Biotecnologia Aplicada à Saúde - Vol. 2, pt. 2

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2 FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES

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Nesta coleção, a intenção foi reunir, em uma obra didática, sucinta e objetiva, os fatos mais recentes na literatura com os conhecimentos clássicos dos temas disponíveis em obras separadas. Para se ter todo o escopo de Biotecnologia Aplicada à Saúde e Biotecnologia Aplicada à Agro&Indústria, dividimos o primeiro tema em três volumes e o segundo em um, totalizando 4 volumes, sendo que todos os tópicos são abordados nos cursos de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia, entre outros.

FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES

Seguindo essa direção e no sentido de produção de um livro que seja para o uso tanto de alunos de graduação como de pós-graduação e para aqueles profissionais que queiram se introduzir na área de biotecnologia utilizando técnicas modernas e qualquer tipo de modelo celular, disponibilizamos, em um tópico de cada capítulo, as metodologias e os procedimentos para a realização de experimentos. Um guia prático e simples para a bancada de experimentos complexos.

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organizador

RODRIGO RIBEIRO RESENDE

Neste segundo volume, você aprenderá a engenharia genética pela tecnologia do DNA recombinante. Descobrirá os mais recentes avanços na produção de linhagens celulares e vetores virais. Aprenderá a produzir proteínas recombinantes para uso em clínica médica, na produção de kits de diagnóstico, e anticorpos para uso médico, vacinas e mutações sítio-dirigidas, usando animais ou plantas como biorreatores. Aprenderá também a isolar, caracterizar, identificar e transformar células adultas em células-tronco embrionárias, a produzir animais transgênicos e a controlar expressão gênica no tempo e no espaço. É a terapia gênica mais perto de você, mais acessível e, de fato, funcionando.

organizador

colaborador

RODRIGO RIBEIRO RESENDE

CARLOS RICARDO SOCCOL

CAPÍTULO

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ANTICORPOS HUMANIZADOS Wilmar Dias da Silva Angela Alice Amadeu Megale 12.1 INTRODUÇÃO

Este capítulo tem como objetivo introduzir interessados em Biotecnologia, estudantes e biotecnólogos, no tema “Anticorpos Humanizados” (AcHm). Certos aspectos celulares ou moleculares referentes aos anticorpos (Ac) estão descritos com detalhes porque os julgamos necessários à compreensão dos processos de geração de AcHm, motivo deste capítulo. Fundamentos e perspectivas foram realçados. Dados essenciais para o entendimento e reprodução de processos biotecnológicos foram indicados em referências colocadas on-line. Certas informações ilustrativas sobre os eventos acontecidos ao longo da história dos Ac, que ocupariam espaço no corpo do texto, foram disponibilizadas aos eventuais interessados como Suplementos I e II.

12.2 ANTICORPOS (AC) OU IMUNOGLOBULINAS (IG) Estrutura molecular: Ig são proteínas de massa molecular de 150-190 kDa produzidas pelo sistema imune (SI). Ig são formadas por dois tipos de cadeias polipeptídicas, uma de massa molecular 55-77 kDa, cadeia H (do inglês, heavy), e outra de massa molecular 25kDa, cadeia L (do inglês, light). Na cadeia L há uma região em que a sequência de aminoácidos varia de Ac para Ac, denominada VL, e uma região em que a sequência de aminoácidos

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é constante em todos os Ac, denominada CL. Na cadeia H, há também uma região em que a sequência de aminoácidos varia de Ac para Ac, denominada V H, e três regiões denominadas C H1, C H2 e C H3, em que as sequências de aminoácidos são constantes em todos os Ac (Figura 12.1A).

Figura 12.1A Estrutura da molécula de Ig.

Duas cadeias L e duas H se associam por meio de pontes dissulfeto, ligando: (a) uma cadeia H e uma cadeia L entre os domínios moleculares CL e CH1; o polipeptídeo resultante é denominado Fab; (b) duas cadeias H entre os correspondentes domínios CH2 e CH3; o polipeptídeo resultante é denominado Fc. Entre os dois polipeptídeos Fab e um Fc há duas pontes dissulfeto formando a hinge region. Essa região confere flexibilidade aos dois Fab em relação ao Fc. Tal flexibilidade permite acomodação dos Fab de uma mesma molécula de Ig a epítopos iguais, porém, dispostos em diferentes regiões da molécula de Antígeno (Ag). Assim, cada molécula tetramérica de Ig consta de 12 a 14 domínios: 4V (2VL e 2CL) e de 8 a 10 domínios VH (2VH e 6-8CH). A clivagem de IgG com pepsina resulta em um fragmento bivalente contendo dois fragmentos Fab, e com papaína, em três fragmentos, dois Fab e um Fc (Figura 12.1B). As cadeias L e H são codificadas por loci genéticos separados; as sequências de pares de base de L que codificam V ou C nunca são encontradas em uma H e vice-versa. Moléculas purificadas de Ig mostraram que os polipeptídeos H e L são alinhados de tal maneira que os domínios V e C na cadeia L posicionam-se diretamente opostos aos correspondentes da cadeia H. Assim, na molécula Ig cada um dos dois sítios de combinação com o Ag é formado

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Figura 12.1B Produtos de clivagem da molécula de Ig por enzimas proteolíticas. Pepsina: cliva a molécula de IgG depois da região do hinge, resultando no fragmento F(ab’)2 e em pequenos peptídeos do Fc. Papaína: cliva a molécula de Ig antes da região do hinge, resultando em dois fragmentos de Fab e no Fc íntegro.

pelo emparelhamento de um domínio VL de uma cadeia L e um domínio HL da cadeia H. O posicionamento da ligação dissulfeto unindo as cadeias H a L fora dos domínios V permite esse emparelhamento. Os domínios V e C nas cadeias polipeptídicas de Ig possuem uma estrutura básica comum domínio Ig. Cada domínio Ig consta de 70 a 110 aminoácidos (± 12 kDa). Contêm um resíduo Cys em cada extremo que formam uma ponte dissulfeto. Conquanto a sequência de aminoácidos não seja idêntica nos diferentes domínio Ig, exibem semelhanças suficientes para que organizem estruturas cilíndricas conhecidas como Immuniglobulin barrel ou Immuniglobulin fold. Nos Fab há uma sub-região em que a sequência de aminoácidos varia de Ig para Ig, referida como sub-região hipervariável. Dentro das regiões variáveis das cadeias H e L há três segmentos curtos responsáveis pela

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hipervariabilidade. Cada segmento consta de cinco a sete aminoácidos que conferem a estrutura tridimensional que acomoda rigidamente a imagem especular fornecida pelo epítopo para o qual foi selecionada. Para cada configuração de epítopo, foi ou será selecionada no processo de indução da resposta imune a sequência de pares de bases que codifica ou codificará o segmento hipervariável. Esse processo, origem da diversidade dos Ac, atende ao vasto repertório de diversidades das Ig necessário para reconhecer qualquer molécula no universo de antígeno. Pelo fato de essas estruturas serem complementares às estruturas dos epítopos, foram designadas complementarity-determing regions, abreviadamente CDR. Os três CDR (CDR1, CDR2 e CDR3) representam juntos apenas 15% a 20% da região hipervariável; os restantes 80% a 85% distribuem-se não uniformente em quatro regiões intercaladas entre CDR, denominadas frame-work regions, abreviadamente FR (FR1, FR2, FR3 e FR4) (Figura 12.2)*.

Figura 12.2 Regiões hipervariáveis da molécula de Igs. As sequências de aminoácidos obtidas de diferentes Igs purificadas foram comparadas. Depois de alinhadas, sequências contendo resíduos repetivos e diferentes apareceram ao longo da molécula. Três regiões hipervariáveis intercaladas entre quatro regiões bem conservadas emergiram. Essas regiões localizavam-se nas porções V das cadeias L e H. As regiões hipervariáveis responsáveis pela combinação com os epitiopos do Ag indutor da resposta imune foram designadas “complementarity-determinig regions” (CDR). As regiões intercaladas de sequência conservada foram designadas “framework regions” (FR). Parte desta figura foi adaptada da figura correspondente publicada por Wu e Kabat1. *

Informações originalmente obtidas com o sequenciamento de aminoácidos das regiões variáveis de proteínas Bence Jones e de cadeias L de mieloma alinhadas e confrontadas1, posteriormente confirmadas e ampliadas em diversos modelos experimentais.

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12.3 ORIGEM DA DIVERSIDADE DAS IGS 12.3.1 Um pouco do passado Informações acumuladas até a metade do século XX indicavam que o sistema imune poderia desenvolver Ac para quase todos os Ag existentes na natureza e que a produção de Ac seria uma atividade exclusiva de plasmócitos. Os componentes deste vasto repertório de Ac seriam produzidos por qualquer plasmócito que ao acaso entrasse em contato com determinado Ag. Para explicar como as moléculas de Ag eram reconhecidas pelos plasmócitos e como a enorme diversidade de Ac seria gerada, quatro teorias foram elaboradas: 1) “Teoria instrutiva”, propondo que a presença do Ag no ato da geração da resposta imune modelaria a conformação estrutural da molécula do Ac como sua imagem especular. A demonstração de moléculas de Ac prontas, fixas na superfície de plasmócitos antes do contato com o Ag, invalidou a teoria. 2) Teoria da “variação na linhagem germinativa”, propondo que as sequências de pares de base necessárias para codificar moléculas de Ac específicas para cada Ag individualmente estariam no DNA de cada plasmócito. O papel do Ag seria selecionar a sequência de DNA adequada para codificar o Ac específico. Informações subsequentes mostraram que o número de especificidades de Ac seria da ordem de 109 a 1011 sequências diferentes de DNA. Para codificar a especificidade de uma única molécula de Ig seriam necessários cerca de 3 bilhões de pares de base, correspondentes a 1 bilhão de códons. Esse número é superior ao existente em uma célula. 3) Teoria da “mutação somática”, propondo a existência no DNA dos plasmócitos maduros de sequências susceptíveis a sofrer mutações induzidas pelo Ag. As sequências mutantes codificariam as regiões do Ac específicas para o Ag indutor da mutação somática. A região de DNA suscetível a uma mutação somática seria pequena, não interferindo com as demais atividades da célula. 4) Teoria da “geração somática da diversidade dos Ac”, idealizada em 1965 por William Dreyer e J. Claude Bennett. Propunha que múltiplos genes que codificam as regiões V tanto da cadeia L como da cadeia H estariam presentes como cópias únicas no DNA dos precursores de plasmócitos imunologicamente virgens. Propunha, ainda, que os genes que

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codificam os domínios de C, L e H estariam fisicamente separados dos genes da região V. Esse aditivo à teoria explicaria o escape da região C aos processos de geração da diversidade e da mutação somática. Essa teoria associava, portanto, o implicitamente mais razoável nas teorias da “variação na linhagem germinativa” e da “mutação somática”. A demonstração de sua validade aguardou a emergência de conhecimentos fundamentais na área da biologia molecular, destacando-se: • Os genes que codificam as sequências de aminoácidos na estrutura das proteínas incluem blocos de DNA denominados éxons. • Os éxons dispõem-se linearmente e estão separados um do outro por sequências de DNA denominadas íntrons. • Os íntrons podem conter sequências que regulam a expressão dos genes contidos nos éxons. • Cada éxon codifica uma região discreta da molécula de proteína. • As informações contidas nos éxons se juntam durante o processo de montagem final da molécula de RNAm conforme descrito a seguir. Essa maleabilidade de organização estrutural da molécula de proteína permitiria a criação de membros ligeiramente diferentes de uma mesma família de proteínas. • Durante o processo de transcrição da informação gênica forma-se uma longa molécula de RNA denominada “transcrito primário” que inclui as sequências de éxons e íntrons. • Durante a maturação, o “transcrito primário” se liga com várias moléculas de adenina. • Ainda no núcleo, os íntrons dos “transcritos primários” são cortados e eliminados. • A secção da molécula de R NA para esse corte é feita pelos “splyceosomes”, um complexo de vários componentes que reconhecem especificamente sequências de nucleotídeos curtas denominadas “splice donor” e “splice receptor”, posicionadas respectivamente nos extremos 5’ e 3’ dos íntrons. • Uma enzima do “splyceosome” realiza a junção entre dois éxons eliminando o íntron situado entre eles e juntando os dois éxons antes separados pelo íntron, agora aproximados por meio das “splice junctions”. • Os éxons se juntam linearmente um em seguida ao outro e resultam nas moléculas de RNAm maduro. • As moléculas de RNAm maduro deixam o núcleo e passam para o citoplasma, onde podem ser reguladas por microRNAs.

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• Um microRNA contém 22 nucleotídeos. • Cada microRNA se liga com sequências preferencialmente da porção 3’ da molécula de RNAm para a qual é específico, bloqueando suas atividades. • Os RNAm não bloqueados entram nos poliribossomas para serem traduzidos. • Descoberta das endonucleases de restrição. Essas enzimas clivam DNA de fita dupla. Agem sobre sequências curtas, com 4 a 8 pares de bases, chamadas sítios de restrição. Cada enzima reconhece e cliva um sítio de restrição distinto. Os produtos de clivagem podem ser fragmentos de tamanhos e padrões diferentes. O padrão de clivagem varia de enzima para enzima e é reprodutível. Os fragmentos resultantes podem ser analisados pelo método de Southern blotting, descrito por E. Southern. As etapas desse procedimento são descritas a seguir.

12.3.2 Análise de fragmentos de DNA por Southern blotting 1) Separar os segmentos de DNA em eletroforese em gel de agarose. 2) Separar as duas fitas do DNA de fita dupla, tratando o gel com solução de hidróxido de sódio (desnaturação). 3) Transferir o DNA para membrana de nitrocelulose. 4) Tratar a membrana contendo os fragmentos de DNA de fita única com sonda hibridizadora, que é uma molécula de DNA isolada de sequência conhecida complementar à que foi transferida, previamente marcada com isótopo radiativo, radicais fluorescentes ou cromogênicos. Observação: como as duas fitas da dupla hélice do DNA são complementares uma a outra, tanto faz escolher uma sonda que seja idêntica ou complementar à sequência procurada. Essa sonda irá parear apenas com segmentos de DNA que exibam sequências que lhe sejam complementares.

12.3.3 Teoria da geração somática da diversidade dos Ac A teoria da geração somática da diversidade dos Ac não foi aceita com entusiasmo. Era incompatível com certos dogmas então vigentes, tais como “um gene, um RNAm, uma proteína” e “todas as células de um organismo contêm exatamente a mesma sequência de DNA”. Conhecimentos importantes cristalizados no início dos anos 1970 permitiram que Susumo Tonegawa

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e colaboradores demonstrassem em 1976 que o genoma, de fato, não contém genes intactos de Igs. Esses pesquisadores compararam as sequências que codificam Ig presentes em preparações de DNA de embrião inteiro (representando a sequência completa da “linhagem germinativa” mantida em células não B) com células de mieloma (representando células de linhagem B). Como resultado da comparação, demonstraram que os genes que codificam as regiões V e C de Ig estavam nitidamente separados na sequência da “linhagem germinativa” mantida em células não B, mas haviam trocado de posição nas células de mieloma representando células de linhagem B. Trabalhos subsequentes realizados por esses e outros autores mostraram que a região V de Ig é codificada por um éxon V intrinsecamente organizado pelo assentamento de pequenos fragmentos de DNA denominados gene segments. Os gene segments que compreendem o éxon V são colocados juntos no genoma de cada um dos precursores de células B. Nessa fase do processo, os gene segments são colocados juntos ao acaso em cada precursor de célula B por um mecanismo denominado recombinação somática, ou recombinação V(D)J. O resultado é a geração dentro do precursor de uma população de células B de enorme variedade de éxons V. As sequências dos éxons V são, em seguida, ligadas nas sequências do éxon C de uma única Ig. Os mecanismos enzimáticos envolvidos na recombinação somática só estão ativos em linfócitos em desenvolvimento; não agem sobre o DNA de células não linfocitárias. O sistema enzimático usado nos precursores de células B para rearranjar os genes que codificam Ig são os mesmos que funcionam no rearranjo dos genes que codificam os receptores presentes em células B (BCR) e em células T (TCR).

12.3.4 Essência do estabelecido no presente As Ig da maioria das espécies de mamíferos, incluindo o ser humano, são codificadas por sequências de nucleotídeos que residem em três grandes loci genéticos: Igh (locus para cadeia H), Igk (locus para cadeia L kapa), e igl (locus para cadeia L lambda). Em humanos, cada locus está localizado em cromossomos diferentes: igh no cromossomo 12, Igk no cromossomo 2 e igl no cromossomo 22. Os loci Igk e igl contêm dois tipos de segmentos gênicos, V (de variável) e J (de joining), enquanto o locus igh contém, além dos segmentos V e J, o segmento D (de diversity) (Figura 12.3). Cada segmento gênico contribui com informações para sequências particulares de aminoácidos na região variável de uma, e somente uma, molécula de Ig. Na linhagem celular germinativa são feitas múltiplas cópias de segmentos

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Figura 12.3 Representação esquemática dos loci das cadeias Lλ, Lκ e H.

de nucleotídeos para cada segmento. Esses segmentos de nucleotídeos ou éxons estão alinhados e separados do anterior e do seguinte por blocos de nucleotídeos, os íntrons. Na extremidade 5’ de cada locus V há um agrupamento de V-éxons também separados um do outro por íntrons. O número de V-éxons varia consideravelmente entre os diferentes loci de Ig e entre as espécies animais. Na espécie humana, por exemplo, há aproximadamente 45 éxons para a cadeia H, 35 para a cadeia К e 2 para a cadeia λ. Os segmentos V para os loci estão alinhados em um longo segmento de DNA com cerca de 2 mil pares de bases. Em seguida ao último locus-V, em direção à extremidade 3’, encontramse os loci-C: 1 para cadeia LК, 4 para a cadeia Lλ e 9 para a cadeia H. Os 9 loci-C para a cadeia H estão alinhados cada um codificando determinado isótipo de Ig: IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM.

12.3.4.1 Remodelação dos segmentos gênicos que geram a diversidade dos Ac A remodelação dos múltiplos segmentos gênicos de DNA inseridos nos blocos V(D)J só ocorre na linhagem germinativa de Igs. Células de linhagens não linfocitárias não realizam essa remodelação. O processo de remodelação aproxima e une éxons V e C, de modo a permtir que a transcrição se processe no nível de DNA antes da transcrição completa do gene para a molécula inteira de

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Ig. Enzimas recombinases específicas reúnem e combinam os segmentos gênicos V, D e J selecionados em uma faixa única e alinhada do DNA. Por meio desse processo, os demais segmentos V, D e J, além de outros segmentos intervenientes não selecionados, são excluídos. A recombinação V(D)J é estritamente controlada. Além disso, as etapas de excisão e colagem de segmentos gênicos ocorrem de maneira precisa em sequências de pares de bases. No processo de organização dos genes das cadeias H, o primeiro passo é a seleção aleatória de segmentos gênicos D e J. No exemplo, um dos segmentos D, DH4, se une a um dos segmentos J, segmento JH4, resultando DH4JH4. A seguir, um dos segmentos VH, por exemplo VH12, é selecionado e unido a DH4JH4 resultando no segmento VH12DH4JH4. Após a recombinação VH12DH4JH4 completar-se, a transcrição do resultante gene organizado procede-se, e transcritos do RNA primário são produzidos. Nesses transcritos primários, apenas os éxons Cµ e Cδ se unem ao segmento VH12DH4JH4. Os RNAs dos transcritos primários VH12DH4JH4 sofrem cortes diferenciais, resultando em RNAms que codificam regiões ligadas alternativamente a Cµ ou a Cδ. A tradução desses RNAms produz VH12DH4JH4 Cµ e VH12DH4JH4 Cδ. O rearranjo de éxons das cadeias H (Figura 12.4A) e das cadeias L: Igκ (Figura 12.4B) e Igλ (Figura 12.4C), envolve ligação de segmentos V e J, como descrito nos respectivos esquemas.

12.3.4.2 Alguns valores teóricos Múltiplos segmentos gênicos “germline”: • Éxons H: 100-200 • Éxons D:15 • Éxons J: 4 para cadeia H; 4 para cadeia Lκ; 0 para cadeia Ly • Éxons Lκ: 250-300 • Éxons Ly: 3 Possibilidades combinatoriais de junções V-D-J ou VJ: • Cadeia H: 100 x 15 x 4 = 6,0 x 103. • Cadeia Lκ: 250 x 4 = 1 x 103. • Cadeia Ly: (3 x 3) -1 = 8 A maior parte da diversidade no repertório de Ac deriva-se, como descrito nos esquemas apresentados anteriormente, da integração de quatro fontes de variabilidade: presença no genoma de células B imaturas de múltiplos

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Figura 12.4A Cadeia H: Recombinação aleatória de segmentos V, D e J presentes na linhagem germinativa do DNA de linfócitos B para organizar um segmento gênico V-D-J. Durante a organização gênica da cadeia H de Ig, primeiro ocorre a ligação de D em J, formando DJ. No esquema, DH15 se uniu com ɯJH3 ɯ ao acaso, resultando em DH15 ɯJH3 ɯ. Este segmento, também ao acaso, se une a um segmento VH, no exemplo, VH15 ɯ, resultando no segmento VH15 ɯ DH15 ɯJH3 ɯ. Em seguida, procede-se a transcrição do gene rearranjado e transcritos de RNA primário são produzidos. Apenas éxons referentes a Cµ e Cδ são incluídos. Os demais íntrons Cy3, Cy1, Cy2b, Cy2a, C£3 e Cα serão incluídos mais tarde na evolução de uma resposta imune após encontro com o antígeno, processo de “switching”. Este processo é canônico: ocorre depois que os íntrons são eliminados, é independente da ocorrência ou não de hipermutação somática, preserva a especificidade para o Ag criada originalmente durante o rearranjo gênico que é integralmente transferida para o isotipo seguinte que for gerado. Os transcritos de RNA criados são processados resultando na produção de RNAm que codificam regiões V ligadas a regiões C, Cµ e Cδ durante o processo de translação em proteínas.

Figura 12.4B Cadeia Lκ: O rearranjo do gene para cadeia envolve a junção aleatória de um segmento de gene V a um segmento de gene J. No esquema, o locus Vκ3ɯ, em um primeiro instante, junta-se a ao locus ɯ, formando Vκ3ɯJɯCκ, que por sua vez, se liga a um éxon Cµ. O RNAm Vκ3ɯJɯCκ é transladado para a proteína da cadeia µ.

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Figura 12.4C Cadeia Lλ: O rearranjo do gene para a cadeia envolve a junção aleatória de um segmento de gene V a um segmento de gene J. No esquema, o locus Vλ1ɯ, em um primeiro instante, junta-se a ao loci ɯ, formando Vλ1 ɯJH1 ɯ, que, por sua vez, se liga a um éxon Cλ. O RNAm Vλ1 ɯJH1 ɯ Cλ1 é transladado para a proteína da cadeia Cλ.

segmentos gênicos (linhagem germinativa), ligação combinatória, junção de diversidades e emparelhamento entre cadeias L e H. Estas fontes de diversidades criam uma única sequência BCR para cada célula B antes de sua liberação na periferia. Essa diversidade resulta do rearranjo de segmentos gênicos do genoma de células B imaturas. Os valores obtidos em cada etapa antecipam 6 milhões de sítios combinatórios ou parátopos diferentes. Sabendo-se que um número apreciável de células B degenera e morre antes de expressar atividade de Ac, o número de diversidades oferecido aos determinantes antigênicos ou epítopos dos Ag disponíveis na natureza seria ainda menor. Mecanismos compensatórios concorrem para suprir diversidades adicionais. Um deles seria pelo processo de hipermutação somática que ocorre após o encontro de uma célula B virgem contendo sua única diversidade já organizada com o Ag contendo o epítopo que reconhece. Pontos de mutação na progênie da célula B são gerados e aumentam a diversidade. Um mecanismo adicional para potencializar as ações de uma diversidade já gerada é pelo “switching” de isotipos de Igs. Diferentes isotipos, cada um explorando suas particularidades efetoras, expandiriam as ações de uma mesma diversidade.

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12.4 PERSPECTIVAS A utilização das informações coligidas na construção de Ac com especificidades planejadas destinada à pesquisa de novos conhecimentos e aplicações. Observação: A pergunta: “Como o sistema imune organiza e comporta tão vasto repertório de regiões variáveis que cobre igualmente vasto repertório de Ag?” foi respondida com experimentos criativos de biologia molecular 2. Pela importância da colaboração, S. Tonegawa foi laureado com o prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina, em 1987. • Isotipos de Ig: são conhecidos cinco isotipos: IgG com quatro subisotipos (IgG1, IgG 2 , IgG3 e IgG 4), IgD, IgM, IgA com dois subisotipos (IgA1, IgA 2), e IgE. Isotipos específicos para o mesmo epítopo conservam parte considerável da sequência de aminoácidos na região que interage com o epítopo, mas possuem sequências de aminoácidos distintas entre as diversas classes e subclasses de Igs. • Ac policlonais (AcP): são uma mistura de Ac dirigidos individualmente para regiões restritas dispostas na molécula de Ag. Como os patógenos, ao longo de sua evolução desenvolveram múltiplos domínios moleculares nos componentes das várias estruturas que formam suas moléculas e/ou células. São valiosos na defesa do organismo nas infecções naturais. Continuam sendo reagentes valiosos tanto como meios de diagnóstico na identificação de patógenos como recursos de imunoterapia direcionada. • Ac monoclonais (AcM) 4,5: em 1975, Cesar Milstein e Georges Köller uniram fisicamente uma célula de mieloma expressando a característica básica de células tumorais, que intrinsicamente se reproduzem indefinidamente, com uma célula B cujos receptores BCR já diferenciados expressam as características fundamentais de Ac de reconhecer e se combinar especificamente com o Ag que estimulou sua produção, resultando em uma célula híbrida, o hibridoma. Células de hibridomas retêm em si mesmas a capacidade de reprodução da célula mieloma e produção de Ac de especificidade única. Hibridomas no sentido funcional são células imortalizadas. Estava desenvolvido um método de produção de Ac monoclonais3. Os dois cientistas foram laureados com o Prêmio Nobel para Fisiologia ou Medicina em 1984. AcMs tornaram-se ferramentas notáveis de investigação e esclarecimento de

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pormenores essenciais da resposta imune. O mais emblemático: estabelecer, de forma definitiva, que cada clone de linfócitos expressa uma e apenas uma região hipervariável de Ac. Mais que emblemático: Cesar Milstein e Georges Köller disponibilizaram esta soberba contribuição, através da Organização Mundial de Saúde (OMS), ao uso universal. Exemplo de positivação de “internacionalização” de conhecimento. Progressos em biotecnologia transformaram AcM, por sua característica de especificidade de reconhecimento, em moléculas transportadoras que levam até alvos específicos vasto repertório de moléculas efetoras: enzimas para tratamentos pró-drogas, toxinas para tratamento de tumores, vírus para terapia gênica, lipossomas, biossensores etc. a) Isotipos: são epítopos distribuídos nos domínios CL, C H1, C H2 e C H3. Ac anti-isotipos são produzidos imunizando animal de uma espécie (coelho, por exemplo) com Ig de outra espécie (camundongo, por exemplo). Há subpopulações de anti-isotipos cada uma específica para um isotipo. Cada população de anti-isotipo pode ser purificada por imunoadsorções programadas. b) Alotipos: alelos são formas múltiplas de um mesmo gene. São epítopos de distribuição restrita aos domínios CH1, CH2 e CH3. Resultam de modificações pequenas em certos nucleotídeos. Expressam-se em certos indivíduos de uma mesma espécie. Polimorfismo designa a ocorrência de múltiplos alelos em uma população. Ac antialotipos são produzidos imunizando animal de uma linhagem isogênica (camundongo BALB/c, por exemplo) com Ig de outra linhagem (camundongo C57Bl/6, por exemplo). c) Idiotipos: são epítopos exclusivos às regiões V H e V L. Estão localizados nas duas regiões hipervariáveis da Ig. Ac anti-idiotipos são produzidos usando como Ag, IgG-Ac monoclonal, e como produtor de anti-idiotipo animal da mesma linhagem. A identidade genética entre fornecedor de IgG e produtor de anti-idiotipo garante que estes Ac sejam dirigidos exclusivamente aos domínios da região hipervariável. O uso de Ac monoclonal garante como antígeno a produção de Ac para um único idiotipo.

12.5 FUNÇÕES DOS AC Os fragmentos Fab das Ig reconhecem o Ag livre ou apenso a patógenos, células infectadas ou cancerosas e através da região Fc promovem a eliminação

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e/ou destruição do Ag. A ação neutralizante-destruidora do Ac ligado ao Ag organizando complexos Ac/Ag ligados na molécula-partícula-célula-alvo pode ser processada por quatro mecanismos: neutralização, opsonização, citoxicidade mediada por células e Ac ou ativação do sistema complemento (SC).

12.5.1 Neutralização Certos vírus, toxinas bacterianas e venenos animais causam doença ligando-se com proteínas constitutivas presentes na superfície da célula -alvo. Penetram a célula através de receptores. Uma vez dentro da célula-alvo, dependendo do resultado competitivo dos mecanismos acionados, sobrevivem, multiplicam-se e promovem destruição da célula-alvo, ou não se multiplicam e são destruídos. Em cada um desses eventos, diferentes plataformas intracelulares são ativadas. O reconhecimento de patógenos infecciosos (vírus, bactérias, fungos, protozoários) e não infecciosos (β-amiloide, ATP, glicose, hialuronas, cristais de ácido úrico, cristais de colesterol), denominados em conjunto PAMP (pathogen-associated molecular patterns), é mediado por receptores expressos em moléculas ou células do hospedeiro denominados PRR (pattern-recognition receptors) ou por Ac específicos. Entre os PRRs incluem-se “Toll-like receptors” (TLR) e os “cytoplasmic nucleic-acid receptors”6,7 RIG-I e Mda5. A proteína paracaspase MALTL1 se combina com a ubiquitina E3 TRAF6 que se auto-ubiquitina e ubiquitina MALT1 e Bcl-10. Cria-se uma plataforma que ativa8,9 IKKγ. IKK ativada fosforila a parte IκBα do complexo IκBα-NfκB, tornando este bloqueador susceptível à degradação por proteosoma, liberando NFκB que se desloca para o núcleo da célula hospedeira onde irá ativar e/ou reprimir genes que ativam ou reprimem expressão de mediadores envolvidos na multiplicação e destruição de patógenos. Portadores de PAMP reconhecidos por PRR são transferidos em vesículas para o citoplasma da célula hospedeira. Ligantes endógenos particulados formados por sensores citoplasmáticos, como NLRP3, pertencente ao complexo molecular inflamasoma, reconhecem e processam no citosol patógenos inteiros ou seus produtos transferidos por Ac. Este complexo, através da interação molecular entre diversos componentes, regula a ativação de caspase-1, que cataliza a clivagem dos precursores das citocinas pro-IL-1β e pro-IL-18 nas formas maduras ativas IL-1β e IL-1810. PRR e os mecanismos que os modulam encaixam-se na imunidade inata. PRR reconhecem panoramas.

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12.5.2 Opsonização Ac reconhecem detalhes. O encontro de Ac com Ag ligados na superfície de patógenos opsoniza, isto é, favorece em cerca de 4 mil vezes o encontro do Fc ligado ao Ac com receptores FcγRs de fagócitos. A fagocitose-endocitose do patógeno opsonizado estimula vias intracelulares que inibem seu crescimento ou promovem sua destruição. Componentes menores da estrutura de patógenos, Ags, induzem a produção de Ac. Ag exibidos pelos patógenos infecciosos e não infecciosos interagem com os Ac que induziram. Imunecomplexos Ags-Ac ativam diferentes plataformas efetoras. Interagem com o sistema complemento (SC) e geram os peptídeos anafilatoxinas que medeiam inflamação e os fragmentos C3b, C4b, e C5b que fazem pontes entre os patógenos e/ou suas moléculas com receptores de fagócitos, monócitos, macrófagos, apresentadoras de Ags, células dendríticas, ou fontes de mediadores inflamatórios, mastócitos, eosinófilos, neutrófilos. C5b, adicionalmente, porém de modo não menos importante, inicia e integra o complexo C5b, C6, C7, C8, C9 (complexo lítico), que se insere irreversivelmente na membrana celular do patógeno e promove sua lise (Figura 12.5). Patógenos endocitados-fagocitados em vesículas citoplasmáticas ativam vários mecanismos que bloqueiam a multiplicação do patógeno e induzem sua destruição. Produção de citocinas e radicais ativos de O 2 fazem parte desse processo. A manifestação de alguns desses eventos foi recentemente explorada em experimentos de opsonização de bacilos BCG com Ac desenvolvidos em camundongos. BCG opsonisados são mais avidamente fagocitados in vitro por macrófagos em comparação com bacilos não opsonisados. Nos macrófagos infectados com bacilos opsonisados o número de bacilos reduz-se progressivamente com o tempo de incubação coincidindo com aumento significativo da expressão da enzima nitric oxide synthase e de óxido nítrico11. Há observações semelhantes com outros patógenos.

12.5.3 Citoxicidade mediada por células e Ac (ADCC) Quando um Ag é muito grande para ser fagocitado, a opsonização pode favorecer ligação do Fc do Ac ligado com certos tipos celulares potencialmente citolíticos. Células NK, eosinófilos e em menor extensão neutrófilos, monócitos e macrófagos aderem ao patógeno opsonizado e promovem sua destruição. A destruição do patógeno aderido decorre de aumento do

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Figura 12.5 Vias de ativação do sistema complemento salientando ativadores, complexos moleculares organizados e a emergência dos efetores anafilatoxinas, opsoninas e complexo lítico. A ativação do sistema complemento inicia-se e estabelece-se através de três cascatas moleculares: via clássica (VC), via das lectinas (VL) e via alternativa (VA), resultando na organização de dois complexos enzimáticos, C3 convertases e C5 convertases. Das ações dessas enzimas resultam produtos de clivagem, anafilatoxinas C3a, C4a e C5a, de opsonina C3b e de complexo molecular [C5b1-C61-C71-C81-C94]2 potencialmente citolítico. Sutil, porém importantes interconexões ocorrem ao longo da ativação com utilização de determinados componentes já ativados em uma via por outra em paralelo. Imunocomplexos, algumas bactérias e vírus interagem com o componente C1 via o subcomponete C1q, rersultando na ativação do subcomponente C1s que cliva e ativa os componentes C4 em C4b e C4a e C2 em C2a e C2b. Polissacarídeos ricos em manose interagem com a proteína MBL (manose-binding lectin), o complexo resultante MBL-polissacarídeo rico em manose ativa as pré-proteases MASPs. MASPs ativadas clivam C4 e C2 de maneira similar a C1s. A VA inicia-se espontaneamente após hidrólise do grupo tioéster presente na cadeia alfa da molecula de C3, fenômeno designado “tickover”. Formam-se, suscessivamente, os complexos enzimáticos C3 convertase de ativação e C3 convertase de amplificação. A adição de molécula adicional de C3b às enzimas C3 convertases C4bC2b e C3bBbP resulta na organização das C5 convertases C4bC2bC3b e C3bBbC3bP, que clivam C5 em C5a e C5b. C5b inicia a construção do complexo molecular [C5b1-C61-C71-C81-C94]2. Baseada em Dias da Silva (2012, Figura 2)44.

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metabolismo celular com síntese de enzimas hidrolíticas e, às vezes, extrusão de granulações pré-formadas sobre o patógeno.

12.5.4 Ativação do sistema complemento (SC) Imunocomplexos ativam a via clássica do SC, opsonizando o patógeno com fragmentos C3b do componente C3, preparando-o para ser fagocitado, liberando fragmentos mediadores dos eventos iniciais da inflamação, C3a, C4a e C5a produtos de clivagem dos componentes C3, C4 e C5 e formando complexos macromoleculares C5b-C9 mediadores da lise do patógeno. O sistema complemento (SC) inclui cerca de três dezenas de proteínas, a maioria circula solúvel no sangue, na linfa e em outros fluidos interteciduais, e algumas presas na superfície de certos tipos de células. Quanto às funções gerais que desempenham durante o processo de ativação do SC, essas proteínas poderiam ser distribuídas em seis grupos: 1) proteínas que servem para estabelecer o primeiro contato entre SC e patógenos, como os componentes C1q, “mannose-binding lectin” (MBL) e C3; 2) pró-enzimas que se ativam em seguida ao contato entre patógenos e SC, como os componentes C1r, C1s, MBL-associated serine proteases 1 e 2 (MASP1 e MASP-2), C2, fator B, além de enzimas que circulam ativas como os fatores D e I; 3) proteínas organizadoras de complexos para suporte de enzimas, como C3 e C4; 4) proteína estabilizadora de complexos enzimáticos ativados, a properdina (P); 5) proteínas que regulam a ativação do SC, como inibidor de C1 (C1in), B1H, “decay-accelewrating factor” (CD55)(DAF), CR1, “membrane cofactor protein” (MCP) (CD46), vitronectina ou proteína S, “membrane inhibitor of reactive lysis protein” (CD59)(MIRL), e “homologous restriction factor” (HRF), também chamado “C8 binding protein, 65kDa”; e 6) proteínas que se agregam para formar complexos de ataque à membrana do patógeno, C5, C6, C7, C8 e C9. O SC é ativado por três vias: via alternativa (VA), via das “mannose binding lectins” (VMBL) e via clássica (VC). As enzimas resultantes da ativação dessas vias convergem para uma via comum, a via lítica (VL) (Figura 12.4). A VL envolve os componentes C3, fB, fD, e P. Íons de Mg++ são necessários para sua

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ativação. O componente C3 é uma glicoproteína de 195 kDa encontrada no sangue e nas secreções. É constituída de duas cadeias polipeptídicas, cadeia-α (125 kDa) e cadeia-β (75 kDa), ligadas por uma ponte dissulfeto. Na porção N-terminal da cadeia-α da molécula de C3 localizam-se dois sítios de importância fundamental para a expressão de suas atividades biológicas: a ligação peptídica Arg 726-Ser 727, suscetível à clivagem pelas enzimas C3 convertases, e a sequência de aminoácidos hidrofóbicos Cys998 e Gln991, que formam um grupamento tioéster. fB é uma pró-serina protease de cadeia única de 93 kDa. fD circula aparentemente como enzima ativa. P é uma proteína de 56 kDa. Pode circular como monômero, dímero, trímero ou tetrâmero.

12.5.4.1 Mecanismos de ativação da VA A ligação tioéster da molécula de C3 como fonte de energia química utilizável é o alvo das vias de ativação do SC. Apesar de protegida dentro da alça hidrofóbica da cadeia-α que incorpora os resíduos Cys998 e Gln991, cerca de 0,005% das moléculas de C3 espontaneamente incorporam uma molécula de H2O por minuto, na proporção de uma molécula de água por molécula de C3. No processo de incorporação de água, C3 é designado C3(H2O). A ligação tioéster é hidrolizada. Libera-se, durante o processo de hidrólise, a energia que estava armazenada. As moléculas de C3(H2O) podem utilizar a energia química liberada para construir ligações covalentes, éster ou amida, desde que estruturas contendo grupos –OH ou –NH estejam disponíveis e suficientemente próximas. C3 neste estágio com sua cadeia–α intacta é designado C3 reativo, abreviadamente C3‫٭‬. Depois de um curto espaço de tempo, da ordem de milésimos de segundos, a energia química é liberada, perde-se e C3(H2O) se inativa. Nesse estágio, por analogia, a molécula de C3 é designada C3 inativo, abreviadamente C3i. De acordo com a ticking-over hypothesis, C3‫٭‬, na presença de ions de Mg++ associa-se reversivelmente com fB. Nessa situação, fB é clivado por fD em dois fragmentos, um peptídeo pequeno, Ba, que se solta na fase fluida, e um fragmento maior, Bb, que contém o sítio enzimático de serina protease e que permanece ligado a C3‫٭‬. Organiza-se a enzima C3‫٭‬Bb, denominada C3 convertase de ativação da VA, de vida média bastante curta. O complexo se desfaz em frações de segundos a não ser que se ligue através de ligações éster ou amida com grupamentos –OH ou –NH2 estrategicamente dispostos em estruturas da superfície celular. Células de mamíferos e mesmo de certos patógenos desenvolveram mecanismos estratégicos de escape que eliminam ou inativam C3‫ ٭‬e impedem a

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organização do complexo C3‫٭‬Bb. C3‫٭‬Bb cliva C3‫ ٭‬em C3a e C3b. Moléculas de C3b, de maneira análoga à C3‫٭‬, interagem com moléculas de fB para formar C3bBb, outro complexo com atividade enzimática. Esta enzima, conquanto de meia-vida mais longa do que C3‫٭‬Bb, torna-se ainda mais estável, quando a ela se liga uma molécula de properdina (P). A enzima C3BbP, vida média da ordem de 10 a 12 minutos, é denominada C3 convertase de amplificação da VA. A amplificação, isto é, organização de C3BbP, favorece o hospedeiro, enquanto a inativação dessa enzima favorece o patógeno. Da clivagem de C3 entre os resíduos Arg 726 e Ser 727 da cadeia-α por essas enzimas resultam dois fragmentos, C3a e C3b, respectivamente de 9 kDa e 186 kDa. C3a induz contração de músculo liso, aumento de permeabilidade vascular, desgranulação de mastócitos e quimiotaxia para leucócitos, sobretudo eosinófilos. É mediador dos eventos iniciais do processo inflamatório agudo. Quando se liga covalentemente na superfície de patógenos ou de imunoglobulinas combinadas com antígenos, C3b é reconhecido por receptores CR1 (CD35) dispostos na membrana celular de fagócitos e de eritrócitos. No primeiro caso funciona como opsonina mediando fagocitose de patógenos e, no segundo, na remoção de imunocomplexos circulantes favorece a multiplicação do patógeno. A inativação requer a intervenção de quatro proteínas distintas denominadas proteínas controladoras da ativação do SC: fator I, fator H, CR1 e MBP (CD46). Essas proteínas atuam colaborativamente entre si. Fator H, CR1 e MBP funcionam como cofatores, facilitando a remoção de um peptídeo, C3f, da cadeia-α de C3b pela enzima fator I. Na superfície das células do hospedeiro que expressam certos poliânions como ácido siálico, fator H liga-se a C3b com maior afinidade que fator B. Aborta-se a organização de C3bBb; protege-se a célula de eventual fagocitose ou lise. Na superfície de patógenos que não expressam poliânions, fator B liga-se com maior afinidade que fator H; favorece-se a formação de C3bBb; expõe o patógeno à fagocitose ou à lise. Amplificação leva à destruição do patógeno e controle da infecção; inativação permite sua sobrevivência e multiplicação.

12.5.4.2 Via de ativação VMBL VMBL envolve os componentes “Lectin-Binding Protein”, (MBL) e as proenzimas associadas MASP-1 e MASP-2 (MBL-associated serine proteases 1 ou 2) e uma proteína de baixo peso molecular sem atividade enzimática cuja função precisa ainda é desconhecida, denominada MAP-19 ou sMAP (small MBL-associated protein). Os componentes da VC, C4 e C2 são os

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alvos das MASP ativadas. O reconhecimento na VMBL é feito pela proteína MBL pertencente á família das colectinas. VMBL é produzida pelos hepatócitos e é encontrada no sangue circulante e em outros fluidos orgânicos. Sua produção aumenta em resposta a infecções e a outras injúrias comportandose como proteína de fase aguda. A molécula de MBL, como as demais colectinas, possui dois domínios distintos, um em forma de haste de estrutura semelhante à molécula de colágeno (colágeno) e outro, multimérico de forma globular que contém a região lectina (lectina) que reconhece carboidratos. Íons de Ca++ são absolutamente necessários para que MBL reconheça e se combine com carboidratos. O domínio lectina, como nos demais membros da família das colectinas, reconhece e interage com carboidratos dispostos de maneira particular sobre a superfície dos patógenos. A sequência de aminoácidos nesse domínio define a conformação e, portanto, o repertório da estrutura do carboidrato que reconhece. Esse detalhe de reconhecimento é importante porque os carboidratos da parede da célula microbiana são claramente distintos dos encontrados na superfície das células eucariotas. Por exemplo, as glicoproteínas presentes em células de mamíferos exibem cadeias laterais contendo galactose e ácido siálico como resíduos mais distais na estrutura da molécula, estruturas que não são reconhecidas por MBL. Portanto, MBL ignora carboidratos de células de mamíferos, isto é, o que é “self” mas identifica carboidratos de células de microrganismos, isto é, o que é “nonself”. MBL é lectina do tipo-C, isto é, íons de Ca++ são necessários para que interaja com o ligante. As formas ativas de MBL são homomultímeros de massa molecular da ordem de 200-600 kDa. Os homomultímeros são constituídos de 2 a 6 subunidades. Na estrutura da cadeia polipeptídica (31 kDa), distinguem-se três regiões: uma região N-terminal rica em resíduos do aminoácido Cys, uma região intermediária semelhante à molécula de colágeno e uma região –COOH terminal que aloja o sítio para reconhecimento de carboidratos, “carbohydrate-recognition domain” ou CRD. Para formar uma subunidade, três cadeias polipeptídicas se acoplam, seus resíduos de Cys da região N-terminal se unem para ligar as cadeias através de pontes dissulfeto e as regiões semelhantes a colágeno se enovelam em tríplice-hélice para formar a haste da qual emergem os três CRD. Para formar homopolímeros, duas ou mais subunidades se ligam também região N-terminal, os mais comuns sendo com dois, três, quatro, cinco e seis subunidades. CRD reconhece um largo espectro de carboidratos ricos em hexoses, tanto não modificadas como manose, fucose, glicose e galactose, como modificadas, entre elas, N-acetilmanosamina e N-acetilglicosamina, expressas em vários micróbios, por exemplo, Pneumocystis carini, Listeria

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monocytogenes, Neisseria meningitidis, vírus da influenza vírus do herpes etc. A baixa afinidade dos CRD para seus ligantes é compensada pela grande quantidade de carboidratos expressos na superfície dos microrganismos, o que permite o envolvimento simultâneo de múltiplos CRD. Microrganismos que expressam carboidratos reconhecíveis por MBL, uma vez adequadamente contendo MBL na superfície, podem ser opsonizados ou lisados. O complexo MBL-ligantes, em presença de íons de Ca++, ativa C4 e C2 e organiza a enzima C4bC2b, a enzima C3 convertase da VC. Para realizar esses eventos, utiliza como substitutos de C1 as proenzimas MASP-1 e MASP-2 (MBL-associated serine proteases 1 ou 2) e uma proteína sem atividade enzimática de baixo peso molecular cuja função precisa ainda é desconhecida, denominada MAP-19 ou sMAP (small MBL-associated protein). Íons de Ca++ são absolutamente necessários para que MBL, MASP1 e MASP-2 e sMAP se mantenham associados. O complexo MB-MASP-1-MASP-2 só exibe atividade de serina protease depois que MBL interage com seu ligante. O domínio enzimático de MASP-1 é homólogo ao de C1r, enquanto o correspondente de MASP-2 é idêntico ao de C1s. Após a interação entre MBL e ligantes, provavelmente por autoativação, um dos MASP se ativa e cliva o outro. Em seguida, MASP-2, como C1s ativado, que exibe atividade de serina -esterase, cliva C4 e C2 por processos semelhantes aos que se passam durante a ativação da VC, descrita a seguir. C envolve os componentes C1, C2 e C4. Íons de Ca++ e de Mg++ são necessários para que sejam ativados.

12.5.4.3 Ativadores de VC a) Imunoglobulinas (Ig): Ig livres, não combinadas com o antígeno não ativam a VC. Domínios que se ligam a C1q, C H 2 de IgG ou C H 3 de IgM estão recolhidos na estrutura terciária do Fc das moléculas de Igs; expõem-se em seguida à interação do anticorpo com o antígeno, tanto em imunocomplexos (ImC) livres como ligados a células. A eficiência dos ImC na ativação do SC depende da relação molecular Ac/Ag. ImC formados nas zonas de excesso de Ac com quatro ou mais moléculas de Ac por molécula de Ag são mais eficientes, enquanto ImC solúveis formados na zona de excesso de Ag praticamente não ativam. b) Proteína A de Staphylococcus aureus: trata-se de proteína de cadeia polipeptídica única com duas partes distintasna região N-terminal há quatro regiões cada uma podendo ligar-se a uma molécula de IgG humana e a parte COOH terminal que ancora a proteína na parede da bactéria.

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Esta proteína tem afinidade para o Fc de imunoglobulinas tanto humanas (IgG1 > IgG2 > IgG) como murinas (IgG2a > IgG2b > IgG3). Complexos formados por duas moléculas de imunoglobulinas e uma de proteína A, como ImC, ativam a VC. c) Proteína-C reativa (PCR): trata-se de uma β-globulina presente em quantidades traços no soro de indivíduos normais que aumenta durante infecções ou doenças inflamatórias (como artrite reumatoide), infarto do miocárdio, injúria do músculo esquelético por reperfusão sanguínea e outras. É sintetizada pelos hepatócitos. Consiste de cinco subunidades idênticas de 20 kDa a 30 kDa não covalentemente associadas e dispostas como pentâmero cíclico. Pertence à família de proteínas denominadas “pentraxin”. Cada uma de suas unidades expressa um sítio de ligação que reconhece sítios de ligação na molécula de fosfatidilcolina, componente do polissacarídio C encontrado em várias espécies de pneumococos. Reconhece também estruturas semelhantes de membranas e de componentes nucleares derivados de células lesadas do hospedeiro. PCR, como os demais ativadores da VC, ativa C1 e organiza C3 convertase; todavia, interfere na subsequente organização da C5 convertase. PCR prepara patógenos para fagocitose, opsonisando-os com C3b, porém não organiza o complexo citolítico C5b-C9 sobre sua superfície. d) Proteína amiloide P do soro e fibrilas da proteína β-amiloide: essa proteína ativa C1 de maneira semelhante à proteína C reativa. e) Certos retrovírus e micoplasmas: esses patógenos ativam C1 in vitro, porém ainda não se sabe a importância desse fenômeno in vivo. VC é iniciada pela interação entre ativadores e C1. O componente C1 inclui os subcomponentes C1q, C1r e C1s, que se associam na forma de um pentâmero, C1q1C1r2C1s2, cujas unidades são mantidas associadas por meio de íons de Ca++, circula livre, potencialmente ativo (menos de 1%) ou inativo (99%) associado a uma molécula do inibidor de C1 (C1in). C1q é a unidade de reconhecimento, enquanto C1r (85kDa) e C1s (85kDa) funcionam como unidades catalíticas. C1q (462 kDa) é constituído de seis subunidades idênticas. Cada subunidade é formada por três cadeias polipeptídicas diferentes, A, B e C, contendo, respectivamente, 223-, 226- e 217- resíduos de aminoácidos. As seis subunidades enovelam-se para formar uma haste semelhante ao colágeno. Da haste projetam-se seis domínios de forma globular, cada um contendo as sequências que se ligam aos ativadores da VC. A molécula de C1 só se ativa quando o subcomponente C1q interage simultaneamente com Fc em dois sítios de ligação vizinhos. Esse fato explica por que ImC

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formados de IgM e de certos isotipos de IgG são mais eficientes para ativar a VC que outros. Nos ImC em que o anticorpo é IgM, mesmo quando com relação Ac/Ag = 1, esta única molécula de IgM poderá fornecer cinco sítios Fc suficientemente próximos para ativar C1. Já nos ImC em que o anticorpo for IgG, a relação Ac/Ag deverá ser no mínimo igual a 2 para que tal ImC interaja com dois sítios globulares de C1q. Dois domínios de forma globular de C1q, no mínimo, têm de se ligar simultaneamente à molécula do ativador para que haja ressonância na molécula de C1q e ocorram as modificações estruturais que levam à ativação autocatalítica de uma das moléculas C1r do complexo C1. Por este processo C1r é clivado, e o fragmento ativo de 28 kDa que retém o sítio de serina-protease cliva e ativa a outra molécula de C1r. As duas moléculas de C1r, agora expressando atividade enzimática de serina-protease, clivam C1s, liberando seu fragmento ativo C1s (28 kDa), também com atividade de serina-esterase. C1In, uma glicoproteína de cadeia única altamente glicosilada de 105 kDa, pertence à família de proteínas que inibem serina-proteases, denominada “serpins”, de “serine proteinases inhibitors”. Contém cerca de 35% de carboidratos ligados na cadeia polipeptídica por ligações N- e O-. A molécula de C1In consiste em uma região globular terminal e de uma haste N-terminal rígida, rica em carboidratos ligados a seis ou sete domínios formados pela sequência Glu(Gln)-Pro-Thr-Thr. No domínio COOH terminal encontra-se uma alça, que contém o centro reativo, muito sensível à proteólise. O centro reativo assemelha-se aos centros reativos encontrados em outras proteínas. O centro ativo, enquanto íntegro, mantém inativos C1r2 e C1s2 ligados a C1q. Nesta situação, suas regiões globulares estão não covalentemente ligadas ao sítio ativo de C1r. C1In tem afinidade para o domínio catalítico de C1r. Duas moléculas de C1 ligam-se a um dímero de C1r e impedem sua ativação. A presença de C1In no sítio ativo de C1r impede a ativação do componente C1. C1In e C1r estão em permanente equilíbrio: continuamente se associam e se dissociam. Em condições normais, apenas 1% de C1In encontra-se livre no plasma. Na presença de ativadores da VC, o complexo C1-C1In se dissocia, C1q liga-se aos domínios adequados do ativador e previne a reassociação C1-C1In. C1 é ativado como já descrito e C1s ativado cliva C4 e C2. Os componentes C4 e C2 são os substratos naturais das enzimas ativadas C1s e MASP-2, que, como vimos, são as enzimas efetoras das vias VA e VMBL. CI e MASP-2, como já vimos, são serina-esterases. C4 é uma glicoproteína de 210

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kDa encontrada no soro na concentração de 200 mg/mL a 600 mg/ mL. Uma ligação tioéster similar à encontrada em C3 encontra-se na sequência Cys 991-Gly-Glu-Glu-994-Gln. Há, na população humana, duas isoformas de C4, C4A e C4B. O grupo tioéster de C4A forma ligação amida com grupos -NH 2 de proteínas; é a isoforma que se liga, preferencialmente, com moléculas de anticorpo em IMCs. C4B, ao contrário, forma ligação éster com grupos –OH de carboidratos; é a isoforma que se liga preferencialmente, na superfície de microrganismos. A diferença funcional entre as duas isoformas de C4 é influenciada pelo resíduo X- 1106, situado em sequência: Asp, isoforma A, orienta para ligação amida; His, isoforma B, orienta para ligação éster. A formação de amida ou de éster previne a hidrólise e estabiliza C4b na superfície do patógeno. Parece ser o mecanismo que orienta o restante da cascata do SC para a superfície do patógeno, lugar onde o anticorpo deveria estar exercendo sua ação. C1 ativado em presença de íons de Mg++ cliva C4 na sequência Arg 76 - Ala 77 da cadeia-a e libera dois fragmentos, C4a e C4b. C4a (8,6 kDa), o segmento N-terminal da cadeia-a, é uma das três anafilatoxinas, difunde-se na fase fluida e exerce suas atividades inflamatórias. C4b (± 201 kDa) retém a maior parte da cadeia-a e as cadeias b e g íntegras. Com a remoção de C4a, a ligação tioéster de C4b expõe-se ao ataque por grupos nucleofílicos. Inativa-se por dois mecanismos: (a) por hidrólise (o produto inativo é referido como iC4b); e (b) pelo fator I, uma serina-protease normalmente ativa que, em conjunção com os cofatores C4bp “C4 binding protein” ou CR1, subcliva C4b e libera o fragmento maior C4c. O fragmento C4d de 380 resíduos de aminoácidos permanece na superfície do patógeno ou do ImC. As moléculas de C4b que sobreviverem, se suficientemente próximas entre si nos ImC livres ou apensos na superfície de patógenos, podem formar ligações covalentes éster ou amida.

12.5.4.4 Via lítica (VL) VL envolve os componentes C5, C6, C7, C8 e C9. Estima-se que as enzimas, C3(H2O)Bb (C3 convertase de iniciação da VA), C3bBbP (C3 convertase de amplificação da VA) e C4bC2b (C3 convertase da VC) produzam e depositem 2 x 106 moléculas de C3b a cada cinco minutos sobre a superfície do patógeno. Essa vasta e rápida saturação da superfície com moléculas de C3b prepara o patógeno para destinos diferentes: moléculas de C3b ligadas,

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porém isoladas, são reconhecidas pelos receptores CR1 (CD35) e fagocitadas; moléculas de C3b que se incorporam nas C3 convertases reorientam os sítios ativos dessas enzimas para clivar C5 e construir o complexo de ataque à membrana (membrane attack complex – MAC). Na construção de MAC, participam as enzimas C3bBbPC3b (C5 convertase da VA) e C4bC2b C3b (C5 convertase da VC) e os componentes C5, C6, C7, C8 e C9. • C5: Proteína de 190 kDa encontrada no soro na concentração de 80 mg/mL. É formada por duas cadeias polipeptídicas, cadeia-a (115 kDa) e cadeia b (75 kDa), ligadas por uma ponte dissulfeto. Compartilha certas regiões de homologia com C3 e C4, mas não possui ligação tioéster. As C5 convertases C3bBbPC3b (da VA) e C4bC2b C3b (da VC) clivam a molécula de C5 na porção N-terminal da cadeia-a e liberam um fragmento de 11 kDa com potente atividade de anafilatoxina, denominado C5a. O restante da molécula, C5b (180 kDa), é constituído pelo fragmento que sobrou da cadeia-a e pela cadeia-b íntegra. O restante da cadeia-a e a cadeia-b permanecem ligados entre si pela ponte dissulfeto. O rearranjo na estrutura tridimensional causado pela clivagem na cadeia-a permite que a molécula de C5b se acomode, sem se ligar, sobre a membrana celular do patógeno. Cada molécula de C5b depositada na membrana celular do patógeno servirá de plataforma para a organização de MAC. • C6 e C7: C5b associado com qualquer das duas C3 convertases na superfície celular do patógeno é lábil. Seus sítios de ligação para o componente seguinte, C6, na sequência de organização de MAC, inacessíveis na molécula íntegra de C5, inativam-se em dois minutos. A ligação com C6 estabiliza esses sítios. C6 é uma proteína de cadeia única de 128 kDa encontrada no soro na concentração de 45 mg/ mL. O complexo C5bC6 não possui atividade enzimática. Sua função é ligar C7, outra proteína de cadeia única de 121 kDa presente no soro na concentração de 90mg/mL. Com a ligação de C7 ocorrem modificações estruturais no complexo C5bC6C7, exposição de varias regiões hidrofóbicas antes recolhidas e protegidas de contato com água da fase fluida fisiológica nas moléculas dissociadas. O complexo C5bC6C7 passa a ser lipofílico e se insere na dupla camada de fosfolipídios da membrana celular ou do envelope viral. O complexo C5bC6C7 que se ligar com imunocomplexos livres não depositados na membrana celular de patógenos ou no envelope viral rapidamente é desligado e se dispersa na fase fluida. Nessa situação, conquanto

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sejam instáveis com meia-vida da ordem de 0,1 segundo, podem, caso encontrem patógenos disponíveis, inespecificamente se incorpor na sua membrana e provocar lise. • C8 e C9: após inserir-se na dupla camada lipídica da membrana celular, o complexo C5bC6C7 funciona como receptor para o componente C8. C8, proteína de 155 kDa, ao contrário das demais proteínas da via comum, é um heterodímero composto de três cadeias, a (64 kDa), b (64 kDa) e g (22 kDa). As cadeias g e a são unidas por uma ponte dissulfeto. A molécula de C8, quando se associa ao complexo C5bC6C7, passa por modificações estruturais que permitem a inserção de sua cadeia-g na membrana celular. De imediato, ocorrem duas consequências: o complexo C5bC6C7 se estabiliza e se formam poros com cerca de 10 Å de diâmetro nos sítios de inserção do novo complexo C5bC6C7C8. Células contendo o complexo C5bC6C7C8 e que expressam esses pequenos poros já são ligeiramente suscetíveis à lise. Lise explosiva só se manifesta depois que moléculas de C9, uma proteína “perforina-símile” de 79 kDa encontrada no soro na concentração de 60 μg/mL, se agregam ao complexo C5bC6C7C8. Moléculas de C9, variando de 4 a 9, polimerizam-se logo que contatam o complexo e completam a estrutura final de MAC, C5bC6C7C8C9(n). Esse complexo se dimeriza e dá origem a um microtubo cilíndrico com cerca de 100 Å de diâmetro que atravessa a bicamada de fosfolipídios da membrana celular e estabelece comunicação entre o meio externo e o citosol. Tal microtubo permite o tráfico de água e de íons, particularmente Ca++, em direção ao citosol, de modo que a célula se intumesce e explode. Determinações feitas por Manfred Mayer (1964) 45 demonstraram que a efetiva inserção de uma única molécula de MAC na membrana celular é suficiente para causar lise da célula. Tal verificação permitiu a elaboração da “one-hit theory”. De acordo com essa teoria, a inserção efetiva de apenas um complexo MAC na membrana celular do patógeno ou de células eucariotas é suficiente para provocar lise e morte celular.

12.5.5 Regulação das vias de ativação As várias etapas da cascata de ativação do SC são reguladas e rigidamente controladas por proteínas reguladoras, ou solúveis na fase fluida ou imobilizadas na membrana da célula-alvo. As proteínas reguladoras agem

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em pontos estratégicos da ativação do componente C1, das C3 e C5 convertases e na organização do complexo lítico C5b-C9. • Regulação da ativação de C1: a ativação do complexo C1 é monitorada pelo inibidor de C1, C1In, uma glicoproteína de cadeia única altamente glicosilada de 105 kDa. Mais informações sobre a estrutura de C1In e sobre como funciona podem ser encontradas na seção sobre ativação de C1 deste capítulo. A organização, ativação e atividade enzimática das enzimas C3 e C5 convertases são monitoradas pelas proteínas C4bp (C4 binding protein), DAF (decay-accelerating factor), CR1 (C3b receptor) e MCP (membrane cofactor protein). À exceção de C4bp, que é envolvida somente no controle de ativação da VC, as demais funcionam nas duas vias. A dissociação espontânea das C3 convertases é potencializada pelas proteínas C4bp, DAF e MCP. As proteínas C4bp e C1R facilitam a degradação por clivagem de C3b e C4b dissociados dos complexos C4bC2b ou C3bBb por fator I, uma serina-protease de duas cadeias polipeptídicas glicosiladas unidas por ponte dissulfeto, encontrada no soro ou plasma na sua forma ativa. A alta especificidade de fator I para C4b ou C3B explica a resistência de outras proteínas plasmáticas à sua ação enzimática; a concentração plasmática normal de C4bp no soro é bem mais elevada do que C4b resultante da dissociação de um único sítio de interação entre C4bpC4b. Assim, na maioria das situações a concentração de C4bp excede significativamente as pequenas quantidades de C4b geradas durante a ativação da VC0, permitindo que C4b seja inativado. A proteína DAF está ligada na membrana dos eritrócitos por uma âncora de glicosilfosfatidilinositol. A única atividade expressa por DAF é dirigida para as enzimas C3 convertases. DAF age, de um lado, facilitando a dissociação das subunidades das enzimas C3bBb e C4bC2b e, de outro, prevenindo a organização dessas enzimas. DAF não possui atividade de cofator para fator I e não exerce funções de receptor, embora possua expressiva afinidade para C3b e C4b. MCP possui potente atividade de cofator, quase que exclusiva, para fator I sobre C3b na fase fluida, ou C3b aderido a moléculas solubilizadas. O fator H humano é sintetizado como cadeia polipeptídica de 1.231 resíduos de aminoácidos; peptidases removem de tal cadeia dois pepetídios, um de 18 resíduos na região -NH 2 -terminal e outro de 2 aminoácidos na região –COOH terminal, resultando na proteína nativa com 1.211 resíduos de aminoácidos. A molécula de fator H nativa contém 9

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sítios potenciais de glicosilação, é organizada em 20 domínios CCPR e funciona como cofator na clivagem de C3b das C3 convertases da VA pelo fator I. A regulação do complexo citolítico C5b-C9 é realizada essencialmente nos níveis da associação de C8 e C9 a C5b-C7. Uma das proteínas ativas nessa regulação, denominada homologous restriction factor (HRF), foi isolada de eritrócitos humanos. HRF é uma proteína de 65 kDa, que, como DAF, está ligada na membrana dos eritrócitos por uma âncora de glicana fosfatidilinositol. Tal proteína está presente também na superfície de plaquetas, neutrófilos e monócitos e possui elevada afinidade para C9. HRF inibe a formação de canais pelo complexo C5b-C8, C5b-C9 e a polimerização de C9. Anticorpos anti-HRF aumentam em cerca de 20 vezes a lise de eritrócitos humanos pelo complexo C5b-6,7,8,9, porém não interfere com a adesão de C5b6-7 aos eritrócitos. Uma outra proteína que inibe a formação de canais na lise causada por ativação do SC, denominada membrane inhibitor of reactive lysis (MIRL), restringe a organização do complexo citolítico C5b-C9 no nível da membrana da célula-alvo. MIRL é uma proteína de 18 kDa a 20 kDa, idêntica ao antígeno CD59, e é encontrada em leucócitos e em células endoteliais

12.5.6 Atividades biológicas derivadas de componentes do sistema complemento Fragmentos mediadores da inflamação e promotores de fagocitose são liberados dos componentes C3, C4 e C5 por enzimas ativadas na cascata de ativação do SC. • Peptídeos mediadores da inflamação: peptídeos com atividade inflamatória são liberados por clivagem enzimática dos componentes C3, C4 e C5, denominados, respectivamente, C3a, C4a e C5a. Esses peptídios reproduzem, in vitro, fenômenos típicos da reação anafilática, como contração espasmódica do músculo liso, seguida de taquifilaxia depois de algumas aplicações da mesma dose; aumento da permeabilidade vascular, quimiotaxia para leucócitos e ativação de certas células particularmente mastócitos com liberação de mediadores como histamina e leucotrienes. Os peptídeos C3a, C4a e C5a são coletivamente designados pelo termo de significação ambígua “anafilatoxinas”, introduzido por Friedberger em 1910 para designar a “toxina

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anafilática” formada no soro por imunocomplexos e que reproduzia alguns sintomas da reação anafilática. C3a é produzido por clivagem de C3 pelas enzimas C3bBbP e C4bC2(C2a-C2b), tripsina e plasmina. Produz edema na pele humana na concentração de 10 -10 a 10 -12 M. Consta de 78 resíduos de aminoácidos, tendo Ser na porção NH 2 terminal e Arg na porção -CooH terminal. A expressão de suas atividades biológicas depende da integridade do oligopeptídio -COOH terminal Leu-Gli-Leu-Ala-Arg. Há no plasma uma carboxipeptidase N, com massa molecular de 300 kDa, que remove o resíduo -COOH terminal Arg de C3a e abole suas propriedades biológicas. Como veremos adiante, no item sobre receptores para fragmentos ativos do SC, esse resíduo de Arg deve participar na ligação de C3a com seus receptores celulares C3a/C4a-R, encontrados em mastócitos, basófilos e fibra muscular lisa. C4a é produzido por clivagem de C4 pela enzima C1s, possui estrutura semelhante ao C3a, mas sua afinidade para receptores celulares é bem inferior à de C3a. C5a resulta da clivagem de C5 pelas enzimas C3bBbP e C4bC2(C2a-C2b), tripsina e plasmina. Além das atividades que exercem C3a e C4a, C5a é um potente fator quimiotático para polimorfonucleares, para basófilos e para macrófagos. Conquanto as atividades biológicas de C3a/C4a e C5a sejam redundantes, C5a se distingue estruturalmente pela presença de um oligossacarídio complexo de mais ou menos 3 kDa contendo de 3 a 4 manoses, 2 galactoses, de 3 a 4 galactosaminas e de 3 a 4 resíduos de ácido siálico apensos ao resíduo de Asp, posição 4 de sua sequência de aminoácidos. Difere, ainda, das duas outras anafilatoxinas pelo fato de preservar sua atividade quimiotática, porém não suas atividades anafilotóxicas após remoção do resíduo Arg-COOH terminal (C5-des Arg). C5a interage com receptores C5a-R. • Opsoninas: moléculas de C3b covalentemente ligadas na superfície de patógenos ou de imunocomplexos livres interagem com receptores da superfície de fagócitos, CR1, CR2, CR3 e Cr4.

12.6 RECEPTORES CELULARES PARA FRAGMENTOS DE COMPONENTES DO SISTEMA COMPLEMENTO Como vimos, da ativação do SC resultam produtos de clivagem biologicamente ativos, alguns maiores outros menores, principalmente dos componentes C3, C4 e C5. Esses produtos, para expressar suas atividades, interagem

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com receptores dispostos na superfície de diferentes tipos celulares. Das interações resultam sinais dirigidos ao citoplasma onde são acionadas diferentes e complexas vias de ativação. Algumas promovem reorganização do citoesqueleto celular que se manifestam na forma de extrusão de grânulos, secreção de produtos, emissão de pseudópodos e movimentação da célula; outras, na ativação em cascatas de enzimas e de mensageiros intermediários que ativam certos genes e produzem mediadores. Os seguintes receptores serão analisados: CR1, CR2, CR3, C1q-R, C3a-R e C5a-R. • CR1 (CD35): este receptor é uma glicoproteína de cadeia única, massa molecular 165 kDa a 280 kDa, com as três regiões, extracelular, transmembrânica e intracelular. Possui alta afinidade para C3b e C4b e, em menor extensão, para iC3b. Os quatro alótipos mais comuns, tipo A (190 kDa), tipo B (220 kDa), tipo C (160 kDa) e tipo D (250 kDa) são codificados por genes localizados em alelos de um único locus. Essas formas de CR1 são difusíveis e espalhadas na membrana celular de fagócitos e eritrócitos. A região extracelular, que interage com os fragmentos C3b e C4b consistem de uma série de complement control protein repeats (CCPR) dispostos em quatro domínios: A, B, C, D (Figura 12.15). Os quatro alótipos de CR1 são identificados pela ausência de determinados CCPR. O número de CR1 varia de 300 a 1.000 nos eritrócitos e de 5.000 a 30.000 nos leucócitos. Como no sangue circulante o número de eritrócitos é cerca de mil vezes maior que o número de leucócitos, mais de 90% do total de CR1 encontram-se nos eritrócitos. CR1 exerce quatro funções: (A) Regulação das C3 convertases: CR1 ao ligar-se com C4b, na C3 convertase da VC, ou com C3b, na C3 convertase da VA, acelera a desativação dessas duas enzimas; funciona como co-fator para o fator I (consultar Seção “Regulação da ativação do SC”). (B) Fagocitose ou endocitose: CR1 é encontrado nos fagócitos macrófagos e neutrófilos; habilita essas células a reconhecer e fagocitar micróbios patogênicos ou endocitar imunocomplexos, opsonisados com iC3b, C3b e C4b (consultar Seção “Fagocitose”); as moléculas de CR1 liberam a partícula fagocitada ou endocitada no fagolissosoma e retornam à superfície do fagócito, prontas para reconhecer novas partículas opsonisadas com fragmentos de C3 ou de C4. (C) Remoção de imunocomplexos do sangue circulante: anticorpos são continuamente produzidos e liberados no sangue circulante, principalmente durante processos infecciosos e doenças autoimunes. Esses anticorpos se combinam com

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os antígenos formando imunocomplexos de diferentes tamanhos e relação molecular antígeno-anticorpo. Imunocomplexos nas zonas de excesso de anticorpo ou de equivalência, ao contrário dos imunocomplexos na zona de excesso de antígeno, ativam eficientemente o SC. Moléculas de C3b agregadas nos fragmentos Fab do anticorpo, participam na eliminação dos imunocomplexos do sangue circulante por dois mecanismos distintos: solubilização dos imunocomplexos dispersos na fase líquida do sangue ou sua adesão nas moléculas de CR1 de eritrócitos. Imunocomplexos menores e quando em pequenas quantidades são eficientemente solubilizados; imunocomplexos maiores e em grandes quantidades são transportados pelos eritrócitos e entregues para macrófagos residentes principalmente dos capilares sinusoides do fígado e baço onde são removidos e destruídos. Nas situações em que há excesso de produção de anticorpos, deficiências de componentes do SC ou do receptor CR1, os imunocomplexos que se formam no sangue circulante depositam-se nos tecidos e causam inflamação. (D) Potencialização do processamento de antígenos: CR1 expresso em linfócitos B e células dendríticas pode participar no processamento e apresentação de antígenos. Esse efeito seria consequência direta da fagocitose e digestão no fagolissosoma de imunocomplexos e micróbios contendo C4bC3b, C3dg, C3d na superfície. Peptídeos microbianos inseridos patógeno ou livres ambos ligados a anticorpos e opsonisados com fragmentos de C3b ou C4b, resultantes da digestão, seriam apresentados sobre produtos de MHC a linfócitos T. • CR2(CD21). Este receptor é uma glicoproteína integral de membrana de cadeia única, massa molecular 140kDa com as três regiões, extracelular, transmembrânica e intracelular. CR2reconhece C3dg e C3g, produtos resultantes da clivagem de C3b. As funções primárias de CR2 são essencialmente as mesmas de CR1: opsonisação, remoção de imunocomplexos da circulação e apresentação de antígenos a linfócitos T. CR2 é encontrado na superfície de linfócitos B e de células epiteliais. Nos linfócitos B participa ativamente no reconhecimento de sinais para estimulação do ciclo celular e da diferenciação. O vírus Episten -Barr (VEB), causador da mononucleose infecciosa aguda, infecta os linfócitos B através de CR2. A proteína gp350/220 deste vírus possui a sequência –EDPGFFNVE-, homóloga à sequência –EDPGKSLYNVEencontrada nos fragmentos C3dg e C3d de C3. C3dg, C3d e VEB provavelmente interagem com CR2 através dessa sequência. CR2 é expresso nos linfócitos B associado com a proteína CD19 formando o

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correceptor CR2/CD19. Este correceptor coopera com o receptor BCR (Ig monomérica ligada à membrana mais o complexo acessório Igα/Igβ requerido para a sinalização intracelular) na indução da resposta do linfócito B. Quando os receptores BCR dos linfócitos B são estimulados pelo antígeno e o CR2 do correceptor está com fragmentos de C3 ligados, a resposta do linfócito B é mais vigorosa. • CR3 (Mac-1; CD 11c/CD18). Este receptor é um heterodímero formado de duas subunidades, as cadeias polipeptídicas a (150 kDa) e b (95 kDa), associadas não covalentemente. Reconhece o fragmento iC3b resultante da clivagem de C3. É encontrado na superfície de leucócitos polimorfonucleares, monócitos e linfócitos. • C1q-R. Este receptor é uma proteína de cadeia única de 65 kDa, encontrada na superfície de linfócitos B, neutrófilos, monócitos, fibroblastos e em plaquetas. Reconhece e interage com domínios situados na porção colágeno-símile de C1q.C3a/C4a-R e C5-R. São encontrados em número elevado em mastócitos, basófilos, eosinófilos e fibras musculares lisas, e em número reduzido em monócitos e neutrófilos. Esses receptores são constituídos de uma cadeia polipeptídica única, caracterizada pela presença de sete domínios hidrofóbicos cada um interposto entre duas regiões hidrofílicas adjacentes. Os sete domínios hidrofóbicos estão inseridos na membrana celular e as regiões hidrofílicas formam seis alças, sendo três na face extracelular e três na intracelular da membrana celular. Na região NH 2 extracelular encontra-se o domínio que reconhece os ligantes C3a/C4a ou C5a. Na face intracitosólica, na alça hidrofílica vizinha da porção COOH terminal encontra-se o sítio de agregação do receptor com a proteína G. A proteína G é formada de três subunidades, α, β e γ. No estado não ativado, as subunidades α, β e γ acham-se unidas entre si; a subunidade α está ligada a uma molécula de GDP (guanosina difosfato). Quando os ligantes C3a/C4a ou C5a interagem com os receptores, a molécula de GDP é fosforilada, transforma-se em GTP e a porção G-α(GTP) se desloca do complexo G-α(GDP)βγ. O complexo G-α(GTP) pode ativar três importantes grupos de proteínas associados à membrana celular: adenilciclase, certas fosfolipases γ e canais de íons. O resultado da ativação da proteína G depende da célula onde houve a interação receptor -ligante: extrusão de grânulos e liberação de mediadores como histamina, produtos derivados do ácido aracdônico, enzimas (mastócitos e basófilos), contração (fibras musculares lisas), ou quimiotaxia, emissão de pseudópodos, movimentação e fagocitose (neutrófilos, eosinófilos e

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macrófagos) A Figura 12.5 resume os principais eventos que ocorrem na ativação do SC*.

12.7 IG IGY A galinha (Gallus gallus), como as aves em geral, produz anticorpos conhecidos como IgM, IgA e IgY. Esses anticorpos, produzidos pelo sistema imune e liberados no sangue circulante, são ativamente transferidos para o ovo. IgM e IgA se concentram na clara e IgY na gema, onde atinge concentrações de 10 mg/L a 20 mg/L. O tempo de transferência de anticorpos IgY do sangue circulante para a gema varia entre 3 a 7 dias. IgY, massa molecular de 167,2 kDa, possui estrutura molecular semelhante a IgG de mamíferos: duas cadeias leves (L) associadas a duas cadeias pesadas (H). Como em mamíferos, cada cadeia L (massa molecular, 18kDa) possui um domínio variável e um constante, enquanto cada cadeia H (massa molecular, 65,1 kDa) possui um domínio variável e quatro constantes. As regiões variáveis (V) das cadeias L e H como em IgG de mamíferos estão justapostas de modo a criar parátopos que reconhecem e se combinam com a região do epítopos do antígeno. A molécula de IgY está esquematicamente representada na Figura 12.6. Como em mamíferos, cerca de 1011 configurações diferentes, bem acima do necessário para cobrir o número de epítopos existentes na natureza, são teoricamente possíveis. Nas aves, a cadeia L das Ig é codificada pelos genes VL (região variável), JL (região de junção) e CL (região constante), enquanto a cadeia H é codificada pelos genes VH, (região variável), JH (região de junção) e DH (região de diversidade). Os genes completos que codificam Ig funcionais se organizam acoplando-se linearmente um em seguida ao outro após eliminação das regiões não codificantes que os separam. As cópias únicas dos genes VL e VH amplificam-se para gerar a diversidade dos anticorpos existentes na natureza por mutação somática pontual, e, em maior extensão, graças a grupos de pseudogenes associados a esses genes. Logo que genes VL e VH se acomodam, os pseudogenes contendo as diferentes variantes substituem as sequências dos genes que codificam VL e VH, processo denominado conversão gênica.

*

A importância do sistema complemento como fonte de mediadores da inflamação e de envolvimento na destruição de patógenos tanto na imunidade natural como na adquirida justifica sua inclusão neste capítulo.

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Figura 12.6 Esquema da molécula da imunoglobulina IgY.

Dados quantitativos Com 150 genes V , 5 genes J e até 10 possíveis uniões VJ juntos, o número total de cadeias leves (L) κ possíveis é de 7.500. Com 80 genes V, 50 genes D e até 100 maneiras diferentes de produtivamente obter-se V-D e D-J, há 2,4 milhões de cadeias pesadas (H) possíveis. Assim, há 7,5 mil x 2,4 milhões, ou 18 bilhões de anticorpos diferentes possíveis, que se acrescem por mutações somáticas, podendo chegar a 10 11 recombinações diferentes. Informações detalhadas encontram-se nas referências12-16. Concentração de anticorpos IgY na gema A concentração de IgY na gema varia de acordo com a raça ou linhagem genética: Single Comb White Leghorn 2,21 ± 0,44 [SD] mg/mL; SLU-1329 1,95 ± 0,48 mg/mL; Rhode Island Red 1,68 ± 0,50 mg/mL (14,0). Parâmetros físico-químicos dos Ac de galinha O ponto isoelétrico da IgY é da ordem de 5,7 a 7,6. Anticorpos IgY são sensíveis a pH ácido da ordem de 3,0 a 4,0 e ao armazenamento por tempos longos a -20 ºC, porém são estáveis a -70 ºC. Tal como anticorpos IgG de mamíferos, anticorpos IgY expressam especificidade, afinidade e avidez

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para o antígeno. A região Fc de IgY, mais longa que a correspondente de IgG de mamíferos é bastante hidrofóbica. Esta propriedade favorece a adsorção de IgY em partículas de látex sem perda apreciável de seu poder de combinar com o antígeno, condição importante para o desenvolvimento de kits de diagnóstico*.

12.8 ANTÍGENOS E IMUNÓGENOS Antígenos (Ag) são substâncias reconhecidas especificamente por receptores dispostos na superfície de Lt, Lb e de Ig. Imunógenos são antígenos que, além de serem reconhecidos, estimulam linfócitos e induzem resposta imune adaptativa. Portanto, todos os imunógenos são antígenos, mas nem todos os antígenos são imunógenos. Ig, Lt e Lb interagem especificamente com o Ag através de receptores. Receptores são proteínas que contêm domínios moleculares que reconhecem e se combinam com domínios específicos na molécula do Ag. Para cada domínio do Ag há um receptor. As moléculas de Ig possuem um (IgG), dois (IgA) ou cinco (IgM) receptores. Os Lt e Lb expressam milhares de receptores na superfície. Cada molécula de Ig, bem como cada clone de Lt e Lb, está equipado com receptores com uma e somente uma configuração molecular, isto é, especificidade. Receptores TCR São proteínas dispostas na superfície de Lts. Constam de duas cadeias, cadeia α e cadeia ß unidas por uma ponte dissulfeto, porém, individualmente inseridas na membrana celular por regiões transmembrânicas, cada uma com o segmento C-terminal curto intracitoplasmático. A cadeia α consta de dois domínios, Vα e Cα intercalados por segmentos retilíneos. A cadeia ß consta de dois domínios, Vß e Cß, também intercalados por segmentos retilíneos. Os quatro domínios são extracelulares. Cinco grupos carboidratos estão ligados nas regiões constantes, três na cadeia ß e dois na cadeia α. O sítio de reconhecimento e combinação com Ag é formado pelo espaço delimitado pelos domínios variáveis Vα e Vß. A periferia desse espaço acomoda parte da molécula do complexo principal de histocompatibilidade (CPH) que *

Imunocomplexos formados com anticorpos IgY não ativam o sistema complemento de mamíferos. O Fc de IgY não interage com receptores celulares para IgG ou IgE dispostos na superfície de células de mamíferos. Esses dois fatos reduzem a incidência de reações falso-positivas quando IgY é usada como imunorreagente. Há mais duas vantagens da IgY sobre Ig de mamíferos como reagente imunobiológico: os processos de produção são comparativamente menos elaborados e o produto final é mais barato.

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está apresentando o peptídeo, e na região central acomoda-se o peptídeo que está sendo apresentado. A combinação entre Ag e TCR não é suficiente para sinalizar a ativação celular. Duas proteínas invariantes, CD3 e ξ, não covalentemente associadas ao TCR formando o complexo TCR, acionam os sinais bioquímicos que induzem a ativação celular. Diferenciação celular e produção de citocinas são os eventos decorrentes da combinação Ag e TCR. Complexo principal de histocompatibilidade (CPH) Este complexo macromolecular é produto de extenso locus genético contendo número enorme de genes cujos produtos foram inicialmente implicados na rejeição de transplantes, mais tarde também como apresentador de Ag aos Lts. Há dois produtos principais do locus CPH: moléculas CPH classe I e classe II. Moléculas classe I recolhem e apresentam peptídeos resultantes da digestão de proteínas de patógenos parasitos intracelulares a Lts CD8 + citolíticos. Moléculas classe II, ao contrário, recolhem e apresentam peptídeos resultantes da digestão de proteínas de patógenos parasitos extracelulares, a Lts CD4+ “helper”. • CPH classe I consiste de duas cadeias polipeptídicas, α (44-47kDa) e ß2 microglobulina (12kDa), unidas não covalentemente. A cadeia α é codificada por genes pertencentes ao locus genético CPH. A cadeia ß2 microglobulina é codificada por genes não pertencentes ao locus genético CPH. Cerca de três quartos da α estendem-se extracelularmente. Contém os domínios α1, α2 e α3 cada um com cerca de 90 resíduos de aminoácidos. Os domínios α1 e α2 formam a plataforma onde se localiza a fenda que acomoda peptídeos de 8 a 11 aminoácidos resultantes da digestão das moléculas de Ag. O domínio α3, está situado mais próximo da membrana celular em paralelo com a ß2 microglobulina. Em sua alça acomoda-se o sítio de ligação de Lts CD8+ citolíticos. O terço restante compreende as regiões transmembrânica e citosólica C-terminal. • CPH classe II consiste também de duas cadeias polipeptídicas, α (32 kDa a 34 kDa) e de uma cadeia ß (29 kDa a 32kDa) unidas não covalentemente. Ambas as cadeias são codificadas por genes pertencentes ao locus genético CPH. Como para CPH classe I, três quartos da proteína estão no lado externo da membrana celular, seguindo-se uma porção transmembrânica e o segmento contendo a região C-terminal no citosol. Os quatro domínios moleculares dispõem-se dois a dois e face a face: α1-ß1 e α2-ß2. A interação α1-ß1constrói a fenda onde se alojam os peptídeos resultantes da digestão de Ag nas células apresentadoras. Como na fenda em CPH classe I, essa fenda apresenta

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também enorme variabilidade na sequência de aminoácidos. A cadeia ß2, como em ß2 microglobulina de CPH classe I, não é polimórfica e contém o sítio de ligação para Lts CD4 + helper. Reconhecimento do Ag e ativação de Lts Peptídeos derivados da digestão do antígeno macromolecular seguem destinos diversos se expressos na superfície das CAA acoplados em produtos CPH classe I ou II. Peptídeos apresentados por produtos classe I interagem com receptor TCR: o peptídeo é reconhecido especificamente pela porção central e as variantes do produto classe I pelas regiões periféricas da fenda do receptor. A combinação entre o complexo peptídeo-produto classe I com o receptor TCR classe I não basta para traduzir os sinais intracelulares de ativação e mediar adesão celular. Esses dois eventos são mediados por moléculas acessórias inseridas na membrana celular de Lts. As proteínas, LFA-1, CD8, CD3, CD2, ξ e CD28 funcionam na transdução de sinais que levam a ativação, resultando na diferenciação de Lt citolítico CD8+. Peptídeos apresentados por produtos classe II interagem com receptor TCR de maneira semelhante à interação receptor TCR classe I. Moléculas de CD3 são substituídas por moléculas CD2. O resultado da ativação é a diferenciação de Lt helper CD4 +. Nos dois casos a adesão célula-célula é mediada pela proteína integrina. Ativação de Lb e produção de anticorpos ou Igs Distinguem-se, esquematicamente, várias fases nos processos de ativação de Lb e produção de anticorpos. Lb virgens através de receptores IgM e IgD expressando sítios combinatórios já organizados reconhecem especificamente moléculas de Ag. O processo de ativação só continua com a cooperação de linfócitos T CD4 + Th que expressam receptores específicos para o mesmo antígeno. Os Lb se multiplicam, diferenciam-se, expandem o clone original e sintetizam Igs. Alguns membros do clone sintetizam IgG, outros realizam mudanças de isotipos de IgG, (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) e de classe (IgG, IgA1 e IgA2 IgE), evidentemente específicos para o mesmo Ag. Membros do mesmo clone adquirem vida longa; são os linfócitos B de “memória”. Ao longo desse processo os anticorpos além de manter a especificidade de reconhecimento do Ag, produzem anticorpos de maior avidez e afinidade. Essas fases de reconhecimento, ativação, diferenciação e maturação dos Lb refletem-se na predominância do isotipo ou classe de Ig e, na quantidade, avidez e afinidade dos anticorpos.

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Combinação entre Ag e Ac Os Ac reconhecem regiões da molécula de Ag através das regiões hipervariáveis localizadas nos fragmentos Fab da molécula de Ig. A ligação Ac-Ag resulta da interação de várias forças não covalentes: pontes de hidrogênio, forças de Wan der Waals, ligações hidrofóbicas e ligações electrostáticas ou iônicas. Ac bivalentes (IgG), isto é, com dois Fabs, colocados em presença do Ag específico que expresse pelo menos dois determinantes antigênicos, formam imunocomplexos cujo tamanho e conformação vão depender da proporção em que Ac e Ag foram confrontados. Na predominância Ac cada uma de suas moléculas se combina com uma molécula de Ag. Formam-se imunocomplexos pequenos com predominância de moléculas de Ac. Quando moléculas de Ac e Ag estão em proporções equivalentes, cada molécula de Ac pode se combinar com duas moléculas de Ag. Como a mesma molécula de Ag pode se ligar com Fab de uma mesma molécula de Ac, os imunocomplexos resultantes se interligam na forma de rede. Os imunocomplexos resultantes são grandes e se precipitam. Na predominância de Ag cada duas de suas moléculas se combinam com uma molécula de Ac. Formam-se imunocomplexos pequenos com predominância de moléculas de Ag. Esses dados podem, teoricamente, ser obtidos para qualquer sistema de Ac e Ag. O método experimental consiste, basicamente, em incubar sob condições de pH (de 7,2 a 7,5), força iônica (0,15), e tempo, (de 30 a 60 minutos) que permitam a combinação Ac-Ag, quantidades variáveis de Ag com uma concentração fixa de Ac. Os imunocomplexos precipitados são dosados, as quantidades de Ac são calculadas e as relações Ac/Ag determinadas. Na zona de excesso de Ac todas as moléculas de Ag são precipitadas, sempre restando moléculas de Ac livres. Na zona de equivalência todas as moléculas de Ac e de Ag são precipitadas. Na zona de excesso de Ag todas as moléculas de Ac são precipitadas, sempre restando moléculas de Ag livres. Essa reação de precipitação permitiu conhecer os princípios básicos que regem o reconhecimento e combinação entre moléculas de Ac e Ag. As variantes, reações clássicas de imunodifusão, imunoeletroforese, fixação de complemento, bem como variantes modernas que usam sinalizadores quantificáveis como radioisótopos, o sistema biotina-avidina, enzimas como “horseradish peroxidase”, fosfatase alcalina, e b-galactosidase, e fluorocromos como fluoresceina, rhodamina, e phycoerythrina, primeiro permitem que Ac e Ag se combinem para depois quantificar indiretamente o imunocomplexo já formado.

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12.9 PRODUÇÃO DE AC Ac são parte importante do arsenal de reagentes rotineiramente usados no diagnóstico, e, em menor escala, no tratamento de doenças. Dois métodos já padronizados permitem obter Ac em larga escala: tradicional para produção de Ac policlonais e de hibridomas para produção de Ac monoclonais.

12.9.1 Método tradicional Consiste em imunizar animais com misturas do Ag para o qual se deseja obter Ac, coletar o soro depois da imunização e em seguida purificar os anticorpos. Os Ag devem ser preferencialmente purificados e incorporados em misturas de adjuvantes imunológicos. O animal de escolha para produzir os Ac, o esquema de imunização, as quantidades de Ag, o número de imunizações, as vias de inoculação e os intervalos entre duas imunizações consecutivas dependem do objetivo do projeto. Ag purificados focalizam a resposta imune na produção dos Ac desejáveis. Adjuvantes imunológicos potencializam a resposta imune favorecendo a produção de maiores quantidades de Ac. Este método permite obter grandes quantidades de Ac. Os Ac obtidos são policlonais. Vantagens e desvantagens de AcP Na imunização de animais produtores de Ac com molécula integral de Ag, numerosos clones de células B respondem, cada clone específico para um epítopo, a coleção total de epítopos produzem anticorpos com diferentes especificidades. A mistura final, complexa, contém enorme população de Ac com distintas sequências de aminoácidos, cada Ac em quantidades relativamente pequenas. Essa mistura é vantajosa quando se deseja controlar infecções in vivo pelas múltiplas possibilidades de ataque ao patógeno. Permite também identificar in vitro moléculas de Ag como um todo, por não ser restrita a um ou outro epítopo. Mutações pontuais que eliminem ou modifiquem determinados epítopos não impedem o reconhecimento dos demais não afetados. O uso de Ac policlonais é limitante quando o propósito é identificar determinado epítopo disperso na molécula de Ag. O reconhecimento simultâneo de outros epítopos falseia o resultado final. A remoção de Ac indesejáveis além de não garantir completa remoção, demanda tempo e é onerosa. Além disso, os títulos de Ac obtidos variam mesmo quando se usa animal geneticamente idêntico na imunização.

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12.9.2 Método de hibridomas Milstein e Köhler 3 uniram uma célula de mieloma murino com um Lb cuja especificidade da Ig produzida era conhecida. Em uma mesma célula híbrida a eventual ilimitada capacidade produtora de Ig da célula de mieloma foi associada com a especificidade de um Lb obtido de animal imunizado com o Ag desejado. A célula híbrida foi batizada como hibridoma. Com o sucesso, obtiveram o prêmio Nobel em 1984. As várias linhagens de mielomas foram obtidas a partir de um tumor induzido por injeção de óleo mineral via intraperitoneal em camundongos BALB/c, o qual foi chamado de MOPC-1 (do inglês, mineral oil-induced plasmacytoma, plasmocitomas induzidos por óleo mineral). Essas células tumorais foram então adaptadas a meios de cultura onde puderam se dividir de maneira intensa, recebendo o nome de MOPC-21. Atualmente, existem várias linhagens de plasmocitomas derivadas deste tumor inicial, com especificações particulares de sobrevivência conferidos pelos defeitos nas vias de síntese de nucleotídeos que lhes foram induzidas. A partir destes defeitos, é realizada a seleção do plasmocitoma que se fundiu com sucesso ao linfócito B de interesse, sobrevivendo assim aos meios e seleção, onde a sobrevida é fornecida pelas células normais, de modo que somente os híbridos podem continuar crescendo. Além disso, os genes das células de mieloma tornam esses híbridos imortais17. Camundongos foram imunizados com duas doses do Ag selecionado. Cinco a sete dias depois da segunda imunização, época em que os Lbs estariam ativados, os baços foram recolhidos e os Lbs foram isolados. Estas células, como toda célula normal, usam tanto a “via síntese de novo” que constrói nucleotídeos como a “via síntese de salvação” que utiliza fragmentos resultantes de degradação normal de moléculas de DNA na construção de novos nucleotídeos. Assim, na presença de inibidores estratégicos como aminopterina que bloqueia a via síntese de novo, a célula sobrevive usando a via síntese de salvação para sintetizar seus nucleotídeos. A via síntese de salvação depende da atividade das enzimas hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HGPRT) que utiliza hipoxantina exógena para a geração de guanosina monofosfato (GMP), da adenosina monofosfato (AMP) e de timidina quinase (TK), que utiliza timidina para gerar timidilato. Se as células são incubadas em meio contendo aminopterina, inibidor da via síntese de novo, mas suplementado com hipoxantina e timidina, somente as células capazes de expressar as duas enzimas HGPRT e TK irão sobreviver. Ao contrário, células deficientes nessas enzimas irão morrer na presença de

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aminopterina, uma vez que tanto a via síntese de novo como a via síntese de salvação para síntese de nucleotídeos não estarão funcionando. Como resumido a seguir, a escolha judiciosa dos parceiros de fusão celular assegurará a sobrevida das células híbridas desejadas. O método de produção de AcsMs consiste nas eguinte etapas: (a) Imunizar camundongo com o Ag-X. (b) Isolar células Lbs ativadas (HGPRT +, Ig+ e TK+) do baço. (c) Isolar células de mieloma (HGPRT-, Ig- e TK-, imortalizadas). (d) Fazer a fusão entre Lbs e células de mieloma por meio de polietilenoglicol ou vírus Sendai. (e) Identificar os clones sobreviventes que expressem simultaneamente HGPRT+, Ig+ e TK+, imortalizadas, e que secretem Ig. (f) Selecionar os hibridoma que secretam a Ig específica para o Ag-X. (g) Reclonar e expandir os hibridomas selecionados cultivando as células de hibridoma in vitro e coletando os AcsMs secretados no meio de cultura. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser injetadas na cavidade peritoneal de camundongo geneticamente compatível, e os AcsMs podem ser recolhidos no líquido ascítico. Os AcsMs são purificados usualmente por cromatografia de afinidade. Vantagens e desvantagens de AcsMs Hibridomas em cultura de células podem produzir cerca de 10 μg a 100 μg de Ac/mL de cultura. Hibridomas injetados na cavidade peritoneal de camundongos geneticamente compatíveis produzem líquido ascítico contendo cerca de 1 mg a 25 mg de Ac/mL. Os hibridomas podem ser expandidos e mantidos por tempo quase ilimitado garantindo permanente fonte do mesmo Ac. Os Ac monoclonais permitem identificar epítopos específicos em moléculas de Ag solúveis ou ligadas em células ou tecidos. Essa propriedade, aliada à grande quantidade que o método permite obter, facilita a construção de reagentes para purificar Ac, Ag ou imunocomplexos Ag-Ac. Uma qualidade adicional dos AcsMs emergiu com o desenvolvimento de estratégias de inserir segmentos VH e VL de suas regiões hipervariáveis pelo método CDR-grafting nos segmentos CH e CL de Ig humana para obter anticorpos humanizados.

12.10 MÉTODOS PARA DETECTAR E QUANTIFICAR AC Os métodos clássicos de imunoprecipitação, aglutinação e de fixação de complemento desenvolvidos e usados durante a evolução da imunologia serviram de base para o desenvolvimento de métodos modernos que ocuparam

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o espaço tanto em pesquisa como em imunologia clínica: Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Western blotting (WB), immunofluerescence assays (IFA), radioimmunoassays (RIA), antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC), immunoelectrophresis (IE), equlíbrio por diálise (EpD), entre outros menos usados. Decidimos, em função dos propósitos deste capítulo, descrever com certos detalhes três deles: Imunoprecipitação, equilíbrio por diálise e cromatografia de afinidade. O primeiro por ser a base molecular da interação entre Ac e Ags; o segundo, por sua aplicabilidade na tecnologia de hibridomas.

