESCENTES POR RECOMBINAÇÃO ESTOCÁSTICA – ZEBRABOW Os plasmídeos brainbow propostos por Livet e Weissman 3 podem ser utilizados para diversos organismos com pequenas alterações na sequência – principalmente de promotor do cassete de expressão – modificações na metodologia de ativação da Cre recombinase. No exemplo de protocolo a seguir, baseado em Mahou e Zimmerley29, foi utilizado um dos plasmídeos brainbow com alteração do promotor Thy para um promotor específico para zebrafish e inclusão de sequências up e downstream para que houvesse recombinação homóloga por transposição para o genoma do peixe do cassete de XFP.

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27.5.1 Crescimento de Zebrafish A linhagem de zebrafish TL/AB deve ser mantida em condições de crescimento padrão: Os embriões devem ser mantidos a 28,5 °C em meio contendo 0,1% azul de metileno e 0,03% sal marinho. Após 24 horas de fertilização, os embriões devem ser transferidos para água contendo 0,003% 1-fenil2-tioureia (para inibir pigmentação).

27.5.2 Geração de linhagem recombinante O plasmídeo brainbow 1.0L3 contendo o cassete de expressão que contem RFP, CFP e YFP (Figura 27.9) e promotor de ubiquitina b são utilizados. Para permitir a incorporação dessa sequência no genoma, o cassete deve ser flanqueado por sítios Tol2 e I-SceI. 35 pg de mRNA de Tol2 transposase, e 20 pg do plasmídeo devem ser coinjetados nos embriões. A confirmação da inserção pode ser feita atráves da PCR pelo método de HotSHOT33. Os embriões são digeridos com 100 μL de 50 mM NaOH, incubados a 95 °C por vinte minutos e resfriados a 4 °C. Em seguida, adicionar 10 μL de 1 M Tris-HCl pH 7,5 a cada amostra. O DNA deve ser adicionado aos primers e à GoTaq qPCR Master Mix (Promega) e colocados em termociclador. Os primers controle são: 5’TCAGTCAACCATTCAGTGGCCCAT3’ 5’CAGGAAAGGGAATGCAGGGTTTGT3’ Os primers zebrabow são: 5’ACCTGGTGGAGTTCAAGACCATCT3’ 5’TCGTACTGTTCCACGATGGTGTAGTC3’. O número de cópias é determinado pelo método de comparação de CT.

Figura 27.9 Plasmídeo brainbow 1.0L contendo três XFP: RFP (vermelha), CFP (ciano) e YFP (amarela). O promotor de ubiquitina b, ubi, foi inserido em substituição ao promotor Thy do plasmídeo original para que a expressão fosse possível em zebrafish.

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A expressão de RFP (cor padrão quando não há recombinação Cre-Lox) pode ser vista a partir de seis horas após a fertilização.

27.5.2.1 Recombinação Cre-Lox Devem ser eluídos 50 μM de Cre recombinase purificada (New England Biolabs) na razão 1:20 de 0,1 M de cloreto de potássio, e 1 μL dessa solução deve ser injetada em um blastômero no estágio de 1-8 células. Um padrão de cores proporcionado pela recombinação já pode ser visualizado de seis a oito horas após a fertilização.

27.5.2.2 Microscopia Os animais devem ser anestesiados com sulfanato de etil-3-aminobenzoato e montados em 1% de agarose abaixo do ponto de fusão em placas de cultura de fundo de vidro. As amostras estão prontas para serem processadas em microscópio confocal ou de fluorescência. São necessários os filtros de emissão para RFP: 561 nm e emissão entre 585-685 nm, YFP: 515 nm e emissão 535-565 nm e CFP: 440 nm com emissão entre 465-495 nm.

27.6 PERSPECTIVAS FUTURAS A utilização de XFP já foi considerada um marco na pesquisa científica. Agora é aplicada de modo combinado e estocástico em tecido vivo ou em culturas de células. Ela possibilita inferir sobre os principais eventos celulares, como sinaptogênese, crescimento axonal, desenvolvimento embrionário, migração celular, taxa de crescimento, dentre outros, com uma riqueza de detalhes que supera as técnicas já desenvolvidas, sem provocar nenhuma alteração lesiva e citotóxica considerável. Existem alguns pontos-chave para a utilização de brainbow. A seleção de promotores tecido específicos, quando se deseja estudar determinadas regiões, permite selecionar um grupo de células para o estudo sem interferir nas demais. A posição da região promotora também pode criar uma regra de combinação das XFP, que pode inclusive permitir a detecção dos tipos de células em diferenciação de ESC, determinando-se células adultas e funcionais. Esta é uma das áreas de pesquisa atuais de nosso laboratório.

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Um segundo ponto importante para a utilização da técnica é relacionado ao sistema Cre-Lox. O número de pares de sítios Lox que flanqueiam as sequências necessita ser incompatível para que sejam geradas XFP funcionais. O modo de indução da recombinação via expressão de Cre recombinase também é um ponto crucial para a brainbow. A Cre pode ser ativada espacial e temporalmente, dependendo do tipo de promotor que precede o gene cre, a necessidade de indução por drogas, bem como a sua forma de inserção na célula. A obtenção de imagens de fluorescência de experimentos brainbow requer uma atenção especial. Imagens multicoloridas são cada vez mais utilizadas em biologia para uma variedade de experimentos; por isso, tem-se desenvolvido, nos últimos anos, formas de se obter imagens sem nenhuma perda informacional, como uma adaptação da microscopia de fluorescência excitada por dois fótons (two-photon-excited fluorescence microscopy – 2PEF) 29. Neste tipo de microscopia, a imagem de três fluoróforos com espectros de absorção cobrindo um amplo espectro do infravermelho próximo são obtidas pelo microscópio de dois fótons, como é necessário para a imagem das XFP produzidas via brainbow, gerando dados com alta resolução sem o cruzamento de excitações e emissões que geram ruídos nos experimentos. A obtenção de imagens ao longo do tempo, conhecida como time-lapse imaging, também desponta como uma grande ferramenta aliada ao brainbow. No entanto, os aparelhos atuais, em sua maioria, estão limitados a faixas de excitação e emissão que não necessariamente acompanham o perfil de cores das XFP, o que deve ser sanado com adaptações e desenvolvimento de equipamentos capazes de trabalhar em largas faixas do espectro.

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CAPÍTULO

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TRANSPLANTE DE ESPERMATOGÔNIAS-TRONCO COMO ABORDAGEM BIOTECNOLÓGICA PARA A PRODUÇÃO DE ANIMAIS TRANSGÊNICOS Samyra M. S. N. Lacerda Guilherme M. J. Costa Fernanda M. P. Tonelli Gleide F. Avelar Luiz Renato de França 28.1 INTRODUÇÃO

Todos os eucariotas que apresentam reprodução sexuada são constituídos de dois tipos fundamentais de células: as células somáticas, que formam o corpo ou estrutura do organismo, e as células germinativas que dão origem aos gametas e são responsáveis pela transferência do genoma de uma geração para a outra 1. Nesse sentido, uma vez que apresentam potencial de se

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reproduzir indefinidamente, as células germinativas são muitas vezes consideradas imortais1. Quanto à gametogênese masculina, para se manter o intrincado processo espermatogênico e a homeostase testicular durante toda a sua vida reprodutiva, os vertebrados contam com importantes populações de células-tronco germinativas, denominadas espermatogônias-tronco (do inglês, spermatogonial stem cells – SSC)2. Assim, além de constituírem a base para o processo espermatogênico, essas células apresentam características únicas no animal sexualmente maduro devido à sua capacidade de transmitirem informações genéticas para as gerações subsequentes. Em outro importante contexto, estudos recentes têm demonstrado que as SSC podem ser reprogramadas em células pluripotentes, apresentando a capacidade de se diferenciarem em tecidos somáticos3-5. À semelhança do que ocorre em outras populações de células-tronco adultas, as SSC são capazes de se autorrenovar e também de gerar células comprometidas com o processo de diferenciação 6,7. A atividade das SSC é regulada dentro de um microambiente específico nos testículos, denominado nicho espermatogonial, que pode ser influenciado por diferentes elementos celulares 8,9. Tradicionalmente, as células-tronco têm sido definidas por suas características funcionais. Assim, a identificação das células-tronco tem como base o desenvolvimento de ensaios demonstrando sua capacidade regenerativa apropriada a diferentes sistemas autorrenováveis do corpo, tais como a hematopoiese, pele, intestino e espermatogênese, dentre outros6,7,10. Nesse aspecto, a técnica de transplante de células germinativas, inicialmente desenvolvida em camundongos por Brinster e colaboradores nos anos 199011,12, representou um importante marco no conhecimento acerca da biologia das células-tronco espermatogoniais. A técnica do transplante de células germinativas consiste na transferência de espermatogônias-tronco de um doador fértil para o testículo de um receptor infértil, onde essas células se desenvolvem e formam espermatozoides férteis com características genéticas do doador. A eficiência do transplante depende da quantidade de SSC a ser transplantada e do microambiente testicular do receptor, que deve ter nichos acessíveis para a colonização das células do doador. Essa inovadora metodologia tem se tornado não apenas uma valiosa abordagem para se investigar a fisiologia das SSC, como também tem proporcionado enormes avanços no estudo da espermatogênese em si, das interações entre células de Sertoli e células germinativas, além de propiciar contribuições significativas na área de produção animal, preservação de espécies ameaçadas de extinção, medicina reprodutiva e a produção de animais transgênicos13,19.

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O termo animal transgênico refere-se ao animal cujas características genéticas (genoma) foram intencionalmente alteradas, por meio de técnicas de engenharia genética, o que o difere substancialmente das mutações espontâneas que ocorrem naturalmente e são importantes para a evolução biológica20,21. Uma vez que a manipulação genética in vitro permite a realização de estudos para se compreender de maneira mais ampla os processos biológicos e moleculares que ocorrem nos mais diversos tipos de organismos vivos, a produção de animais transgênicos constitui um dos grandes progressos recentes das pesquisas biotecnológicas. Ademais, a transgenia representa valiosa abordagem biotecnológica para a obtenção de maior ganho em produtividade, tanto na pecuária quanto na agricultura, além de propiciar a geração de biorreatores de grande importância na produção de biofármacos e bioprodutos. Classicamente, através de diversas metodologias, a tecnologia de transgenia permite a transferência de DNA exógeno (transgene) para o animal de interesse. Dentre essas metodologias podem ser mencionadas a eletroporação, microinjeção pronuclear, transferência nuclear e infecção por vetores virais em ovócitos recém-fertilizados 22,25 e células-tronco embrionárias 26. Também podem ser citadas técnicas de inseminação utilizando-se espermatozoides geneticamente modificados 27,28, bem como aquelas nas quais a alteração do DNA endógeno é feita através da recombinação homóloga em células-tronco embrionárias (do inglês, embryonic stem cells – ES) 29-31. Entretanto, apesar dos significativos e recentes progressos, tais métodos não raro têm apresentado limitado sucesso devido a dificuldades técnicas e à geração de animais mosaicos, acarretando como consequência alto custo de produção. Considerando-se que uma única SSC dá origem a um grande número de espermatozoides potencialmente capazes de gerar descendentes após a fertilização, essas células-tronco vêm se tornando atraente alvo para a manipulação genética, principalmente pelo fato de o transplante de espermatogônias permitir a produção de progênie carreando genes provenientes de SSC isoladas do doador. Assim, com a finalidade de se gerar animais transgênicos, a modificação genética dessas células, seguida do transplante, representa uma excelente tecnologia alternativa à modificação de ES e ovócitos recém-fertilizados32-35. Além de ser mais simples e barata, essa via de engenharia genética apresenta enorme potencial de uso em animais que ainda não possuem a tecnologia de modificação das ES desenvolvida, disponível ou mesmo eficiente. Ademais, outro aspecto bastante positivo é o fato de a recombinação gênica que ocorre nas células germinativas permitir alta variabilidade genética de indivíduos da mesma espécie.

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28.1.1 Estrutura do testículo em mamíferos A Figura 28.1 ilustra os principais constituintes dos compartimentos tubular e intertubular de mamíferos sexualmente maduros, indicando também algumas das possíveis interações entre as células germinativas e os componentes somáticos do testículo, principalmente células de Sertoli, de Leydig e peritubulares mioides36,41. Nos testículos, a célula de Sertoli é a primeira célula somática a se diferenciar. Esta célula origina-se provavelmente do epitélio celômico e seus precursores expressam o gene determinante do sexo masculino, o Sry, no braço curto do cromossomo Y. Dessa forma, a célula de Sertoli desempenha papel crucial na cascata de eventos relacionadas à diferenciação do testículo, que ocorre em torno de 11,5 dias de gestação em camundongos42,43 e por volta de 56 dias em humanos44. Já nos animais adultos, a célula de Sertoli é o elemento-chave da espermatogênese e, durante esse processo, interage com as células germinativas de maneira bastante complexa, tanto física quanto bioquimicamente. As junções de oclusão entre células de Sertoli adjacentes dividem o epitélio seminífero em compartimentos basal e adluminal 45. No compartimento basal estão localizadas as espermatogônias e os espermatócitos primários iniciais (pré-leptótenos/leptótenos), enquanto no adluminal encontram-se os espermatócitos primários a partir de zigóteno, espermatócitos secundários e espermátides. Funcionalmente, as junções de oclusão compõem a barreira de células de Sertoli que propicia um microambiente específico e imunoprivilegiado, essencial para o desenvolvimento do processo espermatogênico45. Assim, fica bastante evidente a necessidade da interação das células germinativas com os componentes somáticos do testículo, principalmente células de Sertoli, Leydig e peritubulares mióides, para que o processo espermatogênico transcorra de maneira normal e eficiente36,39,46. Além da formação da barreira dita hematotesticular, as células de Sertoli desempenham outras funções essenciais para o desenvolvimento das células germinativas, tais como37,47,48: fornecimento de nutrientes e inúmeros outros importantes fatores; suporte físico (sustentação) para as células espermatogênicas; fagocitose do excesso de citoplasma (corpos residuais) resultante da liberação das células espermiadas, bem como das células germinativas que sofrem apoptose; intermediação hormonal da espermatogênese através de receptores para esteroides (andrógenos e estrógenos) e para o hormônio folículo-estimulante (follicle-stimulating hormone – FSH). As células de Sertoli participam ainda ativamente no processo de espermiação das espermátides para o lume tubular, além de serem responsáveis pela secreção de fluido, o

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qual possui substâncias importantes para a função epididimária e maturação espermática, servindo também de veículo para o transporte dos espermatozoides, que são liberados ainda imóveis. As células de Leydig são geralmente encontradas próximas aos vasos sanguíneos ou do tecido conjuntivo da cápsula testicular (túnica albugínea) e sua ultraestrutura denota sua alta atividade esteroidogênica, evidenciada pela presença de retículo endoplasmático liso bem desenvolvido e mitocôndrias com cristas tubulares 49, que participam ativamente da síntese de esteroides (principalmente andrógenos), a partir de uma molécula base, o colesterol50. Essa produção ocorre através de estímulos do hormônio luteinizante (LH) em receptores localizados na membrana citoplasmática dessas células. Nos testículos, existem receptores para andrógenos nas células de Sertoli, peritubulares mióides, musculares lisas dos vasos e na própria célula de Leydig 38,51,52. Dentre os andrógenos sintetizados pelas células de Leydig incluem-se a testosterona e a diidrotestosterona, os quais são responsáveis pela diferenciação do trato genital masculino e da genitália externa na fase fetal53,54 e pelo aparecimento dos caracteres sexuais secundários e a manutenção quantitativa da espermatogênese a partir da puberdade47,52,54,55. Particularmente, a diidrotestosterona é também responsável pela manutenção funcional das glândulas sexuais acessórias e do epidídimo56,57. As células peritubulares mióides constituem o principal componente da parede dos túbulos seminíferos e, juntamente com as células de Sertoli, são responsáveis pela formação da lâmina basal, cuja integridade funcional é essencial para o processo espermatogênico40,58. Pelo fato de serem responsáveis pela secreção de várias substâncias que compõem a matriz extracelular (laminina, fibronectina, colágenos dos tipos I e IV e proteoglicanas) e fatores de crescimento como fator peritubular que modula a função das células de Sertoli (peritubular factor that modulates Sertoli cell function – PmodS), fator de crescimento semelhante à insulina-1 (insulin-like growth factor 1 – IGF-I), activina-A e fator de transformação do crescimento β (transforming growth factor β – TGF-β), as células peritubulares mióides participam de maneira bastante ativa da regulação parácrina da função testicular, particularmente das células de Sertoli 40,59. Ainda, como células contráteis, as células peritubulares mióides expressam proteínas do citoesqueleto (α-isoactina, F-actina e miosina), cujos filamentos são arranjados longitudinal e circularmente ao maior eixo do túbulo seminífero. A atividade desses filamentos é responsável pela contração dos túbulos seminíferos que resulta em movimentação de fluidos e propulsão dos espermatozoides40. Recentemente,

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foi demonstrado que camundongos cujas células peritubulares mioides não possuem receptores de andrógenos (PTM-ARKO46) são inférteis.

Figura 28.1 Composição do parênquima testicular de suíno sexualmente maduro, mostrando os dois principais compartimentos do testículo, bem como algumas das possibilidades de interações entre os componentes somáticos e germinativos. O compartimento tubular é composto da porção externa para a interna por: (i) túnica própria, constituída pelas células peritubulares mióides e lâmina basal (não indicada); (ii) epitélio seminífero onde se encontram as células de Sertoli e células germinativas em diferentes fases de desenvolvimento; e (iii) lume tubular. Além de outros tipos celulares, o compartimento intertubular apresenta grande número de células de Leydig e vasos sanguíneos.

28.1.2 Espermatogênese e potenciais biotecnológicos das espermatogônias-tronco De maneira geral, através de evento denominado especificação, durante as fases iniciais de desenvolvimento embrionário nos vertebrados as células germinativas primordiais (PGC) diferenciam-se das demais células somáticas 60. Posteriormente, essas células proliferam e migram para a região das cristas genitais, que darão origem às futuras gônadas masculinas (testículos) ou femininas (ovários) 61,62. Nos indivíduos geneticamente machos, após chegarem às cristas genitais, as PGC são denominadas de gonócitos ou pré-espermatogônias 63,64. Posteriormente, nos testículos já diferenciados e formados e após um curto período de quiescência, esses gonócitos se dividem e dão origem a um grupo de células mitoticamente ativas, as

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espermatogônias do tipo A, dentre as quais uma pequena fração permanece indiferenciada como células-tronco espermatogoniais, que constituem a base funcional da espermatogênese2,65,66. A espermatogênese (Figura 28.2) é um evento cíclico complexo, altamente organizado e coordenado, no qual as espermatogônias diploides (que apresentam dois conjuntos de cromossomos) se dividem e se diferenciam, levando finalmente à formação dos espermatozoides, que são células haploides (possuem um conjunto de cromossomos) altamente especializadas e equipadas para fertilizar os ovócitos67,68. Morfofuncionalmente, a espermatogênese pode ser dividida nas fases espermatogonial (proliferativa ou mitótica), espermatocitária (meiótica) e espermiogênica (diferenciação). A fase espermatogonial é caracterizada pela autorrenovação e diferenciação das SSC, gerando células “amplificadoras” e de reserva ou células comprometidas com a diferenciação. Essas espermatogônias mais diferenciadas dão continuidade ao processo espermatogênico, e um intrincado processo de diferenciação e proliferação ocorre até a última divisão mitótica que originará os espermatócitos primários, iniciando a fase meiótica ou espermatocitária 2. Após a primeira divisão meiótica formam-se os espermatócitos secundários, que num curto intervalo de tempo originam as espermátides haploides através da segunda divisão meiótica. Em seguida, ocorre a fase espermiogênica ou de diferenciação, na qual as espermátides se transformam em espermatozoides. Durante todo o processo espermatogênico, as contínuas mudanças que ocorrem nas células germinativas são notáveis, sendo a passagem pela fase meiótica fundamental para a manutenção da variação genética entre indivíduos da mesma espécie através da troca de genes entre cromossomos homólogos (recombinação gênica ou crossing-over) nos espermatócitos primários em paquíteno. Ilustrando o enorme potencial de amplificação da gametogênese masculina, teoricamente uma única SSC pode gerar 4.096 espermatozoides em ratos, camundongos e suínos 69. Embora tal potencial seja drasticamente menor no homem devido ao número muito baixo de divisões espermatogoniais, mesmo assim sua produção espermática diária por testículo pode chegar a até 100 milhões de espermatozoides70. O número de SSC no testículo adulto é relativamente pequeno (0,03% do total de células germinativas), com estimativas variando de 3 mil a 25 mil SSC em camundongos71-73 e 830 mil em ratos33. Esse importante aspecto motivou a investigação de marcadores fenotípicos específicos e a busca de características funcionais para a identificação das SSC em mamíferos, principalmente roedores, bem como em outras espécies de vertebrados, tais como peixes e aves66,74-77.

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Figura 28.2 Representação diagramática da espermatogênese de camundongo mostrando as três fases deste processo (proliferativa, meiótica e espermiogênica), representadas respectivamente pelas espermatogônias, espermatócitos e espermátides. A seta grande externa com várias linhas indica a sequência de diferenciação das células germinativas durante a espermatogênese. O círculo central representa o nicho espermatogonial caracterizado pela presença das espermatogônias indiferenciadas (As, Apr e Aal). Dentro do nicho espermatogonial, as setas menores denotam os possíveis destinos das espermatogônias indiferenciadas, e a seta curva em particular denota autorrenovação. A seta tracejada representa o processo de diferenciação das espermatogônias indiferenciadas em A1. As: espermatogônia isolada; Apr: espermatogônia pareada; Aal: espermatogônia alinhada; A1, A2, A3, A4, In e B: espermatogônias diferenciadas do tipo A, intermediária e do tipo B; espermatócito primário em: Pl (pré-leptóteno), L (leptóteno), Z (zigóteno), P (paquíteno), e D (diplóteno); M: figura de meiose; II: espermatócito secundário; R: espermátide arredondada; E: espermátide alongada.