12.10.1 Imunoprecipitação (RP) Estudos quantitativos da reação de precipitação foram iniciados e desenvolvidos por Michel Heidelberger e Kendall18, em 1936. Esses pesquisadores usaram como Ag, polissacarídeos de Pneumococos e Ac produzidos em coelho. Como na época a dosagem de proteínas era feita pelo método trabalhoso, mas preciso, de dosagem de N total, a restrição de proteínas nos imunoprecipitados facilitava, e sobretudo precisava, a quantificação da relação Ag/Ac nos imunoprocipitados. Operacionalmente, a reação de RP é feita adicionando-se a um volume de Ac diferentes quantidades de Ag. Após incubação por tempo e em temperatura desejáveis, os imunocomplexos são lavados e os teores de proteínas em cada precipitado são dosados. Com os valores de proteínas totais obtidos quatro parâmetros são identificados em cada amostra ensaiada: (1) quantidades de imunoprecipitados (Ag + Ac) em proteínas totais; (2) quantidades de Ac (por subtração do valor total de Ac-Ag os valores conhecidos do Ag); (3) a relação em massa molecular Ac/ Ag (Ag, variável de Ag para Ag e Ac, em torno de 160 mil para a maioria das espécies); e (4) as relações molecular Ac/Ag dividindo-se a relação em massa pelo quociente obtido da divisão do peso molecular de Ac pelo peso molecular do Ag. Projetando-se em coordenadas os valores obtidos de cada relação Ag/Ac, Ac em ordenada e Ag em abscissa, na curva de precipitinas obtida, distinguem-se três regiões: excesso de Ac, equivalência e excesso de Ag18 (Tabela 12.1 e Figura 12.7). Com a publicação dos dados e conceitos recolhidos da reação quantitativa de precipitinas, a interação entre moléculas de Ac e Ag fundamentou a imunologia como ciência. O reconhecimento de Ag, que antes era referido em termos frouxos de “maior diluição”, passou a ser referido em termos de unidades precisas. A imunologia deixou de ser “sorologia”.

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Tabela 12.1 Dados da reação de imunoprecipitação

AG

PRECIPITADO (AG-AC)

AC

RELAÇÃO AC/ AG PONDERAL

RELAÇÃO AC/ AG MOLAR

TESTE DOS SOBRENADANTES

9

156

147

16,2

4

Excesso de Ac

40

526

486

12,2

3

Excesso de Ac

50

632

582

11,6

2,9

Excesso de Ac

74

794

720

9,7

2,4

Nem Ag nem Ac

82

830

748

9,1

2,3

Traços de Ag

90

826

739

8,5

2,1

Excesso de Ag

98

820

731

8,2

2

Excesso de Ag

124

730

643

7,4

1,8

Excesso de Ag

307

106

Excesso de Ag

490

42

Excesso de Ag

A Tabela 12.1 exibe reação de imunoprecipitação usando o sistema Ag (ovalbumina) e Ac (soro de coelho imunizado com ovalbumina). Diferentes quantidades de Ag foram individualmente adicionadas a tubos contendo 1,0 mL de Ac. Após incubação a 4 °C durante 24 horas, os tubos foram centrifugados e os sobrenadantes e precipitados foram recolhidos. Os precipitados foram lavados com solução de NaCl a 0,15 M por três vezes e resuspensos em 1,0 mL de NaCl a 0,15 M. O conteúdo de nitrogênio proteico em cada amostra foi determinado pelo método de micro-Kjeldahl convertido em proteínas e os valores obtidos indicados na coluna “Precipitado (Ag-Ac)”. Ag e imunoprecipitados são referidos em µg de proteinas. De cada valor da coluna “Precipitado (Ag-Ac)” foram subtraídos os valores de Ag correspondentes obtendo-se os valores de Ac. A coluna “Relação Ac/Ag ponderal” em cada amostra-teste foi calculada dividindo-se os valores de Ac pelos correspondentes valores de Ag. A relação molar e Ac/Ag foi obtida dividindo-se a relação ponderal pelo quociente dos pesos moleculares do anticorpo e do antígeno (160.000/40.000 = 4). Ag e Ac não precipitados foram pesquisados nos sobrenadantes e indicados na coluna “Teste dos sobrenadantes”18. Essa técnica permite isolar ou detectar Ag presentes em baixa concentração em misturas complexas de proteínas. Ac específico, preferencialmente Ac monoclonal por conter Ac exclusivo para o Ag que se deseja identificar, é

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Figura 12.7 Curva da reação de recipitinas.

adicionado na mistura de proteínas. Em seguida, os imunocomplexos formados são removidos da solução adicionando à mistura reagente imobilizado em partículas insolúveis ao qual o imunocomplexo irá ligar. Esse reagente poderá ser proteína A (reconhece Fc do isotipo IgG) ou G (reconhece Fc de outros isotipos de Ig) de Staphylococcus, ou Ac de outras espécies que reconhecem Fc do Ac ligado aos imunocomplexos. As partículas são isoladas por centrifugação, lavadas e o Ag ligado aos imunocomplexos é liberado com substâncias que rompem a ligação Ag-Ac, como guanidina-HCl, tiocianato de sódio ou dietilamina, que abaixam drasticamente o pH para 3,0 ou o elevam para 11,5, ou elevam a força iônica*.

12.10.2 Equilíbrio por diálise Este método permite avaliar quantitativamente a interação Ag-Ac em que Ag é de baixo peso molecular classicamente referido como hapteno (H). Um *

O poderoso e vasto arsenal de recursos atualmente disponíveis que usam Ac como ferramenta identificadora de moléculas fundamenta-se em dados e conceitos recuperados e definidos da reação de precipitação.

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mililitro da fonte de Ac (soro, Ig purificada, Acm etc.) é colocada em um tubo de diálise e colocado para dialisar contra 1,0 mL de solução 0,15 M de NaCl contendo quantidade cnhecida de H. A diálise é feita sob agitação até que as concentrações de H dentro e fora do tubo de diálise atinjam o equlíbrio. A operação controle é feita em paralelo, trocando a fonte de Ac por equivalente usando com Ac dirigido para Ag diferente. Determina-se a concentração de H livre não agregado ao Ac. Subtraindo-se a concentração de H livre após a diálise da concentração de H inicial, obtém-se a concentração de H combinado ao Ac. Conhecendo-se as massas moleculares do reagente fonte de Ac e de H, calcula-se o número de moles de H combinado com um mole de Ac. Com esses dados realiza-se estudo da reação H-Ac. Ac+H ←→AcH, cuja constante de associação pode ser calculada pela lei de ação das massas: K= AcH/(Ac)(H). Se a valência de Ac for representada por n, o número de moléculas H ligadas, e c a concentração de Ac: K= r/(n-r)c, usando-se esses dados, constrói-se a equação de Scatchard, r/c=Kn-Kr, cuja projeção em gráfico permitirá determinar a constante intrínsica de associação Ko da interação H-Ac.

12.10.3 Cromatografia de afinidade Moléculas de Ac ou Ag podem ser covalentemente ligadas a uma partícula sólida, usualmente agarose. As partículas de agarose contendo Ac ou Ag designadas adsorventessão colocadas em uma coluna de cromatografia. As moléculas alvo do isolamento, Ag ou Ac designadas ligantessão adicionadas

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na coluna em fluxo suficientemente lento para otimizar a adsorção. Ao “adsorvente” Ac adiciona-se o ligante Ag e vice-versa. Após lavagem para remover substâncias não adsorvidas, procede-se a liberação do “ligante” com tampão em pH 3,0 ou 11,5. Essa técnica é usada para purificar Ac tanto AcsPs como AcsMs.

12.11 HUMANIZAÇÃO DE AC O objetivo é produzir Ig que retenha as qualidades de especificidade e afinidade da Ig murina original obtida pela técnica de AcM, com redução, e se possível abolição, da imunogenicidade para o sistema imune humano. Métodos anteriores substituíam os domínios constantes da molécula murina doadora de AcM por correspondentes humanas resultando numa quimera com cerca de 70% de sequências humanas19. O aprimoramento seguinte foi a substituição de domínios das regiões C e H murinas pelas correspondentes humanas, conseguindo-se reduzir, em média, 90% da imunogenicidade do AcM murino para o sistema imune humano20,21.

12.11.1 Método de Phage Display (PD) Fundamentos PD é uma técnica que usa informações genéticas aleatoriamente embutidas no genoma de bacteriófagos para identificar proteínas, peptídeos ou DNA. Bacteriófago é o componente-chave da técnica. A identificação baseiase em interações configuracionais entre imagem real da molécula-alvo e imagem especular disposta em uma das milhões de moléculas-identificadoras. Moléculas-alvo são proteínas, peptídeos ou DNA motivo do estudo, que se deseja detectar, isolar e multiplicar; moléculas-identificadoras são proteínas e/ou DNA naturalmente expressas no genoma do fago. Essa técnica foi descrita em 198522. A superfície de bacteriófagos possui um sistema para expressar (poli) peptídeos (fenótipo) que estão fisicamente ligados ao segmento de DNA de seu correspondente gene (genótipo). Esta ligação é conseguida por clonagem do gene estranho em fusão com a proteína do fago usualmente pIII e pVIII. O fago tem forma cilíndrica, 2.000 nm de comprimento e 6 nm de diâmetro e um coat de proteína revestindo o genoma. As proteínas coat dispõem-se da seguinte maneira: moléculas de pIII, em uma das extremidades entremeadas

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com moléculas de pVI; moléculas de pVII e pIX entremeadas na outra extremidade; e moléculas de pVIII dispostas em paralelo revestindo o restante do corpo do fago. pIII é composta dos domínios N1, N2 e CT conectadas entre si por peptídeos ligantes ricos em glicina23. As moléculas alvo dentro desta proteína são usualmente inseridas na posição 249 de pIII na região do peptídeo ligante entre CT e N2, posição 198 dentro de N2 e na posição N-terminal de pVIII, que é a principal proteína do fago. pVIII é o principal ligante de alvos peptídeos. pVI é a fonte de de cDNA na biblioteca do fago PIII23. Protocolo geral A tecnologia de PD empregada na identificação de polipeptídeos que se ligam com alta afinidade em uma desejada molécula-alvo de outra proteína ou de DNA obedece a seguinte ordem: 1) A biblioteca de phage-display é submetida à adesão na superfície interna de poços de microplacas. Populações de biblioteca de phage-display não aderidas são removidas por lavagens. 2) Phage-display aderidas podem ser retiradas e usadas para infectar bactérias hospedeiras adequadas visando obter mais phage-display. Os novos fagos formam uma nova população de fagos mais pura. 3) Os DNA desses fagos são isolados, sequenciados e as sequências obtidas emparelhadas com as respectivas sequências do DNA recuperado do genoma que codifica as proteínas ou peptídeos (fenótipo) que aderiram ao fago. Para assegurar que os fragmentos estão inseridos em todos os três reading frames, de modo que o fragmento de cDNA seja transladado no próprio frame, múltiplos sítios de inserção são em geral ligados. O gene do fago e o segmento de DNA híbrido são a seguir inseridos, processo referido como transdução, em cepas de Escherichia coli (E. coli), comumente usada nesse processo, tais com TG1, SS320, ER2738, ou XL1-Blue E. coli. Se o vetor phagemid for usado, partículas de fago não serão liberadas das células de E. coli até que sejam infectadas com helper phage. Esta infecção adicional auxilia no empacotamento do phage DNA e subsequente organização dos virions maduros contendo fragmentos da proteína de interesse como parte da proteína do coat do fago ligada a pIII ou pVIII. Essas operações são facilitadas imobilizando os alvos DNA ou proteína na superfície de uma microtiter plate. Fagos que exibem a proteína que se liga a um desses alvos em sua superfície são retidos, enquanto os demais serão removidos por lavagens. Fagos retidos são recuperados e usados para

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produzir mais fagos infectando bactérias com helper phage. Ciclos repetidos dessas etapas são referidos como panning, (em referência à purificação de ouro por remoção de impurezas). Fagos recuperados na etapa final podem se usados para infectar bactérias hospedeiras adequadas que servirão de fonte de phagemids. Amostras de DNA relevante podem ser obtidas de phagemidse sequenciadas para identificação das proteínas ou peptídeos que se interagem. A etapa em que se usa helper phage pode ser eliminada pela tecnologia de bacterial packaging cell line technology 24. Aplicações da técnica de PD Identificação das moléculas parceiras, proteína ou DNA, que interagem. A molécula da proteína-alvo de identificação é imobilizada em superfície insolúvel. A molécula de DNA faz parte da biblioteca vasta do fago25. Recursos de bioinformática utilizados em PD Bases de dados e programas “mimotopes” são recursos importantes usados em PD26-28.

12.12 ESTRATÉGIA PARA A PRODUÇÃO DE AC MONOCLONAIS HUMANOS (ACSMSH) Como visto em tópicos iniciais deste capítulo, as estruturas da porção variável da molécula de Ig origina-se da combinação aleatória de segmentos gênicos que codificam as regiões variáveis V H, diversidade DH e ligação JH da cadeia pesada (H) e VL e JL da cadeia leve (L). Essas combinações ocorrem durante as fases iniciais de maturação de linfócitos B 2,42. Considerando-se apenas o número estimado destes segmentos, mais de 107 sítios diferentes de ligação de antígenos poderia ser gerado. Esses valores crescem com a adição ao processo de outras fontes de geração de diversidade, como a resultante da própria inserção espacial e de mu tações somáticas. Importantes informações sobre a expressão das diferentes diversidades do repertório de regiões variáveis de Ig humanas ao longo da maturação de linfócitos B foram obtidas de análises de bibliotecas de cDNA construídadas a partir RNAm total preparado de linfócitos B individuais26-28. A associação dessas informações permitiu desenvolver estratégia para clonar e expressar Ac produzidos por linfócitos B oriundos de um único clone original32.

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12.12.1 Método de hibridoma e imortalização celular Conquanto as tecnologias de hibridomas e de imortalização de células B humanas com EBV sejam as mais usadas para gerar AcMH, ambas apresentam inconvenientes operacionais. A eficiência de transformação é baixa, da ordem de 1% a 3%, necessita de estimulação prévia e depende do estado de maturação da célula29,30. O aprimoramento mais recente foi o desenvolvimento da tecnologia de clonagem de genes de Ig de uma única célula B humana31. Esse método é de alta eficiência para produzir AcMH derivados de células B individuais em qualquer estágio de desenvolvimento. Informações detalhadas sobre este processo de clonagem das regiões V e C de Ig humana foram obtidas. A expressão de genes IgH e IgL é feita em vetores distintos, permitindo substituições de cadeias IgH e IgL quando for necessário determinar a detecção e a comparação nos ensaios de reatividade com os epítopos antigênicos. A eficiência das células HEK 293 transfectadas para produzir Ac é alta, da ordem de 1 µg/mL a 20 µg/mL de Ac liberado no sobrenadante de cultura celular e de 10 µg/mL a 80 µg/mL por lipossoma. Esses dados são comparáveis usando dados obtidos com linhagens de células B estáveis e com contribuição relativa de cada uma na expressão nos níveis de reatividade do Ac resultante32. Os procedimentos orientados para produção de AcsMsH obedecem à seguinte ordem. (A) Obtenção de populações de células B que expressem BCR com especificidade de reconhecimento para um único epítopo Amostras enriquecidas de células mononucleares (CM) são isoladas do sangue ou da medula óssea e purificadas pelo método de Ficoll-Paque em gradiente de centrifugação. O enriquecimento das amostras de CM é feito pelo método RosetteSep human B cell enrichment antibody cocktail (Stemcell Technologies Inc.). Esta técnica favorece a interligação entre células não-B com componentes expressos na superfície de eritrócitos (Er), formando “imunorrosetas”. Em seguida, as células são depositadas na superfície de um gradiente de concentração e centrifugadas. Durante o processo de centrifugação, as imunorrosetas e Er livres vencem a resistência do gradiente e se depositam, enquanto as células B livres, menos densas, permanecem isoladas livres acima do gradiente. Podem ser recuperadas em suspensões quase homogêneas. No caso de as amostras de células conterem baixo número de células B, a população dessas células pode ser enriquecida tratando a suspensão celular original com anti-CD19 magnetic beads (Miltenyi Biotech). Subpopulações de células B são identificadas corando amostras das

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células B purificadas com anti-human antibodies (Becton Dickinson), diretamente conjugados alternativamente com fluorescein-isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE), allophycocyanin (APC) ou biotin. As células B isoladas expressam os seguintes fenótipos: Células B da medula óssea Pré-imaturas: CD19 + CD34 – CD10 + IgM−. Imaturas: CD19 + CD34 – CD10 + IgM+. Células do sangue Recém-migradas: CD19 + CD10 + CD27 – IgM+. Maturas virgens: CD19 + CD10 − CD27 − IgM+. Memória-IgM: CD19 + CD10 − CD27 + IgM+. Memória IgG+: CD19 + CD10 − CD27 + IgG+. (B) Clonagem e expressão de AcMH Os genes das cadeias IgH e IgL são amplificados por Real-Time-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). RNA total de células B individuais é extraído em água livre de nucleases, misturado com quantidades adequadas de “hexamers primers” (pd(N)6 selecionados ao acaso, de cada nucleotídeo dNTP-Mix, de DTT, de RNAsin, de inibidor de sonda de RNase e de transcriptase reversa de Superscript III. A transcrição reversa é feita sucessivamente a 42 °C durante 10 minutos, 25 °C durante 10 minutos, 50 °C durante 60 minutos e 94 °C durante 5 minutos. Amostras do cDNA obtido são armazenadas a -20 °C. Os transcritos gênicos IgH, Igλ e Igκ são amplificados independentemente por Polymerase Chain Reaction (PCR), começando com cDNA servindo de molde. Todas as reações de PCR são realizadas na presença de cada primer isolado ou de misturas delineadas de primers, e de dNTP Taq DNA polimerase. Cada PCR é feita em 50 ciclos a 94 °C/30 segundos, 58 °C/30 segundos (quando IgH ou gκ) ou 60 °C/30 segundos (quando Igλ). A Tabela 12.2 inclui as sondas usadas, e a Figura 12.8 resume a estratégia usada na clonagem e expressão de Ac monoclonais humanos. Tabela 12.2 Sequência dos primers utilizados na produção de AcMH

FORWARD PRIMER

SEQUÊNCIA 5’ - 3’

5’ AgeI VH1

CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG

5’ AgeI VH1/5

CTGCAACCGGTGTACATTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG

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FORWARD PRIMER

SEQUÊNCIA 5’ - 3’

5’ AgeI VH3

CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGGTGGAG

5’ AgeI VH3-23

CTGCAACCGGTGTACATTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAG

5’ AgeI VH4

CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAG

5’ AgeI VH 1-18

CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTTCAGCTGGTGCAG

5’ AgeI VH 1-24

CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTCCAGCTGGTACAG

5’ AgeI VH3-33

CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAG

5’ AgeI VH4-3-9

CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGCTGCAGCTGCAGGAG

5’ AgeI VH6-1

CTGCAACCGGTGTACATTCCCAGGTACAGCTGCAGCAG

5’ AgeI Vκ 1-5

CTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCCAGATGACCCAGTC

5’ AgeI Vκ 1D-43

CTGCAACCGGTGTACATTGTGCCATCCGGATGACCCAGTC

5’ AgeI Vκ 2-24

CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACCCAGAC

5’ AgeI Vκ 2-28

CTGCAACCGGTGTACATGGGGATATTGTGATGACTCAGTC

5’ AgeI Vκ 2-30

CTGCAACCGGTGTACATGGGGATGTTGTGATGACTCAGTC

5’ Age Vκ 3-11

TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC

5’ Age Vκ 3-15

CTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATAGTGATGACGCAGTC

5’ Age Vκ 3-20

TTGTGCTGCAACCGGTGTACATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT

5’ Age Vκ 4-1

CTGCAACCGGTGTACATTCGGACATCGTGATGACCCAGTC

5’ AgeI Vλ 1

CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTGACKCAG

5’ AgeI Vλ 2

CTGCTACCGGTTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAG

5’ AgeI Vλ 3

CTGCTACCGGTTCTGTGACCTCCTATGAGCTGACWCAG

5’ AgeI Vλ 4/5

CTGCTACCGGTTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTGACTCA

5’ AgeI Vλ 6

CTGCTACCGGTTCTTGGGCCAATTTTATGCTGACTCAG

5’ AgeI Vλ 7/8

CTGCTACCGGTTCCAATTCYCAGRCTGTGGTGACYCAG

REVERSE PRIMER

SEQUÊNCIA 5’ - 3’

3’ SalI JH 1/2/4/5

TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG

3’ SalI JH 3

TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTG

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FORWARD PRIMER

SEQUÊNCIA 5’ - 3’

3’ SalI JH 6

TGCGAAGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTG

3’ BsiWI Jκ 1/4

GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC

3’ BsiWI Jκ 2

GCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTC

3’ BsiWI Jκ 3

GCCACCGTACGTTTGATATCCACTTTGGTC

3’ BsiWI Jκ 5

GCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTC

3’ XhoI Cλ

CTCCTCACTCGAGGGYGGGAACAGAGTG

Nota: as sequências sublinhadas referem-se aos sítios de restrição. Tabela elaborada com base na Figura 2 de Tiller, et al. (2008)31.

(C) Análise por RT-PCR de uma única célula B e amplificação de gene de Ig Usando RNA total de uma única célula foi sintetizado o cDNA. Amostras desse RNA total são obtidas por metodologia usual simplifidamente na seguinte ordem: transcrição em solução aquosa livre de nucleases usando uma mistura contendo 150µg de sondas examéricas (pd(N)6, 10 mM de cada um nucleotídeo dNTP – Mix, 1 mM de DTT, 0,5% de Igepal CA-630 4 URNAsin, 6 U do inibidor primer RNAse e 50 U de transcriptase reversa Superscript III. A reação de transcriptase reversa (RT) é realizada por incubações sucessivas a 42 °C e 25 °C por 10 minutos, 50 °C por 60 minutos e 94 °C por 5 minutos. Amostras de cDNA sintetizado são armazenadas a -20 °C. Transcritos de genes de IgH, Igλ e Igκ são amplificados independentemente por PCR, usando amostras do cDNA sintetizado em presença de sondas individuais ou misturas, dNTP e Taq DNA polimerase. As sondas usadas estão incluídas na Tabela 12.2. A Figura 12.8 esquematiza as operações envolvidas na clonagem e expressão de Ac monoclonais humanos. (D) Análise da sequência do gene Ig Cadeias V H, Vκ e Vλ resultantes do segundo PCR são purificadas com ExoSAP-IT (USB) e sequenciadas com os respectivos primersreversos. As sequências são analisadas pelo método comparativo IgBlast e comparadas com dados armazenados no GenBank (para identificação dos segmentos gênicos “germlineV(D)J” que expressem maior identidade). As regiões CDR de IgH são obtidas como indicado no IgBlast por duas alternativas: contando os resíduos de aminoácidos dispostos na região framework (FWR3) até o motivo conservado tryptophan-glycine presente

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Figura 12.8 Estratégia geral de produção de anticorpos monoclonais humanos (AcmH).

em todos segmentos JH, ou até o motivo conservado “phenylalanin-glycine” presente nos segmentos JL, como originalmente indicado33. O número de resíduos de aminoácidos positivamente carregados, Histidine (H), Arginine (R) e Lysine (K), ou negativamente carregados, Aspartate (D) e Glutamate (E), é determinado para cada CDR3 nas regiões IgH e IgL. As sequências de aminoácidos de cada reading frames (RF) podem ser identificadas seguindo critérios definidos34. (E) Expressão de genes Ig em vetores: todos os produtos da reação de PCR são purificados usando o kit Qia-Quick 96 PCR-Purification Kit (Qiagen) e QIAvac96. Amostras dos produtos da reação de PCR são eluídas com 50 μL de água livre de nucleases (Eppendorf) e transferidas para poços de placas de 96 poços. As enzimas de restrição AgeI, SalI e XhoI (todas fornecidas por NEB) são adicionadas aos mesmos poços contendo os produtos de PCR, e os produtos da digestão são purificados como descrito antes da ligação nos vetores de expressão. Igγ1, Igκ e Igλ humanos, contendo o gene que codifica a sequência de um peptídeo-sinal de Ig murina * e um sítio upstream *

GenBank, accession nº DQ407610.

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múltiplo que codifica as regiões constantes de Ig humana Igγ1, Igκ ou Igλ. A transcrição se processa sob a influência do promotor citomegalovírus humano (do inglês, human cytomegalovirus – HCMV). Os clones resultantes são selecionados na base de sua resistência a ampicilina. A ligação é feita em um volume total de 10 μL com 1 U de T4-Ligase (Invitrogen), 7,5 μL de produto PCR purificado e 25 ng de vetor linearizado. Bactérias E. coli DH10B (Clontech) competentes são depositadas em placas de 96 poços e transformadas a 42 °C com 3 μL do produto de ligação. Após o cultivo, colônias bacterianas são analisadas para a presença de segmentos gênicos de Ig human usando 5’Absense as forward primer e 3’IgG internal, 3’Cκ494 ou 3’Cλ as reverse primer (ver Tabela 12.2). Para confirmar a identidade dos produtos de PCR obtidos com os originais (650 bp para Igγ1, 700 bp para Igκ e 590 bp para Igλ), os produtos de PCR obtidos são sequenciados. O plasmídeo DNA é isolado de 3 mL de bactérias transformadas em cultura por 16 horas a 37 °C em meio Terrific Broth (Difco Laboratories) contendo 75 μg/mL de ampicillina (Sigma) usando QIAprep Spin columns (Qiagen). Em média, 35 μg de plasmídeos de DNA podem ser recuperados de 1,5 mL bactérias em cultura usando 75 μL do tampão de eluição EB (Qiagen). (F) Produção de Ac recombinantes Ig recombinante humana é produzida usando células renais humanas de linhagem contínua (HEK) 293 (ATCC, nº CRL-1573) ou 293T (ATCC, nº CRL-11268) cultivadas em placas (Falcon, Becton Dickinson) contendo meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; GibcoBRL) suplementado com 10% soro bovino fetal pobre em IgG (FCS) (Invitrogen), 1 mM piruvato de sódio (GibcoBRL), 100 μg/mL de estreptomicina, 100 U/mL de penicillina G e 0,25 μg de anfotericina (GibcoBRL). As células em cultura são transfectadas com plasmídeos IgH (12,5 μg) ou IgL (20 μg), ambos em meio contendo 0,25 μg de anfotericina (GibcoBRL). Após 8 a 12 horas de cultivo, os sobrenadantes são recolhidos e a presença de Ig recombinante é analisada pelo método Elisa. (G) Purificação do Ac recombinante Os sobrenadantes das culturas de células são recuperados e fragmentos de células removidos por centrifugação a 800 × g por 10 minutos. Azida sódica (0,05%) é adicionada, e os sobrenadantes, armazenados a 4 °C. Os Ac recombinantes são purificados tratando a solução com proteína G aderida em beads (GE Healthcare). Alíquotas de 25 μL de Protein G beads são misturadas com 25 mL de sobrenadante de cultura, e a mistura é incubada por

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14 horas a 4 °C. Os sobrenadantes são removidos por centrifugação a 800 × g por 10 minutos, e os “beads” são transferidos para uma chromatography spin column (BioRad) equilibrada com PBS. Após lavagem da coluna com 1 mL de tampão PBS, os Ac são recuperados com 200 μL de solução de 0,1 M glicina, pH 3,0. A operação é repetida por 3 a 4 vezes. Os eluatos são coletados em tubos contendo 20 μL do tampão 1 M Tris pH 8,0 e 0,5% de azida sódica. Os Acsão titulados por ELISA.

12.13 CONCLUSÕES A estratégia descrita resultou no delineamento de método altamente eficiente de produzir AcMH derivados de um único clone de células B humanas. Esse método, adequado ao estudo de repertórios de Ac humanos, parece ser também a melhor alternativa para a produção de AcMH, com evidente futuro em aplicação imunoterápica. Potencialidades práticas dessa estratégia Obtenção de Ac para terapia em câncer: a efetiva terapia em câncer teve início em 1948 com o uso de antimetabólitos derivados de folato no tratamento de leucemia infantil. Nos últimos dezesseis anos, drogas inibidoras de proteínas oncogênicas seletivamente expressas por células tumorais têm sido continuamente desenvolvidas. Com o objetivo de direcionar drogas para células tumorais, Ac passaram a ser usados como transportadores. Ac CD20-rituximab e HER2 antagonists trastuzumab foram os primeiros introduzidos. Como tais Ac eram monoclonais murinos indução prevista de resposta imune em humanos com produção de Ac humanos anti-Ac murinos foi antecipada e comprovada. A descoberta que Ac murinos expressando regiões hipervariáveis desejáveis poderiam ser inseridas em esqueletos de CH de Ig humanas pelo método de CDR-Grafting ampliou a perspectiva do uso de “mísseis” CDR transportando “ogivas” contendo drogas anticancerígenas. A molécula de Ig manufaturada resultante deste processo, além de preservar a especificidade de reconhecimento do epítopo, recupera ou potencializa a afinidade de interação entre Acm e epítopo 35-37. Essa abordagem estimulou o desenvolvimento de Ac terapêuticos dirigidos para o tratamento de câncer e de outras doenças38. A estratégia de clonar e expressar Ac monclonais humanos dirigidos para epítopos exclusivos de proteínas expressas em células tumorais certamente é mais promissora.

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Obtenção de informações estruturais de antígenos/epítopos encobertos em moléculas de patógenos: dados epidemiológicos recolhidos até 2002 indicam que amostras de vírus HIV-1 pertencentes ao mesmo subtipo diferem em até 20% em suas proteínas do envelope e em subtipos distantes em até 30% 39. Além de apresentar ao sistema imune um diverso e móvel conjunto de epítopos, o HIV-1 possui um número pequeno de spikes funcionais por virion revestidos de glicanas que encobrem sítios potencialmente vulneráveis40. Uma vacina anti-HIV-1 eficiente deveria induzir Ac que reconhecessem epítopos presentes nos spikes de amostras de vírus contemporaneamente emergindo. Publicação recente contém resultados mostrando que AcsMsH obtidos de células humanas isoladas e clonadas de pacientes infectados com HIV-1 permitem a identificação de epítopos “ocultos” nos spikes virais e que suprimem infecções por HIV-1 em modelos animais41. A produção de AcsMsH representa produtiva associação de conhecimentos básicos sobre a imunoquímica da molécula de Ac e a inclusão de informações adquiridas em diferentes áreas correlatas da imunologia e de outras ciências. Horizontes amplos foram e estão sendo abertos em biotecnologia. A identificação de domínios estrategicamente encobertos na estrutura de patógenos alvos potenciais para identificar modos de infecção, epítopos apensos a esses domínios alvos que se tornam visíveis para o desenvolvimento de vacinas e de regiões moleculares para desenho de drogas terapêuticas são apenas alguns dos focos que já estão sendo explorados38.

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Suplemento nº 1: Fragmentação da molécula de IgG Porter submeteu IgG de coelho à digestão pela papaína em presença de cisteína e verificou que a constante de sedimentação do material dirigido baixava de 7 S a 3,5 S, indicando uma clivagem em fragmentos de aproximadamente 50 mil43. Quando o material digerido era dialisado contra tampão de fosfato pH7 e passado através de uma coluna de carboximetilcelulose, pH 5,2, separavam-se três picos, que foram designados, pela ordem de eluição (usando um gradiente de tampão de acetato, pH 5,2 ), fragmentos I, II e III. O material correspondente aos picos I e II possuía atividade de

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anticorpo monovalente, pois inibia a precipitação pelo anticorpo completo, ao passo que o material do pico II era biologicamente inativo. Ao dialisarse o produto digerido contra o tampão de baixa força iônica, o fragmento III cristalizava. Sabemos hoje que os fragmentos I e II são antigenicamente idênticos e provêm de moléculas de IgG de mobilidades diferentes, razão pela qual aparecem em picos separados. Os fragmentos I e II são denominados Fab (fragment antigen binding) pelo fato de se combinarem ao antígeno. O fragmento III é designado Fc (crystalized fragment) pelo fato de cristalizar-se uma vez liberado íntegro dos Fabs. Nisonoff, Markus e Wissler submeteram IgG de coelho a digestão com pepsina em vez de papaína, na ausência de Cys42. Mostraram que o peso molecular do produto digerido reduzia-se para 100 kDa (5 S), porém conservava o poder de precipitação do Ag; conservava a propriedade de anticorpo bivalente. Em uma segunda fase adicionava-se Cys, o peso molecular baixava para 50 kDa e não havia mais precipitação, mas apenas inibição da precipitação (fragmento monovalente). Suplemento nº 2: Evolução dos conhecimentos sobre anticorpos, antígenos e reações antígeno-anticorpo.

Fotografia de M. Heidelberger, professor emérito de imunoquímica do College of Physicians and Surgeons, Columbia University, Nova York, Estados Unidos. Crédito: “Michael Heidelberger 1954”. Fotografia de Harold Low, “Gift. Dr. Heidelberger”. Imagem da History of Medicine (NLM), Order No.:

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B014461. Licensed under Public Domain via Wikimedia Commons. Disponível em: <http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Michael_Heidelberger_1954.jpg#/media/File:Michael_Heidelberger_1954.jpg>. O professor M. Heidelberger (químico orgânico, formação da qual se orgulhava) e Oswald Avery descobriram que os principais antígenos de pneumococos são polissacarídeos. A consequência dessa descoberta foi a demonstração que anticorpos são proteínas. Esses dois fatos, fundamentais para o desenvolvimento da imunologia e, por extensão, da medicina, permitiram estudos refinados das reações de interações entre moléculas de anticorpos e de antígenos. Os aspectos quantitativos da reação de precipitinas foram firmemente determinados. Como consequência, tornou-se possível quantificar, em bases ponderais, o conteúdo de anticorpos nos soros. Estava encerrada a época da sorologia. Nascia, formalmente, a imunologia. As células se comunicam com o meio ambiente e entre si através de moléculas que produzem e expõem, estrategicamente, na sua superfície. Moléculas que levam mensagens são referidas como mensageiras ou ligantes e as que recebem mensagens, como receptores. As moléculas fazem parte de grandes grupos ou famílias, como hormônios, mediadores, fatores de crescimento, citocinas, enzimas, anticorpos etc. Para cada tipo de mensagem há pares específicos de moléculas mensageiras e de moléculas receptoras. Como o número de mensagens que exercem essas atividades é imenso, o número de moléculas que transmitem e recebem mensagens é proporcionalmente enorme. As células se reproduzem, crescem, diferenciam-se, locomovem-se, destroem outras células ou cometem suicídio sob o comando de mensagens específicas para cada uma dessas atividades. As células, no ato da comunicação, reconhecem formas. A linguagem usada é a configuração embutida nas moléculas que transmitem e que recebem a mensagem. A configuração tridimensional mais grosseira de moléculas como ácidos nucleicos, proteínas, carboidratos e lipídeos complexos é determinada pela sequência dos blocos que as constituem, nucleotídeos, aminoácidos, mono-, di- e trissacarídeos, lipídeos. Esses blocos fornecem o substrato maior onde repousam os átomos que dão a configuração mais delicada final. Para configurações extensas, imprecisas, há receptores panorâmicos; para pormenores, precisos, há receptores de ajuste fino. As mensagens recebidas pelos receptores são transmitidas, também, via moléculas especiais de proteínas para o interior da célula. No citoplasma, entram numa rede de difusão, própria para cada tipo de mensagem, de onde são orientadas para as organelas encarregadas de dar a resposta.

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Há mensagens que permitem que as células distingam material produzido na sua própria comunidade de material importado do meio externo. Ambas são iniciadas por três famílias de moléculas: receptores de linfócitos T (RCR), anticorpos e proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (pCPH), dispostas, respectivamente, na superfície de linfócitos T, linfócitos B e de quase todas as células. Anticorpos são singulares: funcionam tanto como mensageiros quanto como receptores e executores de mensagens. Quando sua existência não passava de uma hipótese, eram referidos pelo termo vago de entidades; depois que uma de suas funções, talvez a que lhe confere identidade, foi descoberta, foram denominados anticorpos e, finalmente, quando a anatomia funcional de sua molécula foi conhecida, foram denominados imunoglobulinas (Ig). A evolução dos conhecimentos sobre essa fascinante molécula é parte do motivo das aulas de anticorpos humanizados. A história da evolução do conhecimento, na Antiguidade, está entremeada de mito e realidade. Observações isoladas já indicavam que certas doenças passavam de pessoa a pessoa: eram contagiosas. Certas pessoas, talvez a maior parte, que tivessem tido certa doença raramente tornavam a adquirir a mesma doença: tornavam-se imunes. As ordenhadeiras, por exemplo, eram resistentes à varíola bovina. Essas senhoras, no início de suas atividades profissionais, em geral adquiriam uma forma branda da varíola bovina restrita às mãos. Depois de curadas, não adquiriam mais essa doença, apesar de continuarem a ordenhar vacas com varíola. Além disso, as manchas cutâneas típicas que caracterizavam pessoas sobreviventes de epidemias de varíola raramente eram encontradas em ordenhadeiras. As ordenhadeiras eram resistentes tanto à varíola bovina como à humana. A humanidade estava ansiosa por medidas que prevenissem ou curassem a varíola. O índice de mortalidade da varíola era da ordem de 20% a 30%! Os circassianos, para impedir que suas jovens tivessem manchas de varíola e, assim, proteger seu comércio de escravas com os reis da Turquia e da Pérsia, inoculavam seus filhos com pus obtido de pústulas de varíolas brandas. Com base nessas observações, Edward Jenner, em 1796, realizou sua famosa heroica e “antiética” experiência em seres humanos: injetou pus obtido de pústulas da varíola bovina em crianças. As crianças que foram inoculadas com o pus, da mesma forma que as ordenhadeiras, durante as epidemias de varíola não tinham a doença. Tornavam-se imunes. Estava descoberta, oficialmente, a primeira vacina, termo proveniente do latim vacca, “vaca”. Curiosamente, essa vacina grosseira testada sem obedecer os princípios rigorosos da ética médica, foi a primeira vacina a erradicar

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uma doença. O último relato oficial de um caso de varíola aconteceu na Somália, em 1970! Essa descoberta esperou 150 anos para ser estendida a outras doenças: Robert Koch, von Bhering, Paul Eherlich e Louis Pasteur, no século XIX, foram os responsáveis. Supunha-se, com base apenas em observações cientificamente frágeis, que as pessoas que se recuperavam de uma doença infecciosa e se tornavam resistentes àquela doença produziam entidades de resistência que circulavam em seu sangue. Essa suposição foi cientificamente comprovada, no século XIX, com a realização de experimentos bastante simples. A adição de quantidades seriadas de amostras desses soros a uma série de tubos contendo igual volume de uma suspensão da bactéria causadora da infecção para a qual o doador do sangue estava resistente produzia aglutinação das bactérias. Esse fenômeno, observado com lentes de aumento, mostrava que as bactérias, isto é, pequenos “corpúsculos”, juntavam-se uns aos outros na presença daquele soro. O soro continha entidades que reconheciam aqueles corpúsculos, isto é, “anticorpúsculos”. Essas entidades foram denominadas anticorpos. Quando, em lugar de bactérias íntegras, vivas, extrato solúvel da bactéria era adicionado a uma série de tubos contendo igual volume do soro, observava-se a formação de flóculos mais grossos ou de precipitados mais finos. As entidades que aglutinavam as bactérias foram denominadas anticorpos aglutinantes, e as que as precipitavam, anticorpos precipitantes ou precipitinas. As entidades presentes na superfície da bactéria e nos extratos bacterianos foram denominadas antígenos. Se, em lugar de soro obtido de pessoa convalescente, fosse utilizado soro de pessoa que ainda não tinha tido a doença, não havia nem aglutinação e nem floculação ou precipitação. Estava descoberta a característica distintiva dos anticorpos: a especificidade. Arrhenius e Madsen repetiram os experimentos descritos acima usando soro de convalescentes de difteria como fonte de anticorpos, toxina diftérica como antígeno, porém testando a toxicidade residual da toxina em animais, e verificaram que os anticorpos neutralizavam a toxina. Estava descoberta a atividade antitóxica dos anticorpos. Esses anticorpos foram denominados anticorpos neutralizantes. Conquanto a estrutura das proteínas como cadeias de polipeptídeos já tivesse sido, naquela época, demonstrada por Emil Fischer, a natureza dos anticorpos, dos antígenos e dos fenômenos da aglutinação, precipitação e neutralização ainda não podia ser estudada. Os conhecimentos de física e de química ainda eram insuficientes. Surgiram, todavia, algumas sugestões

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curiosas. Arrhenius e Madsen, por exemplo, propuseram que na neutralização de toxinas anticorpos e antígenos se combinariam à maneira da neutralização de ácidos fracos por bases fracas; Kraus interpretou a reação de precipitinas como modificações induzidas pelo antígeno no estado coloidal do soro, de modo a desnaturar suas proteínas, e que os anticorpos estavam associados à fração do soro denominada globulinas. Apenas esta última sugestão sobreviveu. Restava saber se o antígeno, de fato, incorporava-se nos precipitados durante a reação de precipitinas. Apesar das dificuldades operacionais com os métodos disponíveis na época, essa importante questão foi elegantemente resolvida por von Dungern, em 1902. Esse arguto pesquisador escolheu como antígeno sangue de caranguejo. Injetou coelhos com esse soro e, depois de algumas semanas, tempo suficiente para a formação de anticorpos antissoro de caranguejo, colheu sangue dos coelhos e usou o soro na reação de precipitação com sangue de caranguejo como antígeno. Os precipitados resultantes quando agitados com ar tornavam-se azuis. Radicais de cobre associados à molécula de hemocianina do sangue de caranguejo adquirem cor azul ao serem oxidados. Assim, elegantemente, Von Dungern demonstrou que, de fato, o antígeno incorpora-se nos imunoprecipitados. Resumindo: na virada do século XX, estava cientificamente demonstrado que o organismo produz substâncias que o protegem contra infecções; que essas substâncias interagem tanto com bactérias vivas como com seus extratos; que induzir produção de anticorpos não é “privilégio” de bactérias, pois substâncias de origem não bacteriana também induzem a produção de anticorpos; e que tanto a indução como a interação dos anticorpos com os antígenos são fenômenos específicos. Duas décadas depois, portanto nos anos 1920, foram feitas três importantes descobertas: • Avery e Dochez observaram que formas virulentas de pneumococos excretam substâncias no meio de cultura. As substâncias excretadas formam precipitados com anticorpos específicos para o tipo de pneumococo do qual a substância foi derivada; • Bial descobriu as “agressinas”, substâncias excretadas no meio de cultura que tornam a bactéria mais virulenta quando adicionada à suspensão bacteriana; e • Ascoli observou que o Bacillus anthracis pode ser reconhecido por reações de precipitação.

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Coube, todavia, a Oswald T. Avery entender a enorme importância dessas descobertas. Antecipou que nos polissacarídeos grupo-específicos, geralmente livres de nitrogênio e resistentes à ação de enzimas do organismo do hospedeiro, presentes nas suas culturas de pneumococos (Streptococcus peneumoniae), encontrava-se o segredo da especificidade bacteriana. Admitindo a enorme possibilidade de configurações distintas que os polissacarídeos podem originar, estava aberta a possibilidade de se usar, pela primeira vez, uma substância diferente de proteínas nas reações imunológicas. Naquela época, eram conhecidas três formas “fixas” de pneumococos, tipo I, tipo II e tipo III, e uma quarta, tipo IV, na qual eram colocadas as demais que não se enquadravam entre as três primeiras. Essas formas excretavam no meio de cultura polissacarídeos absolutamente específicos nas reações de precipitação frente a soros contendo os correspondentes anticorpos. Demonstrou-se, a seguir, que nos microrganismos encapsulados sua especificidade se deve aos carboidratos aí presentes. A exceção foi encontrada no Bacillus anthracis, cuja cápsula, ao contrário, é um polipeptídeo que consiste exclusivamente de D(-) ácido glutâmico. D(-) ácido glutâmico é o enanciomórfico, o oposto espacial L(+) ácido glutâmico, sendo o que existe na maioria das proteínas. Os polissacarídeos de penumococos, de outros microrganismos encapsulados e a proteína da cápsula de Bacillus anthracis injetadas em cavalos induziam a produção de anticorpos específicos. Com tais descobertas, estava aberto o caminho para estudos mais seguros da especificidade das reações de precipitação. Uma adição importante foi feita por Felt: misturando-se soro de cavalo contendo anticorpos antipneumococos com água acidulada, 90% dos anticorpos são precipitados sem desnaturação, enquanto 90% das demais proteínas permanecem na fração solúvel. Foi a primeira tentativa bem-sucedida de isolar anticorpos de outras proteínas do soro. Os caminhos para se conhecer a natureza dos anticorpos, das reações de precipitação e aglutinação estavam abertos: • polissacarídeos de pneumococo solúveis tipo III, S-III, constituídos de ácido policelobiurônico, isto é, ácido glucurônico-4-b-glucose, injetados em cavalo, coelho e seres humanos, produzem grandes quantidades de anticorpos; • o método descrito por Felton para isolar anticorpos; • um método rigorosamente preciso para dosar nitrogênio com um mínimo de erro experimental: método de micro-Kjeldahl; • um método altamente sensível para dosar polissacarídeos de pneumococos.

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Michael Heidelberger e colaboradores, entre os anos 1930 e 1940, dedicaram-se a percorrer aqueles caminhos. À série de tubos contendo igual volume de soro de cavalo (Ac) que havia sido injetada com polissacarídeo S-III (S), adicionaram 0,05 mg, 0,10 mg, 0,15 mg, 0,20 mg ou 0,25 mg de S. Controles contendo apenas S ou Ac foram incluídos. Uma série de tubos foi incubada a 37 °C e outra similar a 0 °C por algumas horas. Após centrifugação, dosava-se o nitrogênio total nos precipitados e os polissacarídeos residuais nos sobrenadantes. Estes últimos eram submetidos, novamente, à reação de precipitação para titular anticorpos residuais. 1. Imunoglobulinas em animais inferiores Imunoglobulinas têm sido encontradas em todas as classes de vertebrados mandibulados: peixes de esqueleto cartilaginoso e ósseo, dipnoanos, crossoptergianos, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Nestes animais encontramse imunoglobulinas de estrutura tetramérica com duas cadeias H e duas L, tanto na forma secretada como ligada à membrana celular. São exceção a essa regra as imunoglobulinas de camelídeos, que não possuem cadeias L, e as imunoglobulinas-símiles de tubarão. As imunoglobulinas-símiles de tubarão, denominadas “nurse shark antigen receptor” (NAR), são proteínas diméricas em que cada cadeia consiste em cinco domínios, o domínio N-terminal semelhante à região V e quatro domínios semelhantes à região constante das imunoglobulinas. Parece que os genes para NAR se rearranjam somaticamente e que os aminoácidos substituídos agrupam-se em três regiões correspondentes aos CDR. Admitese que NAR situe-se filogeneticamente entre imunoglobulinas e TCR. Nos peixes cartilaginosos (chondrichthyanos), a molécula de imunoglobulina possui dois tipos de cadeias H e um tipo de cadeia L. Uma das cadeias H é relacionada à cadeia m de mamíferos, enquanto a outra é distinta. A cadeia L é, também, relacionada à cadeia k de mamíferos. Nesses animais há, portanto, duas classes de imunoglobulinas notadas: IgM e IgX. A organização dos segmentos gênicos que codificam para as cadeias H e L nos peixes cartilaginosos é diferente da das demais classes de vertebrados. Os peixes cartilaginosos possuem múltiplos loci para ambas as cadeias H e L, localizados em diferentes cromossomas. Cada locus consta de regiões únicas para os segmentos V, J e C. Em algumas sequências que codificam para as cadeias H e L todos os segmentos estão separados por sequências de mais ou menos 400 pb; em outras, o segmento de 400 pb foi removido, permitindo que as regiões se liguem, o que resulta nas seguintes associações: (VD)-J-C, (VDJ)-C e (VD)-(DJ)-C para os loci das cadeias H, e (VJ)-C para

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os loci das cadeias L. Os parênteses indicam segmentos unidos. As recombinações ocorrem dentro de um locus, e jamais entre loci diferentes. Parece que em cada linfócito B há apenas um locus. Há duas famílias de loci para a cadeia H: uma engloba loci que codificam para D1 ou D1 mais D2, porém não para D2 sozinho; e a outra engloba loci que codificam alternativamente para D2 ou D1 e D2, mas não para D1 sozinho. Há três famílias de loci que codificam para a cadeia L: uma relacionada aos genes da cadeia k de mamíferos; as outras duas diferem tanto da cadeia k como da l de mamíferos. Os genes para essas famílias de genes para as cadeia H e L de peixes cartilaginosos provavelmente divergiram antes da bifurcação dos peixes cartilaginosos e ósseos, há mais de 450 milhões de anos. Todos os outros vertebrados mandibulados (peixes ósseos, dipnoanos, crossopterygianos, anfíbios, répteis, aves e mamíferos) possuem um número limitado de loci para as cadeias H e L, cada locus consistindo em múltiplos segmentos V, (D) e J alinhados, seguidos dos éxons para C. Os crossopterygianos, representados pelo coelacanto (Latimeria chalumnae), possuem seus genes para a cadeia H arranjados, como nos peixes ósseos, na sequência V-D-V-D. Os dipnoanos, pouco estudados, possuem os isotipos m e n de cadeias H. Os anfíbios, representados pela rã-de-unhas-africana (Xenopus laevis), expressam três isotipos de cadeias H, m, u e c, e as correspondentes classes de imunoglobulinas, IgM, IgY e IgX. Os répteis expressam três isotipos de cadeias H, m, u e n, e as correspondentes classes de imunoglobulinas, IgM, IgY e IgN. Suas cadeias L ainda não foram caracterizadas. Nas aves, as imunoglobulinas contêm cadeias H m, a e u e apenas cadeias L tipol. As cadeias H expressam-se nas correspondentes classes IgM, IgA e IgY. As cadeias m, a e l são homólogas às de mamíferos. Já a cadeia u é homóloga à de anfíbios e répteis. A cadeia u é encontrada em diferentes formas: a forma Cu1, Cu2, Cu3 e Cu4, comuns na maioria das aves, e a forma em que Vu se acha combinada com duas regiões C, Cu1 e Cu2. Esta última tem sido detectada em palmípedes. As aves possuem também IgM e IgA. A IgY do Gallus gallus corresponde à IgG de mamíferos. Consiste de duas cadeias H e de duas L. A cadeia Hu tem peso molecular de 66 kDa, e a Ll, de 22 kDa. A molécula inteira tem em torno de 188 kDa. IgY possui atividades biológicas tanto de IgG como de IgE de mamíferos. IgY, à medida que vai

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sendo sintetizada, acumula-se na gema dos ovos. É a reserva de anticorpos que a mãe lega à sua prole. 1.1 Produção de Ac Ac são produzidos por plasmócitos, células derivadas de linfócitos B. Linfócitos B, após uma série de diferenciações, passam a expressar na superfície da membrana celular receptores para Ag designados BCR. Esses receptores resultam da associação não covalente de uma molécula de Ig com o heterodímero transmembrânico Igα\Igβ. Os dois Fab da Ig acham-se livres e expostos na superfície, e a região Fc acha-se inserida na membrana da célula sem chegar ao citoplasma. As regiões extracelulares das proteínas Igα (42 kDa) e Igβ (37 kDa) estabelecem contato entre o heterodímero Igα\Igβ e a molécula de Ig. As regiões citoplasmáticas do heterodímero Igα\Igβ contendo motivo de ativação do imunorreceptor baseado em tirosina (immunoreceptor tyrosine-based activation motive – ITAM) servem de pontes para o estímulo resultante da interação Ag-Ac na molécula de Ig e a ativação de quinases e de outras moléculas tanto citoplasmáticas como nucleares. Transcrição de genes, ativação celular e expressão de funções efetoras são os resultados imediatos. Linfócitos T, após uma série diferenciações, passam a expressar na superfície da membrana celular receptores para Ag designados TCRαβ ou TCRγδ. TCRs são glicoproteínas heterodiméricas com um único sítio de combinação para o Ag. A molécula de TCRαβ possui uma cadeia TCRα (49 kDa) ligada via ponte dissulfeto a uma cadeia TCRβ (43 kDa). Da mesma maneira, a molécula de TCRγδ possui uma cadeia TCRγ (40-55 kDa) unida também por ponte dissulfeto a uma cadeia TCRδ (45 kDa). Cada cadeia TCR é constituída de um domínio V e um domínio C, um resíduo de Cys conectando as sequências Vα e Cα e Vβ e Cβ em TCRαβ, assim como Vγ e Cγ e Vδ e Cδ em TCRγδ. Os domínios C e V, estabilizados por ligações internas de dissulfeto, estão estruturalmente organizados como na molécula de Ig. As regiões V situadas nas regiões N-terminais dos dois polipetídeos do TCR formam um único sítio de combinação para o Ag. Estabelecem contato simultâneo com o epítopo antigênico e com a molécula adequada de MHC. Diferentemente de BCR, que pode originar isotipos, TCR expressa região C original ao longo de toda a vida celular e nem está envolvida na ativação de mecanismos efetores. As moléculas de TCRs atravessam a membrana celular do linfócito T, mas atingem o citoplasma com porções muito curtas, insuficientes para a transferência de estímulos de sinalização intracelular. Essa transferência é realizada pelo complexo CD3. O complexo CD3 contém combinações heterodiméricas variáveis de cinco cadeias de proteínas

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designadas CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ e CD3η. As moléculas de CD3 como Igα\Igβ também usam ITAMs no processo subsequente de sinalização intracelular. As moléculas de Ig de Ig-símile expressas, respectivamente, na superfície de cada clone de linfócitos B ou T reconhecem um, e apenas um, epítopo antigênico. O processo de origem da diversidade dos Ac responsável pelo vasto repertório de regiões hipervariáveis dos Fab aconteceu em fases determinadas do desenvolvimento embrionário. Esse vasto repertório, da ordem de 108 a 1011 sequências diferentes, cada uma potencialmente expressa nos CDR das futuras regiões hipervariáveis, aparentemente inclui especificidades para todos Ag. A estratégia de gerar mensagens antes de células preserva espaços nos tecidos linfoides.

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CAPÍTULO

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PLANTAS COMO BIORREATORES: FUNDAMENTOS, MÉTODOS E APLICAÇÕES Diego Grando Módolo Marcelo Menossi 13.1 INTRODUÇÃO

O uso de plantas na obtenção de produtos medicinais é amplamente conhecido desde os primórdios da humanidade. Com o avanço da biologia molecular e da manipulação de ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid – DNA) pela engenharia genética, tornou-se possível a utilização de plantas para a obtenção de diversos produtos farmacêuticos e industriais que não eram encontrados naturalmente em células vegetais. O desenvolvimento de plantas transgênicas visando à produção de proteínas recombinantes é usualmente denominado “plantas como biorreatores”, “agricultura molecular” (tradução direta de molecular farming), ou “fármacos produzidos em plantas” (tradução direta de plant-made pharmaceutical). As primeiras plantas transgênicas foram obtidas na década de 1980 e um dos primeiros casos de sucesso foi a obtenção de plantas resistentes ao cloranfenicol, um antibiótico de amplo espectro eficaz contra bactérias gram-negativas e gram-positivas. Ele bloqueia a síntese proteica bacteriana, por inibição

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da unidade ribossômica 50S (unidade sem a qual a bactéria não consegue sintetizar proteínas vitais para a sua multiplicação e sobrevivência). Nesse trabalho, pela primeira vez foram inseridas no genoma vegetal sequências de DNA quiméricas (gene recombinante que contém sequências de mais de uma fonte de material genético, por exemplo, o promotor de um gene com a sequência gênica para a proteína/enzima de interesse) (Figura 13.1). Isso possibilitou a expressão da enzima cloranfenicol acetiltransferase1. Na mesma década, surgiu um dos trabalhos pioneiros descrevendo a produção em plantas de uma proteína recombinante de interesse farmacêutico. Nesse caso, foi feita a expressão do hormônio de crescimento humano em tabaco e calos de girassol2. Desde então, diversos produtos de interesse farmacêutico e industrial foram obtidos através da expressão recombinante em plantas, cabendo destacar vacinas, anticorpos, enzimas, hormônios, suplementos nutricionais e plásticos biodegradáveis, como discutido a seguir.

Figura 13.1 Estrutura de uma sequência de DNA quimérica. O DNA representado contém uma fusão do promotor 35S obtido do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) com uma sequência codificante de uma proteína de interesse (que pode ser de diversos organismos), ligada ao terminador da nopalina sintase da bactéria A. tumefaciens.

O interesse na geração de plantas transgênicas que produzam proteínas de uso farmacêutico ocorre devido a uma série de fatores, tais como a capacidade das células vegetais de promover modificações pós-traducionais semelhantes às encontradas em seres humanos e micro-organismos 3. Há também a possibilidade mínima de contaminação do produto por patógenos humanos e animais, como, por exemplo, a transmissão de vírus ou príons. As plantas contam com órgãos de estocagem naturais, como frutas e sementes, para facilitar a acumulação estável das proteínas recombinantes, existindo também protocolos estabelecidos para colheita, transporte, estocagem, processamento do material vegetal, além da produção em larga escala a um custo reduzido4.

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De modo geral, para a obtenção do produto final, a purificação da proteína recombinante é necessária, existindo diversas metodologias para esse processo, que variam de acordo com as características da proteína e do local de expressão na planta. Entretanto, existe a possibilidade de produção de vacinas comestíveis, que não necessitam de etapas de purificação prévias, já que a imunização ocorre com a ingestão de material vegetal sem o seu processamento (Figura 13.2). Atualmente, vacinas comestíveis estão sendo produzidas e testadas para várias doenças humanas, como a vacina contra a hepatite B produzida em batata 5, e para animais, como a vacina contra a pasteurelose pneumônica bovina expressa em alfafa6.

Figura 13.2 Produção de vacinas comestíveis. Através da transferência de um gene codificante de um antígeno de organismos patogênicos, é possível produzir plantas transgênicas. Um exemplo são plantas que produzem batatas, cuja ingestão pode desencadear proteção imunológica contra uma determinada doença.

Neste capítulo, serão abordados os principais pontos no desenvolvimento de uma planta transgênica com vistas à produção de proteínas de interesse farmacêutico: (a) organismos hospedeiros; (b) otimização dos níveis de expressão; (c) compartimentos subcelulares; (d) métodos de transformação genética; (e) modificações pós-traducionais; (f) processos downstream; (g) biossegurança; (h) propriedade intelectual. Também será discutida uma técnica passo a passo de transformação genética de tabaco, considerada uma das principais plantas utilizadas como biorreatores para a produção de proteínas heterólogas. Além disso, descreveremos diversos produtos já obtidos em plantas transgênicas e as perspectivas futuras em relação a essa tecnologia.

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13.2 ORGANISMOS HOSPEDEIROS A escolha da espécie hospedeira é muito importante para a produção de proteínas recombinantes e está associada ao tipo de proteína que será expressa e a sua finalidade. Apesar de existirem várias espécies vegetais comprovadamente eficientes na expressão de proteínas heterólogas, nenhuma delas pode ser considerada ideal para todos os tipos de produtos. Diversos fatores são levados em consideração na escolha do hospedeiro, tais como: ciclo de vida, quantidade de biomassa, facilidade de manipulação genética e custos de produção em larga escala7. Em especial, para vacinas comestíveis, o ideal é a produção em alimentos que não necessitem de cozimento para o consumo, evitando a desnaturação da proteína recombinante e a consequente queda da eficácia do princípio ativo8. Na Tabela 13.1, temos vários exemplos de organismos hospedeiros que foram utilizados na expressão de proteínas recombinantes. Tabela 13.1 Exemplos de aplicações na produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico em plantas transgênicas. RE: retículo endoplasmático; n/d: não determinado APLICAÇÃO

HOSPEDEIRO

PROTEÍNA

PROMOTOR

COMPARTIMENTO

REFERÊNCIA

Anticorpos

Milho

2G12

gt-1

RE

Rademacher, et al.103

Tabaco

SIgA

p35S

RE e Apoplasto

Ma, et al.102,117

Tabaco

scFv idiotipos

pSP

Secretada

McCormick, et al.11

Tomate

hIgA_2A1

35S

n/d

Juarez, et al.105

Tabaco

mAbP SO57

35S

RE

Lee, et al.106

N. benthamiana

2G12

35S

n/d

Strasser, et al.77

Anti-hemorrágico

Milho

Aprotinina

Ubiquitina de milho

n/d

Zhong, et al.37

Citocinas

Tabaco

IL-10

35S

RE, Apoplasto, Citosol

Bortesi, et al. 109

Células de arroz

hGM-CSF

Ramy3D

Secretada

Biemelt, et al. 18

A. thaliana

hlGF-1 Humano

Oleosin

Corpúsculos Oleosos

Li, et al.64

Tabaco

INF-b

35S

n/d

Edelbaum, et al.108

Tabaco

IL-13

2x 35S

RE

Wang, et al.110

Arroz

hIGF-1

GT13a

RE

Xie, et al.111

Diversas

Arroz

Lactoferrina

Gt1

RE

Nandi, et al.115, 116

Enzima

Células de cenoura

prGDC

35S

Vacúolo

Shaaltiel, et al.17, Aviezer, et al.114

Hormônios

Tabaco e alface

Pró-Insulina

pLD

Cloroplasto

Boyhan e Daniel112

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Plantas como Biorreatores: Fundamentos, Métodos e Aplicações APLICAÇÃO

Vacinas

HOSPEDEIRO

PROTEÍNA

PROMOTOR

COMPARTIMENTO

REFERÊNCIA

Soja

hGH

b-conglycinin

Vacúolo

Cunha, et al.19

Tabaco

hGH

g-kafirina

RE

Leite, et al.43

Tabaco

PfMSP1 de P. falciparum

35S

n/d

Ghosh, et al.100

Tabaco

OsoA de B. burgdorferi

35S

Cloroplasto

Glenz, et al.80

Batata

HBsAG de Hepatite B

35S

n/d

Kong, et al.5

Alfafa

GS60 de M. haemolytica

35S

RE

Lee, et al.6

Tabaco e batata

L1 de HPV-16

35S

n/d

Biemelt, et al. 118

Alface

S-HBsAg

35S

RE e Envelope Nuclear

Pniewski, et al.33

Tomate

RSV-F

E8

n/d

Sandhu, et al.45

Tabaco

L1 de HPV-16

pRM

Cloroplastos

Lenzi, et al.84

Tabaco e alface

M- e L-HBsAg de HB

35S

n/d

Pniewski, et al.92

Espinafre

TAT de HIV-1

CP sgRNA

n/d

Karasev, et al.97

Milho

CT-B de Vibrio cholerae

g-zein

n/d

Karaman, et al.98

Banana

HBsAg de HB

ubq3 e EFE

ER

Kumar, et al.94

Tabaco e alface

ESAT-6 de M. tuberculosis

psbA

Cloroplasto

Lakshmi, et al.99

O tabaco é considerado planta modelo na produção de proteínas recombinantes devido à sua versatilidade em cultura de células e tecidos, avançada tecnologia em manipulação genética, ciclo de vida curto (germinação da semente até a produção de novas sementes em três meses) e alta produção de biomassa, proporcionando um grande potencial para uma rápida produção em larga escala9,10. As primeiras plantas transgênicas foram produzidas a partir da transformação do tabaco e, atualmente, existem diversas proteínas de interesse farmacêutico sendo expressas nessa cultura. Em tabaco, foi possível a obtenção de vacinas baseadas em anticorpos idiótipos específicos para cada paciente no tratamento contra o linfoma folicular de células B, com uma rápida produção de anticorpos de cadeia simples em plantas. Em testes pré-clínicos, foi demonstrado que esta vacina é segura e que os pacientes desenvolveram uma resposta imunológica contra a doença11. O idiótipo de um anticorpo é a porção deste característico do clone de linfócitos B que o produziu, sendo formado pelo primeiro domínio conformacional (a contar da extremidade

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amino) de um par de cadeias H e L em conjunto. É ao nível do idiótipo que se define a especificidade do anticorpo por um determinado antígeno, pois atua na interação daquele com uma determinada conformação à superfície do mesmo, o epítopo (Figura 13.3).

Figura 13.3 Estrutura do anticorpo IgG. O anticorpo IgG é constituído por uma região constante e uma variável. Em destaque está a região do idiótipo, responsável pela especificidade do anticorpo por um determinado antígeno.

A expressão de proteínas em sementes de cereais é atrativa, pois essas culturas geralmente produzem uma grande quantidade de grãos, com alto conteúdo proteico e, no caso do milho, existe uma metodologia avançada de transformação genética12, 13. A primeira proteína recombinante comercial expressa em cereais foi produzida em plantas transgênicas de milho, que acumulavam a glicoproteína avidina em sementes. Um alto nível de expressão foi observado (2% de proteína total solúvel). Os autores estimaram que seriam necessários aproximadamente 100 kg de sementes de milho para a obtenção de 20 g dessa proteína, uma quantidade muito menor de material em comparação com o método de extração da proteína nativa em ovos de galinha, que necessitaria de 900 kg para chegar à mesma quantidade de avidina14. É possível utilizar cultura de células vegetais na expressão de proteínas recombinantes, através do cultivo de calos indiferenciados ou células em suspensão. Nesse sistema, as proteínas de interesse podem ser retidas no interior da célula ou secretadas para o meio de cultura, sendo que neste último caso o processo de purificação proteica é simplificado. Outrossim, como o cultivo é feito em tanques de contenção (como biorreatores), existem vantagens em relação a sua biossegurança 15-16. Células de tabaco BY-2 (bright yellow) e NT-1 são as células hospedeiras mais utilizadas nesse processo,

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pois possuem um crescimento rápido e ciclo celular sincronizado 15, ainda que diversas outras espécies venham sendo utilizadas, como a cenoura e o arroz17-18. Outras culturas têm sido utilizadas para a produção de proteínas recombinantes, dentre as quais vale destacar a soja, que, por ser uma leguminosa, possui uma alta quantidade de proteínas em sua semente. Nela, foi possível a obtenção do hormônio de crescimento humano (human growth hormone – hGH) ativo em altos níveis (mais de 2% de proteína total solúvel)19. Outro aspecto interessante de espécies que produzem altas taxas de óleo é o endereçamento da proteína recombinante para corpúsculos oleosos, através da fusão do gene de interesse a um gene de uma oleosina (Figura 13.4). Dessa forma, é possível obter boas quantidades de proteínas recombinantes sem a necessidade de etapas complexas de purificação20.

Figura 13.4 Expressão e endereçamento de proteínas recombinantes para corpúsculo oleoso. O gene da proteína de interesse é fusionado ao gene de uma oleosina, podendo conter uma região intermediária de DNA que será traduzido em aminoácidos específicos (peptídeo de ligação), alvo para uma posterior clivagem por proteases. Após a transcrição e tradução, a proteína recombinante é endereçada para o corpúsculo oleoso e sua estrutura fica exposta na superfície. Após mínimas etapas de purificação, a proteína de interesse pode ser utilizada quando ainda ligada ao corpúsculo ou separada através da clivagem do peptídeo de ligação.

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A batata tem sido amplamente utilizada em testes para produção de vacinas comestíveis 21, mesmo havendo a necessidade de seu cozimento para se tornar palatável. Alternativamente, podem ser utilizados o tomate, a banana e a alface, pois podem ser consumidos crus, evitando, assim, a degradação do medicamento8.

13.3 OTIMIZAÇÃO DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO A obtenção de altos níveis de expressão de proteínas recombinantes em plantas transgênicas é essencial para viabilizar o seu uso comercial, pois baixos níveis de expressão, consequentemente, elevarão muito o custo do produto final. Diversos fatores podem influenciar os níveis de expressão de uma proteína recombinante. Por isso, estratégias devem ser utilizadas com o objetivo de otimizar a expressão de um determinado gene em células vegetais.

13.3.1 Vetores de expressão Vetores de expressão são plasmídeos que carregam o cassete de expressão do gene de interesse, permitindo assim, que este gene possa ser transcrito e traduzido em proteína. Usualmente, esses vetores são constituídos por diversos componentes que auxiliam a obtenção de plantas transgênicas. Através de diversos métodos, detalhados adiante, os vetores são introduzidos nas células da planta hospedeira, de forma que a maquinaria celular utilize a informação genética para a produção da proteína recombinante. O cassete de expressão da proteína recombinante é basicamente composto por um promotor, o gene de interesse e um terminador. Normalmente esse vetor também possui um segundo cassete de expressão, contendo um gene que confere à planta resistência a um determinado antibiótico ou herbicida. Esse segundo cassete é importante no processo de produção das células geneticamente modificadas, pois as metodologias de transferência de DNA para a célula hospedeira são, geralmente, muito pouco eficientes (apenas uma fração das células é modificada geneticamente). Com o segundo cassete de expressão, geralmente denominado de gene de resistência, as células geneticamente modificadas podem ser selecionadas frente às não modificadas (Figura 13.5). Isso, normalmente, é feito pelo cultivo das células em meio de cultura com agente seletivo (antibiótico ou herbicida), que mata as células

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que não foram modificadas geneticamente. Além da expressão dos genes de interesse e de resistência, os vetores podem incluir genes repórteres, cuja expressão permite identificar visualmente células transformadas.

Figura 13.5 Estrutura básica de um vetor de expressão. O vetor de transformação de plantas contendo o cassete de expressão do gene de interesse usualmente contém adicionalmente um cassete de expressão que conferirá resistência a planta a antibióticos ou herbicidas, possibilitando a seleção de células transformadas.Também poderá conter um cassete de expressão de uma proteína repórter, possibilitando a identificação visual de plantas transformadas, como a proteína β-glucuronidase. pNos: promotor da nopalina sintase; NPT II KanR: gene da neomicina fosfotransferase, que confere resistência ao anntibiótico canamicina; tNOS: terminador da nopalina sintase; SMC: sítio múltiplo de clonagem; p35S: promotor 35S; Gene GUS: gene repórter da b-glucuronidase.

Em técnicas de transformação via Agrobactéria é necessário que o vetor contenha uma região de DNA de transferência (T-DNA, detalhada a seguir), que é transferida para o genoma da planta e na qual os cassetes de expressão são inseridos. Usualmente, um vetor de expressão contém sítios múltiplos de clonagem, que são locais onde enzimas de restrição podem cortar o DNA permitindo a inserção do cassete de expressão do gene de interesse. O vetor de expressão contém diversas outras regiões importantes para outros aspectos, como replicação, seleção das bactérias, mas que extrapolam os objetivos deste capítulo.

13.3.2 Otimização de códons O código genético é redundante, uma vez que a maioria dos aminoácidos pode ser traduzida por mais de um códon (códons sinônimos). A frequência relativa de códons utilizados na transcrição do DNA em ácido ribonucleico

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mensageiro (messenger ribonucleic acid – mRNA) varia entre organismos e mesmo entre os diferentes genes de um mesmo organismo. Para um mesmo aminoácido, alguns códons permitem maiores velocidades de tradução, menores taxas de erro durante a tradução, bem como menor formação de estruturas que terciárias que inibem a tradução. O mecanismo de utilização de códons preferenciais é complexo, e ainda não existe um modelo bem caracterizado. Entretanto, o aperfeiçoamento da sequência de códons de um gene usualmente é realizado com a obtenção de um gene sintético ou por mutagênese sítio-dirigida, de forma que os códons se assemelhem aos mais utilizados pela espécie hospedeira. É importante não incluir na sequência otimizada sempre o mesmo códon para um mesmo aminoácido, pois esse gene pode gerar uma demanda do mesmo RNA transportador (tRNA) muito maior do que a população normal desse tRNA na célula hospedeira. Isso leva a erros, como a troca de aminoácido durante a tradução proteica, como também pode diminuir a velocidade de tradução22, 23. Além disso, a flexibilidade na escolha de códons é essencial para se evitar sequências repetitivas e estruturas secundárias que desestabilizam o mRNA e impedem seu processamento pelo ribossomo24. O banco de dados de utilização de códons* é uma excelente fonte de informação nesse sentido, pois descreve os códons preferenciais de mais de 35 mil organismos. Adicionalmente, diversas empresas comercializam softwares que facilitam a obtenção dessa sequência otimizada. O processo de otimização de códons refere-se às modificações na sequência de DNA, sempre utilizando códons sinônimos, com o qual a sequência da proteína não é alterada. Assim, é possível reduzir o número de códons raros e motivos que desestabilizam o mRNA, auxiliando no aumento da expressão de proteínas recombinantes em diversos sistemas25. O uso de um gene otimizado pode promover um aumento na expressão proteica, como observado com o gene que codifica a proteína L1 de papilomavírus bovino em Nicotiana benthamiana: a otimização do gene promoveu um grande aumento da expressão da proteína recombinante quando comparado com o uso do gene nativo26. No caso do gene humano que codifica a enzima acetilcolinesterase (AChE), a versão otimizada teve uma produção de cinco a dez vezes maior que o gene nativo de humanos, quando expressa em em N. benthamiana27. Na expressão de genes em organelas, como o cloroplasto, a otimização geralmente é essencial. Isso se deve ao fato de existirem diversas diferenças entre a utilização de códons em cloroplastos e genoma nuclear, mesmo *

Disponível em: <http://www.kazusa.or.jp/codon/>.

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dentro de uma mesma espécie. As organelas possuem genoma e mecanismos de tradução próprios, além de um padrão de utilização de códons similar ao encontrado em bactérias28. No caso de algumas angiospermas, cloroplastos têm preferência por nucleotídeos A e/ou U no fim do códon, enquanto o genoma nuclear tem por G e/ou C. Além disso, os códons mais utilizados em genes de cloroplastos são os mais encontrados em genes menos expressos codificados pelo genoma nuclear29. Apesar dos diversos trabalhos que demonstram resultados positivos em relação a essa otimização, as estratégias de otimização ainda não são 100% seguras, podendo até reduzir os níveis de expressão. Esse foi o caso da expressão do antígeno SAG1 de Toxoplasma gondii em tabaco: o gene otimizado teve uma expressão cinco vezes menor em relação ao gene nativo30. Por isso, um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na utilização de códons preferenciais ainda é necessário.

13.3.3 Escolha de promotores Promotores são sequências de DNA regulatórios adjacentes ao gene e possuem sítios de ligação da RNA polimerase necessários para ocorrer o início da transcrição de DNA em mRNA, além de sítios de ligação de fatores de transcrição que poderão ativar ou inibir a transcrição. O promotor possui um papel essencial para modular a expressão do gene e, consequentemente, para a obtenção de uma alta produção da proteína recombinante. A escolha do promotor utilizado na produção de plantas transgênicas deve ser feita levando em consideração as características da proteína a ser expressa e a espécie do hospedeiro. Por exemplo, não se devem utilizar promotores constitutivos na expressão de proteínas que interfiram no desenvolvimento vegetal. Nesse caso, é preferível um promotor que dirija a expressão somente em alguma parte da planta, como é o caso de promotores específicos de sementes, ou utilizar um promotor induzido por agentes químicos. A Tabela 13.1 identifica os promotores utilizados nos trabalhos citados neste capítulo. Existem vários promotores funcionais descritos na literatura, possibilitando diversas estratégias de produção de proteínas recombinantes, de modo que se faz necessário o entendimento de seus componentes e de sua modulação da expressão gênica. Os promotores são caracterizados de acordo com sua atividade, podendo ser promotores constitutivos, induzidos, sintéticos e específicos de tecidos ou estágio de desenvolvimento (Figura 13.6).

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Figura 13.6 Tipos de promotores. Promotores constitutivos promovem a expressão da proteína recombinante em todos os tecidos vegetais e em qualquer fase do desenvolvimento. Promotores específicos de tecido e/ou estágio de desenvolvimento promovem a expressão somente em determinadas regiões da planta ou em um determinado estágio. Já o promotor induzido promove a expressão apenas na presença de um produto químico ou outros fatores de natureza física ou biológica.

13.3.3.1 Promotores constitutivos Habitualmente, um promotor é denominado constitutivo quando induz a expressão de um gene em praticamente todas as fases de desenvolvimento e em todos os tecidos de uma planta (ou seja, também é ubíquo), sem necessitar de ativação por fatores externos. Geralmente, esses promotores são utilizados para se obter uma alta expressão recombinante em todos os tecidos vegetais. Um dos promotores constitutivos mais utilizados na produção de plantas transgênicas é o promotor 35S, do vírus do mosaico da couve-flor31. Esse promotor é amplamente utilizado por não possuir especificidade por tecido e promover uma expressão alta do transgene 32. Diversos tipos de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico foram obtidos através da utilização desse promotor, como vacinas e anticorpos33, 34. Entretanto, o promotor 35S não possui uma atividade eficiente em monocotiledôneas. O promotor do gene da ubiquitina de milho é amplamente utilizado em monocotiledôneas, nas quais possui altos níveis de expressão35, 36. Um exemplo de sucesso da utilização desse promotor foi a produção correta e em altas quantidades da proteína terapêutica aprotinina em milho37. Outros promotores constitutivos podem ser utilizados para diferentes espécies de hospedeiros, como os de opinas sintetases encontrados em

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agrobactérias, a exemplo da nopalina sintetase (nos) e da manopina sintetase (mas). No entanto, apesar desses promotores serem considerados constitutivos, sua atividade pode ser alterada por lesões na célula vegetal38, 39.

13.3.3.2 Promotores induzíveis Promotores induzíveis são ativados somente na presença ou ausência de fatores bióticos (contato com patógenos, estresse etc.) ou abióticos (produtos químicos, temperatura etc.). A utilização desses tipos de promotores possui algumas vantagens, pois sua atividade pode ser iniciada ou interrompida de acordo com a fase de desenvolvimento da planta e período de tempo em que se deseja que a proteína seja expressa. Esse tipo de promotor cumpre papel essencial na expressão recombinante de proteínas que possam interferir no desenvolvimento vegetal. A proteína humana fator de estimulação de colônias granulócito-macrófago humano (human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor – hGM-CSF) degrada rapidamente quando expressa em cultura de tabaco ao passar do tempo, devido à atividade de proteases encontradas no meio de cultivo. Para que essa questão seja contornada, a proteína foi expressa em arroz, utilizando o promotor Ramy3D, que é ativado na ausência de sacarose: com isso, a expressão pode ser ativada apenas em uma fase de crescimento, na qual a atividade de proteases é menor, possibilitando a obtenção de altas quantidades da proteína recombinante18. Outro sistema de ativação por indução utilizado é o sistema de indução química por etanol (alc). Esse sistema é composto por dois cassetes de expressão: no primeiro, o fator de transcrição ALCR é expresso constitutivamente pelo promotor 35S, mas só é ativo na presença de etanol. O etanol ativa a proteína ALCR, que se liga ao promotor alcA do segundo cassete de expressão (Figura 13.7). O promotor alcA controla a expressão do gene de interesse. Assim, a indução da expressão se dá através da pulverização de álcool no tecido vegetal40.

13.3.3.3 Promotor específico de tecido e/ou estágio de desenvolvimento Esses promotores são utilizados quando é desejável que a proteína recombinante acumule-se apenas em um tecido vegetal ou em um determinado

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Figura 13.7 Sistema do promotor induzível alcR/ALCR. O sistema alcR/alcA é constituído por dois cassetes de expressão, um responsável pela expressão do fator de transcrição ALCR e outro pela expressão da proteína de interesse. O fator de transcrição ALCR é expresso constitutivamente pelo promotor 35S, porém não possui atividade e é incapaz de se ligar ao promotor alcA. Quando a planta é pulverizada com etanol, o fator ALCR interage com o etanol, levando a uma mudança conformacional que o torna ativo. Assim, ele consegue se ligar ao promotor alcA, induzindo a expressão da proteína de interesse. p35S: promotor 35S; alcR: gene codificante da proteína ALCR; ALCR: fator de transcrição ALCR; t-NOS: terminados da nopalina sintase; E: etanol; p-alcA: promotor alcA; t-35S: terminador 35S.

estágio do desenvolvimento. Dessa forma, a expressão do transgene pode ser restrita, impedindo que ocorra a expressão da proteína recombinante em todos os outros tecidos. Um bom exemplo dessa estratégia é a restrição da expressão do transgene às sementes. Isso permite uma série de vantagens, como o aumento da estabilidade da proteína, devido à queda da atividade de proteases, bem como a prevenção da acumulação da proteína em órgãos vegetativos, que pode causar toxicidade para a planta hospedeira 41. A acumulação da proteína recombinante, somente no tecido que será utilizado no processamento, também evita gasto energético desnecessário pela planta, decorrente da expressão em tecidos que serão descartados. A expressão somente em sementes geralmente é realizada em cereais e leguminosas, devido às altas taxas de acúmulo de proteínas de reserva. Para isso, utilizam-se promotores como o do gene que codifica a proteína de reserva de sorgo, denominada g-kafirina 42, utilizado na expressão do hormônio de crescimento humano funcional (hGH) em sementes de tabaco43. O acúmulo de proteínas recombinantes em tubérculos pode ser restringido com a utilização de promotor específico para raiz, estratégia bastante utilizada na produção de vacinas comestíveis. O promotor SRD1, proveniente

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de batata doce, demonstrou altos níveis de expressão heteróloga em tubérculos de batata e em raiz de cenoura, sendo utilizado na produção de proteínas de interesse farmacêutico44. Promotores específicos para a expressão em frutos também são utilizados na produção de vacinas comestíveis. No entanto, apesar de frutas serem mais palatáveis para a ingestão, geralmente seus níveis de acumulação de proteínas recombinantes são baixos. Em frutos de tomate, foi possível a obtenção de antígenos do vírus sincicial respiratório (respiratory syncytial virus – RSV) através do uso do promotor E8, específico de frutos. Após a ingestão do fruto por camundongos, foi verificada uma resposta imunológica significativa, com a produção de anticorpos IgG e IgA anti-RSV, indicando a possibilidade de produzir vacinas comestíveis contra essa doença45.

13.3.3.4 Promotores sintéticos Promotores sintéticos ou híbridos são desenvolvidos para obter um controle mais fino sobre o nível e localização da expressão. Os elementos (sequências de DNA) usados nesses promotores podem ser retirados de diversos organismos e inseridos em um determinado arranjo, formando um promotor que não é encontrado naturalmente. O promotor sintético deve conter requerimentos universais necessários para que ocorra a transcrição de um gene, como o cerne do promotor (core promoter) que possui a região do TATA box (TATAAA) necessária para o recrutamento de complexos proteicos, que por sua vez atraem a RNA polimerase II. Usualmente, à montante do cerne do promotor existem sequências que podem ser potencializadoras e ativadoras, às quais se ligam fatores de transcrição, que promovem e intensificam a formação do complexo de iniciação da transcrição46 (Figura 13.8).

Figura 13.8 Estrutura de um promotor. No cerne do promotor está a região do TATA box necessária para o recrutamento de complexos proteicos que atraem a RNA polimerase II. O promotor pode conter na sua região à montante um potencializador no qual fatores de transcrição específicos ligam-se, ativando e potencializando a transcrição e consequentemente a expressão de uma proteína.

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Um promotor sintético, contendo duas cópias da sequência montante do cerne do promotor 35S, apresentou um aumento em dez vezes da expressão de proteínas recombinantes em plantas, quando comparado com o promotor nativo 35S 47. Já a utilização de um promotor híbrido contendo uma região altamente ativa dos promotores Mas e 35S proporcionou aumentos dos níveis de expressão de proteína recombinante de três a cinco vezes em raízes e de dez a quinze vezes em folhas, quando comparada à versão duplicada do 35S48.

13.4 COMPARTIMENTOS SUBCELULARES Proteínas podem ser expressas e acumuladas em diferentes compartimentos subcelulares. Ao contrário de cloroplastos e mitocôndrias, que possuem uma maquinaria de expressão própria, a maioria das proteínas é sintetizada no citosol ou em ribossomos ligados à membrana do retículo endoplasmático (RE). Neste último caso, o RE é considerado o ponto de entrada da maioria das proteínas secretadas e de membrana49. O sistema secretório celular inicia com a síntese de proteínas no RE, que podem ser retidas no próprio RE, formar corpúsculos oleosos ou serem transportadas para o complexo de Golgi. A partir do complexo de Golgi, as proteínas podem ser secretadas ou direcionadas para o vacúolo. A retenção ou endereçamento de proteínas para compartimentos específicos do sistema secretório ocorre devido à presença de sinais específicos presentes na sequência de peptídeos ou na estrutura da proteína49, 50. A seguir, discutiremos os compartimentos cujas propriedades são mais vantajosas para a acumulação de proteínas recombinantes. O RE é considerado um lugar favorável para o acúmulo de proteínas recombinantes, pois pode armazenar altos níveis de proteína sem interferir no desenvolvimento celular, tem baixa atividade hidrolítica (permite a conservação de proteínas recombinantes em longo prazo) e promove modificações pós-traducionais importantes, como a glicosilação49, 51. A sinalização de retenção da proteína no RE pode ocorrer com a adição de peptídeossinais na extremidade N-terminal, como KDEL, utilizado na obtenção de anticorpos contra o rotavírus em N. Benthamiana 52, HDEL, empregado na produção de anticorpos contra a gastroenterite suína em feijão-de-corda 53, bem como a sequência do peptídeo-sinal da a-coixina, usada na expressão do hormônio de crescimento humano em sementes de tabaco43, 54. A proteína de interesse pode ser fusionada a outras proteínas, como a g-zeína de milho, levando à acumulação em corpúsculos proteicos insolúveis, que são

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facilmente purificados em centrifugação por gradiente55. Um segundo exemplo é a fusão do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAG) com o peptídeo-sinal VSPaL da proteína de estocagem vspA de soja, o que possibilitou a retenção protéica no RE. Isto permitiu uma alta expressão desse antígeno, ocasionando a formação de partículas virais com maior imunogenicidade, quando comparadas com a versão não modificada da proteína56. Vacúolos podem armazenar metabólitos celulares e proteínas, sendo um compartimento subcelular muito utilizado na produção de proteínas recombinantes. Os vacúolos possuem funções físicas e metabólicas no desenvolvimento celular de vegetais, armazenando de forma dinâmica metabólitos celulares e proteínas. A determinação do endereçamento da proteína para o vacúolo ocorre devido à presença de sequências-sinais de aminoácidos N-terminal, C-terminal e sinais internos expostos na estrutura terciária da proteína57, 58. Um exemplo de sequência-sinal é um peptídeo-sinal da proteína inibidora de protease de batata I, que pode ser ligado na região N-terminal da proteína de interesse 59. É importante atentar, também, ao fato de que proteínas recombinantes tóxicas para a planta, quando direcionadas para o vacúolo, têm reduzidas chances de alterar o desenvolvimento vegetal59. Apesar de a sinalização para o vacúolo ainda não ser bem definida, a utilização de peptídeos-sinais para a retenção no RE, como o HDEL e a-coixina, permite que algumas proteínas sejam acumuladas em vacúolos de armazenamento de proteínas, como no caso da expressão do hormônio de crescimento humano em sementes de soja19. Os cloroplastos possuem um sistema de expressão de proteínas próprio, sendo necessária a transformação de seu genoma com sequências regulatórias que garantem a expressão apenas nessa organela, além da otimização de códons como descrito anteriormente. A expressão em cloroplastos possui vantagens como a obtenção de altos níveis de proteínas recombinantes, devido ao fato de cada célula vegetal possuir de dez a cem cloroplastos, e a possibilidade de transformação multigênica, utilizando óperons, com apenas um evento de transformação60. Um dos maiores níveis de expressão em plantas foi observado na produção da proteína cry2Aa2 de Bacillus thuringiensis (Bt) em cloroplastos de tabaco: aproximadamente 46% de proteína total recombinante61. Diversas proteínas de interesse farmacêutico foram obtidas utilizando este sistema, como é o caso da somatropina humana, expressa de forma solúvel, ativa e similar à nativa encontrada em humanos. Nesse caso, o nível de expressão chegou a 7% de proteínas totais solúveis, sendo trezentas vezes mais expressa nesse sistema em comparação com outros métodos62.

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Plantas frequentemente acumulam corpúsculos oleosos em suas sementes. O endereçamento da proteína recombinante para essas estruturas celulares pode ser feito através de sua fusão com uma proteína estrutural denominada oleosina ou pela adição de uma cauda hidrofóbica ancorada na região C-terminal (Figura 13.4). O envio de proteínas recombinantes para esses corpúsculos apresenta algumas características interessantes na obtenção de produtos de interesse farmacêutico, pois facilita a purificação de proteínas, permite a emulsificação protéica e auxilia na obtenção de um produto mais palatável63. Em Arabidopsis, com a utilização desse sistema de expressão, a citocina, fator de crescimento semelhante à insulina humana tipo 1 (human insulin like growth factor 1 – hIGF-1), foi fusionada a uma oleosina, sendo obtida em sua forma ativa. Sua purificação pode ser feita através de sucessivas etapas de centrifugação em tampão aquoso. A separação da proteína-alvo da oleosina pode ser realizada através da digestão por uma protease sítio-específica, liberando a proteína de interesse64.

13.5 MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE PLANTAS Para a transformação genética de plantas, é necessário que o transgene seja inserido na célula hospedeira empregando diversos métodos biológicos ou físicos, que podem ser caracterizados como indiretos e diretos. Dentro dos métodos indiretos, os mais utilizados são a infecção por agrobactéria ou vírus. Os métodos diretos mais comuns estão baseados na biobalística ou canhão de genes, eletroporação de protoplastos e infiltração a vácuo de tecidos com solução contendo agrobactéria. A escolha do método utilizado depende, principalmente, da espécie de hospedeiro, mas também deve levar em conta alguns requerimentos necessários, tais como: baixo custo, facilidade no procedimento/redução de mão de obra extensiva, capacidade de regenerar plantas transgênicas a partir de apenas uma célula hospedeira e eficiência de transformação65. Basicamente, existem duas diferentes estratégias que podem ser utilizadas para a produção de proteínas recombinantes em plantas: a expressão transiente e a expressão permanente. Na expressão transiente, a produção da proteína de interesse ocorre de maneira rápida: poucos dias após a infecção do tecido vegetal por agrobactéria ou vírus contendo o vetor de expressão, ocorre a expressão do gene de interesse e a proteína recombinante é processada para a extração, purificação e caracterização. Esse é um método

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utilizado quando há o interesse em se obter uma proteína de uma maneira rápida, pois alguns passos como a regeneração e a seleção de plantas transformadas não são necessários. Porém, toda vez que a produção da proteína é desejada, é necessário repetir as infecções, pois não é gerada uma planta com o transgene estavelmente integrado no seu genoma. Já a expressão permanente consiste em inserir o gene de interesse no genoma da planta hospedeira. A integração é estável, permite sua expressão permanente e proporciona a transferência do gene para a progênie da planta transformada, possibilitando, assim, a multiplicação de plantas que expressam a proteína de interesse. Como desvantagem com relação à expressão transitória, é um processo que leva meses para ser concluído.

13.5.1 Métodos indiretos Um dos métodos de transformação genética de plantas mais utilizados é a transformação por agrobactéria (Agrobacterium tumefaciens), uma bactéria patogênica que infecta diversos tipos de vegetais causando tumores conhecidos como galha-da-coroa. A multiplicação descontrolada de células vegetais ocorre após a transferência de material genético extracromossomal do plasmídeo indutor de tumor (tumour inducing – Ti) da bactéria para a planta. Esse plasmídeo Ti possui uma região de genes de virulência (vir) e uma região de transferência de DNA (T-DNA), que é mobilizada para a célula vegetal. O T-DNA possui genes de enzimas que sintetizam opinas, compostos derivados de aminoácidos utilizados como fonte de energia, nitrogênio e carbono pela agrobactéria. A ligação da bactéria à planta ocorre através da ativação de genes vir por compostos fenólicos liberados pela célula vegetal quando machucada. As proteínas vir e o T-DNA são transferidos para a célula hospedeira e formam um complexo que permite a integração do T-DNA no genoma vegetal66 (Figura 13.9). A retirada de genes oncogênicos do T-DNA tornou possível a produção de bactérias desarmadas (que transfere o mínimo de T-DNA para célula vegetal sem inibir a regeneração da planta), permitindo a expressão de diversas proteínas de interesse no genoma vegetal. A adição de genes marcadores seletivos, que conferem resistência a herbicidas ou antibióticos, foi a estratégia encontrada para permitir a seleção das células contendo o T-DNA integrado no genoma. O uso de um vetor binário é a estratégia de transformação de agrobactéria mais empregada. Esse vetor consiste em um plasmídeo capaz de se replicar tanto em E.coli quanto em agrobactéria. Além de

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Figura 13.9 Infecção e transferência do T-DNA da agrobactéria para uma célula vegetal. Quando machucada, a célula vegetal libera compostos fenólicos que ativam a expressão de proteínas de virulência da agrobactéria. Essas proteínas auxiliam na transferência de uma fita de T-DNA da bactéria para a célula vegetal através do canal de transporte. Quando a fita de T-DNA entra no núcleo celular ocorre a integração no genoma vegetal.

ser mais versátil, o vetor binário pode ser inserido em cepas de agrobactéria cujo plasmídeo Ti não possui a região do T-DNA, contendo apenas os genes de virulência67 (Figura 13.10). Assim, é possível tanto a obtenção de plantas que produzem essas proteínas de forma transiente, quando se faz a inoculação da agrobactéria em folhas, ou através da transformação genética de uma única célula vegetal, que poderá ser regenerada por técnicas de culturas de tecidos em uma planta transgênica de expressão permanente. Outro método indireto de expressão transiente é baseado em vetores virais, que podem alcançar altos níveis de expressão de proteínas heterólogas. Nessa metodologia, o gene de interesse é inserido entre elementos de replicação viral, amplificado e traduzido pela célula hospedeira, podendo causar uma infecção local ou sistêmica na planta 68. A infecção viral pode ocorrer basicamente através da inoculação mecânica das partículas virais no tecido vegetal ou pelo uso de agrobactéria contendo construções de cDNA

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Figura 13.10 Exemplos de plasmídeos. O plasmídeo Ti possui uma região que expressa proteínas de virulência (genes vir) e uma região de T-DNA contendo genes de enzimas que sintetizam opinas. A região T-DNA possui duas bordas (esquerda e direita) com sequências repetidas de nucleotídeos, delineando a região do plasmídeo a ser processada pelas proteínas de virulência. O plasmídeo Ti cujos genes contidos no T-DNA foram retirados é chamado de plasmídeo Ti desarmado. Um vetor binário possui usualmente o cassete de expressão da proteína de interesse e um segundo cassete de expressão de um gene de resistência (podendo conter também um terceiro cassete, com um gene repórter) inserido entre as duas bordas características do T-DNA, além de uma sequência de DNA, denominada origem de replicação, que permite a multiplicação do plasmídeo em E. coli e agrobactéria. Quando uma agrobactéria desarmada (contendo o plasmídeo Ti desarmado) é transformada com o vetor binário, temos uma células apta para proceder à transferência do T-DNA para a célula vegetal.

virais com o gene de interesse, possibilitando a utilização de vírus que não infectam naturalmente a planta de forma mecânica68.

13.5.2 Métodos diretos O método de biobalística, também conhecido como canhão de genes, permite a entrada do DNA exógeno em células vegetais sem a ajuda de micro-organismos como a agrobactéria. A biobalística consiste em cobrir partículas de tungstênio ou ouro, menores que a célula vegetal, com o vetor

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de expressão contendo o DNA de interesse (Figura 13.11). A transformação genética ocorre com a aceleração dessas partículas por gás hélio em direção à célula vegetal, em uma câmara à vácuo. Quando aceleradas, essas partículas conseguem atravessar a parede celular e os transgenes são liberados das partículas podendo ser integrados ao genoma vegetal. Essa técnica é bastante utilizada, pois pode ser empregada em diversas espécies vegetais, e também por ser considerada um processo rápido de transformação65.

Figura 13.11 Método de biobalística. Esta técnica de transformação genética utiliza jatos de gás hélio para acelerar partículas de ouro ou tungstênio impregnadas com o DNA exógeno. As partículas são aceleradas a velocidades supersônicas, sendo capazes de romper as barreiras celulares e entrar no núcleo celular. Após a entrada, o DNA é dissolvido e integrado no genoma vegetal.

A eletroporação é utilizada na transformação genética de protoplastos (célula vegetal sem parede celular). Na eletroporação, os protoplastos são imersos em solução com o material genético contendo o transgene, sendo aplicadas altas voltagens para permeabilizar a membrana celular (Figura 13.12). Com isso, ocorre a passagem do DNA exógeno para o interior da célula, permitindo a sua integração no genoma vegetal. A proteína pode ser recuperada de 24 a 48 horas após a transfecção do DNA (expressão transitória), ou os protoplastos podem ser cultivados in vitro, originando plantas geneticamente modificadas. No entanto, a produção de protoplastos

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Figura 13.12 Eletroporação de protoplastos. Quando é aplicado um choque elétrico ocorre permeabilização da membrana dos protoplastos, que estão imersos em uma solução contendo DNA. Como isso ocorre a entrada do DNA na célula, que posteriormente é integrado ao genoma vegetal.

e a posterior regeneração de plantas envolvem metodologias laboriosas, cuja eficiência ainda é avaliada como baixa69. Um método que une a transformação mediada por bactéria com a física é a agroinfiltração a vácuo. Nessa técnica, a infiltração da agrobactéria no tecido vegetal ocorre com a aplicação de vácuo em um sistema que contém a planta hospedeira em meio de cultura de agrobactérias, transformadas com o vetor de expressão (Figura 13.13). Com a aplicação do vácuo, a pressão negativa faz com que o ar entre as células vegetais diminua, permitindo a entrada das bactérias nessa região. Esse sistema, normalmente é utilizado para expressão transiente, pois é um método muito rápido de produção de proteínas recombinantes, apesar de ter uma eficiência de transformação média em relação aos outros métodos65. Os métodos discutidos anteriormente são os mais utilizados e que reproduzem os melhores resultados. Entretanto, existem diversas outras técnicas de transformação genética de plantas que são menos utilizadas devido à complexidade dos processos, altos custos e baixa eficiência na regeneração de plantas a partir da cultura de tecidos. Dentre estes, podemos citar a microinjeção70, a eletroforese71 e os microfeixes de laser72.