Com o objetivo de se obter populações homogêneas de células germinativas, os primeiros trabalhos na literatura descrevendo a dissociação do tecido testicular e a obtenção dessas células foram publicados na década de 1970, utilizando-se centrifugação diferencial em gradientes de densidade78-82. Já nessas investigações, a obtenção de células testiculares tinha como principal finalidade o estabelecimento de sistema de cultivo para estudos bioquímicos de diferenciação das células germinativas. Atualmente, a obtenção das células germinativas em diferentes espécies é usualmente realizada através de

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modificação do procedimento originalmente relatado por Bellvé e colaboradores82, no qual o testículo do animal avaliado é coletado e dissociado por meio de um protocolo de digestão enzimática dupla ou tripla (colagenase associada com hialuronidase e tripsina). Após lavagem em meio de cultura de rotina, as células espermatogênicas são ressuspendidas e diluídas nas concentrações desejadas, sendo então submetidas à separação. Com o estabelecimento e utilização cada vez mais frequente da técnica de transplante de células germinativas, desenvolveu-se também amplo interesse pela investigação e descoberta de novas abordagens para se isolar e purificar as SSC, principalmente pelo fato de uma maior eficiência do transplante requerer a obtenção de populações celulares enriquecidas em SSC. Assim, dentre as várias abordagens empregadas na obtenção de populações celulares enriquecidas em SSC, podem ser citadas, por exemplo, as seguintes: i) utilização ou desenvolvimento de animais que apresentam alterações dos elementos somáticos do testículo (por exemplo, células de Sertoli, de Leydig e peritubulares mioides) e de maturação espermatogonial mais avançada, sem apresentar, no entanto, defeitos intrínsecos das células germinativas; ii) isolamento de espermatogônias indiferenciadas com base em marcadores moleculares específicos; e iii) expansão in vitro de espermatogônias isoladas. Várias outras metodologias também têm sido empregadas com o objetivo de se enriquecer o pool de SSC, podendo ser citadas, por exemplo, o criptorquidismo experimental em camundongos que causa a depleção (apoptoses) de células germinativas mais avançadas 83,84 e a utilização de doadores pré-puberes que apresentam somente espermatogônias em seus testículos83,85. Criptorquidia ou criptorquia (de cripto, escondido, e orquis, testículo) é a condição médica na qual não houve uma descida correta do testículo da cavidade abdominal (onde se desenvolve na vida intrauterina) para o escroto. Difere do testículo ectópico porque se encontra no lugar comum de descida testicular. Ainda nesse aspecto, McLean e colaboradores 86 evidenciaram que populações de células germinativas isoladas de camundongos deficientes em vitamina A, fator essencial para a diferenciação espermatogonial, ou aqueles cujos testículos sofreram insulação ou hipertermia (43 oC por quinze minutos), resultavam em maior eficiência após o transplante. Camundongos mutantes Steel (S1) também apresentam testículos contendo maiores frações de espermatogônias indiferenciadas. Mais especificamente, ao envolver falha na produção de c-kit ligante produzido pelas células de Sertoli (importante elemento somático do epitélio seminífero), nesses camundongos tal mutação resulta na parada de maturação espermatogonial, permitindo assim a obtenção de suspensões testiculares enriquecidas em SSC84,87. Além

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disso, diversas abordagens baseadas em características fenotípicas (marcadores moleculares) também têm sido descritas e utilizadas, principalmente em camundongos, com a finalidade de se identificar e isolar SSC. Nesse aspecto, o receptor do c-kit foi o primeiro marcador de superfície investigado. Assim, estudos utilizando anticorpos anti-c-kit evidenciaram que espermatogônias indiferenciadas são negativas para c-kit, enquanto espermatogônias diferenciadas expressam este receptor88,89. Atualmente, diversos marcadores fenotípicos de superfície de espermatogônias indiferenciadas em roedores (onde se encontram as SSC) estão disponíveis, podendo ser citados os seguintes: side scatter low, integrinas α1e β6, CD9, CD24, Thy-1(CD90), Ep-CAM, CD44, caderina 1 (Cdh1), Numb, receptor acoplado à proteína G 125 (GPR125), receptor GDNF α-1 (GFRα1), Ret, receptor de fator estimulante de colônia 1 (CFS1r)13,90-98. Outras técnicas surgidas recentemente também podem ser empregadas com o intuito de se obter populações celulares específicas enriquecidas. Assim, o isolamento de SSC através da utilização de citometria de fluxo (fluorescence-activated cell sorter – FACS), que se baseia nas propriedades de dispersão de luz (light scattering), associada a marcadores de superfície, tem permitido a aquisição de resultados bastante promissores, contribuindo sobremaneira para a caracterização funcional dessas células em diversas espécies, principalmente roedores91,99-101. De forma semelhante, a separação magnética de células (magnetic-activated cell sorting – MACS) é outra interessante abordagem que também pode ser utilizada para se isolar espermatogônias indiferenciadas102-104. Nesse sentido, quando comparadas às células testiculares não selecionadas, em suínos pré-púberes, populações de células testiculares SSEA-1+ (stage-specific embryonic antigen 1, ou antígeno embrionário 1 de estágio específico) separadas por FACS originaram número quinze vezes maior de colônias após o transplante100. O xenotransplante de espermatogônias Thy1+ isoladas através de MACS de testículos de caprinos pré-púberes também resultou em maior capacidade de formação de colônias do que células testiculares não selecionadas105,106. Da mesma forma, estudos em bovinos pré-púberes também mostraram resultados semelhantes após o xenotransplante de espermatogônias DBA + obtidas por FACS107. Finalmente, ainda como ilustração do alto potencial dessas abordagens, utilizando-se MACS espermatogônias indiferenciadas GFRα1+ também foram isoladas com sucesso de testículos de macacos Rhesus e humanos108,109. Em outra interessante vertente, com o objetivo de se obter suspensões celulares enriquecidas com espermatogônias indiferenciadas, a centrifugação diferencial em gradientes de densidade, os quais promovem a separação celular com base no tamanho e densidade, associadas ao plaqueamento

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diferencial, representam técnicas relativamente simples e possíveis de serem aplicadas110-113. Assim, suspensões celulares contendo até 85% de espermatogônias do tipo A de ratos foram obtidas através da adesão à aglutinina Dolichos biflorus (DBA) e fracionamento em gradiente descontínuo de Percoll111. Utilizando-se adesão à laminina, o isolamento observado de SSC foi de três a quatro vezes maiores em camundongos 90. Da mesma forma, Dirami e colaboradores114 obtiveram suspensão celular contendo entre 95% a 98% de espermatogônias do tipo A em suínos, usando velocidade de sedimentação e plaqueamento diferencial. Essas abordagens técnicas têm sido ainda utilizadas com sucesso no isolamento de espermatogônias do tipo A de peixes66,115, bovinos112,113, ovinos116, caprinos117, humanos118,119 e, mais recentemente, de búfalos120-122. Outro importante aspecto a ser considerado é a possibilidade de se cultivar e expandir a população de SSC in vitro. Assim, utilizando-se o transplante de células germinativas como ensaio funcional, após 132 dias de cultura Nagano e colaboradores123 demonstraram a sobrevivência e a propagação de espermatogônias de camundongos. Essas células germinativas foram capazes de sobreviver por quatro meses sobre feeder layer de fibroblastos embrionários (STO), utilizando-se meio enriquecido. A identificação dos fatores que modulam as funções das SSC e a possibilidade de se utilizar esses fatores na indução da proliferação dessas células em cultura têm nítidas vantagens para o enriquecimento de SSC, bem como para a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam as SSC, especialmente quando se pretende empregá-los na modificação genética dessas importantes células. Assim, em vários estudos o cultivo por longo prazo de SSC de camundongos em meio contendo fatores importantes para a regulação, manutenção e proliferação dessas células e de PGC, tais como o fator neurotrófico derivado de células da glia (glial cel lline-derived neurotrophic factor – GDNF), fator inibidor de leucemia (leucemia inhibitory factor – LIF), fator de crescimento fibroblástico básico (basic fibroblast growth factor – bFGF), fator de crescimento epidermal (epidermal growth factor – EGF) e soro fetal bovino, têm demonstrado aumento significativo no número de SSC, permitindo que mantenham suas propriedades originais de colonização e diferenciação após o transplante124-128. Ainda nesse contexto, a manutenção e expansão in vitro de presumíveis SSC têm sido estabelecidas e reportadas para outras espécies, como rato 97,129,130, bovino 131-132, búfalo 133, caprino 134,135, gato 136, suíno137, homem138-141, galo doméstico142, zebrafish 143, 144, tilápia-nilótica66 e truta-arco-íris145-147.

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28.2 HISTÓRICO DA TRANSGENIA ANIMAL A seguir, faremos um breve histórico sobre o surgimento e potenciais aplicações da técnica de transgenia. Em animais, esta importante ferramenta só foi possível a partir do sucesso na manipulação da maquinaria celular, principalmente com a finalidade de se induzir a expressão de uma sequência de interesse e da modificação genética permanente de células isoladas. Assim, com o objetivo de se modificar geneticamente as células, vários estudos que remontam à década de 1970 utilizaram o ácido ribonucleico (RNA) como sequência codificante. Em 1973, Gurdon148 relatou sucesso na tradução em proteínas do RNA mensageiro (mRNA) de hemoglobina de coelho, camundongo e pato, inseridos em ovócitos de Xenopus laevis. Posteriormente, o RNA polissomal de seres humanos (obtidos de placenta) foi injetado em ovócitos de Xenopus, obtendo-se a expressão de precursor do lactogênio placentário humano149. Em 1979, a molécula de DNA começou a ser utilizada como sequência codificante para a modificação genética de células. Assim, Wigler e colaboradores150 inseriram o gene da timidina quinase viral em células de camundongos selvagens (que não expressavam essa proteína), as quais passaram a produzir a enzima, tornando-se capazes de sobreviver em meio HAT contendo hipoxantina, aminopterina e timidina como fonte de energia. Esses mesmos autores inseriram ainda várias outras sequências de DNA que foram expressas em proteínas, como a da β-globina de coelho, o plasmídeo pBR322 e o bacteriófago oX-174. Por sua vez, Mulligan e colaboradores 151 conseguiram inserir o DNA complementar (cDNA) da β-globina de coelho no genoma viral e transferir esse genoma recombinante para células de rim de macacos em cultura, onde tais células passaram então a produzir o polipeptídeo de coelho151. A integração de sequências ao DNA genômico em células-alvo foi relatada pela primeira vez em 1979 por Breindl152 e colaboradores, que foram capazes de integrar o gene estrutural do vírus da leucemia Moloney (Moloney murine leucemia virus – MMLV) no cromossomo 6 de célula da linhagem germinativa de camundongos (BALB/Mo). Nesse estudo, evidenciou-se o potencial de modificação genética destas células para a transmissão da modificação de geração a geração 152. Já no ano seguinte, Brinster e colaboradores publicaram trabalho no qual foram utilizados ovócitos recém-fertilizados em estágio de uma célula, oriundos de camundongos, para se injetar o mRNA de globinas de rato e camundongo, obtendo-se a expressão dessas proteínas153. Ainda em 1979, Jähner e Jaenisch obtiveram três sublinhagens do camundongo BALB/Mo com integração de transgene em diferentes

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cromossomos, as quais foram capazes de transmitir a modificação genética a outras gerações154. Em 1981, Costantini e Lacy 155 publicaram trabalho destacando o papel da modificação genética de células da linhagem germinativa no desenvolvimento de animal contendo gene exógeno clonado em todas as suas células, bem como a transmissão dessa modificação genética para gerações subsequentes. Os trabalhos divulgados até então produziam animais mosaicos, com expressão das sequências de interesse em apenas algumas de suas células. Como exemplos, podem ser citados os estudos de Jaenisch e Mintz 156, que microinjetaram blastocistos explantados de camundongos com o DNA viral de vírus símio 40 (SV40) e os transferiram para o útero de fêmeas pseudográvidas156; e os de Gurdon e colaboradores, que inseriram no plasmídeo pBR322 fragmentos do genoma do herpes vírus e do SV40 e o microinjetaram em pronúcleo de ovócitos recém-fertilizados de camundongo, que foram então implantados em fêmeas pseudográvidas157. Apesar de não terem gerado animal transgênico não mosaico, Costantini e Lacy155 desenvolveram estudos pioneiros nos quais a sequência de DNA de um mamífero foi integrada ao genoma de células germinativas de outro animal, inserindo assim o gene da β-globina de coelho em células germinativas de camundongos155. Em 1982, Palmiter e colaboradores obtiveram camundongos transgênicos gerados a partir de fragmento de DNA contendo o promotor do gene da metalotioneína I de camundongos e o gene do hormônio de crescimento de ratos. Essa construção de DNA foi microinjetada em ovócitos recémfertilizados de camundongo, fazendo com que, devido ao hormônio produzido, os embriões microinjetados se desenvolvessem cerca de 30% a mais do que nos controles 158. Três anos depois, em peixes, fragmento do plasmídeo pBPVMG-6 foi microinjetado no interior de ovócitos fertilizados de goldfish (Carassius auratus). Cinquenta dias após a transfecção, os animais ainda continham a sequência injetada devido à integração desta em seu genoma 159. Além da microinjeção em ovócitos recém-fertilizados, é possível também utilizar os espermatozoides geneticamente modificados como carreadores de genes durante a fertilização in vitro 160. Alternativamente, pode-se também utilizar lipossomos catiônicos161 para a transferência de DNA em ES162 e em células somáticas reprogramadas induzidas a um estado de pluripotência (induced pluripotent stem cells – iPSCs)163. Desde então, a modificação genética para geração de animais transgênicos tem sido realizada com diversos objetivos, tais como: (i) aumentar a produção e qualidade dos alimentos; (ii) reduzir impactos ambientais das atividades agrícolas; e (iii) produzir substâncias de interesse biotecnológico.