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Figura 13.13 Agroinfiltração a vácuo. Em uma câmara de vácuo é colocado um recipiente com meio de cultura com agrobactéria contendo um vetor que expressa a proteína de interesse. Com a aplicação de vácuo, a pressão negativa faz com que o ar contido entre as células diminua, permitindo a entrada da bactéria nesses espaços. Posteriormente, a bactéria transfere seu DNA para as células, nas quais o gene de interesse será expresso, produzindo a proteína recombinante.

13.6 MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS As modificações pós-traducionais são um aspecto de grande importância no que concerne à produção de proteínas recombinantes em plantas. A glicosilação e a lipidação, que atuam diretamente na estrutura, função, estabilidade e na interação da proteína com outras moléculas são exemplos dessas modificações. Dentre elas, a glicosilação é a mais estudada, consistindo no padrão de adição de moléculas de açúcares às proteínas. A glicosilação de proteínas tem diversas funções, dentre as quais a manutenção da estrutura tridimensional e o aumento da estabilidade73. Os organismos apresentam dois principais mecanismos de glicosilação: N-glicosilação, quando há a adição de açúcares em resíduos de asparagina ou arginina, ou O-glicosilação, quando a adição de açúcares ocorre em resíduos de hidroxilisina, hidroxiprolina, serina, tirosina e treonina. As plantas possuem uma ampla gama de enzimas envolvidas no processo de glicosilação74. O padrão de glicosilação de proteínas realizado pelas células vegetais difere ligeiramente daquele observado em células humanas (Figura 13.14). A adição de b(1,2) xilose e a(1,3) fucose, que ocorre no complexo de Golgi em plantas, pode, potencialmente, desencadear respostas imunes indesejadas (alergias)75. No entanto, diversos estudos indicam que essas diferenças

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Figura 13.14 Padrão de glicosilação em plantas e humanos. Em plantas ocorre a adição de a(1,3) fucose e b(1,2) xilose na estrutura do glicoconjugado. Já em humanos ocorre a adição de a(1,6) fucose, b(1,4) galactose e de ácido N-acetilneuramínico na estrutura. O cerne do glicoconjugado é composto por N-acetilglicosamina e manose, sendo igual em plantas e humanos. Legenda: GlcNAc: N-acetilglicosamina; Man: manose; Fuc: fucose; Xil: xilose; Gal: galactose; NeuAC: ácido N-acetilneuramínico.

têm impacto mínimo ou nulo na atividade ou alergenicidade das proteínas recombinantes75, 76. A glicoengenharia é uma estratégia que emprega modificações do genoma do hospedeiro, de forma a inserir, nocautear ou reprimir genes que atuam na glicosilação de proteínas. Isso permite que a proteína recombinante tenha um padrão de glicosilação parecido ao observado no organismo doador do gene de interesse. Por exemplo, em Nicotiana benthamiana foi possível produzir

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um transgênico em que a expressão dos genes FucT e XylT foi reprimida por técnica de RNA de interferência (RNAi), possibilitando a obtenção de anticorpos monoclonais 2G12 anti-HIV, que não possuíam b(1,2) xilose e a(1,3) fucose em sua estrutura 77. Por outro lado, as plantas não têm algumas enzimas que são encontradas em mamíferos: b-Galactosiltransferase (betaGalT), responsável pela adição de b(1,4) galactose, enzimas necessárias para a síntese do ácido siálico N-acetilneuramínico (NeuAC) e para mediar sua ligação em b(1,4) galactose da estrutura do glicoconjugado 75 (Figura 13.14). Consequentemente, a glicosilação de proteínas recombinantes pode diferir daquela observada em mamíferos, gerando problemas como a queda da eficácia do produto terapêutico. Entretanto, é possível a coexpressão da enzima betaGalT com outras proteínas de interesse. A expressão de anticorpos monoclonais de camundongo em células de tabaco que expressam a GalT humana permitiu a produção de anticorpos com padrões de adição de galactose semelhantes à encontrada em humanos em sua estrutura78. Uma segunda aplicação da glicoengenharia está relacionada à adição de novos sítios de glicosilação em uma determinada proteína, pois padrões de glicosilação de proteínas distintos do observado naturalmente podem ter consequências positivas quanto ao uso de proteínas recombinantes na saúde humana. A adição de novos sítios de glicosilação N-terminal na sequência da proteína eritropoetina humana (recombinant human erythropoietin – rHuEPO) permitiu obter uma proteína recombinante expressa em células de mamíferos com glicosilações adicionais às encontradas na proteína nativa. Dessa maneira, a proteína recombinante apresentou tanto um aumento em sua atividade in vivo quanto no tempo de duração de sua ação79. Proteínas podem ser covalentemente ligadas a lipídios, incluindo ácidos graxos e colesterol. Essas modificações pós-transducionais ocorrem geralmente em resíduos de cisteína e glicina, possuindo funções importantes na atividade e na localização da proteína. A proteína de superfície celular A (outer surface protein A – OspA) de Borrelia burgdorferi, agente causador da doença de Lyme ou borreliose, é imunogênica somente quando ocorre a ligação do ácido graxo palmitato em sua região N-terminal. A utilidade da adição de lipídios a proteínas em plantas pode ser comprovada com a expressão da OspA em cloroplastos de tabaco. Nesse caso, a proteína recombinante foi modificada com a adição de lipídeos e apresentou uma resposta imunológica aceitável, podendo ser utilizada para promover proteção contra a borreliose80.

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13.6.1 Produção de partículas virais (virus like particle – VLPs) VLPs são partículas virais montadas através do arranjo de proteínas estruturais do capsídeo viral. Elas não possuem material genético e são, usualmente, muito imunogênicas e não infecciosas, semelhantes aos vírions (partícula viral completa que está fora da célula hospedeira, sendo constituída por DNA ou RNA cercado por proteínas). Essas características permitem a produção de vacinas recombinantes mais seguras do que as que têm como base a utilização de vírus atenuados ou inativados. A produção de VLPs em células vegetais é uma alternativa promissora, pois plantas oferecem um ambiente favorável para a formação correta de VLPs recombinantes. O antígeno HBsAg do vírus da hepatite B, quando expresso em folhas de tabaco, forma VLPs semelhantes às encontradas em sua forma nativa81. A produção desse antígeno também foi feita em batata, sendo que camundongos imunizados através da ingestão do tubérculo desenvolveram uma resposta imunológica primária que pode ser ampliada com uma subsequente imunização com um antígeno comercial. Apesar da baixa expressão do HbsAg, foi possível verificar em testes pré-clínicos, em animais, a eficácia da vacina 82. Testes posteriores em humanos demonstraram que aproximadamente 60% dos voluntários que ingeriram a batata transgênica desenvolveram uma resposta sistemática por anticorpo contra o antígeno HBsAg, indicando uma possível viabilidade em se utilizar vacinas comestíveis em humanos21. Outras VLPs podem ser obtidas através da transgenia de plantas como, por exemplo, a VLP do vírus Norwalk, causador da gastroenterite humana, em frutos de tomate 83, e a VLP do papilomavírus humano (HPV), através da expressão da proteína L1 em cloroplasto de folhas de tabaco 84. Esses trabalhos demonstram a capacidade e a versatilidade de células vegetais em produzir partículas virais através da expressão de proteínas estruturais recombinantes.

13.7 PROCESSOS DOWNSTREAM O desenvolvimento de uma estratégia eficiente de concentração e purificação de proteínas recombinantes em plantas é essencial na produção de produtos farmacêuticos, devido à necessidade de se obter purezas maiores que 99% para proteínas de uso terapêutico, e maiores que 90% para a

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utilização de tais proteínas em diagnósticos. Os processos downstream são necessários para a obtenção de um produto de alta qualidade e elevada pureza, sendo divididos em várias etapas: liberação do produto ou extração de proteínas totais através da quebra da célula vegetal por métodos físicos ou químicos, separação da fase sólida e líquida através de técnicas de centrifugação, microfiltração ou filtração de profundidade, pré-tratamento para diminuir a quantidade de impurezas e de proteínas endógenas da planta, como a técnica de precipitação por sulfato de amônio de umas das proteínas mais abundantes em plantas, a RuBisCo85 e, por fim, as etapas de captura e polimento através de técnicas cromatográficas ou não cromatográficas (Figura 13.15).

Figura 13.15 Processos de purificação de proteínas recombinantes expressas em plantas.

A eficiência de cada etapa é determinada por diversas variáveis, como a concentração e as características da proteína recombinante, nível de complexidade do extrato proteico vegetal e o nível de pureza que deve ser alcançado. Assim, a estratégia de purificação adotada deve ser estudada especificamente para cada caso86. Como os processos de purificação utilizados em plantas são semelhantes aos encontrados em outros organismos, eles serão discutidos detalhadamente em outro capítulo deste livro.

13.8 BIOSSEGURANÇA A utilização de plantas transgênicas na produção de fármacos e na alimentação humana ou animal gera diversas preocupações em relação aos efeitos dessas culturas na saúde humana e sobre o meio ambiente. A primeira geração de plantas geneticamente modificadas esteve focada na produção de proteínas que conferiam resistência a patógenos e a herbicidas. Já as plantas transgênicas voltadas à produção de fármacos expressam proteínas que têm atividade biológica em animais e humanos. O fato de a produção ser

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otimizada para se obter o máximo de expressão heteróloga é um fator que aumenta os riscos em relação à exposição humana e ao meio ambiente87. Como pequenas doses dessas proteínas recombinantes podem causar efeitos indesejados em humanos e animais, um dos principais focos da avaliação de biossegurança dessas culturas é evitar a possibilidade de ocorrer uma ingestão acidental desses vegetais e/ou a entrada errônea dessas plantas, ou parte delas, na cadeia produtiva de alimentos. Um cuidado especial deve ser observado durante o processamento do material e o descarte da biomassa após os processos de extração. Adicionalmente, deve-se avaliar o impacto ambiental dessas culturas quando cultivadas em ambiente aberto (não em contenção), devido ao fluxo gênico entre plantas geneticamente modificadas e não modificadas87, 88. Algumas estratégias de biossegurança podem ser utilizadas para impedir que essas culturas transgênicas sejam consumidas inapropriadamente por humanos e animais, ou evitar o cruzamento com plantas não transgênicas. Dentre essas estratégias está a escolha de um organismo hospedeiro que não seja utilizado na alimentação, como o tabaco. Como alternativa, técnicas de contenção física ou biológica podem ser aplicadas para evitar a disseminação do transgene para plantas cultivadas com finalidade alimentar88, 89. A contenção física pode ser feita através do cultivo de plantas em estufas ou câmaras de crescimento, ou em tanques de contenção. É neste último que ocorre o cultivo de células vegetais em suspensão. Já na produção em campo aberto, duas estratégias são as mais utilizadas para conter o fluxo gênico. Uma delas é manter uma distância entre os cultivares transgênicos das plantas não geneticamente modificadas (GM) da mesma espécie, sendo que essa distância varia de espécie para espécie. Isso é feito normalmente empregando-se o cultivo de plantas selvagens da mesma espécie nas bordas da plantação, que são posteriormente descartadas (Figura 13.16). A segunda opção é limitar a produção de organismos geneticamente modificados (OGM) a regiões nas quais não existam plantas selvagens e/ou cultivadas da mesma espécie88, 89. Técnicas biológicas também podem ser empregadas para o mesmo fim. Dentre diversas opções, temos a produção de semente estéril, o que impede a propagação de plantas GM, ou mesmo a macho-esterilidade, que não permite a disseminação do transgene pelo pólen. A transformação genética de cloroplastos também é eficiente, pois impede a disseminação dos transgenes pelo pólen devido à herança maternal do genoma da organela na maioria das espécies de plantas. A expressão transiente em tecidos vegetais usualmente é realizada antes da produção de pólen, e a possibilidade de integração do

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Figura 13.16 Métodos de contenção de plantas GM. Plantas podem ser cultivadas em casas de vegetação, impedindo que plantas GM polinizem outras culturas. A expressão de proteínas recombinantes em culturas de células em suspensão ocorre em tanques de contenção, o que garante um maior controle da disseminação destas células. Já na produção em campo aberto, a Resolução Normativa 4 da CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança) determina que uma plantação de OGM deve estar a 100 metros de distância de uma plantação convencional da mesma espécie. Alternativamente, a distância pode ser de 20 metros, desde que sejam plantadas em suas bordas dez fileiras de plantas convencionais da mesma espécie, cujo desenvolvimento seja parecido com a GM. Métodos biológicos de contenção também podem ser utilizados, como exemplo a macho-esterilidade e a transformação de cloroplastos, que impedem a disseminação do transgene pelo pólen. Já a produção de sementes estéreis evita que ocorra a multiplicação de plantas GM, pois elas não germinam. Pode-se realizar a expressão de forma transiente, já que o transgene não é repassado para a progênie da planta. Por fim, a utilização de promotores induzíveis por produtos químicos é uma alternativa, pois promovem a expressão do transgene de uma forma controlada.

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transgene no genoma hospedeiro é muito reduzida, de modo que o transgene não é repassado para a progênie da planta. Por fim, existe a possibilidade da utilização de promotores induzidos por produtos químicos, que promovem a expressão de uma forma controlada. Assim, mesmo que houvesse a transferência de material genético, não haveria produção da proteína em condições naturais88,89 (Figura 13.16). No Brasil, está em vigor a Lei de Biossegurança (Lei n. 11.105/2005), que estabelece normas de segurança e fiscalização sobre diversas etapas de manipulação de OGMs e seus derivados, tanto para fins de pesquisa quanto para comercialização. A Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio) tem uma série de exigências para atividades envolvendo OGMs. Somente após criteriosa análise é permitida a realização de pesquisas, cabendo destacar que as exigências para a comercialização são muito mais complexas. As normas de biossegurança nacionais são extensas e podem ser encontradas na página da web da CTNBio*.

13.9 PROPRIEDADE INTELECTUAL A produção de proteínas recombinantes com a finalidade de uso farmacêutico e industrial, geralmente é realizada com o intuito de se obter um produto comercial. Consequentemente, os pesquisadores em universidades ou centros de pesquisa públicos e aqueles em empresas, especialmente, devem tomar conhecimento dos aspectos legais em relação à propriedade intelectual. Essa preocupação visa não só proteger as próprias pesquisas, mas também evitar infringir patentes que possam estar relacionadas ao desenvolvimento de plantas transgênicas. Um equívoco muito comum é postergar os assuntos relacionados à propriedade intelectual para o momento em que o produto estiver pronto, como, por exemplo, quando após anos de experimentos chega-se a uma planta que produz uma proteína humana de alto valor agregado. Via de regra, esse é o pior momento para negociar com terceiros o uso de tecnologias que foram usadas para se chegar ao produto. Kowalski e colaboradores 90 discutem de forma clara o que cientistas devem saber sobre direitos de propriedade intelectual na biotecnologia de cultivares transgênicos. Diversos componentes e processos comumente utilizados em biotecnologia têm direitos de propriedade e/ou termos de

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Ver <http://www.ctnbio.gov.br/>.

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transferência de tecnologia (MTA), como é o caso do gene nptII, que confere às plantas a resistência à canamicina, e do promotor 35S. Uma primeira etapa, a ser realizada ainda na fase de planejamento, já deve mapear as tecnologias e insumos que podem ser propriedade de terceiros. Para facilitar o processo de análise de patentes envolvidas e verificar se o produto final pode ou não estar livre para comercialização, é necessário desconstruir o produto, verificando seus componentes e processos. Uma vez identificadas as partes (processos, sequências de DNA etc.), a existência de propriedade industrial de cada item deve ser analisada em bancos de dados de patentes. Diversos bancos de patentes estão disponíveis na internet. Entre eles, há bancos gratuitos *, como o do Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI), para patentes depositadas no Brasil; o do escritório de patentes dos Estados Unidos, USPTO, para patentes depositadas nos Estados Unidos; e o Espacenet, especializado em patentes europeias; e os bancos pagos **, como o Derwent, da Thomson Reuters. Sequências de DNA protegidas por patentes podem ser analisadas por bancos de dados *** como o do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e o do Cambia, sendo que neste último é possível verificar sequências contidas somente nas reivindicações das patentes. Nesse ponto, cabe uma ressalva importante: a maioria das patentes envolvendo genes contém listas muito longas, com centenas de sequências gênicas. No entanto, em geral apenas uma delas é de fato o objeto da patente e que consta nas reivindicações. O banco de dados do NCBI faz comparações de uma determinada sequência do usuário contra todas as sequências que constam nas patentes, mas não é capaz de fazer somente contra aquelas que de fato são protegidas nas patentes. Isso gera uma quantidade enorme de falsos positivos, ou seja, o pesquisador observa que a sua sequência é muito similar a outra que consta em uma determinada patente. No entanto, como mencionado anteriormente, somente se aquela sequência do banco de dados estiver mencionada nas reivindicações é que o pesquisador terá conflito real. Outro ponto relevante diz respeito aos termos de transferência de tecnologia, comumente exigidos por universidades e empresas dos Estados Unidos e Europa, como condição para o envio de sequências de genes, vetores etc. É muito comum que o pesquisador assine esses termos para obter o material desejado, porém, sem a devida atenção às cláusulas do termo. Normalmente, *

INPI: <http://www.inpi.gov.br/>; USPTO: <http://www.uspto.gov/>; Espacenet: <http://worldwide.espacenet.com/>. ** Derwent: <http://thomsonreuters.com/derwent-innovations-index/>. *** NCBI: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>; Cambia: <http://www.patentlens.net/>.

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esses documentos delimitam o uso do material exclusivamente para fins de pesquisa, possuindo severas restrições em relação à comercialização de produtos contendo o material em questão. Enquanto patentes expiram usualmente após vinte anos, os acordos de transferência de materiais não costumam ter prazo de validade, o que é um complicador a mais. A síntese de sequências de DNA que não sejam disponibilizadas gratuitamente, mas que estão disponíveis em bancos de dados públicos é uma alternativa simples e que pode eliminar a necessidade de assinar termos de transferência de material. Porém, sempre que houver a intenção de comercializar um produto, qualquer decisão precisa ser muito bem planejada, para se encontrar a melhor estratégia, evitando, assim, problemas futuros.

13.10 EXEMPLOS DE PRODUTOS FARMACÊUTICOS PRODUZIDOS EM PLANTAS Diversos produtos farmacêuticos podem ser obtidos através de utilização de plantas transgênicas (Tabela 13.1). Embora a grande maioria ainda esteja em fase de desenvolvimento e em testes pré-clínicos, vários já estão aprovados para comercialização por agências regulatórias ou, inclusive, já disponíveis no mercado. A seguir, serão discutidas algumas aplicações de plantas transgênicas na produção de vacinas, anticorpos, citocinas, hormônios e outras proteínas de interesse farmacêutico.

13.10.1 Vacinas Antígenos de diversos patógenos humanos ou animais têm sido produzidos em plantas e testados em relação à sua eficácia em conferir imunidade a uma determinada doença. Ainda que vacinas produzidas em plantas possam ser administradas por via parenteral, uma das principais vantagens em expressar antígenos em plantas é a possibilidade de produzir vacinas comestíveis, já que a administração oral desses vegetais pode promover uma proteção imunogênica humoral e celular contra infecções gastrointestinais ou não91. Adicionalmente, como antes citado, é possível produzir VLPs altamente imunogênicos em plantas, que podem ser utilizados como vacinas. Por exemplo, a produção de VLPs obtidas através da expressão em alface de um antígeno de superfície do vírus da hepatite B (S-HBsAg). Nesse caso, foi possível

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imunizar camundongos por via oral com pequenas doses desse antígeno (100 ng/dose). Os camundongos imunizados apresentaram uma resposta imune contra HB na mucosa e humoral de forma sistêmica. Os autores descreveram que o pó liofilizado dessa planta, quando convertido em tabletes, pode apresentar alta durabilidade e preservar os antígenos por, no mínimo, um ano33. De maneira alternativa, vacinas contra HB também podem ser expressas em tabaco, como no caso dos antígenos de superfície médio e grande (M/L-HBsAg) 92, também em tomate, como é o caso do antígeno L-HbsAG 93 ou em banana, como no caso do antígeno S-HbsAg94. A primeira vacina produzida de forma recombinante em plantas que obteve aprovação regulatória nos Estados Unidos protege galinhas contra o vírus de Newcastle. Ela é obtida através da expressão de antígenos desse patógeno em suspensão de células de tabaco95. Existem diversos tipos de vacinas para humanos e animais sendo produzidas em escala laboratorial, e a variedade de plantas hospedeiras, técnicas e tipos de patógenos são extensos. Resumidamente, podemos citar alguns antígenos expressos com o intuito de promover proteção contra patógenos virais: a expressão da proteína L1 do papilomavírus humano (HPV) em tabaco96 e da proteína TAT do vírus HIV, obtida em espinafre 97. Para patógenos bacterianos: a produção da toxina B de Vibrio cholerae em milho 98 e da proteína ESAT-6 de Mycobacterium tuberculosis, expressa em cloroplastos de tabaco ou de alface99 e, finalmente, contra o protozoário causador da malária, o antígeno PfMSP119 de Plasmodium falciparum em folhas de tabaco100.

13.10.2 Anticorpos Anticorpos são glicoproteínas produzidas pelo sistema imune de vertebrados, que reconhecem e se ligam à antígenos com grande especificidade e afinidade. Devido a essas características, anticorpos podem ser utilizados de diversas maneiras, como na prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças que atingem humanos e animais. A capacidade de plantas em produzir e montar corretamente anticorpos foi comprovada pela expressão de IgGs completos e funcionais em folhas de tabaco101. Após esse trabalho pioneiro, diversos anticorpos ou fragmentos foram produzidos em plantas. Anticorpos mais complexos como IgAs, encontrado em superfícies de mucosas, também podem ser obtidos em plantas, como no caso do produto CaroRx. Esse produto possui um anticorpo

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de secreção IgA, produzido em folhas de tabaco transgênico que se liga à bactéria Streptococcus mutans, impedindo sua colonização nos dentes, auxiliando no tratamento e na prevenção de cáries dentárias102. Outro anticorpo de alto interesse farmacêutico produzido em plantas é o 2G12, que foi expresso em N. benthamiana e em milho 77, 103. Testes in vitro demonstraram que esse anticorpo é capaz de neutralizar o vírus HIV de uma forma melhor quando comparado com o produzido em células de mamíferos. Atualmente, o produto está em fase de testes em humanos pelo Consórcio Pharma-Planta*, e seu processo de produção já foi aprovado de acordo com as boas práticas industriais104. Dentre diversos anticorpos que estão sendo produzidos em plantas, podemos destacar a obtenção da imunoglobulina A (hlgA_2A1), que se liga ao peptídeo VP8 de rotavírus em plantas de tomate. Em testes in vitro, esse anticorpo demonstrou ser eficaz para inibir a infecção viral. Além disso, os autores cruzaram linhagens de plantas expressando hlgA_2A1 com plantas que expressam genes responsáveis pela biossíntese de antocianinas em tomate, conferindo a cor roxa para os frutos, tornando possível a distinção visual das plantas transgênicas e das selvagens105. O vírus da raiva causa uma doença neuro-invasiva letal. A estratégia de tratamento e intervenção é a neutralização do agente infeccioso com anticorpos logo após a exposição ao vírus, antes da entrada no sistema nervoso. Plantas podem ser úteis para o desenvolvimento de anticorpos para o tratamento dessa enfermidade, pois foi possível expressar em tabaco anticorpos que neutralizam o vírus da raiva de uma maneira semelhante aos anticorpos produzidos em hibridomas105.

13.10.3 Citocinas Citocinas são pequenas proteínas secretadas, glicosiladas ou não, cuja função é a sinalização entre células, incluindo processos de proliferação, diferenciação e apoptose celular. Citocinas são diversas e abrangem hematopoietinas, interleucinas, interferons, fatores de crescimento, fatores de necrose tumoral e quimiocinas. Elas podem ser utilizadas no tratamento contra o câncer, distúrbios no sistema imune e diversas outras doenças. Devido ao seu alto custo de produção, o uso clínico de citocinas é limitado,

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Ver <http://www.pharma-planta.net>.

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tornando a produção em plantas desejável por ser um sistema considerado mais barato de fabricação107. Diversas citocinas foram expressas em plantas visando à redução de custo de produção, como o IFN-b, produzido em tabaco108 e as interleucinas IL-10 e IL-13, também produzidas em tabaco109, 110. Em sementes de arroz foi possível obter o fator de crescimento humano semelhante à insulina (hlGF-1) utilizada no tratamento da diabetes, em concentrações maiores de 6% de proteína total em sementes. Ademais, camundongos diabéticos que receberam doses dessa proteína por via oral tiveram taxas de glicose sanguínea reduzidas, sugerindo a possibilidade de tratamento dessa doença através da ingestão de vegetais contendo esses peptídeos111. Citocinas expressas em plantas já são encontradas comercialmente: a empresa ORF Genetics comercializa cerca de trinta fatores de crescimento para uso em pesquisa (ISOKine TM). A obtenção desses peptídeos ocorre através da utilização de um sistema chamado Orfeus TM, que consiste na clonagem rápida e eficiente de genes contidos em um cassete de expressão, sendo que a produção ocorre em sementes de cevada hidropônica mantidas em um ambiente altamente controlado para otimizar a expressão.

13.10.4 Hormônios Hormônios humanos importantes, como a insulina, também podem ser produzidos de forma recombinante em plantas. Altas quantidades da proinsulina (precursor da insulina) foram obtidas em cloroplastos de tabaco e alface (47% e 53%, respectivamente). Assumindo que a produção dessa proteína é de 3 mg/g de folha, os autores estimaram que seria possível obter em um acre de plantação (40 toneladas de tabaco ou 11 toneladas de alface) em torno de 20 milhões de doses de insulina, mesmo levando em consideração uma perda de 50% desse hormônio durante as etapas de purificação. É importante mencionar que a administração via oral ou injetável da proinsulina recombinante em camundongos foi capaz de promover uma redução nos níveis de glicose sanguínea similar à insulina comercial112. Outro hormônio de importância farmacêutica é o hormônio de crescimento humano, que estimula o crescimento e a reprodução celular. Através da expressão em sementes de soja, foi possível obter aproximadamente 9 g de hGH por quilo de semente. Os autores relataram que, devido ao acúmulo dessa proteína em vacúolos de estocagem, a estabilidade é mantida por longos períodos de tempo19. Já a expressão desse hormônio em cultura

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de células de arroz alcançou 57 mg por litro de meio de cultura, quando foi utilizado o promotor Ramy 3D113.

13.10.5 Outros produtos de interesse farmacêutico Indivíduos com quadro clínico de Gaucher possuem mutações no gene que codifica a enzima glicocerebrosidase (GDC), cuja falta no organismo leva a uma disfunção de múltiplos órgãos. O tratamento para essa doença é a reposição intravenosa da enzima GDC, considerada uma das drogas mais caras no mercado. A produção dessa enzima foi realizada pela expressão em vacúolos de células de cenoura em suspensão, de uma forma industrial e menos custosa. A GDC recombinante foi testada em camundongos e humanos sadios, e a empresa Protalix passou a elaborá-la sob o nome de ElelysoTM (Taliglucerase Alfa)17, 114. A expressão de proteínas presentes no leite materno empregando plantas é uma alternativa que beneficia a produção de formulações de alimentos infantis, tornando esses alimentos mais saudáveis. A lactoferrina humana (HLF) é uma proteína encontrada em alta quantidade no leite materno e atua na proteção contra patógenos, modulação do sistema imunológico, absorção de ferro e no crescimento celular. A expressão da HLF de forma recombinante em arroz foi realizada através da expressão de um gene sintético codificante de HLF controlado por um promotor da glutelina de arroz (Gt1). A proteína recombinante HLF inibiu o crescimento de patógenos humanos e se mostrou resistente à digestão por proteases in vitro, indicando que ela pode resistir à degradação durante a digestão. Ademais, sementes transgênicas de arroz apresentaram quantidades de ferro duas vezes maiores que a encontrada em sementes não GM, sugerindo que esse arroz pode ser utilizado não só em fórmulas alimentares para crianças, mas também auxiliar pessoas com deficiências nutricionais sérias devido à falta de ferro115, 116.

13.11 PERSPECTIVAS FUTURAS A tecnologia de produção recombinante de proteínas de interesse farmacêutico tem se aprimorado constantemente e a cada ano surgem novas estratégias com o intuito de desenvolver proteínas com características semelhantes às encontradas naturalmente, sempre visando também ao uso de plataformas de baixo custo. Avanços futuros na produção dessas plantas

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transgênicas podem incluir o desenvolvimento e escolha de espécies hospedeiras que se adaptem a diferentes climas, permitindo o cultivo em várias regiões do planeta. Isso abre perspectivas de atender a demanda em países que mais necessitam de um determinado produto. O desenvolvimento de plantas cujos padrões de glicosilação são semelhantes aos encontrados em humanos pode também colaborar com a melhoria da qualidade dos produtos provenientes dessa tecnologia. A pesquisa de novos elementos controladores, como promotores e potencializadores da transcrição, junto com um melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na utilização de códons preferenciais, certamente irá colaborar para o aumento da expressão proteica. Esse componente é essencial, pois afeta diretamente os custos de produção. O aperfeiçoamento de técnicas de extração e purificação de proteínas recombinantes também é um foco muito investigado. Isso se deve ao fato de o maior custo de produção ocorrer nessa etapa da produção e também devido à alta porcentagem de pureza que deve ser alcançada para uma molécula poder ser utilizada como fármaco. Para isso, novas metodologias, como a produção de corpúsculos oleosos e a secreção em meio de cultura, são necessárias, pois estas permitem que algumas etapas de purificação e processamento sejam eliminadas. Já a expressão de forma transiente pode ser uma alternativa na produção de vacinas contra patógenos que mutam rapidamente, uma vez que a expressão de antígenos vacinais pode ser realizada em um curto período de tempo. É o caso das vacinas contra o vírus influenza, causador da gripe, que podem ser obtida de uma forma mais rápida em plantas em comparação com a produção em ovos. Um exemplo é a vacina contra H5N1, produzida em plantas pela empresa Medicago.

13.12 CONCLUSÕES Neste capítulo, discutimos diferentes aspectos em relação à produção de plantas transgênicas para a obtenção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico. Plantas possuem algumas vantagens em relação a outros organismos hospedeiros em questões de qualidade, escalabilidade e segurança. Na escolha da espécie hospedeira devem ser consideradas algumas características vegetais, como a possibilidade de transformação genética, cultivo e colheita, processamento do material vegetal, transporte, complexidade de metabólitos e proteínas endógenas, níveis de produção de massa e a

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possibilidade de escalonamento da produção. Diversas espécies podem ser utilizadas, algumas com metodologias de transformação já bem desenvolvidas, e outras, não. Porém, diversos grupos de pesquisadores vêm trabalhando tanto no desenvolvimento dessas técnicas quanto na identificação de novos hospedeiros vegetais para a produção recombinante de proteínas. Uma alta expressão proteica é elemento chave na produção de fármacos em vegetais. Apesar de ainda não existir um modelo definitivo sobre a utilização de códons em organismos, a otimização dos códons do gene exógeno, de acordo com os mais utilizados pelo hospedeiro, tem promovido bons resultados. Na literatura, existem diversos promotores e sequências regulatórias descritas, e constantemente o número tem aumentado. Neste capítulo, citamos os tipos mais utilizados e que apresentaram resultados positivos consistentes. A escolha dessas sequências deve levar em consideração diversos aspectos, como mencionado anteriormente. A produção, endereçamento e retenção da proteína de interesse para uma determinada organela pode influenciar tanto na estabilidade proteica quanto nos níveis de acúmulo. Em cloroplastos é possível obter altos níveis de expressão, devido à presença de várias organelas em uma única célula. No entanto, por possuírem características bacterianas, não promovem uma modificação pós-traducional característica de algumas proteínas, como a glicosilação. Já a retenção em organelas do sistema secretório demonstrase eficiente em promover essa modificação, além de prover um ambiente favorável para o acúmulo protéico, geralmente com baixa possibilidade de degradação proteica. Portanto, a seleção por essas opções deve considerar as características de cada proteína recombinante. Métodos de transformação genética têm por função romper barreiras físicas da célula para que ocorra a entrada do DNA heterólogo. Diversos métodos foram aqui apresentados, sendo alguns mais utilizados para uma determinada espécie hospedeira em relação a outras. Porém, é importante estar atento aos vários estudos que vêm sendo realizados para adaptar técnicas mais simples e mais eficazes para uma maior variabilidade de hospedeiros, permitindo aperfeiçoar processos de transformação e aumentar os níveis de células transformadas. Diversas proteínas possuem modificações pós-traducionais essenciais para sua atividade e estabilidade. Plantas promovem algumas modificações pós-traducionais de forma semelhante a mamíferos. Apesar da glicosilação vegetal ser diferente em alguns aspectos da observada em humanos, já existe a possibilidade de “humanização” dessas plantas. Isso é possível através da inserção ou repressão de genes responsáveis pela expressão de enzimas

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envolvidas no processo de glicosilação, permitindo a obtenção de produtos cada vez mais semelhantes aos encontrados naturalmente. Entretanto, algumas dessas diferenças podem não ser prejudiciais e, ocasionalmente, podem ser benéficas para determinadas proteínas. Células vegetais possuem um ambiente propício para a formação de partículas virais, permitindo a produção de vacinas de uma forma mais segura que o uso de vírus inativados ou mortos. Isso ocorre devido à capacidade de algumas proteínas do capsídeo viral conseguirem formar estruturas vazias (sem material genético), muito semelhantes às encontradas naturalmente, caracterizando-as como altamente imunogênicas e não virulentas. Aspectos de biossegurança devem ser levados em consideração na produção de fármacos em plantas transgênicas. Existem diversas técnicas para evitar a contaminação acidental humana e/ou animal por moléculas recombinantes. É aconselhável o uso de plantas que não estão envolvidas diretamente na alimentação humana. O conjunto de tecnologias atuais e os procedimentos de biossegurança da legislação brasileira permitem produzir plantas transgênicas de uma forma segura para o meio ambiente e para a população. A propriedade intelectual é um aspecto usualmente desconhecido da maioria dos pesquisadores e de novos empreendedores. Considerando a possibilidade de que os produtos de um projeto de pesquisa cheguem ao mercado, é essencial que haja uma preocupação extrema com a possibilidade de infração de propriedade de terceiros, principalmente na forma de patentes de sequências de DNA e de metodologias. Os Núcleos de Inovação Tecnológica (NITs) das universidades e centros de pesquisa podem orientar os pesquisadores e alunos. Diversos tipos de proteínas têm sido produzidos em plantas em nível laboratorial. Enquanto a maioria está em processo de testes em animais e humanos, algumas já foram aprovadas para comercialização. Apesar de um número relativamente pequeno de produtos no mercado, a expectativa é de que, com o aumento e refinamento das técnicas de transformação, produção e purificação dessas moléculas, diversos produtos com variadas aplicações estarão disponíveis para a sociedade.

13.13 MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO Neste capítulo, apresentaremos um método de transformação genética de tabaco mediada por agrobactéria para expressão permanente em folhas. Esta metodologia foi escolhida devido à facilidade da manipulação genética

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dessa espécie vegetal e está dividida em cinco etapas: (1) construção do vetor de expressão; (2) obtenção de material vegetal; (3) transformação de agrobactéria; (4) infecção de fragmentos foliares e (5) regeneração de plantas transgênicas. O material e equipamentos necessários para essa técnica estão descritos na Tabela 13.2. Tabela 13.2 Material e equipamentos utilizados no protocolo de transformação genética de tabaco

MATERIAL

EQUIPAMENTOS

Acetato de Potássio

Hormônios: ANA e BAP

Autoclave

Acetosiringona

Inositol

Câmara de crescimento vegetal

Ácido Hidroclorídrico (HCl)

Kit de extração in gel de DNA

Câmara dissecadora tipo Bell Jar

Ácido Acético Glacial (CH3COOH)

Lâminas de bisturi

Capela de exaustão

Agar

Lisozima

Casa de vegetação

Agarose

Material Plástico (Placas, ponteiras, tubos, etc)

Cuba e fonte de eletroforese

Agrobactéria termocompetente (Ex. GV3101)

Nitrogênio líquido

Fluxo laminar

Água destilada e Ultra Pura

Phytagel

Fotodocumentador de DNA

Água sanitária

Potes de vidro de 300 mL

Microcentrífuga

Álcool etílico 70%,

Reagentes PCR (DNA polimerase, tampão, etc)

Micropipetas

Álcool Isoamílico

Sacarose

Shaker

Álcool Isopropílico

Sacos de papel e plástico

Termociclador

Antibióticos: Canamicina, cefotaxima, vancomicina

Sementes de tabaco SRI

Vórtex

Dodecil sulfato de sódio (SDS)

Sais MS

EDTA

Solo

Cloreto de Sódio (NaCl)

Triptona

Clorofórmio

Tris

Enzimas de restrição

Vasos de 12 L

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MATERIAL

EQUIPAMENTOS

Extrato de levedura

Vermiculita

Fenol

Vetores (clonagem, passagem e binário/expressão)

Glicose

Vitamina MS

Hidróxido de Sódio (NaOH): 1 N e 5 N

Meios de cultura 1) LB (Luria-Bertani) 1 L: em 900 mL de água destilada adicionar 10 g de triptona, 5 g de NaCl e 10 g de extrato de levedura. Ajustar o pH para 7,0 com NaOH 5 M e autoclavar. Para meio sólido, adicionar 15 g de ágar antes de autoclavar. 2) MS 1 L: em 900 mL de água destilada adicionar 4,33 g de sais MS119, 1 mL de vitamina MS, 30 g de sacarose e 0,1 g de Inositol. Agitar até dissolver, ajustar o volume para 1 L, ajustar o pH para 5,8 com NaOH 1 M e autoclavar. Para meio sólido adicionar 2,5 g de Phytagel antes de autoclavar. 3) MS-I 1L: em 900 mL de água destilada adicionar 4,33 g de sais MS, 1 mL de vitamina MS, 30 g de sacarose, 0,1 g de Inositol e 2,5 g de Phytagel. Agitar até dissolver, ajustar o volume para 1 L, ajustar o pH para 5,8 com NaOH 1 M e autoclavar. Esperar a temperatura do meio diminuir até aproximadamente 40 ºC e adicionar BAP (1 mg/L), ANA (0,1 mg/L) e acetoseringona (20 mg/L). Distribuir o meio em placas de Petri. 4) MS-R1 1L: Em 900 mL de água destilada adicionar 4,33 g de sais MS, 1 mL de vitamina MS, 30 g de sacarose, 0,1 g de Inositol e 2,5 g de Phytagel. Agitar até dissolver, ajustar o volume para 1 L, ajustar o pH para 5,8 com NaOH 1M e autoclavar. Esperar a temperatura do meio diminuir até aproximadamente 40 ºC e adicionar BAP (1 mg/L), ANA (0,1 mg/L), cefotaxima (250 mg/L) e vancomicina (200 mg/L), para evitar o crescimento das bactérias remanescentes e canamicina (100 mg/L) para seleção de células transformadas. Alternativamente, pode-se usar o antibiótico Timentin (300 mg/L) no lugar de cefotaxima e vancomicina. O antibiótico de seleção em plantas deve ser escolhido de acordo com o gene de resistência encontrado no vetor de expressão. 5) MS-R2: em 900 mL de água destilada adicionar 4,33 g de sais MS, 1 mL de vitamina MS, 30 g de sacarose, 0,1 g de Inositol e 2,5 g de Phytagel. Agitar até dissolver, ajustar o volume para 1 L, ajustar o pH para 5,8 com

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NaOH 1 M e autoclavar. Esperar a temperatura do meio diminuir até aproximadamente 40 ºC e adicionar cefotaxima (250 mg/L), vancomicina (200 mg/L) e canamicina (100 mg/L). As mesmas alterações de antibióticos podem ser feitas como descrito anteriormente. Soluções e tampões 1) MPA-1: em 40 mL de água ultra pura adicionar 0,450 g de glicose, 0,146 g de EDTA, 0,151 g de Tris. Ajustar o pH para 8,0 com HCl e completar o volume para 50 mL com água ultrapura. 2) MPA-2: em 8 mL de água ultra pura adicionar 200 mL de NaOH 10 M, 0,1 g de SDS. Completar o volume para 10 mL com água ultra pura. 3) MPA-3: em 60 mL de água ultra pura adicionar 29,45 g de acetato de potássio, 11,25 mL de ácido acético glacial. Completar o volume para 100 mL com água ultra pura. 1. Construção do vetor de expressão Nesta etapa, são utilizadas técnicas rotineiras de biologia molecular120. a) Amplificação por PCR do gene de interesse e purificação da banda in gel utilizando kits de extração (como QIAquick, da Quiagen). b) Ligação do produto de PCR a vetores de clonagem (como pGEM-TEasy, da Promega) e clonagem em bactérias. Recuperar o plasmídeo por técnica de minipreparação de DNA plasmidial (miniprep). c) Digestão do vetor contendo o gene de interesse utilizando enzimas de restrição (utilizar enzimas que flanqueiem o gene e não cortem no seu interior). d) Digestão do vetor de passagem que contém o promotor e terminador com as mesmas enzimas compatíveis com as utilizadas para recuperar o gene de interesse. Diversos vetores podem ser utilizados, por exemplo, o vetor pRT104 que possui o promotor 35S e sítio de poliadenilação de CaMV121 (Figura 13.17). e) Ligação do vetor de passagem ao gene de interesse, clonagem em bactéria. f) Preparação do vetor de passagem contendo o gene de interesse por miniprep, seguida de digestão com enzimas de restrição para recuperar o cassete de expressão (Promotor – Gene de interesse – Terminador). Utilizar enzimas compatíveis com a região múltipla de clonagem do vetor de destino.

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g) Digestão do vetor de destino com enzimas de restrição compatíveis com as utilizadas para recuperação do cassete de expressão anterior. Diversos vetores podem ser utilizados, por exemplo, vetores binários pCAMBIA*, que possuem extremidades de T-DNA, entre as quais o cassete de expressão será inserido. Esses vetores geralmente possuem regiões que expressam genes de resistência para seleção em bactérias e plantas (resistência a antibióticos ou herbicidas), podendo conter genes repórteres para identificação visual de plantas transformadas, como por exemplo, o gene gus 122 ou gfp 123. h) Ligação do cassete de expressão no vetor de destino, clonagem em bactérias e recuperação do vetor final (vetor de expressão) por miniprep. i) Verificar a integridade do vetor por restrição enzimática e sequenciamento de DNA.

Figura 13.17 pRT 104, um típico vetor para construção de cassetes de expressão. O vetor pRT104 contém o sítio múltiplo de clonagem inserido entre o promotor 35S (p35S) e o sítio de poliadenilação (poli-A). Também possui uma região codificante de um gene de resistência a ampicilina (ampR), necessária para a seleção de bactéria transformadas durante a clonagem do vetor.

2. Obtenção de material vegetal a) Desinfetar sementes de tabaco da variedade SR-1. Todo o processo deve ser realizado em uma capela de exaustão devido à toxidez da fumaça proveniente da reação da água sanitária e HCl.

*

Ver <www.cambia.org>.

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• Colocar aproximadamente 100 sementes de tabaco SR-1 em um microtubo de 1,5 mL. • Acomodar este tubo em uma câmara dissecadora tipo bell jar, contendo um becker com 70 mL de água sanitária comercial. • Adicionar 1 mL de HCl concentrado à água sanitária e fechar rapidamente a tampa da câmara dissecadora. Manter por aproximadamente 4 horas. • Retirar o tubo com as sementes da câmara e manter a câmara aberta na capela de exaustão por 24 horas para eliminação da fumaça tóxica. b) Obtenção de material vegetal para transformação. Todo o processo deve ser realizado em um fluxo laminar, com extremo cuidado para não contaminar os meios de cultura. • Semear aproximadamente 25 sementes em uma placa de Petri contendo meio de cultura MS sólido. Manter em câmara de crescimento a 25 ºC e fotoperíodo de 16 horas por 1 a 2 semanas. • Transferir as plântulas germinadas para potes de 300 mL contendo 30 mL de MS sólido. Manter em câmara de crescimento a 25º C e fotoperíodo de 16 horas por 2 a 4 semanas. Essas plantas serão utilizadas para a transformação genética. 3. Transformação de agrobactéria Todo o processo deve ser realizado em um fluxo laminar, com extremo cuidado para não contaminar os meios de cultura. a) Incubar Agrobactérias termocompetentes em um tubo de 1,5 mL contendo 1 mg de vetor de expressão em água ultrapura durante 30 minutos no gelo. b) Congelar o tubo com DNA e bactérias em nitrogênio líquido, em seguida transferir para banho-maria a 37 ºC por 5 minutos. c) Adicionar 1 mL de meio de cultura LB. Incubar por 2 horas a 28 ºC com agitação de 250 rpm. d) Plaquear as bactérias em meio LB sólido contendo antibióticos de seleção bacteriana e plasmidial. Incubar por 48 a 72 horas a 28 °C no escuro. e) Selecionar colônias transformada e inocular em 6 mL de meio LB contendo antibióticos de seleção. Incubar por 24 horas a 28 °C no escuro. f) Transferir 1,5 ml de inoculo para tubo de 1,5 mL, centrifugar a 14.000 rpm por 1 minuto e descartar o sobrenadante. Repetir este passo.

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g) Adicionar 100 mL de tampão MPA-1, ressuspender as células com a ajuda de um vórtex e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. h) Adicionar 4 mL de solução aquosa de lisozima (100 mg/mL), agitar levemente e incubar por 15 minutos a 37 ºC. i) Adicionar 200 mL de solução MPA-2, misturar levemente invertendo o tubo 4 vezes e incubar no gelo por 5 minutos. j) Adicionar 150 mL de solução MPA-3, agitar em um vórtex por 10 segundos e incubar por 5 minutos no gelo. k) Centrifugar por 5 minutos a 14.000 rpm a 4 ºC. Transferir o sobrenadante para novo tubo; l) Adicionar ao sobrenadante 400 mL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), agitar no vórtex e centrifugar por 5 minutos a 14.000 rpm a 4 ºC. Transferir o sobrenadante para novos tubos. Repetir este passo apenas com clorofórmio; m) Adicionar 300 mL de isopropanol e incubar por 10 minutos no gelo. Centrifugar por 10 minutos a 14.000 rpm a 4 ºC. n) Descartar o sobrenadante e adicionar vagarosamente ao precipitado 500 mL de álcool etílico 70%, centrifugar por 5 minutos a 14.000 rpm a 4 ºC. Descartar o sobrenadante. o) Ressuspender o precipitado em 20 mL de água ultrapura. p) Montar uma reação de PCR para cada amostra de DNA representativo de uma colônia de agrobactéria, empregando primers específicos do cassete de expressão contendo o gene de interesse. Em geral, é desejável que um dos primers corresponda ao gene de interesse e o outro a uma região do promotor ou do terminador que flanqueiam o gene. Os resultados da amplificação podem ser observados em uma eletroforese em gel de agarose. 4. Infecção de fragmentos foliares Todo o processo deve ser realizado em um fluxo laminar, com extremo cuidado para não contaminar os meios de cultura. a) Incubar colônias de agrobactérias selecionadas por PCR em 20 mL de meio LB contendo antibióticos a 28 ºC, 250 RPM no escuro até atingir a fase exponencial de crescimento (OD600 entre 0,6 e 0,8). b) Centrifugar a suspensão bacteriana a 5.000 rpm por 5 minutos e descartar o sobrenadante.

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c) Adicionar meio MS ao precipitado bacteriano de forma a se obter uma OD600 de 0,1. Manter a temperatura ambiente. d) Cortar 100 fragmentos foliares de tabaco (explantes) com aproximadamente 1 cm 2 com ajuda de uma lâmina de bisturi e colocar em dois tubos falcon de 50 mL (50 explantes cada) contendo 29 mL de meio MS e 1 mL de MS contendo a suspensão bacteriana. Manter por 10 minutos a temperatura ambiente. Evitar cortar regiões das folhas que possuem nervuras ou que estejam cloróticas. e) Transferir aproximadamente 10 explantes por placa contendo meio MS-I sólido. Manter a região adaxial da folha em contato com o meio. Incubar por 48 horas à temperatura de 25 °C no escuro. 5. Regeneração de plantas transgênicas Todo o processo deve ser realizado em um fluxo laminar, com extremo cuidado para não contaminar os meios de cultura. a) Transferir os explantes para placas contendo meio de cultura MS-R1 para a indução de brotos e antibióticos para controle de crescimento de bactérias remanescentes e seleção de célula vegetal transformadas. Manter à 25 °C por 2 semanas com fotoperíodo de 16 horas. b) Repetir o passo anterior cortando e descartando regiões foliares que estiverem necrosadas. Brotos resistentes podem surgir durante a as primeiras duas semanas, mas a maioria geralmente aparece após este tempo. Neste caso, transferi-los de acordo com a próxima etapa. c) Transferir brotos com aproximadamente 1 cm a 2 cm para potes contendo MS-R2 e manter à 25 °C com fotoperíodo de 16 horas até o desenvolvimento de raízes. Brotos transgênicos desenvolverão raízes, enquanto os não transgênicos não desenvolverão (podendo ficar necrosados). d) Quando as plantas enraizadas alcançarem em torno de 10 cm a 15 cm, elas devem ser aclimatadas. Transferir as plantas isoladamente para potes (100 mL) contendo solo e vermiculita estéreis (3:1 v/v). Lavar bem as raízes com água destilada antes da transferência. Adicionalmente, deve-se cobrir as plantas com saco plástico com pequenos furos durante 1 semana para garantir uma alta umidade. Manter as plantas em casa de vegetação na sombra (debaixo de uma tela sombrite). e) Após a aclimatação, transferir as plantas para vasos de aproximadamente 12 L contendo solo adubado. Manter em casa de vegetação durante a análise dos eventos transgênicos e até a produção de semente. Embora a

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fecundação cruzada seja rara em tabaco, deve-se cobrir as flores com um saco de papel, para evitar ao máximo a dispersão de pólen, garantindo a autofecundação. f) Analisar a expressão da proteína de interesse por técnicas de SDS-PAGE, western blot, ELISA etc. g) Quando as sementes estiverem maduras e secas, deverão ser coletadas, estocadas ou desinfetadas e semeadas em meio MS contendo antibióticos ou herbicidas de seleção. h) Contar o número de plântulas germinadas resistentes após duas semanas e aplicar uma análise estatística (teste X²), usando como hipótese uma segregação mendeliana (3:1). Repetir autofecundação das plantas positivas até a obtenção de homozigose.

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A – Adenina CNTBio – Comissão Técnica Nacional de Biossegurança C – Citosina DNA – Ácido desoxirribonucleico G – Guanina RNA – Ácido ribonucleico TI – Indutor de tumor U – Uracila

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CAPÍTULO

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ANIMAIS DOMÉSTICOS COMO BIORREATORES: PRODUÇÃO E USOS Luiz Sergio de Almeida Camargo Vicente José de Figueirêdo Freitas Luciana Magalhães Melo Humberto de Mello Brandão João Henrique Moreira Viana 14.1 INTRODUÇÃO

As aplicações e consequente demanda global por proteínas recombinantes farmacêuticas têm aumentado constantemente 1, e seu mercado para a saúde humana já atingiu 99 bilhões de dólares em 20092. Os sistemas atuais de produção dessas proteínas estão baseados no cultivo in vitro de células eucariontes ou procariontes geneticamente modificadas em biorreatores. Embora estes sistemas de biorreatores sejam o de eleição para a produção de proteínas recombinantes, ainda possuem limitações. A produção de proteínas recombinantes 3, apesar de poder atingir até 5 g/L, geralmente está limitada a miligramas por litro devido à baixa densidade de células possíveis no cultivo4, limitando o aumento da produção por área. Além disso, o custo para se estabelecer uma estrutura física completa pode ultrapassar 1 bilhão de dólares5, requerendo equipamentos especializados de valor elevado e alto

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consumo de energia. Existe também certa dificuldade em estabelecer linhagens de células com expressão estável6, requerendo renovação constante. Uma alternativa ao cultivo in vitro de células eucariontes é o uso de animais domésticos geneticamente modificados como biorreatores. As proteínas recombinantes produzidas nesses animais sofrem glicosilação e montagem semelhante àquelas produzidas pelas células mamíferas mantidas em cultivo in vitro, e podem favorecer a expressão de proteínas complexas que têm sido difíceis de serem produzidas em linhagens celulares 5,7. Proteínas recombinantes podem ser produzidas na glândula mamária, urina, sangue e clara de ovos. A glândula mamária tem sido o órgão preferencial8,9, de onde o leite com grandes quantidades de proteínas é facilmente removido pela ordenha, com menos estresse ao animal. As espécies domésticas de preferência para atuarem como biorreatores são caprinos, ovinos e bovinos pelo fato de produzirem grandes quantidades de leite, terem um manejo nutricional e sanitário conhecido e possuírem tecnologias reprodutivas que permitem acelerar os processos reprodutivos, facilitando a geração de descendentes. Coelhos também têm sido considerados uma opção devido à facilidade de manutenção, alta prolificidade e curta duração da gestação10,11, assim como galinhas para a produção de ovos contendo proteínas recombinantes12. Neste contexto, está em uso o termo gene pharming para traduzir a utilização de animais domésticos geneticamente modificados para a produção de medicamentos, com o argumento de que esses animais transgênicos são capazes de atender à demanda industrial de medicamentos quando comparados aos equipamentos complexos e dispendiosos do cultivo celular tradicional em biorreatores. Estima-se que o custo para se produzir uma proteína recombinante por meio de um animal biorreator possa ser um décimo do custo das estruturas comerciais de cultivo de células7. No Brasil, um estudo da Universidade Estadual do Ceará (UECE) gerou cabras (Figura 14.1) para o fator estimulante de colônias de granulócitos humano (human granulocyte colony stimulating factor – hG-CSF)13, com produção de 0,63 g/L de leite, enquanto, na Argentina, estudo de Salamone e colaboradores14 produziu bovinos que secretam até 5 g/L de hormônio do crescimento humano no leite. Com a estimativa de produção de 1 g/L de proteína recombinante no leite, poder-se-ia atender a importação brasileira de 2010, de duas toneladas de imunoglobulinas no valor de 162 milhões de dólares15, com 334 vacas produzindo 6.000 kg de leite por lactação. Considerando o valor do litro de leite convencional (0,70 centavos de dólar), o valor total do custo para as 334 vacas seria de 1,4 milhão de dólares. Outras estimativas, baseadas na produção de anticorpos

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monoclonais, calculam que, para a produção de 100 kg por ano, os custos de produção por grama são entre três e trinta vezes menores com o uso de um modelo com caprinos transgênicos quando comparado ao modelo utilizando células eucariontes16. Obviamente, animais domésticos biorreatores devem ser mantidos em instalações ou estábulos controlados, com elevados níveis de exigência sanitária e higiênica e respeitando-se as diretrizes de biossegurança, o que aumenta o custo de produção do litro de leite. Deve-se considerar também que esta é uma ferramenta que ainda exige investimento em pesquisa e desenvolvimento para a geração de animais domésticos geneticamente modificados, purificação da proteína recombinante do leite do animal e avaliações préclínicas e clínicas da ação das drogas produzidas, o que agrega mais custos à produção. Entretanto, pela capacidade de produção em alta escala, geração de descendentes e o custo de instalação e manutenção dos animais, é uma alternativa aos biorreatores convencionais de cultivo celular. Neste capítulo, será apresentado um histórico da evolução da produção de animais domésticos geneticamente modificados e as principais técnicas utilizadas, com algumas aplicações de animais biorreatores para a saúde humana.

Figura 14.1 Camilla, cabra biorreatora que secreta o fator estimulante de colônias de granulócitos humano no leite, gerada na Universidade Estadual do Ceará.

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14.2 HISTÓRICO Apesar do uso de animais domésticos como biorreatores ser ainda um conceito inovador, estudos com modificações genéticas de embriões de mamíferos ocorrem desde a década de 1960, quando o professor Lin 17 microinjetou DNA em zigotos de camundongos. Na década de 1970, foi possível produzir camundongos saudáveis carreando sequências de DNA do gene do vírus Simian 40 microinjetadas na blastocele18. Em 1980, houve o relato do método mais comum para se produzir embriões camundongos transgênicos: a microinjeção pronuclear de DNA 19. Em 1982, foram publicados estudos com camundongos transgênicos gerados por este método e portando o gene do hormônio de crescimento de ratos20. Com uma eficiência de aproximadamente 30%21, a microinjeção pronuclear permitiu o avanço da transgenia em camundongos e ratos, de modo que, atualmente, tem sido possível gerar linhagens modificadas geneticamente para estudos de diversas doenças humanas e que podem ser encontradas comercialmente, produzidas por laboratórios especializados. Outra maneira importante para a geração de camundongos transgênicos é com o uso de células-tronco embrionárias geneticamente modificadas por meio de recombinação homóloga. No início da década de 1980, foi relatado o isolamento de células-tronco de embriões em fase pré-implantação22, e que tais células podiam colonizar as células germinativas após serem injetadas na blastocele, formando um embrião quimera 23. Em seguida, demonstrouse que um gene poderia ser modificado via recombinação homóloga nas células-tronco embrionárias. Após transferir as células-tronco modificadas geneticamente para a blastocele de um embrião, obteve-se camundongos quimeras aptos a transmitirem a modificação gênica para seus descendentes e gerar animais geneticamente modificados24. A grande vantagem do uso das células-tronco embrionárias é a manutenção de sua pluripotência e autorrenovação, mesmo após a transfecção para introdução da modificação gênica, permitindo a seleção e estabelecimento de linhagens geneticamente modificadas. Além disso, a recombinação homóloga nas células-tronco embrionárias permite a integração controlada, sítio-específica da modificação gênica no genoma hospedeiro, evitando-se efeitos indesejáveis que podem ser causados por integrações aleatórias. Desde então, células-tronco de camundongos com recombinação homóloga têm sido usada para produzir animais com mutações, substituições, deleções e inversões gênicas 25 para servir de modelos para estudos de função gênica e de doenças.

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O avanço ocorrido com o uso de microinjeção pronuclear ou de célulastronco para gerar camundongos geneticamente modificados não foi observado para espécies domésticas. Apesar de muitos estudos com células-tronco de bovinos, caprinos e ovinos, linhagens verdadeiramente embrionárias, com capacidade de autorrenovação e longo tempo em cultivo, ainda não foram estabelecidas26-28 e, portanto, ainda não têm sido usado para a modificação gênica. Apesar do primeiro relato de ovinos e suínos transgênicos gerados pela microinjeção pronuclear ter ocorrido em 1985 29, este método apresenta uma eficiência muito menor para espécies domésticas do que para camundongos, entre 0,8% a 10% 21,30,31, o que limita a produção em escala de embriões e animais transgênicos. Ainda assim, é uma opção para a produção de animais como biorreatores. O primeiro relato de proteínas recombinantes produzidas em espécies mamíferas domésticas biorreatores (fator IX de coagulação humana em ovelhas) aconteceu em 1988, com o uso da microinjeção pronuclear32. Em 2006, o Brasil gerou, em Fortaleza, cabras que secretavam hG-CSF, também por esse método33. Em 1971, houve a comunicação de que DNA exógeno poderia ser transferido por um espermatozoide para um oócito após a fertilização 34, mas somente em 1989 foi relatado o nascimento de animais (camundongos) com espermatozoides fazendo a transferência gênica 35, e, ainda assim, de maneira controversa 36. Animais de outras espécies foram em seguida gerados pela transferência gênica mediada por espermatozoides (sperm-mediated gene transfer – SMGT). Em 1995, demonstrou-se que espermatozoides de bovinos poderiam carrear um gene exógeno para o oócito, apesar de os cientistas terem obtido apenas um animal positivo de 45 nascimentos 37. Em 1996 suínos transgênicos foram produzidos por meio da inseminação artificial de porcas com espermatozoides carreando um transgene repórter38, e, em 2002, foi relatada a produção de porcos com um gene humano para uma proteína de membrana que protege as células da ativação de complementos autólogos 39. A SMGT apresenta a vantagem de ser um método aparentemente simples, no qual os espermatozoides são expostos à construção gênica e, em seguida, usados para fertilizar os oócitos. Entretanto, os resultados de diferentes experimentos e em diferentes espécies nem sempre são reproduzíveis21,36,40, podendo requerer uso de biotecnologias reprodutivas mais avançadas, como a injeção espermática intracitoplasmática (intracytoplasmic sperm injection – ICSI) para favorecer a entrada do espermatozoide contendo o transgene, mesmo que com baixa eficiência41,41. Um grande estímulo para estudos com transgenia em animais domésticos foi o advento da transferência nuclear com células somáticas (TNCS), relatado em

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1997 com o nascimento da ovelha Dolly42. Com este método, tornou-se possível modificar geneticamente as células e selecionar aquelas com a modificação desejada durante o período de cultivo in vitro. As células selecionadas são então usadas para produzir um embrião transgênico, com aproximadamente 100% de garantia de obtenção da modificação gênica no animal nascido43. O primeiro relato do uso de TNCS para este fim foi de Schnieke e colaboradores em 1997 em ovinos, para secreção do fator IX de coagulação humana44. No ano seguinte, foi relatado o uso do método para bovinos, gerando o animal clone transgênico com o gene da beta-galactosidase como marcador45. A partir de então, animais transgênicos de diversas espécies domésticas foram gerados14,46-48. Contudo, a TNCS enfrenta diversos problemas para gerar animais vivos saudáveis, independentemente de modificação gênica. A técnica é caracterizada por uma grande incidência de abortos, hidropsias (acumulação anormal de fluido nas cavidades naturais do corpo) e morte nos primeiros meses de vida, gerando uma perda de até 99% dos embriões gerados49-51. Suspeita-se de que boa parte das perdas deva-se a falhas na reprogramação do genoma das células somáticas52-54, cujo padrão de expressão deve ser reprogramado para uma célula embrionária. Essas perdas causam um problema: apesar de a transferência nuclear com células somáticas modificadas geneticamente garantirem que o animal nascido será transgênico, é difícil produzir muitos animais saudáveis devido à grande incidência de perdas. Vetores retrovirais também têm sido usados para gerar animais domésticos geneticamente modificados, aproveitando a habilidade desses vírus em se integrar ao genoma hospedeiro. Em 1998, Chan e colaboradores injetaram vetores retrovirais defectivos no espaço perivitelino de oócitos maturados de bovinos e, após a fecundação, conseguiram gerar embriões e animais nascidos saudáveis55. Antes disso, vetores retrovirais já haviam sido usados para gerar camundongos56. Porém, um dos problemas com vetores retrovirais é o silenciamento, reprimindo a expressão do transgene57, e a incapacidade de transduzir células em quiescência58, o que limita seu uso para a geração de animais geneticamente modificados. Para resolver esses problemas, vetores lentivirais foram desenvolvidos a partir de retrovírus mais complexos, como o vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1). Em 2002, um estudo relatou que o uso de vetores lentivirais em embriões de camundongos permitiu a transferência de genes sem causar o seu silenciamento nos animais nascidos 59. Nos anos seguintes, o mesmo grupo relatou altas taxas de produção de suínos e bovinos geneticamente modificados para a proteína verde fluorescente (green fluorescent protein – GFP) usando tais vetores60,61. O avanço científico permitiu o aprimoramento dos vetores lentivirais, como a autoinativação de

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promotor viral, deleção de genes associados com infecção e menores chances de gerar vírus competentes por recombinação e ativação de oncogenes62, tornando-os mais seguros para aplicações em animais63. A eficiência dos vetores lentivirais em gerar animais domésticos geneticamente modificados fica clara na carta de Simon Lillico e colaboradores do Roslin Institute do Reino Unido, o mesmo instituto que produziu Dolly, quando afirmam que em uma única estação (2008/2009) produziram 32 animais fundadores para seis transgenes, uma quantidade maior do que a soma de todos os 25 anos de pesquisa da instituição64. Tal eficiência aponta para os vetores lentivirais entre os procedimentos preferidos para a geração de animais biorreatores.

14.3 APLICAÇÕES DE ANIMAIS BIORREATORES Em princípio, animais biorreatores podem produzir proteínas recombinantes com aplicação semelhante àquelas produzidas por células mantidas em biorreatores de cultivo. Animais biorreatores têm sido considerados de grande potencial para a produção de proteínas recombinantes em escala a menores custos do que os disponíveis atualmente5,7,8,65, mas ainda de forma controversa, uma vez que os custos reais que envolvem a produção do animal geneticamente modificado, a espera para o animal alcançar a maturidade, a obtenção e purificação da proteína são estimativas e irão competir com uma capacidade já instalada de biorreatores de cultivo celular. Contudo, algumas situações podem favorecer o uso de animais biorreatores. O aumento da demanda de proteínas recombinantes tem sido constante e pode ultrapassar a capacidade atual de produção1,7, criando a necessidade de novos sistemas para produção em larga escala. Além disso, muitos biofármacos deverão perder a proteção de patentes por volta de 20162,3 e, assim, abrir um maior espaço para animais biorreatores. Proteínas mais complexas podem ter sua síntese mais favorecida em animais do que em cultivo celular, possibilitando alguns nichos específicos para animais biorreatores, como é o caso da antitrombina, de expressão difícil em células em cultivo, mas com produção eficiente em leite de cabras geneticamente modificadas 7. Esta proteína é um anticoagulante e é a primeira droga recombinante originada de um ruminante doméstico biorreator aprovada para uso médico pelas agências reguladoras americana (Food and Drug Administration – FDA) e europeia (European Medicine Agency – EMA). Comercialmente denominada Atryn ®, é indicada na prevenção de tromboembolia em pacientes com deficiência hereditária de antitrombina. A estimativa

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é de que a companhia que a desenvolveu (antiga GTC Biotherapeutics, renomeada rEVOBiologics após aquisição pela LFB Biotechonologies S.A.S.) possa alcançar um mercado anual de 40 a 50 milhões de dólares nos Estados Unidos da América66. A proteína recombinante inibidora da C1 esterase (nome comercial Ruconest™ na Europa) foi aprovada para uso farmacêutico pela agência europeia de medicamentos em 2010 e é produzida pela Pharming Group *. Esta é a segunda proteína recombinante produzida por animais biorreatores aprovada pela European Medicines Agency e é indicada para o tratamento de pacientes com angioedema hereditário, uma desordem genética que leva à deficiência do inibidor de protease plasmática C1, causando episódios de angioedemas na pele e mucosa67. Animais biorreatores já foram produzidos para diversas outras proteínas recombinantes, e algumas se encontram em estágios de avaliação pré-clínicos. Alguns exemplos de proteínas recombinantes já secretadas por animais biorreatores e ainda em estudo são mostrados na Tabela 14.1. Tabela 14.1 Exemplos de proteínas recombinantes farmacêuticas produzidas por animais biorreatores que estão em estudo8,33,68,69

PROTEÍNAS

ANIMAL

Fibrinogênio

Coelhos

Antígeno para produção de vacina contra malária

Cabras

Alfa-1 antitripsina

Cabras

Hormônio do crescimento

Vacas

Fator VIII de coagulação

Coelhos

Fator IX de coagulação

Cabras

Fator estimulante de colônias de granulócitos humano

Cabras

Albumina

Vacas

Eritropoetina

Coelhos

Entre as proteínas recombinantes, os anticorpos têm tido a maior demanda2 e têm diversas aplicações, desde pesquisa e diagnóstico até terapias. Anticorpos monoclonais atuam em epítopo específico dos antígenos, *

Ver <http://www.pharming.com>.

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enquanto os policlonais possuem afinidade a diferentes epítopos. Atualmente, em torno de 95% dos anticorpos monoclonais aprovados são produzidos em linhagens de células de mamíferos em cultivo in vitro, que permitem a produção de anticorpos semelhantes àqueles produzidos pelo corpo humano70. Porém, camundongos modificados geneticamente com sequências para a produção de anticorpos humanos têm sido validados como uma nova plataforma de produção, com a aprovação comercial de anticorpo monoclonal para tratamento de certos tipos de câncer nos Estados Unidos em 2006 71. A alta demanda por anticorpos monoclonais para combater doenças específicas pode favorecer o uso de animais biorreatores devido à possibilidade de escala e processamento da proteína. Vacas e coelhos secretando anticorpos monoclonais na glândula mamária já foram produzidos 72 e demonstraram a viabilidade do uso de animais biorreatores para atender a demanda. De modo semelhante, animais biorreatores secretando anticorpos policlonais já foram gerados. Kuroiwa e colaboradores produziram bezerros capazes de secretar imunoglobulinas humanas na circulação 73 e, em 2009, relataram a geração de animais com capacidade de secreção de grandes quantidades de anticorpos policlonais humanos (acima de 2 g/L IgG humana) na circulação sanguínea 74. Anticorpos policlonais podem ser desejados quando se requer a neutralização de diversos epítopos, em patógenos com diversidades de cepas e/ou que sofrem rápida mutação e em pacientes em condições de septicemia 5,75. Anticorpos policlonais podem ser úteis também contra o bioterrorismo, em situações de terapias para contaminações provocadas por disseminação de agentes infecciosos responsáveis por doenças como antraz, botulismo, tularemia, febre hemorrágica viral, entre outras76.

14.4 TÉCNICAS DISPONÍVEIS PARA A PRODUÇÃO DE ANIMAIS DOMÉSTICOS GENETICAMENTE MODIFICADOS A obtenção de animais domésticos transgênicos, como bovinos, caprinos e ovinos, é um trabalho que depende do domínio de diversas técnicas, tais como: biologia molecular, cultivo celular, embriologia e biotécnicas da reprodução. A microinjeção pronuclear de DNA é a técnica mais comum para a geração de camundongos geneticamente modificados, mas com pouco sucesso em ruminantes. Apesar disso, este método já gerou vários animais transgênicos em diferentes espécies domésticas e com diversas aplicações em pecuária e medicina19,56.

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Vários métodos alternativos à microinjeção pronuclear têm sido desenvolvidos nos últimos anos a fim de melhorar a eficiência e reduzir os custos da geração de animais transgênicos. Entre estes métodos, encontram-se os seguintes: (a) transferência gênica mediada por espermatozoides (sperm mediated gene transfer – SMGT) 38, (b) transdução de oócitos e/ou zigotos por vetores retro ou lentivirais 61 e (c) TNCS 44. A TNCS é a técnica com maior adoção para geração de animais domésticos transgênicos, e sua taxa de sucesso típica, ou seja, animais nascidos vivos e saudáveis, é baixa, geralmente apenas 1% a 3% dos embriões transferidos76. De uma maneira geral, a microinjeção pronuclear e a TNCS são os métodos mais utilizados para a obtenção de animais transgênicos de produção (Figura 14.2).

Figura 14.2 Métodos mais utilizados para a obtenção de animais transgênicos de produção: (A) microinjeção pronuclear de DNA em zigotos e (B) transferência nuclear de células somáticas (TNCS).

A seguir, são apresentados com um pouco mais de detalhes os métodos utilizados com sucesso em diferentes espécies domésticas para a obtenção de animais transgênicos. A TNCS será abordada mais adiante, com detalhes de procedimentos, em parte posterior deste capítulo.

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14.4.1 Microinjeção pronuclear de DNA Esta técnica envolve a injeção direta de uma construção de DNA exógeno em um dos pronúcleos de embriões recém-fecundados, seguido da transferência para o oviduto de fêmeas receptoras previamente preparadas. Assim, a transferência de genes por este método já foi descrita em muitas espécies domésticas, como: leporinos (lebres), suínos, ovinos, caprinos e bovinos 29,77-79. As principais características deste método são a visualização do pronúcleo (Figura 14.3) por um operador qualificado e uso de sequências de DNA com algumas centenas de quilobases (kb). No entanto, a técnica possui uma baixa eficiência na produção de transgênicos fundadores, com a integração aleatória do transgene e formação de mosaicismo30,80.

Figura 14.3 Sequência da microinjeção de DNA em pronúcleo de zigoto caprino: (A) O embrião é apreendido pela micropipeta holding (à esquerda do zigoto), enquanto a microagulha de injeção se aproxima (à direita do zigoto), (B) microinjeção em um dos pronúcleos e (C) a pipeta de microinjeção é afastada. Fotomicrografias realizadas no Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução pela dra. Lyudmila Andreeva.

14.4.2 Vetores retrovirais Este método utiliza a capacidade do retrovírus de realizar a integração estável de seu material genético nos cromossomos das células transduzidas. As principais características são a sua eficácia e simplicidade para a integração de uma cópia. Porém, uma vez que a transdução retroviral não ocorre na fase de zigoto, os animais resultantes são mosaicos, ou seja, nem todas as suas células possuem o transgene, e ainda pode ocorrer o silenciamento do transgene. Além disso, somente sequências de DNA menores do que 8 kb podem ser integradas e, portanto, em geral, apenas construções de DNA complementar (cDNA) podem ser usadas. Para superar as limitações do

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uso de vetores retrovirais para transduzir células que não estão em divisão, vetores alternativos foram desenvolvidos, a exemplo dos adenovírus81 e lentivírus59. Devido à sua capacidade de transduzir um largo espectro de células hospedeiras, alcançando o núcleo em diferentes fases do ciclo celular 82, o uso de vetores lentivirais tem sido adotado para a obtenção de animais domésticos transgênicos em diversas espécies, como bovinos, ovinos e suínos61, 64. Os vetores lentivirais carreando o gene de interesse são microinjetados no espaço perivitelino, sob a zona pelúcida, de um oócito maturado ou recém-fertilizado, de onde são capazes de penetrar na membrana plasmática e entregar o material genético às células. Apesar das vantagens na utilização desses vetores, esta abordagem tem limitação do tamanho do genoma lentiviral em torno de 8 kb83, não muito maior do que os vetores retrovirais convencionais.

14.4.3 Transferência de genes mediada por espermatozoides (SMGT) Com a demonstração de que espermatozoides podem carrear DNA exógeno para dentro de um oócito durante a fertilização34, foi desenvolvida a técnica de SMGT39. No entanto, uma grande variação na eficiência desta técnica tem sido observada entre as espécies de produção21,40. Uma taxa de transferência de DNA muito eficiente (até 80% da descendência) foi obtida em suínos39, enquanto o método teve um sucesso limitado na produção de bovinos transgênicos37. A injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) pode também ser utilizada para a SMGT. Porém, a maioria dos embriões de animais domésticos não se desenvolve adequadamente após ICSI. Uma etapa adicional no protocolo, a ativação química haploide, permitiu a utilização de transferência de genes mediada por ICSI e gerou em embriões pré-implantacionais transgênicos ovinos, suínos, felinos, equinos e bovinos84.

14.4.4 Novas tecnologias em transgênese animal O avanço dos estudos científicos e tecnológicos tem permitido que novas metodologias sejam propostas para a geração de animais geneticamente modificados, envolvendo diferentes áreas da ciência. A seguir, serão apresentados alguns dos métodos emergentes nesta área.

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14.4.4.1 RNA de interferência O RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo biológico conservado que inibe especificamente a expressão em nível de pós-transcrição de genes e é encontrado na maioria dos sistemas biológicos, incluindo fungos, plantas e animais. O elemento comum é RNA de cadeia dupla que provém da própria célula (micro RNA, ou miRNA) ou de seu exterior (pequenos RNAs de interferência, ou siRNA). Bovinos expressando RNAi para inibição pós-transcricional de beta-lactoglobulina, uma proteína alergênica do leite bovino, foram gerados recentemente por meio da TNCS 85. Outra possibilidade é a combinação das tecnologias de siRNA e vetores lentivirais para silenciamento de genes associados a doenças86 e que poderiam ser aplicados a animais de produção.

14.4.4.2 Nucleases A inserção controlada de um DNA exógeno no genoma tende a ser extremamente rara em células somáticas, e várias estratégias têm sido desenvolvidas para melhorar sua eficiência. Em vez de esperar pelo acontecimento espontâneo e raro, a frequência de recombinação homóloga pode ser consideravelmente aumentada com a introdução de uma quebra na fita dupla de DNA no local desejado. Enzimas endonucleolíticas, altamente específicas, têm sido desenvolvidas para alcançar este objetivo. A enzima FokI, uma endonuclease, é associada a proteínas com domínio específico à sequência-alvo do DNA87, criando moléculas híbridas que podem ser usadas para clivar uma sequência específica do genoma e, assim, causar o silenciamento do gene ou permitir a introdução de uma modificação gênica por recombinação homóloga88,89. Nucleases dedos de zinco (zinc-finger nucleases – ZFNs) e nucleases efetoras tipo ativador de transcrição (transcription activator-like effector nucleases – Talens) têm sido as moléculas híbridas utilizadas para modificar geneticamente o genoma de ratos, camundongos89-91 e, mais recentemente, de suínos e bovinos92.

14.4.4.3 Transposons Transposons são sequências de DNA móveis que podem se autorreplicar em um determinado genoma e estão sendo utilizados como importante ferramenta para transgênese em moscas, peixes, sapos, camundongos e

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ratos. Muitas das desvantagens dos métodos clássicos para obtenção de animais transgênicos podem ser superadas pela transferência de genes mediada por transposição, o que aumenta a eficiência da integração cromossômica e facilita a inserção de uma única cópia, mas a principal vantagem da transgênese mediada por transposons é que a integração do DNA exógeno é direcionada para as regiões eucromáticas acessíveis, nas quais o silenciamento do transgene é evitado. O uso de transposons combinado com a TNCS93 já permitiu a obtenção de animais nascidos.

14.4.4.4 Nanopartículas Nanopartículas podem ser uma alternativa para carrear genes para dentro de uma célula. Nanotubos de carbono são nanopartículas capazes de carrear vetores plasmidias e RNAi para dentro das células, promovendo uma expressão ou silenciamento gênico94-96. Nanopolímeros, associados à SMGT, foram capazes de transfectar oócitos durante a fertilização in vitro em bovinos97. Estudos com nanopartículas para geração de animais domésticos geneticamente modificados são ainda iniciais, mas abrem uma nova possibilidade na geração de biorreatores.

14.5 PROCEDIMENTO DE TRANSFERÊNCIA NUCLEAR COM CÉLULAS SOMÁTICAS (TNCS) PARA A PRODUÇÃO DE BOVINOS GENETICAMENTE MODIFICADOS A TNCS, ou clonagem, é o método desenvolvido para a geração de clones de animais a partir de células diferenciadas42. Desde sua descrição, a TNCS vem sendo usada para gerar embriões a partir de células geneticamente modificadas durante o cultivo in vitro, produzindo ao final um animal clone transgênico. Apesar das dificuldades em gerar eficientemente um animal sadio, esse método ainda tem sido o mais utilizado. Basicamente, esse método consiste em enuclear um oócito maturado (oócito receptor), removendo totalmente seu material genético, e introduzir um novo genoma por meio da eletrofusão da membrana plasmática do oócito com a de uma célula somática que está doando o novo genoma (célula doadora). Na transgenia para a produção de um animal biorreator, as células somáticas são transfectadas para receberem o gene (transgene) da proteína de interesse, quando ainda estão em cultivo in vitro e, depois

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de selecionadas, tais células são usadas como doadoras de núcleos (Figura 14.4). Neste capítulo será descrito um procedimento da TNCS para gerar bovinos clones, geneticamente modificados ou não. Deve-se ter em mente que existem muitas variações e adaptações disponíveis na literatura que não estão citadas no procedimento abaixo, mas que podem ser avaliadas ao se estabelecer uma rotina de produção de embriões clones em um laboratório. Soluções bases mais comumente utilizadas na TNCS são: • os meios de maturação in vitro: meio de cultivo de tecido 199 (TCM 199) enriquecido com hormônios, fatores de crescimento e soro fetal bovino98; • o meio de cultivo embrionário: meio Charles Rosenkrans 1 enriquecido com aminoácidos (CR1aa) ou fluido sintético do oviduto enriquecido com aminoácidos (SOFaa)99,100 ; e • a solução tamponada: meio de Tyrode com albumina, lactato de sódio e piruvato tamponado com HEPES (TALP HEPES)98 ou meio de Dulbecco tamponado com fosfato (DPBS).

14.5.1 Preparo das células doadoras Diversos tipos de células somáticas podem ser usadas como doadoras de núcleos e podem ser obtidas de fetos, animais jovens ou adultos. As células são mantidas in vitro em meio de cultivo por diversas passagens, quando então podem ser transfectadas com a construção contendo o gene de interesse e um gene repórter que será usado para selecionar as células geneticamente modificadas. Para a TCNS, a célula deve estar preferencialmente em quiescência (estágio G0 do ciclo celular), o que pode ser alcançado com a privação do soro, isto é, o cultivo das células com 0,5% de soro fetal bovino (SFB) por dois a cinco dias, ou permitindo que o cultivo celular atinja mais de 80% de confluência, ambos antes do uso na TCNS. Alternativamente, podem ser usados agentes químicos que induzam a quiescência, como a roscovitina (um inibidor seletivo reversível e permeável à célula das cinases dependentes de ciclinas 1, 2 e 5 – cyclin-dependent kinases, CDK1 (cdc2), CDK2 e CDK5)101. Para o uso na TCNS as células são destacadas do fundo da placa de cultivo com solução a 0,25% a 0,5% de tripsina por dois a cinco minutos, em temperatura de 37 ºC. Após se destacarem, a tripsina é inativada com meio de cultivo com 10% de SFB e as células são lavadas por centrifugação em meio de cultivo de duas a três vezes, antes de seguirem para a reconstrução do novo embrião.

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Figura 14.4 Esquema mostrando a transfecção das células somáticas com um transgene e posterior introdução no espaço perivitelino de um oócito enucleado para se produzir um embrião clone transgênico.

14.5.2 Preparo do oócito (citoplasma) receptor Os oócitos receptores são produzidos por meio do cultivo de oócitos imaturos em meio de maturação. Oócitos imaturos envoltos por células do

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cumulus são aspirados de folículos ovarianos e são cultivados por 18 a 22 horas em incubadoras com 38,5 ºC, 5% CO2 em ar atmosférico e umidade, até alcançarem a metáfase II da meiose, quando então possuem o primeiro corpúsculo polar (CP) visível no espaço perivitelino, entre a membrana do oócito e a zona pelúcida. As células cumulus que estão em volta do oócito têm papel fundamental no controle do crescimento oocitário, maturação, fertilização e habilidade de suportar a embriogênese. Elas mantêm o metabolismo em cooperação com os oócitos, interação crucial para a regulação da maturação oocitária e remodelamento da cromatina em oócitos bovinos e para a total competência de suportar a embriogênese. Para a visualização do CP e posterior manipulação do oócito, é necessário remover as células do cumulus que estão em volta do gameta. Isto é feito expondo os oócitos com as células do cumulus a uma solução tamponada contendo 0,5% a 1,0% de hialuronidase dentro de um tubo cônico e levando a amostra ao agitador de tubo por cinco a seis minutos. Após a agitação, os oócitos são recuperados pela visualização em um microscópio estereoscópio (lupa), e aqueles com CP são selecionados para a enucleação. Os que não tiverem CP visível podem retornar ao cultivo da maturação para uma nova avaliação da extrusão do CP.

14.5.3 Enucleação A enucleação dos oócitos, assim como a reconstrução de um novo embrião com as células doadoras, é um procedimento realizado em microscópio invertido com epifluorescência, montado com sistema de micromanipulação que permita manobrar o oócito e as células por meio de micromanipuladores ou joysticks. Antes da enucleação, os oócitos com CP são expostos por quinze a vinte minutos a 37 ºC a uma solução tamponada contendo Hoeschst 33342 (5 μg/mL) e citocalasina B (7,5 μg/mL) para coloração do núcleo e para relaxar a contração de microfilamentos, respectivamente, evitando assim danos ao citoplasma durante a micromanipulação. Em seguida são lavados e mantidos em solução tamponada. Para a enucleação, os oócitos com CP são mantidos em microgotas (15 μL a 30 μL) de solução tamponada e cobertas com óleo mineral em uma placa de Petri estéril. Usando os braços direito e esquerdo do micromanipulador, o oócito é posicionado de forma que o CP torne-se visível, geralmente na posição entre 2 e 4 horas. A posição do CP é usada como guia para orientar a localização da placa metafásica do oócito maturado. Em geral, a placa metafásica está próxima do CP; assim, ao se remover o CP e o citoplasma

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adjacente remove-se também a placa metafásica. A enucleação é feita segurando o oócito pelo lado oposto de onde se encontra o CP com uma micropipeta (holding) com diâmetro interno de 20 a 30 micras e externo de 70 a 100 micras. Com uma microagulha com diâmetro interno de 20 a 25 micras e externo de 30 a 35 micras e com bisel de 35 a 45 graus de ângulo é feita a penetração na zona pelúcida e a aspiração do CP e do citoplasma adjacente, onde se deve encontrar a placa metafásica. A certificação da remoção da placa metafásica é feita pela exposição do material aspirado, ainda dentro da microagulha, à luz ultravioleta e com o filtro adequado no microscópio invertido com epifluorescência. Por estar corada com Hoeschst 33342, a placa metafásica emite fluorescência, confirmando a enucleação do oócito. Após a enucleação, os oócitos retornam ao meio de cultivo usado para a maturação in vitro a fim de se recuperarem por 30 a 60 minutos, antes de seguirem para a reconstrução do novo embrião.

14.5.4 Reconstrução, eletrofusão e ativação do embrião Os oócitos enucleados e as células somáticas em quiescência são transferidos para microgotas de solução tamponada cobertas com óleo mineral em placas de Petri. O oócito enucleado é segurado firmemente com a micropipeta holding, enquanto a mesma microagulha usada na enucleação seleciona uma ou mais células doadoras, de preferência com aspecto redondo e bordas bem delimitadas. A microagulha é inserida pela zona pelúcida e uma célula doadora é deixada no espaço perivitelino, assegurando-se que tenha contato com a membrana plasmática do oócito. Após a ação em um conjunto de oócitos, a dupla oócito enucleado: célula doadora é transferida para a solução de eletrofusão, constituída de 0,26 M a 0,3 M de manitol e 0,1 mM de sulfato de magnésio (MgSO4) em água ultrapura, onde são lavados duas ou três vezes. Em seguida, são transferidos para a placa de eletrofusão contendo dois eletrodos com espaço de 0,5 mm entre eles e o mesmo meio de eletrofusão. A dupla é posicionada entre os eletrodos, de modo que o oócito enucleado e a célula doadora fiquem perpendiculares aos eletrodos (Figura 14.5). Após o posicionamento, dois a três micropulsos elétricos (DC) de 2,0 KV/cm a 2,5 KV/cm de duração entre 40 a 80 microssegundos são liberados para induzir a eletrofusão das membranas plasmáticas e, assim, introduzir o núcleo da célula no citoplasma do oócito enucleado. Após a fusão, a dupla oócito:célula é lavada em meio de cultivo embrionário e cultivada por uma a

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duas horas antes de seguirem para a ativação. Somente as duplas fusionadas após uma a duas horas serão submetidas à ativação. A ativação é feita por quatro a cinco minutos em meio embrionário contendo 5 μM de ionomicina de cálcio dentro de incubadora a 38,5 ºC, com 5% CO2 em ar atmosférico e umidade. Após a ativação, os zigotos reconstruídos são lavados em meio embrionário e transferidos para novo meio contendo 2 μM de 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), onde serão cultivados por quatro horas a fim de evitar a extrusão de material nuclear introduzido no citoplasma do oócito receptor. Outros agentes também podem ser usados para a mesma função, como cicloheximida (inibidor da síntese proteica em eucariotas, produzida pela bactéria Streptomyces griseus, apresenta efeito inibitório da síntese de proteínas porque interfere com o passo de translocação – deslocação de duas moléculas de tRNA e do mRNA em relação ao ribossoma –, interferindo com a fase de elongação na tradução)102. Ao final, os zigotos reconstruídos são lavados duas ou três vezes e transferidos para o meio de cultivo embrionário.

Figura 14.5 Foto de oócito com célula somática no espaço perivitelino na posição 12 horas, orientadas perpendicularmente aos eletrodos (faixas escuras acima e abaixo na horizontal).

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14.5.5 Cultivo embrionário Os zigotos reconstruídos são cultivados por sete a oito dias em meio de cultivo embrionário dentro de incubadoras a 38,5 ºC e umidade com proporção de gases 5% CO 2, 5% O 2 e 90% N 2. Alternativamente, podem ser cultivados em incubadoras com somente 5% CO 2 em ar atmosférico, na mesma temperatura e umidade. No segundo ou terceiro dia após a ativação, avalia-se as primeiras divisões celulares (clivagem) e, no sétimo ou oitavo dia, a produção de blastocistos. Se os embriões foram reconstruídos com um gene repórter fluorescente, será possível avaliar a fluorescência expondo os embriões rapidamente à luz UV em um microscópio invertido com epifluorescência, certificando-se da expressão do gene repórter (Figura 14.6). Os blastocistos gerados e com a expressão do gene repórter podem ser então transferidos para o útero de uma receptora no sétimo ou oitavo dia do ciclo estral. O ciclo estral, derivado do latim oestrus, consiste nas mudanças fisiológicas recorrentes induzidas pelos hormônios reprodutivos na maioria das espécies de mamíferos placentários. Em comparação, os seres humanos passam por um ciclo menstrual. Ciclos estrais começam depois da puberdade em fêmeas sexualmente maduras. Aos 25 dias pode ser feito o primeiro exame ultrassonográfico para diagnosticar a gestação.

Figura 14.6 Fotos de um blastocisto clone bovino expressando a proteína verde fluorescente (GFP) do gene repórter antes (esquerda) e após (direita) a exposição à luz UV em microscópio invertido.

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14.6 CONCLUSÕES Animais domésticos biorreatores são uma alternativa para a produção de proteínas recombinantes, com dois produtos já disponíveis comercialmente. Diferentes espécies podem ser usadas, tais como coelhos, cabras, ovelhas e vacas, sendo que a principal via de secreção é a glândula mamária. Ruminantes, pela maior capacidade de produção de leite, têm sido as espécies com maior potencial para a produção em escala de proteínas recombinantes.

14.7 PERSPECTIVAS FUTURAS O aumento da demanda por proteínas recombinantes, a queda de diversas patentes de bioprodutos e a aprovação recente pelas agências reguladoras americanas e europeias de produtos farmacêuticos recombinantes gerados por animais domésticos transgênicos devem estimular o uso desses animais como biorreatores. A melhoria dos procedimentos existentes e o surgimento de novas e mais eficientes alternativas para a geração de embriões e animais geneticamente modificados de médio e grande porte devem contribuir para a formação de rebanhos que produzam proteínas recombinantes em larga escala a custos menores, favorecendo o acesso da sociedade aos biofármacos.

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AGRADECIMENTOS À Fapemig, Funcap e CNPq pelo apoio as pesquisas envolvendo a produção de embriões e animais geneticamente modificados nos laboratórios de reprodução e embriologia da Embrapa Gado de Leite e da Universidade Estadual do Ceará.

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CAPÍTULO

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PLANTA BIOFARMING: PERSPECTIVAS INOVADORAS PARA A EXPRESSÃO DE PEPTÍDEOS EM SISTEMAS HETERÓLOGOS Patrícia Barbosa Pelegrini Maria Fátima Grossi-de-Sa 15.1 INTRODUÇÃO

Desde a década de 1980, pesquisadores vêm utilizando a tecnologia de DNA recombinante e estudos de controle da expressão gênica, no intuito de direcionar sistemas heterólogos para a produção de proteínas de interesse. Estudos sobre promotores virais e a possibilidade de cloná-los, visando ao aumento da expressão de proteínas heterólogas, permitiu uma abertura no campo da produção de proteínas recombinantes 1-3. Desde então, diversos organismos – de bactérias a plantas superiores – têm sido estudados com o objetivo de se entender suas propriedades genômicas específicas e sua

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maquinaria celular para melhor aproveitamento de seu perfil de expressão para cada proteína de interesse. Assim, devido ao vasto conhecimento de suas características genéticas e em biologia molecular, a bactéria Escherichia coli foi, inicialmente, o organismo mais utilizado como célula hospedeira para a expressão proteica. Essa bactéria também foi o primeiro organismo utilizado para escalonamento da expressão de proteínas em sistema heterólogo 2-5. Todavia, a aplicação deste sistema para determinadas proteínas eucarióticas é problemática, já que esse organismo não apresenta ferramentas complexas para processos pós-traducionais, nem uma via que permita o transporte e secreção de proteínas da célula para o meio extracelular. Portanto, com o objetivo de se obter proteínas que necessitam de processos de enovelamento e modificações pós-traducionais específicas, estudos com outros sistemas e linhagens celulares foram realizados. Assim, o uso de diferentes organismos, tais como leveduras, células de mamíferos e, posteriormente, plantas 6-10, trouxe alternativas para a produção de proteínas recombinantes eucarióticas em larga escala, permitindo a expressão de macromoléculas com enovelamento correto e apresentando modificações complexas, incluindo o alto conteúdo de ligações dissulfeto, glicosilações e padrões de fosforilação. Durante as últimas três décadas, a produção de proteínas e peptídeos em sistemas heterólogos tem sido objeto de intensos estudos, que permitiram grandes avanços na área. No entanto, esses progressos têm produzido pouco em termos de uma nova escolha de um organismo hospedeiro para expressão proteica, que permanecem basicamente os mesmos desde a década de 1980. A grande mudança ocorrida foi o aumento na concentração de proteína produzida, que se elevou exponencialmente devido à introdução de biorreatores no mercado11,12. Outra alternativa observada foi a modificação no conteúdo de meios de cultura e a aplicação de diferentes estratégias de alimentação de células/tecidos, os quais permitem uma produção constitutiva de proteínas recombinantes por longos períodos, com a manutenção da saúde e o vigor das células. Estudos recentes evidenciaram o uso de biorreatores como o processo de melhor custo-eficiência na produção de grandes concentrações de proteínas recombinantes. Biorreatores podem ser aplicados para diferentes tipos de células e organismos 12-16, especialmente para produtos biofarmacêuticos 13,15,17-19, os quais são de grande interesse para a indústria e saúde pública. Nesse contexto, plantas inferiores e superiores ocupam a primeira posição de preferência de uso, principalmente para a produção de proteínas de uso humano20-22.

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Portanto, este capítulo faz uma revisão dos sistemas de plantas utilizados na expressão de proteínas heterólogas, suas principais utilizações, vantagens e desvantagens. O uso de biorreatores como nova ferramenta na produção em larga escala de proteínas será também discutido.

15.2 HISTÓRICO A primeira demonstração de cultivo de células de plantas num sistema artificial foi realizada por Haberlandt em 1902 e publicada no trabalho intitulado Attempts of cultivation with isolated plant cells. Investigações posteriores sedimentaram o desenvolvimento do cultivo de plantas in vitro, as quais envolviam o estabelecimento de temperatura, aeração e condições de agitação, soluções e nutrientes para meios de cultura. Assim, a primeira patente em cultivo de tecidos de plantas foi dada a Routien e Nickell (1956), em associação com a Pfizer and Co. Inc. (Nova York, EUA). Com os avanços no uso da engenharia genética e biotecnologia vegetal, além da demonstração da aplicação da bactéria Agrobacterium tumefaciens, em 198323-26, para a transferência de genes em outros organismos, foi observado um substancial aumento de sistemas de cultura de células de planta em atividade. Consequentemente, novas estratégias para cultivo de células foram sendo introduzidas para a produção de diferentes compostos em larga escala, tais como proteínas recombinantes, metabólitos derivados de plantas e polissacarídeos 22. O desenvolvimento de biorreatores permitiu a produção em larga escala e de alta qualidade de moléculas relevantes para o mercado farmacêutico27. Atualmente, é possível induzir culturas de calos de um grande número de variedades de plantas, especialmente as dicotiledônias. Um exemplo é a coleção de micro-organismos e culturas de células na Alemanha, que possui cerca de 700 linhagens de células de plantas de oitenta espécies diferentes em estoque*. Nesse contexto, uma metodologia interessante para a produção biotecnológica de moléculas é a transferência de processos biossintéticos de frascos para biorreatores. Apesar dessa transferência ser capaz de preservar o potencial biossintético das culturas de células de plantas, esta poderá ser dependente de diversos fatores inter-relacionados, tais como o método de cultivo e características fisiológicas da planta. Para que a expressão possa ser controlada de forma ótima em sistemas em que não há a adição de indutores de expressão proteica, todos os sistemas *

Ver <www.dsmz.de>.

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existentes dependem da expressão dirigida por um promotor constitutivo modificado. No entanto, até o momento, todos os promotores, já descritos, ainda não são capazes de manter altos níveis de indução da expressão proteica, mesmos os induzíveis20. Dessa forma, uma das metodologias mais aplicadas no desenvolvimento de plantas transgênicas é a utilização de vetores de expressão baseados em vírus. Esses vetores permitem maior rapidez na expressão, bem como maior capacidade de elevar os níveis de produção proteica em toda a planta 28-30. Atualmente, existem diversos vírus usados como vetores de expressão, porém, vetores baseados no vírus do mosaico do tabaco (tobacco mosaic virus – TMV) vêm sendo os que permitem maior rendimento de expressão de proteínas em plantas31,32. Esse vetor tem sido aplicado na expressão de diversas proteínas em plantas, incluindo anticorpos 33, fragmentos de anticorpos34, moléculas alergênicas35,36 e candidatos a vacinas37,38. Dentre as técnicas existentes para a transformação de plantas está a utilização da bactéria A. tumefasciens e o bombardeamento de partículas contendo o DNA de interesse 39. Esta última, também conhecida como biobalística, envolve o revestimento de partículas de ouro ou tungstênico, as quais são posteriormente bombardeadas em células ou calos de plantas40. Essa metodologia pode ser utilizada para introduzir o DNA de interesse tanto no genoma nuclear da planta quanto no genoma de cloroplastos39. A vantagem em relação ao método por A. tumefasciens é a ausência de vetores necessários para a transformação. No entanto, a técnica da A. tumefasciens é a mais escolhida na produção de proteínas com potencial farmacêutico, devido à sua maior capacidade de manter quantidades relevantes de biomassa, além de causar danos menores aos tecidos da planta 30. Nos últimos vinte anos, diversas técnicas têm sido desenvolvidas com o objetivo de se otimizar a expressão transiente de proteínas em plantas41. Recentemente, o surgimento da metodologia denominada “agroinfiltração” tem chamado a atenção por sua facilidade de manipulação, custo-benefício e eficiência42. Há duas vertentes dessa nova técnica: a agroinfiltração a vácuo e por meio do uso de seringa (Figura 15.1). A primeira demonstrou ser mais eficiente para escalonamento de proteínas com potencial farmacêutico e aplicação industrial. Este método também mostrou ser mais eficaz na agroinfiltração de plantas para as quais a seringa não havia funcionado, tais como alface e Arabidopsis30,39. Já a técnica de agroinfiltração por seringa é mais simples e de menor custo, quando comparada à técnica a vácuo. Além disso, a agroinfiltração por seringa permite uma maior flexibilidade de infiltração, uma vez que é possível adicionar um único

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gene-alvo ou múltiplos genes-alvos numa mesma localização da planta42-46. Recentemente, a combinação das duas técnicas mostrou unir as vantagens da agroinfiltração por seringa e a vácuo, garantindo a simplicidade, eficiência e robustez da metodologia na expressão proteica47.

Figura 15.1 Métodos de agroinfiltração: A) utilizando seringa; B) pelo método a vácuo.

Diversos são os sistemas de expressão que garantem a produção de grandes quantidades de proteínas. Todavia, cada um desses sistemas pode proporcionar somente parte das soluções necessárias para se obter um sistema de expressão em escala industrial. Estudos anteriores relataram que transgenes nucleares em sementes eram capazes de produzir até 10 g de proteínas recombinantes por quilo de sementes48. Contudo, nesse caso, o rendimento é relativamente baixo, quando comparado à biomassa verde das plantas, a qual é muito maior do que a de sementes colhidas. Nesse contexto, uma alternativa em plantas é a expressão de proteínas em cloroplastos, o que pode aumentar até 50% na concentração de material solúvel final49. Outro fator limitante dentro dos sistemas de plantas é o fato de que algumas proteínas sintetizadas nos plastídeos poderiam não ser glicosiladas, impedindo sua aplicação e utilidade, principalmente no caso de biofármacos. Assim, devido a sua complexidade, proteínas recombinantes utilizadas como biofármacos – na sua maioria moléculas humanas – são geralmente produzidas em células de mamíferos21,50,51. Esse sistema permite que os processos

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pós-traducionais de glicosilação ocorram de forma semelhante ao que acontece no organismo humano 52,53. Entretanto, os sistemas de expressão em plantas também podem ser considerados métodos alternativos de produção de glicoproteínas recombinantes 54. Da mesma forma que outros organismos eucariontes superiores, as plantas são capazes de sintetizar complexos proteicos multiméricos e a maquinaria necessária para promover modificações pós-traducionais de forma muito similar ao que ocorre em mamíferos. Atualmente, os sistemas de produção em plantas ainda apresentam a vantagem de serem livres de agentes infecciosos humanos, o que não ocorre em sistemas de células de mamíferos17. Todavia, em certos casos, há ainda dificuldade em se estabelecer uma espécie de planta ótima para a expressão de determinadas glicoproteínas humanas recombinantes. Um exemplo está na glicosilação pós-traducional de proteínas ligadas a asparagina. Essa característica é encontrada na maioria das proteínas do sangue e fazem parte de 70% das moléculas utilizadas na indústria biofarmacêutica 53. O processo de glicosilação pode ser essencial para manutenção da estrutura e função da proteína expressa, sendo que erros na adição de N-glucanas específicas podem ser o suficiente para inviabilizar a atividade da molécula. Apesar de serem altamente semelhantes, algumas N-glucanas de planta apresentaram caráter imunogênico, sendo potenciais alergênicos para uso humano55,56. Assim, técnicas de RNA interferente foram aplicadas a diversas espécies de plantas, com o intuito de minimizar a adição de possíveis glicosilações errôneas. Estudos de engenharia genética foram também feitos em outras plantas, na tentativa de se obter glicosilações mutantes que mais se aproximassem às modificações nativas em humanos. Dentre essas plantas, destacam-se o tabaco, a alfafa, a lentilha e a A. thaliana57-60. Nos últimos dez anos, o musgo Physcomitrella patens foi introduzido como uma nova alternativa na produção de proteínas de uso biofarmacêutico devido à sua facilidade de cultivo e adaptação como biorreator13,18,51. De forma semelhante ao ocorrido em plantas superiores, técnicas de engenharia genética aplicadas ao musgo proporcionaram a remoção de glicosilações indesejadas e a adição de moléculas de N-glucanas similares às de humanos, permitindo a utilização desse sistema para expressão de qualquer proteína de uso terapêutico61,62. Como observado na Figura 15.2, o sistema de glicosilação em musgo é semelhante ao de plantas superiores63. A estrutura dominante de oligossacarídeos em musgo é formada por moléculas de N-acetilglicosamina (NAcGlc) e manose na sua região central, com duas moléculas de galactose ligadas na extremidade de dois resíduos de NAcGlc. Essa estrutura também é comum

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em plantas superiores e mamíferos. O diferencial está na presença de uma ligação b-1,2 entre uma molécula de xilose e uma de manose, duas ligações do tipo a-1,4 entre uma molécula de NAcGlc e uma de fucose, além de mais duas ligações b-1,3 entre uma molécula da NAcGlc e uma de galactose 63. Em mamíferos, além da ausência de moléculas de xilose, as ligações entre NAcGLc e fucose são do tipo a-1,6 e as ligações entre NAcGlc e galactose são do tipo b-1,464. Essa diferença é primordial para gerar respostas alergênicas em proteínas contendo esse perfil65,66. Desse modo, para que sistemas de musgo fossem capazes de produzir moléculas biofarmacêuticas, algumas estruturas de glicosilação em P. patens foram modificadas67. Devido à sua alta frequência de recombinação homóloga no genoma nuclear, foi possível a identificação e o isolamento de genes de glicosiltransferase e fucosiltransferase, responsáveis por etapas-chave na glicosilação 63. Os genes-alvos foram inibidos, gerando novas linhagens de musgo capazes de produzirem glicoproteínas sem xilose e ligações a-1,3 entre fucose e NAcGlc61,62 (Figura 15.2). Dentre as moléculas já produzidas dentro deste sistema, encontram-se a eritropoietina, anticorpos IgG, fator H humano e o fator de crescimento endotelial humano (VEGF)61,68-71.

Figura 15.2 Processo de glicosilação de proteínas em plantas e mamíferos.

15.3 BIORREATORES Os biorreatores de plantas já são otimizados de tecnologias anteriores, originalmente usadas para microorganismos 27,72. Recentemente, diversas configurações de biorreatores têm sido utilizadas, incluindo as tradicionais

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– reatores em tanque, transporte aéreo ou colunas de bolhas – e novas técnicas, que utilizam uma cascata de reatores ou uma combinação de diversos reatores 73,74. Além disso, com o objetivo de otimizar a produção dos compostos desejados, validar os resultados e reduzir custos, novos biorreatores de culturas de células de planta foram desenvolvidos. Incluem-se nessa categoria os reatores life, os biorreatores de fluxo e refluxo, os biorreatores do tipo wave e do tipo bolha (slug bubble), os biorreatores plate inclined e os biorreatores undertow75-77 (Figuras 15.3 e 15.4).

Figura 15.3 Biorreatores: (A) biorreator do tipo wave, em que o movimento de ondas ocorre pela movimentação de toda a base; (B) biorreator cilíndrico do tipo slug bubble. Os círculos indicam a movimentação de bolhas; e (C) biorreator do tipo undertow, em que o movimento de ondas no meio é feito pelo levantamento da lateral da base que sustenta as bags contendo meio de cultura e células em expressão proteica.

Já os biorreatores de musgo surgiram como uma nova alternativa para a produção em larga escala de proteínas recombinantes, principalmente as utilizadas para o desenvolvimento de produtos biofarmacêuticos. O musgo contém um pequeno genoma de 511 Mbp, sendo mais fácil para manipulação do que sistemas de plantas superiores. Além disso, o risco de contaminação com patógenos humanos e de plantas é reduzido, quando comparado com culturas de células de bactérias e mamíferos. O musgo Physcomitrella patens é a espécie mais utilizada em sistemas de biorreatores, nos quais as células de protoplastos são transformadas mediadas por polietilenoglicol (PEG). Uma vez que são fotoautotróficas, são capazes de crescer em meio contendo somente sais inorgânicos, sem a necessidade de adição de carboidratos complexos ou fontes de aminoácidos13. As vantagens de P. patens em relação a outros sistemas de plantas é a alta taxa de recombinação em seu DNA nuclear 74,78,79, permitindo nocautes de genes específicos, o que é extremamente importante no desenvolvimento

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Figura 15.4 Biorreator do tipo plate inclined. Setas indicam a direção e movimentação do meio líquido dentro (setas verticais) e fora (setas curvas) das plataformas retangulares.

de novas linhagens celulares80,81. Outra vantagem é que musgos da espécie P. patens são organismos-modelos para estudos fisiológicos, por isso, seus estágios de crescimento já são bem conhecidos, o que permite a possibilidade de análises para suas condições de desenvolvimento no meio ambiente82. Há também o fato de que o estágio de desenvolvimento maior dos musgos é a forma de gametófito haploide. Isso torna os procedimentos de glicosilação mais fáceis, em comparação a outras culturas de células79,83. Biorreatores de musgo apresentam vantagem em relação a outros sistemas pela não necessidade de se utilizar codon usage, permitindo a adaptabilidade de produção de qualquer proteína18. O cultivo de P. patens também é relativamente simples e de baixo custo. Cultivos in vitro de tecidos são a melhor opção para musgos e envolvem a germinação do esporo haploide, produzindo protonemas que se proliferam por meio da divisão celular apical. Assim, divisões subsequentes do protonema estimularão o desenvolvimento de brotos ou ramos/galhos, os quais se transformarão em gametófoto e, finalmente, na planta adulta13. A formação dos órgãos sexuais pode levar à autofertilização e ao crescimento de um esporo encapsulado no topo do gametófoto. Esses esporos são, depois, liberados, completando o ciclo de vida do organismo13 (Figura 15.5). O meio de cultura para musgo é feito essencialmente de água e sais inorgânicos e, apesar de muitos compostos terem sido testados para o seu crescimento, não há necessidade de adição de hormônios ou complexos aditivos

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Figura 15.5 Esquema do ciclo de vida do musgo Physcomitrella patens.

ao meio84. A luz e o gás carbônico são as únicas fontes de energia e carbono necessárias. Ademais, esse organismo pode crescer sob uma grande variação de pH e temperatura 84,85. O cultivo de musgo em biorreatores de vidro já foi estabelecido e, comparado com sistemas de células animais, é mais facilmente adaptável ao desenvolvimento de tecnologias de processos em larga escala86. O uso de culturas de P. patens foi iniciado em biorreatores devido à sua capacidade de produzir diferentes compostos heterólogos, se mantido no estágio de protonema para isolamento de protoplastos e transformação em larga escala87. O fato de o musgo ser capaz de realizar processamentos pós-traducionais, incluindo glicosilação e formação de pontes dissulfeto, fez desse sistema uma excelente ferramenta para a produção de biofármacos e outros produtos de interesse biotecnológico 88. Dentre os promotores testados para plantas, animais, e mesmo para P. patens, foi mostrado que sequências upstream do homólogo de actina de musgo PpAct5 era capaz de causar uma forte ativação transcricional, assim como os sistemas promotores GH3 (promotor de soja contendo elementos indutores de auxina) e DR5

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(promotor sintético de resposta a auxina, construído a partir do promotor GH3) 86. Além disso, os sinais de secreção são ferramentas úteis para direcionar proteínas-alvos para o espaço extracelular, especialmente quando se produz macromoléculas complexas modificadas. Estudos anteriores demonstraram que não somente sinalizações de plantas e musgos são bem interpretadas, mas a sinalização de humanos pode ser usada para a secreção de produtos recombinantes 89,90. Portanto, o uso de engenharia genética e a otimização das condições de cultura permitiram avanços com sucesso no rendimento de produtos dentro de sistemas de musgo. O desenvolvimento de métodos para a substituição de genes-alvos e o uso de anticorpos melhorados que funcionam via sistemas de otimização de glucanos tornaram os biorreatores de musgo a melhor alternativa para a expressão de proteínas biofarmacêuticas.

15.4 APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS Desde a primeira descrição da produção de anticorpos em tabaco 91, as plantas têm se mostrado como alternativas interessantes para a reprodução de proteínas complexas, tais como anticorpos, os quais dependem de diversas pontes dissulfeto para obterem a conformação apropriada à sua atividade ideal91,92. Essa peculiaridade tornou as plantas uma fonte essencial de produção de proteínas recombinantes. Entretanto, todas as espécies de plantas adicionam uma molécula de β(1,2)-xilose e uma de α(1,3)-fucose à região N-ligada às glucanas, e esses açúcares específicos de planta podem apresentar alto potencial imunogênico93,94. Há ainda poucas estratégias de glicoengenharia para contornar o problema da adição desses açúcares alergênicos. Algumas adaptações em sistemas heterólogos de plantas têm sido feitas na tentativa de diminuir esses fatores: (a) eliminação de sítios de glicosilação por meio de mutagênese sítio-específica, removendo resíduos de asparagina ou serina/treonina, os quais são os mais reconhecidos pela maquinaria de glicosilação no retículo endoplasmático. Essa metodologia é mais drástica e pode causar deformação na estrutura da proteína e, consequentemente, problemas na atividade e longevidade do produto; (b) inibição das glicosiltransferases presentes no complexo de Golgi95,96; (c) adição de sinais de retenção no retículo endoplasmático (H/KDEL), a fim de prevenir que proteínas cheguem ao complexo de Golgi, onde os açúcares serão adicionados97; (d) superexpressão de glicosiltransferases humanas em plantas, usadas como plataformas de biofarming; e

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(e) expressão de enzimas responsáveis pela adição do terminal β(1,4) galactose e subsequente adição de um ácido siálico nesse resíduo de galactose localizado na N-glucana, uma vez que o ácido siálico é essencial para biofármacos intravenosos, devido à sua importância na meia-vida das proteínas56. Os sistemas atuais disponíveis para a produção comercial de vacinas recombinantes, anticorpos e proteínas para uso na fabricação de biofármacos incluem bactérias, leveduras, insetos e culturas de células de mamíferos. Cada um desses sistemas apresenta seus benefícios particulares, mas, de modo geral, suas aplicações são limitadas pelos seguintes fatores: alto custo, segurança e ineficiência para escalonamento98. As plataformas de produção em plantas destacam-se por sua alta capacidade para escalonamento, custo -benefício e segurança. Além disso, as plantas permitem a produção de proteínas recombinantes complexas, mantendo sua conformação e atividade21,98. A possibilidade de se obter vacinas recombinantes em plantas e sua aplicação via oral, de forma segura e simples, sempre foi um projeto desejado por diversos pesquisadores e cientistas. Além da facilidade de administração, vacinas produzidas em plantas apresentam a vantagem de escalonamento permitida por esse sistema, gerando um processo final alto e com baixíssimo custo99. Nesse contexto, uma variedade de moléculas candidatas têm sido produzidas em diferentes espécies de plantas, incluindo alface, batata, cenoura, espinafre, milho e tomate. Dentre os avanços obtidos, já há cultivares transgênicos expressando vacinas contra diarreia, hepatite B e raiva na fase de testes clínicos I21. Não somente vacinas para administração via oral estão sendo transformadas em plantas: moléculas desenvolvidas para uso injetável também estão sendo produzidas em diversas espécies de plantas. Dentre elas, destacam-se: a vacina VLC produzida em plantas de tabaco para utilização contra o vírus H1N1 pela empresa canadense Medicago Inc.100,101; o anticorpo Anti-CD20 produzido em plantas da espécie Lemna minor pela empresa norte-americana Biolex Therapeutics Inc., com o intuito de ser utilizado para o tratamento de linfomas do tipo não Hodgkin e artrite reumatoide57; e a insulina recombinante produzida pela empresa SemBioSys Genetics (Canadá) em cártamo para tratamento de diabetes21 (Tabela 15.1). Além das vacinas, outras moléculas de valor terapêutico e dietético estão sendo transformadas em plantas para expressão em larga escala102. Algumas destas também já se encontram em fase de testes clínicos I e II, tais como a lipase gástrica de caninos produzida em milho e desenvolvida pela Meristem Therapeutics (França), a qual tem como objetivo substituir a enzima lipase em pacientes com fibrose cística e pancreatite103.

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A Tabela 15.1 mostra outras moléculas de valor terapêutico e dietético produzidas em biorreatores de plantas e que se encontram em fase de testes clínicos. Apesar de ser uma tecnologia recente em relação aos sistemas de expressão em bactérias, leveduras e células de mamíferos, o musgo P. patens já tem sido utilizado com sucesso na produção de diversas proteínas de uso terapêutico. Dentre estas, destaca-se o fator H humano, molécula de alta demanda no mercado biofarmacêutico, uma vez que pode ser usada no tratamento de diversas doenças, incluindo degeneração macular relacionada à idade (DMI), desordens severas nos rins e na retina, glomerulonefrite membranoproliferativa II (GNMP II) e síndrome urêmica hemolítica (SUH)71 (Tabela 15.1). Do mesmo modo, o peptídeo glicosilado eritropoietina (EPO), o qual apresenta um papel chave na regulação da maturação de eritrócitos, foi produzido na linhagem mutante de P. patens Delta-fuc-t Delta-xil-t70. Além disso, estudos anteriores mostraram que células em suspensão do musgo P. patens já eram um excelente hospedeiro para expressão do fator de crescimento endotelial 121 (rhVEGF), importante no tratamento de lesões obtidas por pacientes diabéticos104. Anticorpos monoclonais do tipo IgG também já foram testados em sistema de musgo, incluindo o anticorpo IGN311, específico para antígenos tumorais69. Tabela 15.1 Moléculas produzidas em plantas para fins terapêuticos e dietéticos (em ordem alfabética da planta transformada) PLANTA TRANSFORMADA

INDICAÇÃO

EMPRESA/INSTITUIÇÃO DE PESQUISA

Fator intrínseco humano Arabidopsis thaliana

Deficiência de vitamina B12

Cobento Biotech AS (Dinamarca)

Fase 2

105

Lisozima humana

Suspensão de células de arroz

Diarreia infantil

Academia Chinesa de Ciências

-

106

HBsAg

Batata Tabaco

Hepatite B

Academia Polonesa de Ciências e Universidade Thomas Jefferson (EUA)

Fase 1

107-108

Batata

Diarreia

Universidade Texas A&M (EUA)

Fase 1

109

Cártamo Suspensão de células de cenoura Musgo

Diabetes

SemBioSys Genetics (Canadá) Protalix BioTherapeutics (Israel) Greenovation Biotechn GmbH (Alemanha) Universidade Thomas Jefferson (EUA)

Fase 1-2

110

Fase 3 Pré-clínica

111-112

Fase 1

113

NOME DA MOLÉCULA

Proteína do capsídeo do vírus Norwalk Insulina Glicocerebrosidase Proteínas do vírus da raiva

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Espinafre

Doença de Gaucher Raiva

ESTÁGIO DE REFERÊNCIA DESENVOLVIMENTO

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NOME DA MOLÉCULA

PLANTA TRANSFORMADA

Anti-CD20

Lentilha

Lactoferrina humana

Arroz Milho

LT-B de Escherichia coli

Batata Milho

Lipase gástrica

Milho

Lipase gástrica

Milho

Anti-HIV gp120

Milho Tabaco

INDICAÇÃO Linfoma do tipo não Hodgkin, artrite reumatoides Infecção gastrointestinal Diarreia Fibrose cística Pancreatite Fibrose cística Pancreatite

EMPRESA/INSTITUIÇÃO DE PESQUISA Biolex Therapeutics Inc. (EUA) Ventria Bioscience (EUA) Meristem Therapeutics (França) Boyce Thompson Institute for Plant Research (EUA) Escola de Medicina da Universidade de Maryland (EUA)

ESTÁGIO DE REFERÊNCIA DESENVOLVIMENTO Pré-clínica

57

Fase clínica

114

Fase 1 Fase 1

115-116

Meristem Therapeutics (França)

Fase clínica

Meristem Therapeutics (França)

Fase clínica

HIV

Consórcio Pharma-Planta (Europa e África do Sul)

Pré-clínica

117-118

Musgo

Lesões em pacientes diabéticos

Greenovation Biotech GmbH (Alemanha)

Pré-clínica

104

Musgo

Antitumoral

Igeneon AG (Áustria)

-

69

Fator H humano

Musgo

Desordens severas nos rins e na retina

Universidade de Freiburg (Alemanha)

-

71

Fator de crescimento de queratinócitos humano recombinante (FGF7/KGF)

Musgo

Mucosite

Greenovation Biotech GmbH (Alemanha)

Mercado

112

Alfa-galactosidase

Musgo

Doença de Fabry

Pré-clínica

112

Eritropoietina humana

Musgo Suspensão de células de tabaco

Pré-clínica -

70 119-120

NH do vírus da doença de Newcastle

Suspensão de células de tabaco

Regulação da maturação de eritrócitos Doença de Newcastle (galináceos)

Dow AgroSciences LLC (EUA)

Aprovado pelo USDA

121

Albumina humana

Suspensão de células de tabaco

Reposição volêmica

Mogen International NV (Holanda) Greenovation Biotechnologie GmbH (Alemanha)

-

122-123

Interleucina-2 e Interleucina-4

Suspensão de células de tabaco

Câncer e melanoma

Universidade do Estado de Washington (EUA)

-

124

Fator de crescimento endotelial 121 (rhVEGF) Anticorpo monoclonaI IGN311

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Greenovation Biotech GmbH (Alemanha) Greenovation Biotech GmbH (Alemanha) Universidade de Kyoto (Japão)

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NOME DA MOLÉCULA Ricina recombinante

PLANTA TRANSFORMADA Suspensão de células de tabaco

INDICAÇÃO

EMPRESA/INSTITUIÇÃO DE PESQUISA

Tumores e câncer

Universidade da Flórida (EUA)

-

125

Universidade do Estado de Washington (EUA) Universidade Nacional de Chonbuk (Coreia do Sul)

-

126-127

Large Scale Biology Corp. (EUA)

Fase 1

34

Medicago Inc. (Canadá)

Fase 1

101

Leucemia mieloide aguda Acelera a recuperação de células sanguíneas após quimioterapia e transplantes Linfoma do tipo não Hodgkin Gripe aviária H5N1

ESTÁGIO DE REFERÊNCIA DESENVOLVIMENTO

Fator estimulante de macrófrago-granulócito (hGM-CSF)

Suspensão de células de tabaco Tabaco

scFV anti-idiopático personalizado

Tabaco

VLP H5N1 influenza HA

Tabaco

HAC1 influenza H1N1

Tabaco

Gripe suína H1N1

Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology (EUA)

Fase 1

128

Antígeno de superfície I/II anti-Streptococcus

Tabaco

Cáries dentárias

Planet Biotechnology Inc. (EUA)

Fase 2, aprovada pela UE

129

Anti-aCCR5

Tabaco

HIV

Universidade do Estado do Arizona e Mapp Biopharmaceutical Inc. (EUA)

Pré-clínica

33

Atualmente, a empresa alemã Greenovation Biotech GmbH vem se destacando na produção de proteínas humanas em biorreatores de musgo P. patens *. Recentemente, ela lançou no mercado o medicamento Briokine TM FGF7, composto pelo fator de crescimento de queratinócitos humano recombinante (FGF7/KGF) e utilizado no tratamento de mucosite. Além dessa molécula, a empresa possui duas outras proteínas recombinantes na fase de testes pré-clínicos: a alfa-galactosidase, utilizada no tratamento da doença de Fabry, e a glucocerebrosidase, usada no tratamento da doença de Gaucher (Tabela 15.1).

15.5 TÉCNICA PASSO A PASSO A técnica de expressão de proteínas em plantas é bastante extensa e depende de diversas variáveis, como: (a) a escolha da variedade de planta que será a hospedeira; (b) características da proteína a ser produzida; (c) *

Ver <www.greenovation.com>.

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detalhes na construção do plasmídeo (tipo de vetor, promotor, peptídeo-sinal etc.); (d) método de transformação e regeneração a ser escolhido; (e) estabilização da geração para produção comercial; e (f) métodos de purificação e caracterização da proteína recombinante. O organismo escolhido para demonstração da expressão de proteínas será o musgo P. patens. O conhecimento sobre seu potencial como plant biofarming é recente, porém, este vem demonstrando ser altamente produtivo na expressão de diversas proteínas, principalmente de origem humana. Tal como nas plantas superiores, diferentes técnicas estão sendo testadas, a fim de se otimizar a produção de moléculas proteicas nesse organismo. Uma relevante vantagem em se escolher o musgo P. patens como planta hospedeira na expressão de moléculas heterólogas está na simplicidade do meio de cultura utilizado para seu cultivo, uma vez que crescem em meios inorgânicos, não necessitam de hormônios ou vitaminas para seu desenvolvimento e podem crescer tanto em meio sólido quanto líquido. Geralmente, o crescimento do musgo ocorre em meio sólido, mas a expressão da proteína é feita por cultivo do P. patens em meio líquido. Abordaremos, de maneira geral, os principais passos a serem seguidos para o desenvolvimento da respectiva técnica. Toda a metodologia descrita abaixo foi desenvolvida pela equipe de Magdalena Bezanilla, pesquisadora do Departamento de Biologia da Universidade de Massachusetts (Amherst, Estados Unidos) e apresenta algumas alterações e adaptações realizadas pela equipe do Laboratório de Interação Planta-Praga, da Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília – DF).

15.5.1 Passo 1 – Cultivo do musgo O musgo P. patens apresenta um ciclo de vida caracterizado por duas fases: uma haploide e uma diploide. O ciclo inicia-se com a germinação do esporo haploide sob condições suficientes de luz e água, resultando no desenvolvimento de uma estrutura celular filamentosa, denominada protonema, a qual se prolifera a partir de divisões das células apicais. A divisão das células subapicais dará origem a apêndices e, posteriormente, à planta adulta. Sob condições adequadas, o musgo adulto pode desenvolver órgãos sexuais e autofecundar-se. Após a fecundação, haverá a produção de esporos haploides, recomeçando o seu ciclo de vida13,130 (Figura 15.5). A manutenção de P. patens é feita com o cultivo em meio sólido (placas de Petri) das formas diploides do organismo. Já a expressão proteica,

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principalmente em biorreatores, é realizada com a forma haploide (protonema), em meio de cultura líquido. Além disso, o musgo pode ser cultivado para utilização imediata na transformação e expressão proteica, como pode ser cultivado para manutenção, a longo prazo, das cultivares selvagens, ou mesmo transformadas.

15.5.1.1 Cultivo de musgo para propagação do tecido Antes de começar, lembre-se de realizar todo o procedimento em fluxo laminar, de preferência utilizando jaleco, máscaras e luvas para evitar a contaminação de seu material. 1) O meio PpNH4 (meio de cultura para crescimento de Physcomitrella patens contendo amônio) ou meio Knop sólidos devem ser previamente preparados e distribuídos em placas de Petri (Tabela 15.2). As placas devem ter sido preparadas há não mais do que 7 dias. 2) Cobrir cada placa com papel celofane (previamente autoclavado). Manter o papel celofane bem fixado no meio de cultura. Caso necessário, usar uma espátula para eliminar possíveis bolhas entre o papel celofane e o meio sólido. 3) Num tubo de vidro, adicionar 4 mL de água destilada. Adicionar uma ou mais colônias de P. patens adultas. 4) Use um homogeneizador para triturar o tecido na água, até que esta fique com uma coloração esverdeada. O processo deve levar de 10 a 30 segundos. 5) Distribua 0,5 mL da mistura líquida em cada placa de Petri contendo papel celofane. 6) Selar a placa com micropore, para evitar possível desidratação do meio. 7) Incubar as placas em ambiente a 25 ºC com condições de luminosidade claro/escuro de 16h/8h. Caso haja suspeita de contaminações por bactérias, recomenda-se inocular uma placa contendo antibiótico com 0,5 mL do material triturado e incubá-lo a temperatura ambiente por uma semana. Para autoclavar o papel celofane, empilhá-lo junto a papel almaço, alternando uma folha de papel celofane para uma folha de papel almaço. Colocá-los numa placa de Petri de vidro e vede com papel alumínio. O papel almaço evita que as folhas de papel celofane grudem durante a autoclavagem. O papel celofane evita que o musgo enraíze-se para dentro do meio de

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cultura, mas permite que o organismo consiga utilizar os nutrientes contidos no meio.

15.5.1.2 Geração e propagação de gametóforos para manutenção em longo prazo Tanto o tecido da planta adulta quanto os protonemas utilizados para a cultura de rotina podem ser utilizados para geração e propagação de gametóforos em longo prazo, ou seja, para estoque. A diferença do método em relação ao descrito anteriormente encontra-se, simplesmente, na ausência da adição do papel celofane às placas de Petri. Para o crescimento do organismo ser mais lento, pode-se utilizar meio de cultura PpNO3 (meio de cultura para crescimento de Physcomitrella patens contendo óxido nítrico) em vez de PpNH4. P. patens deve crescer nas mesmas condições de temperatura e luz descritas anteriormente até atingir um tamanho de cerca de 2 cm de raio. Depois, é aconselhável que ele seja transferido para temperaturas de 4 ºC a 6 ºC, com condições luz/escuro 4h/20h.

15.5.2 Passo 2 – Preparo dos protoplastos 15.5.2.1 Geração de protoplastos para transformação e/ou expressão proteica Para o preparo dos protoplastos, o seguinte protocolo deve ser seguido: 1) Utilizar de 2 a 4 placas contendo o musgo P. patens com 5 a 7 dias de incubação. 2) Adicionar 15 mL de manitol a 8,5% a uma placa de Petri nova, retirar o musgo e colocá-lo na placa contendo o manitol. 3) Adicionar 5 mL de driselase a 2%. 4) Incubar a solução por 1 hora e 15 minutos sob leve agitação. 5) Filtrar o musgo com filtro de 100 mm. 6) Centrifugar o filtrado a 250 x g por 5 minutos. 7) Lavar o pellet com 10 mL de manitol a 8,5%. 8) Centrifugar a 250 x g por 7 minutos. 9) Lavar o pellet novamente com 10 mL de manitol a 8,5%. 10) Contar os protoplastos.

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A contagem de protoplastos deve ser feita da seguinte maneira: 1) Adicionar 10 mL da solução contendo protoplastos num hemocitômetro. 2) Contar o número de células nos quadrantes e obter o valor total de células por mililitro seguindo a fórmula abaixo: Número de células/mL = número de células contadas × 104 número de quadrados grandes contados

15.5.3 Passo 3 – Transformação dos protoplastos A inserção de um vetor contendo o gene de interesse para a expressão de proteínas heterólogas em sistema de musgo pode ser feita por meio de bombardeamento de partículas ou mediada por PEG. A descrição a seguir é da técnica da mediação por PEG, pela facilidade e maior disponibilidade de execução. 1) Calcular o volume ideal de protoplastos para a transformação, sendo o ideal de 2 × 106/mL. 2) Centrifugar os protoplastos a 250 x g por 7 minutos. 3) Ressuspender os protoplastos em solução 3 M (4,55 g de manitol; 750 mL de cloreto de magnésio sexta-hidratado [MgCl 2 .6H 2O] a 1 M; 5 mL de meio de cultura Murine Embryonic Stem [MES] a 1%, pH 5,6; q.s.p. 50 mL com água destilada). 4) Adicionar 300 mL de protoplastos a 15 mg do DNA a ser transformado. Agitar bastante. 5) Adicionar 300 mL de PEG (4 g de PEG 8000 [Sigma P-2139] em 50 mL de água destilada). Misturar bem. 6) Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. 7) Aquecer a 45 ºC por 3 minutos. 8) Incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. 9) Adicionar manitol até completar um volume de 5 mL. 10) Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11) Centrifugar a 250 x g por 7 minutos. 12) Ressuspender o pellet em 2 mL de meio top ágar protoplast regeneration medium – top layer (PRMT) (Tabela 15.2). 13) Adicionar 1 mL da amostra de protoplastos por placa contendo meio protoplast regeneration – bottom layer (PRMB) (Tabela 15.2). 14) Incubar as placas a 25 ºC sob condições de luz claro/escuro 16h/8h.

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Tabela 15.2 Meios de cultura utilizados no cultivo de Physcomitrella patens e expressão de proteínas recombinantes

REAGENTES

MEIO PPNH4

MEIO PPNO3

MEIO KNOP

MEIO PRMB

TOP ÁGAR PRMT

CaCl2·2H2O

-

-

-

0,5 M

10 mM

MgSO4

-

-

2 mM

-

-

MgSO4·7H2O

2,1 mM

2,1 mM

-

2,1 mM

525 mM

KH2PO4

2,1 mM

1,84 mM

1,84 mM

2,1 mM

525 mM

CaNO3

-

-

6 mM

-

-

CaNO3·4H2O

3,3 mM

3,38 mM

-

3,3 mM

825 mM

FeCl3

-

-

Traços

-

-

FeSO4·7H2O

50 mg

12,5 mg

-

50 mg

12,5 mg

H3BO3

9,9 mM

9,9 mM

-

9,9 mM

2,48 mM

CuSO4·5H2O

0,34 mM

0,34 mM

-

0,34 mM

85 nM

MnCl2·4H2O

1,96 mM

1,96 mM

-

1,96 mM

490 nM

CoCl2·6H2O

0,42 mM

0,42 mM

-

0,42 mM

105 nM

ZnSO4·7H2O

0,34 mM

0,34 mM

-

0,34 mM

85 nM

KI

0,168 mM

0,168 mM

-

0,168 mM

42 nM

Na2MoO4·2H2O

0,1 mM

0,1 mM

-

0,1 mM

25 nM

Tartarato diamônio

2,7 mM

-

-

2,7 mM

675 mM

Manitol 8,5%

-

-

-

240 g

60 g

Ágar

28 g

7g

20 g

32 g

3g

Água destilada

q.s.p. 4 L

q.s.p. 1 L

q.s.p. 1 L

q.s.p. 4 L

q.s.p. 1 L

5,8

5,5

pH

15.6 EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES A expressão proteica em sistema de musgo pode ser feita tanto em cultivo de meio sólido, quanto em meio líquido. Em biorreatores, a utilização de meio líquido é a mais recomendada, já que o cultivo em meio sólido requer grandes quantidades de P. patens, placas de Petri e espaço para incubação.

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O musgo P. patens, previamente incubado em meio sólido PpNH4, deve ser retirado e macerado, preferencialmente utilizando homogeneizador elétrico (por exemplo: Powergen 125 Homogenizer, da Fisher Scientific). Recomenda-se a utilização inicial de 30 mg de peso seco de P. patens para cada litro de meio utilizado na expressão proteica131. Alguns fatores são essenciais para a otimização do processo de expressão da proteína desejada: • O meio líquido em que o musgo está inserido deve ter pH constante de 5,8, o qual deve ser checado diariamente. Em alguns casos, culturas com pH 4,5 mostraram ser mais eficientes para a expressão de proteínas humana104. • A expressão e secreção da proteína recombinante ocorre, pelo menos, 4 dias após inoculação do musgo em meio líquido, independentemente da expressão ser transiente ou constitutiva. Portanto, a primeira coleta de material e extração de proteínas deve ser feita somente após o sétimo dia de inoculação, podendo estender-se por até 12 dias85, 131. No entanto, o crescimento celular deve ser constantemente avaliado por meio da medida do peso seco do musgo (50 mL por litro de meio de cultura), após incubação a 105 ºC por 2 horas. • Independentemente do biorreator utilizado, as condições de iluminação devem ser mantidas iguais às observadas durante o cultivo do musgo em placas de Petri (luz/escuro = 16h/8h). • Apesar das condições de temperatura ideal ser de 25º C para o crescimento de P. patens, estudos anteriores mostraram que temperaturas a 22º C podem estimular a expressão proteica132 . • Recomenda-se avaliar a presença da proteína recombinante tanto no meio de cultura quanto no próprio musgo, uma vez que ela pode estar presente em ambos. Fatores alternativos: • A inserção de oxigênio (O2) e/ou gás carbônico (CO2) não é obrigatória. Em alguns casos, pode estimular o aumento de massa celular, mas, no geral, a adição de 1 ppm de ar atmosférico é suficiente para manter o musgo em condições ótimas de sobrevivência e crescimento. No entanto, para biorreatores cilíndricos, é recomendada a adição de 0,3 vvm de O2 e 2% de CO2 nas culturas em meio líquido sob agitação média de 100 rpm131.

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15.7 CONCLUSÕES A utilização de diferentes tecnologias baseadas na produção de proteínas em plantas depende do objetivo final do produto. É imprescindível que as plataformas escolhidas estejam também ligadas a escalonamento para produção industrial e comercialização. De maneira idêntica, o sistema de expressão deve ser compatível com as exigências estruturais e de atividade da proteína desejada, de modo que as modificações pós-traducionais em eucarióticos devam ser consideradas. O rendimento da produção final deve ser também planejado, assim como a aplicação terapêutica da proteína recombinante. Nos últimos anos, diferentes empresas produtoras de biofarmacêuticos estão deixando de investir em sistemas de expressão bacterianos, de leveduras e células de mamíferos para instalar sistemas de produção em plantas. Atualmente, as tecnologias existentes venceram os desafios exigidos para a expressão de proteínas em plantas e já começam a lançar no mercado produtos recombinantes derivados desse sistema. A posterior introdução de sistemas de musgo permitiu unir a facilidade de sistemas de organismos inferiores com as vantagens de sistemas mais complexos na expressão de proteínas humanas. Outra consideração para programas de produção de moléculas de uso terapêutico está na via de administração do produto. Nesse caso, sistemas de expressão que ofereçam maior segurança contra infecções por agentes patogênicos são mais atrativos, assim como os que permitem maior facilidade de purificação das proteínas recombinantes.

15.8 PERSPECTIVAS FUTURAS Atualmente, as empresas produtoras de biofarmacêuticos estão familiarizadas com os padrões de controle de qualidade da Food and Drug Administration (FDA), da European Medicines Agency (EMA) e da norma ISO 9001. Do mesmo modo, tendem a manter-se atualizadas quanto às regulamentações do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (United States Department of Agriculture – USDA), uma vez que este órgão poderá exigir novos processos de aprovação para que produtos biológicos de sistemas de plantas possam vir a se tornar medicamentos comerciais. Com relação às permissões para a produção em campo, o USDA, em parceria com as empresas que optaram por utilizar sistemas de plantas,

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desenvolveram procedimentos operacionais que permitem uma produção comercial em larga escala de produtos farmacêuticos em plantas. Assim, nos Estados Unidos é necessário que as empresas farmacêuticas tenham licença do USDA para a produção de biorreatores de planta em campo, importação de produtos e transporte de qualquer material recombinante viável produzido em sistema de plantas. A otimização de sistemas de produção fechados – projetados para evitar fluxo gênico de plantas transformadas para plantações não transformadas e a consequente mistura de cultivares – tem facilitado os processos regulatórios, já que incentiva a autopolinização das plantas e o distanciamento de culturas semelhantes usadas para outros fins. Em termos de custo-benefício, muitos empreendedores veem a produção de moléculas terapêuticas em biorreatores de plantas como uma forma de baratear o sistema de produção e, consequentemente, o valor final de medicamentos. Os primeiros biofármacos produzidos em células de mamíferos, ou mesmo em células bacterianas, apresentavam alto custo de manutenção, com baixa produção de massa celular e rendimento proteico. Esses fatores contribuíram para o elevado custo de muitos medicamentos à base de biomoléculas. No entanto, com a entrada dos biorreatores de plantas como produtores em larga escala de diversas proteínas humanas, uma queda significativa no valor final dos biomedicamentos poderá ser observada nos próximos anos. Com o mercado aberto para as indústrias de biofarmacêuticos e o constante surgimento de novas tecnologias, espera-se que, num futuro próximo, a expressão de proteínas em sistemas heterólogos deixe de ser um desafio e torne-se um mecanismo facilitador de produção de moléculas para usos diversos.

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CAPÍTULO

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DERIVAÇÃO DE NOVAS LINHAGENS DE CÉLULAS-TRONCO EMBRIONÁRIAS: EVOLUÇÃO DA METODOLOGIA Ana Maria Fraga Naja Vergani Simone Aparecida Siqueira da Fonseca Lygia V. Pereira 16.1 INTRODUÇÃO

As primeiras linhagens de células-tronco embrionárias (ESC) pluripotentes foram derivadas no início dos anos 1980 a partir de embriões de camundongos em estágio pré-implantacional1. Desde então, centenas de linhagens murinas de ESC foram estabelecidas ao redor do mundo, a grande maioria através da utilização de um mesmo protocolo básico, que consiste no plaqueamento de embriões inteiros, livres de zona pelúcida, sobre uma camada de fibroblastos embrionários murinos (mouse embryonic fibroblasts – MEF) mitóticamente inativados, na presença de meio de cultura contendo o fator

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de inibição da leucemia (leukemia inhibitory factor – LIF), usado para a manutenção do estado pluripotente dessas células em cultura (revisado em Guasch e Fuchs2). Em relação às linhagens de ESC humanas, o quadro é bem diferente. Foi só em 1998, após mais de uma década de grandes e contínuos esforços por parte de diversos laboratórios, que se obteve sucesso na derivação das primeiras linhagens de hESC3. Depois dessas primeiras publicações, diversos outros grupos relataram o estabelecimento de novas linhagens de hESC, e o número de linhagens registradas nos bancos de dados rapidamente aumentou. As condições descritas para a derivação das primeiras linhagens de hESC3,4 eram essencialmente as mesmas usualmente utilizadas durante a derivação de linhagens murinas1. Entretanto, depois do estabelecimento dessas primeiras linhagens de hESC, novas vias de sinalização envolvidas no controle do estado pluripotente dessas células foram identificadas, o que, juntamente com o desenvolvimento de novos reagentes, permitiu a implementação de estratégias mais eficientes para a derivação de novas linhagens de hESC 5. Neste capítulo, fazemos o levantamento e análise dos diferentes protocolos empregados durante o processo de derivação de linhagens de hESC registradas em dois grandes bancos de dados internacionais nos últimos dezesseis anos, e procuramos delinear tendências metodológicas em cada um dos passos envolvidos durante o estabelecimento dessas linhagens. Os dados foram coletados a partir de dois importantes bancos de registro internacionais – o European Human Embryonic Stem Cell Registry * e o University of Massachusetts’ International Stem Cell Registry ** – e atualizados no dia 3 de outubro de 2013. Apenas as linhagens de hESC com pluripotência comprovada in vivo, ou seja, linhagens capazes de gerar teratomas quando injetadas em camundongos imunodeficientes, foram incluídas na análise. As sublinhagens de hESC também foram excluídas da análise pois o método para obtenção das mesmas não se trata de derivação propriamente dita. Analisamos parâmetros relacionados ao meio de obtenção do embrião (fonte – se o embrião foi gerado para fins reprodutivos ou de pesquisa –, frescos ou congelados, estágio de desenvolvimento, qualidade, método de remoção da zona pelúcida, método de isolamento da massa celular interna), assim como parâmetros relacionados às condições de cultura (meio básico, fonte de proteínas, fatores utilizados para manutenção da pluripotência, tipo de suporte). Detalhes específicos relacionados aos diferentes aspectos do * Ver <www.hescreg.eu>. ** Ver <www.umassmed.edu/iscr>.

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processo de derivação foram também obtidos das publicações correspondentes, quando disponíveis. Sempre que os dados descritos nos bancos de dados diferiram daqueles descritos na publicação correspondente, consideramos os dados descritos na publicação.

16.2 ASPECTOS HISTÓRICOS DAS DERIVAÇÕES DE hESC 16.2.1 Número de derivações de hESC ao longo dos anos Dentre as muitas diferentes linhagens de hESC registradas nos dois bancos de registro de células-tronco consultados (hESCReg e UMass ISCR), 460 linhagens foram descritas como sendo capazes de formar teratomas quando injetadas em camundongos imunodeficientes. As informações relacionadas aos diferentes parâmetros utilizados durante a derivação dessas 460 linhagens foram listadas, sendo que essas informações foram extraídas tanto do banco de dados quanto da publicação correspondente à linhagem, sempre que disponíveis 6. Sete linhagens registradas não possuíam a informação quanto ao ano em que foram derivadas e, por este motivo, foram excluídas da análise. A Figura 16.1 mostra o aumento no número total de linhagens de hESC derivadas de 1998 até 2013. Nenhuma linhagem foi registrada em 2013. É interessante notar que levou dois a quatro anos, desde as primeiras derivações pelos grupos de Thomson e colaboradores3 e de Reubinoff e colaboradores4, até que outros grupos relatassem o estabelecimento de novas linhagens de hESC. Esses dois primeiros grupos relataram a utilização de fator inibidor de leucemia humano (human leukemia inhibitory factor – hLIF) e MEF como fatores utilizados na manutenção do estado pluripotente durante o processo de derivação de hESC. Entretanto, em 2000, o uso de fator de crescimento de fibroblasto (basic fibroblast growth factor – bFGF) foi descrito como requisito importante durante o cultivo prolongado de hESC em meio de cultura livre de soro7, e, a partir daí, esse fator de crescimento foi consolidado como sendo o fator principal para a manutenção do estado de pluripotência de hESC em cultura. Essa constatação, provavelmente, teve um grande papel no aumento do número de derivações obtidas desde então. De fato, o número de novas linhagens de hESC, assim como o número de grupos de pesquisa e laboratórios engajados no estabelecimento dessas novas linhagens, cresceu de maneira considerável de 2004 até 2010. De 2011 a 2013,

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uma redução no número de novas derivações foi observada (Figura 16.1), provavelmente influenciado pela tendência em se obter células pluripotentes pelo método da reprogramação celular, as chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (induced pluripotent stem cells – iPSC).

Figura 16.1 Número total acumulado de novas linhagens de hESC derivadas desde 1998 (linha verde) e número de linhagens de hESC estabelecidas em cada ano, publicadas e não publicadas (barras).

A maior parte das derivações de linhagens de hESC avaliadas foi descrita em artigos científicos, mesmo aquelas derivadas nos últimos anos (Figura 16.1). Entretanto, nos artigos publicados mais recentemente, o relato da derivação de novas linhagens de hESC geralmente constitui uma pequena porção dessas publicações, nas quais a derivação de linhagens de hESC serviram de base para o estudo de outras questões científica, o que demonstra uma menor disponibilidade de publicação de estudos relatando apenas novas derivações sem que haja um outro aspecto científico original relevante. Isso também poderia explicar a diminuição no número de linhagens derivadas entre 2011 e 2013, observada em nossa análise. Ainda assim, já que existe um grande interesse na comunidade científica para que novas linhagens sejam derivadas, aumentando a diversidade de linhagens de hESC disponíveis, é importante que haja também um veículo disponível para a divulgação

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de novas linhagens com descrições de suas características específicas assim como das metodologias aplicadas para a obtenção das mesmas, um papel que pode ser desempenhado pelos bancos de registro de células-tronco.

16.3 MÉTODOS DE DERIVAÇÃO DE LINHAGENS DE hESC 16.3.1 Fonte de obtenção de embrião A grande maioria (433, ou 98,2% das linhagens informativas) dos embriões utilizados para a derivação de linhagens de hESC consiste em embriões extra-numerários obtidos em ciclos de reprodução assistida (Tabela 16.1). Apenas oito linhagens de hESC (1,8%) foram derivadas a partir de embriões gerados exclusivamente para a pesquisa – seis na China e duas na Bélgica (Tabela 16.1), países com legislações mais permissivas em relação à pesquisa com células-tronco e transferência nuclear de célula somática para fins terapêuticos8. Embora outros países, como Estados Unidos e Inglaterra, também permitam a geração de embriões com a finalidade de pesquisa, não há registro de nenhuma linhagem celular derivada a partir de embriões gerados exclusivamente para pesquisa nesses países. Além disso, todas as linhagens de hESC estabelecidas entre 2008 e 2013 foram derivadas a partir de embriões excedentes gerados com finalidade reprodutiva (Tabela 16.1). Dessa forma, podemos observar que a criação de embriões gerados exclusivamente para a pesquisa não constitui prática comum, provavelmente devido à dificuldade de obtenção de doadores de oócitos humanos. Uma importante implicação do uso de embriões extranumerários no estabelecimento de novas linhagens de hESC é a possível limitação de diversidade genética dos embriões. Uma vez que a grande maioria desses embriões é gerada em clínicas particulares de reprodução assistida em procedimentos caros, não abrangem toda a miscigenação étnica compreendida dentro de uma determinada população9. De fato, estudos recentes relataram que a maioria das linhagens de hESC derivadas ao redor do mundo são de etnicidade europeia ou leste-asiática 10-12. Com base nessas observações, tornase claro que um maior esforço deve ser realizado no sentido de se obter embriões etnicamente diversificados para a derivação de novas linhagens de hESC que possuam perfis genéticos distintos e tipagem HLA diversificadas. Embriões congelados (186 linhagens) e frescos (148 linhagens) têm sido igualmente utilizados nos processos de derivação, uma tendência que não

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Tabela 16.1 Principais características dos embriões e procedimentos utilizados na derivação de linhagens de hESC

Finalidade do embrião

Fresco/congelado

Estágio de desenvolvimento

Qualidade do embrião

Método de remoção da zona pelúcida

Método de isolamento da ICM

NÚMERO DE LINHAGENS 1998 A 2013 (%*)

NÚMERO DE LINHAGENS 2008 A 2013 (%*)

Reprodução

433 (98,2)

222 (100)

Pesquisa

8 (1,8)

0

NA

12

10

Fresco

148 (44,3)

76 (45,5)

Congelado

186 (55,7)

91 (54,5)

NA

119

65

Blastocisto

424 (95,7)

210 (94,6)

Pré-blastocisto

7 (1,6)

4 (1,8)

Blastômero

12 (2,7)

8 (3,6)

NA

10

0

Boa

81 (49,7)

34 (40,0)

Intermediária

21 (12,9)

5 (6,0)

Ruim

61 (37,4)

46 (54,0)

NA

290

147

Químico Enzimático Mecânico Hatching espontâneo Laser NA

129 (35,5) 137 (37,7) 68 (18,7) 24 (6,6) 5 (1,4) 90

49 (28,0) 55 (31,4) 58 (33,1) 9 (5,1) 4 (2,3) 57

Imunocirurgia

169 (43,0)

31 (16,8)

Mecânico

139 (34,6)

99 (53,8)

Embrião inteiro

70 (17,8)

42 (22,8)

Laser

17 (3,3)

11 (6,0)

Lise hipotônica

5 (1,3)

1 (0,5)

NA/NAp

60

32

* Porcentagem de linhagens celulares informativas. NA = informação não disponível, NAp = não se aplica.

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sofreu modificações nos últimos anos (Tabela 16.1, Figura 16.2A). Enquanto embriões frescos, quando excedentes dos ciclos de reprodução, tendem a estar disponíveis em menor número e sob curto tempo de aviso de disponibilidade para cada experimento de derivação, o uso de embriões congelados permite trabalhar com grandes quantidades de embriões ao mesmo tempo e de forma mais programada. Ainda assim, alguns pesquisadores relatam melhores taxas de eficiência de derivação a partir de embriões frescos, se comparadas ao uso de embriões congelados13.

Figura 16.2 Embriões utilizados no estabelecimento de linhagens de hESC. Número de linhagens de hESC derivadas ao longo dos anos de acordo com (A) embriões frescos ou congelados, (B) estágio do embrião, (C) método de remoção da zona pelúcida e (D) método de isolamento da ICM utilizado. NA = informação não disponível, NAp = não se aplica.

16.3.2 Qualidade do embrião A qualidade do embrião é um importante parâmetro na eficiência de derivação de linhagens de hESC. Publicações mais antigas sugerem que o uso de embriões de boa qualidade em estágio de blastocisto é essencial para o sucesso da derivação. Das 453 linhagens celulares avaliadas nesse capítulo, apenas 163 (36,0%) foram informativas quanto à qualidade do embrião a partir dos quais essas linhagens foram geradas (Tabela 16.1).

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Uma vez que diversas metodologias para avaliação da qualidade do embrião foram utilizadas pelos diferentes laboratórios nos quais as linhagens de hESC foram derivadas, optamos por utilizar em nossa análise a classificação adotada pelos bancos de dados consultados (ou nas publicações correspondentes), na qual a qualidade do embrião foi simplesmente definida como “boa”, “intermediária” ou “ruim”. Para algumas das linhagens celulares, ajustamos a informação fornecida pelos autores para esse formato. Das 163 linhagens celulares que concordaram com esse meio de classificação, 81 (49,7%) foram originadas a partir de embriões classificados como possuindo qualidade “boa”, 21 (12,9%) foram originadas a partir de embriões classificados como possuindo qualidade “intermediária” e 61 (37,4%) foram originadas a partir de embriões classificados como possuindo qualidade “ruim” (Tabela 16.1). Se olharmos apenas para as linhagens derivadas mais recentemente, podemos observar que uma porcentagem significativamente mais alta de linhagens de hESC (54,0%) foi derivada de embriões de qualidade “ruim” (Tabela 16.1). Assim, embora embriões de qualidade “boa” pareçam ser mais adequados para a derivação de linhagens de hESC, uma alta proporção de linhagens foi estabelecida a partir de embriões de qualidade “ruim”, não adequados para reprodução – o que provavelmente está associado ao fato de que a maioria dos embriões doados por clínicas de reprodução assistida para a pesquisa se enquadrem nessa categoria. É importante notar que a disponibilidade de mais informações relacionadas à qualidade dos embriões utilizados em derivações de cada uma das linhagens de hESC, assim como o estabelecimento consensual de um único método classificatório para avaliação da qualidade do embrião é de fundamental importância para que se possa definir o papel dessa variável na taxa de sucesso de geração de uma nova linhagem de hESC.

16.3.3 Estágio de desenvolvimento do embrião A maioria (424, ou 95,7%) das linhagens informativas de hESC com potencial para a formação de teratomas foram originadas a partir de embriões no estágio de blastocisto, enquanto apenas 1,6% (7 linhagens) foram estabelecidas a partir de embriões em estágios mais precoces do desenvolvimento, e 2,7% (12 linhagens) foram derivadas a partir de um único blastômero, uma distribuição que não teve alteração significativa nos últimos anos (Tabela 16.1, Figura 16.2B). Vale notar que as derivações originadas de embriões em estágios precoces ou a partir de blastômeros únicos, embora não frequentes,

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foram relatadas por grupos distintos e independentes14-19, o que demonstra a aplicabilidade dessas estratégias, além de aumentar o número de embriões que se tornam adequados para a geração de linhagens de hESC. Além disso, mais do que ter o objetivo de obter uma melhor fonte de células para derivação de linhagens de hESC, a utilização de blastômeros únicos demonstrou ser geralmente executada com o intuito de evitar polêmicas e controvérsias associadas à questão da destruição de embriões humanos.

16.3.4 Métodos de remoção da zona pelúcida e isolamento da massa celular interna (inner cell mass – ICM) Os métodos de remoção da zona pelúcida mais utilizados para a derivação da maioria das linhagens de hESC estabelecidas entre 1998 e 2013 foram a remoção enzimática, geralmente por uso de pronase (137, ou 37,7% das linhagens informativas), remoção química, geralmente por utilização do ácido de Tyrode (129 ou 35,5% das linhagens informativas), ou remoção mecânica (68 ou 18,7% das linhagens informativas). Entretanto, de 2008 a 2013, houve um aumento no uso da técnica de remoção mecânica (33,1%) e pequena diminuição da utilização dos métodos de remoção enzimática (31,4%) e química (28,0%) da zona pelúcida (Tabela 16.1, Figura 16.2C), demonstrando que esses três métodos são utilizados de maneira similar quando não há eclosão (hatching) espontânea do embrião. As linhagens de ESC de camundongo são estabelecidas a partir do plaqueamento de blastocistos inteiros, seguido do isolamento mecânico das células da massa celular interna (ICM) do trofoectoderma que as envolve após alguns dias. Em contraste, os procedimentos adotados até 2004 para a derivação de linhagens de hESC geralmente incluíam o isolamento da ICM antes do plaqueamento do embrião (Figura 16.2D). É verdade que, quanto menor a manipulação do embrião, menor a chance de danos às células que o compõem. Porém, como as células do trofoectoderma proliferam-se de maneira extremamente rápida, há um risco de que essas células possam suprimir o crescimento da ICM, o que pode acarretar no surgimento de uma linhagem celular trofoectodérmica embrionária20. Desde 1998 até 2013, a técnica mais utilizada para o isolamento da ICM foi a imunocirurgia (Tabela 16.1, Figura 16.2D), que consiste em um procedimento não específico baseado na susceptibilidade do embrião à citotoxidade aos anticorpos de maneira dependente de complemento21. A maior desvantagem desse método é o risco de danificar as células da ICM22 diminuindo,

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assim, as chances de essas células poderem originar uma nova linhagem de hESC. Além disso, essa metodologia envolve o uso de componentes derivados de animais, o que pode tornar a linhagem de hESC não adequada a certas aplicações. Dessa forma, métodos alternativos de isolamento da ICM, como dissecção mecânica ou assistida por laser, foram desenvolvidos. De fato, desde 2008 até 2013, a dissecção mecânica da ICM foi a estratégia mais comumente utilizada (Tabela 16.1, Figura 16.2D). Adicionalmente, uma grande proporção das linhagens de hESC foram estabelecidas a partir do plaqueamento do embrião inteiro livre da zona pelúcida (Tabela 16.1, Figura 16.2D), procedimento empregado especialmente para embriões de qualidade pobre, sem ICM distinta, embora tenha sido utilizado também para embriões de boa qualidade. Em conclusão, o nosso levantamento permitiu identificar uma tendência a não se empregar a imunocirurgia e a adotar a dissecção mecânica no isolamento da ICM. Todavia, a melhor metodologia para o isolamento da ICM a partir de embriões humanos ainda não foi consolidada. Dessa forma, a morfologia e a qualidade do embrião, juntamente com a disponibilidade laboratorial de equipamentos de dissecção a laser ou de micromanipulação, desempenham papéis centrais na escolha do método a ser utilizado. Além disso, uma vez que uma grande quantidade de linhagens de hESC têm sido estabelecidas a partir de embriões plaqueados inteiros, principalmente nos últimos anos, a grande novidade nesse passo do procedimento é a falta de necessidade de isolamento da ICM para a derivação de uma nova linhagem de hESC, o que simplifica consideravelmente o procedimento de derivação.

16.3.5 Condições de cultura Para realizar nossa análise, dividimos os componentes presentes no meio de cultura para a derivação de linhagens de hESC em quatro principais componentes: (1) meio básico, por exemplo, Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM), DMEM-F12, KO-DMEM (knockout-DMEM); (2) fonte de proteínas, por exemplo soro fetal bovino (fetal bovine serum – FBS), KnockOut™ serum replacement (KSR); (3) fator(es) usados para manter a pluripotência celular, por exemplo, bFGF, LIF; e (4) tipo de matriz/suporte celular, por exemplo, MEF, fibroblastos de prepúcio humano (human foreskin fibroblasts – HFF), Matrigel™. Dezenas de combinações dos diversos tipos desses quatro componentes demonstraram ser capazes de manter as hESC em estado pluripotente em cultura (revisado em Fernandes et al.23), e nossa

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análise demonstrou que muitas dessas combinações são também apropriadas para a geração de novas linhagens celulares (Tabela 16.2). KO-DMEM e KSR têm sido respectivamente o tipo de meio básico e o tipo de fonte de proteínas mais utilizados durante a derivação de linhagens de hESC (Tabela 16.2, Figura 16.3A e 16.3B). De fato, 262 (57,8%) de todas as linhagens de hESC consideradas em nossa análise foram cultivadas nesses dois componentes pelo menos durante algum dos estágios envolvidos no processo de derivação. Portanto, KO-DMEM e KSR compreendem a base de cultivo mais empregada, não apenas durante a manutenção das hESC em cultura23, mas também durante o processo de derivação de uma nova linhagem de hESC. Tabela 16.2 Condições de cultura para a derivação de linhagens de hESC

Meio de cultura

Fonte de proteínas

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NÚMERO DE LINHAGENS 1998 A 2013 (%*)

NÚMERO DE LINHAGENS 2008 A 2013 (%*)

KO-DMEM

277 (64,3)

134 (62,0)

DMEM-F12

99 (23,0)

58 (26,9)

DMEM

35 (8,1)

9 (4,2)

DMEM-F12/KO-DMEM

12 (2,8)

12 (5,6)

TeSR1 ou mTeSR1

4 (0,9)

2 (0,9)

DMEM/KO-DMEM

3 (0,7)

0

E8

1 (0,2)

1 (0,5)

NA

22

16

KSR

291 (68,2)

150 (69,8)

FBS/KSR

86 (20,2)

56 (26,0)

FBS

45 (10,5)

8 (3,7)

HS

4 (0,9)

1 (0,5)

RHP

1 (0,2)

0

NA/NAp

26

16

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Fatores de crescimento

Tipo de suporte/Matriz

NÚMERO DE LINHAGENS 1998 A 2013 (%*)

NÚMERO DE LINHAGENS 2008 A 2013 (%*)

FGF

324 (75,3)

170 (78,3)

LIF/FGF

84 (19,5)

45 (20,7)

LIF

20 (4,7)

2 (0,9)

Nenhum

2 (0,5)

0

NA

24

17

Murino

289 (64,4)

129 (56,6)

Humano

147 (32,7)

91 (39,9)

Acelular

10 (2,2)

7 (3,1)

Mix

3 (0,7)

1 (0,4)

NA

4

0

* Porcentagem de linhagens celulares informativas. KO-DMEM = knockout DMEM, KSR = knockout serum replacement, FBS = soro fetal bovino, HS = soro humano, RHP = proteínas recombinantes humanas, FGF = fator de crescimento de fibroblasto, LIF = fator inibidor de leucemia, NA = informação não disponível, NAp = não se aplica.

O KO-DMEM é um meio “baseado em DMEM” que possui osmolaridade reduzida, o que favorece o crescimento de ESC indiferenciadas, enquanto o KSR, desenvolvido em 1998, é mais adequado para o cultivo de ESC do que o soro fetal bovino (FBS) porque contém fatores promotores de crescimento e diferenciação definidos 24. Além disso, embora contenha componentes de origem animal, o KSR é um suplemento de composição definida, o que evita a variação entre diferentes lotes observada no FBS 25. Ainda assim, até mesmo nos últimos anos, um número significante de linhagens de hESC (56 linhagens, ou 26,0% das linhagens informativas) foi estabelecido em combinação de KSR/FBS – o que aparentemente melhora o potencial de adesão e crescimento iniciais da ICM26 – e foram subsequentemente transferidas para meio contendo somente KSR para cultivo a longo prazo. Em contraste, o uso de FBS como única fonte de proteína durante a derivação diminuiu significantemente nos últimos anos (Tabela 16.2, Figura 16.3B). Outra preocupação em relação ao uso de componentes de origem animal durante o cultivo de hESC foi a identificação, em 2005, de ácido siálico não humano (Neu5Gc) potencialmente imunogênico em linhagens de hESC cultivadas sobre células não humanas ou em produtos derivados de soro

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Figura 16.3 Composição do meio de cultura. Número de linhagens de hESC derivadas ao longo dos anos de acordo com (A) meio básico de cultura – KO-DMEM = knockout DMEM; (B) fonte de proteínas – KSR = knockout serum replacement, FBS = soro fetal bovino, HS = soro humano, RHP = proteínas recombinantes humanas; (C) fator para manutenção da pluripotência – FGF = fator de crescimento de fibroblasto, LIF = fator inibidor de leucemia; e (D) tipo de suporte celular. NA = informação não disponível, NAp = não se aplica.

animal 22. Embora essa preocupação não seja uma limitação ao estabelecimento de linhagens de hESC voltadas para o uso em pesquisa científica, diferentes grupos interessados na derivação de linhagens de hESC com propósito de utilização em terapia celular optaram por trabalhar em condições livres de componentes de origem animal, e adotaram o uso de meios de cultura xeno-free – TeSR1™ e TeSR™-E8™ ou Essential 8™ – e o uso de proteínas humanas recombinantes como substitutos do soro animal durante o processo de derivação de suas linhagens (Tabela 16.2, Figuras 16.3A e 16.3B). Ambos o fator inibidor de leucemia (LIF) e as camadas de fibroblastos embrionários murinos (MEF) constituem os componentes responsáveis para a manutenção de estado de pluripotência de ESC de camundongos. Embora o LIF humano (hLIF) tenha sido empregado durante o estabelecimento das primeiras linhagens de hESC3,4, estudos posteriores demonstraram que esse componente não é capaz de promover a manutenção do estado indiferenciado das hESC durante um período de tempo prolongado em cultura27. Por esse motivo, o uso de apenas hLIF no meio de cultura utilizado para a

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derivação de linhagens de hESC diminuiu ao longo dos anos, ao passo que o uso de bFGF, seja sozinho ou em combinação com hLIF, foi consolidado como sendo o principal fator de manutenção de pluripotência de hESC, tanto durante o processo de derivação de novas linhagens, como também durante a manutenção prolongada em cultura dessas células23 (Tabela 16.2, Figura 16.3C). Embora os MEF constituam o tipo de suporte mais comumente utilizado para o estabelecimento de linhagens de hESC (289, ou 64,4% das linhagens informativas), já a partir de 2002 pode-se observar o início do uso no processo de derivação, tanto de tipos alternativos de suporte celular de origem humana (147 linhagens, ou 32,7% das linhagens informativas), como de tipos de matrizes proteicas acelulares (10 linhagens, ou 2,2% das linhagens informativas), provavelmente com o intuito de evitar a contaminação dessas culturas por componentes de origem animal (Tabela 16.2, Figura 16.3D). De 2008 até 2013, observa-se uma redução na utilização de MEF e um aumento no uso de camadas celulares de suporte de origem humana (Tabela 16.2, Figura 16.3D). Por outro lado, uma grande porcentagem (56,6%) de linhagens de hESC continua a ser derivada na presença de MEF, um indício de que esse tipo de suporte celular possa apresentar maior capacidade de manutenção do estado de pluripotência de hESC e/ou de que a fácil disponibilidade e custo mais baixo dos MEF os tornem um tipo de suporte mais vantajoso para o processo de derivação do que os outros tipos de suporte alternativos. Outros parâmetros relacionados ao processo de derivação de hESC, como momento da primeira passagem, frequências das passagens, frequência de troca de meio de cultura e taxa de eficiência da derivação foram também avaliados durante o nosso trabalho de levantamento de dados. Entretanto, esses parâmetros apresentaram grande variação entre as linhagens de hESC consideradas em nosso estudo não sendo portanto conclusivos. Informações como, por exemplo, número de linhagens de hESC obtidas por número de embriões manipulados, seriam de fundamental importância para se avaliar a taxa de eficiência de cada tipo de metodologia empregada durante a derivação das linhagens de hESC. Infelizmente, além desses dados frequentemente não estarem descritos de maneira clara em diversas publicações, o número relativamente pequeno de linhagens celulares estabelecidas em cada condição metodológica específica torna difícil a execução de uma análise estatística significante em relação à taxa de eficiência de derivação associada aos diferentes protocolos laboratoriais aplicados para o estabelecimento de linhagens de hESC.

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16.4 POSSIBILIDADES E IMPLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DAS hESC Células doadoras geradas a partir de células pluripotentes podem ser utilizadas como uma fonte de obtenção de tecidos em medicina regenerativa e, portanto, representam uma possível solução para o número limitado de doadores de órgãos, assim como para a regeneração de tecido nervoso e reposição de tecido danificado. Em contraste às células-tronco adultas que geralmente apresentam um potencial de diferenciação em tipos celulares distintos limitado (revisado em Kerkis et al.28 e Fonseca et al.29), as hESC são pluripotentes, ou seja, possuem um inquestionável potencial de diferenciação e, portanto, são capazes de ser diferenciadas em uma grande variedade de tipos celulares distintos, o que as tornam uma fonte de células para terapia mais abrangente. O interesse constante nessas células é claramente evidenciado pelo fato de que, desde a derivação em 1998 da primeira linhagem de hESC, o número de linhagens registradas nos bancos de dados rapidamente aumentou. Além disso, estudos pré-clínicos e clínicos realizados até o momento, sugerem que as hESC possuem tanto atividade biológica relevante, como baixo risco de toxicidade a curto ou longo prazo para o receptor. Entretanto, para que essas células sejam adequadas para uso em terapia celular, condições rigorosas devem ser adotadas durante a derivação e manutenção em cultura das hESC. Como vimos, até agora o método mais efetivo de derivação de uma nova linhagem de hESC ainda não está bem estabelecido. Ainda assim, se considerarmos uma futura aplicação das hESC em terapia celular, o consenso é de que as condições de cultura de hESC devam, preferencialmente, ser definidas e livre de contaminantes de origem animal. Por esse motivo, existe um esforço contínuo em estabelecer suportes celulares de origem não animal (matrizes), meios de cultura completamente definidos e procedimentos de cultivo adequados para as hESC utilizadas em terapia celular30. Entretanto, a maioria das linhagens de hESC disponíveis não foram derivadas ou mantidas sob essas condições ótimas, já que a metodologia utilizada durante o estabelecimento dessas linhagens foi baseada em protocolos de derivação de ESC murinas (mESC). Ainda assim, é importante notar que o primeiro estudo clínico na qual hESC são utilizadas para o tratamento de lesões da medula espinhal está sendo conduzido através do uso de uma linhagem de hESC que foi derivada na presença de componentes animais em cultura3 e que foi, posteriormente, adaptada para condições livres de componentes animais antes de serem transplantadas nos pacientes. Mesmo assim, este tratamento ainda deve ser considerado como xenotransplante.

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A propagação contínua de hESC no laboratório pode levar à geração de populações de células anormais, uma vez que as células melhores adaptadas às condições de cultura podem ser progressivamente selecionadas31. Já está bem documentado que as alterações cromossômicas mais frequentemente observadas em hESC cultivadas por longos períodos são os ganhos de cromossomos 12 e 1731-33. Outros autores também descreveram ganhos de um ou mais cromossomos X extras nessas populações celulares34,35. Além disso, uma análise de 125 linhagens de hESC publicada pela International Stem Cell Initiative mostrou que a amplificação da região cromossômica 20q11.21 foi encontrada em mais de 20% dessas linhagens36. Os mesmos achados haviam sido anteriormente relatados por Lefort e colaboradores37. A região cromossômica 20q11.21 contém o gene BCL2L1, cujo produto é um inibidor de apoptose e, portanto, um forte candidato para estar envolvido na adaptação de hESC às condições de cultura36. Talvez a maior preocupação do uso de hESC em terapia celular esteja relacionada à segurança clínica do uso dessas células, mais especificamente o potencial intrínseco que as células pluripotentes possuem para originar teratomas ou teratocarcinomas quando injetadas no paciente. Esse efeito adverso do uso de terapia baseada em células pluripotentes poderia ser evitado através do pré-diferenciamento dessas células in vitro antes do uso destas em procedimentos de terapia celular. Entretanto, a aquisição de uma população homogênea de células diferenciadas não é tarefa fácil, e a presença de apenas uma pequena porção de células não diferenciadas no material utilizado para transplante poderia levar à formação de teratomas ou teratocarcinomas no paciente. Ainda assim, estudos pré-clínicos demonstraram que células diferenciadas derivadas de hESC poderiam ser seguramente injetadas em organismos-modelo alogênicos como ratos, camundongos e porcos-da-índia sem que acarretassem na formação de teratomas. Por outro lado, Erdö e colaboradores 38 relataram que, em animais-modelo para acidente vascular cerebral, ratos que receberam mESC – tanto indiferenciadas como diferenciadas – não desenvolveram teratomas, enquanto os camundongos que as receberam desenvolveram tumor. Isso demonstra que diferentes consequências podem ser observadas entre xenotransplantes e transplantes homólogos. Sendo assim, estudos clínicos rígidos devem ser realizados com hESC a fim de excluir a possibilidade de formação tumoral em humanos. Em relação ao potencial de diferenciação das hESC, diversos protocolos distintos estão disponíveis na literatura para a geração de tipos celulares específicos a partir de hESC indiferenciadas. A maioria desses protocolos requer extensa manipulação em cultura e uso de diversos reagentes39, o que

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torna a pré-diferenciação das hESC in vitro um procedimento laborioso e de custo relativamente elevado. Além disso, muitos dos protocolos disponíveis não são sempre facilmente reproduzidos e diferenças significantes podem ser observadas de cultura para cultura, mesmo quando protocolos e condições idênticas de cultivo são empregados. Sendo assim, muitos grupos de pesquisa estão atualmente trabalhando para desenvolver protocolos de diferenciação de baixo custo, robustos e escalonáveis com o intuito de produzir populações de células pré-diferenciadas derivadas de hESC que sejam altamente homogêneas. Entretanto, alguns tipos celulares são ainda difíceis de obter através de diferenciação in vitro, como, por exemplo, células pancreáticas e células germinativas funcionais, e mais estudos tornam-se necessários nesse sentido. Finalmente, uma implicação do uso de embriões excedentes de ciclos de reprodução assistida para o estabelecimento de novas linhagens de hESC é a possível limitação de diversidade genética desses embriões, que pode não atender à miscigenação étnica de uma dada população. Assim como em transplante de órgãos, é possível que haja necessidade de que as células-tronco sejam HLA-compatíveis com seus receptores. Alguns trabalhos demonstraram uma restrição no perfil de HLA e background genético nas linhagens de hESC estabelecidas ao redor do mundo, mostrando que a etnicidade dessas linhagens eram principalmente europeia e leste-asiática 10-12. Sendo assim, será importante obter embriões etnicamente distintos para a derivação de novas linhagens de hESC com diferentes backgrounds genéticos e diferentes tipagem de HLA. Por outro lado, as hESC podem originar potentes células apresentadoras de antígenos (células dendríticas – DC) (revisado em Senju et al.40 e Silk et al.41). Vacinas baseadas em DC já estão sendo testadas em terapia do câncer, na qual as células cancerosas se tornam alvos para o sistema imune 42, 43. No contexto de compatibilidade de HLA, DC derivadas de hESC poderiam persuadir o sistema imunológico dos pacientes submetidos à terapia celular a tolerar tecidos alogênicos diferenciados a partir da mesma linhagem de hESC 41. Isso poderia prolongar a aceitação de derivativos de hESC pelo sistema imunológico do paciente com uma utilização mínima de drogas imunossupressoras44. Em resumo, embora as hESC constituam uma fonte promissora de células para uso em medicina regenerativa, alguns fatores impedem a ampla aceitação do uso de células pluripotentes, em geral, para terapia celular e, portanto, devem ser considerados, o mais crítico deles sendo o potencial que essas células apresentam de formar teratomas e teratocarcinomas quando transplantadas no paciente. Outras fontes de células para terapia já são

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conhecidas – entre elas células-tronco adultas, iPSC e células diretamente convertidas – mas, em cada caso, os benefícios associados são contrabalanceados pelas suas desvantagens. Sendo assim, atualmente não é possível afirmar que exista um tipo celular perfeito para o tratamento de todos os problemas de saúde, uma vez que isso irá depender, principalmente, do tipo de doença a ser tratada. Portanto, antes que todas as muitas promessas associadas à terapia celular possam ser concretizadas, pesquisas básicas e translacionais envolvendo todos esses tipos celulares como fonte de material para a terapia celular devem continuar a ser desenvolvidas.

16.5 CONCLUSÕES Frente ao início de um projeto envolvendo derivações de novas linhagens de hESC, a escolha da melhor estratégia metodológica irá depender principalmente de fatores como a qualidade dos embriões disponíveis e da finalidade pela qual tais linhagens serão geradas. Para linhagens de hESC cuja finalidade seja a de aplicação em pesquisa básica, pode-se não haver a preocupação em se utilizar produtos contendo componentes de origem animal. Por outro lado, se as linhagens de hESC forem geradas com o propósito de utilização em terapia celular, o emprego de condições definidas e livre de componentes de origem animal se faz mais adequado. Ainda assim, é importante ressaltar que este não é um requisito indispensável – linhagens de hESC estabelecidas na presença de produtos de origem animal podem ser transferidas às condições de cultura adequadas ao uso clínico. De fato, esse é o caso da primeira linhagem de hESC gerada no mundo, a linhagem H1, que foi posteriormente utilizada para gerar oligodendrócitos empregados no tratamento de lesões da medula espinhal – o primeiro produto no mundo derivado de hESC a ser injetado em humanos*. Em resumo, a grande heterogeneidade de metodologias aplicadas a derivação de linhagens de hESC descrita nesse capítulo indica que as condições ótimas associadas a esse tipo de procedimento ainda não foram identificadas. Ainda assim, podemos identificar melhoras significativas nos protocolos de derivação empregados desde 1998: embora a derivação em suporte acelular ou suporte celular de origem humana tenha demonstrado ser eficiente, os MEF são ainda o tipo de suporte celular mais utilizado e a combinação de KO-DMEM/KSR com bFGF foi consolidada como sendo o tipo de meio de *

Ver <www.geron.com>.

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cultura e fonte proteica mais adequados. Além disso, o isolamento da ICM pode ser dispensado e linhagens de hESC podem também ser estabelecidas a partir de embriões de baixa qualidade plaqueados inteiros após hatching espontâneo ou remoção da zona pelúcida. Porém, todas as metodologias listadas ainda geram linhagens de hESC que diferem significantemente das linhagens de ESC murinas em morfologia, estabilidade epigenética e cinética de crescimento, entre outras características45. Mais recentemente, os efeitos positivos do uso de níveis fisiológicos de oxigênio durante a cultura e manutenção das linhagens de hESC foi relatado46. Além disso, células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) derivadas na presença de inibidores de quinases e hLIF demonstraram ser mais similares a mESC45. Esses achados ainda precisam ser confirmados por outros grupos de pesquisa para serem consolidados, mas possuem o potencial de promover grandes mudanças nesse campo de estudo. Finalmente, temos que levar em consideração a heterogeneidade genética humana, fator que adiciona mais um nível de complexidade às hESC se comparadas às suas correspondentes murinas - geralmente derivadas de animais isogênicos, em sua grande maioria pertencentes à linhagem 129/Sv. Podemos, para os próximos anos, antecipar melhoras importantes nas condições metodológicas empregadas durante o estabelecimento e cultivo de novas linhagens de hESC, o que tornará essas células ainda mais adequadas, tanto para a utilização em pesquisa básica, quanto para o uso em terapia celular.

16.6 PROTOCOLO PARA DERIVAÇÃO DE LINHAGENS DE hESC 16.6.1 Preparo da camada de células de suporte (feeder cells) Podem ser utilizados como feeders fibroblastos de origem humana – dentre eles os mais utilizados são os fibroblastos de prepúcio humano (HFF) – ou fibroblastos de origem murina, como os fibroblastos embrionários de camundongos (MEF), amplamente utilizados em protocolos de derivação. Descreveremos aqui o protocolo de preparo e cultivo de MEF.

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16.6.2 Isolamento, preparação e cultivo inicial de MEF Material • 1XDPBS (tampão fosfato salino de Dulbecco) livre de Ca 2+ e Mg 2+ (Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium, Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 14190-144) • 0,05% Tripsina / EDTA (Life Technologies™ – Gibco ® , Cat# 25300-054) • 0, 25% Tripsina / EDTA (Life Technologies™ – Gibco®, Cat# 25200-056) • Álcool 70% • Solução de gelatina 0,01% em água (StemCell Technologies™, Cat# 07903) • Tubos de centrífuga de 50 mL • Placas de Petri estéreis com 100 mm de diâmetro • Placas de Petri estéreis com 60 mm de diâmetro • Garrafas de cultura de T75 estéreis e aderentes • Tesouras e pinças estéreis • Meio MEF (ver a seguir) • DNAse I (opcional) Meio MEF • 1X DMEM High Glucose (Life Technologies™ – Gibco ® , Cat# 11960-044) • 10% FBS E S - Qualified (Life Technologies™ – Gibco ® , Cat# 16141-079) • 2 mM GlutaMAX™ Supplement (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 35050-061) • 100 U/mL penicilina / 100 µg/mL estreptomicina (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 15140-122) • 1 X (0,1 mM) aminoácidos não essenciais (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 11140-050) • 1 mM piruvato de sódio (Life Technologies™ – Gibco ® , Cat# 11360-070) • 10 mM HEPES (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat # 15630-080) • 0,055 mM 2-mercaptoetanol (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 21985-023)

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• Preparar o meio e filtrar (filtro de 22 uM). O meio deve ser guardado em geladeira e pode ser utilizado por até duas semanas. Procedimento 1) O tempo de gestação de camundongos para obter as células deve ser de 12,5 a 14,5 dias pós-coito. As fêmeas grávidas devem ser sacrificadas por deslocamento cervical. 2) Esterilizar a região abdominal das fêmeas antes do procedimento com álcool 70%. 3) Abrir a cavidade abdominal com o auxílio de tesouras e pinças esterilizadas. 4) Retirar o útero e colocar imediatamente os cornos uterinos em uma placa de Petri (100 mm) contendo DPBS. Retirar os fetos com o auxílio de tesouras. 5) Transferir os fetos para nova placa de Petri (100 mm) contendo DPBS. 6) Repetir o processo pelo menos três vezes até que o DPBS esteja livre de sangue. 7) Com o auxílio de uma lupa, remover a cabeça e as vísceras (áreas vermelhas) dos fetos, preservando as demais partes. Os membros e cauda também podem ser retirados, preservando-se apenas o tronco. 8) Recomenda-se que a partir de agora todo o processo seja realizado em ambiente estéril. Transferir os tecidos para nova placa de Petri (60 mm) contendo cerca de 2 mL de DPBS. Lavar os tecidos até que eles estejam totalmente livres de sangue, transferindo-os para novas placas de Petri (60 mm) contendo DPBS. 9) Transferir os tecidos para uma nova placa de Petri (60 mm) contendo cerca de 1 mL de tripsina 0,05% para cada dois fetos. O ideal é trabalhar com até cinco fetos por vez. 10) Com o auxílio de uma tesoura, cortar rapidamente todo o feto em pequenos pedaços (1 mm a 2 mm). 11) Transferir os fragmentos e a tripsina para um tubo de centrífuga e incubar por 10 minutos a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade. Não deixar os tecidos durante muito tempo na tripsina para evitar a morte celular. 12) Após o período de incubação, neutralizar a tripsina com meio MEF (o volume de meio MEF adicionado deve ser pelo menos duas vezes o volume utilizado de tripsina). 13) Com o auxílio de uma pipeta sorológica de 5 mL ou 10 mL, pipetar vigorosamente para se obter células isoladas em suspensão. Neste momento,

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pode-se formar um gel devido ao DNA proveniente do rompimento de células. Para evitar isso, pode-se adicionar DNAse I (1 µg/mL) à preparação, que deve ser novamente incubada a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade por cerca de 5 minutos. 14) Centrifugar a 230 g por 5 minutos em temperatura ambiente. 15) Retirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio MEF aquecido (use cerca de 25 mL de meio por feto). 16) Plaquear as células em um frasco de cultivo de 75 cm 2 (utilizar um frasco por feto) tratado previamente com gelatina. O pré-tratamento com gelatina é realizado adicionando-se 10 mL da solução 0,01% de gelatina ao frasco que deve ser deixado à temperatura ambiente por pelo menos 20 minutos. Após esse período, a solução de gelatina deve ser descartada e as células em meio MEF imediatamente plaqueadas. 17) No dia seguinte ao plaqueamento, trocar o meio de cultura para retirar células que não aderiram e as células mortas e adicionar meio MEF fresco mantido à temperatura ambiente. 18) As células deverão ser passadas cerca de 3 a 5 dias após plaqueamento – quando cobrirem aproximadamente 90% da placa (90% confluente) – na proporção de 1:3. 19) Congelar as células em passagens baixas (segunda ou terceira passagem) em meio de congelamento (70% meio MEF, 20% FBS, 10% DMSO) para que futuramente possam ser expandidas, inativadas e empregadas como feeders nos procedimentos de derivação e cultivo de hESC.

16.6.3 Passagem dos MEF Material • 1XDPBS livre de Ca 2+ e Mg 2+ (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 14190-144) • Solução de gelatina 0,01% em água (StemCell Technologies™, Cat# 07903) • 0, 25% Tripsina / EDTA (Life Technologies™ – Gibco ® , Cat# 25200-056) • Tubos de centrífuga de 15 mL ou 50 mL • Garrafas de cultura de T75 estéreis e aderentes • Meio MEF (ver item 16.6.2)

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Procedimento 1) Retirar o meio das garrafas e lavar as células delicadamente com 10 mL de DPBS por duas vezes. 2) Aspirar o DPBS e adicionar à garrafa de cultura contendo MEF cerca de 5 mL de tripsina/EDTA 0,25% agitando gentilmente para garantir que todas as células estejam cobertas com a tripsina. 3) Incubar 3 a 5 minutos a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade (ou até que as células se soltem do frasco). 4) Após esse período, observar ao microscópio se as células estão em suspensão. Em caso negativo, incubar por mais três minutos, certificar novamente que as células estão em suspensão e isoladas. 5) Neutralizar a tripsina adicionando cerca de 10 mL a 15 mL de meio MEF ao frasco de cultura. 6) Transferir para tubos de centrífuga e centrifugar 5 minutos a 230 g, temperatura ambiente. 7) Retirar o sobrenadante e ressuspender as células em 15 mL de meio MEF. 8) Dividir as células para 3 frascos de T75 pré-tratados com gelatina contendo 10 mL de meio MEF. Alternativamente, os MEF podem ser congelados para uso futuro.

16.6.4 Inativação dos MEF com mitomicina-C A inativação dos MEF é um passo importante no protocolo de derivação e cultivo de hESC. Esse procedimento tem como objetivo bloquear a multiplicação dos MEF para que essas células não concorram com as hESC cultivadas sobre eles, impedindo o crescimento das colônias de hESC. O procedimento de inativação dos MEF pode ser realizado através do uso de radiação gama ou da droga mitomicina-C (um antibiótico antitumoral que promove a ligação cruzada entre as cadeias complementares do DNA, prevenindo a separação dessas cadeias e, portanto, a replicação do DNA, o que impede a progressão no ciclo de divisão celular). Os MEF inativados podem ser congelados para uso futuro ou utilizados logo após o tratamento de inativação. Descreveremos a seguir o protocolo de inativação de MEF por tratamento com mitomicina-C. É importante ressaltar que, sendo a mitomicina-C um reagente tóxico, deve-se adotar cuidado especial durante sua manipulação e descarte. Todo o material utilizado durante a inativação dos MEF por mitomicina-C deve ser descartado de acordo com as regras de descarte de lixo tóxico/químico em recipientes e com coleta apropriados.

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Material • Frasco T75 contendo MEF ativos • 1XDPBS livre de Ca 2+ e Mg 2+ (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 14190-144) • Solução de gelatina 0,01% em água (StemCell Technologies™, Cat# 07903) • 0, 25% Tripsina / EDTA (Life Technologies™ – Gibco ® , Cat# 25200-056) • Mitomicina-C (Sigma-Aldrich®, Cat# M4287) • Tubos de centrífuga de 50 mL • Para contagem das células: tubos plásticos estéreis de 1,5 mL, Trypan Blue, câmara de Neubauer • Meio MEF (ver item 16.6.2) Procedimento 1) A solução de tratamento por mitomicina é preparada adicionando-se 180 µL de solução estoque de mitomicina C (C = 0,5 µg/ul em PBS) em 9 mL de meio MEF (concentração final = 10 µg/mL). 2) Retirar o meio de cultura de um frasco T75 contendo MEF ainda ativos, adicionar a solução de tratamento por mitomicina ao frasco e retornar as células para a incubadora a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade por 3 horas. 3) Retirar a solução de tratamento por mitomicina cuidadosamente do frasco (essa solução deve ser descartada em lixo tóxico/químico) e lavar as células duas vezes em DPBS (25 mL de DPBS para cada lavagem). O DPBS utilizado durante a lavagem dos MEF também deve ser descartado em lixo tóxico/químico. 4) Adicionar 3 mL a 5 mL de tripsina 0,25% ao frasco e incubar as células a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade, por 5 minutos até que se soltem do frasco. 5) Neutralizar a tripsina adicionando 15 mL de meio MEF ao frasco, transferir as células em suspensão para um tubo de centrífuga. 6) Centrifugar a 230 g por 5 minutos à temperatura ambiente. 7) Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 6 mL de meio MEF. 8) Coletar 10 µL da suspensão de células e misturar a 10 µL de Trypan Blue em um eppendorf. Após 2 minutos, 10 µL dessa mistura são aplicados à câmara de Neubauer para contagem do número de células viáveis.

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9) As MEF tratadas com mitomicina podem ser imediatamente plaqueadas em placas de cultura previamente tratadas com 0,01% gelatina e retornadas à incubadora a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade, ou, alternativamente, centrifugadas novamente a 230 g por 5 minutos à temperatura ambiente, ressuspendidas em volume apropriado de meio MEF de congelamento e congeladas para uso futuro.

16.6.5 Plaqueamento de MEF inativados para uso em derivações e cultivo de hESC Material • MEF inativados • Solução de gelatina 0,01% em água (StemCell Technologies™, Cat# 07903) • Placas aderentes de poço central (Falcon ® 60mm Center Well Organ Culture Dish, Corning© Cat#353037, para utilização em derivações de hESC) ou placas aderentes de 35 mm (para utilização em derivação e cultivo de hESC) • Meio MEF (ver item 16.6.2) Procedimento 1) Pré-tratar as placas com solução de gelatina 0,01% (500 µL para placas de poço central ou 1 mL para placas de 35 mm) por pelo menos 20 minutos a temperatura ambiente. A solução de gelatina deve ser retirada imediatamente antes do plaqueamento dos MEF. 2) Para cada poço, plaquear aproximadamente 105 MEF inativados/cm2 em meio MEF (800 µL de meio MEF para placas de poço central ou 2 mL para placas de 35 mm). 3) Incubar a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade. 4) Cerca de 24 horas após o plaqueamento, verificar se as células estão corretamente plaqueadas (bem distribuídas e com confluência adequada, que deve ser de cerca de 90%). A placa contendo MEF inativados está pronta para ser utilizada nos procedimentos de derivação ou cultivo de hESC. Uma vez que os MEF inativos tem período de viabilidade curto, MEF plaqueados há mais do que três dias não devem ser utilizados para derivação ou cultivo de hESC.

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16.7 DERIVAÇÃO E CULTIVO DE NOVAS LINHAGENS DE hESC 16.7.1 Derivação de novas linhagens de hESC A derivação de novas linhagens de hESC no Brasil é realizada a partir de embriões excedentes de clínicas de reprodução humana, procedentes de tratamentos para infertilidade e considerados inviáveis para transferência. De acordo com a Lei de Biossegurança nº 11.105, de 24 de março de 2005, são requisitos para o uso de embriões humanos em pesquisa: os embriões devem ser considerados inviáveis para transferência (apresentar baixa qualidade embrionária) e devem ter sido congelados há pelo menos três anos ou considerados inviáveis pelo resultado anormal obtido através de diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) e devem ser doados para pesquisa com consentimento informado do casal. Em geral, deve haver um trabalho colaborativo entre o centro de pesquisa que irá estabelecer as novas linhagens e as clínicas de reprodução assistidas envolvidas. Os embriões utilizados para derivações de linhagens de hESC devem estar em estágio de blastocisto (dia cinco ou dia seis), de preferência com boa visualização da ICM e trofoectoderma. Quando não ocorre o hatching espontâneo, é necessária a remoção da zona pelúcida do embrião que, em geral, pode ser feita de forma química (com a utilização do ácido de Tyrode), enzimática (com o uso de pronase), manualmente, ou ainda com a utilização de equipamentos apropriados para dissecção mecânica (micromanipulador) ou a laser. Uma vez que o embrião apresente-se livre da zona pelúcida pode ser plaqueado inteiro sobre a camada de feeders inativados, mas o ideal é que seja feita a separação da ICM do blastocisto de modo que a ICM possa ser plaqueada isoladamente do trofoectoderma. Esse procedimento pode ser realizado através de imunocirurgia, lise hipotônica, isolamento manual da ICM ou, ainda, com a utilização de micromanipulador ou equipamento de dissecção a laser. Além disso, diferentes meios de cultura podem ser utilizados para derivação e cultivo de linhagens de hESC. Descreveremos a seguir o processo de derivação através de remoção manual da zona pelúcida e isolamento manual da ICM e com o uso de meio de cultura baseado em KO-DMEM, KSR e bFGF. Material • Embrião humano qualificado para uso em pesquisa de acordo com a Lei de Biossegurança nº 11.105, de 24 de março de 2005

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• Placas aderentes contendo MEF inativados já plaqueados • Placas de cultivo não aderentes de 35 mm para lavagem do embrião, remoção da zona pelúcida e isolamento da ICM • Meio de cultivo de embrião (observação: diferentes meios podem ser utilizados, como o Modified HTF Medium with Gentamicine – HEPES, Irvine Scientific©, Cat# 90126, utilizado também para transporte do embrião da clínica de reprodução assistida para o laboratório. Em geral, recomenda-se utilizar o mesmo meio de cultura para embrião usado pela clínica de reprodução onde o embrião foi gerado) • 1XDPBS livre de Ca 2+ e Mg 2+ (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 14190-144) • Stripper ® micropipetter (Mid Atlantic, Cat# MXL3-STR) • Stripper ® tips (150 um, 175 um e 200 um, MidAtlantic Inc., Cat# MXL3-150, MXL3-175, MXL3-200) • Lâminas ultra sharp splitting blades (Bioniche Animal Health USA©, Cat# ESE020) • Meio hESC (ver a seguir) Meio hESC • 1 X KO-DMEM (Knockout™-DMEM, Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 10829-018) • 20% KnockOut™ Serum Replacement (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 10828-028) • 1 X (ou 0,1 mM) aminoácidos não essenciais (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 11140-050) • 50 U/mL penicilina/ 50 µg/mL estreptomicina (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 15140-122) • 2 mM GlutaMAX™ Supplement (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 35050-061) • 0,055 mM 2-mercaptoetanol (Life Technologies™ – Gibco ®, Cat# 21985-023) • 8 ng/ml bFGF (EMD Millipore©, Cat# GF003) • Observação: O bFGF deve ser adicionado ao meio imediatamente antes do uso para evitar degradação. Preparar o meio sem bFGF e filtrar (filtro de 22 um). O meio hESC pode ser mantido em geladeira por até 10 dias. Antes de utilizar, aliquotar o volume que irá utilizar, aquecer a alíquota a 37 ºC e adicionar o bFGF imediatamente antes de colocar o meio de cultura em contato com as células.

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Procedimento 1) Preparar as placas contendo os MEF inativados no dia anterior ao plaqueamento do embrião (ou no máximo três dias antes), de acordo com o protocolo descrito acima. 2) No dia do processamento do embrião, retirar o meio antigo da placa contendo o MEF e lavar uma ou duas vezes com DPBS para retirar o FBS contido no meio MEF. Adicionar meio hESC à placa e deixar em incubadora até o momento de plaqueamento do embrião/ICM. 3) Verificar a qualidade do embrião. Para blastocistos de boa qualidade com fácil visualização da ICM e trofoectoderma, a ICM pode ser isolada. Blastocistos de qualidade não muito boa podem ser plaqueados inteiros após remoção da zona pelúcida (ZP). 4) Se o blastocisto já apresentar hatching espontâneo, transferi-lo diretamente para uma placa de cultura de 35 mm contendo meio de embrião (2 mL) para isolamento da ICM. Se o blastocisto não apresentar hatching espontâneo, a zona pelúcida deve ser retirada. A remoção mecânica da ZP deve ser realizada com o uso de lâminas (ultra sharp splitting blades) previamente tratadas com álcool 70%, secas ao ar e lavadas em meio de embrião. Para remoção da ZP, transferir o embrião para uma placa de poço central contendo meio de embrião. Visualizar o blastocisto sob estereomicroscópio para se certificar da localização da ZP de maneira que se possa fazer um corte com a lâmina no polo oposto à ICM. A ZP pode ser bastante elástica, o que pode dificultar sua abertura. Fazer uma pequena pressão sobre o embrião, de maneira delicada, e tentar fazer a abertura com a ponta da lâmina. Após a abertura, o embrião pode ser isolado da ZP com a própria lâmina ou com o auxílio de uma Stripper ® micropipetter (175 um ou 200 um) (Figura 16.4). Evitar cortar o plástico da placa. Neste momento, o blastocisto pode colapsar e tornar impossível a visualização do trofoectoderma. Nesse caso, deve ser plaqueado inteiro. 1) Caso seja possível visualizar a ICM após a remoção da ZP, a ICM pode ser mecanicamente separada do trofoectoderma adjacente com o auxílio da lâmina ou de uma Stripper ® micropipetter (150 um ou 175 um) e plaqueada já livre de trofoectoderma. O blastocisto livre da ZP apresenta uma menor resistência e elasticidade, sendo possível cortá-lo facilmente com o auxílio da lâmina. Após ter certeza da localização da ICM, deve-se fazer um corte bem próximo da ICM, deixando a menor quantidade possível de trofoectoderma. Nesse momento, o blastocisto pode ficar aderido à placa. Para não causar muito dano à ICM, deixar a placa parada por

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Figura 16.4 (A) Fotografia de blastocisto humano evidenciando as estruturas que o compõem; e (B) sequência de fotografias demonstrando o procedimento de remoção manual da zona pelúcida.

alguns minutos para que a ICM se solte, ou tentar soltá-la com o auxílio da Stripper ® micropipetter ou da própria lâmina. Importante: proteger a ICM o máximo possível. Caso isso não seja viável, dar preferência ao plaqueamento do embrião inteiro. 2) Com o auxílio de uma Stripper ® micropipetter, transferir o blastocisto inteiro livre de ZP ou ICM para gotas de 50 µL contendo meio hESC preaquecido para lavagem. Repetir a lavagem mais duas vezes (se transferir a ICM, tomar muito cuidado durante a lavagem ou transferir a ICM diretamente para a placa contendo MEF em meio hESC). 3) Transferir o embrião inteiro ou ICM para a placa contendo o MEF e meio hESC e incubar a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade. A placa não deve ser movida ou manipulada por 48 horas, a fim de permitir que o embrião/ ICM possa aderir à placa. 4) Após esse período, trocar o meio diariamente e acompanhar o desenvolvimento das hESC. O critério para escolha do momento certo para primeira

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passagem vai depender em parte se o embrião foi plaqueado inteiro ou se apenas a ICM foi plaqueada, assim como da quantidade de trofoectoderma presente. Se o embrião foi plaqueado inteiro ou com grande quantidade de trofoectoderma, deve-se observar o crescimento das células epiblásticas-like (ICM) e das células do trofoectoderma. Esses dois tipos de células apresentam morfologia diferente – enquanto as células derivadas ICM são menores, arredondadas e crescem bastante juntas, as células derivadas do trofoectoderma são maiores e tendem a crescer mais achatadas e de forma mais afastada umas das outras (Figura 16.5). Se as células derivadas da ICM estiverem isoladas das células do trofoectoderma, a primeira passagem pode ser realizada após 10 ou mais dias a partir do plaqueamento. Mas se as células estiverem comprimidas pelas células do trofoectoderma, a passagem deve ser realizada mais precocemente, 4 ou 5 dias após o plaqueamento do embrião. Geralmente, a passagem pode ser feita entre os dias 5 e 8 após o plaqueamento, no máximo 14 dias, e deve ser feita cortando-se as células derivadas da ICM de forma a evitar a passagem concomitante das células do trofoectoderma. Após as primeiras passagens, as colônias de hESC geralmente apresentam superfície mais homogênea e suas margens são mais facilmente identificadas (Figura 16.6). O protocolo de passagem de hESC está descrito a seguir.