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28.3 POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS E/OU INDUSTRIAIS Com relação às abordagens aplicadas e de interesse comercial, vários estudos já foram desenvolvidos. Através da adição de lactoferrina, α-lactoalbumina e/ou lisozima, a geração de transgênicos já foi utilizada com a finalidade de aumentar a qualidade do leite de vaca164,165 e cabra166. O leite de camundongos167 e suínos168 foi também aprimorado, tendo se observado efeitos benéficos para a prole. A produção de substâncias de interesse biotecnológico, por sua vez, motivou, por exemplo, a criação de cabras transgênicas expressando antitrombina humana, que é liberada através do leite, de comercialização aprovada pela European Medicines Agency (EMA, da União Europeia) e pela Food and Drug Administration (FDA, dos Estados Unidos) 169. Peixes também foram geneticamente modificados visando ao aumento da produção e melhoria de características para comercialização. Assim, dentre outras, características tais como aumento de crescimento 170, resistência a doenças bacterianas171 e tolerância às baixas temperaturas172 foram desenvolvidas. No que se refere à redução de impactos ambientais gerados por substâncias que contêm o íon fósforo, principalmente o fitato, um porco transgênico (Enviropig) foi desenvolvido por meio da utilização da sequência codificante da enzima fitase de Escherichia coli. Assim, a saliva desse suíno transgênico contendo a enzima fitase é capaz de degradar o fitato da dieta, evitando que essa substância polua o ambiente ao ser eliminada através das fezes 173. Em peixes, também já existem atualmente transgênicos comerciais, como, por exemplo, o GloFishTM, que expressa proteína fluorescente nas células musculares esqueléticas. Esse teleósteo, que foi originalmente desenvolvido como indicador de poluição ambiental, agora é vendido com finalidade ornamental174.

28.4 TRANSGENIA ANIMAL POR MEIO DE ESPERMATOGÔNIAS-TRONCO A modificação genética em animais é realizada utilizando-se principalmente duas técnicas, quais sejam, a microinjeção de ovócitos recém-fertilizados em estágio de célula única e o transplante de SSC geneticamente modificadas. Essas SSC podem ser oriundas de animal doador transgênico ou modificadas in vitro, principalmente por meio do uso de vetores virais. A microinjeção, que não será abordada em detalhes no presente capítulo, é

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a técnica mais utilizada e sedimentada, sendo mencionada em vários trabalhos anteriormente citados (ver Seção 28.2). No entanto, o fato de apresentar baixa eficiência, relatada desde a década de 1980 158,175, tem motivado o desenvolvimento e a busca de novas técnicas. Pelo fato de as SSC serem capazes de promover espermatogênese de forma contínua 176, a manipulação de uma única SSC propicia a obtenção de número bastante elevado de gametas geneticamente modificados, permitindo, portanto, gerar rapidamente prole transgênica de forma muito mais eficiente do que por meio de técnicas que empregam, por exemplo, ES177-179. Pois, enquanto as ES são derivadas de embriões, as SSC estão disponíveis nos testículos já na fase pós-natal. Outro aspecto a considerar é que, diferentemente de camundongos, a maioria das fêmeas de mamíferos não ovula grande número de ovócitos e podem demandar longo período de tempo para atingir a maturidade sexual. Esses aspectos limitam sobremaneira a manipulação genética de tais espécies animais. Além disso, provavelmente refletindo suas características como células-tronco mais comprometidas com a diferenciação, em contraste com o padrão observado em ES, as SSC apresentam propriedades genéticas e epigenéticas muito estáveis180,181. Ademais, particularmente devido ao fato de não estarem comprometidas com uma linhagem celular específica, as ES são facilmente capazes de se diferenciar em tipos celulares variados, podendo, assim, perder seu potencial de linhagem germinativa182. A produção de animais transgênicos através de alteração de informação genética nas SSC apresenta também como vantagens a formação de transgênicos não mosaicos e a obtenção de animais com características desejáveis sem a necessidade de vários cruzamentos. Além disso, uma vez que as células espermatogoniais são transplantadas num ambiente testicular propício para o desenvolvimento da espermatogênese, essa abordagem resulta na redução do intervalo de tempo necessário para a produção dos gametas transgênicos. Assim, existem boas razões para se considerar que, num futuro próximo, devido aos vários aspectos positivos já mencionados, provavelmente as SSC se tornarão alvo preferencial para a transgenia em muitas espécies animais para as quais ainda não existem outras tecnologias disponíveis ou mesmo bem estabelecidas. Nos próximos tópicos, descrevemos passo a passo as metodologias de produção de animais transgênicos por meio das SSC.

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28.4.1 Técnica passo a passo 1: transplante de espermatogônias-tronco isoladas de animais transgênicos Conforme já mencionado, o transplante de SSC apresenta alto potencial para ser utilizado como ferramenta para a maximização da produção de animais transgênicos. Assim, quando transplantadas para o testículo de vários receptores selvagens, espermatogônias obtidas de um único animal doador transgênico que porta uma característica genética desejável amplificam sobremaneira a capacidade de produção de gametas, resultando como consequência em maior número de fêmeas fertilizadas. Conforme ilustrado na Figura 28.3, para a realização do protocolo referente às SSC isoladas de animais transgênicos devem ser executados basicamente quatro passos: 1) Escolha dos animais doadores e receptores. 2) Obtenção das SSC do doador geneticamente modificado: 2.1) Os testículos doadores são assepticamente coletados e lavados em solução salina balanceada de Hank (HBSS) contendo 0,1% (v/v) de penicilina/estreptomicina (10.000 UI/10mg/mL), procedendo-se à remoção da túnica albugínea. 2.2) Preparação de solução de colagenase (Tipo IA) em meio de cultura de Dulbecco modificado por Eagle/meio HAM F-12 1:1 (DMEM/ F12) na concentração 2 mg/mL, na qual os túbulos seminíferos são imersos e incubados sob leve agitação por 30 minutos, adicionando-se 20 µg/mL de DNAse I para diminuir a viscosidade do meio e facilitar a dispersão das células. 2.3) Centrifugação da suspensão por 5 minutos a 100 g. O sobrenadante é descartado, e o pellet, ressuspendido em solução de tripsina e ácido etilenodiamino tetracético (ethylene diamine tetraacetic acid – EDTA) a 0,25%. Após 30 minutos sob leve agitação, a ação da tripsina é interrompida pela adição de 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB). A DNase I (20 µg/mL) é novamente adicionada à suspensão celular, facilitando assim o processo de filtragem de tal suspensão, feita em filtro (Sigma) com poros de aproximadamente 60 µm. 2.4) O filtrado assim obtido é novamente centrifugado por 10 minutos a 100 g e ressuspendido em DMEM/F12 suplementado com 0,75% (p/v) de albumina do soro bovino (bovine serum albumin – BSA). 2.5) As SSC podem ser enriquecidas através de centrifugação em gradiente de Percoll. Assim, a partir da solução de Percoll 100%,

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utilizando-se DMEM/F12-BSA, diferentes concentrações são preparadas para a montagem do gradiente a ser utilizado. Finalmente, a suspensão de células é depositada no topo da coluna de gradiente de Percoll, e centrifugada. Das bandas celulares formadas após a centrifugação, aquelas apresentando maior concentração de espermatogônias são selecionadas. 2.6) As células selecionadas são colocadas em meio DMEM/F12 suplementado (10% de SFB) e cultivadas por 12 horas. Durante esse período, as eventuais células somáticas vão se aderir à placa de cultura, enquanto as células germinativas permanecem suspensas no sobrenadante, ou mesmo fracamente aderidas às células somáticas. 2.7) Após esse período, o sobrenadante contendo as células livres é coletado e as espermatogônias aderidas às células somáticas são desprendidas utilizando-se solução de Tripsina-EDTA 0,25% em solução salina tamponada com fosfato (phosphate buffered saline – PBS) de Dulbecco sem cálcio e magnésio (DPBS), na diluição de 1:10. As espermatogônias selecionadas são ressuspendidas em DMEM/F12BSA (0,75%) e mantidas no gelo até serem transplantadas. 3) Transplante das SSC geneticamente modificadas para os testículos dos animais receptores sem espermatogênese endógena: 3.1) No momento do transplante, é adicionado à suspensão celular volume igual de solução de azul de tripan a 0,4% em PBS, de modo que a suspensão a ser injetada se torna visível. 3.2) Os animais receptores são anestesiados, ambos os testículos são expostos e a túnica albugínea próxima à rede testicular é levemente seccionada. Com auxílio de microscópio estereoscópico, utilizandose micropipeta de vidro (diâmetro externo de 50 µm), a suspensão celular pode ser microinjetada, através da rede testicular, nos dúctulos eferentes ou diretamente nos túbulos seminíferos dos testículos receptores*. 3.3) Após o transplante, o sucesso da microinjeção pode ser confirmado através da observação da visualização do azul de tripan nos túbulos seminíferos receptores. 4) Cruzamento entre machos receptores e fêmeas selvagens**.

* Para maiores detalhes deste passo a passo, ver trabalhos de Tang e colaboradores183. ** Em caso de transplante interespecífico (xenogênico), procede-se à obtenção de espermatozoides do animal doador e à fertilização in vitro de ovócitos de fêmeas da mesma espécie do animal doador.

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Figura 28.3 Transgenia a partir de doador com SSC geneticamente modificada. (1) Testículos de macho doador que porta um transgene em suas células germinativas são enzimaticamente digeridos para se obter a suspensão celular da qual as SSC são isoladas (2). (3) Estas células são posteriormente microinjetadas nos túbulos seminíferos de machos receptores sem espermatogênese endógena (inférteis). (4) Após o acasalamento dos machos receptores com fêmeas do tipo selvagem, indivíduos transgênicos, apresentando o haplótipo do doador, podem ser produzidos na progênie.