16.7.2 Passagem manual e cultivo de hESC Durante o cultivo de hESC, vários parâmetros devem ser levados em consideração para a manutenção das células em estado indiferenciado. As células podem ser cultivadas sob uma camada de feeder (murino ou humano) e meio hESC, ou cultivadas sob suportes acelulares (matrizes proteicas) como por exemplo Matrigel™ (BD Biosciences™), Geltrex ® (Life Technologies™ – Gibco ®), vitronectina ou laminina. Nesses casos, o meio utilizado deve ser um meio comercial, definido, como, por exemplo, mTeSR1™ (StemCell Technologies™), TeSR™-E8™ ou Essential 8™ (StemCell Technologies™ ou Life Technologies™ – Gibco®) ou outro equivalente. Diversos métodos de passagem podem ser empregados durante o cultivo de hESC, incluindo métodos enzimáticos (colagenase, dispase, Accutase ®), químicos (baseados em EDTA), ou passagem manual. Descreveremos aqui o método de passagem manual para células cultivadas sobre feeders. O mesmo procedimento pode ser adaptado para células cultivadas sobre Matrigel™ ou Geltrex™, que constituem os tipos mais

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Figura 16.5 Derivação da linhagem de hESC BR-1. Imagem das células nos dias 5 (A), 8 (B), 10 (C) e 12 (D) após o plaqueamento do embrião. O embrião livre de zona pelúcida foi primeiramente plaqueado em placa revestida com Matrigel™. A partir do sexto dia foram acrescentadas MEF à cultura. Aumento de 100 X.

Figura 16.6 Colônias de hESC da linhagem BR-1 em MEF após a primeira (A) e terceira (B) passagens. Aumento de 100 X.

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utilizados de suporte acelular. Nesses casos, o tempo de passagem para hESC deve ser determinado pela densidade e tamanho estimado das colônias e é, geralmente, de cerca de 4 a 6 dias, sendo que algumas linhagens apresentam taxa de crescimento bastante rápida e outras um pouco mais lenta. No momento da passagem, as colônias devem conter aproximadamente 300 a 500 células, independentemente do número de colônias presentes na placa. Porém, a densidade das colônias na placa não deve nunca ser alta a ponto de que as colônias formem uma monocamada ou toquem nas colônias vizinhas. Colônias muito grandes – que ocupam todo o espaço da área do microscópio quando visualizadas em microscópio sob objetiva de 10 X (aumento total de 100 X) – ou placas apresentando densidades muito altas de colônias podem resultar em diferenciação celular espontânea. Material • Placas aderentes de 35 mm contendo MEF inativados já plaqueados • Meio hESC contendo bFGF (ver item 16.7.1) • Seringa de insulina com agulha estéril • Ponteiras plásticas para micropipeta P200 estéreis ou cell scraper Procedimento 1) Preparar as placas contendo MEF inativados no dia anterior à passagem (ou no máximo três dias antes), de acordo com o protocolo descrito anteriormente. 2) Antes da passagem manual, verificar se as colônias de hESC apresentam algum tipo de diferenciação. Em caso afirmativo, retirar as porções de colônia diferenciadas com o auxílio de uma ponteira de micropipeta sob visualização em lupa ou microscópio de luz invertido e dentro do fluxo laminar. 3) Retirar o meio de cultura antigo contendo os fragmentos diferenciados em suspensão e adicionar meio hESC fresco (2 mL de meio hESC por placa de 35 mm). 4) Sob a lupa ou microscópio de luz invertido, cortar as colônias com o auxílio de uma seringa de insulina, fazendo riscos na colônia do tipo “jogo da velha”. Um fator importante na passagem manual é o tamanho dos fragmentos. Eles não devem ser muito grandes nem muito pequenos. Os fragmentos devem conter cerca de 50 a 100 células, ou seja, numa colônia com aproximadamente 300 células, a colônia deve ser fragmentada em seis pedaços, cada um com aproximadamente 50 células.

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5) Com o auxílio do cell scraper ou ponteira de micropipeta, levantar gentilmente os fragmentos de colônias cortados para evitar que se quebrem ainda mais ou que as células se danifiquem. 6) Após todos os fragmentos de colônia estarem descolados da placa, transferir com o auxílio de uma pipeta sorológica de 2 mL os fragmentos de colônia em suspensão para placas de cultivo novas contendo MEF inativados e previamente lavadas com meio hESC (para remoção do meio MEF residual). Divida os fragmentos na proporção de 1:2 ou 1:3. Se uma placa estiver com densidade alta e colônias grandes, pode-se aumentar a taxa de divisão. Vale notar que densidades de plaqueamento muito altas ou muito baixas podem resultar em diferenciação das colônias. 7) Transferir as células para incubadora a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade. 8) Deixar as placas na incubadora por 48 horas antes de trocar o meio novamente, sem movê-las ou manipulá-las. Esse tempo é necessário para que os fragmentos possam aderir à nova placa e iniciar o crescimento. 9) Após 48 horas, remover o meio de cultura das placas, adicionar cuidadosamente meio hESC fresco preaquecido e retornar as placas à incubadora a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade. 10) A partir daí, trocar o meio de cultura diariamente até o momento da próxima passagem.

16.7.3 Congelamento e descongelamento de hESC As hESC são extremamente frágeis ao processo de congelamento e descongelamento, e por isso devem ser sempre manuseadas de forma delicada e com muito cuidado. Para o congelamento, o tamanho dos fragmentos deve ser duas vezes maior que o tamanho de passagem para subcultivo. Vale notar que a taxa de recuperação dos fragmentos de colônia congelados é muito baixa e, por isso, geralmente, os fragmentos obtidos a partir de uma a três placas de cultura (dependendo da densidade) devem ser congelados em um único criotubo e descongelados e plaqueados na mesma área de uma placa original.

16.7.3.1 Congelamento Material • Meio hESC (ver item 16.7.1)

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• Meio hESC de congelamento (ver a seguir) • Seringa de insulina com agulha estéril • Ponteiras plásticas para micropipeta P200 estéreis ou cell scraper • Tubo de centrífuga de 15 mL • Criotubo de 2 mL • Container para congelamento (como Mr. Frosty freezing container, Thermo-Scientific™ – Nalgene ®, Cat# 5100-001) • Isopropanol Meio de congelamento para hESC • 50% meio hESC • 40% FBS E S - Qualified (Life Technologies™ – Gibco ® , Cat# 16141-079) • 10% DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma-Aldrich®, Cat# D2650) Procedimento 1) Remover o meio de cultura da placa de 35 mm contendo as colônias a serem congeladas e adicionar à placa 2 mL de meio hESC fresco aquecido. 2) Sob a lupa ou microscópio de luz invertido, cortar as colônias com o auxílio de uma seringa de insulina, fazendo riscos na colônia do tipo “jogo da velha”. Os fragmentos de colônia devem conter cerca de 100 a 200 células). 3) Com o auxílio do cell scraper ou ponteira de micropipeta, levantar gentilmente os fragmentos de colônias cortados para evitar que se quebrem ainda mais ou que as células se danifiquem. 4) Após todos os fragmentos de colônia estarem descoladas da placa, transferir com o auxílio de uma pipeta sorológica de 2 mL o meio de cultura contendo os fragmentos de colônia em suspensão para um tubo de centrífuga e centrifugar a 230 g por 5 minutos à temperatura ambiente. 5) Remover o sobrenadante e ressuspender gentilmente os fragmentos de colônias em 1 mL de meio de congelamento para hESC gelado. 6) Transferir as células em meio de congelamento para hESC para um criotubo de 2 mL de capacidade, transferir o criotubo para um container tipo Mr. Frosty contendo isoprapanol e imediatamente transferir o container tipo Mr. Frosty para o freezer a -80 ºC. 7) Após pelo menos 24 horas a -80 ºC, os criotubos devem ser transferidos rapidamente para o nitrogênio líquido para estocagem.

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16.7.3.2 Descongelamento de hESC Material • Placas aderentes contendo MEF inativados já plaqueados • Meio hESC contendo bFGF (ver item 16.7.1) • Tubo de centrífuga de 15 mL Procedimento 1) Preparar as placas contendo MEF inativados no dia anterior ao descongelamento (ou no máximo três dias antes), de acordo com o protocolo descrito anteriormente. 2) Preparar um tubo de centrífuga de 15 mL contendo cerca de 8 mL de meio hESC preaquecido a 37 ºC. 3) Descongelar a alíquotas estocadas em nitrogênio líquido em banho-maria a 37 ºC por 2 a 3 minutos. 4) Transferir rapidamente o criotubo contendo os fragmentos de colônia descongelados para o fluxo laminar, adicionar cuidadosamente 1 mL de meio hESC preaquecido a 37 ºC ao criotubo e ressuspender gentilmente as células no criotubo pipetando apenas uma vez com o auxílio de pipeta sorológica de 2 mL. 5) Transferir o conteúdo do criotubo para o tubo de centrífuga contendo meio hESC e centrifugar os fragmentos de colônia a 130 g por 5 minutos. 6) Descartar o sobrenadante e ressuspender gentilmente os fragmentos de colônia em volume apropriado de meio hESC, pipetando lentamente para cima e para baixo por poucas vezes. 7) Transferir os fragmentos de colônia para placas contendo MEF inativados e previamente lavadas com meio hESC (para remoção do meio MEF residual) e incubar a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade por 48 horas, sem mexer ou manipular a placa, antes da primeira troca de meio de cultura. Esse tempo é necessário para que os fragmentos possam aderir à nova placa e iniciar o crescimento. 8) Após 48 horas, remover o meio de cultura das placas, adicionar cuidadosamente meio hESC fresco preaquecido e retornar as placas a incubadora a 37 ºC, 5% CO2 , 95% umidade. 9) A partir daí, trocar o meio de cultura diariamente até o momento da próxima passagem.

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Derivação de Novas Linhagens de Células-Tronco Embrionárias: Evolução da Metodologia

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CAPÍTULO

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PROTEÍNA PRION: BIOLOGIA MOLECULAR, ASPECTOS FISIOLÓGICOS E PATOLÓGICOS, DIAGNÓSTICO E INTERESSE SANITÁRIO Michele Christine Landemberger Bruno Lobão Soares Cleiton Fagundes Machado Norberto Cysne Coimbra 17.1 INTRODUÇÃO

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são um grupo de doenças neurodegenerativas fatais que afetam tanto animais quanto seres humanos (Figura 17.1), podendo apresentar-se na forma esporádica, com determinantes genéticos ou de caráter adquirido.

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A principal característica das EET é a formação de espongiose no encéfalo com intensa perda neuronial e formação de placas amiloides, levando a um quadro clínico de demência rapidamente progressiva 1. Essas mudanças estão associadas com o acúmulo de uma proteína resistente a proteases conhecidas como proteinaceous infections only (prion)2 (Figura 17.2). Pela primeira vez na história, uma proteína foi descrita como agente etiológico responsável por uma doença transmissível, e essa teoria foi recebida com grande ceticismo pela maior parte da comunidade científica, já que contradizia a ideia de que patógenos deveriam conter DNA ou RNA. No entanto, o conceito acabou prevalecendo e rendeu o Prêmio Nobel de Medicina de 1997 a Stanley B. Prusiner, autor da ideia2-5. Dentre as patologias causadas pelos prions que atingem os animais estão: o scrapie em ovinos, a doença crônica debilitante em cervídeos e a encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em gado. Dentre as formas humanas estão a síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS), a insônia familiar fatal (IFF) e a doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ), a doença humana causada por prions mais comum.

Figura 17.1 Formas mais comuns de encefalopatias espongiformes e respectivas espécies acometidas.

A EEB foi uma doença alarmante durante a década de 1990, atingindo grande parte do gado do Reino Unido e de outros países da Europa, e foi responsável pela transmissão da encefalopatia bovina para humanos causando a nova variante da doença de Creutzfeldt-Jakob (vDCJ).

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A mais surpreendente das descobertas da área de estudos com prion foi o fato de essa enfermidade nem sempre ser maléfica. De fato, todos os animais estudados, inclusive o homem, possuem um gene que codifica essa proteína. A forma normal da proteína, conhecida como proteína prion celular (sigla em inglês: PrPC), aparece predominantemente no sistema nervoso central, e tem um papel crucial na manutenção do funcionamento do neurônio. Por outro lado, a proteína que pode causar a doença ficou conhecida como proteína prion scrapie (PrPSc), já que scrapie foi a primeira doença causada por prion descrita.

17.2 FUNÇÕES FISIOLÓGICAS DE PrPC A proteína PrP C é sintetizada no retículo endoplasmático rugoso, encaminhada para o complexo de Golgi e transportada até a superfície celular6. No retículo endoplasmático rugoso, o peptídeo-sinal N-terminal (aminoácidos 1-22) e o segmento hidrofóbico C-terminal (aminoácidos 231-253) são clivados, seguindo-se a adição da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) 7. Além disso, duas cadeias de oligossacarídeos são adicionadas nos aminoácidos Asn 181 e Asn 197, e uma ponte de dissulfeto é formada entre os aminoácidos Cys 179 e Cys 2148,9. A molécula de PrPC madura (Figura 17.2) contém 207 aminoácidos, pode apresentar-se com duas, apenas uma ou mesmo nenhuma cadeia de oligossacarídeos associada e está ligada à face externa da membrana plasmática por uma âncora de GPI8. A região aminoterminal da molécula não apresenta estrutura definida (randon coil) e, durante a biossíntese e reciclagem da molécula, as PrPC que não estão na superfície celular concentram-se no complexo de Golgi e em endossomos de reciclagem10,11. A PrP C é abundantemente expressa no sistema nervoso central (SNC), mas também está presente em muitos outros tecidos não neurais, incluindo linfócitos sanguíneos, células gastroepiteliais, coração, rim e músculo 12-16. É uma proteína conservada entre as espécies, e sua similaridade está entre 85% a 97% entre os mamíferos 13 e, em comparação entre primatas e o homem, sua similaridade está entre 92,9% a 99,6%17. Atualmente, grande número de trabalhos vem demonstrando uma relação entre PrPC e Alzheimer. A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que tem como característica a presença de placas fibrilares amiloides extracelulares, composta por um peptídeo conhecido por β-amiloide. Estes trabalhos mostram que a proteína PrP C tem alta afinidade pelo peptídeo

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Figura 17.2 Aspectos moleculares da proteína PrPc. A porção N-terminal (resíduos 23-124) aparece como random coil (em amarelo) e a âncora de GPI em cinza. Estrutura secundária: hélice A (aA; resíduos 144-156; vermelho), hélice B (aB; resíduos 177-193; verde), hélice C (aC; resíduos 200-223; azul claro), folhas-b b1 (resíduos 128-131; vermelho) e b2 (resíduos 160-164; vermelho escuro). Cadeias laterais de histidina envolvidas com a ligação de cobre são mostradas em verde, na região randon coil. Resíduos de lisina e arginina representados em azul (Para visualizar as cores da imagem, acesse o site da Editora Blucher).

β-amiloide e, aparentemente, essa ligação é responsável por desencadear as sinalizações celulares responsáveis pela morte neuronial nessa doença18,19. A PrP C, como dito anteriormente, é uma proteína acoplada à âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI); portanto, uma questão fundamental é como ela poderia estar envolvida na transdução de sinais através da membrana plasmática. As proteínas ancoradas à GPI estão, preferencialmente, localizadas em domínios de membrana ricos em colesterol e esfingolipídios (conhecidos na literatura científica como “balsas” lipídicas) 20. Esses domínios de membrana contêm moléculas que recrutam proteínas especializadas em transdução de sinal21 (Figuras 17.2 e 17.3). Algumas proteínas transmembranas com atividades neurotróficas mostraram-se moduladas por PrP C, levando à ativação ou inibição de vias de

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sinalização intracelulares. Assim, é possível que a PrPC possa modular a atividade dessas proteínas tanto por interação direta quanto indireta. Dentre essas proteínas, temos a molécula de adesão neural (neural cell adhesion molecule – NCAM) 22, integrinas e vitronectina 23, receptores acoplados às proteínas G, como receptores metabotrópicos de glutamato do tipo I (mGluR1 e mGluR5)24-28 e receptores ligados a canais iônicos, como receptores nicotínicos de acetilcolina do tipo α7 (α7 nAChR)29-34. Além de tais evidências, há inúmeros trabalhos mostrando que a PrP C interage com algumas dezenas de proteínas encontradas em diferentes compartimentos celulares, como a proteína reguladora de liberação de vesículas sinápticas sinapsina Ib, a proteína de complexos pós-sinápticos PSD-95, a proteína antiapoptótica Bcl-2, o fator de transcrição nuclear Nrf2, a chaperonina Hsp60, o receptor de membrana plasmática LRP1, a proteína cinase CK2, a proteína ligante a receptor de fator de crescimento celular Gbr, glicosaminoglicanas, particularmente com sulfato de heparan, dentre outras35,36.

Figura 17.3 Plataforma multiproteica. A PrPC pode mediar sinalização intracelular por se ligar a um ligante e a uma proteína transmembrana envolvida com transdução de sinal.

Algumas ligações já bem caracterizadas de PrPC (Figura 17.3) são feitas com as proteínas laminina (Ln) e com a proteína do tipo 1 induzida por

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estresse (stress inducible protein 1 – STI1 em camundongo, Hsp70/Hsp90 organizing protein – Hop, seu homólogo humano)37,38. As lamininas compreendem uma família de macromoléculas multifuncionais e são os principais componentes não colagênicos de membranas basais. Elas regulam uma variedade de fenômenos biológicos, incluindo adesão, crescimento, morfologia e migração celular39. Também estão envolvidas em processos relacionados ao sistema nervoso, como o crescimento de processos neuroniais (neuritos), o direcionamento do cone de crescimento e a formação de sinapses40,41. Foi demonstrado que a interação PrPC-Ln induz diferenciação neuronial37 e consolidação da memória de longa duração42. Esses fenômenos podem ser explicados pelo fato dessa ligação estar envolvida com o desencadeamento de sinalizações intracelulares dependentes de cálcio. A interação PrPC-Ln promove um aumento na atividade da fosfolipase C (phospholipase C – PLC), via receptores metabotrópicos de glutamato, liberação de inositol 3-fosfato (InsP3) que se liga a receptores específicos no retículo endoplasmático, promovendo mobilização de estoques intracelulares de Ca +2 que podem, ainda, promover a entrada de Ca+2 extracelular através da ativação de canais na membrana do tipo SOCs (store operated calcium channels), levando à ativação de proteína cinase dependente de cálcio (PKC) e à fosforilação de cinases reguladas por sinalização extracelular do tipo 1 e 2 (ERK1/2) 24. As ERKs, que são encontradas no citoplasma, quando fosforiladas, podem sofrer uma rápida translocação para o núcleo, onde desempenham uma função essencial na regulação da transcrição, da replicação de DNA, remodelagem da cromatina43,44 etc. Já a interação entre PrPC e STI1 induz sinais neuroprotetores, inibindo a morte celular programada (apoptose) e também induzindo a diferenciação neuronial38,45,46. Esses fenótipos parecem ocorrer devido ao desencadeamento de sinalizações intracelulares dependentes de cálcio e de Adenosina Monofosfato cíclica (AMPc) 46. O aumento intracelular de Ca 2+ parece ocorrer através de ativação de canais iônicos identificados como receptores nicotínicos de acetilcolina do tipo α7 (α7 nAChR)29. Já o aumento de AMPc no citoplasma pode ativar uma cascata de reações que resulta no aumento da atividade de enzimas, tais como a proteína cinase dependente de adenosina monofosfato cíclica (protein kinase A – PKA) o que, em última instância, pode levar à ativação de fatores de regulação gênica. Assim, o AMPc está relacionado com o controle da proliferação em diversos tipos celulares 47, além de diversos outros processos biológicos, desde a resistência bacteriana,

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Figura 17.4 Ligantes da proteína prion-celular. A sequência de tradução da proteína prion está apresentada na forma de um bastão, com os domínios mais importantes mostrados em cores (números de resíduos de aminoácido relacionados à proteína prion de camundongo). SP: peptídeo sinalizador. OR: domínio octapeptídeo de repetição. HC: núcleo hidrofóbico. H1, H2, H3: domínios alfa-hélice. GSP: peptídeo sinalizador de ancoragem a GPI. Cada local de ligação molecular é indicado junto com o trecho do resíduo de aminoácido que contém o domínio de ligação na proteína prion de camundongos. GAC: Glicosaminoglicanos. HS: sulfato de heparan. LRP1: receptor de lipoproteína de baixa densidade 1. LRP/LR: receptor de laminina. SynIb: Sinapsina Ib. APLP1: proteína 1 similar ao precursor amiloide. Nrf2: fator de transcrição. GASP: receptor associado à proteína G. HnRNP: ribonucleoproteína nuclear heterogênea. AldC: aldolase c/zebrina. Figura reproduzida (com permissão) de R. Linden et al, Physiology of the Prion Protein, Physiological Reviews, 88: 673-728, 2008.

a percepção de odor, o aprendizado, a contração e o relaxamento do músculo cardíaco e a liberação de certos hormônios48 (ver Figuras 17.4 e 17.5). Além disso, a PrPC também tem demonstrado possuir um possível papel na proteção celular contra o estresse oxidativo 49. Há, também, evidências de que a PrPC liga-se a íons de cobre50. O cobre é um importante cofator para várias enzimas. Entretanto, como o cobre é altamente reativo, existem vários mecanismos celulares para a sua absorção e transporte51. Quando isso não ocorre de maneira adequada, ele tem sido associado a patologias, incluindo várias doenças neurodegenerativas52.

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O acúmulo de PrPSc pode resultar em neurodegeneração53 pela formação de placas amiloides que podem causar lesão estrutural nos neurônios. Mas, a perda de função biológica de PrPC, quando convertido a PrPSc, pode levar a um possível mecanismo de alteração de sinalização intracelular que contribuiria para o desenvolvimento da doença. Como vimos anteriormente, numerosos estudos têm proposto várias funções para a PrPC, incluindo papel em neuroproteção, inibição de apoptose, proteção contra estresse oxidativo, sinalização celular, adesão, mielinização, tráfego de íons e envolvimento na atividade sináptica53-55. Apesar dessas evidências, ainda há um debate na literatura quanto à função biológia da PrPC, principalmente pela falta de fenótipos patológicos que sejam incompatíveis com a vida em camundongos deficientes em PrPC. Os fenótipos encontrados nesses animais foram descritos como alterações na transmissão neuronial e atividade elétrica, alterações na neurogênese, no ritmo circadiano e aumento da sensibilidade à isquemia, hipóxia e convulsões55, 56, além de alterações na atenção defensiva, medo inato e ansiedade57, 58. Uma explicação para estes fenótipos pouco letais pode ser a existência de mecanismos compensatórios desempenhados por proteínas com funções redundantes em relação à PrPC59. Alguns mecanismos compensatórios já foram descritos nas vias de sinalização em células provenientes destes animais, dentre os quais, hiperativação da via de ERK45, 46, 60 e maior atividade da integrina23 αvβ3. Classicamente, as integrinas são conhecidas por constituírem uma grande família de ligantes na superfície celular e estão envolvidas em diversas atividades biológicas, como proliferação e sobrevida celular61. É interessante ressaltar que os fenótipos mais relevantes relacionados a alterações em PrPC encontram-se em camundongos-PrPC-deletados onde a expressão de moléculas de PrPC deficientes em domínios específicos, por meio dos quais a PrPC liga-se com vários daqueles ligantes descritos anteriormente, foi reconstituída. Esses animais desenvolvem doenças neurodegenerativas severas logo nas primeiras semanas de vida 55. Nesse sistema, não haveria mecanismos compensatórios para PrP C, o que levaria esses animais a apresentarem fenótipos drásticos por falta de sinalizações celulares dependentes de PrPC. Com base em todos esses dados, fica claro que, além da participação da partícula infecciosa PrPSc, a proteína normal PrPC pode participar de outros fenômenos patológicos ligados a outras doenças neurodegenerativas, por exemplo, a doença de Alzheimer e a fenótipos importantes para a manutenção da vida da célula como proteína organizadora de plataformas de sinalização intracelular responsáveis por sobrevida de divisão celular.

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Figura 17.5 Rotas de sinalização intracelular acionadas pela proteína prion celular. Interações entre PrPC/STI1 e PrPC/peptídeo γ1 de laminina. As setas vermelhas indicam a sinalização disparada pela interação entre PrPC e STI1, enquanto as setas pretas indicam a sinalização disparada pela interação entre PrPC e peptídeo γ1 de laminina. Pep. γ1 Ln = peptídeo γ1 de laminina; mGluR = receptor metabotrópico de glutamato; α7nAChR = receptor nicotínico de acetilcolina do tipo α7; ↑ Ca2+ci = aumento da concentração de cálcio citoplasmático (Para visualizar as cores da imagem, acesse o site da Editora Blucher).

17.3 FISIOPATOLOGIA DAS DOENÇAS PRIÔNICAS A ideia de que uma proteína pudesse ser o agente responsável por causar uma doença transmissível causou grande polêmica na comunidade científica, para a qual a replicação de um organismo dependia necessariamente de ácidos nucleicos. Entretanto, os prions apresentavam características físicoquímicas incomuns aos patógenos até então conhecidos. Vários métodos utilizados para destruir patógenos eram ineficientes com os prions, que são altamente resistentes à alta concentração de sais e a alterações de pH 3,4,62. Além disso, os prions são resistentes a processos convencionais de inativação de vírus, tais como radiação ultravioleta e ação de nucleases63. Entretanto, métodos utilizados para desnaturar proteínas, como altas temperaturas, ureia e detergentes catiônicos, como o dodecil sulfato de sódio

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(sodium dodecyl sulfate – SDS), foram eficientes tanto na solubilização, quanto na diminuição da capacidade infectante dessas partículas64. A partir daí, Prusiner e seus colaboradores demonstraram que uma proteína era capaz de se replicar e causar doença 65,66. Além disso, sendo esse agente uma proteína, a sua forma estrutural pôde ser estabelecida e um código genético foi a ela associado67,68. Essa proteína foi nomeada prion (do inglês proteinaceous infectious particle, ou PrP, de prion protein). Tal proteína, em sua forma tridimensional típica, não era encontrada em cérebros de animais saudáveis. No entanto, descobriu-se que a sequência de aminoácidos da PrP era a mesma que a de uma proteína encontrada em ambos os tecidos de animais infectados como de não infectados. Estavam sendo descobertas, àquela altura, duas formas de apresentação estrutural tridimensional de uma mesma proteína, uma com uma característica fisiológica e outra, bastante similar, com uma conotação patológica69. A proteína com forma patológica, encontrada com exclusividade nos animais infectados, foi chamada de PrP Sc (o sufixo Sc vem de scrapie, uma doença típica em ovinos). Já a forma não infecciosa, encontrada tanto em animais infectados como saudáveis, foi nomeada PrPC (o sufixo C indica celular, remetendo à forma fisiológica). A principal evidência da participação de PrPC no processo infeccioso de encefalopatias espongiformes transmissíveis surgiu com a construção de um camundongo transgênico, o qual teve o gene de PrPC (Prnp) removido70. Esse animal mostrou-se completamente resistente à infecção por prions, o que pôde ser revertido quando o gene foi reintroduzido. A PrP C e a partícula infecciosa PrP Sc têm a mesma composição de aminoácidos, embora a composição estrutural de PrP C apresente cerca de 40% de conformação em α-hélice, com menos do que 10% de conformação em folhas β. Em contraste, a PrP Sc mostra cerca de 50% da sua estrutura como folhas β. Por isso, propôs-se que o ganho de infectividade é uma consequência da modificação conformacional69 de PrPC em PrPSc. Acredita-se que a PrP Sc se propague pela ligação à PrPC e à conversão da última em uma nova molécula de PrP Sc por um processo que não está completamente compreendido69,71. Esta última estrutura é altamente amiloidogênica, ou seja, sua insolubilidade leva à agregação dessas proteínas, sendo a deposição de PrPSc, a vacuolização envolvendo o soma e os processos neuroniais (neuritos) e a consequente morte neuronial observações típicas em análises histopatológicas de tecido cerebral afetado com encefalopatia espongiforme transmissível (EET)72,73.

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Em termos de fisiopatologia, acredita-se que o agente siga a rota de acumulação e replicação inicial nos linfonodos, provavelmente por transporte retrógrado de fibras nervosas de vísceras até que seja atingido o tecido neural74. No Brasil e no mundo, a forma mais crítica de afecção em animais, do ponto de vista da saúde publica, é a encefalopatia espongiforme bovina, ou EEB. Seu período de incubação (ausência de sintomas clínicos) pode levar de dois a oito anos. Estima-se que a EEB foi desenvolvida inicialmente na década de 1970 por uso de rações de farinha de carne ou de osso de bovinos e ovinos, previamente contaminadas pela proteína patológica, em uma forma esporádica que não havia sido até então percebida pela comunidade científica. Isso se deve ao fato de que a ingestão de menos de 1 g de um cérebro contaminado já é considerada suficiente para desenvolver as encefalopatias. Em geral, sinais típicos da infecção por PrP Sc ocorrem com uma degeneração progressiva do tecido nervoso, com vacúolos em forma de esponja (de onde surgiu o termo “espongiforme”). Os principais sinais em animais são agressividade, perda de equilíbrio e tônus muscular, hiperssensibilidade à luz e ao som, perda de peso e um considerável decréscimo na produção de leite75. As pesquisas iniciais envolvendo as proteínas prions, bem como a maioria das pesquisas atuais, eram (e têm sido) voltadas à forma com que as proteínas prions tornam-se patológicas, à forma como elas se transmitem, com que se propagam pelo organismo e, principalmente, como a proteína anômala causa patologias neurodegenerativas. Apesar do avanço notável no estudo das patologias causadas por formas mutadas da proteína prion celular, nem tudo está esclarecido sobre o seu papel fisiológico, e ainda existem diversas lacunas no conhecimento sobre alterações do sistema prion nas mais diversas doenças neurológicas que não aquelas associadas às formas patológicas da proteína prion.

17.4 CONTROLE DAS INFECÇÕES PRIÔNICAS EM REBANHOS NO BRASIL: ASPECTOS LEGAIS, VETERINÁRIOS E AGROPECUÁRIOS 17.4.1 Aspectos legais A regulamentação do controle de doenças priônicas no Brasil, no âmbito agropecuário, deu-se a partir de 1997, com o Programa Nacional

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de Prevenção e Controle das Encefalopatias Espongiformes transmissíveis (Portaria número 516, de 9 de dezembro de 199776). A partir daí, os detalhamentos do controle das EE vêm sendo promulgados no país através de portarias, instruções normativas e guias veterinários emitidos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). A Portaria número 516 declara o Brasil livre de encefalopatia espongiforme bovina, e institui a EE bovina e o scrapie como doenças de notificação compulsória para a autoridade de defesa sanitária animal da jurisdição, associada ao sistema de vigilância da raiva. A partir daí, também o controle de entrada de animais, produtos e subprodutos de origem animal no Brasil passa a estabelecer critérios de entrada e de exame desses itens advindos de outros países com foco nas EET, com base no capítulo 3.2.13 do código zoossanitário internacional. Atualmente, considera-se como de risco países que tenham notificado caso autóctone ou os países com risco indeterminado ou desconhecido para as EET. Tais países não podem, atualmente, importar para o Brasil ruminantes ou seus produtos que sejam destinados à alimentação animal ou ao uso veterinário (Instrução Normativa número 49, de setembro de 2008). Na Portaria número 519 (1997), também se tornou instituído que as rações de ruminantes não poderão conter quaisquer fontes de proteínas de outros ruminantes, salvo as proteínas lácteas. Houve, também, publicações do MAPA especificamente sobre procedimentos relativos à identificação e condução de casos de scrapie. A Instrução Normativa número 15, de abril de 2008 77, tende a caracterizar o scrapie como um diagnóstico clínico de exclusão, após o descarte da possibilidade de outras doenças, como cenurose, raiva, pseudorraiva, intoxicação etc. Essa instrução considera o diagnóstico por meio de resultado positivo à prova de imuno-histoquímica em amostras de tecido nervoso ou linfoide, ou por meio de outras técnicas aprovadas pelo MAPA. Recomenda-se que as amostras suspeitas sejam encaminhadas aos laboratórios de diagnóstico das EE, pertencentes à Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários do Sistema Unificado de Atenção à Sanidade Agropecuária. A instrução prevê que, em caso de diagnóstico positivo de EE, o estabelecimento pode ser interditado pelo Ministério e, posteriormente, desinterditado, após terem sido cumpridas as ações estabelecidas pelo órgão competente do governo.

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17.4.2 Sinais clínicos dos animais É essencial que o exame clínico e todas as fases da conduta em caso de suspeita de EE sejam conduzidos por um médico veterinário. O Ministério da Saúde dispõe de guias de conduta e de instruções normativas específicas que ajudam a conduzir o exame clínico em caso de suspeita de EE em bovinos e pequenos ruminantes75,77,78.

17.4.2.1 Bovinos A média de incubação da EEB é de cinco anos, mas existem registros de casos de até oito anos para o aparecimento de sinais clínicos. Após o início dos sintomas, a doença evolui para a morte em um intervalo de semanas a seis meses, havendo nesse ínterim perdas de peso e na produção de leite. Devido à degeneração do SNC, os bovinos podem apresentar, principalmente, alterações de temperamento, sensibilidade e de locomoção. Distúrbios no comportamento incluem agressividade, postura anormal, descoordenação e dificuldade em levantar, bem como ranger de dentes e movimentos nervosos das orelhas. Os animais acometidos pela doença priônica também podem reagir exageradamente ao toque, ao som e à luz.

17.4.2.2 Caprinos e ovinos Os caprinos e ovinos (pequenos ruminantes) podem apresentar sinais e sintomas quando da infecção por prions patológicos, tais como: automutilação, cegueira, decúbito prolongado, descoordenação motora, prurido intenso, perda de peso acentuada, perda de lã ou pelos, ranger de dentes, movimentação lateral da cabeça, reflexo de mordiscar ou tremor.

17.4.3 Tratamento e controle Vale ressaltar que não há, atualmente, um tratamento para impedir a progressão da doença, ou qualquer tipo de vacinas para animais. As medidas profiláticas são aquelas recomendadas pelo MAPA, que incluem restrição de importação de animais de países de risco, assim como a suspensão de proteína animal na alimentação de ruminantes. Além disso, é recomendável

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a remoção das carcaças de animais que eventualmente venham a óbito no campo.

17.4.4 Evidências histopatológicas As evidências histopatológicas das EE constituem lesões extremamente específicas. Tratam-se de lesões degenerativas em que há morte celular abundante e, bilateralmente, abundante presença de vacúolos. Esses vacúolos lembram, grosso modo, o aspecto de esponja, de onde vem o nome de encefalites espongiformes. Localizam-se, preferencialmente, no tronco encefálico. Diagnósticos diferenciais se dão com achados semelhantes, como vacúolos no citoplasma de neurônios mesencefálicos, encontrados, normalmente, na maior parte dos encéfalos de bovinos, bem como inflamações purulentas não específicas.

17.4.5 Diagnóstico Ainda não existe diagnóstico para as EET em animais vivos. Somente após a eutanásia dos animais e posterior remoção de tecido nervoso ou linfático pode-se proceder ao diagnóstico. As duas formas possíveis de diagnóstico são a detecção de encefalite espongiforme na histopatologia do SNC, ou a detecção da proteína priônica infecciosa (PrPSc) por imuno-histoquímica ou western-blotting. O procedimento padrão no Brasil é o exame histopatológico do tecido nervoso acometido, seguido de análise imuno-histoquímica do mesmo75.

17.4.6 Conduta em caso de suspeita de EE Para Bovinos, tais condutas estão detalhadas na descrição do documento intitulado: “Procedimentos para Diagnóstico das Doenças do Sistema Nervoso Central de Bovinos”, emitido pelo MAPA75. A conduta para pequenos ruminantes, em caso de suspeita ou ocorrência de paraplexia enzoótica dos ovinos (scrapie) é detalhada na Instrução Normativa número 15 (de abril de 2008), e é semelhante à conduta adotada para os grandes ruminantes. Através desses critérios, já foram realizados mais de 25 mil exames laboratoriais no país.

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Em resumo, a conduta em caso de suspeita por EE poderá constar das seguintes etapas75,78: 1) Exame clínico dos animais acometidos e condução dos procedimentos. Devem ser realizados por médico veterinário responsável. 2) Suspeita diagnóstica. Geralmente, por exclusão de outras patologias mais frequentes com sintomas neurológicos. 3) Necrópsia dos animais suspeitos. Efetuada com equipamentos de proteção individual, com relatório de necrópsia. 4) Preparo dos tecidos nervosos e linfáticos. Deve ser realizado com o uso de equipamentos de proteção individual adequados, como luvas, óculos, máscara etc. O material deve ser acondicionado em solução de formol a 10% (ou formol tamponado a 10%), cujo volume deve ser dez vezes superior ao da amostra. O material deve ser enviado em vasilhame não deformável de plástico duro e hermeticamente fechado. 5) Envio do material às autoridades competentes governamentais. Juntamente com o envio, o responsável enviará os documentos anexos preenchidos das instruções normativas pertinentes mencionadas anteriormente (para bovinos ou pequenos ruminantes), como também devidamente preenchido o Formulário Único de Requisição de Exame para Síndrome Neurológica, que pode ser encontrado no Anexo II do Manual Técnico para Controle da Raiva em Herbívoros, publicado pelo MAPA em 200979. Paralelamente, no verso do formulário, deverão ser disponibilizadas informações referentes ao remetente da amostra, à propriedade e ao animal/ rebanho suspeito de contaminação, além de dados da amostra e outras informações julgadas relevantes (também descritos no manual). Os locais de envio são os laboratórios do Sistema Unificado de Atenção à Sanidade Agropecuária. Os contatos dos principais laboratórios por região do país estão listados no site do MAPA*. 6) Análise da amostra pelo órgão competente. Em caso de confirmação do diagnóstico, algumas atitudes adotadas pelos órgãos competentes são: visita à propriedade, interdição temporária do estabelecimento, aplicação do questionário de investigação epidemiológica, colheita de amostras de animais suspeitos, e separação dos mesmos para observação, bem como sacrifício sanitário (incineração de carcaças e/ou enterramento) de animais contaminados ou suspeitos de contaminação, sob supervisão do órgão competente. O órgão brasileiro também fica responsável pela comunicação do fato à Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), *

Ver <http://www.agricultura.gov.br/animal/laboratorios>.

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como também de solicitar exames complementares a órgãos internacionais, como a Animal Health and Veterinary Laboratories Agency, na Inglaterra. Vale destacar que, com uma pequena probabilidade, quando da realização desses exames, pode também ser diagnosticada alguma ocorrência não clássica do agente das encefalites espongiformes, que pode ocorrer por mutação ou polimorfismo, espontaneamente em algum animal, e não necessariamente por contaminação. No caso da ocorrência destes casos atípicos, o procedimento também consiste em eutanásia e eliminação sanitária da carcaça, dentre outros procedimentos indicados pelo assessor do Ministério que elabora o parecer circunstanciado.

17.5 ASPECTOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS DAS DOENÇAS PRIÔNICAS EM HUMANOS 17.5.1 Formas humanas das doenças por prions As formas humanas das doenças priônicas conhecidas na atualidade encontram-se descritas a seguir: Esporádica: a DCJ esporádica (DCJe) é a forma mais comum das doenças por prions e é responsável por 85% de todos os casos. Na DCJe não existe nenhuma evidência de contaminação iatrogênica e ausência de mutações que caracterizariam a forma hereditária da doença. Não se conhece até hoje o mecanismo pelo qual essas doenças se iniciam. Apesar da não haver evidências que comprovem o caráter infeccioso da forma esporádica, não se recomenda doação de córnea ou transfusão sanguínea em casos suspeitos de DCJe. Hereditária/familial: a forma hereditária das doenças por prions é bastante rara e representa apenas 10% de todos os casos das doenças em todo o mundo. Ocorre em decorrência de mutações no gene que codifica a proteína prion celular e sua penetrância nos portadores é em geral maior que 90%. Entre as doenças familiares, encontram-se a DCJ familial, que ocorre principalmente pela mutação no códon 200 (E200K), e a síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker familial (GSSf), que ocorre, principalmente, pela mutação no códon 102 (P102L). Há, ainda, a insônia familial fatal (IFF),

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que ocorre por uma mutação no códon 178 (D178N), associada ao polimorfismo metionina no códon 129. Essa é mais rara das doenças por prions já descritas, havendo apenas cem pessoas afetadas em quarenta famílias descritas em todo o mundo80, além de um caso recentemente descrito no Brasil81. Iatrogênica: ocorre como consequência de procedimentos cirúrgicos (transplantes de dura-mater e córnea) ou através do uso de instrumentos neurocirúrgicos ou eletrodos intracerebrais contaminados. Foram descritos, ainda, alguns casos relacionados à transfusão sanguínea. Kuru: esta foi a primeira doença descrita como encefalopatia espongiforme transmissível82, e surgiu em consequência de rituais canibalísticos em tribos de Papua Nova Guiné. Sua principal característica são tremores de cabeça e membros e ataxia como consequência de comprometimento cerebelar. Com a proibição de rituais canibalísticos, a incidência da doença caiu consideravelmente e se considera a doença atualmente extinta. Variante DCJ: a outra forma da doença está associada ao consumo de carne e subprodutos de bovinos contaminados com prions que causam a encefalopatia espongiforme bovina (doença da “vaca louca”) e é conhecida como variante da doença de Creutzfeldt-Jakob (vDCJ). Os primeiros casos surgiram em 1996 no Reino Unido e, diferentemente da forma tradicional de DCJ, ela acomete predominantemente pessoas jovens, abaixo dos 30 anos.

17.5.2 Diagnóstico O diagnóstico das doenças causadas por prion em seres humanos é baseado principalmente na avaliação clínica de sinais e sintomas. Os principais sinais clínicos que podem sugerir uma EET são: demência rapidamente progressiva, mioclonias e outros sinais neurológicos, tais como distúrbios visuais e ataxia. Exames de neuroimagem e marcadores liquóricos têm sido utilizados para aumentar a acurácia da suspeita diagnóstica dessas das EET. A identificação das mutações associadas a doenças humanas causadas por proteína prion patológica feita pelo sequenciamento do gene PRNP possibilita a confirmação da forma familiar. Quando existe a suspeita de DCJ, a primeira preocupação consiste em descartar outras formas possíveis e tratáveis de demência, tais como encefalites e meningites crônicas.

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No entanto, não há diagnóstico confirmatório para as doenças esporádicas e iatrogênicas em vida. O diagnóstico só pode ser confirmado por biópsia ou necrópsia. As biópsias cerebrais em pacientes vivos não são eticamente recomendadas, já que não há tratamento eficaz para a doença, e esse procedimento só é realizado quando existem outras hipóteses diagnósticas tratáveis. A proteína alterada, PrPSc, é o marcador mais importante nas TSE, mas a sua detecção no soro é complicada pela sua similaridade com a proteína fisiológica (PrP c). Muitos estudos, ainda sem sucesso, têm sido realizados para tentar detectar a PrPsc fora do cérebro e desenvolver um método diagnóstico menos invasivo. Seguem-se, agora, em descrição individualizada, os principais métodos de diagnóstico de doenças priônicas utilizados no Brasil e no mundo. Torna-se sempre interessante utilizar mais de um método comprobatório, de preferência aliando-se métodos laboratoriais com métodos mais próximos à clínica neurológica, tais como anamnese clínica e eletroencefalograma (EEG).

17.5.2.1 Exame genético de PRNP O sequenciamento de DNA do gene que codifica PrPc (PRNP) é realizado em todos os pacientes suspeitos de EET para a detecção das formas hereditárias das doenças de prions que são causadas por mutações pontuais nesse gene. Já foram descritas mais de cinquenta mutações patogênicas para o gene PRNP, sendo as mais comuns as mutações no códon 200 (E200K que causa DCJ) e no códon 102 (P102L que leva à GSS). Quando a mutação é detectada em um paciente, a doença por prion hereditária é confirmada e nenhum outro exame é necessário. No entanto, a ausência de mutação apenas descarta a possibilidade de doença genética por prions, mas não descarta a hipótese de doença esporádica ou iatrogênica, e o paciente deve continuar sendo investigado83. Há, ainda, a descrição de polimorfismos no gene que codifica a PrPc. Foram descritos doze polimorfismos onde não há a substituição de aminoácido (polimorfismos silenciosos) e quatro que alteram a sequência de aminoácidos. Destes, o mais importante é o códon 129, com implicações clínicas importantes (Figura 17.6). Pacientes homozigotos para metionina nesse códon apresentam um fator de risco para o desenvolvimento da doença. Os pacientes com doença esporádica possuem metionina no códon 129 em sua maioria. Além disso, todos os indivíduos que desenvolveram a nova variante eram homozigotos para metionina no códon 129, indicando que a valina nesse códon representa um fator protetor para

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Figura 17.6 Eletroesferograma representativo do gene PRNP. Na parte de cima do painel pode-se verificar as 3 formas polimórficas de PRNP no códon 129, sendo que 50% da população caucasiana tem o códon 129 em heterozigose (M129V), 40% apresenta metionina em homozigose (M129M) e 10% da população normal apresenta valina em homozigose (V129V). Na parte de baixo da figura estão representadas duas mutações patogênicas: a P102L, que causa GSS familial, e a E200K, que leva ao acometimento de DCJ familial.

o desenvolvimento da doença. Além disso, esse polimorfismo tem sido relacionado a apresentações clínicas, bioquímicas e neuropatológicas diferentes nos indivíduos com doenças por prions84.

17.5.2.2 Detecção de 14.3.3 As proteínas 14.3.3 são uma família de moléculas reguladoras conservadas expressas em todas as células eucarióticas. As proteínas 14.3.3 têm a capacidade de se ligarem funcionalmente a uma multiplicidade de proteínas de sinalização, incluindo cinases, fosfatases, e receptores transmembranas. Mais de duzentas proteínas de sinalização têm sido relatadas como ligantes da 14.3.3. O nome 14.3.3 refere-se à eluição particular e ao padrão de migração destas proteínas por cromatografia em DEAE-celulose e eletroforese em gel de

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amido. As proteínas 14.3.3 eluem na fração 14 do homogenado de cérebro bovino e foram encontradas nas posições 3.3 de eletroforese subsequente85. A proteína 14.3.3 pertence a um grupo de polipetídeos que está alterado no liquor (LCR) em várias condições patológicas, incluindo processos inflamatórios, lesões, convulsões, entre outras, e pode, ainda, ser um marcador importante de destruição rápida de neurônios, o que é característico de desordens neurológicas 86. O uso da 14.3.3 no diagnóstico das doenças por prions87 foi sugerido pela primeira vez em 1996 e, apesar de serem bastante questionadas a especificidade e a sensibilidade desta ferramenta diagnóstica, a OMS coloca a detecção da proteína 14.3.3 como exame recomendado no diagnóstico de DCJ, aumentando o grau de possibilidade quando essa proteína está presente no liquor. Na DCJ esporádica, a proteína 14.3.3 tem 90% de especificidade e sensibilidade. Está presente, ainda, em casos familiares da DCJ; porém, em geral, está ausente em pacientes com IFF e GSS84. Outras análises bioquímicas têm sido descritas para o diagnóstico da DCJ, como a proteína TAU (proteínas que estabilizam os microtúbulos), a enolase neuroespecífica (neuronal specific enolase – NSE), que é uma enzima glicolítica, cuja forma neuroespecífica é encontrada no tecido nervoso e em células do sistema neuroendócrino (detectam-se concentrações séricas elevadas em pacientes com carcinoma medular da tireoide, tumor endócrino pancreático, feocromocitoma, neuroblastoma e carcinoma pulmonar de pequenas células), e proteínas S100 (úteis como marcadores para certos tumores e na diferenciação da epiderme). As proteínas S100 podem ser encontradas em melanomas, em 50% dos tumores da bainha dos nervos periféricos, em células de Schwann, em células do estroma de paraganglioma, histiocitoma e em sarcomas de células claras. Além disso, as proteínas S100 são marcadores para doenças inflamatórias e podem mediar a inflamação e atuar como agentes antimicrobianos88. Porém, elas não estão incorporadas ao diagnóstico dessa doença, sendo apenas usadas de forma diferencial para descartar outras patologias.

17.5.2.3 Eletroencefalograma (EEG) O eletroencefalograma (EEG) é um exame não invasivo que auxilia no diagnóstico das EET. Nos casos de DCJ esporádicos, 70% apresentam atividade periódica curta e, no início, podem não ser observadas mudanças, as quais surgem com o curso avançado da doença. Eletroencefalogramas devem

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ser feitos durante a evolução do quadro até ser obtido o padrão característico, ou para descartar outras causas que geram esse padrão89.

17.5.2.4 Imagem por ressonância magnética (IRM) Recentemente incorporada ao diagnóstico dessas doenças recomendado pela OMS, a IRM é fundamental no diagnóstico na DCJ e pode auxiliar principalmente em fases iniciais da doença, quando o padrão de EEG apresentase normal ou com anormalidades inespecíficas. A IRM apresenta hipersinal característico em 80% dos pacientes já na fase inicial de sintomatologia da doença. Com a ressonância magnética, pode-se observar atrofia cerebral, o que pode aumentar ao longo da doença. Na variante, o exame mostra a distribuição característica de hiperintensidade simétrica do núcleo pulvinar do tálamo. Essas alterações denominadas de sinal pulvinar têm demonstrado alta sensibilidade e são consideradas como o melhor teste diagnóstico não invasivo da vDCJ. Uma amostra de encéfalo alterado pela doença priônica, visto em secções transversais, é mostrada na Figura 17.7.

17.5.2.5 Análise neuropatológica O exame neuropatológico realizado pela necrópsia é a única maneira de confirmar a suspeita diagnóstica de DCJ esporádica ou variante. Por ser um exame invasivo, poder oferecer riscos aos pacientes e não trazer nenhum benefício adicional, a biópsia cerebral não é recomendada para os casos onde a única suspeita diagnóstica seja DCJ. A biópsia só deve ser realizada se houver outra causa suspeita tratável. As principais características das doenças por prion são a formação espongiforme, perda neuronial e a gliose, sendo a característica espongiose a mais importante, já que é a única presente apenas nas doenças por prions. Além disso, a característica fundamental para a confirmação das doenças por prions é o depósito de PrPSc no SNC. O tipo de depósito de PrPSc varia com a doença. Na forma iatrogênica, observam-se alterações espongiformes, vacúolos redondos e pequenos, astrocitose e uma importante perda neuronial. Na DCJ, ocorre a formação de placas unicêntricas e depósitos sinápticos de PrP Sc. Já na GSS, ocorre a formação de placas multicêntricas e degeneração talâmica. Na vDCJ, ocorre um padrão bastante específico de depósito de PrPSc. Esses depósitos são compostos de

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Figura 17.7 Imagem de ressonância magnética de paciente com doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ), a doença humana mais comum causada por prions. Notar a hiperintensidade de sinal no tálamo principalmente no núcleo dorsomedial e no pulvinar (B), em A. Notar, também, alterações predominantemente subcorticais (C e D), alterações tanto corticais como subcorticais (E-F) e predominantemente corticais (G e H). Figura reproduzida com permissão de P. Vitali, et al.90

uma grande quantidade de placas fibrilares de PrPSc circundadas por um halo de vacúolos espongiformes, conhecidos como placa florida89,91,92.

17.5.3 Classificação das doenças de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), as DCJ são classificadas de acordo com exames clínicos, laboratoriais e de imagem de acordo com os seguintes critérios: 1) Possível DCJ: • Curso da doença menor que dois anos. • Demência rapidamente progressiva.

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• Pelo menos dois dos seguintes sintomas clínicos: mioclonias, distúrbios visuais ou cerebelares, mutismo acinético e disfunções piramidais e extrapiramidais. 2) Provável DCJ: • Curso da doença menor que dois anos. • Demência rapidamente progressiva. • Pelo menos dois dos seguintes sintomas clínicos: mioclonias, distúrbios visuais ou cerebelares, mutismo acinético e disfunções piramidais e extrapiramidais. • Resu ltado positivo nos testes 14. 3. 3, E EG típico ou I R M característicos. 3) Confirmado DCJ: • Apresentar característica espongiforme na região do córtex cerebelar ou na substância cinzenta e imunorreatividade para PrP Sc. 4) Doença hereditária: • Presença de mutação descrita para as doenças por prions.

17.5.4 Diagnóstico da variante DCJ (vDCJ) A vDCJ não pode ser diagnosticada somente com critérios clínicos. O diagnóstico requer a confirmação neuropatológica, sendo que o padrão de placas floridas é confirmatório para a forma variante. Os critérios de sinais e sintomas são classificados utilizando os seguintes critérios clínicos do quadro a seguir: GRUPO I Curso da doença maior que seis meses. Desordem neuropsiquiátrica progressiva. Exclusão de um diagnóstico alternativo. Ausência de suspeita de exposição iatrogênica. Ausência de mutações no gene PRNP.

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GRUPO II Demência. Disestesias dolorosas e persistentes. Ataxia. Mioclonia. Sintomas psiquiátricos precoces (depressão, ansiedade, apatia).

GRUPO III EEG com padrão não típico de DCJ esporádica. IRM com hipersinal pulvinar simétrico bilateral.

GRUPO IV Biópsia de tonsila positiva (não recomendada de rotina por questões éticas).

1) Possível vDCJ: • Paciente apresenta os sinais do Grupo I e pelo menos quatro sinais do Grupo II. • EEG atípico para DCJ. 2) Provável vDCJ: • Paciente apresenta os sinais do Grupo I e pelo menos quatro sinais do Grupo II. • EEG atípico para DCJ. • Hipersinal pulvinar bilateral em IRM. • Ou paciente apresenta os sinais do Grupo I e biópsia de tonsila positiva. 3) Confirmado DCJ: • Paciente apresenta os sinais do Grupo I e neuropatológico confirmado com depósitos em placas floridas.

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17.6 TRATAMENTO DAS DOENÇAS PRIÔNICAS Até hoje, não existe nenhum tratamento efetivo para as doenças causadas por prions, nem mesmo para melhorar as funções cognitivas e motoras comprometidas pela doença. É uma doença de rápida progressão em que aproximadamente 90% dos indivíduos sintomáticos evoluem rapidamente para o óbito de seis meses a um ano. Nos últimos anos, vários estudos têm sido conduzidos na tentativa de encontrar uma forma de impedir a progressão da doença, seja pela redução da conversão de PrPSc, seja pelo bloqueio da proteína infecciosa, utilizando anticorpos monoclonais. Apesar de haver muitos estudos in vitro, poucos estudos clínicos têm sido conduzidos na área. Dentre os estudos em andamento estão investigações sobre a atividade da quinacrina e da tetraciclina no controle da doença priônica, por serem tais drogas capazes de ultrapassar a barreira hematoencefálica, e, em abordagens in vitro, foi demonstrado que o tratamento com essas drogas foi capaz de inibir a formação de depósitos proteicos93. O estudo criterioso dos mecanismos que levam à conversão de PrPc em PrPSc é um caminho a ser trilhado na tentativa de encontrar alvos terapêuticos para tratar ou prevenir a doença.

17.7 CONCLUSÕES As doenças por prions destacam-se como o único grupo de doenças já descrito que pode ser tanto genético quanto esporádico e ainda possuir um caráter infeccioso, atingindo diversas espécies animais e seres humanos. A descoberta da natureza proteica dos agentes responsáveis por essas doenças representou uma quebra de paradigma referente aos conceitos tradicionais da biologia molecular, segundo os quais o fluxo de informação genética deveria ser mediado necessariamente por ácidos nucleicos. O estudo das doenças por prions abriu, ainda, um novo campo de investigação, onde o mecanismo de muitas doenças tem sido atribuído a um mecanismo do tipo prion. Diversas doenças já conhecidas são causadas pelo acúmulo de uma proteína anômala em consequência do mal dobramento dessas proteínas e seu consequente acúmulo. Entre as doenças envolvendo as desordens proteicas, podemos destacar a doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington.

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O diagnóstico das doenças por prion envolve uma etapa crucial de diagnóstico diferencial com diversas desordens neurológicas que podem se apresentar de forma semelhante. Apesar dos critérios da OMS, todos os casos suspeitos de DCJ devem ser investigados. Estudos demonstram que os critérios clínicos não abrangem todos os casos, e 17% de todos os casos confirmados para DCJ não apresentavam critérios clínicos para possível ou provável DCJ94,95. O Brasil tem empenhado esforços para manter um rigoroso sistema de controle e diagnóstico das encefalopatias animais, mas também tem contribuído substancialmente na área de pesquisa envolvendo as funções celulares da proteína prion. Devido ao potencial infeccioso dessas doenças, a OMS recomenda a vigilância da incidência de todas as doenças por prion, incluindo as formas familiares. No Brasil, as doenças humanas causadas por prion se tornaram de notificação compulsória em 2005 e, desde então, mais de quatrocentos casos suspeitos da forma esporádica foram notificados, além de casos familiares da doença. A forma variante da doença humana nunca foi encontrada no Brasil.

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CAPÍTULO

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CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS ADULTAS DE DIVERSAS ORIGENS: UMA VISÃO GERAL MULTIPARAMÉTRICA PARA APLICAÇÕES CLÍNICAS Ricardo Cambraia Parreira Katia Neves Gomes Emerson Alberto da Fonseca Bruna Raphaela Sousa José Luiz da Costa Luiz Orlando Ladeira Alexandre Hiroaki Kihara Rodrigo R Resende 18.1 INTRODUÇÃO

As Células-tronco (do inglês, Stem Cells - SCs) estão entre as mais intensas e atuais linhas de pesquisa e têm trazido à luz do conhecimento o

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desenvolvimento celular, bem como perspectivas de tratamento para doenças e problemas de saúde diversos. Em um trabalho que data de 1961, J. E. Till trouxe-nos os primeiros conceitos de SC, que são a capacidade de autorrenovação (self-renewal), autogeração e a multipotência, ou seja, a capacidade de se diferenciar em várias linhagens celulares1. Desde o isolamento da primeira célula-tronco derivada de embrião de camundongo em 1981 2, a pesquisa com as SC tem sofrido considerável expansão. O primeiro trabalho com SC derivadas de embrião humano data de 1998 3. Seguindo os conflitos éticos que o tema tocava, a pesquisa com SC ganhou outra dimensão após a descoberta das SC adultas 4. Em 1999, Mark F. Pittenger e colaboradores demostraram o potencial de células-tronco mesenquimais adultas humanas derivadas da medula óssea (do inglês, bone marrow mesenchymal stem cell – BM-MSC) de se diferenciarem em linhagens diversas, in vitro, constatando o potencial multipotente das SC adultas 5. As células-tronco mesenquimais (mesenchymal stem cell – MSC) adultas são encontradas virtualmente em todos os tecidos6 e têm um importante papel na manutenção da homeostasia em caso de injúria ou doença e pela renovação do repertório celular. As SC derivadas de embrião são capazes de proliferar/renovar indefinidamente porque, como as células tumorais, possuem a incrível capacidade de manterem íntegros seus telômeros (parte final dos cromossomos reconhecidos por manterem a capacidade proliferativa celular), impedindo o encurtamento desses nas sucessivas divisões celulares que as células-tronco sofrem. O mesmo não ocorre com as SC adultas 7-9. Entretanto, as MSC são hoje a promessa da medicina regenerativa, pela sua facilidade de cultivo in vitro, alta taxa de proliferação e versatilidade em se diferenciar em vários tipos celulares, desde os mais bem estabelecidos, como osteoblastos, condrócitos e adipócitos5, até hepatócitos10, neurônios11-14 e glia15. A população de células da medula óssea é heterogênea e, apenas uma minoria delas é multipotente. Acredita-se que uma parcela ainda menor seja totipotente 16. A medula óssea contém pelo menos dois tipos principais de células-tronco: células-tronco hematopoiéticas (hematopoietic stem cells – HSC), que dão origem aos glóbulos brancos e vermelhos do sangue, e as MSC, que dão origem, in vitro, pelo menos aos três tipos celulares diferenciados, osteoblastos, adipócitos e condrócitos. A terapia com MSC é uma abordagem que se tem mostrado promissora para o tratamento de doenças neurodegenerativas, reparação tecidual e alguns tipos de cânceres. A seguir, vamos discorrer sobre MSC derivadas de vários tecidos como medula óssea, cordão e sangue umbilical, tecido adiposo, sangue menstrual e tecido extraembrionário.

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas

18.2 CÉLULAS-TRONCO HEMATOPOIÉTICAS E DERIVADAS DA MEDULA ÓSSEA E DO SANGUE DO CORDÃO UMBILICAL 18.2.1 Células-tronco hematopoéticas (hematopoeitic stem cells – HSC) Há mais de cinquenta anos sabe-se que a medula óssea é fonte de células-tronco hematopoiéticas (HSC) responsáveis pela geração e manutenção de células sanguíneas 17. J. E. Till e McCullough, em 1961, depletaram o sistema hematopoiético de camundongos após submetê-los a altas doses de irradiação. Após este procedimento, os animais receberam células da medula óssea e tiveram seu sistema hematopoiético reconstituído 1. Esse trabalho mostrou que células presentes na medula óssea são responsáveis pela produção de células sanguíneas, embora argumentos contrários questionem esse modelo. Donald Metcalf salienta que, nesse modelo, temos uma condição extrema que pode não corresponder ao que se observa em condições fisiológicas normais. Não poderiam as células progenitoras maduras sustentar a hematopoiese em condições fisiológicas normais e as HSC serem ativadas apenas em condições extremas18? Mas o que são as HSC? São células capazes de promover a autorrenovação e de se diferenciarem em todo tipo de células sanguíneas especializadas. As HSC encontram-se no sangue circulante e na medula óssea, e são responsáveis pela manutenção das células sanguíneas, apresentando altas taxas de renovação. São produzidas bilhões de novas células sanguíneas por dia 19. Acredita-se que uma em cada 10 mil a 15 mil células da medula óssea seja célula-tronco. No sangue, esse número muda para uma em cada 100 mil95. Pesquisas mostram que as HSC residem na região endósteal20,21 e próximo aos vasos sanguíneos na medula 22. Essa região é formada por osteoblastos23, células reticulares (Cxcl12-abundant reticular cells)24, células-tronco expressando marcador de células nervosas (nestin-positive mesenchymal stem cells) 25, células de Schwann 26 e células perivasculares 27. Nilsson et al. mostraram que a osteopontina, uma proteína que é superexpressa por osteoblastos, é a molécula-chave na manutenção e regulação da proliferação e na localização física das HSC no nicho de células-tronco hematopoiéticas (bone marrow hematopoietic stem cell niche)28,29. Pelo menos três populações de células compõem a medula óssea: long-term (LT-HSC), short-term (ST-HSC) e multi-potent progenitor30. Essas células-tronco deixam a medula continuamente, caem na circulação e retornam à medula. Assim, o sangue circulante é

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fonte de MSC, e o transplante de medula pode ser aplicado para tratamento de doenças sanguíneas 31. O transplante de HSC é também uma boa abordagem para diversas patologias. Centenas de pacientes de leucemia foram tratados com transplante de medula óssea na década de 1970, nos trabalhos pioneiros de Thomas e colegas32, e outras tantas doenças são também tratadas com essa mesma abordagem33. Surpreendentemente, pesquisas mostram que as HSC podem se diferenciar também em hepatócitos, o que aumenta ainda mais seu potencial terapêutico34,35.

18.2.2 Células-tronco da medula óssea (bone marrow mesenchymal stem cells – BM-MSC) A medula óssea é fonte não somente de HSC, mas também das chamadas mesenchymal stem cells ou multipotent mesenchymal stromal cells (MSC). São também conhecidas como bone marrow stem cells (BM-MSC) ou bone marrow stromal cells (BMSC) 36-39. Trata-se de nomes diferentes que denominam o mesmo tipo celular. Os primeiros relatos de BM-MSC foram de Friedenstein e colaboradoes em 1966, isoladas a partir da medula óssea de camundongos 36, quando se observou então a forma fibroblástica das BM-MSC 40. O trabalho de 1974 foi definitivo para a constatação das BM-MSC denominadas de “células fibroblastoides” (fibroblast-like cells) pela semelhança com aquela célula 41,42. As células-tronco mesenquimais humanas (hMSC) foram isoladas por Pittenger e colegas em 1999, a partir da crista ilíaca da pelve5. Murphy e colegas, em 2002, e D’Ippolito e colegas, no mesmo ano, isolaram hMSC da tíbia e da região femoral, respectivamente43-35. Assim como as HSC que correspondem a uma pequena fração de células aderentes, as BM-MSC, cultivadas in vitro, são prioritariamente aderentes e, por definição, capazes de se diferenciar em osteoblasto, condrócito e adipócito46. Entretanto, diversos estudos têm mostrado a capacidade das BM-MSC de se diferenciarem não somente nos tipos celulares de origem mesodermal, mas também do folheto germinativo ectodermal12-14. Pesquisadores já obtiveram células da glia, células musculares e hepáticas a partir de BMSC 34,47,48. Sanchez-Ramos e colegas, além de nosso próprio grupo, promoveram a diferenciação de BMSC de camundongos em neurônios imaturos13,14,49. Bastante heterogênea, a população celular da medula óssea forma o nicho, ou “estroma”, responsável pela manutenção das HSC, promovendo sua sobrevida e fatores de adesão para essas últimas50. Este “nicho” é formado pelas células estromais (stromal cells), fibroblastos reticulares,

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osteoprogenitores e componentes celulares primários da medula óssea (respectivamente, reticular cells, fibroblasts, osteoprogenitors, primary cellular components of the marrow stroma) 51. A cultura de BM-MSC é denominada de “unidade de formação de colônia de fibroblasto” (do inglês, colony-forming units-fibroblastic – CFU-F), uma mistura de células tri-, bie unipotentes. A taxa relativa dessas populações determina a multipotencialidade da cultura de BM-MSC, ou seja, o potencial de crescimento, senescência e diferenciação. Por ter uma população celular heterogênia, as BM-MSC apresentam, em diversos trabalhos, diferentes potenciais de diferenciação. Muraglia e grupo obtiveram 30% de “Tri-lineage”, o restante “bi-lineage” e “uni-lineage” em uma cultura de BM-MSC52. Isso, provavelmente, porque a BM-MSC apresenta subpopulações de MSC em diferentes estágios de diferenciação e a homogeneidade da população é dependente do tecido de origem, método de isolamento e quanto aos números de passagens celulares, isto é, o número de vezes que uma cultura de células é passada entre garrafas de cultivo. Entretanto, uma miríade de estudos mostra a capacidade das MSC de se diferenciarem em tecido adiposo42, tendão53, músculo48,54, cartilagem55, osso56 e células nervosas13,14,49,57.

18.2.3 Células-tronco do sangue do cordão umbilical (umbilical cord blood-stem cells – UCB-MSC) Outra importante fonte de MSC é o sangue do cordão umbilical (umbilical cord blood-mesenchymal stem cells – UCB-MSC, ou simplesmente UCB)58. É uma rotina comum a criopreservação das UCB com a intenção de servirem como alternativa para futuros tratamentos de transplantes autólogos. Embora haja argumentos contrários 59, estudos mostram que a população celular do UCB, assim como da medula óssea, abriga células estromais pluripotentes/multipotentes, capazes de se diferenciarem, por exemplo, em neurônios com sucesso de 87%60, além de osteoblastos, condrócitos e adipócitos. Goodwin demonstrou o potencial multilineage de células (aderentes) isoladas do sangue de cordão umbilical que foram capazes de expressar marcadores de tecidos neuronal, ósseo e adiposo. Porém, o autor é bastante cauteloso para não tratar o que pode ser “plasticidade celular” como “pluripotência”61 e aborda essas células como progenitoras não hematopoiéticas (do inglês nonhematopoietic progenitors - NHP), em vez de células-troncos. Essa mesma cautela deve ser atribuída às BM-MSC, já que elas compartilham marcadores de superfície com células especializadas, como proteínas

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neuronais GFAP (Glial fibrillary acidic protein) e TuJ1 (β-tubulin)62, dentre outras (ver Tabela 18.1) 63. Células aderentes isoladas de UCB-MSC apresentaram duas populações: uma com inclinação ao fenótipo de osteoclasto e outra com fenótipo de célula mesenquimal (mesenchymal-like phenotype) (segundo estudo de Erices e grupo). Pelo menos 75% apresentaram morfologia e características de osteoclasto multinucleado, já 25% deram origem, inicialmente, a colônias individuais fibroblastoides com alta taxa de proliferação64. É importante salientar que a expressão “fenótipo” significa expressão de proteínas, tanto de superfície (marcador molecular) quanto proteínas intracelulares. Além do sangue do cordão, as células estromais do cordão têm sido exploradas como fonte de MSC. UC-MSC já apresentaram fenótipo de cardiomiócitos65. As UCB-MSC têm ainda uma interessante propriedade imunorregulatória. Suprimem a proliferação de linfócitos e reduzem níveis de citocinas proinflamatórias (interferon-γ, tumor necrosis factor-α – TNFα; tumor growth factor-β – TGF-β). Modelos de isquemia cerebral, cirrose hepática e fibrose pulmonar apresentaram significativas melhoras e controle de inflamação, além do efeito antifibrótico pela diminuição do colágeno, dias após a infusão de UC-MSC66. Tabela 18.1 Marcadores de superfície celular

CÉLULAS HUMANAS

MARCADORES

REFERÊNCIAS

Células-tronco de cordão umbilical (UC-MSC)

CD29, CD44, CD49b, CD105 (SH2), CD166, HLA-ABC

Erices et al., 200064; Wang et al., 200465

Células-tronco derivadas da medula óssea (BM-MSC)

CD29, CD44, CD73 (SH3), CD90 (Thy-1), Stro-1, CD106 (VCAM1) CD105, CD166, HLA-ABC,

Choong et al., 2007234; Gronthos et al., 2003235; Bhattacharya et al., 2000236

Células-tronco hematopoéticas (HSC)

CD34, CD38, CD59, CD133

Drake et al., 2011237

Osteoblastos

CD45, CD51/CD61

Wang et al., 200465

Neurônios

GAP-43, NF-H, NeuN, TuJ-1

Fanarraga et al., 1999238

CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); GAP-43 = proteína associada ao crescimento-43 (growth associated protein-43); HLA = antígeno leucocitário humano (human leukocyte antigen); SH2 = domínio de homologia Src 2 (Src homology 2 domain); NF-H = neurofilamento-H (neurofilament-H); NeuN = núcleos neuronais (Neuronal Nuclei); SH3 = domínio de homologia Src 3 (Src homology 3 domain); STRO-1 = antígeno precursor estromal (stromal precursor antigen-1); Thy-1 = antígeno timocitário (thymocyte antigen); TuJ-1 = classe III β-tubulina (class-III β-tubulin); VCAM-1 = molécula de adesão de célula vascular (vascular cell adhesion molecule-1).

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18.2.4 Marcadores superficiais de célulastronco hematopoiéticas e derivadas da medula óssea e do cordão umbilical Em 2006, o Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee, da International Society for Cellular Therapy, definiu os critérios mínimos que as MSC devem apresentar: serem aderentes em condição de cultura, expressar alguns marcadores de superfície como CD105, CD73 e CD90, não expressar CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19 e HLA-DR39. Entretanto, alguns desses marcadores não são exclusivos de MSC63,67,68. Os diferentes tecidos de origem podem estar relacionados com essa diferença de expressão. Mas, para todos os casos, a norma geral dos marcadores positivos é CD73, CD90 e CD105, e os respectivos negativos conforme mencionamos acima, como critério mínimo de expressão para as MSC nas terapias (Tabela 18.1). Há uma variedade de protocolos para isolamento, cultivo e indução de MSC derivadas de sangue, medula óssea e cordão umbilical sumarizados nas Tabelas 18.2 a 18.3 (Figura 18.1).

18.2.5 Aplicações terapêuticas das células-tronco do sangue do cordão umbilical, da medula óssea e hematopoiéticas Diversos trabalhos em modelos animais mostram o potencial terapêutico das SC: ratos que tiveram o disco intervertebral regenerado com implante de MSC 69, terapias que, em caninos, também foram bem-sucedidas70; infarto do miocárdio em ratos já apresentaram bons resultados após transplantes de BM-hMSC 71; melhora no quadro de encefalomielite em camundongos diminuindo o infiltrado inflamatório e estimulando a oligodendrogênese72. A infusão de MSC também já promoveu benefícios na terapia para derrame em ratos73. A identificação in vivo das MSC transplantadas em modelos animais é feita, normalmente, por marcação histopatológica, também com auxílio da fluorescence in situ hybridization (FISH), método este extremamente evasivo 71. Algumas metodologias de monitoramento in vivo da dinâmica, distribuição e localização das MSC transplantadas usam sondas (probes) fluorescentes ou inserem genes repórteres, como proteínas fluorescentes (green fluorescent protein – GFP)74-76, marcação de 5-bromodeoxiuridina (BrdU)77, 111 In-oxine78. Existem abordagens ainda mais sofisticadas que possibilitam a visualização e monitoramento in vivo da migração das MSC. A ressonância

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Tabela 18.2 Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea (Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells - BM-MSC) e hematopoiéticas humanas (Human Hematopoietic Stem Cell - hHSC) CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS HUMANAS PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

CARACTERIZAÇÃO

Marcadores de superfície celular positivos: CD44, CD71, CD73 (SH3), CD90 (Thy-1), CD105, CD29, HLA I, CD106 (VCAM-1) e CD166. BM é aspirada e diluída com EDTAMarcadores de superfície celular negativos: PBS. A fração MNC é então isolada CD10, CD13, CD14, CD24, CD31, CD34, por centrifugação em gradiente CD36, CD45, CD38, CD45, CD49d, de densidade e semeada a uma CD117, CD133, SSEA-4 e HLA-DR. 6 2 densidade de 1 x 10 células por cm . Marcadores de superfície celular positivos: CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105. Marcadores de superfície celular negativos: CD13, CD34, CD45 e CD133.

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

REFERÊNCIAS

Osteogênica: dexametasona, AsA, AsAP, βGP e FCS em meio basal osteogênico. Adipogênica: MSCGM ou DMEM, MSCGS, dexametasona, IBMX, insulina recombinante humana, indometacina e FCS. Condrogênica: DMEM-HG, dexametasona, ácido ascórbico, piruvato de sódio, prolina, TGF-β1 e ITS+ premix. Hepática: meio IMDM sem soro, fator de crescimento epidermal e bFGF. Etapa 1 – IMDM, HGF, bFGF e nicotinamida. Etapa 2 – IMDM, oncostatina M, dexametasona e ITS+ premix. Neurogênica: DMEM, FBS, β-mercaptoetanol. Meio de indução neuronal é composto de DMEM/BME. Posteriormente, DMEM/ DMSO e BHA.

Jaiswal et al., 199756 Kern et al., 2006250 Lee et al., 200410 Lee et al., 200410 Woodbury et al., 2000248

CÉLULAS-TRONCO HEMATOPOIÉTICAS HUMANAS (hHSC) PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

CARACTERIZAÇÃO

Sangue periférico humano é separado por Ficoll-Paque. As células são retiradas e transferidas para um tubo Marcadores de superfície celular positivos: e centrifugadas. Depois as células CD29, CD71, CD38, CD90 são lavadas com meio de cultura (Thy-1), 105, CD166. e centrifugadas. O sedimento de Marcadores de superfície celular negativos: células é então ressuspenso e as CD34, CD45 e CD38. células são semeadas em meio de cultura de 10% a 20% de FBS.

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

REFERÊNCIAS

Osteogênica: dexametasona, ácido ascórbico and β-glicerofosfato. Condrogênica: DMEM sem soro, ácido ascórbico-2-fosfato, piruvato de sódio, prolina, dexametasona, ITS+ premix , TGF-β3 e bFGF. Adipogênica: IBMX, dexametasona, insulina, indometacina. Células vermelhas do sangue: BSA deionizada, transferrina humana saturada com ferro, sulfato ferroso, nitroto ferroso, insulina, hidrocortisona, fator de célula-tronco, IL-3 e eritropoietina. Macrófaga: meio RPMI 1640, FBS, L-glutamina, M-CSF tratados com cultura de monócitos e LPS. T Linfócito: RPMI 1640, FBS, L-glutamina e IL-2. Epitelial: RPMI 1640, FBS, L-glutamina e EGF. Endotelial: RPMI 1640, FBS, L-glutamina e VEGF. Hepática: RPMI 1640, FBS e HGF. Neurogênica: RPMI 1640, FBS, L-glutamina e NGF.

Kassis et al., 2006251 Chong et al., 2012252 Kassis et al., 2006251 Giarratana et al., 2005253 Zhao et al., 2003254

AsA = acido ascórbico (ascorbic acid); AsAP = ácido ascórbico 2-fosfato (ascorbic acid 2-phosphate); bFGF = fator de crescimento fibroblástico básico (basic fibroblast growth factor); βGP = β-glicerofosfato; BHA = hidroxianisol butilado (butylated hydroxyanisole); BME = β-mercaptoethanol; BSA = albumina de soro bovino (bovine serum albumin); CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); DMEM = meio Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s medium); DMEM-HG = meio Eagle modificado por Dulbecco, alta glicose (Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose); DMSO = dimetilsulfóxido (dimethyl sulfoxide); EDTA = ácido etilenodiaminotetracético (ethylenediaminetetraacetic acid); EGF = fator de crescimento epidérmico (epidermal growth factor); FBS = soro fetal bovino (fetal bovine serum); FCS = soro fetal de cabra (fetal calf serum); HGF = fator de crescimento humano (human growth factor); HLA = antígeno leucocitário humano (human leukocyte antigen); HLA-DR: antígeno leucocitário humano-DR (human leukocyte antigen-DR); IBMX = isobutil-metilxantina (isobutyl-methylxanthine); IL-3 = interleukin 3; IMDM = Iscove’s modified Dulbecco’s media; ITS = insulina-transferrina-selênio (insulin-transferrin-selenium); MSCGM = mesenchymal stem cell growth medium; MSCGS = mesenchymal stem cell growth supplement; NGF = fator de crescimento do nervo (nerve growth factor); PBS = solução salina tamponada com fosfato (phosphate buffered saline); RPMI = Roswell Park Memorial Institute; SH3 = domínio de homologia Src 3 (Src homology 3 domain); SSEA-4 = antígeno específico do estágio embrionário 4 (stage-specific embryonic antigen-4); TGF = fator de crescimento de transformação (transforming growth factor); Thy-1 = antígeno timocitário (thymocyte antigen); VCAM-1 = molécula de adesão de célula vascular (vascular cell adhesion molecule-1); VEGF = fator de crescimento endotelial vascular (vascular endothelial growth factor).

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magnética por imagem (Magnetic resonance imaging – MRI) usa um nanocompósito de óxido de ferro superparamagnético (superparamagnetic iron oxide nanocomposite), que é internalizado pelas MSC 79-81. Mais recentemente, nanotraçadores de ouro (gold nanotracers) foram utilizados para marcar MSC e monitorá-las por métodos de ultrassom e fotoacústicos82. Procedimentos clínicos em humanos têm sido feitos há décadas com transplantes de HSC autólogas. Kessinger e grupo infundiram pacientes que sofriam de doenças hematológicas com sangue periférico 83. Thomas e colaboradores trataram cem pacientes de leucemia com transplantes de medula óssea até a década de 1970 32. Estudos mais recentes mostram casos de sucesso da terapia celular das MSC. Pacientes com defeito na espessura da cartilagem articular da patela, quando transplantados com gel de colágeno contendo BM-MSC direto sobre a cartilagem articular, tiveram o defeito reparado 84. Pacientes com injúria no cordão espinhal foram tratados com UC-MSC 85. Pacientes com cirrose hepática receberam infusão de HSC na veia periférica, mas apresentaram resultados poucos satisfatórios 86. Esse mesmo grupo procedeu a transplante de BM-MSC via artéria hepática e obtiveram resultados melhores, trazendo esperança para a terapia de regeneração hepática87.

18.3 CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DE TECIDO ADIPOSO E SANGUE MENSTRUAL 18.3.1 Células-tronco derivadas de tecido adiposo (Adipose-derived Stem Cells – ASC) O tecido adiposo é uma fonte abundante e acessível de células-tronco que possuem a capacidade de se diferenciarem em diversos tipos celulares. A International Fat Applied Technology Society adotou o termo “célulastronco derivadas de tecido adiposo” (do inglês adipose-derived stem cells – ASC) para identificar a população de células isoladas do tecido adiposo. Essa população é caracterizada por células aderentes ao plástico e multipotentes88. É digno de nota o fato de que diferentes nomenclaturas podem ser encontradas na literatura para designar essa específica população de células isoladas de tecido adiposo, como “células-tronco adultas derivadas de tecido adiposo” (do inglês adipose-derived adult stem cells – ADAS), “células adultas estromais derivadas de tecido adiposo” ou “células estromais derivadas

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Tabela 18.3 Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco humanas de sangue do cordão umbilical (Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cell - UCB-MSC) PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

CARACTERIZAÇÃO

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

Adipogênica: IBMX, dexametasona, insulina e indometacina. Osteogênica: dexametasona, β-glicerofosfato e fosfato-ascorbato. O cordão umbilical é lavado Marcadores de superfície Hepática: Etapa 1 – IMDM, HGF, bFGF e nicotinamida; Etapa-2 com EBSS e preenchido com celular positivos: – IMDM, oncostatina M, dexametasona e ITS+ premix. colagenase em meio 199. CD73/SH3, CD54 (ICAM-1), Condrogênica: DMEM-HG, dexametasona, ácido ascórbico, piruvato de A amostra é centrifugada e CD29 (β1 integrina), CD49e sódio, prolina, fator transformador de crescimento-β (transforming growth o sedimento é ressuspenso (α5 integrina), CD44, CD90 factor-β), ITS+ (insulina, transferrina, selênio), BSA e ácido linóico. em DMEM-LG. As células (Thy-1), ASMA, CD105/ Cardíaca: meio de cultura, soro de cavalo, dexametasona e hidrocortisona. são cultivadas e depois de SH2/endoglina e CD13. Neurogênica: quatro dias as células são Marcadores de superfície Etapa 1 – o meio consiste de IMDM, bFGF, ácido retinóico e BME. transferidas para uma placa celular negativos: Etapa 2 – IMDM 1, cAMP e AsA. de cultivo e expandidas. CD14, CD45 and CD34. Etapa 3 – IMDM, hidrocortisona e cAMP. Etapa 4 – IMDM, aFGF, SHH, BDNF, NGF, vitronectina, AsA, IBMX, forscolina e PMA.

REFERÊNCIA

Romanov et al., 2003247 Lee et al., 200410 Lee et al., 200410 Gang et al., 2004219 Woodbury et al., 2000248

aFGF = fator de crescimento fibroblástico acídico (acidic fibroblast growth factor); AsA = ácido ascórbico (ascorbic acid); ASMA = alpha -smooth muscle actin; BDNF = fator neurotrófico derivado do cérebro (brain-derived neurotrophic factor); bFGF = fator de crescimento fibroblástico básico (basic fibroblast growth factor); BME = β-mercaptoethanol; BSA = albumina de soro bovino (bovine serum albumin); cAMP = adenosina monofosfato cíclica (cyclic adenosine monophosphate) CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); DMEM -HG = meio Eagle modificado por Dulbecco, alta glicose (Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose); DMEM-LG = meio Eagle modificado por Dulbecco, baixa glicose (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, low glucose); EBSS = Earle’s balanced salt solution; HGF = fator de crescimento humano (human growth factor); IBMX = isobutil-metilxantina (isobutyl-methylxanthine); ICAM-1 = intercellular adhesion molecules-1; IMDM = Iscove’s modified Dulbecco’s medium; ITS = insulina-transferrina-selênio (insulin-transferrin-selenium); NGF = nerve growth factor; PMA = phorbol myristate acetate; SH2 = domínio de homologia Src 2 (Src homology 2 domain); SH3 = domínio de homologia Src 3 (Src homology 3 domain); SHH = sonic hedgehog; Thy-1 = antígeno timocitário (thymocyte antigen).

de tecido adiposo” (do inglês adipose-derived stromal cells – ADSC), “células estromais do tecido adiposo” (do inglês adipose stromal cells – ASC), “células-tronco mesenquimais do tecido adiposo” (do inglês adipose mesenchymal stem cells – AdMSC), “preadipócitos”, “células processadas de lipoaspirado” (do inglês processed lipoaspirate cells – PLA), e “célulastronco/estromais derivadas de tecido adiposo” (do inglês adipose-derived stromal/stem cells – ASC)89-92. ASC são células-tronco mesenquimais, assim, são progenitores de tipos celulares derivados da mesoderme e também são células estromais. Em passagens tardias, culturas de ASC são homogêneas e apresentam morfologia fibroblastoide93 (Figura 18.1).

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A)

B)

Figura 18.1 As células-tronco foram obtidas a partir de diversos tecidos e isoladas com protocolos diferentes. (A) células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (do inglês, adipose-derived stem cells -ASC), do sangue do cordão umbilical (do inglês umbilical cord blood mesenchymal stem cell - UCB-MSC)) e (B) da medula óssea (do inglês bone marrow-derived stem cell - BMSC) e célulastronco mesenquimais do sangue menstrual (do inglês menstrual blood mesenchymal stem cells - MenSCs) podem se diferenciar em osteoblastos, condrócitos, cardiomiócitos, neurônios, adipócitos, miócitos, hepatócitos, pâncreas, células epiteliais e endoteliais (também relacionadas com a angiogênese). O processo de diferenciação é induzido por fatores de crescimento, hormônios e moléculas orgânicas (ver tabelas 18.2 a 18.5 para obter informações detalhadas).

O tecido adiposo é composto, principalmente por células de gordura organizadas em lóbulos, sendo composto por adipócitos maduros, em mais de 90% do volume do tecido, e por uma fração de estroma vascular (do

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inglês stromal vascular fraction – SVF), onde são encontrados preadipócitos, fibroblastos, células vasculares do músculo liso, células endoteliais, monócitos/macrófagos residentes, linfócitos e ASC (Figura 18.1A) 94,95. Portanto, diferentes populações de células-tronco/progenitoras multipotentes são todas CD45 negativas. A relação de descendência entre MSC e pericitos existe como base para os diferentes fenótipos de células-tronco do tecido adiposo 96. O tecido adiposo do abdômen inferior é a região que contem a maior porcentagem de ASC, em comparação com outros sítios. Adicionalmente, o tecido conjuntivo fibroso, que contém mais tecido adiposo branco, tem um conteúdo mais elevado de ASC. Rodbell, em 1964, foi o primeiro pesquisador a descrever a técnica para isolar as ASC do tecido adiposo97,98. Nesse trabalho, blocos de gordura foram removidos de ratos e lavados sucessivamente para remover as células hematopoiéticas presentes no tecido. Em seguida, o tecido foi incubado e digerido com colagenase para liberar a população de células. Dentre elas, adipócitos maduros e ASC foram separados por centrifugação, encontrados na fração superior e inferior, respectivamente. A seleção final é alcançada pela aderência das células-tronco ao plástico, assim, as demais células, como as células do sangue periférico, fibroblastos, periócitos e células endoteliais são descartadas na manutenção das condições de cultura97,98 (Tabela 18.4, Figura 18.1B). Portanto, as ASC podem ser isoladas pela sua capacidade de aderir ao plástico de placas de cultura de tecidos. O procedimento com camundongos é similar99. Depois de isoladas, as ASC são tipicamente expandidas em meio mínino contendo 10% de soro fetal bovino, em cultura de monocamadas em plástico. Um protocolo semelhante foi utilizado no isolamento de célulastronco humanas100. Blocos de gordura humanos também foram utilizados, mas avanços nos procedimentos cirúrgicos têm simplificado esse processo. O material aspirado retirado no processo de lipoaspiração é uma ótima fonte de células-tronco. Devido à infusão de solução salina e anestésica durante o procedimento cirúrgico, o material lipoaspirado é encontrado na forma fluida, o que facilita o processo de separação celular e possibilita a recuperação da maioria das células97,98 (Tabela 18.4, Figura 18.1B). Essa metodologia permite a recuperação de 0,1 - 1x109 células nucleadas em 200 mL do material lipoaspirado, das quais 10% são ASC. In vitro, ASC exibem um tempo de duplicação de dois a quatro dias, dependendo do meio de cultura e do número de passagens89. Em relação à senescência há controvérsias sobre a conservação da atividade da telomerase durante as passagens. De acordo com vários estudos, a atividade desta enzima é reduzida com as sucessivas

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passagens e as caraterísticas das células deixam de ser idênticas, revelando ainda mutações em ASC humanas98. Tabela 18.4 Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo (hASC) PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

CARACTERIZAÇÃO

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

REFERÊNCIA

ASC de lipoaspirado foram lavadas com PBS. A amostra foi digerida com colagenase. Meio de K-NAC foi adicionado ao sedimento de células. Suspensão celular foi remisturada, filtrada, plaqueada e incubada.

Marcadores de superfície celular positivos: CD106, CD13, CD49, CD44, CD90, CD105, CD29, e CD166. Marcadores de superfície celular negativos: HLA-DR, CD133, CD117, CD45, CD31, STRO-1, HLA-II e CD34.

Osteogênica: dexametasona, β-glicerofosfato e ascorbato 2-fosfato

Kuang-Hung Cheng et al., 2011239

O lipoaspirado foi lavado com PBS. As células foram plaqueadas em frascos de cultura. Após a segunda passagem, as células foram suspensas em meio de criopreservação.

Marcadores de superfície celular positivos: CD90, CD73 e CD166. Marcadores de superfície celular negativos: CD49, CD45 e CD34.

Condrogênica: DMEM/F12, e ascorbato 2-fosfato, L-prolina, dexametasona, piruvato de sódio, ITS, isolados ou combinações de TGF-β2, TGF-β2 e IGF-I.

Kim et al., 2009240

ASC de abdominoplastia foram lavadas com PBS, centrifugadas e ressuspensas em meio α-MEM. Em seguida, as células foram suspensas em meio de expansão.

Marcadores de superfície celular positivos: CD29, CD90, CD105 e CD44. Marcadores de superfície celular negativos: HLADR, CD14, CD45, e CD34.

Hepática: expansão em meio sem soro, rhOSM dimetilsulfóxido e rhHGF.

Seo et al., 2005241

ASC de lipoaspirado foram suspensas em DMEM. As células foram recolhidas e lavadas com meio DMEM/F12.

Marcadores de superfície celular positivos: c-kit e SCF. Marcadores de superfície celular negativos: ABCG2, nestina, Thy-1 e Isl-1

Pancreática: meio DMEM/F12 sem glicose, penicilina/ estreptomicina, nicotinamida, fator de crescimento de hepatócito, pentagastrina, B-27ativina-A, exendina-4, suplemento livre de soro e suplemento N-2.

Timper et al., 2006242

hASC de lipoaspirado foram suspensas em DMEM e centrifugadas. O sedimento foi ressuspenso em NH4Cl e filtrado. As células foram cultivadas em DMEM.

Marcadores de superfície celular positivos: MHC I, CD90, CD73, CD44, CD29 e CD105 (endoglina). Marcadores de superfície celular negativos: CD34, CD45, CD31 e CD14.

Neurogênica: meio livre de soro, hEGF, ßFGF, placa coberta com poli-L-lisina, BDNF, FBS e all-trans RA.

Anghileri et al., 2008243

ASC de lipoaspirado foram lavadas com PBS, suspensas em DMEM e centrifugadas. O sedimento foi ressuspenso em NH4Cl e incubado em meio DMEM.

Marcadores de superfície celular positivos: CD105, CD90 e CD73. Marcadores de superfície celular negativos: CD34 e CD45.

Cardiogênica: DMEM-LG, insulina, transferrina, selenito de sódio, FCS, antibióticos, de albumina de soro bovino, ascorbato, dexametasona e ácido linoleico.

Choi et al., 2010131

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Biotecnologia Aplicada à Saúde PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

CARACTERIZAÇÃO

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

REFERÊNCIA

hASC foram isoladas de lipoaspirado, lavadas com PBS, digeridas com colagenase, filtradas e centrifugadas. As hASC foram cultivadas em condições normais de incubação.

Marcadores de superfície celular positivos: CD9, CD29, CD49, CD54, CD105, CD166, CD44, CD71, CD10, CD13, CD73, CD90 e CD146. Marcadores de superfície celular negativos: CD11b, CD18, C50, D56, CD62, CD104, CD16, C14, CD31, CD45 e HLA-DR.

Adipogênica: dexametasona, isobutil metilxantina, indometacina, insulina e tiazolidinodiona. Cardiomiogênica: transferrina, IL-3, IL-6 e VEGF. Condrogênica: ácido ascórbico, proteína morfogenética óssea 6, dexametasona, insulina e fator de crescimento transformante-β. Endotelial: meio apropriado (EGM-2-MV), ascorbato, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de fibroblastos básico e hidrocortisona. Miogênica: dexametasona e soro de cavalo. Neurogênica: hidroxianisole dutilado, ácido valproico e insulina. Osteogênico: ácido ascórbico, proteína morfogenética óssea 2, dexametasona e 1,25-di-hidroxivitamina D3.

Gimble et al., 200798

hASC foram isoladas a partir de lipoaspirado através de um tratamento com colagenase, seguida por centrifugação e técnica de plaqueamento diferencial.

Marcadores de superfície celular positivos: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD51, CD55, CD59, CD90 e CD166. Marcadores de superfície celular negativos: CD11a, CD11b, CD11, CD14, CD16, CD18, CD31, CD45, CD50, CD56, CD104 e HLADR.

Adipogênica: fator de crescimento ligado a insulina-1 (IGF-1), hormônio de crescimento, glicocorticóides, insulina, ácidos graxos e adenosina cíclica monofosfato. Osteogênico: dexametasona, ácido ascórbico, β-glicerofosfato e fator de crescimento, proteína morfogenética óssea 2. Condrogênica: insulina, TGF-ß1 e ascorbato. Miogênica: meio completo com soro de cavalo e glicocorticoide, como hidrocortisona e/ou dexametasona.

Locke et al., 2009245

hASC foram isoladas a partir de lipoaspirado, digeridas com colagenase. As células obtidas foram separadas por meio de centrifugação por gradiente de densidade, recolhidas, lavadas e filtradas.

Marcadores de superfície celular positivos: CD34 e CD90. Marcadores de superfície celular negativos: CD31, CD45, CD105 e CD146.

Adipogênica: DMEM, isobutilmetilxantina, dexametasona, insulina e indometacina. Osteogênica: DMEM, FBS, a dexametasona, ascorbato-2-fosfato e β-glicerofosfato Condrogênica: DMEM, FBS, insulina, TGF-ß1 e ascorbato-2-fosfato.

Yoshimura et al., 2006246

ABCG2 = cassete membro da subfamília G de ligação a ATP f2 (ATP-binding cassette sub-family G member 2); ASC = células-tronco derivadas de tecido adiposo (adipose-derived stem cells); BDNF = fator neurotrófico derivado do cérebro (brain-derived neurotrophic factor); CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); DMEM/F12 = meio Eagle modificado por Dulbecco/mistura nutriente F-12 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12); DMEM-LG = meio Eagle modificado por Dulbecco, baixa glicose (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, low glucose); EGM-2-MV = meio de crescimento celular endotelial microvascular-2 (microvascular endothelial cell growth medium-2); FBS = soro fetal bovino (fetal bovine serum); FCS = soro fetal de cabra (fetal calf serum); hEGF = fator de crescimento epidérmico humano (human epidermal growth factor); HLA = antígeno leucocitário humano (human leukocyte antigen); HLA-DR = antígeno leucocitário humano-DR (human leukocyte antigen-DR); IGF = fator de crescimento ligado à insulina (insulin-like growth factor); Isl-1 = Islet-1; ITS = insulina-transferrina-selênio (insulin-transferrin-selenium); K-NAC = N-acetil-L-cisteína (NAC) e ácido L-ascórbico 2-fosfato; α-MEM = meio de Eagle α-modificado (α-modified Eagle’s medium); MHC = complexo principal de histocompatibilidade (major histocompatibility complex); NH4Cl = cloreto de amônio; PBS = solução salina tamponada com fosfato (phosphate buffered saline); RA = ácido retinoico (retinoic acid); rhHGF = fator de crescimento humano recombinante (recombinant human growth factor); rhOSM = oncostatina humana recombinante M (recombinant human oncostatin M); SCF = fator de células-tronco (stem cell factor); STRO-1 = precursor estromal de antígeno-1 (stromal precursor antigen-1); TGF = fator de crescimento de transformação (transforming growth factor); Thy-1 = antígeno timocitário (Thymocyte antigen); VEGF = fator de crescimento endotelial vascular (vascular endothelial growth factor); bFGF = fator de crescimento fibroblástico básico (basic fibroblastic growth factor); HLA-DR = antígeno leucocitário humano-DR (human leukocyte antigen-DR); DMEM = meio Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco's modified Eagle's medium).

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas

Figura 18.2 Células-tronco de diversas origens requerem diferentes protocolos de isolamento. Células-tronco derivadas de sangue menstrual (do inglês menstrual blood-derived stem cells – MenSC), líquido aminiótico (do inglês amniotic-derived mesenchymal stem cells – AmnSC) e córion (do inglês chorionic mesenchymal stem cells – ChSC) podem se diferenciar em osteoblastos, condrócitos, cardiomiócitos, neurônios, adipócitos, miócitos, hepatócitos, células pancreáticas, células epiteliais e endoteliais (também relacionadas com a angiogênese). A indução de diferenciação de células-tronco depende de fatores de crescimento, hormônios e moléculas orgânicas (para informações mais detalhadas, consultar Tabelas 18.7 a 18.10).

18.3.2 Células-tronco derivadas de sangue menstrual (menstrual blood stem cells – MBSC) O endométrio humano é um tecido que sofre remodelagem dinâmica, onde ocorrem mais de 400 ciclos de regeneração, diferenciação e sangramento durante o período reprodutivo da mulher 101. O sangue menstrual contém fragmentos do endométrio, que é eliminado durante a menstruação. O endométrio é composto por duas camadas: a funcional, que está sempre passando pelo processo de reestruturação, e a basal, composta principalmente por tecido conjuntivo fibroso frouxo102. As células-tronco mesenquimais podem ser obtidas do útero através de vários processos, incluindo histerectomia, curetagem diagnóstica e sangue menstrual 103. Em 2007, Meng descreveu uma nova população de célulastronco extraídas de sangue menstrual 104. O isolamento dessas células foi

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

realizado através da coleta de sangue menstrual em recipientes apropriados contendo antibióticos e heparina. As células foram então processadas com um coquetel de antibióticos/antimicóticos (vancomicina, cefotaxima sódio, amicacina, gentamicina e anfotericina B), lavadas com solução salina tamponada com fosfato (do inglês phosphate buffered saline – PBS) e isoladas por centrifugação em gradiente de densidade descontínuo e através da adesão ao plástico 104. Após o isolamento, esta linhagem celular pode ser mantida em meio mínimo suplementado. A morfologia das células isoladas de sangue menstrual é típica de células-tronco mesenquimais102: elas possuem características de célula-tronco como autorrenovação, alto potencial de proliferação in vitro e, mais importante, habilidade de se diferenciar em diversas linhagens celulares em meios de indução. Essas células multipotentes têm a capacidade de se diferenciar em várias células funcionais incluindo cardiomiócitos, epitélio respiratório, células neuronais, miócitos, células endoteliais, células pancreáticas, células neurogênicas, células adiposas e osteócitos (ver Tabela 18.5, Figura 18.1B). Culturas de células aderentes obtidas de sangue menstrual expandem-se rapidamente; seu tempo de duplicação é de 18 a 36 horas101, e podem ser mantidas in vitro por 68 duplicações, sem que seja perdida a expressão de marcadores de superfície ou apresentem anormalidades cariotípicas104. Khanjani e colaboradores exploraram a habilidade de diferenciação de MBSC em hepatócitos e demonstraram que, embora o grau de diferenciação seja extremamente dependente das concentrações de elementos específicos (fator de crescimento de hepatócitos e oncostatina M), as células diferenciadas expressam marcadores de hepatócitos maduros, como albumina, tirosina aminotransferase e citoqueratina-18 em nível de RNA mensageiro (mRNA) e proteínas. Elas também mostraram propriedades funcionais de hepatócitos, incluindo secreção de albumina, estoque de glicogênio e expressão de citocromo P450 7A1 (Tabela 18.5, Figura 18.1). Portanto, hepatócitos derivados de MBSCs podem ter potencial para dar um grande passo na aplicação de células-tronco como terapia, como por exemplo em doenças hepáticas crônicas105. Em geral, MBSC é a única população celular que pode ser isolada com segurança (procedimento não invasivo) e fornecer uma fonte expansível de células-tronco para engravidar mulheres com mais idade. Sem dúvida, o estudo das características de MBSC proporcionará uma nova visão sobre o futuro tratamento de várias doenças.

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas

Tabela 18.5 Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas de sangue menstrual (Menstrual Blood-derived Mesenchymal Stem Cells -MBSC) PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

CARACTERIZAÇÃO

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

REFERÊNCIA

As células mononucleares derivadas de sangue menstrual foram separadas através de centrifugação de gradiente de densidade e pré-cultivadas em meio comum. Subsequentemente, as células foram coletadas e repicadas.

Adipogênica: meios de indução adipogênica comerciais. Marcadores de superfície Osteogênica: meios de indução osteogênica comerciais. celular positivos: Endotelial: meios de indução endoteliais comerciais. CD9, CD29, CD59, CD73, Neurogênica: meios de indução neuronal NPMM comerciais, CD41a, CD44, CD90, CD105, penicilina/estreptomicina, e glutamax hFGF-4. hTERT e Oct4. Epitélio pulmonar: meio de indução SAGM Comercial. Marcadores de superfície Hepática/pancreática: meio de indução comercial, fator celular negativos: de crescimento de hepatócitos, bFGF, hFGF-4 e SCF. CD14, CD34, CD38, CD45, Cardiogênica e miogênica: DMEM completo, CD133, STRO-1, SSEA-4 e Nanog 5-azacitidina, seguido pelo cultivo com meio de crescimento muscular esquelético e bFGF.

Células derivadas do sangue menstrual foram lavadas em meio completo, semeadas em frascos de cultura e crescidas em meio completo de Chang

Marcadores de superfície celular Osteogênica: kit de indução de diferenciação comercial. positivos: SSEA-4, Oct4, CD117reduzido, Adipogênica: kit de indução de diferenciação comercial. CD29, CD44, CD166, CD73 e CD90. Condrogênica: kit de indução de diferenciação comercial. Schwab et al., 2005256 Marcadores de superfície Cardiomiogênica: kit de indução de diferenciação comercial. celular negativos: CD133, Neurogênica: kit de indução de diferenciação comercial. CD45, CD105 e CD34.

As células mononucleares derivadas de sangue menstrual foram separadas através de centrifugação por gradiente de densidade e lavadas com PBS. O sedimento celular foi suspenso em DMEM completo e -F12.

Marcadores de superfície celular positivos: CD105, CD73, CD146 e Oct4. Marcadores de superfície celular negativos: c-kit e CD45.

Lin et al., 2011103

Osteogênica: DMEM, soro fetal bovino, dexametasona, β-glicerofosfato, ascorbato-2-fosfato. Adipogênica: DMEM, FBS, a dexametasona, insulina recombinante humana, isobutil1-metil-xantina e indometacina. Condrogênica: meio contendo FBS, fator de crescimento transformador 3, proteína morfogenética óssea 6, dexametasona, 1 x ITS + 1 (ITS + ácido albumina Gargett et al., 2010101 de soro bovino e linoleico) e ácido ascórbico. Hepática: Commitment step: plaqueamento matriz extracelular gel com DMEM isento de soro suplementado com EGF e bFGF. Passo de diferenciação: meio isento de soro contendo dexametasona, 1% de ITS + 1, NTA e HGF. Passo maturação: meio isento de soro contendo dexametasona, 1% ITS + 1 e OSM.

CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); DMEM = meio Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s medium); EGF = fator de crescimento epidérmico (epidermal growth factor); FBS = soro fetal bovino (fetal bovine serum); FGF = fator de crescimento fibroblástico (fibroblast growth factor); hFGF = fator de crescimento fibroblástico humano (human fibroblast growth factor); HGF = fator de crescimento humano (human growth factor); hTERT = telomerase transcriptase reversa humana (human telomerase reverse transcriptase); ITS = insulina-transferrina-selênio (insulin-transferrin-selenium); Nanog; NPMM = meio de manutenção de progenitores neurais (neural progenitor maintenance medium); NTA = ácido trisódico nitriloacético (nitrilotriacetic acid trisodium); Oct4 = fator de transcrição de ligação ao octâmero 4 (octamer-binding transcription factor 4); OSM = oncostatina M; PBS = solução salina tamponada com fosfato (phosphate buffered saline); SAGM = meio de crescimento das pequenas vias aéreas (small airway growth medium); SCF = fator de células-tronco (stem cell factor); SSEA-4 = antígeno específico do estágio embrionário 4 (stage-specific embryonic antigen-4); STRO-1 = antígeno precursor estromal-1(stromal precursor antigen-1).

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18.3.3 Marcadores de superfície de células-tronco derivadas do tecido adiposo e sangue menstrual 18.3.3.1 Células-tronco derivadas do tecido adiposo Vários grupos de pesquisa independentes investigaram as ASC na tentativa de identificar marcadores específicos de superfície celular (Tabela 18.4, Figura 18.1A). Assim, a expressão das proteínas CD105/SH2, CD73 e CD90 e a falta de expressão das proteínas CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19 e HLA-DR tem fornecido evidências para ASC 106. CD73 é considerado um marcador característico de células mesenquimais e, em adição, tem sido relatado que CD29, CD44 e SH3 também são marcadores moleculares característicos de MSC. A expressão do antígeno precursor estromal-1 (do inglês, stromal-derived factor-1 – STRO-1), que é normalmente utilizado como marcador para células progenitoras de medula óssea, também tem sido encontrada em ASC. Em contraste, a expressão de marcadores de linhagens hematopoiéticas, como de CD31, CD34 e CD45 não foi detectada nessas células através de citometria de fluxo e imunofluorescência106. Alterações no perfil de expressão podem ser atribuídas ao tempo e número de passagens. Após duas ou mais sucessivas passagens em cultura, as características das moléculas de adesão, enzimas e receptores de superfície, matriz extracelular e proteínas do citoesqueleto, bem como proteínas associadas com o fenótipo das células-tronco, podem ser alteradas. No entanto, apesar das diferenças nos procedimentos de isolamento e cultura, o imunofenótipo de ASC é relativamente consistente entre diferentes estudos 93. Sucessivas passagens de ASC podem levar a elevados níveis de expressão de CD117 (c-kit), antígeno leucocitário humanoDR (human leukocyte antigen-DR – HLA-DR), bem como marcadores de células-tronco, como CD34. Ao mesmo tempo, níveis reduzidos de expressão de marcadores de células-tronco tais como CD13, CD29 (integrina β1), CD44 (hialuronato), CD63, CD73, CD90, CD105 (endoglina) e CD166 têm sido demonstrados. Além disso, ligeira presença de CD106 foi avaliada em culturas de ASC 107. Outro estudo mostrou que, após a terceira passagem, a expressão de OCT4, c-kit e CD34 em culturas de ASC é eliminada, enquanto a expressão de Sca-1 tem uma melhoria significativa. Essas células têm sido identificadas como positivas para CD29 e CD44, e negativas para expressão de CD45 e de CD3199. Finalmente, em adição aos marcadores de superfície mencionados acima, β-actina de músculo liso, fator de crescimento derivados

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de plaquetas (platelet-derived growth factor – PDGF), receptor-β e neuroglial proteoglicano 2 têm sido identificados em células-tronco derivadas de tecido adiposo99.

18.3.3.2 Células-tronco derivadas de sangue menstrual As células-tronco isoladas de sangue menstrual expressam marcadores típicos de células-tronco mesenquimais, CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105 (108), que também são expressos em outros tecidos, como medula óssea e tecido adiposo101. Entretanto, estas células não expressam STRO-1, CD31 (marcador de células epiteliais), CD34 (marcador de células-tronco hematopoiéticas e epiteliais), CD45 (marcador de leucócitos) ou HLA-DR101. Mais estudos demonstraram a expressão de outras proteínas superficiais nessa linhagem celular por citometria de fluxo, como CD9, CD41a, CD59 e a ausência de expressão de CD14, CD38 e CD133, além dos marcadores já descritos 104. É importante ressaltar que alguns autores também relataram a expressão de marcadores de pluripotência em MBSC, como fator de transcrição de ligação ao octâmero 4 (Oct4), antígeno específico do estágio embrionário 4 (stage specific embryonic antigen 4 – SSEA-4), Nanog e c-kit (CD117), em adição às proteínas de superfície104,109.

18.4 APLICAÇÃO CLÍNICA 18.4.1 Células-tronco derivadas do tecido adiposo No campo da medicina regenerativa, estudos de investigação básica e pré-clínicos foram conduzidos para superar as deficiências clínicas, com a utilização de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo. Utilizando essa atrativa população de células, as pesquisas têm explorado a segurança e eficácia da implantação de ASC em diferentes modelos animais. Da mesma forma, os dados pré-clínicos e ensaios clínicos em estudo com ASC foram iniciados em uma variedade de áreas médicas (Tabela 18.6). Sabe-se que as abordagens terapêuticas atuais para a perda de músculo não pode restaurar a função muscular efetivamente. Portanto, ASC podem ser induzidas a diferenciar-se em células do músculo esquelético e células de músculo liso in vitro, o que pode proporcionar uma fonte alternativa de

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células acessíveis e expansíveis para a terapia celular de desordens musculares. De fato, Di Rocco e colaboradores demonstraram que ASC também têm demonstrado capacidade para diferenciação miogênica in vivo 110. ASC alogênicas injetadas por via intravenosa ou diretamente no músculo afetado podem restaurar a função muscular em modelo de distrofia muscular murino sem quaisquer sinais de rejeição imunológica. Em outro estudo, a combinação de ASC induzidas para diferenciação miogênica e esferas injetáveis de ácido poli(láctico-co-glicólico) (poly(lactic-co-glycolic) acid – PLGA) ligadas às ASC induzidas a miogenicidade foram injetadas subcutaneamente nos pescoços de camundongos nude (camundongos imunodeficientes). Foi observada a formação de tecido muscular sob a pele de camundongos que receberam ASC induzidas à diferenciação miogênica ligadas ao PLGA, mas não naqueles que receberam apenas esperas de PLGA111. No entanto, ainda não está claro se ASC se diferenciam diretamente em linhagens celulares miogênicas ou se elas se tornam incorporadas às fibras musculares via fusão celular. De acordo com Di Rocco e colaboradores, é provável que ASC contenham diferentes subconjuntos de células capazes de qualquer outra função110. Aperfeiçoamento da capacidade de regeneração miogênica e muscular de células-tronco derivadas de tecido adiposo com expressão forçada de fator de diferenciação miogênica D (MyoD), através de transduções virais, foi também conseguido em camundongos112. ASC também podem formar células osteoides in vivo. Cultura de ASC com indução osteogênica dentro de suportes ou scaffolds atelocolágeno em forma de colmeia com membrana vedada (do inglês, atelocollagen honeycomb-shaped scaffold with a membrane seal – ACHMS), quando implantado por via subcutânea em camundongos nude, possuem alta capacidade de diferenciação em osteoblastos113. Dessa forma, ASC combinadas com diferentes tipos de biomateriais ou compostos biomiméticos foram empregues com sucesso em estudos in vivo para reparar defeitos ósseos críticos em modelos murinos e em coelhos 114-116. Além disso, ASC humanas geneticamente modificadas pela transferência adenoviral para superexpressão de proteína morfogenética óssea-2 (bone morphogenetic protein 2 – BMP-2, um fator osteoindutivo) poderiam induzir à formação óssea in vivo e curar um defeito crítico no tamanho femoral em ratos nudes 117. Estudos em curto prazo in vivo, usando ASC por um modelo de fusão vertebral intercorpo, também foram avaliados118. Recentemente, Uysal e Mizuno demonstraram que injeções tópicas de ASC no sítio da injúria acelera a reparação de tendão em coelhos, como apresentado por um aumento significativo na

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas

resistência à tração, diferenciação direta de ASC em tenócitos e células endoteliais, e aumento de fatores de crescimento angiogênicos119. ASC são promissoras candidatas para a regeneração do miocárdio, especialmente em contextos clínicos agudos. Estudos pré-clínicos em animais de grande porte indicam que as ASC podem ser uma potencial alternativa na terapia celular cardíaca, uma vez que elas são capazes de se diferenciar em células que apresentam fenótipos de cardiomiócitos ou de células endoteliais, e também expressam fatores de crescimento angiogênicos e fatores antiapoptóticos120. Assim, vários estudos in vivo mostraram que transplantes alogênicos e xenogênicos de ASC isoladas têm o potencial de melhorar a função cardíaca em experimentos com injúria miocardial induzida 121-129 (Tabela 18.6). Tabela 18.6 Aplicações clínicas: estudos in vivo V Células-tronco derivadas de tecido adiposo

CONDIÇÃO OU PATOLOGIA

ESPÉCIE

TIPO E VIA DE TRANSPLANTE

RESULTADOS

REFERÊNCIA

Distrofia muscular

Camundongos com isquemia nos membros posteriores (camundongos mdx)

Injeção intramuscular. Alogênico.

Incorporação de ASC em fibras musculares, com restauração significativa da expressão de distrofina em camundongos mdx.

Di Rocco et al., 2006110

Tecidos musculares recém-formados em ratos que receberam ASC ligadas a PLGA.

Kim et al., 2006111

Aumento no número de fibras derivadas de células hMADS.

Goudenege et al., 2009112

Foram observadas formação de tecido fibroso, vascularização, calcificações e alta rádio-opacidade.

Hattori et al., 2004113

Formação óssea avançada.

Di Bella et al., 2008114

Capacidade de regeneração óssea em defeitos esqueléticos de tamanho crítico.

Yoon et al., 2007115

Osteogênese em sítios ortotópicos com tamanho crítico.

Hao et al., 2010116

Indução da formação óssea in vivo e cicatrização de defeito femoral.

Peterson et al., 2005117

ASC são injetadas subcutaneamente. Autólogos. hASC são injetadas Camundongos intramuscularmente. RAG2-/-γC-/Xenogênico. Scaffolds ACHMS são transplantados Camundongos nude subcutaneamente. Xenogênico Scaffolds de ASC são enxertados Coelho na calota craniana. Autólogo ASC humanas osteoinduzidas em scaffold PLGA foram Ratos nude implantadas na calota craniana. Xenogênico. ASC encapsulados em gel de colágeno I com scaffolds Coelho PLGA-β-TCP foram implantadas em defeitos radiais. Autólogo. hASC geneticamente modificados Ratos nude em BMP-2 foram implantadas em defeitos femorais.

Regeneração muscular Camundongos nude Distrofia muscular Osteogênese Defeito de tamanho crítico do crânio Defeito crítico na calota craniana Defeito crítico no tamanho radial segmentar Defeito femoral

Injúria no tendão

Coelho

Infarto do miocárdio

Ratos nude

Infarto do miocárdio

Suíno

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Injeção tópica de ASC. ASC humanas intramiocárdicas foram injetadas. Xenogênico. Células foram injetadas intracoronariamente. Autólologo.

Aumento significativo na resistência à tração, diferenciação de ASC para tenócitos Uysal et al., e células endoteliais e aumento de 2011119 fatores de crescimento angiogênicos. ASC humanas preservaram a função do coração, aumentando a angiogênese local Cai et al., 2009121 e o brotamento do nervo cardíaco. Melhorias na função cardíaca e perfusão via angiogênese.

Valina et al., 2007126

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

V

CONDIÇÃO OU PATOLOGIA

ESPÉCIE

TIPO E VIA DE TRANSPLANTE

RESULTADOS

REFERÊNCIA

Infarto do miocárdio

Rato Lewis

Intramiocardial. Autólogo

Wang et al., 2009129

Infarto do miocárdio

Rato Lewis

Injeção na câmara ventricular esquerda de ratos GFP-ASC. Alogênico

Melhorias na função cardíaca de corações de ratos infartados. Dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo foi menos dilatada, a fração de ejeção e cardíaca foram significativamente melhoradas. As ASC foram capazes de promover a neovascularização no coração isquêmico

Schenke-Layland et al., 2009125

As ASC aumentaram a angiogênese.

Bel et al., 2010135

Recuperação funcional e mais redução de atrofia hemisférica.

Yang et al., 2011140

Uma significante melhora na regeneração da distância do nervo

di Summa et al., 2010141

Injeção intramiocardial GFP-ASC. Alogênico Área de infarto foi coberta com uma folha composta para Oclusão na artéria Macacos Rhesus abrigar tanto ASC quanto SSEA-1 coronária + progenitores cardíacos. Autólogo. Injeção intracerebral de ASC Isquemia cerebral Ratos neural induzidas em ratos. Alogênicos. ASC diferenciadas em células de Schwann foram implantadas em Injúria no nervo ciático Ratos Sprague-Dawley extremidades secionadas do nervo. Alogênico. Injúria na medula Injeção em sítios SCI. Cachorro espinhal aguda Alogênicos. Infarto do miocárdio

Camundongo C57B1/6 N

Injúria na medula espinhal

Ratos

Isquemia nos membros posteriores

Camundongos nude

Injúria aguda no fígado

Camundongos nude

Injúria no fígado e Ratos Sprague-Dawley hepatectomia parcial Diabetes mellitus do tipo I

Camundongos C57BL/6J

Deformidade no escleroderma linear “em golpe de sabre”

Humanos

Lipoatrofia facial

Humanos

Reconstrução da mama

Humanos

Síndrome de Treacher Collins

Humanos

Defeito ósseo craniano generalizado

Humanos

Grande defeito ósseo craniano

Humanos

Hemi-maxilectomia devido a um grande queratocisto

Humanos

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Injeção em sítios SCI. Alogênicos. Transplantação intramuscular de culturas de ASC humanos como esferoides. Xenogênico. Injeção na veia de hepatócitos derivados de ASC humanos. Xenogênico. As células foram injetadas via veia portal hepática ou veia dorsal do pênis. PDX-1-ASC transfectadas foram injetadas por veia cauda. Alogênico. Lipoinjeção facial em combinação com ASC. Autólogos. Lipoinjeção tópica em combinação com ASC. Autólogos. Lipoinjeção tópica em combinação com ASC. Autólogos. Enxerto ósseo esculpido. ASC, BMP-2 e enxertos de periósteo foram utilizados. Injeção local associada à cola de fibrina. Autólogo. Implantação de ASC semeadas em scaffold β-TCP. Autólogo. Implante de titânio gaiola cheia de ASC, β-TCP e de BMP-2. Autólogo.

Leobon et al., 2009123

Melhorias da função neurológica Ryu et al., 2009146 e diferenciação neural. Recuperação significativa de função dos Ohta et al., membros posteriores. Fatores neurotróficos 2008144 promoveram a recuperação funcional. Melhorias na sobrevivência celular, secreção de fator angiogênico, neovascularização e sobrevivência dos membros.

Bhang et al., 2011138

Incorporação no parênquima do fígado.

Banas et al., 2007148

As células diminuíram, no soro, os níveis de enzimas do fígado, como aminotransferase, aspartato aminotransferase, de alanina e albumina. PDX-1-ASC adquiriram fenótipo de células beta funcionais e função pancreática restaurada parcialmente in vivo. Melhoria da aparência. Substancial melhora no resultado considerando uma sessão de tratamento. Não houve diferença estatisticamente significativa na pontuação da melhora clínica em relação à lipoinjeção convencional. Melhoria no transplante de gordura com retenção de volume. A tomografia computadorizada demonstrou reconstrução óssea completa dos zigomas bilaterais. Nova formação óssea e recuperação da calvária próxima da completa após três meses da reconstrução.

Liang et al., 2009149 Kajiyama et al., 2010265 Karaaltin et al., 2012153 Yoshimura et al., 2008267 Yoshimura et al., 2008267 Taylor et al., 2010269 Lendeckel et al., 2004154

Não houve complicações, e o resultado foi satisfatório na ossificação.

Thesleff et al., 2011156

Integração de implantes ósseos, sem quaisquer efeitos adversos.

Mesimaki et al., 2009155

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V

CONDIÇÃO OU PATOLOGIA

ESPÉCIE

TIPO E VIA DE TRANSPLANTE

Osteonecrose da cabeça femoral

Humanos

Injeção local de ASC com cloreto de cálcio ativado, plasma rico em plaquetas e ácido hialurônico. Autólogos.

Humanos

Células foram injetadas intracoronariamente. Autólogo.

Melhora da função cardíaca, fração de ejeção e redução no tamanho do infarto no grupo tratado com ASC.

Duckers et al., 2010272

Humanos

Transendocardial. Autólogos.

Estudo em curso. Resultados não disponíveis

Duckers et al., 2010272

Humanos

Injeção tópica. Autólogas.

A cicatrização completa do epitélio corneano foi observada um mês após o transplante.

Agorogiannis et al., 2012159

Humanos

Injeção de fístulas enterocutâneas na parede do traçador associado à cola de fibrina. Injeções retovaginais e fístulas perianais na mucosa retal. Autólogo.

A proporção de pacientes que alcançaram a cura da fístula foi significativamente maior com ASC em comparação à cola de fibrina.

Garcia-Olmo et al., 2003160; Garcia-Olmo et al., 2005161; Garcia-Olmo et al., 2009162

Isquemia miocárdica aguda e comprometimento do ventrículo esquerdo Fase final da doença arterial coronária e disfunção ventricular esquerda grave Defeito do epitélio da córnea estéril persistente Fístulas crônicas na doença de Crohn

Células-tronco derivadas de sangue menstrual

Distrofia muscular Camundongos mdx-SCID de Duchenne

Infarto do miocárdio

Ratos nude F344

Esclerose múltipla

Humanos

Isquemia cerebral

Ratos Sprague-Dawle

Isquemia crítica do membro

Humano

RESULTADOS

REFERÊNCIA

Regeneração do tecido ósseo medular e Pak et al., 2012157 redução em longo prazo da dor no quadril.

Transplante de células derivadas do sangue menstrual humano melhorou a eficiência da regeneração muscular e Cui et al., 2007164 entrega da distrofina para os músculos em camundongos mdx distrófica-SCID. Cardiomiócitos derivados de As células são injetadas MMCs transplantados restauraram Hida et al., no miocárdio. significativamente a função cardíaca 2008165 Xenogênico. prejudicada, diminuindo a área de infarto do miocárdio no coração de ratos. A progressão da doença não ocorre As células são injetadas em pacientes tratados. Anormalidade, Zhong et al., intravenosa e intratecalmente. reações imunológicas ou efeitos 2009168 Alogênico. adversos associados aos tratamentos aplicados não foram evidenciados. As células são injetadas MBSC transplantadas reduziram Borlongan et intracerebral e intravenosamente. significativamente anomalias comportamentais, al., 2010167 Xenogênica. melhorando disfunções motoras e neurológicas. As células são injetadas intramuscularmente. Iniciando estudo clínico. NCT01558908 Alogênicas. As células são injetadas intramuscularmente. Xenogênico.

ACHMS = scaffolds atelocolágeno em forma de colmeia com membrana vedada (atelocollagen honeycomb-shaped scaffold); ASC = células-tronco derivadas de tecido adiposo (adipose derived stem cells); β-TCP = fosfato β-tricálcio (β-tricalcium phosphate); BMP-2 = proteína óssea morfogenética-2 (bone morphogenetic protein-2); camundongos mdx = camundongos com distrofia ligada ao X (mice with X-linked dystrophy); GFP = proteína fluorescente verde (green fluorescent protein); hMADS = células tronco multipotentes derivadas de tecido adiposo humano (human multipotent adipose-derived stem); MBSC = células-tronco do sangue menstrual (menstrual blood stem cells); MMCs = células mesenquimais derivadas de sangue menstrual (menstrual blood-derived mesenchymal cells); PDX-1 = homeobox pancreático-duodenal 1 (pancreatic-duodenal homeobox 1); PLGA = poli(ácido láctico-co-glicólico) (poly(lactic-co-glycolic acid)); RAG2 = gene ativador de recombinação 2 (recombination activating gene 2); SCI = lesão medula espinhal (spinal cord injury); SCID = imunodeficiência combinada severa (severe combined immunodeficiency); SSEA-1 = antígeno específico do estágio embrionário-1 (anti-stage-specific embryonic antigen-1).

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ASC humanas podem espontaneamente se diferenciar em cardiomiócitos in vitro, em que o fator de crescimento endotelial vascular (do inglês, vascular endothelial growth factor – VEGF) desempenha um papel fundamental na indução da diferenciação. Essas células expressam marcadores específicos cardíacos, troponina-I, miosina de cadeia leve 2, e apresentam contrações espontâneas130-132. No entanto, a diferenciação in vivo de ASC humanas em cardiomiócitos ainda é incerta. Cai e colaboradores descobriram que as ASC humanas injetadas intramiocardialmente em ratos se diferenciam em células do músculo liso, mas não em cardiomiócitos 121. Observações semelhantes foram publicadas por Rigol e colaboradores133. Controversamente, Bai e colaboradores observaram que ASC humanas frescas e em cultura quando injetadas na região perienfarte do miocárdio de camundongos com imunodeficiência combinada severa (severe combined immunodeficiency – SCID) induzidos ao enfarte resultaram em significante função miocardial 134. A densidade vascular foi significativamente aumentada, e poucas células apoptóticas estavam presentes na região da injeção de células. Ensaios de imunofluorescência também revelaram que ASC humanas transplantadas sofreram diferenciação cardiomiogênica. Enquanto a maioria dos estudos tem transplantado ASC por injeção direta no tecido miocárdico, pesquisadores continuam a explorar o uso de entrega epicárdica através de folhas de células sem scaffolds. As vantagens dessas folhas de células é a ausência de material estranho, a preservação da coesividade celular, bem como a possibilidade de incorporação de diferentes populações de células135,136. Vários tipos de correções à base de folhas celulares têm melhorado a função do coração danificado em ratos, cães e modelos suínos 137. Em estudos com macacos Rhesus, folhas de ASC autólogas proveram uma matriz para a entrega de células-tronco embrionárias alogênicas de Rhesus que foram diferenciadas ao longo da linhagem cardiomiogênica. Um total de dois meses após o enfarte do miocárdio (myocardial infarction – MI), a presença das ASC havia melhorado a angiogênese. Esse estudo confirmou a segurança da combinação de células-tronco embrionárias e ASC135. Além disso, muitos ensaios clínicos de terapia através da injeção de células ASC foram realizados, e os aspectos controversos quanto à sua propriedade serão resolvidos nos próximos anos, à medida que mais dados forem disponibilizados. O potencial de células derivadas de tecido adiposo para tratar acidentes vasculares cerebrais (AVC) ou isquemia dos membros posteriores foi investigado em vários modelos. Transplante de ASC humanas cultivadas como esferoides e precondicionadas sob condições hipóxicas foram encontradas

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em melhorar a recuperação de isquemia dos membros posteriores em modelos murinos 138. Estudos adicionais têm determinado que ASC expostas à isquemia ou hipóxia secretam citocinas que podem melhorar a proliferação celular e vasculogênese diretamente, sem a presença das próprias ASC 139. Finalmente, estudos recentes têm avaliado a eficácia de ASC autólogas em um modelo de isquemia cerebral em ratos140. Quando as ASC foram induzidas à diferenciação neuronal após transplante, os ratos exibiram melhoras na recuperação neurológica e redução do tamanho do AVC em relação aos controles140. O emprego de ASC está se expandindo tanto para linhagens ectodermais quanto endodermais. Um estudo testando os efeitos de ASC, no qual as células foram diferenciadas em um fenótipo similar às células de Schwann, sobre a cicatrização de nervos periféricos, foi descrito por Di Suma e colaboradores141. Contudo, mais dados experimentais devem ser obtidos utilizando modelos animais de grande porte para que esses métodos possam ser testados de forma segura clinicamente. ASC podem ser usadas não só em lesões dos nervos periféricos, mas também em lesões do sistema nervoso central 142-146. Ryu e colaboradores demonstraram a recuperação funcional e diferenciação neural após o transplante alogênico de ASC em modelo canino de lesão medular aguda146. Avaliações imuno-histoquímicas indicaram que as ASC implantadas diferenciaram-se em astrócitos e oligodendrócitos, assim como em células neuronais. Em outro estudo, as ASC foram usadas em lesões da medula espinhal em ratos após a diferenciação in vitro em células de Schwann144. Eles especulam que fatores neurotróficos derivados das células enxertadas podem ter contribuído para a promoção da recuperação funcional. Em resumo, tem sido bem estabelecido que ASC podem sobreviver no sistema nervoso após injeção e promover a cicatrização de nervos ou por uma diferenciação direta ou através da secreção de uma série de fatores parácrinos. Assim, ASC mostraramse promissoras para o tratamento de injúrias no sistema nervoso central e injúrias relacionadas a lesões nos nervos periféricos em um futuro próximo. A medicina regenerativa também é uma promessa para o desenvolvimento de terapia baseada em células-tronco para o fígado. De fato, a indução in vitro de diferenciação de ASC pode conduzir à realização de células modificadas semelhantes aos hepatócitos, os quais apresentam vários marcadores específicos de fígado e funções relacionadas, tais como a produção de albumina, lipoproteína de baixa absorção e desintoxicação de amoníaco147. Mais importante, hepatócitos derivados de ASC, após o transplante, foram capazes de se incorporar ao parênquima do fígado de camundongos receptores 148.

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A reparação de lesões hepáticas também pode ser possível com o transplante de ASC de ratos, diminuindo os níveis de enzimas-chaves do fígado e aumentando a albumina do soro149. Um tema ainda controverso, discutido em uma revisão recente96, é a existência de células-tronco hepáticas. Mesmo a diabetes pode ser tratada por terapia com ASC. A transferência de ASC murinas reduziu a hiperglicemia em camundongos diabéticos150,151. Tendo como base pesquisas in vitro e in vivo em diferentes animais, o emprego de ASC em humanos teve abordagens diferentes em vários ensaios clínicos (Tabela 18.6). Além disso, a reconstrução de mama e aumento de ensaios têm sido relatados por Yoshimura e colaboradores 151. As células-tronco derivadas de tecido adiposo autólogas foram usadas em combinação com lipoinjeção em mais de cinquenta pacientes. Os resultados não mostraram nenhuma evidência de fibrose ou de adesão, nem melhoramento de enxerto de gordura por células da fração vascular do estroma (stromal vascular fraction – SVF) com retenção do volume de mais de doze meses. Além disso, um estudo clínico foi conduzido para a lipoatrofia facial usando a mesma técnica152. Os autores observaram melhoramento no contorno facial, embora não tenha havido diferença estatisticamente significativa na pontuação de melhora clínica em relação à lipoinjeção convencional. Recentemente, Karaaltin e colaboradores introduziram a aplicação de uma terapia com ASC bem-sucedida para uma deformidade linear escleroderma “em golpe de sabre”153. Pacientes com 1 ano de tratamento apresentaram melhora na aparência que exigia uma sessão refinada de enxerto de gordura autóloga, e a técnica de regeneração por enxerto de células de gordura autóloga proporcionou um melhoramento substancial do resultado em uma sessão de tratamento153. Além disso, existem algumas experiências clínicas com reconstrução óssea utilizando ASC expandidas. Recentemente, a restauração de grandes defeitos em ossos humanos utilizando ASC já foi relatada 154-156. Defeito ósseo craniano generalizado foi reparado com sucesso após o transplante autólogo de SVF em combinação com cola de fibrina154. Implantação de cultura autóloga de ASC com beta tricálcio-fosfato granulado (β-TCP) também foi relatada em quatro pacientes que tiveram grandes defeitos na calota craniana de diferentes etiologias. Três meses após a operação, a tomografia computadorizada revelou resultado satisfatório de ossificação156. Mesimaki e colaboradores publicaram um relato de caso clínico de engenharia de tecido ósseo pré-fabricado utilizando cultura de ASC autólogas com β-TCP e BMP-2, que resultou no sucesso da reconstrução maxilar após transplante de retalho ósseo em um paciente submetido a uma hemimaxilectomia155. Uma pesquisa

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de dois casos clínicos também demonstrou que o tratamento utilizando ASC, em associação com plasma rico em plaquetas ativadas por cloreto de cálcio e ácido hialurônico, leva à regeneração do tecido ósseo medular e redução, em longo prazo, da dor no quadril em pacientes com osteonecrose da cabeça femoral157. Além disso, as ASC são a grande promessa para o tratamento de doenças cardiovasculares humanas. Atualmente, têm sido relatados ensaios clínicos em curso utilizando ASC para o tratamento cardiovascular. O primeiro ensaio clínico foi realizado em 36 pacientes com estágio final da doença arterial coronária não passível de revascularização e com moderada a grave disfunção do ventrículo esquerdo (VE) para receber ASC recém-isoladas via transendocárdia. O segundo ensaio clínico é um estudo com o objetivo de investigar o efeito de ASC em 48 pacientes com isquemia miocárdica aguda e fração de ejeção de VE danificada, após o reparo adequado da artéria relacionada ao infarto com implante de stent. Neste estudo, ASC recém-isoladas são entregues através de uma infusão intracoronária dentro de 36 horas após o início de um ataque cardíaco. Os resultados de catorze pacientes mostram que as ASC foram capazes de melhorar a função cardíaca dos pacientes com isquemia. Aos seis meses, foi observado a melhoria da fração de ejeção do VE e da redução da dimensão do enfarte do grupo tratado com ASC158. Agora, um estudo Advance na fase II/III foi iniciado para avaliar a sua eficácia*. Uma série de questões, tais como tipo e número adequado de células, tempo e via de entrega celular e o mecanismo de ação detalhado devem ser otimizados para resultados clínicos mais consistentes130. Em um aspecto diferente, recentemente, Agorogiannis e colaboradores, em um relato de caso apresentando um paciente com defeito epitelial corneano estéril pós-traumático tratado com aplicação tópica de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo autólogo159, observaram a progressão da cicatrização do epitélio da córnea iniciada onze dias após a aplicação tópica de ASC autólogas. Um mês depois, foi observada uma cicatrização completa do epitélio corneano159. ASC foram também usadas para curar fístulas crônicas na doença de Crohn160,161. Essa doença é uma desordem inflamatória intestinal caracterizada por sangue nas fezes, diarreia, perda de peso e sintomas autoimune-relacionados. Em um ensaio de fase I em pacientes com fístulas que não respondem ao tratamento padrão, ASC cultivadas foram diretamente injetadas na mucosa retal, e 75% dos casos foram curados completamente. Num ensaio *

Website governamental dos Estados Unidos mantido pela Biblioteca Nacional de Medicina do National Institute of Health (NIH).Ver http://www.clinicaltrials.org/NCT01216995/.

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de fase IIb, a proporção de pacientes que atingiram a cicatrização da fístula foi significativamente maior com ASC do que com apenas cola de fibrina162. Embora uma revisão publicada por Locke e colaboradores tenha enfatizado que a literatura revelou uma considerável incerteza sobre o verdadeiro potencial clínico de células-tronco derivadas de tecido adiposo 163, vários ensaios clínicos estão sendo repassados aos pacientes em todo o mundo 107. Uma pesquisa realizada no website clinicaltrials, com o termo de busca “terapia de células-tronco adiposo”, realizada em junho de 2013, revelou oitenta estudos abertos baseados em terapia com células-tronco derivadas de tecido adiposo, amplamente distribuídos em vários campos da medicina e da saúde, o que demonstra a evolução rápida e a expansão do uso clínico de células-tronco derivadas de tecido adiposo (Tabela S1).

18.4.2 Células-tronco derivadas de sangue menstrual Como mencionado anteriormente, células-tronco derivadas do sangue menstrual são rapidamente expandidas e diferenciadas sob condições de laboratório. Essas células multipotentes têm a capacidade de se diferenciar em várias células funcionais, incluindo cardiomiócitos, epitélio respiratório, células neuronais, miócitos, células endoteliais, pancreáticas, hepatócitos, células adiposas e osteócitos 104. Consequentemente, vários estudos recentes têm explorado o potencial regenerativo in vivo de MBSC para tratar uma série de doenças (Tabela 18.6). A distrofia muscular de Duchenne (DMD), a mais comum doença genética letal em crianças, é uma doença muscular recessiva ligada ao cromossomo X, caracterizada pela ausência de distrofina no sarcolema das fibras musculares. Cui e colaboradores investigaram células derivadas de sangue menstrual para determinar se, principalmente, essas células não diferenciadas e cultivadas seriam capazes de reparar a degeneração muscular em um modelo murino com distrofia ligada ao X (mdx) de DMD164. Transplante de células derivadas de sangue menstrual diretamente em músculos distróficos de camundongos imunodeficientes mdx restauraram a expressão sarcolemal de distrofina. Eles também demonstraram que as células derivadas de sangue menstrual podem transferir distrofina em miócitos distrofinados através da fusão celular e transdiferenciação. Hida e colaboradores demonstraram que a terapia com células-tronco extraídas de sangue menstrual pode ajudar a reparar tecidos danificados. Notavelmente, MBSC parecem ser um novo potencial, fonte facilmente

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acessível de material para a terapia cardíaca baseada em células-tronco. Após a indução de diferenciação dessas células, observou-se que elas apresentam um potencial cardiomiogênico maior do que as já avaliadas células da medula óssea. Além disso, após o transplante, cardiomiócitos derivados de MBSC restauraram significativamente a função cardíaca prejudicada, diminuindo a área de infarto do miocárdio (Myocardial Infarction – MI) em um modelo de ratos nude. Ainda, cardiomiócitos transplantados podem ser observados in vivo na área de MI165 (Tabela 18.6). Em um estudo posterior, do mesmo grupo, Ikegami e colaboradores alegaram que estabeleceram um ensaio in vitro de transdiferenciação cardiomiogênica livre de soro fetal bovino 166. Eles confirmaram que a eficiência da indução foi significativamente melhorada e foi, surpreendentemente, aumentado o nível de diferenciação comparado ao meio contendo soro para gerar cardiomiócitos derivados de MBSC165. A fim de testar o potencial terapêutico de células-tronco derivadas de sangue menstrual, Borlongan e colaboradores utilizaram o modelo de acidente vascular cerebral in vitro de privação de oxigênio e glicose (oxygen glicose deprivation – OGD) e descobriram que os neurônios primários de ratos expostos à OGD, que foram cocultivados com células-tronco derivadas de sangue menstrual ou expostos aos meios coletados de cultura de sangue menstrual, exibiram redução significativa de morte de células 167. Fatores tróficos, tais como VEGF, fator neurotrófico derivado do cérebro (brain-derived neuropathic factor – BDNF) e neurotrofina-3 (neurotrophin-3 – NT-3), foram regulados positivamente em meios de cultura expostas à OGD de células-tronco derivados de sangue menstrual. Além disso, o transplante de células-tronco derivadas de sangue menstrual seja por via intravenosa ou por via intracerebral e sem imunossupressão, em acidente vascular cerebral isquêmico induzido experimentalmente em ratos adultos, também reduziu significativamente as deficiências comportamentais e histológicas em comparação com veículos infundidos em ratos. Por conseguinte, esses benefícios neuroestruturais e comportamentais conferidos por células derivadas de sangue menstrual transplantadas, apoiam a sua utilização como uma fonte de células-tronco para terapia celular em acidentes cerebrovasculares (Tabela 18.6). Embora estudos in vivo em seres humanos estejam em uma fase preliminar, as células regenerativas derivadas de sangue menstrual foram testadas em quatro pacientes diagnosticados com esclerose múltipla, através de injeção intravenosa e intratecal de células endometriais alogênicas. Nesta pesquisa, o caso com mais longo acompanhamento (mais de um ano) não revelou reações imunológicas ou efeitos adversos associados ao tratamento,

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sugerindo a viabilidade de administração da célula regenerativa endometrial clínica e apoiando novos estudos com este novo tipo de células-tronco168. Neste contexto, a fase em curso I/II do ensaio clínico investiga a segurança e a viabilidade do uso de células endometriais regenerativas, derivadas de sangue menstrual, em pacientes com isquemia crítica do membro que não são elegíveis para cirurgias ou intervenções à base de cateter. A hipótese é que a administração de células regenerativas do endométrio será bem tolerada e, possivelmente, produzirá um benefício terapêutico*. Muito ainda precisa ser feito e investigado para identificar plenamente a superioridade de MBSC para a pesquisa básica e aplicações clínicas (Tabela 18.6).

18.4.3 Células-tronco derivadas do tecido extraembrionário A principal fonte de estudo de células-tronco adultas são as células mesenquimais da medula óssea. Contudo, esse estudo apresenta algumas limitações. A aspiração das células-tronco da medula óssea é um procedimento invasivo e que causa desconforto ao doador, além do fato de o potencial dessas células diminuir com a idade169 e a quantidade dessas células na medula adulta ser reduzida5,170,171. Uma fonte alternativa, livre dessas limitações e também de questões éticas, seria a placenta. Este tecido é de fácil acesso e de baixo custo, pois é descartado após o parto, e origina célulastronco mesenquimais semelhantes às da medula óssea, com capacidade de se expandir e expressar propriedades funcionais172. A placenta possui três camadas: a decídua, de origem materna, e o córion e o âmnion, de origem fetal173. Devido à complexidade da placenta, foi necessário um critério mínimo para definir suas células mesenquimais. Foram propostos cinco pontos: (1) deve ser de origem fetal, com uma contaminação materna de menos de 1%; (2) deve aderir à superfície plástica; (3) deve produzir unidades de colônias formadoras de fibroblastos; (4) de se diferenciar em um ou mais tipos de linhagem; (5) deve possuir um padrão de marcadores de superfície CD90, CD73, CD105, CD45, CD34, CD14 e HLA-DR174,175. Da placenta fetal é possível isolar as seguintes células de humanos: células amnióticas mesenquimais, células amnióticas epiteliais, células coriônicas mesenquimais e células coriônicas trofoblásticas175. Há vários protocolos para isolamento dessas células, como apresentado pelas Tabelas 18.7 a 18.10. *

Ver www.clinicaltrials.gov, identificador NCT01558908.

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Outra fonte atrativa de células-tronco mesenquimais é o líquido amniótico176. Esse líquido encontra-se na cavidade amniótica, possui uma constituição aquosa e coloração clara, permite a troca de produtos químicos com a mãe, funciona como amortecedor de impactos protegendo o feto de lesões graves, além de possibilitar a movimentação e o crescimento livre do feto no interior da cavidade177. Até por volta da década de 1990, ainda não tinham sido relatadas células capazes de se proliferar e se diferenciar no líquido amniótico. No trabalho de Torricelli e Brizzi178 utilizando líquido amniótico antes de doze semanas, foi constatada a presença de células progenitoras hematopoiéticas, enquanto o estudo de Streubel, Martucci-Ivessa179 também provou a existência de precursores não hematopoiéticos, quando diferenciou as células do líquido em miócitos. Esses resultados sugerem uma fonte alternativa para aplicações terapêuticas180. As células provenientes do líquido amniótico podem ser uma esperança maior na medicina regenerativa, devido à maior facilidade de acesso em comparação com outros tecidos extraembrionários. Duas populações têm sido isoladas até agora: células-tronco mesenquimais do líquido amniótico e células-tronco do líquido amniótico 180. Para isolar tais células, os protocolos utilizam basicamente a centrifugação das amostras e ressuspensão dos pellets em meio contendo soro fetal e antibióticos, com posterior análise do potencial adipogênico e osteogênico, como descrito nos trabalhos de In’t Anker e Scherjon176; Cananzi e Atala180; You e Cai181. O perfil de antígenos de superfície das células tem sido determinado nos trabalhos por meio de citometria de fluxo. As células-tronco do líquido amniótico expressam marcadores tais como SSEA-4, CD73, CD90, CD105, CD29, CD44, MHC-I e são negativas para CD14, CD34, CD45, CD133, CD31, MHC-II 180,182,183 . Já as células-tronco mesenquimais do líquido amniótico são positivas para CD90, CD73, CD105, CD166, CD29, CD44, CD49e, CD54 e MHC-I e negativas para CD45, CD34, CD14, CD133 e CD31 176,180,184,185. A Tabela 18.10 apresenta protocolos de isolamento, cultura e indução de células-tronco do líquido amniótico.

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

Tabela 18.7 Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco epiteliais humanas do âmnion (Human Amnion Epithelial Cells - hAECs) PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

CARACTERIZAÇÃO

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

REFERÊNCIAS

Condrogênica: DMEM-H, FBS, insulina, TGF-b1 e ácido ascórbico fresco. Osteogênica: DMEM-H, FBS, ácido ascórbico, β-glicerofosfato, Marcadores de superfície celular positivos: Tratamento com dispase II, 1α25-hidroxivitamina D3 e dexametasona. CD166,CD105, CD90, CD73, CD49e, cultivação em meio DMEM Adipogênica: DMEM-H/FBS/dexametasona/ Portmann-Lanz CD44, HLA-ABC, CD29 e CD13. (glutamina, glicose concentrada, IBMX/ indometacina e insulina. et al., 2006279 Marcadores de superfície celular negativos: soro fetal bovino inativado) Miogênica: DMEM-H/FBS/hidrocortisona/ CD14, CD34, CD45 e MHC II. dexametasona e soro de cavalo. Neurogênica: DMEM-H/FBS e todos os ácidos retinoicos trans.

A camada de âmnion foi lavada Marcadores de superfície celular positivos: com HBSS e incubada com SSEA-4, TRA1-81, SSEA-3 e TRA1-60. tripsina contendo EDTA4Na. Marcadores de superfície celular negativos: As células digeridas foram SSEA-1 e CD34 lavadas com HBSS.

Cardiomiogênica: DMEM, FBS, 2-mercaptoetanol, piruvato de sódio e AsAP. Neurogênica: DMEM, FBS, 2-mercaptoetanol, piruvato de sódio, todos os ácidos retinoicos trans, e FGF-4. Pancreática: DMEM, FBS, 2-mercaptoetanol, piruvato de sódio e nicotinamida em placas revestidas de colágeno tipo I. Hepática: DMEM, FBS, 2-mercaptoetanol, piruvato de sódio, dexametasona, insulina e 1-fenobarbital em placas revestidas de colágeno tipo I.

Miki et al., 2005173

AsAP = ácido ascórbico 2-fosfato (ascorbic acid 2-phosphate); CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); DMEM = meio Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s medium); DMEM-H = meio Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s medium-high); EDTA4Na = tetrasodium ethylenediaminetetraacetic acid; FBS = soro fetal bovino (fetal bovine serum); HBSS = solução salina balanceada de Hank (Hanks’ balanced salt solution); HLA = antígeno leucocitário humano (human leukocyte antigen); IBMX = isobutil-metilxantina (isobutyl-methylxanthine); MHC = complexo principal de histocompatibilidade (major histocompatibility complex); SSEA-1 = antígeno específico do estágio embrionário-1 (anti-stage-specific embryonic antigen-1); SSEA-3 = antígeno específico do estágio embrionário-3 (stage-specific embryonic antigen-3); SSEA-4 = antígeno específico do estágio embrionário-4 (stage-specific embryonic antigen-4); TGF = fator de crescimento de transformação (transforming growth factor); TRA1-60 = tumor rejection antigen1-60; TRA181 = tumor rejection antigen 1-81.

18.4.3.1 Aplicações terapêuticas das célulastronco derivadas do tecido extraembrionário Com base nas características apresentadas acima das células-tronco adultas, pode-se sugerir que essas células seriam uma alternativa para aplicações terapêuticas. A situação real sobre a terapia regenerativa pode ser analisada no trabalho de Helmy e Patel 186, que demonstra o uso de transplante de células-tronco mesenquimais em 101 casos. A terapia pode ser por transplante autólogo ou alogênico através de infusão local ou sistêmica187 e apresenta sucesso quando certos critérios são obedecidos: a célula deve sobreviver no hospedeiro após o transplante, integrar-se ao tecido que necessita de reparação, realizar função adequada, não sofrer reação de enxerto, ter

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas

Tabela 18.8 Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas derivadas da membrana amniótica (Human Amniotic Membrane-derived Mesenchymal Stem Cells - hAMCs) PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

CARACTERIZAÇÃO

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

REFERÊNCIAS

Marcadores de superfície Condrogênica: DMEM-H, FBS, insulina, TGF-b1 e ácido ascórbico fresco. celular positivos: Osteogênica: DMEM-H, FBS, ácido ascórbico, β-glicerofosfato, CD13, CD49e, CD90, CD105, 1α25-hidroxivitamina D3 e dexametasona. CD73, CD29, CD44, e CD166. Adipogênica: DMEM-H/FBS/dexametasona/IBMX/ indometacina e insulina. Marcadores de superfície Miogênica: DMEM-H/FBS/hidrocortisona/dexametasona e soro de cavalo. celular negativos: Neurogênica: DMEM-H/FBS e os todos ácidos retinoicos trans. CD34, CD45 ou CD14.

Portmann-Lanz et al., 2006279

Condrogênica: DMEM contendo L-AsAP, dexametasona, insulina, As células foram digeridas piruvato de sódio, transferrina, ácido selenoso, ácido linolênico, Marcadores de superfície com solução de tripsina-EDTA, BSA, prolina e fator de crescimento transformante-3. celular positivos: solução de colagenase IV Osteogênica: DMEM contendo FBS, dexametasona, CD166, SH3, SH4, (anti-CD73), e DNase I em DMEM. O glicerofosfato e ácido ascórbico. CD44, CD29 e SH2 (anti-CD105) sobrenadante foi neutralizado Adipogênica: DMEM suplementado com FBS, Marcadores de superfície com FBS, centrifugado e dexametasona, indometacina, insulina e IBMX. celular negativos: resuspendido em DMEM, FBS, Miogênica: DMEM suplementado com FBS, dexametasona, βFGF, MCDB-201, CD34, CD45 e CD14 penicilina e estreptomicina. ITSLA, BSA, fator de crescimento semelhante à insulina I, AsAP e VEGF. Angiogênica: DMEM com FBS e VEGF.

Alviano et al., 2007280

As células foram digeridas com colagenase 2 e adicionadas em meio minimum essential alpha (α-MEM, FBS).

α-MEM = meio Eagle α-modificado (α-modified Eagle’s medium); AsAP = ácido ascórbico 2-fosfato (ascorbic acid 2-phosphate); BSA = albumina de soro bovino (bovine serum albumin); CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); DMEM = meio Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s medium); DMEM-H = meio Eagle modificado por Dulbecco, alto (Dulbecco’s modified Eagle’s medium high); FBS = soro fetal bovino (fetal bovine serum); βFGF = fator de crescimento fibroblástico (fibroblast growth fator); IBMX = isobutil-metilxantina (isobutyl-methylxanthine); ITSLA = insulina, transferrina, selênio e ácido linoleico (insulin, transferrin, selenium and linoleic acid); L-AsAP = L-ácido ascórbico 2-fosfato (ascorbic acid 2-phosphate); MCDB-201 = meio desenvolvido biologicamente com modificações moleculares e celulares (molecular, cellular, and developmental biology medium); TGF-β1 = fator de crescimento de transformação (transforming growth factor); SH2 = domínio de homologia Src 2 (Src homology 2 domain); SH3 = Src homology 3 domain; SH4 = domínio de homologia Src 4 (Src homology 4 domain); VEGF = fator de crescimento endotelial vascular (vascular endothelial growth factor).

potencial de proliferação suficiente para reparar o tecido e diferenciar-se na célula específica188. Porém, recentemente se tem mencionado o papel das moléculas biologicamente ativas produzidas pelas células-tronco mesenquimais sobre as células-alvo, mudando assim o paradigma da necessidade de diferenciação das células-tronco em células tecido-específicas189. Os autores de estudos envolvendo a doença de Parkinson e células-tronco amnióticas epiteliais humanas acreditam que os efeitos benéficos observados estão, provavelmente, mais relacionados a essas moléculas do que à diferenciação em células neurogênicas190. Em Meirelles e Fontes 191, pode-se verificar exemplos dessas moléculas ativas e a divisão dos seus efeitos parácrinos em quimioatrativos,

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imunomoduladores, antiformadores de cicatrizes e tróficos, sendo este último efeito subdividido por mecanismos que impedem a morte da célula ou induzem a proliferação e diferenciação da célula precursora, além do efeito angiogênico. Como se acreditava que a diferenciação das células seria necessária para a aplicação in vivo, diversos autores testaram células-tronco derivadas da placenta in vitro sob condições particulares de cultura e constataram a expressão de marcadores neuronais e gliais nessas células173,192. Estudos com ratos não imunossuprimidos constituem prova significativa de recuperação funcional da doença de Parkinson, como se observa nos trabalhos de Kakishita e Elwan193, Okawa e Okuda194. Células-tronco amnióticas epiteliais humanas apresentam genes e funções hepáticas, sendo necessário, para ser utilizado como fonte de células, um método eficaz e capaz de induzir a diferenciação em células hepáticas 175. Mutações nesses genes podem provocar doenças metabólicas; assim, hepatócitos derivados de células-tronco amnióticas epiteliais humanas podem ser uma terapia eficaz, já que essas células expressam os genes ausentes no fígado doente 175. Essa terapia pode ser comprovada em trabalhos com fibrose hepática e fibrose biliar 195,196. Para uma melhor compreensão, nas Tabelas 18.11, 18.12 e 18.13 são demonstrados estudos clínicos em doenças cardíacas, neurológicas e hepáticas envolvendo as células-tronco mesenquimais de placenta e líquido amniótico. Tabela 18.9 Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas do córion (Chorionic Plate-derived Mesenchymal Stem Cells - CP-MSC) PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

CARACTERIZAÇÃO

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

REFERÊNCIAS

Córion foi degradado com Marcadores de superfície Condrogênica: DMEM-H, insulina, FBS, ácido ascórbico fresco e TGF-b1; colagenase 2 após remoção celular positivos: Osteogênica: DMEM-H, FBS, ácido ascórbico, 1α25mecânica e enzimática CD13, CD49e, CD90, CD105, hidroxivitamina D3, β-glicerofosfato e dexametasona; Portmann-Lanz (dispase II) das camadas. CD73, CD29, CD44 e CD166. Adipogênica;DMEM-H/FBS/dexametasona/indometacina/insulina/IBMX; et al., 2006279 Células tronco mesenquimais Marcadores de superfície Miogênica: DMEM-H/FBS/hidrocortisona/dexametasona e soro de cavalo foram adicionadas em celular negativos: Neurogênica: DMEM-H/FBS e todos ácidos retinóicos trans; α-MEM/20% FBS. CD34, CD45 ou CD14. As células foram lavadas em PBS, digeridas em solução de tripsina-EDTA/ colagenase I e filtradas. Em seguida, foram centrifugadas, ressuspendidas em α-MEM e cultivadas em frascos.

Marcadores de superfície celular positivos: CD105, CD90 e CD73. Marcadores de superfície celular negativos: CD45, CD11b, CD79a, CD34 e HLADR.

Condrogênica: meio basal de diferenciação condrogênica contendo ácido ascórbico-2-fosfato e TGF-β1. Osteogênica: meio basal de diferenciação osteogênica contendo ácido ascórbico-2-fosfato, dexametasona e proteína morfogenética óssea recombinante humana.

Koo et al., 2012281

α-MEM = meio Eagle α-modificado (α-modified Eagle’s medium); CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); DMEM-H = Dulbecco’s modified Eagle’s medium high; EDTA = ácido etilenodiaminotetracético (ethylenediaminetetraacetic acid); FBS = soro fetal

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas

bovino (fetal bovine serum); HLA = antígeno leucocitário humano (human leukocyte antigen); IBMX = isobutil-metilxantina (isobutyl-methylxanthine); PBS = solução salina tamponada com fosfato (phosphate buffered saline); TGF = fator de crescimento de transformação (transforming growth factor).

Tabela 18.10 Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais humanas do líquido amnióico (human Amniotic Fluid Mesenchymal Stem Cell - AF-MSC) PROTOCOLO DE ISOLAMENTO

Amostras de células do líquido amniótico foram cultivadas em meio DMEM ou Amniomax. Em seguida, elas foram destacadas utilizando solução de tripsina/ EDTA e cultivadas com meio Chang suplementado com Chang B e Chang C.

CARACTERIZAÇÃO

PROTOCOLO DE DIFERENCIAÇÃO

Adipogênica: DMEM pobre em glicose, FBS, dexametasona, insulina, indometacina e 3-isobutil-1-metilxantina. Miogênica: placas de plástico revestidas com matrigel, DMEM, soro de cavalo, extrato de embrião de galinha e penicilina/estreptomicina. Em seguida adicionar 5-aza2’-desoxicitidina ao meio de cultura por 24 horas. Osteogênica: meio DMEM pobre em glicose, Marcadores de superfície FBS, penicilina/estreptomicina, dexametasona, celular positivos: β-glicerofosfato e ácido ascórbico-2-fosfato. c-kit, Oct4, SSEA-4, CD29, CD44, Endotelial: placas revestidas com gelatina, meio basal CD73, CD90, CD105, MHC Classe I endotelial e bFGF adicionado a cultura por dois dias. (HLA-ABC) e alguns foram fracamente Hepática: placas revestidas com matrigel, positivos para MHC Classe II (HLA-DR). DMEM, FBS, monotioglicerol, HGF, oncostatina Marcadores de superfície M, dexametasona, FGF4 e 1 x ITS. celular negativos: Neurogênica: Etapa 1 – Processo de diferenciação CD45, CD34 e CD133. para células semelhantes a neurônio: DMEM pobre em glicose, penicilina/estreptomicina, DMSO, hidroxianisol butilado e NGF. Após dois dias, o meio foi substituído por meio Chang suplementado apenas com NGF. Etapa 2 – Processo de diferenciação para células dopaminérgicas específicas: placas revestidas com fibronectina, DMEM/F12, plus 1xN2 e bFGF.

REFERÊNCIAS

Perin et al., 2008282

CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); DMEM = Dulbecco’s modified Eagle’s medium; DMEM/F12 = meio Eagle modificado por Dulbecco/mistura nutriente F12 (Dulbecco’s modified eagle medium/nutrient mixture F12); DMSO = dimetilsulfóxido (dimethyl sulfoxide); EDTA = ácido etilenodiaminotetracético (ethylenediaminetetraacetic acid); FBS = soro fetal bovino (fetal bovine serum); FGF = fator de crescimento fibroblástico (fibroblastic growth factor); HGF = hepatocytes growth fator; HLA = antígeno leucocitário humano (human leukocyte antigen); ITS = insulina-transferrina-selênio (insulin-transferrin-selenium); MHC = complexo principal de histocompatibilidade (major histocompatibility complex); NGF = neurogenic growth factor; Oct4 = fator de transcrição de ligação ao octâmero 4 (octamer-binding transcription factor 4); plus 1xN2 = N-2 Supplement; SSEA-4 = antígeno específico do estágio embrionário-4 (stage-specific embryonic antigen-4).

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

Tabela 18.11 Aplicações clínicas em doenças hepáticas TIPO DE CÉLULA

MODELO DE ANIMAL VIA DE APLICAÇÃO DAS CÉLULAS

RESULTADOS

REFERÊNCIAS

Células-tronco epiteliais humanas do âmnion (hAECs)

Células foram injetadas Redução no soro da transaminase alanina; redução da Camundongos machos intravenosamente em camundongos apoptose dos hepatócitos; diminuição da inflamação Manuelpillai et C57/BL6 com 6 C57/BL6 imunocompetentes hepática; redução de TNF-α e IL-6; redução da al., 2010195 semanas de idade após exposição por CCl4 área de fibrose hepática e conteúdo de TGF-β.

Células-tronco mesenquimais humanas derivadas da membrana amniótica (hAMCs)

Células foram infundidas no baço de camundongos após quatro semanas de exposição a CCl4

Melhora da deterioração da função hepática induzida pelo CCl4; alívio da fibrose do fígado induzida pelo CCl4; redução da ativação das células estreladas Zhang et al., hepáticas induzidas pelo CCl4; supressão da apoptose 2011283 dos hepatócitos e promoção da regenração dos hepatócitos; supressão da senescência dos hepatócitos; implantação das hAMC no fígado afetado pelo CCl4.

CP-MSC foram transplantadas para o lobo direito do fígado de ratos expostos a CCl4

CP-MSC foram implantadas com sucesso e algumas se diferenciaram em hepatócitos. A expressão dos mRNA Col I e mRNA α-SMA foi significativamente menor em ratos tratados do que em não tratados, e a expressão do mRNA albumina foi significativamente maior em ratos tratados do que em não tratados. Maior acumulação de lípidios e forte infiltração de macrófagos em ratos não tratados do que em tratados. Deposição de colágeno menor em ratos tratados. Ratos tratados apresentaram redução global e melhora da fibrose entre a veia central e o sistema porta; menores scores de danos ao fígado em ratos tratados, assim como maior liberação de ICG e menores níveis de GOT, GPT e TBIL.

Lee et al., 2010284

AF-MSC têm a habilidade de se inserir em fígados tratados com CCl4 e melhorar a função hepática. Transplante de célula HPL foi mais efetivo do que Células foram transplantadas tratamento com AF-MSC e diminuiu a inflamação intravenosamente em camundongos sistêmica, como mostrado pela mensuração 24 horas após exposição a CCl4 dos níveis de IL-10, IL-2, IFNg e TNF-α. Algumas citocinas foram secretadas somente pela HPL, incluindo IL-12p70 e IL-10, que induz à redução sistêmica dos mediadores proinflamatórios.

Zagoura et al., 2012285

Transplante de AFSC restaura a histologia normal; mudanças patológicas causadas pelo CCl4 (necrose, infiltração de células inflamatórias e degenração) desaparecem mais rapidamente no grupo AFSC. O grupo CCl4+AFSC tem uma histologia normal após dez dias aos danos no fígado. Células transplantadas secretam fatores de crescimento ou agentes similares que regulam o metabolismo e proliferação dos hepatócitos hospedeiros.

Liu et al., 2011286

Camundongos C57Bl/6J com 4 a 6 semanas de idade

Ratos machos Células mesenquimais do córion Sprague-Dawley com (CP-MSC) 6 semanas de idade

Células-tronco mesenquimais humanas do líquido amnióico (AF-MSC)

Células-tronco do líquido amniótico (AFSC)

Camundongos NOD-SCID

Camundongos machos nude com 8 semanas de idade

Células foram injetadas na veia da cauda dos camundongos

AF-MSC = células-tronco mesenquimais humanas do líquido amnióico (human amniotic fluid mesenchymal stem cells); AFSC = célulastronco do líquido amniótico (amniotic fluid stem cells); α-SMA = α-smooth muscle actin; CCl4 = carbon tetrachloride; Col I = type I collagen; CP-MSC = células mesenquimais do córion (chorionic plate-derived mesenchymal stem cells); GOT = glutamate-oxaloacetate transaminase; GPT = glutamate-pyruvate transaminase; hAECs = células-tronco epiteliais humanas do âmnion (human amnion epithelial cells); hAMCs = células-tronco mesenquimais humanas derivadas da membrana amniótica (human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells); HPL = hepatic progenitor-like; ICG = indocyanine green; IFN = interferon; IL = interleukin; mRNA = RNA mensageiro;

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas

ratos NOD-SCID = non-obese diabetes-severe combined immunodeficiency mice; TBIL = total bilirubin; TGF = fator de crescimento de transformação (transforming growth factor); TNF = fator de necrose tumoral (tumor necrosis factor). Tabela 18.12 Aplicações clínicas em doenças cardíacas TIPO DE CÉLULA

MODELO DE ANIMAL

VIA DE APLICAÇÃO DAS CÉLULAS

RESULTADOS

REFERÊNCIAS

Células-tronco epiteliais humanas do âmnion (hAEC)

Ratos machos rNU atímicos com 8 semanas de idade

Células foram injetadas no centro do miocárdio infartado

Atenuação da dilatação ventricular esquerda; melhoramento da função cardíaca; ganho na fração de ejecão ventricular esquerda; redução da área de infarto.

Fang et al., 2012287

Células-tronco mesenquimais humanas derivadas da membrana amniótica (hAMC)

Ratos Wistar (8 semanas de idade) e ratos rNU F344 (6 semanas de idade)

Células foram injetadas no miocárdio

Transdiferenciação de hAMC para cardiomiócitos; aumento significativo da fração de encurtamento do ventrículo esquerdo. A porcentagem de área de fibrose foi significativamente reduzida pelo transplante de hAMC. Evidência de tolerância.

Tsuji et al., 2010288

Suspensão de células foram injectadas em dois ou três locais da área infartada

Foi verificada diferenciação cardíaca no experimento in vivo; observação de uma massa de células recém-formada a partir de hAMC, sugerindo que seja uma fonte de células adequada para o tratamento do infarte do miocárdio; hAMC sobreviveram no tecido da cicatriz durante pelo menos dois meses e foram submetidas a diferenciação cardíaca; sobrevivência de hAMC em xenotransplantes sugere a baixa imunogenicidade das células.

Zhao et al., 2005289

As células foram injetadas em três locais diferentes na periferia da área danificada

Pequenas massas de células de diferentes tamanhos foram encontradas em regiões subendocárdicas ou intramiocárdicas do ventrículo esquerdo próximo aos locais de injeção; vestígios das AFCS originais foram encontrados na parede cardíaca; infiltração acentuada de células inflamatórias na área de enxerto das AFSC; na ausência de transplante de células AFS, os ratos não evidenciaram uma infiltração de linfócitos.

Chiavegato et al., 2007290

Células-tronco mesenquimais humanas derivadas da membrana amniótica (hAMC)

Células-tronco do líquido amniótico (AFSC)

Ratos fêmeas SD com 12 semanas de idade

Ratos fêmeas SpragueDawley e rNU

AFSC = células-tronco do líquido amniótico (amniotic fluid stem cells); hAEC = células-tronco epiteliais humanas do âmnion (human amnion epithelial cells); hAMC = células-tronco mesenquimais humanas derivadas da membrana amniótica (human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells); rNU = rato Rowett Nude.

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

Tabela 18.13 Aplicações clínicas em doenças neurológicas TIPO DE CÉLULA

Células-tronco epiteliais humanas do âmnion (hAEC)

Células-tronco mesenquimais humanas derivadas da membrana amniótica (hAMC)

MODELO DE ANIMAL

Camundongos fêmeas C57BL/6 com 8 a 12 semanas de idade

Ratos fêmeas Sprague-Dawley

Células-tronco Ratos machos Spraguemesenquimais humanas Dawley adultos do líquido amniótico

VIA DE APLICAÇÃO DAS CÉLULAS

RESULTADOS

REFERÊNCIAS

Células foram administradas intravenosamente

Infusão de hAEC melhorou a encefalomielite autoimune; exame da medula espinhal não mostrou nenhuma ou mínima infiltração de células inflamatórias e perda de mielina; redução no número de células T CD3 e monócitos/macrófagos F4/80 na medula espinal de ratos tratados com hAEC. Os esplenócitos de ratos tratados com hAEC proliferaram significativamente menos do que nos ratos de controle de EAE após a estimulação peptídica com MOG. Produção menor de citocinas Th1, IFN-gama e citocinas inflamatórias GM-CSF e TNF-α; hAEC utilizam TGF-b e PGE2 para a imunossupressão.

Liu et al., 2012291

Células foram injetadas no cérebro de ratos

Sobrevivência de hAMC transplantadas no cérebro isquêmico de ratos; migração e diferenciação das hAMC transplantadas no cérebro isquêmico de ratos; hAMC diminuiram o volume do infarto cerebral isquêmico no rato; recuperação comportamental; inibição da ativação de caspase-3 e iNOS no cérebro isquêmico de ratos.

Tao et al., 2012292

Células foram transplantadas no corpo estriado

Sobrevivência e migração das células transplantadas para a fronteira da lesão isquêmica; células humanas comarcadas com o marcador de astrócitos GFAP foram detectadas nos cérebros de ratos, até noventa dias após o transplante. Cipriani et al., Algumas células foram marcadas para imaturidade com 2007293 marcador de neurônio Dcx, principalmente nas adjacências do local da injeção, e foram detectadas dez dias após o transplante. Células humanas não foram positivas para o marcador neuronal β-tubulina III, em nenhum momento.

Efeito neuroprotetor comparável ao das células-tronco embrionárias neuronais; aumento da pontuação neurológica nos Células-tronco foram transplantadas Células-tronco do líquido Camundongos Swiss ensaios de testes motores, testes sensoriais, testes de equilíbrio, Rehni et al., intracerebro ventricularmente três amniótico (AFSC) albino de ambos sexos bem como nos ensaios de reflexo individual e também na 2007294 dias após procedimento cirúrgico forma de comparação com o grupo de controle, dependente da dose. Reperfusão e inversão da isquemia cerebral focal.

CD = grupo de diferenciação (cluster of differentiation); Dcx = duplacortina (doublecortin); EAE = encefalomielite autoimune experimental (experimental autoimune encephalomyelitis); GFAP = proteína glial fibrilar ácida (glial fibrillary acid protein); GM-CSF = Fator estimulante de colônias de granulócito e macrófago (granulocyte macrophage colony-stimulating factor) hAECs = células-tronco epiteliais humanas do âmnion (human amnion epithelial cells); hAMC = células-tronco mesenquimais humanas derivadas da membrana amniótica (human amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells); IFN = interferon; iNOS = óxido nítrico-sintase induzível (inducible nitric oxide synthase); MOG = glicoproteína mielina de oligodendrócitos (myelin oligodendrocyte glycoprotein); PGE2 = prostaglandina E2 (prostaglandin E2); TGF = fator de crescimento transformante (transforming growth factor); Th1 = células T auxiliares 1 (T helper 1 cells); TNF = fator de necrose tumoral (tumor necrosis factor).

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18.5 CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES INDUZÍVEIS Células somáticas podem ser reprogramadas ao estado pluripotente através da expressão ectópica de fatores de transcrição com muitas possíveis aplicações terapêuticas para doenças humanas (revisado em Beltrao-Braga e colegas197, 2013). A maioria dos estudos utilizaram fibroblastos como população de partida para a modificação, mas levam semanas para se conseguir a ideal expansão de células. Tal como visto na parte anterior deste capítulo, MSC são especialmente promissoras para abordagens terapêuticas, devido à sua ampla capacidade de diferenciação e, devido à sua multi ou mesmo pluripotência, portanto, células indiferenciadas formam a ferramenta perfeita para redefini-las em células embrionárias (revisado em Wakao e colegas198, 2013). Como um exemplo, ASC podem gerar células-tronco pluripotente induzíveis (iPS). ASC são facilmente isoladas, encontradas em grandes quantidades e facilmente mantidas em cultura 199. Além disso, podem ser mantidas em condição isenta de alimentador, eliminando assim a potencial variabilidade provocada pela utilização de células alimentadoras 199,200. Células-tronco derivadas de tecido adiposo expressam intrinsecamente elevados níveis de fatores de pluripotência, como FGF básico, fator de crescimento de transformação-p (TGFp), fibronectina e vitronectina, que podem servir como alimentadores para ambas as células pluripotentes autólogas e heterólogas 200. ASC de humanos, ou camundongos, ou ratos apresentam alto potencial para reprogramação em células tronco induzíveis199-201. Embora o tecido adiposo seja uma ótima fonte de células-tronco expansíveis, o seu potencial para uso em medicina regenerativa não tem sido amplamente explorado200. Assim, com o objetivo de desenvolver uma fonte adequada para estudos com iPSC (células-tronco pluripotentes induzíveis, do inglês, induced-pluripotent stem cells), células estromais derivadas de sangue menstrual foram identificadas como ótimas candidatas. Descobriu-se que célulastronco derivadas de sangue menstrual (MenSC) podem ser reprogramadas para o estado pluripotente por transdução lentiviral induzida por doxiciclina de Oct4, Sox2, e KLF4. As células resultantes, MenSC-iPSC, mostraram as mesmas características de células-tronco embrionárias humanas; morfologia, marcadores de pluripotência, expressão gênica e o estado de epigenética. Essas células foram capazes de diferenciar-se em vários tipos de células de todas as três camadas germinativas tanto in vitro como in vivo, mas também podem ser utilizadas para a geração de iPSC202,203.

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18.5.1 Nanog como mediador do estado de pluripotência em células-tronco mesenquimais Fatores de transcrição Oct4 (de ligação ao octâmero 4), Sox2 e Nanog apresentam um papel central na rede transcricional e na manutenção da pluripotência das células-tronco (revistas nos estudos de Barrero e colegas 204, de 2010, e de Chambers e Tomlinson205, de 2009). Dois outros conjuntos distintos de fatores de crescimento representados por LIF e Bmp4 contra bFGF e Ativina A, que estão regulando positivamente a cascata de sinalização de Oct4, Sox2 e Nanog no estado de pluripotência, definem e mantêm dois discretos estados de pluripotência denominados células-tronco naive e primed. Em células-tronco de camundongos, há dois estados de pluripotêcia funcionalmente distintos: um estado de células-tronco pluripotentes PSC “naive” dependentes de LIF (Pluripotent Stem Cells, PSC), que é compatível com a pré-implantação a partir da massa celular interna (inner cell mass, ICM), e um estado de PSC “primed” dependente de bFGF, que é reminescente da pós-implantação epiblástica206. O estado pluripotente naive representa uma população de células-tronco mais primitivas do que as PSC primed, que são unicamente capazes de integrar-se com o blastocisto da ICM e contribuir para a formação de quimera. Entre os três fatores principais, apenas Nanog demonstrou ser um regulador negativo de ambos os conjuntos de LIF e Bmp4 contra as vias de bFGF e Ativina A, o que transforma Nanog em um atrativo candidato a regulador-chave do estado pluripotente de célulastronco (Figura 3). Dois grupos independentes procurando genes que poderiam conferir o crescimento de células-tronco embrionárias de camundongo (mouse Embryonic Stem Cells, mESC) independente de LIF identificaram Nanog como o principal fator de transcrição envolvido 207,208. Estudos silenciando Nanog mostraram que Nanog não é requerido para a manutenção de pluripotência; de fato, células-tronco embrionárias (ESC). Nanog-/- foram reveladas como sendo mais propensas à diferenciação209. Além disso, na ausência de Nanog, a derivação de PSC naive é prejudicada, o que está de acordo com a demonstração de que Nanog tem um papel importante no estabelecimento de um estado de pluripotencia 210. Recentemente, demonstrou-se que várias vias de sinalização advindas de LIF e receptores de Ativina A/TGF-β regulam a expressão de Nanog. Niwa e colaboradores demonstraram que em mESC, a ativação de PI(3)K/AKT induzida por LIF leva à expressão de T-Box 3 (Tbx3), que por sua vez ativa a transcrição de Nanog (Figura 18.3)211. Além disso, a ativação da via paralela Jak/Stat3 induz a expressão de Klf4; em

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adição, a ligação ao promotor Nanog simula a sua própria expressão 211,212. Descobriu-se que o promotor Nanog humano tem sítios de ligação para SMAD2/3, o que sugere que a expressão de Nanog em ESC humanas é diretamente influenciada pela sinalização via Ativina A/TGF-β. Com efeito, a estimulação de Ativina A de ESC leva a um aumento da atividade do promotor Nanog, ao passo que que mutações dos sítios de ligação de SMAD2/3 anulam essa resposta (Figura 18.3)94.

Figura 18.3 Os fatores de crescimento ativam receptores de membrana regulando os níveis de expressão de Nanog em células-tronco pluripotentes naive. Extimulação por LIF resultam na ativação de PI(3)K/Akt, Stat3 e fatores sinais das vias de sinalização MEK/ERK. Stat3 e PI(3)K/Akt regulam positivamente a auto-renovação: PI(3)K/Akt atua via T-Box3 e Stat3 estimulando a expressão de Klf4. Em contraste, a ativação da sinalização via MEK/ERK inibe a expressão de Nanog, mas esta via é inibida por sinais de BMP4 através de regulação positiva de proteínas Id. A ativação da sinalização via PKA por receptores acoplados à proteína G pode estabilizar o estado pluripotente naive por manter os níveis de expressão de Nanog através de um mecanismo de sinalização desconhecido. Em células-tronco pluripotentes primed, fatores de crescimento via sinalização Ativina A/TGF-β induz a expressão de Nanog via ligação de SMAD2/3 a um sítio encontrado no promotor Nanog. Ativação cooperativa adicional via bFGF foi mostrada em ESC humanas, mas não desempenham nenhum papel na expressão de Nanog em EpiSC murinos.

Interessantemente, é também possível distinguir duas populações de uma colônia mESC relacionada com os níveis de expressão de Nanog como

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Nanogalto e Nanogbaixo. Mesmo quando mESC Nanog-GFP são classificadas em subpopulações heterogêneas, Nanogalto e Nanogbaixo são restabelecidas209,213. A porcentagem de células Nanogalto é muito maior sob ativação da supressão de quinases reguladas por sinal extracelular (ERK), o que é fundamental para o estabelecimento e manutenção de células-tronco embrionárias. Além disso, a inibição da glicogênio sintase-quinase 3 (GSK3) reforça esses efeitos, demonstrando que os altos níveis de expressão de Nanog estão intimamente ligados ao estado naive de ESC imposta pelo inibidor 214. Em contraste, células Nanogbaixo em cultura de ESC são mais propensas à diferenciação, o que sugere que os baixos níveis de Nanog levam a um estado pluripotente mais primed 209, que pode estar relacionado com o estado de pluripotência de MSC em comparação com as ESC, sugerindo a sua diferente capacidade de diferenciação. De fato, a sobre-expressão de Nanog facilita a conversão mediada por LIF de células-tronco epiblásticas (EpiSC) em células-tronco embrionárias de camundongo (mESC)210. Esses dados combinados sugerem que os diferentes conjuntos de fatores de crescimento exógenos que suportam PSC naive e primed promovem um estado pluripotente particular pela manutenção dos diferentes níveis de expressão Nanog. A recente geração de ESC Nanog-GFP knock-in humanas demonstra que Nanog exibe expressão heterogênea em ESC humanas, mas continua a ser analisado se diferenças funcionais similares215 existem entre ESC humanas Nanogbaixo e Nanogalto. Além de alguns autores considerarem a plasticidade de MSC como consequência das condições da cultura celular, em vez de um potencial intrínseco de diferenciação216 de MSC in vivo é razoável que a expressão heterogênea de Nanog e talvez outro fator de transcrição regulando negativamente a cascata de Nanog poderia controlar a plasticidade de MSC. Foi demonstrado que a expressão de marcadores padrão da camada germinativa poderiam apoiar o conceito de que as MSC possuem plasticidade, como foi mostrado por três marcadores coexpressos em linhagem germinativa e a capacidade de MSC de se diferenciarem em três linhagens germinativas (ver Tabela 18.4 para os protocolos de diferenciação de MSC). Recentes pesquisas mundiais, conduzidas pela International Stem Cell Initiative, avaliaram o padrão de expressão de marcadores associados a células-tronco em culturas de células-tronco embrionárias humanas. Todas as linhagens de hES testadas exibiram um padrão comum de expressão para um conjunto específico de marcadores de antígenos e genes: antígenos glicolipídicos SSEA-3 e SSEA-4, os antígenos de sulfato de queratan TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM2 e GCT343, e os antígenos de proteínas CD9, CD90, fosfatase alcalina de tecido não específico, bem como Nanog, Oct4, TDGF1,

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DNMT3B, GABRB3 e GDF3217. Estudos em camundongos e células humanas indicam que Oct4 é um componente de uma rede de fatores de transcrição, incluindo a proteína de homeodomínio Nanog e fator de transcrição Sox2 HMGbox, que cooperativamente mantêm a pluripotência de ESC218. O marcador de superfície celular SSEA-4 é um bom indicador de células hES indiferenciadas, mas também tem sido usado para isolar o fenótipo de células-tronco embrionárias e tem sido estudado em pormenor com vários marcadores que têm sido relatados como antígenos específicos de células ESC, incluindo Oct4, Nanog, Sox2, SSEA-4, dentre outros217. Estudos recentes têm mostrado que as células-tronco adultas, incluindo as MSC, podem expressar marcadores de ESC: a expressão de SSEA-4 foi detectada em medula óssea219 e recentemente mostrou-se que a expressão diferencial de outros marcadores de superfície de subpopulações de BM-MSC de camundongos tem distinto compromisso de linhagens. Além disso, a expressão de CD200 era característica para os clones com um potencial osteogênico, enquanto SSEA-4 marcava progenitores adipogênicos sem capacidade osteógica, e CD140a era expresso em células adipogênicas independentemente da sua eficácia para a osteogênese220 em células-tronco da polpa dentária221 e as células-tronco do ligamento periodontal de decíduos humanos 221,222. A expressão de Oct4 foi reportada na medula óssea223 e em ASC 224, células mononucleares do sangue periférico 225, 226, células-tronco da polpa dentária 227,228, células do coração e fígado223; no entanto, a expressão de Nanog foi encontrada em células-tronco mesenquimais da medula óssea, coração e fígado 229. Além disso, o fator de transcrição Sox2 é expresso na medula óssea, tecidos neurais e epitélio sensorial desde os primeiros estágios de desenvolvimento230-233.

18.6 CONCLUSÃO Com o potencial para tratar uma ampla gama de doenças, de órgãos danificados a defeitos congênitos, HSC formam a base subjacente da medicina regenerativa. Estudos estimam que 250 bilhões de dólares por ano serão poupados só nos Estados Unidos com o emprego de terapias baseadas em células-tronco. O impacto será notado principalmente no custo de tratamento de doenças crônicas e neurodegenerativas como a doença de Parkinson, lesões da medula espinhal, doenças cardiovasculares, diabetes e acidentes neurovasculares.

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Em particular, células-tronco e derivadas de tecidos de doentes adultos podem ser não só uma fonte de células para terapias regenerativas autólogas, mas também no estudo de mecanismos de doença, para rastreamento de drogas e ensaios de toxicidade que são cruciais no desenvolvimento de novas drogas. Além disso, a indústria de células-tronco está testemunhando avanços contínuos no mundo e, portanto, muitos produtos estão em andamento. A ampla disponibilidade de terapias com células-tronco não só irá ajudar a tornar o tratamento acessível nos próximos anos, mas também pavimentará o caminho para a medicina personalizada.

18.7 PERSPECTIVAS FUTURAS O potencial das células-tronco adultas já foi amplamente descrito anteriormente. Além de driblar os questionamentos éticos, gerados pela utilização de células-tronco embrionárias, as células-tronco adultas têm grande potencial para aplicação na engenharia tecidual, seleção de drogas para tratamento de doenças, desvendamento dos mecanismos de sinalização celular, dentre outros. Os avanços futuros, provavelmente, serão voltados para a obtenção cada vez mais eficiente e sem danos ao paciente de células-tronco dos diversos tecidos do organismo, além de mecanismos mais efetivos e precisos para a diferenciação dessas células em tecidos específicos. Na terapia celular, o desenvolvimento de biomateriais que favoreçam a proliferação, adesão, diferenciação e remodelação de tecidos danificados está cada vez mais no foco de pesquisadores. Além disso, ao desvendar os mecanismos de diferenciação de célulastronco adultas, poderão ser propostos protocolos para transdiferenciação celular, ou seja, obtenção de células de interesse a partir de células já diferenciadas. Com isso, será eliminado um passo crítico na obtenção de células específicas. Por fim, ainda serão necessários mais estudos para a aplicação eficiente de células-tronco adultas na clínica, mas o tema já apresenta potencial bastante promissor.

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas

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Biotecnologia Aplicada à Saúde

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas

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APÊNDICE Autorizações Licença número 3658390506066. Este capítulo foi traduzido do original "Human adult stem cells from diverse origins: an overview from multiparametric immunophenotyping to clinical applications". Sousa BR, Parreira RC, Fonseca EA, Amaya MJ, Tonelli FM, Lacerda SM, Lalwani P, Santos AK, Gomes KN, Ulrich H, Kihara AH, Resende RR. Cytometry A. 2014 Jan;85(1):43-77. doi: 10.1002/cyto.a.22402. Epub 2013 Nov 25. Review. Tabela S1 Estudos clínicos em andamento com base na terapia por células tronco derivadas do tecido adiposo de acordo com clinicaltrials.gov em junho de 2013 DISEASE CATEGORY

STUDIES Nº

DISEASE CATEGORY

STUDIES Nº

DISEASE CATEGORY

STUDIES Nº

Síndrome da imunodeficiência adquirida

1

Traumatismo cerebral

1

Diabetes mellitus

3

Leucemia linfoblástica aguda

1

Isquemia cerebral

2

Diabetes mellitus, Tipo 2

3

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Biotecnologia Aplicada à Saúde DISEASE CATEGORY

STUDIES Nº

DISEASE CATEGORY

STUDIES Nº

DISEASE CATEGORY

STUDIES Nº

Adenocarcinoma

1

Doença mamária

1

Doença do sistema digestivo

16

Adenocarcinoma, mucinous

1

Neoplasma mamário

1

Fístula do sistema digestivo

9

Doença anexial

5

Doença de Buerger

1

Discinesias

1

Esclerose lateral amiotrófica

1

Carcinoma

1

Enfisema

1

Anemia

1

Carcinoma de ducto

1

Doenças do sistema endócrino

8

Anemia, aplástica

1

Carcinoma mamário, ductual

1

Hemiatrofia Facial

1

Anoxia

1

Doença do sistema nervoso central

11

Doença do Nervo facial

1

Anemia aplástica

1

Ataxia cerebelar

1

Face

2

Traumatismos do braço

2

Doença cerebelar

1

Incontinência fecal

1

Doença da artéria oclusiva

4

Infarto cerebral

2

Necrose da cabeça do fêmur

1

Arterioscleros

2

Disordem cérebro-vascular

2

Fibrose

3

Artralgia

1

Transtornos globais do desenvolvimento infantil

1

Fístula

12

Artrite

5

Chronic Graft Versus Host Disease

1

Fratura do osso

1

Artrite reumatóide

1

Cicatriz

1

Ganglion Cysts

1

Ataxia

1

Anormalias congênitas

3

Gastroenterite

8

Aterosclerose

1

Connective Tissue Diseases

1

Gastrointestinal diseases

16

Atrofia

1

Constrição patológica

1

Doença genital feminina

7

Transtorno autista

2

Doença da artéria coronária

2

Doença genital masculina

1

Doença autoimmune

1

Doença da coronária

1

Nanismo genital

1

Doença autoimmune do sistema nervoso

1

Trauma craniocerebral

1

Neoplasma genital masculino

1

Avitaminosis

1

Doença de Crohn

9

Disordem de metabolismo da glicose

3

Doença da ganglia basal

1

Cisto

4

Disordem da gônoda

5

Sintomas comportamentais

1

Deficiency Diseases

1

Disgenesia gonadal

1

Peso corporal

2

Doenças autoimunes desmielinizantes do SNC

1

Doença hospedeiro-enxerto

1

Doença óssea

2

Doenças desmielinizantes

1

Doença cardíaca

5

Doenças da medula óssea

1

Depressão

1

Falha cardíaca

3

Doença do cérebro

7

Transtorno depressivo

1

Doença hematológica

1

Infarto cerebral

2

Deficiências do desenvolvimento

1

Infecção por HIV

1

Doença de Hodgkin

1

Malnutritição

1

Doenças vasculares periféricas

2

Linfoma de Hodgkin

1

Menopausa

1

Doença arterial periférica

2

Homologous Wasting Disease

1

Transtornos mentais

1

Síndrome do ovário policístico

4

Fraturas do úmero

1

Transtornos mentais diagnosticados na infância

1

Condições pré-cancerosas

1

Precursor celular leucemia linfoblástica – Linfoma

1

Hipertensão

2

Doenças metabólicas

5

Hipertensão renovascular

1

Doença neuromotora

1

Pré-leucemina

1

Síndromes de imunodeficiência

1

Doenças da boca

1

Insuficiência ovariana primária

1

Transtornos imunoproliferativos

2

Distúrbios do movimento

1

Atrofia hemifacial progressiva

1

Infarto

3

Esclerose múltipla

1

Doença da próstata

1

Doenças inflamatórias intestinais

8

Doenças músculo-esqueléticas

8

Neoplasma prostático

1

Degeneração do disco intervertebral

1

Síndromes mielodisplásicas

1

Transtornos psicóticos

1

Doenças intestinais

14

Infarto do miocárdio

1

Doença pulmonar pbstrutiva crônica

1

Fístula intestinal

9

Isquemia miocárdica

2

Enfisema pulmonar

1

Isquemia

12

Necroses

3

Doença do reto

9

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Células-Tronco Mesenquimais Adultas de Diversas Origens: Uma Visão Geral Multiparamétrica para Aplicações Clínicas DISEASE CATEGORY

STUDIES Nº

DISEASE CATEGORY

STUDIES Nº

DISEASE CATEGORY

STUDIES Nº

Artropatias

5

Neoplasias glandulares e epitelialias

1

Fistula retal

8

Doenças renais

2

Degeneração do nervo

1

Distúrbios urinários

3

Infecções por lentivírus

1

Doenças neurodegenerativas

2

Neoplasias urogenitais

1

Leucemia

2

Manifestações neurológicas

1

Manifestações urológicas

3

Leucemia linfóide

1

Doenças neuromusculares

1

Doenças vaginais

2

Transtornos do metabolismo de lipídios

1

Transtornos da nutrição

3

Fístula vaginal

2

Lipodistrofia

1

Osteoporose

1

Ferimentos e lesões

6

Cirrose hepática

2

Fraturas osteoporóticas

1

Doenças do fígado

2

Cistos ovarianos

4

Doenças pulmonares

2

Doenças do ovário

5

Doenças pulmonares obstrutivas

1

Hipernutrição

2

Doenças linfáticas

2

Excesso de peso

2

Linfoma

2

Dor

2

Linfoma não Hodgkin

1

Doença de Parkinson

1

Linfoma, pequenas células clivadas difusa

1

Transtornos parkinsonianos

1

Lymphoproliferative Disorders

2

Condições patológicas anatômicas

14

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CAPÍTULO

19

PRODUÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO INDUZÍVEIS Ricardo Cambraia Parreira Fernanda Maria Policarpo Tonelli Vânia Aparecida Mendes Goulart José Luiz da Costa Luiz Orlando Ladeira Katia Neves Gomes Alexandre Hiroaki Kihara Rodrigo R. Resende 19.1 INTRODUÇÃO

No embrião de vertebrados, células totipotentes têm o potencial para se diferenciar e dar origem às células tecido-específicas, em última análise, formando um organismo inteiro, incluindo os tecidos extraembrionários, tais como a placenta. Esse processo de especificação celular é controlado pela interação de fatores endógenos e exógenos. As células totipotentes são encontradas desde o óvulo fecundado até o estágio inicial de mórula (estágio em que há 16 células). Na fase de blastocisto do embrião inicial, as células da massa celular interna (inner cell mass – ICM), a partir das quais as células-tronco embrionárias (embryonic stem cells – ESC) são derivadas 1,2, são pluripotentes: elas são capazes de formar cada um dos três folhetos

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germinativos, endoderme, ectoderme e mesoderme. Eventualmente, as células que são determinadas para cada um destes folhetos germinativos especializam-se para dar origem aos tecidos do organismo adulto, tais como o cérebro, intestinos ou músculo cardíaco, entre outros. Essas células adultas diferenciadas geralmente não mudam seus destinos; por exemplo, os hepatócitos não se tornam espontaneamente cardiomiócitos. Vários estudos clássicos, entretanto, sugerem que as células “comprometidas” do embrião são, na verdade, plásticas, porque o destino dessas células pode mudar quando são explantadas e expostas a um microambiente diferente. Em um desses estudos, as células dos discos imaginais de pupas de Drosophila melanogaster foram serialmente transplantadas para o abdômen de uma mosca adulta, e observou-se a “transdeterminação”: as células que eram originalmente destinadas a formar as estruturas genitais deram origem a estruturas como perna e cabeça, e, eventualmente, em transplantes posteriores, a asas3,4. Embora essas mudanças no destino celular tenham ocorrido com uma frequência baixa, essas experiências realizadas por Hadorn e Gehring, respectivamente, forneceram evidências de que as células de explante são surpreendentemente plásticas. Em outro elegante estudo 5, células foram transplantadas de codornas para galinhas: essas células eram suficientemente semelhantes para poder participar no desenvolvimento normal do transplante, mas eram histologicamente distintas, o que lhes permitia ser rastreadas. Usando essa propriedade, Le Lievre e Le Douarin5 mostraram que as células da crista neural explantadas adotavam novos destinos (osso, cartilagem e tecido conjuntivo), que são ditados pela sua nova vizinhança celular, e não pela sua localização original no embrião de aves. Uma ressalva a esses resultados é que o destino das células individuais não pode ser seguido. Mas, já em meados dos anos 1960, tais experiências de transplante de células embrionárias sugeriram que o estado geral estável de uma célula especializada era plástico e podia ser alterado em resposta ao ambiente extracelular. Por muito tempo se pensou que quando uma célula se diferencia ela perde cromossomos ou inativa permanentemente genes de que já não necessita. Por que uma célula especializada manteria o potencial para reativar genes típicos de um outro tipo celular? Este parece ser um mecanismo de risco, dada a possibilidade de que os genes poderiam ser inapropriadamente ativados. No entanto, três abordagens para a reprogramação nuclear – transferência nuclear, fusão celular, e de transdução de fatores de transcrição (descritos em detalhe abaixo) – demonstraram conclusivamente que um tipo de célula especializada definida (isto é, em uma célula que tenha sido cuidadosamente

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Produção e Diferenciação de Células-Tronco Induzíveis

Figura 19.1 Três abordagens para a reprogramação nuclear: A) transferência nuclear; B) fusão celular; C) transdução de fatores de transcrição. Modificado de Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches..

determinada para ser diferenciada) pode ter seu destino invertido, voltando a célula para um estado de pluripotência (Figura 19.1). A) Transferência nuclear: nesta abordagem, o núcleo de uma célula somática (que é diploide, 2n) é transplantado para um oócito enucleado, sem núcleo. No ambiente do ovócito, o núcleo de células somáticas é reprogramado de modo que as células derivadas são pluripotentes. Deste oócito, um blastocisto é gerado, a partir do qual linhagens de células-tronco embrionárias (embryonic stem cells – ESC) são derivadas em cultura de tecidos. Caso o progresso do desenvolvimento do blastocisto não seja interrompido, todo um organismo clonado é gerado. B) Fusão celular: nesta abordagem, os dois tipos de células distintos são combinados para formar uma única entidade. As células fundidas resultantes

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podem ser heterocariônicas ou híbridas. Se as células fundidas proliferarem, irão tornar-se híbridas, e, em divisão, os núcleos serão fundidos para se tornarem 4n (isto é, duas vezes o número de cromossomas de uma célula somática) ou maior. Se as células são derivadas da mesma espécie, seu cariótipo permanecerá euploide (isto é, elas terão conjuntos equilibrados de cromossomas), no entanto, se elas são de espécies diferentes, elas serão aneuploides, já que os cromossomas serão perdidos e rearranjados. Heterocários, pelo contrário, são de curta duração e não se dividem. Como resultado, eles são multinucleados: os núcleos das células originais permanecem intactos e distintos, e a influência de um genótipo de outro pode ser estudado num sistema estável, em que não há cromossomas que são perdidos. Se os heterocárions são de espécies distintas, os produtos gênicos dos dois tipos de células podem ser distinguidos. Ao alterar a razão nuclear na fusão, e, portanto, a estequiometria dos reguladores fornecidos por cada tipo celular, o heterocárion é reprogramado para o tipo celular desejado (Figura 19.1). O meio de cultura, também tem um papel e deve ter uma composição favorecida pelo tipo de célula desejada. C) Transdução de fator de transcrição: esta abordagem pode ser utilizada para produzir as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), que têm propriedades semelhantes às células ES e podem ser geradas a partir de quase qualquer tipo de célula do corpo, através da introdução de quatro genes (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc), usando retrovírus. O estado pluripotente é hereditariamente mantido, e um grande número de células pode ser gerado, tornando esta abordagem vantajosa para aplicações clínicas. Esses três modelos experimentais proporcionaram provas de que, com poucas exceções (como a recombinação homóloga em linfócitos), células somáticas altamente especializadas retêm toda a informação genética que é necessária para que se revertam em ESC, e que os genes das células somáticas não foram permanentemente inativados. Além disso, as três abordagens mostraram que, embora o estado diferenciado de uma célula possa ser, geralmente, estável, a “memória” celular é dinamicamente controlada e sujeita a alterações induzidas por perturbações na estequiometria dos reguladores de transcrição presentes na célula, em qualquer dado momento. Estudos recentes mostram que células-tronco pluripotentes com propriedades semelhantes às células-tronco embrionárias (chamadas de células iPS) podem ser induzidas facilmente a partir de células somáticas diferenciadas. Esta constatação levou a grande excitação a respeito do potencial dessas células na melhora do entendimento e tratamento de doenças e destacou a necessidade de uma melhor compreensão mecanística do processo de

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Produção e Diferenciação de Células-Tronco Induzíveis

reprogramação. Uma melhor percepção é necessária para quais reguladores são necessários para gerar as células iPS de maneira confiável e eficiente, e induzidas a se diferenciarem para o destino da célula especializada de interesse. Para atingir este objetivo, as três abordagens para a reprogramação nuclear precisam ser listadas. Este capítulo fornece uma perspectiva histórica sobre as principais conclusões (Figura 19.2) que levaram à descoberta da plasticidade celular e, por sua vez, discute estudos utilizando cada uma das três abordagens para a reprogramação nuclear. Ele também indica as perguntas que devem ser respondidas antes que a reprogramação nuclear possa realizar o seu potencial em aplicações médicas, além de apresentar metodologias para o desenvolvimento de iPSC.