28.4.1.1 Estudos em roedores Estudos desenvolvidos por Brinster e colaboradores 11,12 , utilizando camundongos, foram os primeiros a demonstrar que o transplante de células germinativas modificadas poderia levar à produção de gametas transgênicos. Nesses estudos, foram utilizados espermatogônias de camundongos geneticamente modificados [ZFlacZ, TgN(cl771acZ)226Bri e TgN(cl77lacZ)227Bri] que continham em suas células o gene repórter LacZ codificando a enzima ß-galactosidase da bactéria Escherichia coli. Essas células transgênicas foram transplantadas para o testículo de camundongos w/w (inférteis) e para camundongos híbridos resultantes do cruzamento das linhagens C57BL/6 e SJL, que tiveram sua espermatogênese endógena previamente depletada por meio do quimioterápico busulfan. Como a enzima ß-galactosidase age sobre substrato incolor, conhecido como 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-galactopiranosídeo (X-Gal), que é convertido em corante azul, foi possível avaliar o sucesso do transplante espermatogonial em camundongos. Assim, com tal abordagem, espermátides e espermatozoides corados em azul no testículo do animal receptor foram identificados, permitindo inclusive a

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geração de prole com característica genética do animal doador (contendo o gene repórter LacZ). Posteriormente, outros dois estudos do mesmo grupo de pesquisa foram desenvolvidos, utilizando-se também camundongos contendo o gene repórter LacZ. Nesses estudos, foram avaliadas tanto a determinação da melhor via para o transplante (túbulos seminíferos, rete testis e dúctulos eferentes184) quanto o número ideal de células germinativas a serem transplantadas para se aumentar a eficiência do transplante185. Como o transplante intraespecífico (singênico) de espermatogônias havia sido realizado com sucesso em camundongos, Clouthier e colaboradores 186 investigaram se o testículo de camundongo era capaz de propiciar o desenvolvimento da espermatogênese de ratos e gerar espermatozoides. Nessas investigações, ratos transgênicos MT-LacZ foram usados como doadores de espermatogônias, enquanto camundongos híbridos F1 (C57BL/6 x SJLF) imunodeficientes foram utilizados como animais receptores. Após o transplante das células germinativas, os testículos foram incubados em solução de X-gal para a coloração e visualização de células doadoras expressando β-galactosidase, ficando demonstrada a progressão completa da espermatogênese de rato nos testículos de camundongos, bem como a formação espermatozoides com morfologia normal. Mais recentemente, foi mostrado que esses gametas eram férteis187. A partir da demonstração de que o ambiente testicular de camundongos era capaz de propiciar o desenvolvimento da espermatogênese de ratos188,189, foi investigado se o procedimento inverso seria viável. Dessa forma, células germinativas de camundongos ZFlacZ contendo o gene repórter LacZ foram transplantadas em ratos previamente tratados com busulfan, enquanto ratos Sprague-Dawley MTlacZ que carreavam o gene repórter LacZ foram utilizados como doadores controle190. Após o transplante da suspensão de células germinativas via túbulos seminíferos, o sucesso da técnica foi avaliado através de incubação dos testículos em solução de X-gal para a coloração e visualização de células doadoras carreando lacZ. Assim, ficou demonstrado, a partir do uso de animais transgênicos, que o testículo de ratos foi capaz de propiciar o desenvolvimento da espermatogênese de camundongos.

28.4.1.2 Estudos em animais de produção Até o presente momento, com o objetivo de se desenvolver uma proteína específica de interesse, apenas um estudo envolvendo doador de células germinativas transgênicas foi realizado em animais domésticos. Nessa

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investigação, SSC de caprino expressando a proteína humana antitripsina alfa 1 foram transplantadas no testículo de caprinos sexualmente imaturos191. Após esses caprinos terem atingido a puberdade, a presença de espermatozoides transgênicos foi detectada e o cruzamento destes com cabras selvagens resultou na produção de prole transgênica, capaz de expressar a antitripsina humana alfa 1.

28.4.1.3 Estudos em peixes À semelhança de mamíferos, embora uma década mais tarde, a técnica de transplante de SSC ou de PGC em peixes tem sido realizada com sucesso em diversas espécies 19,192-195. Existem descritas na literatura três metodologias para se realizar o transplante de células germinativas em peixes, nas quais o transplante é realizado utilizando-se como receptores o embrião, a larva e peixes adultos (para maiores detalhes ver Lacerda e colaboradores66). No entanto, os transplantes com resultados mais completos descritos até o presente momento, usando peixes doadores transgênicos, envolveram larvas recém-eclodidas como animais receptores, podendo ser citados estudos utilizando trutas vasa-GFP (do inglês, green fluorescent protein, proteína fluorescente verde). Nas investigações com trutas vasa-GFP transgênicas, pôde-se observar o sucesso do transplante intraespecífico utilizando-se células a fresco192 e criopreservadas24. Trutas-GFP também foram utilizadas com sucesso em transplantes interespecíficos, tendo como espécie receptora salmão selvagem 193 e triploide 194. O estudo envolvendo a truta-GFP teve ainda como finalidade investigar o sucesso do transplante intraespecífico, utilizando-se fêmeas e machos como receptores196. Nessa investigação, uma vez que as espermatogônias transplantadas foram capazes de se diferenciar tanto em espermatozoides quanto em ovócitos, alta plasticidade sexual das espermatogônias foi observada. Ainda, pelo fato das espermatogônias transgênicas de peixes resultarem na produção de prole 100% transgênica, esses resultados são revestidos de grande importância196.

28.4.2 Passo a passo 2: transplante de espermatogônicas-tronco modificadas in vitro Pelo fato de as SSC poderem ser geneticamente manipuladas in vitro após seu isolamento antes de serem transplantadas no testículo receptor,

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conforme já abordado, essas células apresentam alto potencial para a geração de gametas e animais transgênicos. Seis importantes passos (Figura 28.4) são necessários para a execução do protocolo referente à modificação genética das SSC in vitro: 1) Escolha dos animais doador e receptor. 2) Obtenção (isolamento) das SSC do doador. 3) Obtenção da sequência gênica de interesse para a inserção no genoma das SSC. 4) Modificação genética das SSC, que pode ser realizada utilizando-se, por exemplo, vetor viral*. 5) Transplante das SSC modificadas para os testículos do animal receptor. 6) Cruzamento entre animal receptor e fêmea selvagem**.

Figura 28.4 Transgenia por meio de SSC de doador não transgênico modificadas in vitro. (1) Testículos de machos doadores selvagens são enzimaticamente digeridos para se obter suspensão celular da qual as SSC são isoladas (2). Essas células são mantidas in vitro e submetidas a modificação genética (inserção ou deleção de sequências específicas), principalmente através do uso de vetores virais (3 e 4). Após seleção, as SSC geneticamente modificadas são microinjetadas nos túbulos seminíferos de machos receptores sem espermatogênese endógena (inférteis) (5). Mediante o acasalamento dos machos receptores com fêmeas do tipo selvagem, indivíduos transgênicos podem ser produzidos na progênie (6).

* Para maiores detalhes de passo a passo, ver trabalhos de Dann e colaboradores197. ** Em caso de transplante inter-específico (xenogênico), procede-se a obtenção de espermatozoides do animal doador e a fertilização in vitro de ovócitos de fêmeas da mesma espécie do animal doador.

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A introdução do DNA exógeno em SSC cultivadas por meio de métodos de transfecção convencionais tem-se mostrado um procedimento bastante complexo18,197. Apesar disso, vários estudos têm sido realizados com a finalidade de se utilizar vetores virais para a transdução gênica em SSC e, em alguns destes estudos, sucesso na produção de animais transgênicos tem sido observado. Nos tópicos listados a seguir, abordaremos os vetores virais mais utilizados até o presente momento.

28.4.2.1 Retrovírus O primeiro relato de sucesso envolvendo a manipulação genética de SSC foi realizado através da transdução in vitro por retrovírus em células testiculares de camundongos imaturos ou criptorquídicos 198. Nesse estudo, demonstrou-se que a entrega (delivery) gênica em SSC mediada por retrovírus resultou em integração estável e expressão do transgene lacZ em até 20% das células. Após o transplante das SSC transduzidas, aproximadamente 5% da progênie derivada dos machos receptores eram animais transgênicos, que foram capazes ainda de transmitir o transgene para as gerações subsequentes. Em estudos posteriores, Orwig e colaboradores33 relataram que SSC de ratos também eram suscetíveis à transdução por vetor retroviral, carreando o transgene repórter lacZ. Embora a produção de ratos transgênicos não tenha sido demonstrada, 0,5% das SSC originalmente cultivadas puderam ser transduzidas e, após o transplante xenogênico (rato para camundongo), foram capazes de gerar colônias de células espermatogênicas transgênicas nos testículos de camundongos. A infecção e transdução espermatogonial utilizando vetor retroviral também foi demostrada em galos domésticos 199. Células testiculares isoladas de galos adultos cultivadas por curto período foram expostas a partículas virais recombinantes carreando o gene gfp. Após o transplante nos testículos de galos receptores estéreis, as SSC transfectadas com retrovírus foram capazes de restaurar a espermatogênese exógena em cerca de dois meses, apresentando eficiência de colonização e desenvolvimento da espermatogênese semelhante àquela apresentada por SSC não transfectadas. Assim, a transdução do gene repórter que codifica a GFP foi detectada em espermatozoides presentes nos testículos de galos receptores, sugerindo que a aplicação dessas técnicas também pode ser útil no desenvolvimento de modelos de galináceos transgênicos199.

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Pelo fato de os retrovírus requererem divisão celular ativa para a inserção do DNA pró-viral no genoma da célula hospedeira, esses vetores podem apresentar restrições quanto à sua aplicação em SSC, particularmente quando se considera que em determinados sistemas de cultura in vitro essas células podem se dividir muito lentamente125,200,201.

28.4.2.2 Lentivírus O lentivírus pertence a uma subclasse de retrovírus que exibe a habilidade única de se replicar em células que não estejam em divisão202,203. Portanto, esse vírus exibe maior eficiência para transferência gênica, apresentando-se como potencial vetor para a modificação do genoma de células de divisão lenta tais como as SSC. A viabilidade de vetores lentivirais em transduzir SSC de camundongos foi evidenciada inicialmente através da inserção do transgene repórter lacZ nessas células204. De modo semelhante, utilizando-se vetor lentiviral as SSC de ratos foram transduzidas in vitro com o transgene egfp, sendo posteriormente transplantadas nos testículos de ratos receptores que tiveram sua espermatogênese endógena depletada. O cruzamento desses ratos com fêmeas selvagens resultou em cerca de 5% a 30% de progênie transgênica carreando o egfp que, ao ser integrado de maneira estável e aleatoriamente ao genoma de F1, foi repassado à geração subsequente32,205. Ainda nessa vertente, a produção de ratos transgênicos através de transdução lentiviral associada ao transplante xenogênico de SSC foi demonstrada com sucesso 18. Nesse estudo, considerando que o procedimento de transplante de espermatogônias nos testículos de ratos é menos eficiente do que em camundongos e que a preparação dos ratos receptores é também mais difícil190, após serem transduzidas com o transgene egfp as SSC de ratos foram microinjetadas em testículos de camundongos imunodeficientes 18. Assim, nesse ambiente imunologicamente deprimido, as SSC de ratos geraram espermatozoides EGFP-positivos, que foram utilizados para a produção de ratos transgênicos através de fertilização in vitro, empregando-se injeção intracitoplasmática. Portanto, o transgene desses animais foi transmitido de maneira estável à geração subsequente18. Recentemente, a técnica de modificação genética de SSC por vetores virais visando à produção de animais transgênicos foi estendida para outras espécies de mamíferos não roedores. Assim, Harkey e colaboradores 206 exploraram o potencial do transplante de SSC em cães como ferramenta para se

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produzir importantes modelos transgênicos caninos para ensaios pré-clínicos de doenças genéticas humanas. Em tais estudos, com a finalidade de se testar a eficiência da transferência de genes por lentivírus, células testiculares isoladas de cães pré-púberes foram transduzidas in vitro com vetores lentivirais carreando os genes repórter gfp ou mCherry. Baseada na expressão da GFP, a eficiência de transdução encontrada nas células germinativas foi de aproximadamente 9%. No entanto, embora a produção de cães transgênicos não tenha sido demonstrada, quatro meses após o transplante as SSC geneticamente modificadas foram capazes de se desenvolver e gerar espermatozoides transgênicos GFP-positivos, nos testículos de dois dos seis cães receptores206. Devido às suas semelhanças com os seres humanos, tanto nos aspectos fisiológicos quanto patológicos, os suínos representam importantes modelos experimentais de animais de grande porte que comumente são utilizados em processos de transgenia 207. Entretanto, a produção de suínos transgênicos através de transferência nuclear de célula somática é ainda ineficaz, demorada e de alto custo econômico208,209. Nesse contexto, e visando contrapor essas dificuldades na produção de suínos transgênicos, a modificação genética e o transplante de SSC de suínos foram relatados recentemente 210. Assim, com a finalidade de se produzir gametas transgênicos através do transplante de células germinativas, esses estudos investigaram a aplicação de vetores lentivirais na entrega do transgene egfp às SSC de suíno, e foi observado que as células germinativas de suínos foram transduzidas in vitro de maneira eficaz, resultando, após o transplante, na produção de espermatozoides transgênicos GFP-positivos nos testículos de dois dos cinco animais receptores. Além disso, através da fertilização in vitro de ovócitos (FIV) de fêmeas selvagens dessa espécie, utilizando o sêmen desses dois animais receptores, foi observado que 8% a 26% dos embriões de suínos produzidos pela FIV carreavam o transgene egfp. Portanto, esse estudo pioneiro permitiu evidenciar que também em animais de grande porte a transdução de SSC mediada por lentivírus é capaz de resultar na transmissão do transgene.

28.4.2.3 Vírus adeno-associado Nos últimos cinco anos, o grupo de pesquisa canadense liderado pela pesquisadora Ina Dobrisnki210,211 tem investigado a eficiência da exposição de células germinativas de mamíferos ao vírus adeno-associado (AAV), que é um vetor de terapia gênica. Nessas investigações, as principais questões a

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serem respondidas diziam respeito à estabilidade da transdução com vetor AAV e à ocorrência da transmissão de transgene para a progênie. Inicialmente, pelo fato de o transplante de células germinativas já estar bem estabelecido em camundongos, foi esta a espécie utilizada como modelo para se investigar a viabilidade da transdução de SSC mediada por AAV, bem como a ocorrência da transmissão estável do transgene após o transplante das células geneticamente modificadas 211. Assim, nesse estudo foram testadas a transfecção in situ, na qual vetores AVV foram microinjetados no interior dos túbulos seminíferos, e a transfecção in vitro de SSC, que foi seguida do transplante de células germinativas. Os resultados encontrados mostraram que a introdução direta do vetor viral nos túbulos seminíferos de camundongos não levou à transdução eficiente de células germinativas, sendo o vetor observado quase exclusivamente em células de Sertoli, que carreavam assim o transgene egfp211. Por outro lado, na transfecção in vitro seguida do transplante de SSC foi possível observar extensa colonização por células germinativas que expressavam a proteína verde fluorescente melhorada (enhanced green fluorescent protein – EGFP) nos testículos receptores. Vários meses após o transplante, o acasalamento de camundongos machos receptores com fêmeas selvagens resultou em 10% (26 em 260) de filhotes portando o transgene egfp, o que foi comprovado através da genotipagem por reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction – PCR)211. Em outros estudos, com a finalidade de se verificar a possibilidade de produção eficiente de proteínas biofarmacêuticas recombinantes no leite de animais transgênicos, Honaramooz e colaboradores 211 utilizaram células germinativas isoladas de caprinos pré-púberes e as expuseram a vetores AAV carreando o gene repórter egfp. Essas células foram transplantadas para o testículo de caprinos pré-púberes que tiveram a espermatogênese endógena suprimida por irradiação testicular. Após atingirem a maturidade sexual, o sêmen de três caprinos transplantados foi coletado e analisado por PCR para se detectar a presença do transgene nos gametas. Assim, observouse que espermatozoides carreando o transgene gfp foram detectados em 37% dos ejaculados recolhidos ao longo de um período de dezoito meses. O sêmen desses caprinos foi utilizado para a fertilização in vitro de ovócitos de cabras selvagens, e a transmissão do transgene foi monitorizada pela análise de PCR dos embriões gerados. Aproximadamente 10% dos embriões produzidos carreavam o transgene gfp211. Com a finalidade de se maximizar a produção de suínos transgênicos, Zeng e colaboradores210 avaliaram a possibilidade de transfecção das células germinativas de suínos in vitro empregando o AAV como vetor viral. Nesse

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estudo, foi demonstrado que o uso de AAV em células germinativas resultou em modificação genética das SSC e que estas foram capazes de colonizar o testículo de dezessete suínos receptores. A coleta de sêmen foi feita de cinco a sete meses após o transplante, quando os suínos receptores já estavam sexualmente maduros. Após as coletas, o DNA genômico dos espermatozoides foi extraído e analisado por PCR para a detecção do gene repórter egfp. A presença de espermatozoides transgênicos foi detectada em dez suínos receptores e aproximadamente 30% dos ejaculados apresentavam espermatozoides carreando o transgene egfp. O sêmen coletado de dois animais receptores foi utilizado para a fertilização in vitro de ovócitos de fêmeas suínas selvagens, e o transgene foi observado em aproximadamente 17% dos embriões produzidos. Dessa forma, foi assim observado que a transdução de SSC mediada por AAV é capaz de resultar na transmissão do transgene de maneira eficiente, tanto em animais de laboratório quanto em animais domésticos.

28.4.2.4 Nucleofecção Apesar de diversos estudos terem demonstrado que vetores virais são adequados para a transdução das SSC, cuidados com a biossegurança têm motivado pesquisas envolvendo o desenvolvimento de métodos alternativos (não virais) de entrega do gene. Nesse cenário, foi desenvolvida a nucleofecção, um método de transfecção espermatogonial à base de eletroporação que utiliza combinação de pulsos elétricos e reagentes que facilitam a entrega do transgene. Ficou constatado que, a partir da utilização dessa metodologia, é possível entregar, com alta eficiência, grandes fragmentos de DNA diretamente no núcleo das células que apresentam baixo índice mitótico212-214. Em recente estudo desenvolvido por Zeng e colaboradores215, essa metodologia foi utilizada para se introduzir transgene humano em suspensão celular de caprinos enriquecida com espermatogônias (UCH-L1-positivas). Pelo fato da produção de determinadas proteínas no leite de cabras transgênicas ter grande impacto comercial, o gene de interesse foi o hormônio de crescimento humano (hGH) associado ao gene repórter gfp. Após a nucleofecção, as células transfectadas foram transplantadas para o testículo de caprinos receptores e, nove meses após o transplante, ejaculados dos animais receptores foram coletados para avaliação do DNA genômico dos espermatozoides, através da técnica de PCR. Os resultados encontrados mostraram que o construto contendo o transgene hGH estava presente em aproximadamente 30% dos ejaculados. No entanto, apesar dos espermatozoides não

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terem sido utilizados para a fertilização in vitro, pelo fato de ter se mantido íntegro ao longo da espermatogênese, aparentemente o transgene foi integrado ao DNA do caprino de maneira estável.

28.5 CONCLUSÕES Embora até o presente momento a produção de animais transgênicos tenha utilizado principalmente as ES, para a maioria das espécies (mamíferos não roedores) essa tecnologia não está disponível ou é até mesmo pouco eficiente. Diante dessas limitações, as SSC têm se apresentado como interessante alternativa para a transgenia, particularmente pelo fato de a manipulação genética prévia ou in vitro de uma única SSC, seguida do transplante, propiciar a obtenção de número bastante elevado de gametas que carreiam o genoma modificado para as gerações subsequentes. Os métodos usualmente utilizados para modificar as SSC in vitro são baseados em vetores virais, com destaque para os lentivírus, que são capazes de transduzir com maior eficiência células que apresentam divisão lenta, a exemplo das SSC. No entanto, por questões de biossegurança, a nucleofecção surgiu como método alternativo (não viral), permitindo entregar, com alta eficiência, grandes fragmentos de DNA diretamente no núcleo das SSC. Em síntese, embora outras biotecnologias estejam disponíveis, em associação com a técnica de transplante de células germinativas, a utilização de SSC geneticamente modificadas representa uma abordagem com excelente potencial para a produção de animais transgênicos, particularmente quando são consideradas outras espécies de vertebrados que não mamíferos roedores.

28.6 PERSPECTIVAS FUTURAS Pelo fato de a eficiência atual de transfecção das SSC não ser muito alta, a busca por metodologias que otimizem a transfecção celular constitui uma importante barreira a ser ainda superada. Portanto, outras metodologias mais eficientes de transfecção de SSC são necessárias e, dentre aquelas potencialmente relevantes, pode ser citada a nanobiotecnologia, que já se encontra disponível. O xenoenxerto de suspensões de células testiculares contendo SSC previamente modificadas se apresenta como técnica alternativa com alto potencial para a produção de animais transgênicos. Essa importante biotecnologia,

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que foi desenvolvida em 2007 por Honaramooz e colaboradores216, consiste na obtenção de suspensões de células testiculares que são enxertadas (transplantadas) na região subcutânea do dorso de camundongos imunodeficientes, onde a formação de novo do testículo é observada, com a produção de espermatozoides férteis de várias espécies já investigadas217,218. Numa outra vertente, embora não totalmente inserida no escopo do presente capítulo, vale a pena mencionar que a transdiferenciação das SSC através de engenharia tecidual se apresenta como uma abordagem em potencial para a produção de tecidos ou órgãos transgênicos219,220, os quais, por exemplo, podem ser transplantados para indivíduos imunologicamente compatíveis. Conforme mencionado ao longo do presente capítulo, existem diversas possibilidades para se produzir animais transgênicos a partir da modificação das SSC. Certamente, a utilização das tecnologias desenvolvidas com essas metodologias trará inúmeros benefícios para a sociedade moderna, como, por exemplo, a geração de animais apresentando maior resistência a doenças, maior ganho de peso ou mesmo daqueles que minoram a poluição ambiental decorrente dos sistemas de criação, possibilitando, assim, a produção de alimentos ecologicamente sustentáveis.

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

173. Golovan SP; Meidinger RG; Ajakaiye A; et al. Pigs expressing salivary phytase produce low phosphorus manure. Nature Biotechnology. 2001;19:741-745. 174. Gong Z; Wan H; Tay TL, et al. Development of transgenic fish for ornamental and bioreactor by strong expression of fluorescent proteins in the skeletal muscle. Biochemical Biophysical Research Communications. 2003;58-63. 175. Dunham RA; Eash J; Askins J; Townes TM. Transfer of the metallothioneinhuman growth hormone fusion gene into channel catfish. Transactions of the American Fisheries Society. 1987;116:87-91. 176. Rooij DG. Regulation of spermatogonial stem cell behavior in vivo and in vitro. Anim Reprod. 2006;3:130-134. 177. Denning C; Priddle H. New frontiers in gene targeting and cloning: success, app. and challenges in d. a. and h. embryonic s. cells. Repr. 2003;126:1-11. 178. Olive V; Cuzin F. The spermatogonial stem cell: from basic knowledge to transgenic technology. Int J Biochem Cell Biol. 2005;37:246-250. 179. Kanatsu-Shinohara M; Shinohara T. Spermatogonial stem cell self-renewal and development. Annu Rev Cell Dev Biol. 2013;29:163-187. 180. Kanatsu-Shinohara M; Shinohara T. Germline modification using mouse spermatogonial stem cells. Methods Enzymol. 2010;477:17-36. 181. Lee J; Shinohara T. Epigenetic modifications and self-renewal regulation of mouse germline stem cells. Cell Res. 2011;21:1164-1171. 182. Kanatsu-Shinohara M; Mori Y; Shinohara T. Enrichment of mouse spermatogonial stem cells based on aldehyde dehydrogenase activity. Biol Reprod. 2013;89:140. 183. Tang L; Rodriguez-Sosa JR; Dobrinski I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in mice. J Vis Exp. 2012;60. 184. Ogawa T; Aréchaga JM; Avarbock MR; Brinster RL. Transplantation of testis germinal cells into mouse seminiferous tubules. Int J Dev Biol. 1997;41:111-122. 185. Dobrinski I; Ogawa T; Avarbock MR; Brinster RL. Computer assisted image analysis to assess colonization of recipient seminiferous tubules by spermatogonial stem cells from transgenic donor mice. Mol Reprod Dev. 1999;53:142-148. 186. Clouthier DE; Avarbock MR; Maika SD; et al. Rat spermatogenesis in mouse testis. Nature. 1996, 381:418-421. 187. Shinohara T; Kato M; Takehashi M; et al. Rats produced by interspecies spermatogonial transplantation in mice and in vitro microinsemination. PNAS. 2006;103:13624-13628. 188. Russell LD; Brinster RL. Ultrastructural observations of spermatogenesis following transplantation of rat testis cells into mouse seminiferous tubules. J Androl. 1996;17:615-627. 189. França LR; Ogawa T; Avarbock MR; et al. Germ cell genotype controls cell cycle during spermatogenesis in the rat. Biol Reprod. 1998;59:1371-1377.