Figura 19.2 Linha do tempo das descobertas na reprogramação nuclear. Três abordagens para a reprogramação nuclear são descritas: transferência nuclear (1962, 1997 e 1998), fusão celular (1966-1971, 1983, 1997, 2008 e 2010), transdução de fator de transcrição (1987, 2006 e 2007). Essas abordagens complementares forneceram percepções sinérgicas por quase cinquenta anos e continuam a informar a compreensão da reprogramação nuclear e a influenciar os avanços da medicina. (embryonic germ cells, ou EG cells, são células germinativas embrionárias). Modificado de Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches.

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19.2 A FUSÃO DE TRÊS FLUXOS CIENTÍFICOS LEVOU À PRODUÇÃO DE iPSC Como qualquer outro avanço científico, a tecnologia iPSC foi estabelecida com base em inúmeros achados de cientistas do passado e atuais em áreas afins. Houve três grandes fluxos de pesquisas que levaram à produção de iPSC (Figura 19.2). O primeiro fluxo foi a reprogramação por transferência nuclear. Em 1962, John Gurdon informou que seu laboratório tinha gerado girinos a partir de ovos não fertilizados, que tinham recebido um núcleo de células intestinais de rãs adultas 6. Mais de três décadas depois, Ian Wilmut e seus colegas relataram o nascimento de Dolly, o primeiro mamífero gerado por clonagem somática de células epiteliais mamárias7. Esses sucessos na clonagem somática demonstraram que, mesmo diferenciadas, as células contêm toda a informação genética necessária para o desenvolvimento de organismos inteiros, e que os oócitos contêm os fatores que podem reprogramar núcleos de células somáticas. Em 2001, o grupo de Takashi Tada mostrou que ESC também contêm fatores que podem reprogramar as células somáticas8. A segunda corrente foi a descoberta do “mestre” dos fatores de transcrição. Em 1987, um fator de transcrição da Drosophila, Antennapedia, foi demonstrado induzir a formação de pernas em vez de antenas quando expresso ectopicamente9. No mesmo ano, demonstrou-se que um fator de transcrição de mamíferos, MyoD, convertia fibroblastos em miócitos10. Esses resultados levaram ao conceito de um “regulador-mestre”, um fator de transcrição que determina e induz o destino de uma determinada linhagem. Muitos pesquisadores começaram a procurar reguladores mestres únicos para várias linhagens. As tentativas falharam, com algumas exceções11. A terceira, e igualmente importante, corrente de pesquisa é aquela envolvendo as ESC. Desde a primeira geração das ESC de camundongo em 19811,2, Austin Smithe e outros já tinham estabelecidas as condições de cultura que permitem a manutenção em longo prazo de pluripotência 12. O fator-chave para a manutenção das ESC de rato foi o fator inibitório de leucemia (do inglês, leukemia inhibitory factor – LIF). Da mesma forma, uma vez que a primeira geração de ESC de humanos foi produzida utilizando o LIF 13, ótimas condições de cultivo, desta vez usando o LIF com o fator de crescimento de fibroblastos básico (do inglês, basic fibroblast growth factor – bFGF) também foram estabelecidas. Combinando as duas primeiras correntes de pesquisa, o grupo de Shinya Yamanaka foi levado a supor que fosse uma combinação de vários fatores

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em oócitos ou em ESC os responsáveis pela reprogramação de células somáticas de volta para o estado de pluripotência, e passaram a desenhar experimentos para identificar essa combinação. Utilizando informações sobre as condições de cultura que são necessárias para manter a cultura de células pluripotentes, eles foram capazes de identificar quatro fatores que podem gerar as iPSC.

19.3 A TRANSFERÊNCIA NUCLEAR Quando um núcleo de uma célula somática diferenciada, como uma célula intestinal, é transplantado para um oócito enucleado, a reprogramação nuclear é iniciada, conduzindo à geração de um indivíduo inteiro, que é um clone geneticamente idêntico das células somáticas originais. Tais experiências de transferência nuclear, também conhecidas como clonagem (Figura 19.1), têm demonstrado definitivamente que todos os genes necessários para criar um organismo inteiro estão presentes no núcleo da célula especializada e podem ser ativado por exposição a fatores de reprogramação presentes no oócito. Em outras palavras, a especialização celular envolve uma mudança na expressão gênica, e não em seu conteúdo genético, e o processo de diferenciação pode ser totalmente revertido14. Nesta seção, apresentamos um panorama histórico dos resultados de estudos de transferência nuclear e a visão sobre a diferenciação celular e regulação gênica que os pesquisadores ganharam com essa abordagem (fatores estes ilustrados na Figura 19.1).

19.3.1 Em anfíbios Elegantes estudos de clonagem em sapos forneceram a primeira evidência conclusiva de que os genes não são perdidos ou permanentemente silenciados durante a especialização celular. Briggs e King foram os primeiros a demonstrar15, em 1952, que a transferência de núcleos de blastocistos em oócitos enucleados resultou em clones, neste caso de girinos de natação. Mas eles tiveram dificuldade em reproduzir esse achado com células de tecidos mais especializados, que muitas vezes davam origem a tecidos anormais, e interpretaram essa limitação como evidência de uma perda de plasticidade, com a diferenciação das células. Gurdon realizou o mesmo experimento6,16 com diferentes espécies de sapos

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e conseguiu a transferência de núcleos de células intestinais de girino, altamente especializadas, em oócitos irradiados com luz ultravioleta, obtendo não só girinos, mas também rãs adultas normais. A escolha das espécies de rãs foi fundamental, mas também o foi a interpretação dos resultados. Embora a incidência tenha sido baixa, Gurdon interpretou suas descobertas como prova de que o processo de especialização celular não exigia alterações nucleares irreversíveis. Uma década após as descobertas de Briggs e King terem terem sido publicadas, os relatos de Gurdon 6,16 de que a diferenciação pode ser reversível atraiu a atenção imediata e excitação, mas também eram controversos. Em primeiro lugar, a baixa frequência (cerca de 1%) com que um adulto normal foi obtido após a transferência nuclear de células somáticas adultas em oócitos enucleados (em comparação com 30% para núcleos de células embrionárias ou após a transferência em série, ou seja, dois experimentos de transferência nuclear sequenciais) sugeriu que os clones poderiam ter surgido a partir de uma subpopulação de células contaminantes, possivelmente células-tronco intestinais residuais. Em segundo lugar, as experiências não podiam ser repetidas em outras espécies. Estes obstáculos foram superados.

19.3.2 Em mamíferos Por que a clonagem de mamíferos não teve sucesso até 1997? Certamente não foi por falta de tentativa. O primeiro mamífero clonado com sucesso foi Dolly, a ovelha, feita por fusão de uma célula mamária com um oócito enucleado (usando um pulso elétrico fusogênico) 7. Wilmut e seus colegas foram os primeiros a clonar um mamífero 7, devido, em parte, à sua estratégia. Usaram oócitos não fertilizados como receptores, em conjunto com células de doadores que tinham sido induzidas a sair do ciclo celular por privação de soro, em cultura, e postularam que a estrutura da cromatina mudaria de forma a conduzir à reprogramação nuclear. Um ano mais tarde, Wakayama e colaboradores, com persistência e perícia técnica, utilizando uma pipeta de enucleação projetada para entregar pulsos piezoelétricos, tiveram sucesso na clonagem de camundongos 17. Esse instrumento permitiu ao núcleo ser removido do oócito do camundongo, que é mais sensível do que o da ovelha, e ser substituído pelo núcleo de uma célula somática. Esse processo de transferência nuclear de células somáticas (do inglês, somatic-cell nuclear transfer – SCNT) logo foi repetido em vários laboratórios. Importante, Jaenisch e colegas finalmente acabaram com o argumento de que a

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“reprogramação” era resultante da presença de contaminação de célulastronco ou células progenitoras18,19. Eles obtiveram evidências definitivas de que o destino de núcleos de células altamente especializadas, os neurônios olfativos purificados, ou a partir de células B em que o locus da imunoglobulina tinha sido reorganizado, poderia ser revertido para produzir um clone de camundongo18,19. A SCNT é possível não só com oócitos, mas também com ovos fertilizados (ou zigotos), mostrando que os fatores de reprogramação ainda estão presentes nessa fase do desenvolvimento20. Notavelmente, os núcleos intactos não são removidos em nenhum dos métodos de transferência nuclear. Em vez disso, o complexo de cromossomas condensados e o fuso são cuidadosamente extraídos em fases do ciclo celular em que o envelope nuclear é desmontado (durante a meiose nos oócitos ou metáfase em zigotos submetidos à mitose), de modo que os fatores de reprogramação, que estão normalmente localizados no núcleo, são dispersos no citosol. Em adição aos ovinos e camundongos, uma vasta gama de espécies já foi clonada com sucesso usando SCNT, desde animais domésticos (como cães e cabras), e híbridos (como mulas), até animais selvagens, como gatos selvagens e lobos africanos21. Além disso, os núcleos de tecidos congelados foram transplantados com sucesso em oócitos enucleados, uma década após o congelamento do tecido. Essas experiências foram realizadas com o objetivo de, eventualmente, usar células criopreservadas para fins terapêuticos ou de clonagem de animais extintos 22. A baixa eficiência de clonagem nuclear (1% a 2%) ainda é típica de camundongos, que são o modelo de animais experimentais mais amplamente utilizados21. É notável que células-tronco embrionárias – células ES derivadas de transferência nuclear (nuclear-transfer-derived ES cells – células ntES) – possam ser geradas com eficiência muito maior (cerca de 20%) de blastocistos formados por SCNT23. E, embora primatas ainda não tenham sido clonados, células ntES foram geradas com sucesso a partir de primatas não humanos24.

19.4 PERCEPÇÕES MECANÍSTICAS Camundongos clonados com anatomia bruta aparentemente normal podem ter inúmeras anomalias, o que levanta preocupações sobre a fidelidade da SCNT para a geração de organismos clonados ou células sem defeitos fenotípicos.

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As anormalidades mais comuns incluem a expressão aberrante de genes em embriões, o tamanho dos telômeros, a obesidade em adultos, comprometimento do sistema imune e, muitas vezes, o aumento da suscetibilidade ao câncer e morte prematura21. Para superar esses problemas, várias modificações técnicas foram testadas em camundongos, incluindo tentativas de ativação química de oócitos para torná-los mais sensíveis, alterando o tempo de enucleação, inibindo a citocinese e usando a fusão celular em vez de injeção nuclear, mas tais alterações levaram a apenas um aumento modesto (ou seja, ainda de 1% a 3%, na melhor das hipóteses) na frequência de animais clonados21. A eficiência na geração de camundongos clonados aumenta substancialmente (de 1% a cerca de 20%) quando a fonte de células para os núcleos são as células ntES o invés de células somáticas, uma eficácia equivalente à utilização de células ES normais para gerar um camundongo clonado 20. Com efeito, a abordagem de utilização de células ntES permitiu aos investigadores clonar camundongos a partir de células T e B18. As células ntES são linhagens de células-tronco embrionárias derivadas de um animal clonado e, portanto, passaram por muitas rodadas de divisão celular em cultura. Esses resultados sugerem que o processo de reprogramação nuclear é substancialmente reforçado pela passagem através de um estado de células ES. Notavelmente, a eficiência de clonagem também difere dependendo do tipo celular, o estágio de desenvolvimento e a estirpe do camundongo doador nuclear. Presume-se que os defeitos de desenvolvimento em animais clonados possam resultar, em parte, de problemas com a fidelidade de reprogramação genômica 25, devido a uma falha em apagar a “memória epigenética” completamente, um termo usado aqui para definir efeitos hereditários sobre a expressão gênica que não são devidas às diferenças na sequência de ácido desoxirribonucleico (do inglês deoxyribonucleic acid – DNA). Fatores epigenéticos que contribuem para a manutenção de padrões de expressão gênica incluem reguladores de metilação do DNA, modificações e substituições de histonas e remodeladores de cromatina dependentes de ATP. A maioria desses modificadores da estrutura da cromatina não reconhece sequências específicas de DNA. Fatores específicos orientam esses modificadores para os seus alvos, e alças de retroalimentação (feedback loops) mantêm o equilíbrio necessário de tais fatores de modificação. Ambos os modificadores e fatores têm um papel crucial. A potência da regulação epigenética é exemplificada pela constatação de que abelhas-rainhas e operárias são clones. Apesar do seu DNA idêntico,

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rainhas e operárias têm diferentes comportamentos, morfologias e capacidades reprodutivas. Elas diferem, pois algumas larvas, as futuras rainhas, ingerem a geleia real. A composição da geleia real é desconhecida, mas seus efeitos podem ser largamente imitados diminuindo os níveis de um único regulador epigenético repressivo, a DNA metiltransferase (DNA methyltransferase – DNMT3)25. A frequência de anormalidades nos animais clonados que foram gerados por transferência nuclear sugere que a reprogramação nuclear é incompleta e que uma melhor compreensão dos mecanismos de regulação gênica, em particular aqueles de memória epigenética, é necessária. O impacto combinado de diversas alterações epigenéticas e como elas se relacionam com alterações na expressão gênica e memória celular é um assunto de intensa investigação e interesse para o entendimento básico da plasticidade celular e para o potencial do uso de células-tronco embrionárias a partir de embriões derivados de SCNT para aplicações clínicas.

19.5 FUSÃO CELULAR A fusão celular envolve a fusão de dois ou mais tipos celulares para formar uma única entidade. Isso permite que o impacto de um genoma no outro possa ser estudado e, dessa maneira, a existência de repressores que atuam em trans e proteínas supressoras tumorais foi demonstrada em 1960 (Figuras 19.1 e 19.2). Cerca de uma década depois, estudos de fusão celular forneceram a primeira evidência de que o estado diferenciado de células somáticas de mamíferos não é fixo e irreversível, mas, ao contrário, é ditado pelo equilíbrio dos reguladores e requer uma regulação contínua 26-28. Tais estudos não poderiam ser levados adiante até que as tecnologias moleculares recentes fossem desenvolvidas, a tal ponto que experimentos de fusão celular demostraram que o estado pluripotente pode dominar sobre o estado diferenciado, sob certas condições, levando genes previamente silenciados a tornarem-se ativos. Esta abordagem está sendo revivida como uma potente forma de elucidar os mecanismos de regulação, como a desmetilação do DNA, que são necessários para a reprogramação nuclear. Nesta seção, discutiremos a conversão de um tipo de célula somática diferenciada para outro tipo e, em seguida, a conversão de células somáticas diferenciadas em células pluripotentes.

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19.5.1 A indução de genes típicos de uma célula somática específica A fusão celular pode gerar híbridos ou heterocariontes (Figura 19.1b). Híbridos proliferam, fazendo com que os núcleos das células originais se fundam, enquanto heterocárions não proliferam e, portanto, contêm múltiplos núcleos distintos. Há pouco mais de quatro décadas, experimentos de fusão demostraram que, quando um fibroblasto de camundongo é fundido com um melanócito de hamster (porco-da-índia) ou hepatócitos de rato, a melanina e a tirosina aminotransferase, respectivamente, deixam de ser sintetizadas 29,30. Esses estudos pioneiros proporcionaram novas evidências de que a expressão gênica não é regulada apenas por elementos de DNA de ação cis, mas também por repressores ativados em trans. Alguns anos mais tarde, células híbridas também forneceram evidências convincentes de que existem proteínas supressoras de tumores de ação trans, porque em alguns casos em que as células não cancerosas e células tumorais foram fundidas, o estado “normal” dominou sobre o estado transformado, impedindo a formação de tumor. Tal supressão de malignidade não resultou da perda de oncogene, e por causa da proliferação prolongada o fenótipo transformado reemergiu31. Em alguns estudos, os genes que eram silenciados em um tipo de célula foram ativados em outros 32,33; no entanto, para selecionar para os híbridos, estes devem se dividir, o que leva a fusão nuclear, perda e rearranjo dos cromossomas e aneuploidia, se os híbridos são de espécies diferentes. Como resultado, não ficou claro a partir de experimentos com esses híbridos de células proliferativas se a ativação do gene observado foi causada pela perda de um gene que codifica um repressor ou pela ação de um ativador. Em 1983, a primeira evidência definitiva de que os genes anteriormente silenciosos podem ser ativados em células de mamíferos foi obtido por Blau e colegas, produzindo heterocárions26, que são de vida curta, não se dividem e são produtos de fusão multinucleada de dois tipos de células distintas. Se os tipos celulares são de espécies diferentes, seus produtos gênicos podem ser distinguidos e a reprogramação nuclear pode ser avaliada. Essa demonstração de reprogramação nuclear foi vista, primeiramente, com incredulidade, porque o dogma prevalecente considerava que o estado diferenciado de células de mamíferos era fixo e irreversível. Usando heterocárions, os problemas de perda e rearranjo de cromossomas, que são típicos dos híbridos, foram superados, porque, na ausência de proliferação, os núcleos dos dois tipos de células distintos permanecem intactos.

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Os primeiros estudos de heterocárions mostraram um aumento no DNA nuclear e síntese de RNA e DNA, mas genes silenciosos não tinham sidos ativados34, presumivelmente, como resultado do tipo celular escolhido. Esses estudos envolveram eritrócitos de galinha, que têm um núcleo, mas estão entre as células mais especializadas e difíceis de reprogramarem. A ativação de genes previamente silenciosos foi detectada pela primeira vez em heterocárions de células musculares e células amnióticas26. Nesse estudo, para aumentar a dosagem gênica e evitar a divisão celular, as células musculares de camundongo foram selecionadas como o parceiro de fusão, uma vez que são naturalmente multinucleadas e pós-mitóticas. Células amnióticas humanas foram escolhidas como o outro parceiro de fusão, pois sua origem embrionária indicaria que estas células poderiam ser mais plásticas do que outros tipos celulares. Nos heterocárions resultantes, observou-se a diferenciação dirigida, e várias proteínas musculares humanas foram expressas, indicando que os genes musculares tinham sido ativados em células não musculares26,27. Subsequentemente, heterocárions formados a partir de sincícios de células musculares e diversos tipos de células de camundongos, incluindo fibroblastos humanos (que surgem a partir da mesoderme), hepatócitos (da endoderme) e queratinócitos (da ectoderme), demonstraram que os genes musculares, anteriormente silenciosos, podem ser ativados em células representativas de todos os três folhetos embrionários26,27. A proporção relativa dos núcleos, ou a dosagem gênica, provenientes dos dois tipos de células ditam a direção da reprogramação27,35. A replicação do DNA não era necessária, e o status da metilação do DNA foi fundamental para os resultados na pesquisa com heterocárions 35,37. A frequência e a cinética de reprogramação também diferem entre tipos celulares27. Outros pesquisadores confirmaram que os genes anteriormente silenciosos podiam ser ativados em heterocárions contidos em células musculares, assim como também com outros tipos de células38. E este também provou ser o caso de outros tipos celulares. Por exemplo, genes específicos de hepatócitos e de eritrócitos foram ativados em núcleos derivados de fibroblasto presentes em heterocárions sem capacidade de se dividirem e de espécies distintas39,40. Em conjunto, essas experiências de heterocárions mostraram que a expressão de genes, previamente silenciosos, típicos de diversos tipos de células diferenciadas de mamíferos podia ser induzida em outros tipos de células diferenciadas, mesmo in vivo41,42. Além disso, eles demonstraram que o estado diferenciado não era fixo e irreversível, mas, em vez disso, é continuamente regulado pelo

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balanço de reguladores presentes em qualquer dado tempo14,27,28, proporcionando forte evidência para a plasticidade nuclear.

19.5.2 A indução de genes de pluripotência em células somáticas Com o advento de ferramentas moleculares melhoradas, foi então renovado o interesse em usar a fusão celular como uma abordagem para estudar a pluripotência e os mecanismos de regulação nela envolvidos. Para evitar os problemas de aneuploidia, todos os estudos de híbridos citados abaixo fundiram células de uma mesma espécie. Tada, Surani e colegas foram os primeiros a mostrar a reprogramação nuclear de células somáticas em híbridos proliferativos. Eles fundiram células germinativas embrionárias femininas, que são células-tronco pluripotentes derivadas de células germinativas primordiais, com timócitos de camundongos adultos43. Em seguida, investigaram quais sequências de DNA haviam sido desmetiladas, usando enzimas de restrição sensíveis à metilação de DNA, e se certos genes marcados e não marcados a partir do genoma somático tinham sido ativados. Além disso, eles mostraram que as células tetraploides fundidas eram pluripotentes: as células podiam contribuir para os três folhetos germinativos em embriões quiméricos. Tada e seus colaboradores, em seguida, mostraram que as células somáticas podiam adquirir um fenótipo pluripotente depois de ser fundidas com células ES 8. Eles fundiram células-tronco embrionárias de camundongos machos com timócitos de camundongos fêmea que continham um transgene repórter GFP (do inglês, green fluorescent protein) dirigido pelo promotor de Oct4 (também conhecido como Pou5f1) de camundongo, e descobriram que os genes no cromossomo X inativo e a construção do repórter Oct4-GFP dos timócitos foram reativados. Com células-tronco embrionárias como um parceiro de fusão, em contraste com as células germinativas (descritas acima), genes marcados nas células tetraploides fundidas não eram desmetilados. Posteriormente, o mesmo grupo de pesquisa gerou células híbridas de intersubspécies com células ES de Mus musculus domesticus e timócitos de M. musculus molossinus 44. São frequentes os polimorfismos de sequência de DNA entre os genomas das duas subespécies, o que permitiu aos investigadores monitorizar a origem do RNA e DNA de clones híbridos. Usando essa elegante abordagem, eles mostraram que o genoma somático

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reprogramado em híbridos com células-tronco embrionárias torna-se hiperacetilado em histonas H3 e H4, enquanto o resíduo de lisina na posição 4 da H3 torna-se globalmente hiperdimetilado e hipertrimetilado, uma indicação de que o epigenoma foi convertido para um estado pluripotente. Cowan e colegas estenderam tal trabalho mostrando que a reprogramação nuclear de células somáticas humanas podia ser conseguida através de sua fusão com células embrionárias humanas em híbridos tetraploides45 em uma razão 1:1. Smith e colaboradores demonstraram posteriormente que, em camundongos, a superexpressão de Nanog, que codifica um fator de transcrição de pluripotência, melhorou substancialmente a reprogramação nuclear baseada em fusão 46. Embora, em geral, tais análises de reprogramação nuclear sejam limitadas (com algumas notáveis exceções44) porque apenas um pequeno número de produtos gênicos podem ser distinguidos, essas experiências mostraram claramente que, após proliferação e seleção em cultura, os reguladores de pluripotência podem substituir os reguladores de diferenciação celular. Heterocárions de espécies distintas permitem estudos mais abrangentes de reprogramação nuclear do que a fusão de células de mesmas espécies, como todas as alterações de expressão gênica podem ser monitoradas com base nas diferenças específicas de cada espécie. Além disso, em heterocárions de espécies mistas a perda de cromossomos, rearranjo e aneuploidia, que confundem a interpretação dos resultados obtidos com espécies distintas (híbridos proliferativos), não ocorrem. No entanto, parecia um contrassenso usar heterocárions para estudar a indução de pluripotência em células somáticas, já que células ES dividem-se rápida e extensivamente. Portanto, parecia provável que a indução da parada do crescimento que resulta da fusão celular em heterocárions, que não se dividem, conduziria a uma perda de pluripotência e diferenciação. Em contraste com as expectativas, resultados de dois laboratórios utilizando heterocárions de espécies mistas mostraram que genes de pluripotência, como Oct4 e Nanog, são ativados e seus promotores desmetilados no prazo de um dia de fusão, quando as células ES de camundongos são fundidas com células B humanas ou com fibroblastos humanos47,48. Heterocárions são ideais para análises dos primeiros eventos moleculares que estão na base da reprogramação. A chave para tais análises de expressão gênica é a capacidade de purificar a pequena proporção de heterocárions na população (cerca de 1%) imediatamente após a fusão, que pode ser conseguida por citometria de fluxo. Em contraste, nas experiências que foram realizadas até agora, os híbridos têm proliferado extensivamente e têm sido

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selecionados com drogas antes de ser analisados, por isso não foi possível avaliar as primeiras mudanças na expressão gênica. A eficiência na indução da pluripotência depende dos tipos celulares usados para formar os heterocárions (no exemplo acima, 16% para as células B e 70% para os fibroblastos)47,48, e as diferenças no tempo de ativação gênica e desmetilação do DNA são observadas. Presumivelmente, essas diferenças surgem por causa da proporção de núcleos a partir das células originais, e o equilíbrio de reguladores da transcrição que estão presentes ditam a extensão com que as células podem ser reprogramadas para a pluripotência (como visto anteriormente para a ativação gênica em células somáticas usando heterocárions26-28,36). A rápida taxa de reprogramação detectada em heterocárions, ao contrário de híbridos, torna-os úteis para elucidar os mecanismos moleculares que são necessários para iniciar a reprogramação para o estado pluripotente, usando abordagens de perda e ganho de função (Figura 19.3). Por exemplo, quando as células ES de camundongo que perderam a expressão de Oct4 são fundidas para formarem heterocárions com células B humanas, as células B não são reprogramadas, mostrando que Oct4 é necessário para reprogramar para um estado pluripotente47. Em outro exemplo, utilizando heterocárions, Blau e colegas elucidaram um novo papel para AID, uma enzima conhecida por desaminar resíduos de citosina. Eles descobriram um mecanismo ativo que é essencial para a desmetilação do DNA e para a indução de reprogramação nuclear de fibroblastos para a pluripotência48. Esses novos dados sugerem que, em vez de um mecanismo de reparo do DNA que possa operar em mamíferos, em que uma base metilada ou nucleotídeo é trocado por um não metilado, há uma enzima que promove a desmetilação do DNA. Esses estudos exemplificam o potencial da fusão de células em fornecer insights mecanísticos para os obstáculos, tais como desmetilação do DNA, o sucesso para a reprogramação de células somáticas por SCNT ou a transdução de fatores de transcrição. A fusão de células leva a reprogramação nuclear para um fenótipo específico, o qual é ditado pela razão nuclear dos tipos de células fundidas em heterocárions, que não se dividem. Quando, por exemplo, as células de humanos e de ratos são fundidas numa relação inclinada (tal como 1:3), (a) as células de humanos serão, geralmente, reprogramadas para o fenótipo de células de rato (três exemplos são mostrados). Para descobrir quais os genes estão envolvidos neste processo, no início da reprogramação, Figura 19.1b, (b) o perfil da expressão gênica de todo o genoma específico da espécie pode ser realizado dentro dos três tipos de heterocárions mostrados. Assim, as transcrições de genes humanos que são induzidas logo após a fusão podem ser

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by three approaches

Figura 19.3 Estratégias de investigação dos genes envolvidos na reprogramação nuclear, utilizando heterocárions de espécies mistas. Modificado de Nuclear reprogramming to a pluripotent state

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identificadas, e os efeitos de silenciar esses genes candidatos (perda de função) ou superexpressá-los (ganho de função) também podem ser testados48. A função desses genes pode, então, ser validada por ensaios que avaliam se eles são necessários para a transferência nuclear ou para a geração de células iPS, ou células somáticas induzidas. Por exemplo, os ensaios podem testar se a expressão dos genes identificados nos heterocárions com células ES ou fenótipo iPSC de células – (a), centro – aumenta, ou é necessário para a geração de células iPS ou de reprogramação por transferência nuclear. Os genes identificados nos heterocárions com um fenótipo de células somáticas – (a), superior e inferior – podem ser testados para detectar se aumentam, ou são necessários para, a conversão de células iPS ou células ES para um tipo de célula somática em particular, ou a conversão de um tipo de célula somática em outro tipo. Tais experimentos irão aumentar a compreensão dos reguladores moleculares de reprogramação nuclear e, portanto, melhorar a segurança e eficácia das células produzidas para fins terapêuticos.

19.6 TRANSDUÇÃO DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO A superexpressão de um único fator de transcrição em células somáticas induziu, de maneira inesperada para a época, ativação de genes que eram típicos de outros tipos de células somáticas em D. Melanogaster9,49 e, posteriormente, em células de mamíferos10. Esta ativação de genes próprios de outros tipos celulares levou a mudanças notáveis no destino das células em análise. Mais surpreendentemente, descobriu-se que a pluripotência pode ser recuperada por vários tipos de células somáticas diferenciadas através da superexpressão de apenas quatro genes codificadores de fator de transcrição. Essas células, conhecidas como células iPS, são o exemplo mais forte da medida da plasticidade das células em resposta a uma ruptura na estequiometria de seus reguladores transcricionais. Células iPS humanas podem ser usadas para gerar células para o reparo do tecido ou substituição, evitando as questões éticas e imunológicas que são inerentes à utilização de células ES (Figura 19.5). Além disso, porque tais células podem ser derivadas de células do próprio paciente, fornecem aos pesquisadores a capacidade de modelar doenças humanas e de se fazer uma vasta procura ou screenning de candidatos a drogas in vitro, de uma maneira sem precedentes. Nesta seção, nós fornecemos uma perspectiva histórica sobre os resultados de experiências de transdução de fator de transcrição, que primeiramente envolveu fatores individuais e, em seguida, grupos de fatores. Na última década, tem sido

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demonstrado que o aumento da expressão de quatro proteínas pode reprogramar uma célula somática diferenciada para se tornar célula pluripotente, potencialmente revolucionando a medicina e destacando a importância da reprogramação nuclear.

19.6.1 Conversão de células somáticas de um destino para outro O destino de uma célula pode ser alterado pela expressão forçada de fatores de transcrição específicos de tecidos individuais. Gehring e colaboradores foram os primeiros a demonstrar isso9 em 1987: em larvas de D. melanogaster, a superexpressão ectópica de um gene homeótico, Antennapedia, sob o controle de um promotor de gene de choque térmico, levou a uma mudança no plano do corpo, com um conjunto adicional de pernas sendo formado em vez de antenas. Ainda mais surpreendente foi a descoberta por Gehring 49, quase uma década depois, de que a expressão ectópica de sem olhos (conhecido como Pax6 em camundongos), um controlador principal de uma cascata de mais de 2.500 genes, levou ao desenvolvimento de olhos funcionais sobre as pernas, asas e antenas de D. melanogaster. Em camundongos, o primeiro fator de transcrição regulador-mestre tecido-específico foi identificado por Weintraub e colaboradores10 em 1987. Eles descobriram que era possível induzir a conversão fenotípica da linhagem miogênica, expressando uma única proteína muscular hélice-alça-hélice MYOD49. A clonagem de Myod foi seguida de observações astutas por Taylor e Jones50, em 1979, que perceberam que as estruturas filamentosas em culturas de fibroblastos tratados com 5-azacitidina, um agente anticancerígeno de desmetilação, não eram contaminações por fungos, mas, em vez disso, miotubos sinciciais. Além disso, foi demonstrado por Graf e colegas em 2004 que a família de fatores de transcrição de C/EBP de camundongos tem um papel chave na conversão de um tipo de célula de sangue para o outro (de linfócitos para macrófagos)51, e que quando o gene que codifica para o fator de transcrição PAX5 era removido de células B, essas células revertiam para um fenótipo de progenitores menos especializados52 *. Deve-se observar que, em mamíferos, a alteração da expressão de um único fator de transcrição geralmente resulta no fenótipo de células somáticas mudando apenas para tipos *

Para uma revisão abrangente de tais transdiferenciações induzidas por fatores de transcrição, ver Graf e Enver (2009)53.

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de células estreitamente relacionadas, de modo que os efeitos de fatores de transcrição são altamente dependentes do contexto54,55 (Tabela 19.1). Tabela 19.1 Fatores de reprogramação (diferentes de Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc) e outras moléculas que podem aumentar a eficiência da reprogramação ou promovê-la

MOLÉCULA UTILIZADA

REFERÊNCIA

Ácido ascórbico (ou vitamina C)

Stadtfeld et al., 2012122

Nanog

Silva et al., 2009123

Receptor nuclear órfão Nr5a2 (também chamado Lrh-1)

Heng et al., 2010124

Receptor nuclear órfão Esrrb

Feng et al., 2009125

Butirato

Mali et al., 2010126

POU5F1

Choi et al., 2009101

LIN28

Choi et al., 2009101

Tbx3

Han et al., 2010127

Grande antígeno T do vírus símio 40

Mali et al., 2008128

ZSCAN4

Jiang et al., 2012129

Sall4

Tsubooka et al., 2009130

Rem2 GTPase

Edel et al., 2010131

Inibidores da histona metiltransferase G9a (p. ex. BIX-01294)

Shi et al., 2008132

Inibição da família let-7 de Mirna

Melton et al., 2010133

miR-291-3p, miR-294 e miR-295

Judson et al., 2009134

Família miR-200, miR-141, miR-200, e miR-429

Samavarchi-Tehrani et al., 2010135

miR-130/301/721

Pfaff et al., 2011136

miR302/367

Anokye-Danso et al., 2011137

miR-302b e miR-372

Subramanyam et al., 2011138

Famílias miR-200c, miR-302, miR-369

Miyoshi et al., 2011139

Ativação da sinalização Wnt

Marson et al., 2008140

Inibidores da histona deacetilase (p. ex. ácido valproico)

Huangfu et al., 2008141

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MOLÉCULA UTILIZADA

REFERÊNCIA

Inibidores da GSK3 (p. ex. CHIR99021)

Li et al., 2009142; Valamehr et al., 2012143

Proteína C/EBPα

Hanna et al., 2008144

Inibidor da via de TGFβ (p. ex. SB431542)

Valamehr et al., 2012143

Inibidor da via de MEK (p. ex. PD0325901)

Valamehr et al., 2012143

Inibidor de ROCK (p. ex. Tiazovivina)

Valamehr et al., 2012143

Knockdown do fator de transcrição Pax5 quando se utiliza células B

Hanna et al., 2008144

Antagonistas de receptores da via de sinalização de TGFβ (conjuntamente com inibição da via MEK-ERK em células de humanos)

Lin et al., 2009145

19.6.2 Conversão de células somáticas em células pluripotentes Embora as elegantes experiências de fusão de Tada, Surani e colaboradores43 tenham mostrado claramente que células-tronco embrionárias e células germinativas embrionárias contêm fatores que podem induzir a reprogramação e pluripotência em células somáticas, as tentativas por muitos pesquisadores para identificar os reguladores-mestres do estado de células ES falharam. Como resultado, a visão predominante até 2006 era a de que a reprogramação nuclear para um estado pluripotente é um processo altamente complexo que podia implicar a colaboração de até cem fatores. Consequentemente, quando Shinya Yamanaka e colegas demonstraram 56,57 que uma combinação de apenas quatro fatores de transcrição podia gerar células pluripotentes do tipo ES a partir de fibroblastos de camundongos, os resultados provocaram tanto excitação quanto ceticismo. Eles usaram vetores retrovirais para introduzir em fibroblastos embrionários e adultos de camundongos uma minibiblioteca de DNA complementar de 24 genes expressos por células ES, e estes genes foram então testados quanto à sua capacidade de induzir a pluripotência coletiva. A pluripotência foi determinada pelo teste para a ativação de uma construção de gene repórter contendo o promotor de Fbx15 (também conhecido como Fbxo15) 58, um gene previamente identificado como sendo específico para células ES. Os clones em que o promotor Fbx15 foi ativado produziram uma proteína repórter que os tornaram resistentes ao antibiótico neomicina, e esses clones resistentes ao antibiótico

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tiveram morfologia, propriedades de crescimento e expressão gênica características de células ES. Mais importante, após a injeção em camundongos, eles foram capazes de formar teratomas (tumores que incluem células de todos os três folhetos germinativos), indicando a sua pluripotência. Em vez de determinar a contribuição de cada fator isoladamente ou em subgrupos, os fatores foram progressivamente retirados do pool ou do conjunto, um de cada vez. Como resultado, os autores identificaram quatro fatores-chaves que foram suficientes para induzir a pluripotência em fibroblastos – Oct4, Sox2, KLF4 e c-MYC –, e nomearam essas células pluripotentes como células-tronco pluripotentes induzidas (do inglês induced pluripotent stem cells – iPSC)56. Devido à simplicidade do método, e porque as células iPS inicialmente não conseguiram produzir camundongos quiméricos adultos, muitos pesquisadores tinham dúvidas sobre sua validade como células-tronco com propriedades semelhantes às células ES. No entanto, no prazo de um ano, dois grupos independentes de pesquisa mostraram que a superexpressão dos quatro fatores geraram células capazes de formar quimeras adultas e células germinativas funcionais59,60. Estudos posteriores mostraram que as células iPS podem ser geradas sem a superexpressão de c-MYC 61,62. Células iPS humanas foram obtidas dentro de um ano, induzindo a superexpressão da mesma combinação de fatores 63,64, ou diferentes, mas sobrepondo os coquetéis dos fatores (Oct4, Sox2, Nanog, e Lin28)65. Surpreendentemente, os transgenes que codificam para os quatro fatores precisam estar presentes somente quando as células iPS são geradas. Quando estas células tornam-se estabelecidas, os transgenes retrovirais são silenciados, e os genes endógenos que codificam para os quatro fatores tornam-se ativos. Assim, a autorrenovação das células iPS e a manutenção de sua pluripotência resultam inteiramente na expressão endógena dos genes que codificam para Oct4, Sox2, Klf4 e c-MYC, sugerindo que as células iPS foram sujeitas à reprogramação quase completa.

19.7 OS AVANÇOS TÉCNICOS NA GERAÇÃO DE CÉLULAS iPS Os quatro fatores que foram inicialmente identificados podem agora ser substituídos por diferentes fatores ou por certas pequenas moléculas. Mas a conclusão inicial – de que um conjunto de fatores é necessário – é válida, e alguns fatores-chave, como Oct4, não podem ser omitidos. Um estado de células-tronco pluripotentes já foi induzido em uma infinidade de

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tipos de células diferenciadas, incluindo células β pancreáticas, queratinócitos, hepatócitos e células do estômago66. Muitos grupos utilizam adenovírus e lentivírus para a geração de iPSC humanas e de camundongos. Lentivírus é um ótimo vetor para a entrega de fatores de transcrição na reprogramação de células somáticas, devido à sua capacidade de infectar sem se dividir e manter a proliferação celular67. Para que não haja incorporação de sequência do vetor lentiviral ao genoma das iPSC, construções foram criadas em que cada um dos fatores inseridos foram separados por sequências com sinal de autoclivagem68. Além disso, a tecnologia Cre-Lox também foi utilizada para que a sequência integrada ao genoma fosse retirada através da expressão da recombinase Cre, que reconhece sítios específicos (LoxP)68 (Tabela 19.2). Tabela 19.2 Métodos de delivery dos fatores de reprogramação

MÉTODO

EXEMPLO DE TRABALHO QUE UTILIZA O MÉTODO

Lentivírus

Sommer et al., 2009146

mRNA

Mandal Rossi, 2013147

Vírus sendai (RNA vírus)

Fusaki et al., 2009148

Camundongo reprogramável

Haenebalcke et al., 2013149

Retrovírus

Mali et al., 2010126

Plasmídeo com transposon (p. ex. piggyBac)

Mali et al., 2010126

RNA autorreplicativo sintético

Yoshioka et al., 2013150

Entrega dos fatores na forma de proteínas

Kim et al., 2009151

Outro excelente veículo para a entrega de fatores de transcrição é o adenovírus, pois ele não integra sua sequência ao genoma da célula infectada. Mas a eficiência de reprogramação das células infectadas ainda é baixa, o que abre caminhos para mais pesquisas em busca do aperfeiçoamento do processo67. A utilização de vetores não virais como microRNA (miRNA), RNA mensageiro (mRNA) e proteínas para regular os processos celulares como ciclo celular, a transição epitélio mesenquimal, regulação epigenética e transporte vesicular também tem sido pesquisada. mRNAs foram descritos por facilitar

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a reprogramação de fibroblastos de camundongos. Pesquisadores utilizam miR-302 and miR-372 para regular negativamente inibidores do ciclo celular e aumentar a eficiência da desdiferenciação69. A transfecção com plasmídeos também é descrita, mas é uma transfecção transiente, ou seja, a expressão não se mantém por longos períodos para que possa reprogramar as células. Com isso, a porcentagem de células modificadas é baixa. Contudo, a vantagem da utilização de plasmídeos se dá pela não integração no genoma e por ser considerado mais seguro que a utilização de vetores virais, o que facilitaria a sua inserção na medicina regenerativa70. Uma alternativa para se agregar maior eficiência na reprogramação por fatores de transcrição é a utilização de pequenas moléculas que vão interferir dos processos celulares71. Pequenas moléculas podem causar modificações epigenéticas, como por exemplo inibir histonas deacetilases ou DNA metiltransferases, promovendo alterações na sinalização celular e levando à reprogramação de células somáticas de humanos e camundongos 71-73. Utilizando células progenitoras neurais, foram descobertas pequenas moléculas como BIX-01294, que inibe a ação da G9a, uma histona metiltranferase, levando à redução da expressão de Oct4 e, por consequência, facilitando a reprogramação celular74. Os vários tipos celulares são, no entanto, convertidos em um estado pluripotente com diferentes frequências (geralmente baixa), indicando que (como é o caso da transferência nuclear, heterocárion e experimentos de fator de transcrição único) a reprogramação é dependente do contexto, e o tipo de célula afeta a capacidade de se tornar uma célula iPS. Esforços têm sido direcionados para a melhoria da proporção de células transduzidas com vetores retrovirais. Por exemplo, a exposição a um ambiente hipóxico ou à vitamina C tem demonstrado um aumento na frequência de geração de células iPS75,76. Além disso, interromper as vias de sinalização mediadas pelaproteína p53, um supressor de tumor, ou o regulador do ciclo celular INK4A, remove pontos de controle do ciclo celular, e as células iPS são então geradas mais rapidamente77-80. Certos microRNA também têm sido descritos como capazes de aumentar a eficiência de reprogramação81. Além disso, as célulastronco ou células progenitoras parecem ser mais facilmente reprogramadas de modo a tornarem-se células iPS do que células mais especializados de uma determinada linhagem, tal como tem sido demonstrado para células hematopoiéticas 82. Apesar desses avanços em nossa capacidade de gerar células iPS, todas as células transduzidas não se tornam células iPS. Isto é particularmente evidente em um estudo realizado por Wernig, Jaenisch e colaboradores83, que produziu camundongos transgênicos a partir de células

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iPS estabelecidas pelo uso de vetores induzidos por doxiciclina. Quando os fibroblastos de camundongo foram isolados desses camundongos transgênicos regulados pela doxiciclina, a frequência de células iPS geradas a partir deles era cem vezes maior do que a frequência com que as células iPS originais eram geradas, mas ainda assim era inesperadamente baixa83. Uma descoberta semelhante foi relatada com um sistema excisível de transposon piggyBac, que codifica para todos os quatro fatores inicialmente identificados e é induzível pela doxiciclina 84. Com base nesses resultados, muitos pesquisadores acreditam agora que a reprogramação durante a geração de células iPS implica um evento estocástico (isto é, aleatório)85,86. No entanto, em 2013 observou-se que é possível a obtenção de aproximadamente 100% de iPSC a partir de células somáticas de seres humanos e de camundongos. Logo, a aleatoriedade do processo tornou-se questionável, visto que a partir da depleção de Mbd3 – proteína membro do complexo repressor Mbd3/NuRD (complexo cuja função é de deacetilação e remodelagem de nucleossomas) – conjugada à transdução das células com os fatores de reprogramação Oct4, Sox2, Klf4 e Myc, foi possível obter-se rendimento quase total de obtenção de células iPS de maneira sincronizada87.

19.8 MUDANDO A ABORDAGEM A abordagem de múltiplos fatores para a reprogramação que é utilizada para gerar células iPS levou a um deslocamento da tentativa de identificar e utilizar um único fator de transcrição de regulação “mestre” para a utilização de vários fatores na reprogramação de destino de células de mamífero. Usando os princípios e abordagem experimental que Shinya Yamanaka e seus colaboradores determinaram para a geração de células iPS, dois grupos de pesquisa (liderados por Melton e por Wernig) têm decifrado as contribuições individuais de uma panóplia de fatores de transcrição, identificando três que podem converter um tipo de celula em outro (fatores que podem converter, por exemplo, células exócrinas em células endócrinas produtoras de insulina in vivo e fibroblastos em neurônios excitatórios in vitro)88,89. Muitos grupos, incluindo o nosso, já estão tentando resolver um grande número de fatores de transcrição e identificar conjuntos que podem ser utilizados para converter um tipo de célula somática para outro tipo ou para uma célula progenitora ou célula-tronco que possa ser usada para regenerar um tecido. Além disso, a análise de heterocárions de espécies mistas pode ajudar a descobrir genes e mecanismos envolvidos não esperados ou

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não identificados envolvidos na reprogramação a partir de estados estáveis diferenciados para um estado pluripotente ou na direção contrária 90,91 (Figura 19.3). Ganhar uma melhor compreensão do processo de reprogramação e como a memória epigenética é estabelecida poderia reduzir as chances de geração de células tumorais e, portanto, aumentar a utilidade das células iPS, proporcionando fontes mais seguras para a terapia celular no futuro.

19.9 UMA QUESTÃO DE ÉTICA: ESTÍMULOS EXTERNOS FORAM REFUTADOS COMO REPROGRAMADORES DE CÉLULAS DIFERENCIADAS PARA A PLURIPOTÊNCIA Em 2006, Takahashi e Yamanaka, da Universidade de Kyoto, Japão, induziram células-tronco pluripotentes (células indiferenciadas com propriedade de autorrenovação e potencial de diferenciação em todos os tipos celulares do corpo de mamíferos) a partir de cultura de fibroblastos (células estruturais do tecido) por meio da adição de fatores de transcrição Klf4, c-MYC, Oct4 e Sox2 (proteínas que se ligam ao material genético da célula e estimulam a expressão ou ativação da produção de genes). Até recentemente, além dessa metodologia, a reversão do estado de células diferenciadas de animais para pluripotentes baseava-se na transferência ou manipulação genética/ física do núcleo. Entretanto, as células diferenciadas de plantas, quando expostas a estímulos externos, sem nenhum tipo de intervenção ou reprogramação do núcleo, eram capazes de se tornarem células com potencial de formarem toda a estrutura da planta, incluindo caules e raízes. Observando tal fato, Obokata e colaboradores, pesquisadores das Universidades de Kobe, no Japão, e de Massachusetts, Estados Unidos, decidiram avaliar se células diferenciadas de animais também adquiriam tal potencial quando expostas a condições especiais. Para tal abordagem, os autores do artigo utilizaram células (que eram os linfócitos do baço) positivas para o marcador fenotípico CD45 (proteína de superfície da célula) e avaliaram se essas células adquiriam pluripotência ao sofrerem perturbações químicas simples em seu ambiente externo, tão simples como a mudança de pH, isto é, de um meio neutro, básico, para um meio ácido. Os pesquisadores batizaram a técnica de reprogramação de STAP (do inglês stimulus-triggered acquisition of pluripotency), ou seja, aquisição de pluripotência induzida por estímulos.

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Figura 19.4 Permanência de pluripotência de células-tronco embrionárias. Modificado de Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches.

Figura 19.5 Potencial terapêutico de iPSC. Fibroblastos da derme de pacientes com uma determinada doença podem ser usados para derivar iPSC. iPSC derivadas de doenças específicas que posteriormente são diferenciadas em um tipo celular desejado podem ser usadas como uma ferramenta para modelar doenças e terapias. Adicionalmente, iPSC específicas de pacientes com doenças genéticas causadas por mutações desconhecidas podem ser corrigidas através de uma modificação prévia no gene mutado. Depois, as iPSC corrigidas para o gene defeituoso são induzidas a se diferenciarem na célula desejada in vitro e, posteriormente, podem ser usadas para transplante no paciente.

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Em 15 de fevereiro de 2014, o Centro Riken, onde Obokata conduzia seus estudos sobre células-tronco, anunciou que uma investigação fora aberta para se averiguar irregularidades supostamente encontradas nos dois artigos publicados na revista Nature no mês anterior92,93. As alegações questionaram o uso de imagens aparentemente duplicadas nos jornais, e denunciaram a falta de reprodução de seus resultados em outros laboratórios de células-tronco de destaque. A revista Nature também anunciou que estava investigando o caso. Vários cientistas de células-tronco defenderam Obokata ou reservaram sua opinião enquanto a investigação estava em curso94. Para resolver o problema da reprodutibilidade em outros laboratórios, Obokata publicou algumas “dicas” técnicas sobre os protocolos em 5 de março, prometendo que o procedimento detalhado seria publicado oportunamente95. No entanto, em 11 de março, Teruhiko Wakayama, um dos coautores dos dois artigos, pediu a todos os pesquisadores envolvidos que retirassem os artigos, citando muitos pontos questionáveis96. Charles Vacanti, da Harvard Medical School, norte-americano coautor dos artigos sobre pesquisas com células STAP, supostamente inovadoras disse que se opõe a sua retratação. Ele postou detalhes sobre como criar células STAP no próprio website de seu laboratório *. Em 14 de março de 2014, o Centro Riken lançou um relatório intercalar da investigação. Dos seis itens que estavam sendo investigados, o comitê concluiu que houve manipulação inadequada dos dados em dois, mas não julgou o mau uso como má conduta de pesquisa. A investigação continuava para os outros quatro elementos **. Em 1º de abril, RIKEN concluiu que Obokata havia se envolvido em "má conduta de pesquisa", falsificando dados em duas ocasiões. Os co-autores não foram declarados como tendo, também, má conduta, mas foram responsabilizados por "grave responsabilidade" por não verificar os dados por si mesmos. RIKEN anunciou também que um grupo interno tinha sido estabelecido para verificar se a "aquisição de pluripotência ativada por estímulos" era reprodutível. Obokata manteve a sua inocência e disse que iria recorrer da decisão. Em 4 de Junho de 2014, Obokata concordou em retirar ambos os artigos. Que foram oficialmente retratados em 2 de julho de 2014. Um artigo analisando a controvérsia concluiu que, embora as questões de manipulação de imagens, duplicação e plágio eram potencialmente detectáveis, os revisores não teriam podido *

Ver https://research.bwhanesthesia.org/site_assets/51520d191eea6679ce000001/cterm/Refined_ STAP_protocol-9a685fc86fec5ca857ad58ae75462d07.pdf. ** Ver http://www.riken.jp/en/pr/press/2014/20140314_1/.

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concluir que o artigo era o produto de má conduta acadêmica antes de seu aceite. Na esteira da controvérsia, observadores, jornalistas e ex-membros do RIKEN afirmaram que a organização está repleta de rigor científico e profissional inadequados e com falta de consistência, e que este é o reflexo de problemas sérios com a pesquisa científica no Japão em geral. RIKEN encomendou uma equipe de cientistas para tentar verificar os resultados originais de Obokata e pediu Obokata a participar no esforço. Em 5 de agosto de 2014, o orientador e co-autor do artigo original de Obokata, Yoshiki Sasai, foi encontrado morto por aparente suicídio por enforcamento em um edifício na instalação RIKEN em Kobe, Japão.

19.10 iPSC E ESC SÃO CÉLULAS DIFERENTES? Do ano de 2006, quando Takahashi e Yamanaka obtiveram iPSC a partir de fibroblastos de camundongos97, até o ano de 2009, vários trabalhos científicos relataram a semelhança existente entre iPSC e ESC (ver Quadro 19.1). Porém, em 2009, vários trabalhos foram publicados relatando as diferenças entre essas células. Uma assinatura de expressão gênica recorrente em iPSC, independentemente de sua origem ou método de geração, foi identificada por Chin e colaboradores. Essa diferente expressão manifesta-se inclusive em regiões não codificantes do DNA, resultando em expressão diferenciada de miRNAs. Comparando-se iPSC e ESC humanas (células-tronco de pluripotência induzida humanas – hiPSC e células-tronco embrionárias humanas – hESC) relatou-se, por exemplo, que o gene hsa-miR-371-5p está 3,85 vezes mais expresso em hESC, e que o hsa-miR-100 está 2,38 vezes mais expresso nas hiPSC. Após cultura prolongada, no entanto, observou-se que essas células vão progressivamente se assemelhando mais, o que levou Chin e colaboradores a proporem que essas sejam subtipos de células pluripotentes98. Marchetto e colaboradores também relataram em 2009 que iPSC geradas a partir de células-tronco neurais de camundongos, por plasmídeos epissomais como carreadores das sequências dos fatores de reprogramação, também diferem das ESC obtidas da mesma espécie. Existem diferenças significativas entre os perfis transcricionais de ambas, que não se devem à inserção randômica de sequências no genoma por vetores virais (visto que estes não foram usados neste trabalho); as iPSC retêm consigo memória em expressão de genes relativa à sua célula de origem99. Essa expressão gênica persistente de genes da célula doadora (da qual se obteve a iPSC) em iPSC

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foi também observada por Ghosh e colegas. Segundo eles, há similaridade entre os níveis de expressão de genes entre a célula doadora e sua iPSC, e a geração desta por reprogramação não desdiferencia a célula somática completamente a um estado de célula ES100. No mesmo ano, Choi e colegas demonstraram que o potencial de diferenciação de hESC e hiPSC em células hematopoiéticas e endoteliais, apesar de similar, não é o mesmo101. Karumbayaram e colaboradores, que conseguiram pela primeira vez demonstrar que neurônios motores derivados de hiPSC apresentam atividade elétrica, também fizeram menção às diferenças existentes entre essas células e as hESC no que tange à capacidade de diferenciação em neurônios motores, sendo que hiPSC apresentam menor eficiência ao fazê-lo102. Com relação à metilação do DNA, Deng e colaboradores, pioneiramente, identificaram diferença na metilação entre iPSC e suas células doadoras (fibroblastos), e entre iPSC e ESC. Em relação à célula doadora, encontraram-se 288 regiões diferentemente metiladas, e a metilação em citosinas foi mais prevalente em iPSC. Com relação às ESC, iPSC apresentaram-se mais metiladas 103. No mesmo ano, Doi e colaboradores também relataram diferença em metilação de genes entre iPSC e ESC104. Em 2010, Hu e colaboradores testaram o potencial de diferenciação neural de diferentes clones de iPSC e ESC. Perceberam, então, que iPSC exibiam eficácia mais baixa de diferenciação (eficácia máxima de cerca de 50%, contra os cerca de 90% das ESC)105. No ano seguinte a tal publicação, Lister e colegas, analisando cinco clones de iPSC humanas, relataram que essas células possuem variabilidade significativa na reprogramação, a memória somática, previamente relatada e acima mencionada, e reprogramação aberrante de metilação (principalmente próximo aos centrômeros e telômeros), além de diferenças em modificações nas histonas106. Em 2012, Sepac e colaboradores compararam a capacidade de hESC e hiPSC de se diferenciarem em cardiomiócitos capazes de contração rítmica por um mesmo protocolo de cultura em meio definido com activina-A e BMP4. Apesar de ambos os tipos celulares terem sido capazes de expressar marcadores de cardiomiócitos, iPSC apresentaram menor formação de estrias e contratibilidade rítmica, exibindo, assim, pobre diferenciação terminal107. Em 2013, Huang e colaboradores publicaram um estudo da capacidade de endereçamento (ou homing) de hiPSC obtidas a partir de células endoteliais. Diferentemente de células endoteliais obtidas a partir de ESC de

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camundongos, as obtidas de hiPSC não foram capazes de se direcionar à região de isquemia nos membros superiores de camundongos. No entanto, os autores não atribuíram essa diferença diretamente ao fato de se utilizar iPSC ou ESC como fonte de diferenciação de células endoteliais. Mencionaram que, embora isso seja possível, também pode ter sido causado por dificuldades de comunicação celular interespecífica, visto que as ESC eram de murinos, que foram utilizados como animais de experimentação no trabalho, diferentemente das iPSC, que eram de origem humana108. Outros trabalhos também já foram publicados sugerindo que as consideradas diferenças apontadas por pesquisadores entre iPSC e ESC possam se dever, na verdade, a, por exemplo, diferenças de protocolo utilizado (diferenças na indução de diferenciação ou condições de cultura, por exemplo) ou à utilização de pouco número de clones celulares para avaliação. No que tange ao protocolo, por exemplo, as diferenças no contexto microambiental in vitro durante os experimentos foram analisadas por Newman e Cooper, através dos resultados de microarranjo de sete laboratórios diferentes. Encontrou-se correlação forte entre assinaturas de expressão gênica e um determinado laboratório; cerca de 33% dos genes com expressão laboratório-específica eram diferentemente expressos entre ESC e iPSC109. Com relação ao número de clones, a tendência observada por Yamanaka é a de que autores tendem a descrever diferenças notáveis entre iPSC e ESC quando trabalham com um baixo número de clones dessas células (entre 2 e12); no entanto, quando se elevam esses valores para cerca de 12 a 68 clones, relatase a dificuldade de se distinguir esses tipos celulares – visto que existem, inclusive, variações entre clones de um mesmo tipo celular (entre iPSC ou entre ESC)110. Boulting e colaboradores, utilizando dezesseis clones de iPSC, obtidas de sete indivíduos diferentes, observaram, em dois laboratórios independentes, a diferenciação destas em neurônios motores funcionais (similarmente ao que ocorre com as ESC induzidas à diferenciação)111. Logo, existem clones de iPSC que são indistinguíveis de alguns clones de ESC, e outros que se diferenciam destes. Essa diferença pode ser induzida, por exemplo, por perda de marcação (imprinting) em grupo (cluster) gênico. Em células de camundongos, a perda de imprinting do cluster Dlk1-Dio3 no cromossomo 12 acarretou prejuízo nas propriedades de iPSC durante os estudos de Stadtfeld e colaboradores 112. Essa perda de imprinting, por sua vez, pode ser acarretada por diferente ordem dos fatores de reprogramação no cassete de expressão (que conduz a diferentes níveis de expressão dos

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fatores), assim como pelas condições de cultura das células durante a reprogramação, dentre outras variáveis durante a execução do protocolo. Quadro 19.1 Por que iPSC e ESC são tão semelhantes? Shinya Yamanaka, que participou da geração pioneira de iPSC a partir de células somáticas, respondeu a esta pergunta de maneira bastante interessante. Em seu artigo intitulado “Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, and Future”, o ganhador do Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2012 fez uma reflexão e sugeriu que talvez ao comparar ESC com iPSC não se estivesse comparando uma célula que naturalmente existe no organismo e uma célula feita por humanos, respectivamente. É possível que o estado celular em que se reconhece uma célula como ESC seja uma consequência das condições específicas das células da massa celular interna (inner cell mass – ICM) do blastocisto. Ou seja, é possível que as ESC também sejam células feitas por seres humanos e não existam como tal em condições fisiológicas no organismo. Logo, ao compará-las com as iPSC, estaríamos comparando duas células feitas por humanos em condições padronizadas de cultura semelhantes – o que contribuiria para a similaridade encontrada entre elas110.

19.11 A BARREIRA DA REPROGRAMAÇÃO INCOMPLETA: UMA AMEAÇA À UTILIZAÇÃO DE iPSC? Como mencionado acima, a reprogramação de células somáticas em iPSC pode resultar em um processo incompleto, acarretando como resultado célula com, por exemplo, variações na expressão de genes e padrão de metilação diferente das ESC. Soma-se a isso o fato de ser ainda possível a ocorrência de mutações, conhecidas como mutações associadas à reprogramação. Ou seja, iPSC não apresentam mutações apenas quando as mantêm de uma célula de origem já mutada. Mutações podem ocorrer tanto durante a reprogramação quando após esta, quando as células iniciam sua proliferação. Gore e colaboradores analisaram 22 clones de hiPSC de diferentes laboratórios (ao todo, cinco diferentes métodos de reprogramação) e reportaram que estas continham mutações resultando em diferentes sequências de aminoácidos nas proteínas (mutações não sinônimas); tais mutações se apresentavam em maior número em genes relacionados ao câncer113. Relatou-se, ainda em 2011, que a variação em número de cópias (copy number variation – CNV) das iPSC é distinta da observada em seus fibroblastos de origem e em ESC. Mais CNVs ocorrem em iPSC em passagens iniciais, gerando mosaicismo nestas114. Análises de polimorfismo de nucleotídeo único (single nucleotide polymorphism – SNP) indicou alta frequência de CNV subcromossomal. Enquanto em hESC havia alto número de duplicações, mas em poucas amostras, em hiPSC encontrou-se número moderado de deleções, porém em várias amostras. As deleções em hiPSC, em grande

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parte de genes supressores tumorais, foram associadas então ao processo de reprogramação115. Quanto à reação do organismo às iPSC, também existem na literatura trabalhos que demonstram imunogenicidade a estas. Camundongos B6, quando receberam iPSCs produzidas por meio de retrovírus, obtidas a partir de fibroblastos embriônicos deste mesmo camundongo, rejeitaram os teratomas formados por estas iPSCs, diferentemente dos gerados a partir de ESC, que não foram rejeitados. As iPSC geradas de maneira epissomal (não integrativa no genoma) tiveram a maioria de seus teratomas rejeitados com infiltração de células T e dano tecidual. Análises de expressão gênica apontaram expressão anormal de genes responsáveis pela imunogenicidade observada 116. Seriam então esses relatos uma ameaça à utilização das iPSC em aplicações clínicas? Ao contrário dos relatos mencionados, existem outros trabalhos que apontam para uma possível aplicação segura das iPSC, sem a ocorrência dos problemas relatados. No próprio trabalho de Hussein e colaboradores, inclusive, já havia indícios de que iPSC, apesar de apresentarem as CNV devido à reprogramação, tendiam a selecionar seu crescimento em cultura contra essas células mutadas. Quando foram comparados os resultados de células em passagens iniciais com células em passagens intermediárias, percebeu-se que as células não mutadas prevaleciam, ficando a cultura cada vez mais semelhante à de ESC114. Abyzov e colaboradores desenvolveram um importante trabalho em 2012 com análise de genoma completo e transcriptoma de vinte clones de iPSC oriundas de sete diferentes indivíduos. Relataram que, em média, duas CNV estavam presentes por clone de iPSC, metade delas variantes genômicas (de mosaicismo somático em pele humana), já previamente presentes nos fibroblastos (não originadas com CNV de novo durante a reprogramação)117. Araki e colaboradores avaliaram a imunogenicidade de tecidos de medula óssea e pele diferenciados a partir de dez clones de iPSC de camundongos, comparando-os com os oriundos de sete clones de ESC. Não foram encontradas diferenças na taxa de sucesso dos transplantes, com resposta imune limitada ou ausente para ambas as células118. Thanasegaran e colaboradores observaram que a injeção de iPSC de camundongos em animais C57BL/6 foi capaz de produzir teratoma e não houve rejeição. As iPSC e células mieloides delas diferenciadas inseridas em scaffold poroso 3D, quando transplantadas em camundongos C57BL/6, foram capazes de rápida proliferação, aumentando a densidade de células e sem imunogenicidade detectada119.

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Liu e colaboradores observaram imunogenicidade baixa ao inserir células progenitoras neurais derivadas de iPSC, que, por sua vez, eram derivadas de fibroblastos de pele e células mesenquimais do cordão umbilical, em cultura com células mononucleares de sangue periférico. Essa baixa imunogenicidade foi ainda menor para células diferenciadas de iPSC de células mesenquimais do cordão umbilical120. Rais e colaboradores, por sua vez, obtiveram reprogramação sincronizada e determinista de células somáticas de camundongos e humanos em iPSC, em 2013. Além de utilizar transdução com fatores de reprogramação, também depletaram a proteína Mbd3 (como previamente mencionado neste capítulo), e apresentaram em seu trabalho uma nova metodologia para se evitar a reprogramação incompleta e com baixa taxa de sucesso87. Logo, os trabalhos que vêm sendo recentemente publicados acerca de características das iPSC são um convite à reavaliação dos trabalhos anteriormente publicados apontando diferenças entre iPSC e ESC capazes de impossibilitar aplicações clínicas das primeiras 121. Os novos resultados sugerem que iPSC possam vir, sim, a ser futuramente utilizadas em medicina regenerativa. No entanto, é necessário que sejam previamente mais profundamente estudadas e avaliadas para tal fim.

19.12 CONDIÇÕES DE CULTURA DE CÉLULAS PARA REPROGRAMAÇÃO CELULAR As condições de culturas das células para realização da reprogramação são de extrema importância para a obtenção de sucesso. As condições ótimas para a realização da técnica variam de acordo com o método escolhido para reprogramação, sendo a composição do meio de cultura a principal variável a se ajustar. Inicialmente, os ajustes das condições de cultura para obtenção de iPSC e sua posterior proliferação eram realizados de acordo com o que se observava para as ESC; diferentes protocolos de propagação das ESC foram, inclusive, comparados por iniciativa do The International Stem Cell Initiative Consortium em busca das condições otimizadas 152. Posteriormente, trabalhos foram publicados buscando otimizar as condições para iPSC oriundas de diferentes fontes por diferentes metodologias (ver Tabela 19.1 na qual estão listadas algumas moléculas úteis, que, quando adicionadas durante a cultura, podem aumentar a eficiência da reprogramação, auxiliando sua promoção).

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Chen e colaboradores obtiveram iPSC por meio do uso de retrovírus em meio de cultura otimizado. Este consistia em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com alta percentagem de glicose suplementado com 10% do reagente comercial KnockOut™ Serum Replacement, N2, L-glutamina, aminoácidos não essenciais, penicilina/estreptomicina, LIF e FGF153. Sun e colaboradores reprogramaram células-tronco adiposas de humanos adultos utilizando lentivírus e cultivaram e mantiveram as iPSC geradas de duas maneiras eficientes 154: em camada alimentadora de fibroblasto de embrião de camundongo e em frascos de cultura revestidos de Matrigel usando-se o meio comercial mTESR-1. Koide e colaboradores, por sua vez, estabeleceram condições ótimas de cultura para geração de iPSC via células HEK293, utilizando-se a transfecção de vetor de expressão do microRNA-302s. Para isso, fez-se uso de camada alimentadora de fibroblasto de embrião de camundongo irradiada e meio comercial N2B27 sem soro fetal bovino155. Zhao e colaboradores, utilizando meio comercial KnockOut™ DMEM suplementado com 20% de KnockOut™ Serum Replacement (também comercial), foram capazes de gerar iPSC de alta pluripotência (utilizando retrovírus), capazes de originar posteriormente camundongos156. Chen e colaboradores divulgaram condições quimicamente definidas para obter-se iPSC de maneira epissomal (livre de vetores virais e de integração no genoma celular). Propuseram o meio E8 e cultura e superfícies revestidas de vitronectina. Esse meio é isento de albumina sérica bovina (bovine serum albumin – BSA) e β-mercaptoetanol (BME), sendo composto de DMEM/F12, magnésio, L-ácido ascórbico-2-fosfato, seleneto de sódio, FGF2, insulina, NaHCO3 e transferrina, TGFβ12 ou NODAL, com pH 7,4157. Valamehr e colaboradores, utilizaram, além de DMEM com 10% de soro fetal bovino, glutamax e aminoácidos não essenciais, um coquetel chamado SMC4, com quatro inibidores (um para MEK, um para GSK, um para ROCK e outro para TGFβ), que foi adicionado após confluência (quatro a seis dias) 143 (ver Tabela 19.1 para mais exemplos de trabalhos que utilizaram, junto ao meio de cultura, outras moléculas para atuarem auxiliando a reprogramação nuclear). Além da composição de meios de cultura, a tensão de oxigênio também influencia a eficiência de geração das iPSC. Legner e colaboradores demonstraram que a hipóxia favorece a geração dessas células em cultura158.

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19.13 COMO IDENTIFICAR CÉLULAS REPROGRAMADAS? A identificação de células reprogramadas com sucesso na cultura, é passo crucial na obtenção de iPSC. Uma das metodologias utilizadas para tanto é a marcação de células vivas com o anticorpo TRA-1-60 (que também marca hESC)159. Os anticorpos, primário e secundário, são misturados e colocados sobre as células após remoção do meio de cultura. Após incubação por cerca de uma hora a 37 °C e 5% de CO2, a solução é removida, e após lavagem das células com PBS, adiciona-se meio de cultura fresco. Segue-se a análise em microscópio de fluorescência, na qual as células aparecem fluorescentes. Dessa maneira, as colônias fluorescentes podem ser selecionadas para um novo cultivo a fim de serem submetidas a análises por outros marcadores de pluripotência159. A marcação de pluripotência pode ser feita utilizando outros marcadores, como TRA-1-81 143, SSEA4 160, SSEA3 160, DNMT3B 161, REX1 161, CD326 160, CD30 162, NANOG 143 e OCT4 143 em células fixadas e, em geral, combinando-se mais de um marcador por vez (p. ex. SSEA4 e TRA-1-81143, CD30, SSEA4 e TRA-1-81162 e SSEA4 e TRA-1-60160). É ainda comum a realização de cariótipo das células obtidas 143,159, análise de expressão gênica via RNA extraído das células160, análise de integração genômica143, determinação de número de cópias no DNA extraído por PCR143,159, realização de Southern Blot com sondas para fatores de reprogramação 160, análise de metilação dos promotores OCT4 e NANOG 161, formação de corpo embrioide 159 e de teratoma143,159,161. A formação de corpo embrioide é avaliada após cerca de duas semanas por meio da geração de estruturas císticas na cultura. Estes são então dispersados e transferidos à placa recoberta de gelatina por cerca de dois dias, depois dos quais é possível fixar e corar as células típicas dos três folhetos embrionários e do trofoectoderma. Para isso, podem-se utilizar anticorpos primários, como para α-fetoproteína, actina de musculatura lisa, Alexa Fluor 555-conjugado à β-tubulina classe III159. A formação de teratoma é avaliada após a injeção das células de forma intramuscular na pata traseira de camundongos imunodeficientes. Em cerca de dois a três meses, em média, costuma ser possível a detecção de tumores apalpáveis 159. Pode-se ainda introduzir as células na cápsula renal e testículo de camundongos Beige SCID143, ou injetá-las de forma subcutânea em camundongos NOD-SCID Il2rg-null160. Logo, a caracterização de iPSC é uma etapa demorada que pode durar meses; porém, é essencial que seja realizada para que se obtenha células

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com reprogramação completa, distinguindo-as de clones com reprogramação parcial.

19.14 EXPANSÃO DAS iPSC Os processos de expansão utilizados para a produção de uma colônia de iPSC são semelhantes aos de células-tronco embrionárias e, por mais que as ferramentas moleculares tenham evoluido para a geração dessas células, os métodos de expansão não acompanharam esse avanço163-165. Os protocolos atuais dependem que as células em reprogramação façam sua adesão para propagarem, além do fato de ainda serem utilizados microambientes que possuem componentes de origem animal, aumentando, assim, o risco de contaminação das células em indução 166,167. As iPSC derivadas de células somáticas necessitam de componentes de matriz extracelular para se aderirem e de células alimentadoras para seu processo de expansão. Assim, as células-tronco ficam mais propensas à variabilidade, além do fato de exigirem uma etapa de separação das células induzidas e das células alimentadoras165,167. Nas culturas de células iPS, o processo de expansão ocorre por meio de passagens seriadas. Em camundongos, as colônias conseguem resistir a partir de uma única célula e possuem rápida proliferação, pois o processo de passagem se dá por meio enzimático. Entretanto, em humanos as primeiras passagens devem ser realizadas por processos mecânicos, e só após várias passagens pode-se utilizar o processo enzimático, além do fato de tais colônias não resistirem a partir de uma única célula163. Em ambas as culturas deve-se remover continuamente estruturas diferenciadas, visto que tais células são propensas a se diferenciarem nas primeiras passagens165. Uma alternativa ao tipo de cultura mencionado acima seria a cultura suspensa, em que as células que seriam expandidas e mantidas flutuariam na ausência de células alimentadoras. Pesquisadores têm demonstrado que células-tronco embrionárias humanas e de camundongos foram ampliadas e mantidas com seus estados de pluripotência nesse tipo de cultura 168,169; entretanto, as culturas em suspensão requerem uma série maior de dissociações e agregações que limitam o processo de eficiência e rendimento das células167. Fluri e colaboradores realizaram um trabalho no qual derivaram célulastronco pluripotentes induzidas a partir de células somáticas de camundongos utilizando cultura em suspensão livre de substratos de tecido, soro ou camadas de suporte com células alimentadoras. Compararam as características

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das células induzidas em suspensão com uma cultura convencional, dependente de aderência, e observaram que as características funcionais, os marcadores de pluripotência e o perfil de expressão genética geral foram semelhantes nos dois tipos de cultura167. Esse trabalho exemplifica um avanço na metodologia de expansão das células iPS, contribuindo para contornar as limitações que restrigem o potencial dessas células a favor da ciência e da sociedade.

19.15 CARACTERIZAÇÃO E EFICIÊNCIA DE INDUÇÃO DAS CÉLULAS iPS Durante e após o processo de expansão das células-tronco induzidas, é necessário verificar se tais células apresentam características funcionais, morfológicas e moleculares semelhantes às células-tronco, pois a derivação das células por meio de uma reprogramação mal sucedida pode produzir estruturas que não correspondem ao perfil de uma iPSC. Entretanto, com a possibilidade de inúmeros ensaios disponibilizados para a demonstração de pluripotência, há uma quantidade mínima de critérios a serem alcançados para se certificar que a derivação de uma iPSC foi concluída com sucesso. O primeiro consiste na independência do transgene, ou seja, a célula induzida deve ser capaz de produzir os produtos dos genes de pluripotência, manter sua capacidade proliferativa e de diferenciação independente da necessidade de mais transgenes serem entregues às células. Além disso, como segunda condição, a célula deve expressar em maior quantidade esses genes de pluripotência, ao mesmo tempo que regula para um nível menor de expressão os genes específicos da linhagem da célula de origem. O terceiro critério consiste em apresentar todos os atributos morfológicos, incluindo a capacidade ilimitada de autorrenovação. A quarta condição compreende um teste de rigor aceitável para averiguar a diferenciação funcional165. Como condição do critério de diferenciação funcional, as iPSC devem apresentar a capacidade de se diferenciar em linhagens derivadas dos três tipos de folhetos embrionários. Entretanto, o teste de rigor para utilização com células humanas ou de camundongos é diferente. Neste último, as células devem ser capazes de formar células germinais que, quando transferidas, podem originar descendentes por um processo conhecido como transmissão germinal165. Já em humanos, uma análise histológica e imuno-histoquímica

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confirmaria as estruturas derivadas das camadas germinativas, por meio de uma técnica que utiliza formação de teratomas170. Outra importante questão envolve a possibilidade das células cultivadas por um longo período de tempo adquirirem cariótipos anormais, sendo interessante testar as células com relação a lesões genéticas165,171. Em nível molecular, as iPSC devem apresentar reativação do cromossomo X feminino, conter modificações opostas sobrepostas de histonas em genes com domínios bivalentes, conter antígenos específicos de células-tronco embrionárias, expressar telomerase; os promotores dos genes de pluripotência devem estar desmetilados e deve ocorrer aumento da expressão de proteínas de genes de pluripotência de forma independente da expressão do transgene165,172-174. A criação de uma padronização dos métodos de avaliação da eficiência em produzir células-tronco pluripotentes induzidas permitiria uma comparação e interpretação dos experimentos diversos. Maherali e colaboradores propuseram em seu trabalho medidas que evitariam as discrepâncias encontradas nas medidas de eficiência dos artigos. Os autores defendem a quantificação do número de células que expressam todos os fatores em vez do número de células que incorporaram os fatores (porém, sem expressão destes), a elaboração de um método de identificação e quantificação de colônias de iPSC, a inclusão de uma contagem de células ou revestimento de uma única célula e eliminação da contagem de clones irmãs de placas de única célula165. Esses procedimentos executados e todas as abordagens envolvendo o estudo das células induzidas permitiria a interpretação dos procedimentos para otimização das técnicas de reprogramação e derivação.

19.16 POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS E/OU INDUSTRIAIS Uma grande dificuldade da pesquisa é a possibilidade de criar modelos animais para reproduzirem doenças que acometem seres humanos, devido às diferenças genômicas entre esses animais e a restrição fisiopatológica humana 175,176. Porém, o estudo com células iPS proporcionaria a oportunidade do estudo da patogênese in vitro, visto que as células-tronco pluripotentes induzidas são produzidas a partir de células somáticas paciente-específicas e, por isso, possuem o mesmo material genético do doador, e com isso, tais células representariam a patologia do paciente177. Essa ferramenta, denominada “modelagem de doença em placa” 177 , é importante também para a investigação dos mecanismos envolvidos na

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Tabela 19.3 Caracterização das iPSC de camundongos e humanos

CAMUNDONGOS ENSAIOS MOLECULARES Colônia de iPSC primárias

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL

Intervalo para produção das iPSC primárias: aproximadamente 2 semanas

- Imunocoloração e RT-PCR para análise da expressão de genes de pluripotência 1 a 2 semanas - Determinação do padrão de metilação do DNA por tratamento deste com bissulfito - Cariótipo e perfil transcricional 2 a 3 semanas - Perfil de modificação das histonas e reativação cromossomo X

HUMANOS ENSAIOS MOLECULARES

CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL

Intervalo para produção das iPSC primárias: aproximadamente entre 3 e 4 semanas

- Ensaio de combinação tetraploide e injeções de blastocisto - Início da diferenciação in vitro

- Análise da diferenciação in vitro

- Imunocoloração e RT-PCR para análise da expressão de genes de pluripotência - Início da diferenciação - Determinação do in vitro padrão de metilação do DNA por tratamento deste com bissulfito

4 a 6 semanas

- Análise da diferenciação in vitro

6 a 8 semanas

- Cariótipo e perfil - Análise da diferenciação in transcricional vitro (quimeras, teratomas e - Perfil de modificação - Injeções de blastocisto complementação tetraploide) das histonas e reativação do cromossomo X

10 a 12 semanas

- Teste da transmissão germinal

14 a 16 semanas

- Determinação da transmissão germinal

16 a 20 semanas

- Análise da autorrenovação

- Análises de teratomas e autorrenovação

Fonte: Modificado de Guidelines and Techniques for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells165.

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formação de tecidos no âmbito fisiológico e patológico, além de tais células funcionarem para ensaios toxicológicos178. Tal abordagem de modelagem de doença tem sido utilizada nos estudos executados por Park e colaboradores, que derivaram iPSC a partir de células somáticas de pacientes com doenças genéticas variadas ou de herança mendeliana, incluindo distrofia muscular de Duchenne, distrofia muscular de Becker, doença de Parkinson, doença de Huntington, diabetes mellitus juvenil, trissomia do cromossomo 21, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Shwachman-Bodian-Diamond (SBDS) e imunodeficiência combinada severa relacionada à deficiência de desaminase adenosina175. Pacientes que apresentam distúrbios de único gene, como leucemia de células falciformes, recebem reparo do gene danificado ex vivo, e tais células corrigidas são transplantadas para o hospedeiro. Entretanto, doenças que apresentam uma base genética indefinida, tais como Parkinson e diabetes mellitus juvenil, não possuem um gene específico para a patologia, sendo assim, são difíceis de serem reparadas175. Outro campo para o qual a pesquisa com iPSC contribuiu foi a descoberta de medicamentos, com a avaliação das respostas da célula aos efeitos farmacológicos da droga e verificação da ação desta sobre tal unidade morfológica179. Essa forma de estudo é comprovada pela pesquisa de Lee e seus colaboradores, na qual os precursores da crista neural derivadas de iPSC de indivíduos com disautonomia familiar tratados com cinetina apresentaram reparação da mutação do gene IKBKAP. O efeito da droga nesse estudo está ligado a uma compensação da falha do mecanismo celular, e tal pesquisa também demonstra a viabilidade da iPSC como estudo de modelos para utilização de medicamentos179,180. A aplicação na medicina regenerativa seria o objetivo mais promissor da utilização das iPSC. A intenção era transplantar células progenitoras a partir de iPSC específicas de cada paciente a fim de recuperar todo o tecido danificado, sem, no entanto, promover formação de tumor e/ou desencadear resposta imunológica179. Esse feito foi comprovado por Hanna e seus colaboradores, que corrigiram o alelo da hemoglobina falciforme das células de paciente, diferenciaram estas em iPSC progenitoras hematopoéticas e transplantaram tais células nos ratos, resgatando o fenótipo das células do sangue 181. Em outro estudo, foi demonstrado que células progenitoras cardiovasculares humanas transplantadas em camundongos foram capazes de recuperar danos no coração, pois tais células progenitoras foram capazes de migrar, proliferar e diferenciar em cardiomiócitos, células musculares lisas e células endoteliais177,182.

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19.17 PROTOCOLOS PARA A PRODUÇÃO DE iPSC 19.17.1 Meios de cultura Meio completo de fibroblastos • 450 mL DMEM • 50 mL soro fetal bovino • 5 mL penicilina/estreptomicina • 5 mL glutamina 100x • 5 mL de aminoácidos não essenciais 100x • 0,5 mL de β-mercaptoetanol Meio completo de células-tronco embrionárias de camundongos (mESC) • 425 mL de DMEM KnockOut • 75 mL de soro fetal bovino • 5 mL penicilina/estreptomicina • 5 mL glutamina 100x • 5 mL de aminoácidos não essenciais 100x • 0,5 mL de β-mercaptoetanol • 0,5 mL de LIF 1.000x (comercial ou recombinante) Meio completo de células-tronco embrionárias humanas (huES) • 400 mL de DMEM/F12 1:1 • 100 mL de soro de substituição KnockOut • 5 mL penicilina/estreptomicina • 5 mL glutamina • 5 mL de aminoácidos não essenciais • 0,5 mL de β-mercaptoetanol • 10 ng/mL bFGF Meio de diferenciação de corpos embrioides de camundongos (mEB) • 425 mL de IMDM • 75 mL de soro fetal bovino • 5 mL penicilina/estreptomicina • 5 mL glutamax • 18,9 µL de monotioglicerol • 2 mL de transferrina saturada com Fe • 250 µL de ácido ascórbico (50 mg/mL)

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• 5 mL de aminoácidos não essenciais • 5 mL de piruvato de sódio (100 mM)

19.17.2 Preparação de fibroblastos embrionários de camundongos (mEFs) para reprogramação 1) Entre os dias 12,5 e 15,5 do embrião, sacrificar a fêmea grávida. 2) Colocar o camundongo de costas e cortar o abdômen. 3) Localizar os cornos uterinos onde os embriões são visíveis. Para dissecar o útero, cortar abaixo do colo do útero e através do oviduto. 4) Mergulhar o útero em Wescodyne diluído em PBS (proporção de 1:200) por 30 segundos a 1 minuto, para evitar contaminação com micoplasma. Em seguida, lavar por 3 vezes em PBS. 5) Em um placa de cultura de 10 centímetros, utilizar um par de fórceps e tesouras para retirar o embrião do útero. 6) Retirar a cabeça e órgãos internos do embrião e colocar, o embrião sem a cabeça e seus órgãos internos, em uma nova placa de 10 cm com uma gota de tripsina. Observação: há risco de contaminação da cultura com células progenitoras neurais e células hematopoiéticas caso a cabeça e o fígado fetal não sejam completamente removidos. 7) Cortar completamente o embrião com bisturi, triturando-o em pedaços finos. 8) Adicionar meio completo mEFs e suspender o embrião triturado com pipetagens repetitivas. 9) Cultivar as mEFs a 37 °C com 4% de O2. Não perturbar a placa durante as primeiras 48 horas, para que os fibroblastos cresçam. As mEFs podem ser mantidas por várias passagens em condição de normoxia (21% de O2), entretanto sua capacidade de reprogramação diminui com o tempo devido à senescência provocada pelo estresse oxidativo. Caso utilize a condição de normoxia, utilize antes da quarta passagem para obtenção de melhores resultados.

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19.17.3 Derivação de iPSC a partir de fibroblastos humanos ou de camundongos Há inúmeros métodos de derivação completa de iPSC (Tabela 19.4), entretanto é mais comum a utilização de células de camundongos reprogramáveis ou lentivírus. Tabela 19.4 Métodos de derivação completa de iPSC

SISTEMA DE REPROGRAMAÇÃO

MÉTODO DE ENTREGA DO FATOR

FORNECEDOR

STEMCCA

Lentivírus

EMD Millipore

Stemgent 4F2A&4F2A-loxP

Lentivírus

Stemgent; Sigma

Stemgent mRNA Reprogramming Factors

mRNA

Stemgent

CytoTune-iPS

Vírus sendai

Invitrogen

Col1a1tm(tet0-Pou5f1,-Klf4,-Sox2,-Myc)Hoch/J

Reprogrammable Mouse

Jackson Laboratory

Col1a1tm(tet0-Pou5f1,-Klf4,-Sox2,-Myc)Jae/J

Reprogrammable Mouse

Jackson Laboratory

19.17.4 Protocolo geral de derivação de iPSC de fibroblastos em placas de 6 poços 1) Plaquear em placas de 6 poços contendo meio de fibroblastos cerca de 100.000 a 200.000 fibroblastos de passagem inicial e deixar “overnight” (pular para a etapa 3 se utilizar infecção viral). 2) Entrega dos fatores de reprogramação por exposição a intervalos de 12 a 24 horas com altos títulos de vírus. Observação: o protocolo/tempo de infecção depende do título viral/eficiência de infecção, portanto, o protocolo deve ser ajustado de acordo com essas características. 3) Cobrir com gelatina 0,2% os 6 poços da placa por 30 minutos a uma temperatura de 37 °C durante a infecção. Retirar a gelatina e plaquear células irradiadas CF-1 ou DR4 MEFs a uma concentração de 250.000 a 500.000 células por poço. 4) Trocar o meio por outro contendo 3 mL de células embrionárias humanas ou de camundongos. Antes do processo de repique dos fibroblastos

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infectados. Adicionar ao meio doxiciclina na concentração de 1 µg/mL em sistemas induzíveis. 5) Tripsinizar os fibroblastos infectados. Em poços contendo gelatina e meio com células embrionárias humanas ou de camundongos, plaquear essas células na concentração de 1.000 a 10.000 células por poço. Adicionar ao meio doxiciclina na concentração de 1 µg/mL em sistemas induzíveis. Observação: a eficiência da reprogramação determinará a quantidade de células que serão plaqueadas por poço. 6) Monitorar as colônias emergentes e trocar o meio diariamente. As células que estão se reprogramando proliferarão rapidamente, sofrerão transição morfológica de células epiteliais para células mesenquimais e formarão agrupamentos de colônias semelhantes aos de células-tronco embrionárias. Linhagens de camundongos com Oct-4 e Nanog marcados com GFP podem ser monitoradas devido à ativação promovida no loci de pluripotência ao redor do 9º dia de reprogramação. 7) Remover a doxiciclina entre os dias 14 e 21 da reprogramação de fibroblastos humanos ou entre os dias 12 e 15 da reprogramação de fibroblastos de camundongo, no caso de sistemas induzíveis. Em seguida à lavagem de doxiciclina, deixar por 5 dias para regressão das colônias dependentes de fatores exógenos e, após este passo, analisar e colher as iPSC.

19.17.5 Crescimento e expansão de iPSC de camundongos 1) Clones de iPSC podem ser colhidos 5 dias depois da remoção da doxiciclina no caso de reprogramação de sistemas induzidos, ou cerca de 20 dias no caso de sistemas de reprogramação com lentivírus constitutivos retrovirais. Ao escolher as colônias, elas devem se assemelhar as de células-tronco embrionárias, entretanto pode haver células diferenciadas ao redor das colônias antes da primeira expansão. 2) Para escolha dos clones, preparar uma placa de 96 poços em V com 60 µL de PBS por poço, sem MgCl2 ou CaCl2. 3) Em um microscópio de luz invertida, utilizar ponta de ponteira P10 ou P20 para cortar as colônias individuais. 4) Transferir a colônia para placa de 96 poços e dissociar a colônia com pipetagens repetitivas. 5) Adicionar em cada poço 30 µL de tripsina 0,25% e incubar a 37 °C por 10 minutos.

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6) Transferir os clones para uma placa gelatinada de 24 poços contendo alimentadores irradiados para expansão. 7) Trocar o meio a cada dois dias e utilizar divisões regulares 1:50 para evitar a superlotação e diferenciação das células.

19.17.6 Crescimento e expansão de iPSC humanas 1) Escolher as colônias que se assemelharem às de células-tronco embrionárias humanas e utilizar ponta de ponteira P10 ou P20 para cortar as colônias individuais. 2) Transferir os clones para uma placa gelatinada de 6 poços contendo alimentadores irradiados para expansão. Observação: iPSC e ESC não toleram ser individualizadas em um poço. Para as passagens, não utilizar digestão enzimática. 3) Trocar o meio diariamente para evitar a diferenciação e utilizar as pipetas P10 ou P20 para as passagens. Caso ocorra diferenciação durante as passagens, adicionar inibidor ROCK ao meio seguinte para reduzir esse processo.

19.17.7 Análise das iPSC: imunofluorescência A imunofluorescência é útil para verificar a expressão dos fatores de transcrição ao longo da reprogramação e geração das iPSC. Os marcadores mais conhecidos que indicam o potencial de pluripotência das células tronco induzidas são Oct-4, Nanog e Sox-2. Caso ocorra perda da expressão desses fatores, as células perderam sua pluripotência ou se diferenciaram. É recomendável também detectar os antígenos (por meio de anticorpos específicos) que se encontram na superfície das células-tronco pluripotentes, tais como TRA-1-60, TRA-1-81 e SSEA4. Esses marcadores funcionarão como controle da pluripotência da cultura, juntamente com os fatores de transcrição mencionados acima. No caso de células iPS de camundongos, a expressão de SSEA1 na superfície da célula pode funcionar como indicador de pluripotência.

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19.17.8 Diferenciação in vivo de iPSC por meio da formação de teratoma Um ensaio in vivo para avaliar a pluripotência das células iPS consiste na formação de teratomas em modelo experimental. Esta técnica consiste na injeção por via subcutânea de iPSC em camundongos imunodeficientes, e o potencial de pluripotência das células é avaliado por meio da capacidade de tais células originarem derivados dos três tipos de folhetos embrionários: endoderma, mesoderma e ectoderma. 1) Crescer iPSC em placas de 6 poços contendo gelatina e alimentadores para células iPS de camundongo até atingirem confluência maior de 60%. Para iPSC humanas, transferir antes para placas de 10 cm contendo matrigel livre de alimentadores, a fim de evitar contaminação com fibroblastos. Utilizar a placa depois de atingir mais de 80% de confluência. Tratar as células iPS humanas com 1 mg/mL de colagenase IV (em DMEM/F12) por 5 minutos a 37 °C. Para iPSC de camundongo, tripsinizar e transferir para frasco T-25 sem gelatina e contendo meio completo mES. Incubar por 30 minutos a 1 hora em 37 °C e depois recolher os agregados de células. Este agregado corresponde a fibroblastos, pois eles se anexam mais rapidamente do que as células induzidas, o que permite o enriquecimento das iPSC. 2) Ressuspender as células em PBS com MgCl 2 e CaCl 2 e diluir 0,5-1x106 células por 300 µL. 3) Anestesiar o animal SCID ou NOD/SCID com isoflurano. Depois, puxar a pele do flanco traseiro do camundongo para longe do peritônio e inserir a agulha de calibre 23 (contendo 300 µL de células ressuspensas) neste espaço, tomando cuidado para não atingir o peritônio. Deve-se sentir uma bolha abaixo da pele do camundongo e verificar se a solução injetada não escoará para fora. 4) O teratoma deve crescer por 3 a 6 semanas, e em seguida deve-se dissecá-lo para histologia. Por meio da coloração HE, deve-se constatar os derivados do endoderma, mesoderma e ectoderma.

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19.17.9 Diferenciação de iPSC de camundongos por meio da formação de corpos embrioides 1) Crescer iPSC em placas de 6 poços contendo gelatina e alimentadores para células iPS de camundongo até atingirem confluência maior de 60%. Certificar-se de que a cultura não apresenta sinais de diferenciação. 2) Tripsinizar e transferir as iPSC de camundongo para frasco T-25 sem gelatina e contendo meio completo mES. Incubar por 30 minutos a 1 hora a 37 °C e depois recolher os agregados de células. 3) Ressuspender as iPSC em meio de diferenciação EB na proporção de 400 células por 30 µL. 4) Na tampa de uma placa de Petri de 15 cm, fazer gotas de 30 µL com uma multicanal. Em seguida, colocar a tampa sobre a placa cuidadosamente, de modo que as gotas fiquem penduradas na tampa. 5) Incubar a 37 °C durante 3 a 4 dias. Na mesma direção de cada gota, devem se formar corpos embrioides no fundo da placa. 6) Para coletar os EB, inverter a tampa e lavar com PBS. Em seguida, transferir para tubo cônico. Esperar os EBs colonizarem e aspirar o PBS. 7) Transferir os EB para placas de Petri de 10 cm contendo meio de diferenciação EB e colocar a placa sobre um agitador com velocidade baixa e temperatura de 37 °C. Trocar o meio todos os dias. Os EB podem ser recolhidos no centro da placa após movimento circular e podem ser conduzidos a diferenciar em vários tipos de células das 3 camadas germinais.

19.17.10 Diferenciação de iPSC de humanos por meio da formação de corpos embrioides 1) Transferir as células para placas contendo matrigel livre de alimentadores, a fim de evitar contaminação com fibroblastos. Tratar as células em placas de 10 cm com 1 mg/mL de colagenase IV por 5 minutos a 37 °C. 2) Coletar as células, dar spin e ressuspender em 4 mL de meio de célulastronco embrionárias sem bFGF. Plaquear as células em placas de 6 poços de baixa fixação. 3) Para evitar aglutinação das células, incubar em agitador a 37 °C. Trocar o meio a cada dois dias, girando a placa em movimento circular e aspirando o meio da borda. 4) Esperar os EBs por 16 dias para diferenciar, antes de dissociá-los para análise ou para mais diferenciação.

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19.17.11 Solução de problemas – Razões comuns Falha da reprogramação Baixa eficiência da infecção viral ou título viral: a população de células expressando os fatores de reprogramação deve ser máxima, pois a reprogramação é relativamente ineficiente. A escolha da célula a ser reprogramada, assim como a forma de infecção, são importantes para a eficiência da metodologia. Por exemplo, se as células possuem capacidade divisória lenta, a forma de infecção por lentivírus seria mais adequada, visto que os retrovírus só infectam células em divisão. Fatores de reprogramação marcados são utilizados para quantificar a porcentagem de células com expressão desses fatores, por meio de imunofluorescência. Os fatores exógenos de reprogramação podem também ser verificados em nível populacional por meio de RT-qPCR.

Morte na população inicial ou durante a reprogramação e senescência celular elevada A morte de células pode ser causada por infecção viral tóxica, devido ao alto título viral ou tempo de infecção prolongado, provocando, assim, redução na eficiência da reprogramação. A ativação das vias de senescência se deve ao estresse oxidativo, por isso é recomendado que as células sejam mantidas, desde a população inicial, em atmosfera com 4% de O2.