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190. Ogawa T; Dobrinski I; Brinster RL. Recipient preparation is critical for spermatogonial transplantation in the rat. Tissue Cell. 1999;31:461-472. 191. Honaramooz A; Behboodi E; Blash S; et al. Germ cell transplantation in goats. Mol Reprod Dev. 2003;64:422-428. 192. Takeuchi Y; Yoshizaki G; Takeuchi T. Generation of live fry from intraperitoneally transplanted primordial germ cells in rainbow trout. Biol Reprod. 2003;69:1142-1149. 193. Takeuchi Y; Yoshizaki G; Takeuchi T. Surrogate broodstock produces salmonids. Nature. 2004;430:629-630. 194. Okutsu T; Shikina S; Kanno M; et al. Production of trout offspring from triploid salmon parents. Science. 2007;317:1517. 195. Yoshizaki G; Okutsu T; Morita T; et al. Biological characteristics of fish germ cells and their application to developmental biotechnology. Reprod Domest Anim. 2012;47 Suppl 4:187-192. 196. Okutsu T; Suzuki K, Takeuchi Y; et al. Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. PNAS. 2006;103:2725-2729. 197. Dann CT. Transgenic modification of spermatogonial stem cells using lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 2013;927:503-518. 198 Nagano M; McCarrey JR; Brinster RL. Primate spermatogonial stem cells colonize mouse testes. Biol Reprod. 2001;64:1409-1416. 199. Kalina J; Senigl F; Micáková A; et al. Retrovirus-mediated in vitro gene transfer into chicken male germ line cells. Reproduction. 2007;134:445-453. 200. Hamra FK; Chapman KM; Nguyen DM; et al. Self renewal, expansion, and transfection of rat spermatogonial stem cells in culture. Proc Natl Acad Sci. 2005;102:17430-17435. 201. Ryu BY; Kubota H; Avarbock MR; Brinster RL. Conservation of spermatogonial stem cell self-renewal signaling between mouse and rat. Proc Natl Acad Sci. 2005;102:14302-14307. 202. Bukrinsky MI; Haggerty S; Dempsey MP; et al. A nuclear localization signal within HIV-1 matrix protein that governs infection of non-dividing cells. Nature. 1993;365:666-669. 203. Verma IM; Somia N. Gene therapy – promises, problems and prospects. Nature. 1997;389:239-242. 204. Nagano M; Patrizio P; Brinster RL. Long-term survival of human spermatogonial stem cells in mouse testes. Fertil Steril. 2002;78:1225-1233. 205. Ryu BY; Orwig KE; Oatley JM; et al. Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells. J Androl. 2007;28:353-360.

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206. Harkey MA; Asano A; Zoulas ME; et al. Isolation, genetic manipulation, and transplantation of canine spermatogonial stem cells: progress toward transgenesis through the male germ-line. Reproduction. 2013;146:75-90. 207. Whyte JJ; Prather RS. Genetic modifications of pigs for medicine and agriculture. Mol Reprod Dev. 2011;78:879-891. 208. Bacci ML. A brief overview of transgenic farm animals. Vet Res Commun. 2007;31 Suppl 1:9-14. 209. Dinnyes A; Tian XC; Yang X. Epigenetic regulation of foetal development in nuclear transfer animal models. Reprod Domest Anim. 2008;43 Suppl 2:302-329. 210. Zeng W; Tang L; Bondareva A; et al. Viral transduction of male germline stem cells results in transgene transmission after germ cell transplantation in pigs. Biol Reprod. 2013;88:27. 211. Honaramooz A; Cui XS; Kim NH; Dobrinski I. Porcine embryos produced after intracytoplasmic sperm injection using xenogeneic pig sperm from neonatal testis tissue grafted in mice. Reprod Fertil Dev. 2008;20:802-807. 212. Lorenz P, Harnack U, Morgenstern R: Efficient gene transfer into murine embryonic stem cells by nucleofection. Biotechnol Lett. 2004;26:1589-1592. 213. Trompeter HI; Weinhold S; Thiel C; et al. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J Immunol Methods. 2003;274:245-256. 214. Zeitelhofer M; Vessey JP; Xie Y; et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat Protoc. 2007;2:1692-1704. 215. Zeng W; Tang L; Bondareva A; et al. Non-viral transfection of goat germline stem cells by nucleofection results in production of transgenic sperm after germ cell transplantation. Mol Reprod Dev. 2012;79:255-261. 216. Honaramooz A; Megee SO; Rathi R; Dobrinski I. Building a testis: formation of functional testis tissue after transplantation of isolated porcine (Sus scrofa) testis cells. Biol Reprod. 2007;76:43-47. 217. Rodriguez-Sosa JR; Dobrinski I. Recent developments in testis tissue xenografting. Reproduction. 2009;138:187-194. 218. Campos-Junior PH; Costa GM; Avelar GF; et al. Derivation of sperm from xenografted testis cells and tissues of the peccary (Tayassu tajacu). Reproduction. 2014;147:291-299. 219. Simon L; Ekman GC; Kostereva N; et al. Direct transdifferentiation of stem/progenitor spermatogonia into reproductive and nonreproductive tissues of all germ layers. Stem Cells. 2009;27:1666-1675. 220. Caires K; Broady J; McLean D. Maintaining the male germline: regulation of spermatogonial stem cells. J Endocrinol. 2010;205:133-145.

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AUTORES ALEXANDRE HIROAKI KIHARA Professor adjunto e coordenador do Laboratório de Neurociência, Universidade Federal do ABC, Centro de Matemática, Computação e Cognição.

ALINE MARIA DA SILVA Professora titular do Departamento de Bioquímica, Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP).

ANA MARIA FRAGA Pesquisadora do Laboratório Nacional de Células-Tronco Embrionárias (LaNCE) e Pesquisadora do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia Celular (INCTC), Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Technical Application Specialist na Life Technologies e doutora pelo Departamento de Genética e Biologia Evolutiva (IB-USP).

ANA MARIA MORO Diretora do Laboratório de Biofármacos em Células Animais do Instituto Butantan (São Paulo, SP). Professora colaboradora da Universidade de São Paulo (USP).

ANDERSON KENEDY SANTOS Doutorando do Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia, Departamento de Bioquímica e Imunologia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG, Belo Horizonte, MG).

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ANDRÉA QUEIROZ MARANHÃO Professora do Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília (UnB).

ANGELA ALICE AMADEU Pesquisadora doutora do Laboratório de Imunoquímica do Instituto Butantan (São Paulo, SP).

BERGMANN MORAIS RIBEIRO Professor titular do Departamento de Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB).

BRUNA RAPHAELA SOUSA Mestre pelo Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG, Belo Horizonte, MG). Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia.

BRYAN ERIC STRAUSS Professor doutor do Laboratório de Vetores Virais, Centro de Investigação Translacional em Oncologia/LIM 24, Instituto do Câncer do Estado de São Paulo, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FM-USP).

CARLA COLUMBANO DE OLIVEIRA Professora associada do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP).

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Autores

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CAROLINE RIZZI Pós-doutoranda do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTec) da Universidade Federal de Pelotas (UFPel, Pelotas, RS). Laboratório de Vacinologia, CDTec, UFPel.

CIBELE NUNES PERONI Professora doutora do Laboratório de Hormônios Hipofisários, Centro de Biotecnologia do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN-CNEN, São Paulo, SP).

CLÁUDIA REGINA CECCHI Pós-doutoranda do Laboratório de Hormônios Hipofisários, Centro de Biotecnologia do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN-CNEN, São Paulo, SP).

DANIEL MENDES PEREIRA ARDISSON-ARAÚJO Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Departamento de Biologia Celular do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB).

DANIELA BERTOLINI ZANATTA Pesquisadora do Laboratório de Vetores Virais, Centro de Investigação Translacional em Oncologia/LIM 24, Instituto do Câncer do Estado de São Paulo, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FM-USP).

DANIELA CARVALHO GONZALEZ-KRISTELLER Professora adjunta do Departamento de Ciências Biológicas, Setor de Biologia Celular e Molecular da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).

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DIEGO GRANDO MÓDOLO Pesquisador do Laboratório de Genoma Funcional, Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

DIMAS TADEU COVAS Professor doutor do Hemocentro de Ribeirão Preto, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (USP). Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP.

CLEITON FAGUNDES MACHADO Pesquisador pós-doutorando do Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP).

OLIVEIRO CAETANO DE FREITAS NETO Pesquisador do Laboratório de Ornitopatologia, Departamento de Patologia Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista (Unesp).

JACQUELINE BOLDRIN DE PAIVA Pesquisadora do Laboratório de Biologia Molecular Bacteriana, Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

EDSON JÚNIOR DO CARMO Aluno de doutorado do Programa Multi-Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBIOTEC). Centro de Apoio Multidisciplinar, Divisão de Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas (Ufam).

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Autores

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ELIZA HIGUTI Doutoranda do Laboratório de Hormônios Hipofisários, Centro de Biotecnologia do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN-CNEN, São Paulo, SP).

EMERSON ALBERTO DA FONSECA Mestre pelo Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG, Belo Horizonte, MG). Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia.

EUGENIA COSTANZI-STRAUSS Pesquisadora do Laboratório de Terapia Gênica, Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP).

FÁBIA DA SILVA PEREIRA CRUZ Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, Faculdade de Saúde da Universidade de Brasília (UnB).

FABIANA KÖMMLING SEIXAS Professor do curso de graduação em Biotecnologia e do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGB), Centro de Desenvolvimento Tecnológico da Universidade Federal de Pelotas (UFPel, Pelotas, RS). Grupo de Pesquisa em Oncologia Celular e Molecular (GPO), Biotecnologia/Centro de Desenvolvimento Tecnológico (UFPel).

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

FABIANA LOUISE TEIXEIRA MOTTA Mestranda em Biologia Molecular, Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).

FABRÍCIO DA SILVA MORGADO Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB).

FERNANDA MARIA POLICARPO TONELLI Doutoranda do Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia, Departamento de Bioquímica e Imunologia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG, Belo Horizonte, MG).

FREDERICO MENDONÇA BAHIA SILVA Pesquisador do Grupo de Engenharia Metabólica Aplicada a Bioprocessos, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB).

GLEIDE FERNANDES DE AVELAR Professor adjunto do Laboratório de Biologia Celular, Departamento de Morfologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

GUILHERME MATTOS JARDIM COSTA Professor adjunto do Laboratório de Biologia Celular, Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

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Autores

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HELENA STRELOW THUROW Pós- doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGB), Centro de Desenvolvimento Tecnológico da Universidade Federal de Pelotas (UFPel, Pelotas, RS). Grupo de Pesquisa em Oncologia Celular e Molecular (GPO), Biotecnologia/Centro de Desenvolvimento Tecnológico (UFPel).

HUMBERTO DE MELLO BRANDÃO Pesquisador do Laboratório de Nanotecnologia, Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Leite (Embrapa).

JAILA DIAS BORGES Professor adjunto da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Amazonas (Ufam).

JOÃO HENRIQUE MOREIRA VIANA Pesquisador do Laboratório de Reprodução, Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Leite (Embrapa).

JÖRG KOBARG Professor titular do Instituto de Biologia, Departamento de Bioquímica e Biologia Tecidual da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Foi pesquisador do Laboratório Nacional de Biociências, Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM).

JOSÉ LUIZ DA COSTA Professor doutor da Universidade de Campinas (Unicamp). Perito criminal da Superintendência da Polícia Técnico-Científica de São Paulo.

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

JULIANA GOULART XANDE Pesquisadora do Laboratório de Terapia Gênica, Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP).

KAMILLA SWIECH Professora doutora do Hemocentro de Ribeirão Preto, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (USP). Departamento de Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, USP.

KARINE RECH BEGNINI Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGB), Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas (UFPel, Pelotas, RS). Grupo de Pesquisa em Oncologia Celular e Molecular (GPO), Biotecnologia/Centro de Desenvolvimento Tecnológico (UFPel).

KATIA NEVES GOMES Pós-doutoranda do Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG, Belo Horizonte, MG). Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia.

KELLY CRISTINA RODRIGUES SIMI Aluna de doutorado do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Universidade de Brasília (UnB).

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Autores

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LEONARDO ASSIS DA SILVA Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB).

LILIAN RUMI TSURUTA PhD. Pesquisadora do Laboratório de Biofármacos em Células Animais do Instituto Butantan (São Paulo, SP).

LORENA CARVALHO DE SOUZA CHAVES Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB).

LUCIANA MAGALHÃES MELO Bolsista PNPD/CAPES do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará (UECE).

LUIZ ORLANDO LADEIRA Professor associado do Departamento de Física, Instituto de Ciências Exatas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG, Belo Horizonte, MG). Laboratório de Nanomateriais.

LUIZ RENATO DE FRANÇA Professor titular do Laboratório de Biologia Celular, Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Diretor do Instituto Nacional para Pesquisa na Amazônia (INPA).

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

LUIZ SERGIO DE ALMEIDA CAMARGO Pesquisador do laboratório de Reprodução, Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Leite (Embrapa).

LYGIA DA VEIGA PEREIRA Professora titular do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Laboratório Nacional de Células-Tronco Embrionárias (LaNCE) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia Celular (INCTC), Departamento de Genética e Biologia Evolutiva (IB-USP).

MARCELO DE MACEDO BRÍGIDO Professor titular do Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília (UnB).

MARCELO MENOSSI TEIXEIRA Professor titular do Laboratório de Genoma Funcional, Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

MÁRCIA NEIVA Pesquisadora visitante do Programa Multi-Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBIOTEC). Centro de Apoio Multidisciplinar, Divisão de Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas (Ufam).

MARCO AURELIO AMADEU Pesquisador do Laboratório de Terapia Gênica, Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP).

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Autores

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MARIA FÁTIMA GROSSI DE SÁ Pesquisadora líder do Laboratório de Interação Planta-Praga (Embrapa, Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília/DF).

MARIA SUELI SOARES FELIPE Professora titular do Grupo de Engenharia Metabólica Aplicada a Bioprocessos, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB). Pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília (UCB).

MARIANA SENNA QUIRINO Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB).

MARISA VIEIRA DE QUEIROZ Professora doutora do Departamento de Microbiologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Viçosa (UFV, Viçosa, MG).

MIGUEL DE SOUZA ANDRADE Graduando em Ciências Biológicas, Universidade de Brasília (UnB).

LIVIA PILATTI MENDES DA SILVA Pesquisadora do Laboratório de Biologia Molecular Bacteriana, Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

NÁDIA SKORUPA PARACHIN Pesquisadora do Grupo de Engenharia Metabólica Aplicada a Bioprocessos, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Brasília (UnB). Pósgraduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília (UCB).

NAJA VERGANI Doutoranda do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Laboratório Nacional de Células-Tronco Embrionárias (LaNCE) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia Celular (INCTC), Departamento de Genética e Biologia Evolutiva (IB-USP).

ODIR ANTÔNIO DELLAGOSTIN Professor associado do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTec) da Universidade Federal de Pelotas (UFPel, Pelotas, RS). Laboratório de Vacinologia, CDTec, UFPel.

PAOLO BARTOLINI Professor doutor do Laboratório de Hormônios Hipofisários, Centro de Biotecnologia do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPENCNEN, São Paulo, SP).

PATRÍCIA BARBOSA PELEGRINI Pós-doutoranda do Laboratório de Interação Planta-Praga (Embrapa, Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília/DF).

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Autores

PRISCILA MARQUES MOURA DE LEON Pós-doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGB), Centro de Desenvolvimento Tecnológico da Universidade Federal de Pelotas (UFPel, Pelotas, RS). Grupo de Pesquisa em Oncologia Celular e Molecular (GPO), Biotecnologia/Centro de Desenvolvimento Tecnológico (UFPel).

PRITESH J. LALWANI Professor doutor da Fundação Oswaldo Cruz da Amazônia.

ANTÔNIO AMÉRICO BARBOSA VIANA Professor doutor do Centro de Análises Proteômicas e Bioquímicas (CAPB). Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia (PRPGP), Universidade Católica de Brasília (UCB).

AULUS ESTEVÃO ANJOS DE DEUS BARBOSA Professor doutor do Centro de Análises Proteômicas e Bioquímicas (CAP). Orientador pela pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia (PRPGP), Universidade Católica de Brasília (UCB).

BRUNO LOBÃO SOARES Professor doutor do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

EVERALDO GONÇALVES DE BARROS Professor doutor do Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília (UCB).

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

JOÃO BOSCO PESQUERO Professor Titular do Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).

NORBERTO CYSNE COIMBRA Professor doutor do Núcleo de Apoio à Pesquisa da Universidade de São Paulo (NAP-USP) em Neurobiologia das Emoções (NuPNE) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (USP).

OCTÁVIO LUIZ FRANCO Professor doutor do Centro de Análises Proteômicas e Bioquímicas (CAPB). Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia (PRPGP), Universidade Católica de Brasília (UCB).

WANDERLEY DIAS DA SILVEIRA Professor doutor do Laboratório de Biologia Molecular Bacteriana, Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).

MICHELE CHRISTINE LANDEMBERGER Pesquisadora científica do A.C. Camargo Cancer Center. Professora doutora da Universidade Paulista (Unip).

ROSÂNGELA VIEIRA DE ANDRADE Professora doutora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília (UCB).

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Autores

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SIMONI CAMPOS DIAS Professora doutora do Centro de Análises Proteômicas e Bioquímicas (CAPB). Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia (PRPGP) da Universidade Católica de Brasília (UCB).

RAFAEL TRINDADE BURTET Pós-doutor do Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília (UnB).

RICARDO CAMBRAIA PARREIRA Doutorando do Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMB, Belo Horizonte, MG). Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia.

ROBERTO FRANCO TEIXEIRA CORRÊA Professor visitante vinculado ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, Faculdade de Saúde da Universidade de Brasília (UnB).

RODRIGO ESAKI TAMURA Pesquisador do Laboratório de Vetores Virais, Centro de Investigação Translacional em Oncologia/LIM 24, Instituto do Câncer do Estado de São Paulo, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FM-USP).

RODRIGO RIBEIRO RESENDE Professor adjunto do Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG, Belo Horizonte, MG). Coordenador do Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia. Presidente do Instituto Nanocell.

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

SAMYRA MARIA DOS SANTOS NASSIF LACERDA Pós-doutoranda do Laboratório de Biologia Celular, Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

SILVANA BEUTINGER MARCHIORO Pós-doutoranda do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTec), Universidade Federal de Pelotas (UFPel, Pelotas, RS). Professora adjunta da Faculdade de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Grande Dourados (UFGD).

SIMONE APARECIDA SIQUEIRA DA FONSECA Pós-doutoranda do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (IB-USP). Laboratório Nacional de Células-Tronco Embrionárias (LaNCE) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia Celular (INCTC), Departamento de Genética e Biologia Evolutiva (IB-USP).

SPARTACO ASTOLFI-FILHO Professor titular de Engenharia Genética do Programa Multi-Institucional de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBIOTEC). Centro de Apoio Multidisciplinar, Divisão de Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas (Ufam).

TIAGO COLLARES Professor do curso de graduação em Biotecnologia e do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGB), Centro de Desenvolvimento Tecnológico da Universidade Federal de Pelotas (UFPel, Pelotas, RS). Grupo de Pesquisa em Oncologia Celular e Molecular (GPO), Biotecnologia/Centro de Desenvolvimento Tecnológico (UFPel).

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Autores

VÂNIA APARECIDA MENDES GOULART Doutoranda do Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG, Belo Horizonte, MG). Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia.

VICENCIA MICHELINE SALES Mestre em Biologia Molecular, doutoranda em Biologia Molecular do Departamento de Biofísica da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).

VICENTE JOSÉ DE FIGUEIRÊDO FREITAS Professor do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução, Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará (UECE).

VINICIUS F. CAMPOS Professor do curso de graduação em Biotecnologia e do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGB), Centro de Desenvolvimento Tecnológico da Universidade Federal de Pelotas (UFPel, Pelotas, RS). Grupo de Pesquisa em Oncologia Celular e Molecular (GPO), Biotecnologia/Centro de Desenvolvimento Tecnológico (UFPel).

VIRGÍNIA PICANÇO-CASTRO Pesquisadora do Hemocentro de Ribeirão Preto, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (USP).

WILMAR DIAS DA SILVA Professor titular do Laboratório de Imunoquímica do Instituto Butantan (São Paulo, SP).

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SOBRE A COLEÇÃO BIOTECNOLOGIA APLICADA À SAÚDE E AGRO&INDÚSTRIA: FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES Certa vez perguntaram-me “Por que fazer um livro de tamanha envergadura e alcance?”, e mal sabia o colega cientista que seriam quatro livros... Nesta coleção, a intenção foi reunir, em uma obra didática, sucinta e objetiva, os fatos mais novos na literatura com os conhecimentos clássicos dos temas disponíveis em obras separadas. Para se ter todo o escopo de Biotecnologia Aplicada à Saúde e Biotecnologia Aplicada à Agroindústria, dividimos o primeiro tema em três volumes e dedicamos ao segundo um volume exclusivo, totalizando quatro volumes cujos tópicos são todos abordados nos cursos de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, dentre outros. Ao todo, foram 75 autores no primeiro livro, 97 no segundo, 90 no terceiro e 114 no quarto, totalizando 376 autores, entre professores e cientistas de referência nacional e internacional, de 78 laboratórios de pesquisa diferentes, que atuam em mais de 150 programas de pós-graduação no país, em 49 departamentos de 39 universidades, e mais 27 institutos de pesquisa distintos. Praticamente todos os programas de pós-graduação em biotecnologia estão presentes nesta obra. O objetivo do livro, que é único no mercado, é justamente atender ao maior público possível, entre alunos de pós-graduação e graduação. Um tópico em cada capítulo abordará os aspectos históricos e básicos que conduziram às técnicas e modelos apresentados, de extrema utilidade e didático para cursos de graduação. Por isso, envolvemos 69 instituições de ensino e pesquisa, de todos os estados do Brasil. Seguindo nessa direção e no sentido de produzir um livro dirigido tanto a alunos de graduação quanto de pós-graduação, assim como àqueles profissionais que queiram se introduzir na área de biotecnologia utilizando técnicas modernas e o uso de qualquer tipo de modelo celular, disponibilizamos, em um tópico de cada capítulo, as metodologias e procedimentos para a realização de experimentos. Trata-se de um guia prático e simples para a bancada de experimentos complexos.

Prof. Rodrigo R. Resende (PhD) Laboratório de Sinalização Celular e Nanobiotecnologia Presidente da Sociedade Brasileira de Sinalização Celular Presidente do Instituto Nanocell Departamento de Bioquímica e Imunologia,Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais

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