Condições inibitórias no meio A qualidade do soro pode variar entre os diferentes lotes, e isso pode exercer efeito na eficiência de reprogramação das células. Sugere-se fazer um piloto de reprogramação com todos os lotes disponíveis de soro ou mesmo utilizar soro nocaute para reprogramação. Adicionalmente, pode se utilizar aditivos para aumentar a reprogramação, tais como ácido ascórbico, TGF-b e inibidores de HDAC.

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Infrequência nas trocas do meio ou elevada densidade de células O meio sofre alteração durante o processo de reprogramação das células, por isso deve-se manter as culturas de reprogramação em meios frescos. Essa condição pode provocar reprogramação inconsistente ou mesmo falha completa da reprogramação. Outra condição que interfere na eficiência da reprogramação consiste em sobrecarregar a cultura com muitas células, de modo que os recursos são consumidos muito rapidamente e o contato inibe o crescimento das células.

19.18 PERSPECTIVAS FUTURAS Para o progresso da pesquisa com iPSC em ensaios clínicos é necessário uma colaboração bem coordenada entre os laboratórios responsáveis pela reprogramação dessas células e os departamentos de clínica cirúrgica e transplante183. Entretanto, a tecnologia ainda suscita preocupações de segurança que limitam sua aplicabilidade. Isso se deve ao fato de a metodologia para obtenção dessas células utilizar transgenes para reprogramação entregues por retrovírus, que podem se integrar ao genoma do hospedeiro promovendo instabilidade genômica61,70. Para a medicina regenerativa e terapia celular, as células-tronco pluripotentes induzidas são uma ferramenta revolucionária, pois permitem o estudo e a compreensão das patologias dos indivíduos afetados, proporcionando quantidades suficientes de células para terapia de reposição celular, além do estudo das ações dos agentes terapêuticos sobre essas células 184. O diferencial da utilização das iPSC em comparação ao desenvolvimento de células embrionárias humanas deve-se ao fato de as células induzidas serem produzidas a partir de células somáticas paciente-específicas e se diferenciarem em diferentes tipos de células sendo, portanto, livres de questões éticas e incompatibilidade imunológica177,184. Asgari e colaboradores destacaram em seu trabalho alguns obstáculos que devem ser superados para que a terapia envolvendo as iPSC sejam realidade. O primeiro desafio é gerar iPSC sem integração viral, evitando assim a possibilidade de instabilidade genômica. Em segundo lugar, as células iPS devem ser submetidas a triagem e avaliação da qualidade, e, para tanto, deve-se aumentar a eficácia da produção dessas células. Em terceiro, uma compatibilidade entre as células diferenciadas deveria ser avaliada por meio das células-tronco e das células somáticas específicas in vivo. O quarto

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obstáculo seria obter culturas de células puras, sem qualquer tipo de contaminação que comprometesse a segurança delas. O último desafio, citado no artigo, seria a garantia de função das células iPS após o transplante, sem problemas também de rejeição imunológica185.

19.19 CONCLUSÃO As iPSC são derivadas da reprogramação de células diferenciadas ou somáticas por meio de fatores de reprogramação, retornando, assim, ao estado de pluripotência semelhante ao de uma célula-tronco embrionária. Portanto, as células induzidas apresentam a capacidade indefinida de divisão e diferenciação nos três tipos de folhetos embrionários humanos. A vantagem em relação às células embrionárias está em evitar as questões éticas envolvendo a utilização de embriões humanos, além do fato destas últimas serem oriundas de indivíduos diferentes do paciente, possibilitando respostas imunológicas de rejeição. Vários processos para a geração, expansão e caracterização das iPSC têm apresentado grandes progressos, a fim de proporcionar culturas mais puras e com garantias de segurança para aplicação em várias áreas da ciência, visto que as técnicas atuais são utilizadas para células-tronco embrionárias, mas diferem na questão de eficiência e rendimento dessas células em comparação com as induzidas. Dentre as várias contribuições que o uso das células iPS podem trazer para a ciência e a sociedade, podemos mencionar a utilização na terapia celular associada ao transplante, na medicina regenerativa, no estudo dos efeitos de medicamentos e drogas sobre as células diferenciadas a partir das induzidas, além de contribuir para uma maior compreensão acerca dos mecanismos celulares envolvidos nas patologias que atingem os pacientes. Percebe-se também que a pesquisa sobre as iPSC apresenta algumas limitações que, com o progresso da ciência, poderão ser contornadas. Tais obstáculos concentram-se no processo envolvido para derivação dessas células induzidas, tais como a forma de entrega dos fatores de reprogramação, a integração viral no genoma dessas células, a compatibilidade das células diferenciadas oriundas de iPSC e as células somáticas in vivo e a garantia de função e eficácia em transplantes sem problemas de rejeição. A resolução de tais impedimentos permitiria que todo o potencial dessas células fosse, então, utilizado em benefício da sociedade.

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CAPÍTULO

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REPROGRAMAÇÃO NUCLEAR DE CÉLULAS PARA UM ESTADO PLURIPOTENTE USANDO TRÊS ESTRATÉGIAS Vânia Aparecida Mendes Goulart Fernanda Maria Policarpo Tonelli José Luiz da Costa Luiz Orlando Ladeira Katia N. Gomes Alexandre Hiroaki Kihara Rodrigo R. Resende 20.1 INTRODUÇÃO 20.1.1 O que são células pluripotentes?

As células pluripotentes possuem a capacidade de se diferenciarem para dar origem a células dos três folhetos embrionários (ectoderme, mesoderme e endoderme) (Figura 20.1)1,2.

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Durante o desenvolvimento embrionário, por exemplo, pode-se identificar no estágio de blastocisto um arranjo celular conhecido como massa celular interna3,4. É deste arranjo que se originam as células-tronco embrionárias, que são pluripotentes (Figura 20.1)5,6. A partir de embriões de camundongos, podem-se obter duas outras células pluripotentes: as células-tronco epiblásticas e as células embriônicas germinativas, obtidas, respectivamente do epiblasto nos estágios iniciais pós -implantação e da cultura de células germinativas primordiais (Figura 20.1) 3. Uma outra fonte de obtenção de células pluripotentes, e que independe do embrião, é o foco principal do presente capítulo: a reprogramação nuclear de células já diferenciadas.

Figura 20.1 Células pluripotentes podem ser obtidas a partir da massa celular interna do blastocisto, epiblasto do blastocisto tardio, do embrião (células embriônicas germinativas). Essas células pluripotentes podem, ao se diferenciar, dar origem a células derivadas dos três folhetos embrionários (ectoderme, mesoderme e endoderme).

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20.1.2 O que são células terminalmente diferenciadas? As células ditas terminalmente diferenciadas originam-se durante o desenvolvimento embrionário dos três folhetos embrionários existentes no estágio de gástrula7. As células desses três folhetos originam linhagens de células somáticas com funções bem definidas, como, por exemplo, células do músculo cardíaco (mesoderme), células da pele (ectoderme) e células pancreáticas (endoderme)8,9. O processo de geração dessas células envolve uma série de etapas e mudanças profundas na expressão gênica que faz com que estas não possam se transdiferenciar, ou seja, converter-se de um tipo celular em outro10 espontaneamente1. Por essa razão, até a década de 1960, não se acreditava que seria possível remover uma célula diferenciada de um microambiente e inseri-la em outro, induzindo assim que esta exibisse plasticidade e passasse a se comportar como as células do novo local. Também não havia evidências de que seria possível a obtenção de estágio de pluripotência a partir de células já diferenciadas.

20.2 HISTÓRICO: A TRANSDIFERENCIAÇÃO E A REPROGRAMAÇÃO NUCLEAR No ano de 1962, anunciou-se a primeira das três estratégias de obtenção de células pluripotentes a partir de células já diferenciadas. John Gurdon publicou um trabalho no qual relatava a reprogramação nuclear de oócitos de Xenopus laevis laevis através de transferência nuclear. Essa estratégia envolve a remoção do núcleo da célula receptora, no caso o oócito, e a transferência do núcleo da célula doadora para esta anucleada. As células doadoras utilizadas por Gurdon foram células diferenciadas da base do intestino de girinos. As células resultantes do procedimento foram capazes de sofrer sucessivas divisões celulares, retornando a um estágio de pluripotência, e originar indivíduos adultos (Figura 20.2). Em 1966, a transdiferenciação foi observada por Hadorn, trabalhando com Drosophila melanogaster. Ele mostrou ser possível que células destinadas a formar estruturas genitais pudessem originar estruturas de patas e cabeça após serem inseridas no abdômen do inseto adulto11. Dessa forma, pode-se constatar, novamente, que células já diferenciadas, ainda guardam o potencial de ativar genes característicos de outro tipo

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Figura 20.2 A transferência nuclear na obtenção de pluripotência. A primeira estratégia, transferência nuclear, descrita por Gurdon em 1962, tem o objetivo de obter células pluripotentes a partir de células já diferenciadas. Atualmente, além dessa estratégia há outras duas, a saber, fusão celular e indução de pluripotência por meio de fatores de transcrição.

celular e se comportar como tal. A transdiferenciação pode ocorrer desde que haja um ambiente que a induza. No ano seguinte à publicação de Hardon, Gehring realizou um experimento com Drosophila melanogaster no qual se marcou geneticamente (induzindo-se com choques elétricos crossing over e/ou mutações) células do disco antenal de larvas de tal organismo. Depois de cultivá-las em hospedeiro adulto e transplantá-las para larvas, observou-se que células que normalmente originariam estruturas do palpo maxilar originavam estruturas de asas, a depender do local onde eram transplantadas12. Em 1974, Selman e Kafatos utilizaram pela primeira vez a palavra transdiferenciação para descrever a conversão de células produtoras de cutícula em células secretoras de sal no bicho-da-seda, durante a metamorfose de larva à mariposa adulta13. Um ano após a publicação desse trabalho, Le Lievre e Le Douarin demonstraram que, com células de um organismo sendo inseridas em outro de diferente espécie, a transdiferenciação também ocorre. Células da crista

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neural de codorna foram capazes de originar, por exemplo, células de tecido conjuntivo em galinha14. Esses experimentos, já nas décadas de 1960 e 1970, apresentaram evidências de que as células especializadas, consideradas como terminalmente diferenciadas, apresentavam plasticidade, podendo ter seu destino alterado segundo influências do ambiente em seu entorno. Em 1996, um trabalho de Campbell e colaboradores, utilizando a transferência nuclear, foi publicado e anunciava um feito revolucionário para o momento: a clonagem de ovelha. Foi o primeiro relato de organismo gerado por transferência nuclear de núcleos de células de mamíferos derivados de embriões, sendo cultivados por 6 a 13 passagens e induzidas à quiescência, para oócitos com núcleo removido15. Em 1998, núcleos de células do cumulus de camundongos foram transferidos para oócitos enucleados de indivíduos da mesma espécie, originando o primeiro clone de camundongo16. Em 2001, Tada e colaboradores, valendo-se de uma técnica já utilizada em trabalhos desde a década de 1960, apresentaram uma segunda maneira de se obter a pluripotência a partir de células somáticas: a fusão celular. Essa técnica já havia sido utilizada, por exemplo, por Davidson e colaboradores em 1966, a fim de se investigar o controle de expressão gênica17, e forneceu evidência da existência de proteínas supressoras tumorais de ação trans18 e repressores trans19. Tada e colegas realizaram a fusão de célula germinativa embriônica de camundongo fêmea com timócito, obtendo célula híbrida e pluripotente, capaz de se diferenciar em diferentes tipos celulares para originar embrião quimérico20. Cinco anos mais tarde, Takahashi e Yamanaka apresentaram a terceira estratégia de obtenção de célula pluripotente a partir de células não pluripotentes. Eles conseguiram induzir pluripotência em fibroblastos de camundongos, utilizando um retrovírus. Este carregava em seu material genético sequências codificadoras de quatro fatores de transcrição relacionados à manutenção do estado de pluripotência em células-tronco: Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4. Dessa maneira, geraram-se as células-tronco pluripotentes induzidas (do inglês induced pluripotent stem cells – iPSC) – que apresentam propriedades similares às das células-tronco embrionárias21. No ano seguinte, obtiveram-se iPSC humanas a partir de fibroblastos, porém por meio de conjuntos diferentes de fatores de transcrição. Takahashi e colaboradores utilizaram os fatores já descritos no estudo, (Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc)22 empregando células de camundongos. Já Yu

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e colaboradores utilizaram Oct4, Sox2, Nanog e Lin28: também capazes de promover a indução de pluripotência23. Em 2010, Bhutani e colegas publicaram um estudo indicando e fornecendo informações sobre o mecanismo de promoção de pluripotência. Eles observaram que a citidina deaminase de ativação induzida (activation-induced cytidine deaminase – AID ou AICDA) é necessária para a promoção de desmetilação do promotor dos genes Oct4 e Nanog, e sua consequente expressão em fibroblastos de mamíferos que estão sendo reprogramados24. Em 2013, Nemes e colaboradores, na tentativa de se contornar o problema enfrentado com a utilização de retrovírus para integração de sequências exógenas no genoma celular, obtiveram sucesso na geração de iPSC estáveis a partir de fibroblastos por meio de transdução das proteínas recombinantes KLF4, OCT4, SOX2 e C-MYC. Estas foram sintetizadas fusionadas a uma calda de glutationa S-transferase (glutathione S-transferase – GST tag) para posterior purificação em cromatografia de afinidade e a um peptídeo de localização nuclear: o TAT-NLS. As células obtidas possuíam morfologia semelhante a fibroblastos e propriedades de células-tronco embrionárias (mantendo-se indiferenciadas por mais de vinte passagens)25.

20.3 POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS A reprogramação nuclear oferece uma ampla gama de possibilidades para aplicações terapêuticas. Células humanas podem, por exemplo, ser reprogramadas para reparar lesões em tecidos ou substituir regiões lesadas, inclusive oriundas de falhas genéticas. Por exemplo, a partir de células somáticas de um paciente pode-se realizar sua reprogramação nuclear a um estado de pluripotência e, posteriormente conduzir sua diferenciação em um tipo celular diferente para se repor uma região lesada. Existem, inclusive, estratégias de interconversão direta de um tipo celular em outro, sem a necessidade de se passar pelo estágio de pluripotência. Trata-se de uma das linhas de pesquisa de nosso laboratório. Vierbuchen e colaboradores, por exemplo, foram capazes de converter fibroblastos de pele de camundongos em neurônios por transdução da célula com três genes: Ascl1, Brn2 e Mytl1 (BAM) 26. O trabalho de Kobayashi e colaboradores, publicado em 2010, apresenta, inclusive, uma possível futura fonte de obtenção de órgãos para serem usados em transplantes humanos. Eles mostraram ser possível a geração de pâncreas de rato em camundongo a partir da microinjeção de iPSC de ratos

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no blastocisto de camundongos deficientes para o gene essencial no desenvolvimento do pâncreas27. Além disso, a geração de iPSC apresenta como vantagem a possibilidade de se evitar os entraves éticos/religiosos e imunológicos. Quanto aos imunológicos, células do próprio paciente podem ser usadas para terapias em seu próprio organismo, evitando-se, assim, por exemplo, reações imunes de rejeição. Thanasegaran e colegas não observaram rejeição ao injetarem iPSC derivadas de camundongos de diferentes idades em camundongos C57BL/6. Utilizando scaffold 3D, observaram o rápido aumento de densidade celular no interior do suporte após transplante, mas não rejeições ao compósito; o que é uma esperança para o campo da medicina regenerativa28. Quanto a questões éticas, as iPSC podem vir a substituir as células-tronco de origem embrionária humana, de obtenção tão polêmica, em várias aplicações das últimas, visto que, diferentemente destas, não são obtidas a partir do embrião 1. A obtenção das iPSC, diferentemente da obtenção de células-tronco embrionárias humanas, não envolve a destruição controversa de embriões em estágios de pré-implantação 23, mas células derivadas do próprio indivíduo adulto. Pode-se ainda, in vitro, utilizar-se células de um determinado paciente para que se realize um screening de drogas específico, a fim de se tratar uma determinada doença; é ainda possível utilizar as iPSC para modelar doenças. Israel e colaboradores, visando oferecer uma alternativa ao gargalo existente no estudo da doença de Alzheimer (obter neurônios vivos de pacientes), reprogramaram fibroblastos de pacientes com a forma da doença causada por duplicação do gene da proteína precursora β-amiloide, e diferenciaram em neurônios as iPSC obtidas. Assim, puderam observar fenômenos no nível celular, relacionados ao fenótipo da doença29. Logo, essas células oferecem, por exemplo, novas oportunidades para testes farmacológicos e toxicológicos, e identificação de novos alvos terapêuticos in vitro30.

20.4 TÉCNICAS DE REPROGRAMAÇÃO 20.4.1 Transferência nuclear A transferência nuclear de células somáticas (do inglês somatic cells nuclear transfer – SCNT) é uma técnica que permite reprogramar o genoma de uma célula somática de volta para um estado embrionário indiferenciado. As células

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produzidas através dessa técnica poderão ser utilizadas como progenitoras para dar origem a novos indivíduos com genótipos idênticos ao do indivíduo doador do núcleo (clonagem) ou para a produção de iPSC31. Essa técnica baseia-se, basicamente, na transferência de um núcleo de uma célula somática (célula doadora) para um oócito não fertilizado enucleado (célula receptora)32. Nessa técnica, o DNA da célula somática é incorporado pelo citoplasma da célula receptora, que é estimulada a se reconstituir e iniciar o desenvolvimento de um embrião. Essa estimulação pode ser realizada pelo aumento transitório da concentração de cálcio livre dentro da célula, por estímulo elétrico, ou alternativamente por agentes químicos (Figura 20.3)32,33. Os oócitos, quando estabilizados na metáfase II do ciclo celular, possuem uma capacidade intrínseca de reprogramar núcleos sem a necessidade de permanentes alterações genéticas no núcleo transplantado ou nas células reprogramadas resultantes32,34,35.

Figura 20.3 Transferência nuclear. Nesta técnica, o núcleo de uma célula somática (diploide, 2n) é transplantado para um oócito sem núcleo. Dentro do oócito, o núcleo da célula somática é reprogramado e as células derivadas dele são pluripotentes. Deste oócito é gerado um blastocisto, a partir do qual iPSCs podem ser isoladas e cultivadas. As iPSCs podem ser cultivadas até a formação de um embrião que pode ser implantado em uma mãe hospedeira, resultando em clones neonatos. As iPSCs também podem ser estimuladas a diferenciar em vários tipos celulares.

Descreveremos aqui, resumidamente, um exemplo de protocolo bem sucedido para essa técnica, que foi desenvolvido por Byrne e colaboradores 36. O primeiro passo do protocolo foi estabelecer uma cultura primária

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de fibroblastos retirados da pele de um macaco Rhesus, que, posteriormente foi utilizada como fonte doadora de núcleo para a introdução em oócitos de fêmeas da mesma espécie. Esses fibroblastos foram cultivados durante quatro dias em um meio de cultura capaz de promover a estabilização das células na fase G0/G1 do ciclo celular. O segundo passo consistiu na enucleação dos oócitos, que foi realizada por meio de um sistema de imagem cuja luz polarizada permitiu a visualização e a subsequente retirada do fuso meiótico por aspiração. O terceiro passo foi a inserção dos fibroblastos doadores de núcleo para dentro dos oócitos. A inserção foi realizada utilizando uma micropipeta e a fusão foi induzida por eletrofusão. Em seguida, os embriões reconstruídos foram incubados durante duas horas para permitir a remodelação nuclear e, subsequentemente, foram quimicamente ativados e cultivados até a fase de blastocisto. Usando esse protocolo, além de conseguirem produzir com sucesso embriões de primatas in vitro, Byrne e colaboradores também conseguiram isolar com sucesso duas linhagens de células-tronco embrionárias a partir de tais embriões.

20.4.2 Fusão celular A fusão celular é um fenômeno natural in vivo, altamente regulado e necessário para o desenvolvimento e a homeostase. Em algumas patologias, a fusão celular também pode ocorrer, como nos casos de fusão induzida por vírus ou tumorigênese37,38. Na prática laboratorial, essa técnica foi desenvolvida in vitro e vem sendo utilizada para a reprogramação nuclear de células somáticas para um estado pluripotente 39. Vários tipos de células pluripotentes, tais como células de carcinoma embrionário, células embrionárias germinativas e células-tronco embrionárias, têm demonstrado capacidade de restaurar propriedades de pluripotência quando fundidas com células somáticas, sugerindo que estas possuem componentes de reprogramação semelhantes aos encontrados em oócitos40,41. Os métodos mais frequentemente usados para promover a fusão celular são através do uso de polietilenoglicol (PEG), que é um agente químico fusogênico; ou por pulsos elétricos, técnica conhecida como eletrofusão 42. O processo de fusão celular pode envolver dois ou mais tipos celulares, que são fusionados em uma única entidade. A fusão celular pode gerar células híbridas ou heterocárions, sendo que as células híbridas são resultantes da fusão entre os núcleos de dois tipos celulares e possuem a capacidade de

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proliferar, enquanto os heterocárions contêm múltiplos núcleos distintos e não são capazes de proliferar (Figura 20.4)43. Após a fusão, é possível realizar o monitoramento da eficiência de reprogramação do genoma das células somáticas. Uma das formas de monitoramento é através da utilização de células somáticas, portando um gene repórter, como, por exemplo, o Oct4-GFP (proteína GFP, verde-fluorescente – do inglês green fluorescent protein – sob o controle do promotor Oct4). O gene Oct4 é considerado um marcador de pluripotência e está presente na forma ativa em células-tronco e em células germinativas, porém é reprimido em células somáticas. Desse modo, se houver eficiência na fusão da célula somática portadora do gene repórter com a célula-tronco, a expressão deste gene será reativada, podendo ser considerado que houve a reprogramação genômica44,45. O trabalho realizado por Cowan e colaboradores (2005) é um exemplo bem-sucedido de aplicação da técnica de reprogramação por fusão celular. Nesse trabalho, foram estabelecidas culturas de linhagens celulares de fibroblastos humanos (FH) e de células-tronco embrionárias humanas (human embryonic stem cells – hESC). Nas hESC foi introduzido um DNA linear que codifica para a proteína GFP e um gene de resistência a um tipo de antibiótico (puromicina, higromicina ou neomicina). Os FH também receberam um gene de resistência a antibiótico, através de transdução retroviral de um vetor carreador de um gene de resistência à puromicina. Para a indução da fusão celular e geração de células híbridas, as hESC foram mixadas com FH na presença de polietilenoglicol. Durante dez dias, as colônias formadas foram sendo selecionadas pelo uso de dois antibióticos simultaneamente. Duas colônias individuais selecionadas foram expandidas e cultivadas sob condições padrão para a propagação de hESC. Para confirmar que estas células resistentes a antibióticos surgiram através da fusão, foi realizado um ensaio para determinar marcadores genéticos transportados pelos dois tipos celulares submetidos à fusão. Através da análise das células resistentes por citometria de fluxo (do inglês fluorescence-activated cell sorting – FACS), verificou-se que elas expressavam a proteína GFP introduzida previamente nas hESC. Utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction – PCR) foi possível verificar que essas células também possuíam o vetor viral inserido previamente nos FH. Desse modo, ficou comprovado que houve a fusão celular. Para verificar a presença de marcadores característicos de hESC e confirmar a reprogramação, as células fusionadas foram submetidas à imuno-histoquímica e analisadas por microscopia confocal. Através desta técnica foi possível observar a presença do

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fator de transcrição OCT4 e a presença de antígenos embrionários específicos, tais como SSEA4, TRA1-61 e TRA1-80. Os resultados encontrados por Cowan e colabores nesse estudo comprovam que hESC podem reprogramar cromossomos de células somáticas e que as iPSCs produzidas podem ser uma alternativa útil nos estudos bioquímicos e genéticos para a compreensão de mecanismos de reprogramação de células diferenciadas46.

Figura 20.4 Fusão celular. Nesta técnica, dois tipos de células distintas são combinadas para formar uma única entidade. As células fundidas resultantes podem ser heterocárions ou híbridas. Se as células fundidas proliferarem, irão se tornar híbridas com núcleo tetraploide (4n), isto é, com duas vezes o número de cromossomos de uma célula somática ou mais (dependendo do número de células fundidas). Os heterocárions não se proliferam, e os núcleos das células originais permanecem intactos e distintos. O citoplasma das células-tronco possuem fatores de reprogramação que podem alterar o estado epigenético de uma célula somática, transformando-a em uma iPSC.

20.4.3 Transdução de fatores de transcrição Os fatores de transcrição (transcription factors – TF) desempenham um papel central no destino da célula, sua especificação ao longo do desenvolvimento embrionário e na manutenção da identidade da célula em vários tecidos adultos. Eles apresentam um reconhecimento sequência-específico de elementos do DNA e, ao exercer suas funções de ativação transcricional ou repressão, regulam a expressão de centenas de genes-alvo32,47. O uso de fatores de transcrição para a reprogramação de células somáticas para um estado pluripotente já é bem descrito na literatura para vários tipos de células humanas e de rato, tais como fibroblastos, queratinócitos e células sanguíneas32,48. Vários fatores de transcrição são capazes de induzir células somáticas a apresentarem um estado de pluripotência, dentre eles Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Fbx15 e Nanog. Estes fatores normalmente são

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introduzidos nas células somáticas em grupos ou isoladamente, através de vetores virais ou não virais (Figura 20.5)47,49. Para exemplificar a técnica de reprogramação usando fatores de transcrição, descreveremos brevemente um protocolo desenvolvido por Takahashi e colaboradores para a produção de iPSC a partir de fibroblastos humanos adultos (FH)50. Nesse trabalho, foram produzidas iPSC pela transdução retroviral de quatro fatores de transcrição: Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Primeiramente, foi estabelecida uma cultura de uma linhagem de fibroblastos de derme humana (FH). Para garantir a eficiência no processo subsequente de transfecção viral, usando um lentivírus, foi introduzido nos FH um receptor para retrovírus de rato denominado Slc7a1. Os FH expressando o gene Slc7a1 foram selecionados e semeados em uma nova placa de cultura. Após 24 horas, cada um dos quatro retrovírus portando um fator de transcrição, produzidos previamente, foi adicionado na placa de cultura contendo os FH. Sete dias após a inserção desses fatores reprogramadores, o meio de cultura que até então estava sendo utilizado (meio de Eagle modificado por Dulbecco – DMEM – contendo 10% de soro fetal bovino) foi substituído por um meio de cultura para células-tronco de primata, suplementado com fator de crescimento para fibroblastos. Desde então, a cultura continuou sendo monitorada diariamente e, por volta do vigésimo quinto dia, foram observadas colônias de células com morfologia semelhante à de células-tronco embrionárias humanas. Para confirmar se houve reprogramação, essas colônias foram expandidas e as células foram submetidas a transcrição reversa seguida por reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para verificar a expressão de genes marcadores de células-tronco embrionárias e pluripotência. Foi comprovada a expressão de vários genes, dentre eles Oct3/4, Sox2, Nanog, fator 3 de crescimento e diferenciação, Rex1, Fgf4 e Esg1. Também foram comparados os níveis proteicos entre as célulastronco embrionárias humanas e as iPSC recém-produzidas utilizando a técnica de western blotting. Os níveis proteicos foram similares para OCT3/4, SOX2, NANOG, SALL4, caderina E e hTERT. Através da técnica de microarranjo de DNA foi analisada a expressão de 32.266 genes, e verificou-se que o padrão de expressão global de genes entre as células-tronco embrionárias humanas e as iPSC foi similar, e não idêntico. As iPSCs produzidas nesse trabalho foram capazes de diferenciar, in vitro, nos tipos celulares das três camadas germinativas e em teratoma. Estes resultados demonstraram que iPSCs podem ser obtidas a partir de fibroblastos humanos adultos.

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Figura 20.5 Transdução de fatores de transcrição. Esta técnica de reprogramação direta pode ser usada para formar iPSC com propriedades semelhantes às das células-tronco. Vários tipos de células somáticas podem ser induzidas pela introdução de fatores de transcrição (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc) usando retrovírus. Nesta técnica, o estado pluripotente é hereditariamente mantido e pode ser produzido um grande número de células, tornando esta abordagem vantajosa para aplicações clínicas.

20.5 CONCLUSÃO Há mais de cinquenta anos a história das pesquisas em reprogramação nuclear vem sendo traçada. Desde 1962, quando J. Gurdon57 publicou o primeiro trabalho nesse sentido, várias ferramentas sofisticadas para a pesquisa foram desenvolvidas e permitiram que fossem alcançados os resultados atuais. Embora existam três principais abordagens distintas para a reprogramação celular, os resultados obtidos em cada técnica são úteis e complementares às demais, indicando uma sinergia entre elas. Cada um dos três tipos de técnica apresenta vantagens e limitações inerentes. A transferência nuclear tem como característica ser um processo rápido de reprogramação, adequado para elucidar os princípios fundamentais do início do desenvolvimento embrionário e da biologia reprodutiva, além de proporcionar uma grande variedade de iPSC para aplicações terapêuticas43, 58. No entanto, a pesquisa usando oócitos humanos é limitada por considerações de ordem jurídica e social 35. Já a fusão celular é tecnicamente simples, mas apresenta baixo rendimento e sua eficiência é dependente do tipo de célula somática usada para a fusão 40. A reprogramação direta de células diferenciadas por fatores de transcrição tem se destacado pela produção de uma ampla variedade de iPSC, mas o uso dessas células na terapia celular ainda é limitado devido ao uso de vetores virais e de fatores de transcrição com propriedades oncogênicas59. De modo geral, a facilidade com que as iPSCs estão sendo produzidas em abundância nos laboratórios ao redor do mundo, seu potencial para o estudo dos mecanismos

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subjacentes às doenças humanas e sua utilidade para a pesquisa de drogas e no uso como terapia celular são atualmente incomparáveis e promissores43.

20.6 PERSPECTIVAS FUTURAS Em comparação com os estudos de plasticidade de células-tronco adultas, as pesquisas de reprogramação em linhagens celulares têm feito grandes progressos. Muitas fontes de iPSC diferentes estão sendo estudadas para aplicações clínicas em modelos de doenças, para o desenvolvimento de drogas e como fonte de células autólogas para a reparação de tecidos. Porém, acredita-se que será necessária mais de uma década para a plena caracterização dessas células reprogramadas, de modo que possam ser aplicadas na utilização terapêutica em seres humanos32,60. As iPSCs, no futuro, terão grande valor se dois objetivos principais forem alcançados: o primeiro é o de criar linhagens celulares de longa duração a partir de doenças genéticas, a fim de testar drogas potencialmente úteis ou outros tratamentos61. O segundo é fornecer células-tronco autólogas para o tratamento de pacientes. Para serem terapeuticamente benéficas, as iPSCs precisam ser fornecidas em números suficientes, realizar a função esperada no tecido do paciente e ser capazes de produzir a quantidade correta de seus metabólitos34. Embora a técnica de reprogramação forneça uma alternativa para o uso eticamente problemático de células-tronco embrionárias humanas, não será possível realizar a validação do uso de iPSCs sem usar células-tronco embrionárias humanas62. Além disso, as células-tronco embrionárias ainda se encontram em processo de caracterização, de modo que será difícil confirmar funcionalmente se iPSC são realmente semelhantes às células-tronco embrionárias humanas32. Além dos estudos para terapia celular, os estudos futuros devem se concentrar na capacidade de iPSC para a formação de novos tecidos, órgãos e organismos-modelo, como um fluxo que existe em paralelo com as pesquisas em células-tronco embrionárias humanas63.

20.7 TÉCNICA PASSO A PASSO PARA A PRODUÇÃO DE iPSCS ATRAVÉS DE FUSÃO CELULAR USANDO POLIETILENOGLICOL (PEG) O polietilenoglicol (PEG) é um polímero altamente hidratado, e sua capacidade de induzir a fusão celular foi demonstrada na década de 197064.

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Desde então, este polímero tem sido amplamente utilizado para mediar a fusão de células a fim de formar híbridos de células somáticas, que são ferramentas importantes para os estudos de mapeamento genético, expressão gênica, análise da função de genes e também para a produção de vacinas e anticorpos65. PEG induz a aglutinação celular, aumentando o contato célula a célula, levando à subsequente fusão celular. Aqui, descreveremos o protocolo de fusão celular usando células somáticas publicado em 2006, pelos pesquisadores Yang e Shen66 e que, até o momento, vem sendo utilizado com sucesso em inúmeros trabalhos, tanto para a fusão entre células somáticas quanto para a fusão entre células somáticas e células-tronco. A fusão celular através desta técnica pode ser realizada por meio de células inteiras ou microcélulas como doadoras para a fusão com as células receptoras. Geralmente, a fusão utilizando microcélulas é empregada para a transferência de um único cromossomo, ou um limitado número deles, entre diferentes tipos de células. Os principais procedimentos desse protocolo incluem a preparação de células doadoras e receptoras, a fusão entre células, a seleção de híbridos e caracterização de células híbridas (Figura 20.6). A técnica descrita aqui pode ser adaptada para o uso na fusão entre diversos tipos celulares, fornecendo diretrizes para o desenvolvimento da técnica de fusão celular mediada por PEG. Materiais 1) Linhagens celulares: células de rato LA9 contendo um minicromossomo de mamífero, denominadas células LA9hprt-hgy+, e células de galinha denominadas DT40hprt+hgy-. 2) Meios e suplementos: DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco, Life Technologies), β-mercaptoetanol (Sigma), soro fetal bovino (SFB, Sigma), soro de galinha (Gibco-BRL), glutamina (Sigma), higromicina B (Roche), colcemida (demecolcina, Sigma) e hipoxantina-aminopterinatimidina (HAT, Sigma). 3) Compostos químicos e bioquímicos: • Tampão fosfato-salino (PBS, pH 7,3): 137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 10 mM Na 2 HPO 4 ; 2 mM KH 2 PO 4 • Solução de 0,2% de tripsina em Versene • Citocalasina B (Sigma) • PEG 1500 (Roche) • Percoll (Sigma) • DNA satélite alfoide da região centromérica do cromossomo Y humano, marcado com biotina ou 32 P

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• Primers: P1 (5’-AACTTCATCAGTGTTACATCAAGG-3’ 5’-TGTGGCATTTTGTTATGTGG-3’) P2 (5’-AGGAGATGTCAGGACTATCAGC-3’ 5’-TCCATCCAGCTGGTCATATT-3’); • Estreptavidina Alexa Fluor 488 (Life Technologies); • Anti-estreptavidina biotinilado (Vector Laboratories). 4) Plásticos e equipamentos: frascos de cultura de tecidos, placas de Petri, placas de múltiplos poços, tubos de teste, tubos de policarbonato (40 mL, Fisher), centrífuga, sistema de eletroforese em gel e termociclador. Métodos As células LA9 de rato que são HPRT negativas e contêm um minicromossomo de mamífero marcado com higromicina B fosfotransferase (LA9hprt -hgy+ ) são utilizadas como doadoras, enquanto as células de galinha DT40 que são HPRT positivas (DT40hprt+hgy-) são utilizadas como células receptoras. Os genótipos das células doadoras e receptoras permitem uma dupla seleção positiva usando o HAT e a higromicina, que irão matar as células doadoras e receptoras, selecionando, dessa forma, apenas as células híbridas. As células LA9 hprt-hgy+ são aderentes, já as células DT40 hprt+hgy- crescem em suspensão. Essa diferença facilita a seleção das células híbridas de interesse. Neste caso, o objetivo será a transferência de um minicromossomo das células LA9 hprt-hgy+ (doadoras) para as células DT40hprt+hgy- (receptoras). Portanto, após os procedimentos para a fusão, as células em suspensão são mantidas para posterior seleção, enquanto as células aderidas são descartadas. Os principais passos deste protocolo estão apresentados na Figura 20.6. Primeiramente, células doadoras e receptoras são preparadas e fundidas com PEG. Em seguida, HAT e higromicina B são usadas para a seleção das células híbridas. As células híbridas, então, são clonadas e caracterizadas por análises moleculares e citológicas. Preparação de células doadoras e receptoras Células doadoras inteiras: 1) As células LA9hprt-hgy+ devem ser cultivadas em meio DMEM suplementado com 200 µM de glutamina, 10% de soro fetal bovino e 0,5 mg/mL de higromicina B. Uma placa de Petri de 15 cm deve ser preparada para a fusão de células inteiras. 2) As células deverão ser alimentadas com 30 mL do meio fresco 16 a 20 horas antes da fusão.

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3) Cultivar as células até aproximadamente 70% de confluência. 4) Remover o meio de cultura. 5) Enxaguar a cultura com 10 mL de PBS e em seguida remover o PBS. 6) Adicionar 2 mL de tripsina 0,2% e deixar incubar durante 5 a 10 minutos. 7) Transferir o conteúdo da placa para um tubo e centrifugar a 400 g por 5 minutos e descartar o sobrenadante. 8) Acrescentar 10 mL de PBS, ressuspender as células e centrifugar novamente sob as mesmas condições descritas acima. Ao final, descartar o PBS. 9) Ressuspender as células em 5 mL de meio de cultura DMEM livre de soro e preaquecido. Microcélulas 1) As células LA9hprt-hgy+ devem ser cultivadas em meio DMEM suplementado com 200 µM de glutamina, 10% de soro fetal bovino e 0,5 mg/mL de higromicina B. Quatro placas de Petri de 15 cm devem ser preparadas para a fusão de microcélulas. 2) As células deverão ser alimentadas com 30 mL do meio fresco 16 a 20 horas antes do tratamento com colcemida. 3) Quando a cultura alcançar cerca de 70% de confluência, adicionar 0,1 µg/mL de colcemida. 4) Incubar as células durante 24 horas à temperatura de 37 °C. 5) Remover o meio de cultura. 6) Enxaguar a cultura com 10 mL de PBS e remover o PBS. 7) Adicionar 2 mL de tripsina 0,2% e deixar incubar durante 5 minutos. 8) Transferir o conteúdo da placa para um tubo e centrifugar a 400 g por 5 minutos e descartar o sobrenadante. 9) Acrescentar 10 mL de meio DMEM livre de soro preaquecido, ressuspender as células e centrifugar novamente sob as mesmas condições descritas acima. Ao final descartar o sobrenadante. 10) Ressuspender as células obtidas de cada placa de Petri em 40 mL de uma solução contendo percoll+ DMEM livre de soro preaquecido (1/1) e 10 µg/mL de citocalasina B. 11) Transferir a solução contendo as células para um tubo de policarbonato com capacidade para 40 mL. Fusão mediada por PEG 12) Centrifugar as amostras de células a 19,000 rpm a 37 °C durante 75 minutos.

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13) Recolher aproximadamente 15 mL do sobrenadante contendo as microcélulas sem tocar no gel formado no fundo do tubo. 14) Misturar 15 mL de microcélulas com 35 mL de meio DMEM livre de soro preaquecido. 15) Centrifugar a 500 g por 10 minutos. 16) Juntar os pellets de microcélulas e divida-o em dois tubos de teste com capacidade para 50 mL. 17) Para lavar as microcélulas, acrescentar em cada tubo 50 mL de meio DMEM livre de soro preaquecido, e centrifugar a 400 g por 5 minutos. 18) Repetir o passo 17. 19) Ressuspender as microcélulas em 5 mL de meio DMEM livre de soro preaquecido. Células receptoras 1) As células DT40hprt+hgy- devem ser cultivadas em meio DMEM suplementado com 200 µM de glutamina, 10 µM β-mercaptoetanol, 10% de soro fetal bovino e 1% de soro de galinha. 2) Adicionar igual volume de meio fresco na cultura de células 16 a 20 horas antes da fusão. 3) Deixar as células crescerem até uma densidade de aproximadamente 106 células por mililitro. 4) Coletar 30 mL de células inteiras para a fusão celular ou aproximadamente 60 a 80 mL de microcélulas. 5) Centrifugar a 400 g por 5 minutos e descartar o sobrenadante. 6) Para lavar as células ou microcélulas, acrescentar 10 mL de meio DMEM livre de soro preaquecido. 7) Centrifugar novamente conforme as condições acima e conservar o pellet. Fusão das células doadoras e receptoras 1) Misturar os pellets das células receptoras (DT40hprt+hgy-) com 5 mL de células doadoras (LA9hprt-hgy+) ou com o mesmo volume das microcélulas derivadas de LA9hprt-hgy+. 2) Centrifugar a mistura de células a 400 g por 5 minutos. Descartar o sobrenadante. 3) Ressuspender as células com 1 mL de meio DMEM livre de soro e incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. 4) Centrifugar novamente a 400 g por 5 minutos. 5) Adicionar 1 mL de PEG 1500 (50%) ao pellet suavemente dentro de 30 segundos e incube por 2 minutos em temperatura ambiente.

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6) Adicionar 10 mL de meio DMEM livre de soro lentamente e deixe ocorrer a fusão em temperatura ambiente durante 30 minutos. 7) Lavar a amostra fundida duas vezes usando 50 mL de meio DMEM livre de soro. 8) Ressuspender o pellet de células em 100 mL (para células inteiras) ou 200 mL (para microcélulas) de DMEM suplementado com 200 µM de glutamina, 10 µM β-mercaptoetanol, 10% de soro fetal bovino e 1% de soro de galinha em um frasco com 180 cm 2. 9) Incubar durante 2 horas a 37 °C. 10) Transferir a suspensão de células para um novo frasco (180 cm 2) e descartar o frasco anterior com as células aderidas. 11) Incubar a suspensão de células durante no mínimo 24 horas a 37 °C. Seleção de híbridos, clonagem e caracterização 1) 1. Aplicar dupla seleção positiva na cultura com uma concentração final de HAT(1x) e 2 mg/mL de higromicina B. 2) Dividir a suspensão de células em cinco placas de 96 poços para as células inteiras fusionadas ou dez placas de 96 poços para as microcélulas fusionadas, colocando 200 µL de suspensão em cada poço. 3) Incubar a cultura por aproximadamente 10 a 15 dias a 37 °C. 4) Escolher colônias híbridas de poços de placas individuais. 5) Dividir cada colônia em duas porções. 6) Usar uma porção para a análise através da PCR. Os primers para PCR P1 e P2 são usados para detectar a região da sequência marcada no minicromossomo das células híbridas. 7) Transferir a segunda porção para uma placa de 24 poços para expandir a cultura. 8) Transferir a cultura para um frasco de 25 cm2 após aproximadamente 3 a 5 dias e incubar por aproximadamente 5 a 7 dias. 9) Usar aproximadamente 107 células para as análises de eletroforese em campo pulsado e hibridização fluorescente in situ, usando os métodos convencionais. O DNA satélite alfoide da região centromérica do cromossomo Y humano marcado com 32P é usado para detectar o minicromossomo em células híbridas através de eletroforese em campo pulsado. O DNA satélite alfoide da região centromérica do cromossomo Y humano marcado com biotina é usado para detectar o minicromossomo em células híbridas através de hibridização fluorescente in situ. A estreptavidina Alexa Fluor 488 e o anti-estreptavidina biotinilado são usados no sistema

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de detecção da hibridização fluorescente in situ conforme especificações do fabricante.

Figura 20.6 Técnica de fusão celular usando Polietilenoglicol (PEG).

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Reprogramação Nuclear de Células para um Estado Pluripotente Usando Três Estratégias

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CAPÍTULO

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MECANISMOS DE ENTRADA DOS VÍRUS NA CÉLULA: MÉTODOS DE ESTUDO E APLICAÇÕES Jaila Dias Borges Lalwani Pritesh J. Lalwani 21.1 INTRODUÇÃO

Há vários fatores que podem influenciar a eficiência da adsorção viral, a saber: quantidade de ligantes sobre a superfície viral, o número de partículas virais e de células. Temperatura, pH e a presença ou não de íons específicos também podem interferir na eficiência da adsorção. O primeiro passo para a entrada dos vírus na célula é a interação destes com um receptor na superfície da célula alvo. Estes receptores são moléculas utilizadas pela célula para outros fins, e os vírus se adaptaram a eles para entrar na célula. Após a ligação dos vírus a seus receptores, podem ocorrer: 1) mudanças conformacionais nas proteínas da partícula viral que conduz a uma associação com outros receptores, fusão da membrana e entrada do vírus;

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2) transdução de sinal através da membrana plasmática que conduz à entrada do vírus ou; 3) entrada do vírus na célula por meio de várias vias endocíticas. Muitos vírus utilizam vários tipos de receptores para entrar na célula. Eles interagem com seus receptores simultaneamente ou em série, e também podem utilizar receptores diferentes para entrar em diferentes células. Quando múltiplos receptores são necessários para que haja uma infecção produtiva, por convenção a primeira molécula a que o vírus se liga é denominada receptor e as demais são correceptores. Um exemplo é o vírus HIV, que tem como receptor CD4 e correceptores CXCR4/CCR51,2. Atualmente um número expressivo de receptores virais estão descritos. Para a identificação de receptores virais podese utilizar expressão gênica, métodos bioquímicos e imunológicos. As células dispõem de uma variedade de mecanismos de internalização de moléculas, e os vírus, por sua vez, desenvolveram estratégias para utilizar das vias de endocitose celular para alcançar o citoplasma ou o núcleo da célula, dependendo do ciclo de replicação da partícula viral. A entrada dos vírus na célula pode ocorrer por penetração direta (vírus não envelopados) ou fusão com a membrana plasmática (vírus envelopados) e por endocitose (vírus envelopados e não envelopados) (Figura 21.1).

Figura 21.1 Entrada dos vírus na célula: (A) entrada por fusão; (B) entrada por endocitose.

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A fusão do envelope de vírus envelopados com a membrana celular ocorre de dois modos: fusão mediada por ligantes do vírus e entrada mediada por endocitose. No primeiro modo, após adsorção o vírus se funde à membrana, o nucleocapsídeo é liberado no interior da célula e o seu envelope permanece sobre a membrana celular. Esse processo de fusão independe de pH. No segundo modo, após adsorção do vírus via receptor, a célula é estimulada a internalizar a partícula viral por meio de vesículas endocíticas. Estas vesículas se fundem com lisossomos, que possuem pH interno ácido. Devido ao baixo pH, mudanças conformacionais em proteínas do envelope viral facilitam a fusão da membrana do envelope com a membrana da vesícula endocítica. Este processo é dependente de pH. A maioria dos vírus não envelopados entram na célula via endocitose mediada por receptor. Endocitose é um processo celular utilizado para internalizar diferentes moléculas. Há diferentes tipos de endocitose descritos, que diferem quanto ao mecanismo pelo qual a vesícula é formada e quanto ao tamanho da vesícula endocítica e da carga, a saber: fagocitose, macropinocitose, endocitose mediada por clatrina, endocitose mediada por caveolina e endocitose independente de clatrina e caveolina. Endocitose independente de clatrina e caveolina pode ocorrer através das CLIC (do inglês, Clathrin and dynamin independent carriers), que é uma vesícula independente de clatrina e dinamina, derivada da membrana plasmática3 (Figura 21.2).

Figura 21.2 Vias de endocitose. Partículas grandes podem ser englobadas por fagocitose, e macromoléculas fluidas, por macropinocitose. Diversas moléculas podem ser internalizadas por diferentes vias endocíticas. As vesículas endocíticas podem ser revestidas por proteínas, e desse modo tem-se a endocitose dependente de clatrina, dependente de caveolina e independente de clatrina e caveolina.

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A entrada dos vírus por endocitose é um processo complexo envolvendo centenas de proteínas celulares. E a entrada por esta via oferece muitas vantagens, como por exemplo: permitir que os vírus de animais consigam vencer barreiras como a membrana plasmática e o microambiente do citoplasma celular. Alguns estudos indicam que herpesvírus humano tipo 1 e mimivírus podem entrar na célula por fagocitose 4, 5. Entre os vírus que entram na célula por macropinocitose estão6-8: vírus da vaccínia, HHV-8 e HIV-1. Além dessa via, o HIV também entra na célula por endocitose9. A endocitose mediada por clatrina é a via mais utilizada pelos vírus e é, geralmente, rápida e eficiente. Por esta via, os vírus são expostos ao meio ácido do endossoma e em poucos minutos, após a internalização e devido ao baixo pH, muitos vírus sofrem alterações que conduzem à liberação do seu genoma no interior da célula. Dependendo do pH, o local da penetração será o endossomo precoce (pH 6,5 a 6,0) ou tardio (pH 6,0 a 5,5) 10. Os vírus Influenza utilizam, principalmente, esta via para infectar as células. Na via de endocitose dependente de caveolina, a formação da vesícula endocítica primária é dependente de colesterol, rafts lipidícos e uma complexa via de sinalização envolvendo tirosina-quinases e fosfatases. Os vírus mais bem estudados que utilizam esta via para entrar na célula são os poliomavírus11: SV40, vírus BK e JC. Entre os vírus que utilizam vias independentes de clatrina e caveolina, estão o HPV-16, rotavírus, LCMV e Influenza A. No caso do Influenza, este processo acontece em paralelo com a endocitose mediada por clatrina12,13. Dependendo do vírus, do tipo de célula e do microambiante, os vírus são capazes de explorar uma gama de diferentes vias de endocitose para entrar na célula. Apesar dos avanços na compreensão dos mecanismos de entrada dos vírus na célula, ainda há muitas lacunas a serem preenchidas. Investigar os mecanismos de entrada do vírus na célula é um grande desafio por causa das diversas vias de entrada e da complexidade envolvida no processo. Cada via envolve inúmeras interações físicas e químicas entre o vírus e a célula hospedeira. Os avanços em técnicas experimentais em diferentes áreas têm contribuído para melhorar o conhecimento sobre este importante processo. A compreensão sobre o modo como os vírus conseguem infectar uma célula é de grande relevância não somente para a pesquisa de drogas antivirais. É importante, também, para a produção de vacinas. Além disso, vírus de plantas, animas e bacteriófagos têm aplicações biomédicas e nanotecnoló g icas, como a distribuição de fármacos e a terapia dirigida14. Moléculas seletivas, como peptídeos ou anticorpos, podem ser adicionadas à superfície

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do capsídeo viral por métodos químicos ou genéticos e conferir à partícula viral seletividade e afinidade ao local de interesse terapêutico. Vetores virais também podem ser utilizados para o tratamento de câncer15.

21.2 HISTÓRICO Como parte da luta contra os vírus, os cientistas têm tentado compreender tudo sobre estes minúsculos, mas complexos, inimigos. Aprendemos muito sobre eles nas últimas décadas. Por exemplo, com a ajuda de potentes microscópios, métodos genéticos e bioquímicos, os cientistas descobriram que os vírus contêm somente as informações necessárias para o reconhecimento de células hospedeiras e replicação de seu genoma no interior destas. Dada a sua simplicidade, os vírus são dependentes da maquinaria biossintética da célula hospedeira. Um exemplo é o fato de os vírus utilizarem a via endocítica celular para a entrada na célula. A ironia é que, ao estudar os mecanismos de entrada dos vírus, os cientistas obtiveram uma maior compreensão da maquinaria endocítica celular. A nossa compreensão atual sobre endocitose provém de duas importantes observações feitas na década de 1970. Primeiro, Ralph Steinman e colaboradores utilizaram bioquímica quantitativa e de microscopia eletrônica para demonstrar que as células de mamíferos em cultura eram capazes de internalizar grande quantidade de membrana plasmática. Esses cientistas observaram que a maior parte da membrana internalizada depois era regenerada pela membrana plasmática16. Segundo, Michael Brown, Joseph Goldstein e colaboradores, ao estudar a regulação do metabolismo do colesterol, pretendiam encontrar um tratamento para doenças causadas por níveis altos de colesterol sérico. Ao estudar a absorção de lipoproteínas de baixa densidade (low density lypoprotein – LDL) pelos fibroblastos da pele, eles observaram que a internalização de LDL é mediada por um receptor específico, presente na superfície das células. Eles criaram o termo “endocitose mediada por receptor” para descrever a entrada de LDL nas células17. Em outra série de experimentos, Brown e Goldstein utilizaram o microscópio eletrônico para estudar a endocitose de LDL e vários outros ligantes. Eles observaram que as vesículas responsáveis pela endocitose dessas moléculas eram “vesículas revestidas”. Brown e Goldstein ganharam o Prêmio Nobel por suas contribuições relevantes para o estudo do metabolismo do colesterol, incluindo a descoberta de endocitose mediada por receptores.

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Ainda nos anos 1970, Ari Helenius começou a trabalhar com o vírus Semliki Forest (SFV), um vírus isolado pela primeira vez a partir de mosquitos em Uganda e capaz de causar doenças nos seres humanos e animais. Helenius e colaboradores, utilizando microscopia e estudos bioquímicos, descobriram que SFV após adsorção à membrana celular entrava nas células utilizando a via endocítica mediada por clatrina 18. O trabalho de Helenius liga a história dos vírus à história da endocitose. Passado um razoável tempo após essas descobertas, novas vias de entrada dos vírus nas células foram descobertas, e são clatrina/caveolina independentes. Os principais artigos que contribuíram para um melhor entendimento dos mecanismos de entrada dos vírus nas células são: • 1980: Detecção de partículas de vírus individuais marcadas por fluorescência em células de mamíferos fixadas18. • 1981: Primeiro experimento de rastreamento de partícula individual em células vivas: rastreamento do complexo LDL-receptor19. • A partir de 1985: Desenvolvimento de técnicas de imagem e algoritmos para rastreamento de partícula individual em 2D20,21. • 1990-1992: Detecção precoce de vírus individuais em células vivas por meio de microscopia de fluorescência com imagem em vídeo22,23. • A partir de 1991: Desenvolvimento de proteínas fluorescentes para imagem celular24,25. • 1995: Primeira imagem multicolorida do egresso viral 26 . • 1998: CD4 é o receptor para a entrada do HIV27. • A partir de 1998: Estudos sistemáticos dos mecanismos de entrada viral através da membrana plasmática 28,31. • A partir de 2001: Estudos sistemáticos de egresso viral pela membrana plasmática 32,33. • 2005: Estudo de mecanismos de entrada viral por análises de imagens automatizadas em larga escala 34. • 2005: Primeiros experimentos em animais para o rastreamento de vírus marcados com fluorescência 35. • A partir de 2005: Rastreamento quantitativo de partículas individuais em 3D36,37. • A partir de 2005: High-throughput screening de inibidores de entrada virais38. • A partir de 2008: Por meio da triagem de siRNA para genes que afetam a entrada do vírus Junin, canais de cálcio voltagem-dependentes foram identificados como um bom alvo terapêutico para este vírus39.

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• A partir de 2010: Utilizando RNAi, foi possível identificar uma ubiquitina ligase como sendo essencial para a liberação do vírus influenza A do endossoma durante a sua entrada na célula40.

21.3 POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS A entrada do vírus na célula hospedeira é o primeiro passo para o estabelecimento de uma infecção produtiva para ambos os tipos de vírus, envelopados e não envelopados. Os mecanismos de entrada do vírus na célula são extensivamente estudados e têm contribuído para o desenvolvimento de agentes terapêuticos de combate às infecções virais. Além disso, a especificidade dos vírus aos seu receptores é utilizada como alvo em estudos para o tratamento do câncer e a correção de doenças genéticas.

21.3.1 Inibidor da entrada dos vírus na célula Várias drogas que bloqueiam a ligação do vírus a um receptor ou correceptores estão sendo desenvolvidas. A entrada do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (human immunodeficiency virus-1 – HIV-1) em células TCD4 é mediada pela ligação da glicoproteína do envelope, gp120 e gp41, ao receptor CD4 e a receptores de quimiocinas (CCR5 ou CXCR4), com subsequente fusão do envelope viral à membrana celular. Os alvos terapêuticos podem ser direcionados aos vários estágios da entrada do vírus. Receptores antagonistas podem impedir a adsorção viral, e inibidores de fusão podem bloquear as alterações conformacionais necessárias para a fusão da membrana. Maraviroc e Enfuvirtide são duas drogas antirretrovirais, já aprovadas pela FDA, que atuam inibindo a entrada do HIV na célula. Inúmeras outras moléculas derivadas de produtos naturais ou sintéticos têm sido testadas em fase experimental e demonstram resultados promissores (Tabela 21.1). Comparados ao HIV, os mecanismos de entrada de outros vírus de importância clínica não estão bem elucidados. Porém, atualmente tem crescido o número de estudos que investigam o bloqueio da entrada viral de diversos vírus de importância médica.

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Tabela 21.1 Inibidores da entrada do vírus HIV na célula

DROGA

MECANISMO DE AÇÃO

Maraviroc

Liga-se a CCR5, impedindo uma interação com gp120. “Antagonista do receptor da quimiocina” ou “inibidor de CCR5”.

Enfuvirtide

Liga-se a gp41 e interfere em sua capacidade de aproximar as duas membranas. É também conhecido como um inibidor de fusão.

Vicriviroc

Semelhante ao Maraviroc. É um inibidor de CCR5.

Cenicriviroc

Inibidor dos receptores CCR2 e CCR5.

Enfuvirtide

Liga-se ao gp41 e interfere em sua habilidade de aproximar as duas membranas, viral e celular.

BMS-626529

Uma pequena molécula que interfere na interação de células T CD4 e gp120.

Galato de epigalocatequina

Um polifenol, uma substância encontrada no chá verde, parece interagir com gp120, como fazem várias outras flavinas de chá.

VIR-576

É um peptídeo sintetizado, que se liga a gp41, evitando a fusão do vírus com a membrana celular.

Griffithsin

Lectina ligante de carboidrato, uma substância derivada de algas, parece ter propriedades inibidoras de entrada.

Scytovirin

Cianobactéria, atua como um potente inibidor da entrada do HIV-1.

PRO 140

Anticorpo monoclonal que se liga a CCR5.

Ibalizumab/ TNX-355

Anticorpo monoclonal que se liga a CD4 e inibe a ligação de gp120.

VRC01, PGT121-145 etc.

Proteínas de superfície do HIV capazes de induzir a produção de anticorpos neutralizantes que se ligarão ao vírus e impedirão a sua ligação ao receptor.

21.3.2 Viroterapia Viroterapia não é um conceito novo, mas os avanços técnicos recentes no campo da biotecnologia melhoraram sua especificidade, levando ao desenvolvimento de novos alvos no tratamento do câncer, na terapia gênica para corrigir defeitos genéticos e na imunoterapia contra patógenos. Entretanto, muitos desafios ainda precisam ser superados até que a viroterapia esteja disponível como uma opção de tratamento segura e eficaz. Vários vírus de RNA e DNA são utilizados, porém, os retrovírus e os adenovírus estão entre os vetores virais mais comumente utilizados nos ensaios. Os adenovírus, ao contrário dos retrovírus, não incorporam o seu material genético ao genoma da célula-alvo. Outros vetores virais, tais como, vírus adeno-associados,

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vírus do sarampo e herpes simplex, também são utilizados. O uso de cada vetor viral apresenta vantagens e desvantagens. No contexto da utilização dos receptores virais, estes são específicos para o tipo de células que infectam. No entanto, o tropismo celular pode ser geneticamente alterado, de modo a direcionar o vírus para um determinado tipo celular de escolha. Esta especificidade é essencial para a utilização dos vírus como agentes terapêuticos, somado à vantagem da ausência de resistência, observada no uso de drogas. Essas terapias ainda são incipientes, e mais estudos são necessários para avaliar sua segurança. A seguir, são apresentados alguns exemplos de como os vírus podem ser geneticamente modificados e se tornarem específicos para um determinado tipo celular. Seleção de cepas virais naturais que infectam células com ambiente celular modificado ou expressando receptores específicos sobre as células alvo. Exemplos: O vírus da doença de Newcastle (NDV), um paramixovírus aviário, é tumor-seletivo e intrinsicamente onocolítico por causa de sua potente habilidade em induzir apoptose. Vários estudos comprovam que o NDV é seletivamente citotóxico às células tumorais, mas não às células normais, devido aos defeitos existentes na resposta antiviral via interferon (IFN) em células tumorais. Assim, vetores NDV podem ser utilizados seletivamente na terapia do câncer41. Cepas do vírus do sarampo utilizadas na vacina possuem, naturalmente, propriedades antitumorais in vitro em vários tipos de câncer e em modelo murino. Este vírus utiliza moléculas CD46 como principal receptor de entrada na célula. Tais moléculas regulam negativamente o sistema complemento e são, geralmente, superexpressas em células cancerígenas para escapar da lise mediada por complemento42. Alteração no domínio de proteínas virais para se ligar a diferente receptor celular. O glioblastoma é um tumor cerebral resistente às terapias convencionais e a segunda causa mais comum de morte por doença neurológica. A ausência de terapia efetiva para tumores cerebrais tem gerado intensas investigações de novas abordagens terapêuticas para estes tipos de tumores. O adenovírus sorotipo-5 (AdV-5) somente se replica em células defectivas para via de sinalização do supressor de tumor Rb/p16 e apresenta atividade oncolítica. O AdV-5-Delta 24RGD (DNX-2401) é um vírus oncolítico geneticamente modificado que contém o domínio arginina-glicina-ácido aspártico-4 cisteína (RGD-4C) que se liga à integrina, permitindo a infecção de células tumorais independente da presença do receptor CAR. Testes em animais demonstram que estes vírus parecem não infectar células normais, não foi

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observada citotoxicidade e 60% dos animais tratados sobreviveram por longo tempo43. Vírus modificados para expressar novas proteínas na superfície da célula e alterar o tropismo celular. Exemplos: o vírus do sarampo utiliza uma proteína presente no envelope, a hemaglutinina (H), para se ligar a um de seus dois receptores, CD46 ou CD150, e à proteína de fusão (F) para mediar a entrada do vírus e subsequente distribuição viral célula a célula por fusão. A interação do vírus do sarampo com seus receptores naturais foi ablada, e um anticorpo de cadeia simples (scFv), específico para um receptor de folato A (do inglês folate receptor A – FRA), um alvo superexpresso em 90% dos cânceres de ovário não mucinosos, foi inserido ao vírus. Vírus de sarampo modificados para se ligar ao FRA podem infectar e destruir tumores positivos para FRA, como observado em experimentos em modelo murino44. Proteínas fusogênicas virais modificadas O exemplo mais bem conhecido sobre a entrada dos vírus na célula é por fusão. Muitas proteínas do envelope viral envolvidas no processo de fusão entre as membranas celular e viral dependem de ativação proteolítica. A clivagem das proteínas de fusão é essencial para a infectividade do vírus. Esta atividade proteolítica é específica para cada tipo de célula e define o tropismo celular. Vetores do vírus sendai, deficientes do gene M, foram produzidos e codificam para a proteína F modificada, sendo que o local de clivagem dessa proteína é alterado e esta pode ser clivada por diferentes proteases. Em células transfectadas com esse vetor, o RNA genômico presente no vetor é replicado, a infecção via proteína fusogênica é distribuída às células vizinhas dependendo da presença de outras proteases e não há liberação das partículas virais. Esses vetores que codificam proteínas F que são clivadas por proteases, cuja atividade é aumentada no câncer, demonstram efeito supressor do crescimento de tumores in vivo45,46. Pseudotipagem de vírus. Exemplo: Vetores lentivirais pseudotipados consistem em partículas de vetores portadores de glicoproteínas (GP) derivados de outros vírus envelopados. Tais partículas possuem o mesmo tropismo do vírus a partir do qual foi derivada a GP. Por exemplo, para explorar o tropismo neural natural do vírus da raiva, vetores projetados para atacar o sistema nervoso central têm sido pseudotipados usando GP derivadas deste vírus. Entre as primeiras e ainda as mais amplamente utilizadas GP para a produção de vetores lentivirais pseudotipados estão as GP do vírus da estomatite vesicular (VSV-G), devido ao amplo tropismo e estabilidade dos pseudotipos resultantes47.

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Controle do tropismo celular através de microRNA. Exemplo: vírus oncolítico do sarampo derivado de cepa vivo-atenuada atualmente tem sido investigado em ensaios clínicos, incluindo um estudo de fase I para glioblastoma multiforme. Estudos pré-clínicos recentes demonstraram que o tropismo celular de vários tipos de vírus pode ser controlado através da inserção de sequências de microRNA-alvo nos seus genomas, inibindo assim a proliferação de tecidos que expressam microRNA cognatos. MicroRNA-7 específico de neurônios é subregulado em gliomas, mas altamente expresso em tecido cerebral normal. Um vírus sensível a microRNA foi construído, e na presença de microRNA-7 tal modificação inibe a tradução de proteínas do envelope, restringe a produção e propagação de progênies virais. Embora altamente atenuado na presença de microRNA-7, este vírus mantém a sua eficácia contra xenoenxertos de glioblastoma. Além disso, a inibição mediada pelo microRNA protege camundongos suscetíveis à infecção pelo vírus oncolítico do sarampo48.

21.4 MÉTODOS UTILIZADOS PARA ESTUDAR OS MECANISMOS DE ENTRADA DOS VÍRUS NA CÉLULAS Estudar os mecanismos de entrada dos vírus na células é um grande desafio, pois há diversas vias de entrada e inúmeras etapas em cada uma delas. Cada via envolve numerosas interações físicas e químicas entre o vírus e a célula hospedeira. Métodos de imagem celular in vivo, que incorporam sondas fluorescentes em componentes virais, contribuem para o estudo da expressão de RNAm, interação, movimento e localização viral. Outros eventos da replicação viral no interior de uma célula hospedeira podem ser investigados por detecção não invasiva, como o rastreamento de um vírus individualmente, o que não inibe a infectividade viral ou função celular. Além disso, novas tecnologias, tais como varredura ou screening com pequenos RNA de interferência (small interfering RNA – siRNA), contribuem para a identificação de moléculas que participam de vários mecanismos envolvidos na adsorção e entrada do vírus na célula. Quando aplicada no contexto de infecções virais, validada e acompanhada, as informações obtidas através dessa abordagem de triagem fornecerá uma nova e mais completa compreensão das bases celulares de doenças infecciosas4. Além disso, para avançar é importante usufruir das novas tecnologias, incluindo o rastreamento individual de vírus, métodos quantitativos de imagem celular in vivo e técnicas avançadas em microscopia eletrônica,

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atreladas à melhoria dos ensaios para acompanhar passo a passo as etapas que os vírus precisam alcançar para infectar uma célula.

21.4.1 Microscópio de fluorescência Existem duas estratégias gerais para a marcação dos vírus: a fusão de uma proteína viral-alvo com uma proteína fluorescente (PF), ou a marcação química direta com pequenas moléculas de corante. Para fundir uma PF às estruturas virais, a sequência de DNA da PF deve ser geneticamente modificada na matriz de leitura aberta (do inglês open reading frame – ORF) da proteína viral. As proteínas do capsídeo ou do tegumento são alvos para a marcação49. Diferentemente da marcação com PF, marcadores químicos (MQ) podem ser ligados a estruturas virais em diferentes estágios do ciclo de replicação viral. Um aumento do número de MQ com características diferentes pode se ligar covalentemente ou não às diferentes moléculas-alvo. Por exemplo, o capsídeo de vírus não envelopado pode ser covalentemente marcado com corantes aminorreativos (os vermelhos Cy5, Alexa 647 e a também vermelha proteína mCherry, por exemplo)50, e a membrana externa purificada de vírus envelopados podem ser marcadas por incorporação de corantes lipofílicos (DiD, DII e análogos)51. Marcações de genomas virais podem ser feitas através da infecção de células, na presença de nucleotídeos marcados com fluorescência ou corantes que se ligam a ácidos nucleicos. Os anticorpos não são, geralmente, utilizados para a marcação de vírus em experimentos de rastreamento em células vivas, porque eles podem bloquear a função de proteínas virais após a ligação.

21.4.2 Microscopia eletrônica A microscopia eletrônica (ME), incluindo microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), pode fornecer imagens estáticas com resolução próxima da escala nanométrica. Há mais de cinquenta anos, a ME tem sido rotineiramente explorada em investigações sobre a entrada do vírus na célula e fornece informações sobre a estrutura e composição viral. Como um exemplo mais recente, a micrografia eletrônica foi usada para estudar a entrada do HSV, e observou-se que a entrada se dá por endocitose ou por penetração direta na membrana celular, e isto depende

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do tipo de célula. Quando combinado com estudos funcionais que medem a entrada bem-sucedida de partículas virais que iniciam a infecção produtiva, a análise por ME sustenta a hipótese de que tanto a via endocítica quanto a não endocítica são possíveis para a entrada do HSV4,52. Experimentos com ME são, normalmente, realizados em condições restritas e em células fixadas, o que é muitas vezes incompatível com um ambiente de células vivas. Além disso, as interações dinâmicas importantes são geralmente negligenciadas em quantificações feitas por ME53. A natureza e a complexidade do processo de entrada dos vírus na célula exigem uma investigação em nível da biologia dos sistemas. Isso requer um conhecimento interdisciplinar e experiência em biologia celular, molecular e estrutural, bem como o trabalho de colaboração e complementaridade entre a investigação experimental e teórica/modelagem.

21.5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS Os vírus desenvolveram mecanismos sofisticados para utilizar a maquinaria da célula hospedeira a fim de estabelecer uma infecção produtiva. Os recentes avanços no campo da engenharia genética e microscopia melhoraram nosso entendimento sobre os mecanismos envolvidos na entrada dos vírus nas células. Além disso, a complexidade do processo de entrada viral via endocitose requer investigações multifatoriais, o que exige conhecimento interdisciplinar e experiência em biologia celular, molecular e estrutural, bem como o trabalho complementar entre a investigação teórica e experimental. Estudos sobre a entrada dos vírus nas células constituem uma importante área de pesquisa com forte potencial para a identificação de novas estratégias para prevenir epidemia e pandemia de doenças virais causadas pelo HSV, HIV, papilomavírus, Influenza e muitos outros vírus. As investigações nesta área contribuem não somente para o entendimento da história natural de infecções virais e a descoberta de novas drogas para o tratamento dessas infecções, mas também nos ajudará a projetar melhores vetores virais de terapia gênica e vacinas protetoras.

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CAPÍTULO

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VETORES VIRAIS: TIPOS, DIVERSIDADES, USOS E APLICAÇÕES Eugenia Costanzi-Strauss Daniela Bertolini Zanatta Rodrigo Esaki Tamura Juliana Goulart Xande Bryan E. Strauss 22.1 INTRODUÇÃO

Hoje, a tecnologia de DNA recombinante e vetores para transferência gênica faz parte da rotina dos laboratórios de pesquisa. O sequenciamento de 3 bilhões de pares de bases do genoma humano chamou a atenção para o fato de que o grande volume de informações sobre a sequência descritiva de bases não é acompanhado por volume equivalente de conhecimento funcional, ou seja, o nosso entendimento de funções moleculares ainda é limitado. Transferência gênica é uma estratégia que viabiliza a introdução e expressão de sequências de DNA em células para que funções das sequências de DNA possam ser reveladas. Vetores de transferência gênica são potentes ferramentas geradoras de conhecimento funcional e capaz de mover as descobertas da etapa de diagnóstico até a etapa de terapia gênica. A transferência gênica pode ser empregada de diferentes maneiras, dependendo do objetivo do ensaio, incluindo interesses voltados para pesquisa básica, produtos

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biotecnológicos ou terapêuticos. Pesquisadores estão familiarizados com a metodologia de transferência gênica, desde simples transformação de células de procarioto com plasmídeos regulares, até transdução de células de mamíferos com sofisticados vetores virais. Células geneticamente modificadas têm sido amplamente exploradas na bioindústria, incluindo a produção de proteínas recombinantes, vacinas, produção de anticorpos, entre outros. Este capítulo tem como foco central a aplicação de transferência gênica no tratamento de doenças humanas com visão das diferentes etapas, desde a escolha do sistema de transferência gênica até os protocolos clínicos experimentais, utilização de DNA com fins terapêuticos, a conhecida terapia gênica e suas ferramentas mais promissoras, além dos vetores virais de transferência gênica.

22.2 HISTÓRICO DA TECNOLOGIA DE TRANSFERÊNCIA GÊNICA A ideia de usar a tecnologia de transferência gênica para fins terapêuticos e biotecnológicos não é nova e tem sido uma fiel acompanhante dos estudos de manipulação genética. Em 1947, Tatum e Lederberg observaram pela primeira vez o processo de transferência gênica entre bactérias, denominado conjugação1. Cinco anos depois, em 1952, Zinder e Lederberg mostraram que vírus bacterianos (bacteriófagos) também podem funcionar como veículos de transferência de material genético entre bactérias2. Ambas as publicações inspiraram em 1960 a criação da expressão “terapia gênica” para descrever o uso dessa metodologia com fins terapêuticos, de certa forma prevendo o surgimento do primeiro protocolo de transferência gênica realizado em células de mamíferos, descrito por Szybalska e Szybalski em 19623. Certamente, terapia gênica é uma das aplicações da tecnologia de DNA recombinante com maior impacto e potencial sobre o tratamento de doenças e introdução de novos procedimentos clínicos. A Tabela 22.1 exibe a linha do tempo da transferência gênica, desde as primeiras descrições de transdução de células de procariotos até o licenciamento do primeiro vírus terapêutico para comercialização e uso em humanos no mundo ocidental.

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Tabela 22.1 Linha do tempo indicando as principais descobertas no campo da transferência gênica ANO

EVENTO

PESQUISADORES

DESCRIÇÃO DO EVENTO

1928

Observação do “princípio da transformação”.

Griffith

Descreveu a transformação de bactérias pneumococos não virulentas (forma R, tipo I) em bactérias pneumococos virulentas (forma S, tipo II).

1944

É identificado que o “princípio transformante” é o DNA.

1947

Descoberta da transferência gênica via conjugação

Tatum e Lederberg1

Transferência de material genético entre bactéria.

1952

Introdução do termo “transdução” para descrever mecanismo de transferência gênica.

Zinder e Lederberg2

Observação de que bacteriófagos (vírus de bactérias) podem transferir material genético de uma bactéria para outra.

1960

A expressão “terapia gênica” começa a ser usada.

Citado por: Walters, LeRoy. Gene Therapy: Overview. In Encyclopedia of Ethical, Legal, and Policy Issues in Biotechnology

A expressão “terapia gênica” é utilizada para descrever o procedimento de transferência de material genético com fins terapêuticos.

1961

Mostra que a informação genética também pode partir do RNA para o DNA.

Termin

O estudo foi realizado com células de galinha infectadas com vírus de sarcoma de Rous (RSV).

1962

Primeiro ensaio documentado de transferência gênica com células de mamíferos.

Szybalska e Szybalski

Demonstrou que um defeito genético podia ser “reparado” com transferência de DNA normal e que o gene transferido (exógeno) podia ser herdado pelas células-filhas.

1966

Primeiro crítico artigo discutindo a possibilidade de uso de vírus em terapia gênica.

Tatum

O sucesso dos mecanismos de transformação estimulam as primeiras discussões de que a engenharia gênica poderia ser uma nova estratégia para tratamento de doenças genéticas.

1968

Demonstração de que os vírus são veículos de transferência gênica.

Roger e Pfuderer

O vírus do mosaico do tabaco foi usado como um veículo.

1972

Revista Science publica o artigo “Gene therapy for human genetic disease?”.

Friedman e Robin5

Perspectiva de que o tratamento genético poderia compensar erros na sequência de DNA associado com doenças.

1973

Primeira tentativa de terapia gênica em humanos.

Roger e colegas

O tipo selvagem do Shope papilomavírus foi usado com objetivo de inserir o gene para arginase em duas pacientes portadoras de anomalia no ciclo da ureia.

Cline

O estudo foi realizado com dois pacientes portadores de β-talassemia. Um paciente foi tratado na Itália e outro em Israel. Células da medula óssea foram removidas dos pacientes e o gene da β-globina foi introduzido.

Primeiro protocolo de terapia gênica 1980 utilizando DNA recombinante.

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Avery, Macleod e McCarty Demonstraram que o DNA induz a transformação de pneumococos.

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EVENTO

PESQUISADORES

DESCRIÇÃO DO EVENTO

1990

Primeiro protocolo de transferência gênica em humanos oficialmente aprovado (protocolo sem fins terapêuticos).

Rosenberg

Linfócitos infiltrados no tumor (tumor infiltrating linphocytes – TILs) foram removidos de mestastase de melanoma, transduzidas ex vivo com retrovírus recombinante portador do gene marcador neo (gene bacteriano que promove resistência ao antibiótico neomicina). Em seguida, as células geneticamente modificadas foram implantadas no paciente doador.

1990

Em 14 de setembro, o primeiro protocolo clínico de terapia gênica foi aprovado.

Blaese

Tratamento de duas crianças com deficiência em adenosina deaminase (ADA-SCID). Células brancas do sangue foram geneticamente modificadas ex vivo com vetor retroviral recombinante portador do gene para adenosina deaminase (ADA).

1991

Publicação do primeiro Este documento recebeu registro federal nos EUA. Iniciativa para documento: “Points to Consider Center for Biologics Evaluation estabelecer um guia para manufaturação de vetores de transferência in Human Somatic Cell Therapy and Research – FDA, EUA gênica e linhagens celulares para aplicação clínica. Esta versão foi and Gene Therapy”. atualizada em 2001 incluindo novos vetores e transdução in vivo.

1992

Primeiro protocolo utilizando transferência gênica para tratamento do câncer.

Rosenberg

Tratamento de dois pacientes com melanoma utilizando transdução ex vivo de TILs com retrovírus portador do gene do fator de necrose tumoral.

1999

Morte do paciente J. Gelsinger. Primeira fatalidade de protocolo de terapia gênica diretamente atribuída à administração de vetor adenoviral.

Wilson, Batshaw e Raper

O paciente participou de protocolo experimental para tratamento de deficiência de orninina transcarbamilase (OTC). O protocolo de fase I tinha como principal objetivo investigar o escanolamento de doses de vetor adenoviral portador do gene OCT administrado no fígado dos pacientes.

2000

Comunicação de sucesso no tratamento de SCID-X1.

Cavazzana-Calvo e colegas

Transdução ex vivo de células C34+ recolhidas de pacientes com vetor retroviral.

Crianças com SCID-X1 desenvolvem um tipo de leucemia de 2002 Cavazzana-Calvo e colegas células T após terapia gênica. Uma criança faleceu. 2003

Licenciado o primeiro medicamento de terapia gênica para uso clínico na China.

O retrovírus usado no tratamento das crianças com SCID-X1 continha uma sequência enhancer capaz de ativar proto-oncogenes, como LMO2. Apesar da fatalidade, a imunodeficiência foi corrigida em 18 das 20 crianças tratadas (incluindo os diagnosticados com leucemia sobreviventes).

Administração de Alimentos e Drogas da China

Medicamento para terapia gênica do cancer, GendicineTM é um adenovírus portador do gene supressor de tumor p53. Voltado para o tratamento de carcinoma de cabeça e pescoço.

2005

Licenciado o segundo medicamento de terapia gênica para uso clínico na China.

Administração de Alimentos e Drogas da China

Medicamento para terapia gênica do câncer, OncorineTM é um adenovírus replicativo condicional. OncorineTM contém uma deleção na região E1B que limita sua replicação apenas nas células defectivas no gene p53. OncorineTM é aplicado em combinação com quimioterapia no tratamento de câncer.

2009

Anúncio de sucesso no tratamento de cegueira congênita de Leber.

Bennett e colegas

Vírus adeno-associado foi utilizado para transferir o gene RPE65 para a retina dos pacientes.

2012

Licenciado em 19 de julho o primeiro medicamento de terapia European Medicines Agency gênica para uso clínico na Europa.

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Medicamento para terapia gênica de deficiência severa de lipoproteína lipase: GlyberaTM é um vírus adeno-associado capaz de transferir e expressar o gene da lipoproteína lipase no tecido muscular dos pacientes.

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Vetores Virais: Tipos, Diversidades, Usos e Aplicações

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A década de 1970 foi um período de rápido crescimento e amadurecimento dos conceitos de DNA recombinante. Os primeiros exemplos de construção de um vetor plasmidial recombinante e sua propagação em bactérias valeram o Prêmio Nobel de Química a Paul Berg em 1980, o qual contou com importante e significativa contribuição de Herbert Boyer e Stanley Cohen 4. Essa tecnologia viabilizou o surgimento de uma nova indústria, a da biotecnologia e também despertou atenção para aspectos éticos na manipulação do material genético. Várias conferências foram realizadas com o objetivo de discutir a ética no emprego da tecnologia de DNA recombinante e a biossegurança de organismos geneticamente modificados4. Mesmo antes do surgimento do primeiro produto comercial destinado ao trabalho de construção de vetores (como as enzimas modificadoras de DNA), a ideia de usar vetores para tratamento de doenças humanas já estava sendo discutida. Publicado em 1972, o artigo de Friedmann e Roblin delineou os requerimentos e preocupações para a futura terapia gênica5. Nessa publicação, foi proposto que doenças genéticas, causadas por apenas um gene defeituoso (doenças monogênicas) poderiam ser tratadas utilizando um vetor, talvez um vírus recombinante, capaz de transferir cópia saudável do gene defeituoso para as células do paciente. E também destacou a importância de conhecer a doença sob a lente da biologia molecular e estudar o comportamento dos vetores em modelos animais5. Até hoje, esses princípios e práticas são respeitados em todos os estudos de transferência gênica. O conceito de transferência e terapia gênica surgiu antes da revolução da engenharia genética. O trabalho do vencedor do Prêmio Nobel Renato Dulbecco mostrou, em 1968, que o simian virus 40 (SV40) podia inserir seu DNA no genoma da célula hospedeira, causando alterações fenotípicas. Também na década de 1960, Stanfield Rogers demonstrou que a versão recombinante de SV40 podia ser utilizada como vetor de transferência e expressão de DNA. Em outros estudos, Rogers observou que o vírus do papiloma de Shope confere atividade de arginase às células infectadas e usou este vírus selvagem (sem modificação) para tratar, sem sucesso e sem autorização, crianças com hiperargininemia6. A técnica de DNA recombinante caminhou na direção de criar seguros e eficientes vetores de transferência gênica e, no início da década de 1980, os primeiros vetores virais recombinantes começaram a ser usados 7, 8. Hoje, ainda muito trabalho e esforços continuam sendo dispendidos com o objetivo de aprimorar e aperfeiçoar os vetores de transferência gênica. Em 1980 foi descrita pela primeira vez a aplicação de um vetor recombinante no tratamento de pacientes. Neste protocolo clínico, Martin Cline

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introduziu o gene de β-globina em células de medula óssea de dois pacientes com β-talassemia. Apesar do procedimento não ter resultado em benefício (e nem malefício) clínico, o pesquisador sofreu séria punição em virtude de ter realizado um ensaio clínico sem autorização e sem base sólida de experimentação em animais9. A Food and Drug Administration (FDA) autorizou o primeiro protocolo clínico em 1990. Este ensaio clínico pioneiro usou retrovírus para introduzir o gene da enzima adenosina deaminase (ADA) em células T de dois pacientes com imunodeficiência combinada severa (severe combined immunodeficiency – ADA-SCID). O tratamento conferiu benefício clínico para um desses pacientes, sem efeitos colaterais10,11.

22.3 VETORES VIRAIS ILUMINAM CÉLULAS Talvez não exista um melhor sistema para visualizar a transferência e a expressão gênicas do que quando são empregados vetores portadores de genes que codificam para proteínas fluorescentes. Células geneticamente modificadas com esse tipo de vetor tornam-se uma fonte de luz facilmente visualizada. A descoberta de proteínas fluorescentes (light-emiting proteins) revolucionou a imagem dinâmica e não invasiva de processos celulares. A mais marcante e promissora proteína fluorescente é conhecida pela sigla GFP (green fluorescent protein), com espectro de excitação de 395 nm e emissão de 509 nm. Vetores que expressam GFP e suas variantes fazem parte do arsenal tecnológico atualmente utilizado nos estudos que envolvem transferência gênica12. O gene da proteína fluorescente GFP, clonado da água-viva Aequorea victoria, codifica para um polipeptídeo com 238 aminoácidos contendo um cromóforo natural que consiste em um anel imidazólico, formado pela autociclização dos resíduos de aminoácidos serina 65, tirosina 66 e glicina 67. A proteína GFP exibe autofluorescência verde após excitação com luz azul, não necessita de substrato, cofator ou adicional produto gênico, não é tóxica, é estável a 37 °C, resistente à fotodegradação e emite um alto sinal compatível com microscopia de fluorescência comum. Células vivas que expressam GFP podem ser facilmente contadas, e isoladas em tempo real utilizando citometria de fluxo, leitores de microplacas, microscopia de fluorescência ou sistema de imageamento de animais sem manipulação13. Mutações em alguns códons de GFP resultaram em diversas versões melhor adaptadas para a expressão da proteína em células de mamíferos,

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como a variante enhanced GFP (EGFP), com espectro de excitação de 488 nm e emissão de 509 nm. Mutações também originaram versões com espectros diferentes, com maior brilho e resistentes a mudanças de pH. Por exemplo, as versões blue fluorescent protein (BFP) e cyan fluorescent protein (CFP), com o pico de absorção de 384 nm e 420 nm, respectivamente, foram produzidas por meio da substituição do aminoácido Tyr66 por His66 ou Trp66. A variante yellow fluorescent protein (YFP) é caracterizada pela mutação pontual Thr203Tyr e excitação em 514 nm, é mais brilhante do que EGFP, porém menos estável 14. Na faixa do infravermelho, a proteína monomérica fluorescente Discosoma red (DsRed, excitação 556 nm, emissão 586 nm) isolada do coral Discosoma é uma das mais usadas. A biologia não foi a mesma depois de GFP. Em 1992, o laboratório de Shimomura descreveu pela primeira vez a estrutura da proteína GFP e, no mesmo ano, Prasher isolou e clonou o DNA complementar (cDNA) correspondente ao gene GFP. Dois anos depois, em 1994, Chalfie transferiu GFP para o nematoide Caenorhabditis elegans, revelando o potencial de GFP como marcador de expressão gênica. O laboratório de R. Tsien descreveu em 2004 a maior cartela de cores de proteínas fluorescentes, como mCherry, mBanana, mOrange, mStrawberry, mTangerine, mHoneydew, mPlum, entre outras15, 16. Este arco-íris de proteínas fluorescentes auxilia os pesquisadores na marcação e observação simultânea e em tempo real de várias proteínas na mesma célula ou organismo. O impacto das proteínas fluorescentes foi reconhecido com o Prêmio Nobel de Química de 2008, concedido a O. Shimomura, M. Chalfie e R. Tsien pela descoberta e desenvolvimento da famosa proteína fluorescente GFP13. A tecnologia de marcação de células e organismos com GFP e seus derivados tem impacto direto no desenho experimental e interpretação de resultados. Os biologistas estão cada vez mais dependentes de vetores com cassetes de expressão contendo GFP. O uso básico de proteínas fluorescentes é como um repórter (marcador), o qual viabiliza a observação in vivo de processos biológicos com resolução desde o nível subcelular (localização de proteínas dentro de células) até organismos inteiros. O primeiro passo para a utilização das proteínas fluorescentes é a construção de vetor de transferência gênica capaz de expressar a proteína fluorescente na célula, tecido ou animal de interesse16, 17. É neste ponto que se estabelece a parceria entre proteínas fluorescentes e vetores virais. Praticamente não existe um sistema de vetores virais que não tenha um vetor portador de cassete de expressão contendo GFP, que é usado para avaliar a transferência gênica e capacidade de expressão do vetor na linhagem celular, tecido ou animal-alvo. Vetores

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que expressam GFP são indispensáveis na criação de modelos in vivo relevantes para estudo de diversos processos biológicos (expressão gênica, proliferação, migração, diferenciação celular, crescimento e regressão de tumores, entre outros) incluindo o desenvolvimento de novos medicamentos e estratégias terapêuticas. O cDNA de uma proteína fluorescente pode ser clonado com diferentes configurações nos vetores de transferência gênica. O arranjo mais simples é a inserção do cDNA de GFP ou uma variante na posição do transgene principal, logo após o promotor. Nesse tipo de vetor, é comum a presença de um segundo promotor que direciona a expressão de um cassete de seleção, por exemplo o gene NEO, que é responsável por conferir resistência ao antibiótico neomicina. Como as células transduzidas com vetores portadores de GFP, ou suas variantes, ganham fluorescência, essa luminosidade também serve para selecionar células modificadas, agora utilizando citometria de fluxo (cell sorting) ou clássicos métodos de clonagem celular. A Figura 22.1 ilustra algumas opções para a inclusão de GFP em vetores retrovirais. Vida celular é um processo contínuo no qual as células recebem e respondem a estímulos que resultam em modificações morfológicas que podem ser facilmente visualizadas nas células sensorizadas com GFP. O cDNA de proteínas fluorescentes monoméricas pode ser fusionado com virtualmente qualquer gene de interesse. Um exemplo disso são as proteínas do citoesqueleto, incluindo actina, tubulina e tau, que, quando fusionadas com GFP, permitem a visualização de mudanças dinâmicas de forma e tamanho celular. A principal diferença entre uma linhagem celular marcada com GFP e uma linhagem celular sensorizada com GFP, ou qualquer uma de suas variantes espectrais, é que nesta segunda categoria a fluorescência está relacionada a um evento ou processo celular. A Figura 22.2 mostra uma linhagem sensora produzida com a transdução de células HT1080 com retrovírus que expressam EGFP ou YFP fusionados com o gene de histona H2B, uma das proteínas do nucleossomo. Neste tipo de estratégia, a proteína fluorescente fica ancorada ligada ao nucleossomo, tornando possível acompanhar em células vivas todo o processo de mitose. Diversas linhagens sensoras são reconhecidas como produtos biotecnológicos, com valor e interesse comerciais. Com uma simples medida de fluorescência, as linhagens sensoras oferecem uma oportunidade para analisar em tempo real o efeito de drogas sob diversos critérios e em grande número de amostras. No campo de desenho e desenvolvimento de processos biotecnológicos, como de produção de vetores virais, as proteínas fluorescentes também têm sido intensamente utilizadas, pois facilitam e aceleram a análise

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Figura 22.1 GFP é ideal para visualização não invasiva, em tempo real, de células vivas. (A) Cassete de expressão de típico vetor retroviral contendo dois promotores e dois transgenes. O cDNA do gene GFP ocupa posição 3’ ao promotor 1, enquanto o gene de seleção NEO (que confere resistência ao antibiótico geneticina) está sob regulação do promotor 2. (B) Cassete de expressão de vetor retroviral no qual NEO foi substituído por EGFP, que agora serve para marcar e selecionar as células transduzidas. A posição 5’ seguida ao promotor 1 é ocupada pelo transgene de interesse. (C) Imagens capturadas sob microscopia confocal de células vivas da linhagem HT1080 transduzidas com retrovírus contendo o cassete de expressão na configuração B. (D) Análise quantitativa de citometria de fluxo. Análise de células HT1080 não transduzidas (painel superior) e células HT1080 transduzidas com vetor retroviral portador de cassete de expressão mostrado em C (painel inferior). É possível observar claramente nas células transduzidas duas populações distintas, uma população GFP-, semelhante à distribuição das células não transduzidas, e uma população de células GFP+ com maior intensidade de fluorescência.

de quase todos os parâmetros de produção viral, desde o estabelecimento e monitoramento de linhagens produtoras, até a titulação viral e análises de eficiência de transdução. A proteína GFP e suas variantes têm sido expressas em diferentes organismos. Depois do C. elegans, Drosophila melanogaster, leveduras, camundongos, peixes (zebrafish), Xenopus laevis, coelhos, porcos, gatos, plantas, muitos outros já receberam GFP, promovendo o surgimento de novos modelos de animais transgênicos, nos quais imagens podem ser capturadas ao

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Figura 22.2 Linhagens celulares sensoras para as fases da mitose. Esquema do arranjo de cassete de expressão de vetor retroviral contendo o cDNA do gene YFP fusionado ao cDNA do gene histona H2B. Imagens em tempo real de células HT1080 transduzidas com retrovírus dos cassetes de expressão H2B-YFP, capturadas sob microscopia confocal. Cada núcleo celular pode ser observado individualmente, e a cinética das fases de divisão com diferentes estágios de condensação da cromatina pode ser visualizada em amarelo (YFP). À esquerda, observação panorâmica das linhagens sensoras.

longo do tempo de um modo não invasivo. A incorporação de proteínas fluorescentes aos protocolos de geração de animais transgênicos evita estudos do tipo “end point”, em que muitos grupos de animais são necessários para coleta de dados cinéticos. Agora, o mesmo grupo de animais pode ser monitorado durante o tempo que for necessário. A Figura 22.3 ilustra modelos de animais EGFP transgênicos em uso no nosso laboratório, incluindo o animal C57BL/6 EGFP e o camundongo nude C57BL/6 EGFP, utilizado um modelo xenográfico no qual células HT1080 transduzidas com retrovírus portador do gene para a proteína fluorescente mCherry foram injetadas no subcutâneo. Nas imagens de corpo inteiro, fica clara a distinção entre tecido tumoral e animal hospedeiro.

22.4 NORMAS REGULATÓRIAS E SUPERVISÃO DE TRABALHOS COM ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS (OGM) A introdução de material genético em qualquer organismo precisa ser realizada sob condições adequadas e obedecendo as normas estabelecidas por órgãos governamentais, para manter a segurança do trabalhador, do meio ambiente e da comunidade. Por definição, OGM inclui qualquer célula ou organismo que recebeu material genético exógeno. O trabalho com OGM

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Figura 22.3 Uso de proteínas fluorescentes para marcação de animais e tecidos. (A) Foto de camundongo transgênico C57BL/6 EGFP e sua cria capturada sob campo claro (superior) e escuro (inferior). Pode se observar a forte fluorescência verde produto da expressão de EGFP no corpo inteiro da cria e nas regiões de pouca pelagem do animal adulto (orelhas, patas, focinho). (B) Imagens de modelo xenográfico nude C57BL/6 EGFP capturadas sob diferentes campos de luz. O camundongo nude C57BL/6 EGFP foi gerado a partir do cruzamento entre animal transgênico C57BL/6 EGFP e camundongo nude C57BL/6. O transgênico nude C57BL/6 EGFP exibe forte fluorescência verde no corpo inteiro, resultado da expressão do transgene EGFP. Este animal também exibe um tumor subcutâneo com fluorescência vermelha, devido ao implante de células tumorais humanas da linhagem HT1080 transduzidas com vetor retroviral que expressa a proteína fluorescente mCherry. O modelo permite nítida distinção entre células tumorais e células do animal hospedeiro.

é regulado pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), a qual estabelece as normas e sistemas de supervisão da manipulação de OGM no Brasil (por meio da Resolução Normativa n. 2, de 27 de novembro de 2006). Nenhum trabalho com OGM pode ser executado sem aprovação prévia da CTNBio e/ou seus representantes locais, as Comissões Internas de Biossegurança (CIBio), que atuam como intermediárias entre o pesquisador e a CTNBio. O trabalho com agentes biológicos bem caracterizados e conhecidos por não provocarem doença em seres humanos sadios e que possuem mínimo risco ao operador e ao meio ambiente são classificados pela CTNBio como sendo de nível de biossegurança 1 (NB-I). Para tal, a CTNBio exige que os trabalhadores sigam as normas de boas práticas de laboratório, utilizem equipamentos de proteção individual (EPIs) e recebam treinamento constante. Atividades de NB-I não requerem infraestrutura diferente da disponível em laboratórios comuns (como bancadas com tampo de material não poroso, pias para lavagem de mãos, descarte apropriado para resíduos etc.).

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Trabalhos em NB-I incluem construção de plasmídeos com material genético derivado de organismos classificados como NB-I e transferência destes para organismos NB-I. Como recomendado nas normas da CTNBio, todo OGM deve ser destruído antes de ser removido do laboratório, e todo material deve ser autoclavado antes do descarte. Em contraste, vetores virais (incluindo retrovírus, adenovírus, lentivírus, entre outros) são classificados como NB-II, porque esses vetores têm risco moderado de causar doenças. Esforços para manter as condições de trabalho em contenção são redobrados nas áreas NB-II em comparação com NB-I. O trabalho NB-II contempla as mesmas regras que NB-I, mas também exige que todas as manipulações sejam realizadas utilizando equipamentos de contenção primária, como cabines de segurança biológica. A manipulação, o armazenamento e a descontaminação de OGM NB-II só podem ocorrer dentro de áreas certificadas para trabalho NB-II. A remoção de um OGM e de todo o material que entrou em contato com um OGM de área certificada implica transporte do OGM e também requer autorização do CTNBio.

22.5 A TECNOLOGIA DA TRANSFERÊNCIA E TERAPIA GÊNICA: CONCEITOS BÁSICOS 22.5.1 Considerações sobre o vetor e seu desenho O desenvolvimento de um vetor de transferência gênica, especialmente para aplicação in vivo ou terapêutica, deve ser guiado pelos seguintes pontos: (1) o problema a ser abordado; (2) o ambiente celular e (3) a via de transferência. A Tabela 22.2 apresenta as principais características relevantes para a escolha do vetor.

22.5.1.1 O problema a ser abordado O problema abordado, por exemplo, uma doença genética, é observado em seu aspecto macroscópico como um quadro clínico característico, em que muitas vezes só podemos tratar dos sintomas. Porém, para uma intervenção definitiva a fim de erradicar o problema, é necessário identificar a origem causal, que pode ser um gene ou um conjunto de genes mutados, responsáveis pela alteração funcional de uma ou mais proteínas, e o consequente quadro clínico.

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Vetores de transferência gênica podem introduzir diferentes modificações no transcriptoma celular. Os vetores podem transferir cópia selvagem de um gene que está mutado ou deletado (remediação/reposição), ou adicionar uma cópia extra de um gene já presente para aumentar o nível de expressão (augmentation, amplificação), ou diminuir, até mesmo silenciar, expressão indesejada de um gene, ou ainda atribuir novas propriedades a célula alvo, por exemplo, resistência a drogas. O tipo de modificação gênica que o vetor vai causar está relacionado ao problema a ser resolvido. Aplicação clínica de transferência gênica para o tratamento de doenças monogênicas, em princípio usam um vetor capaz de introduzir cópia selvagem do gene responsável pela doença genética, ou seja, o gene terapêutico é a versão normal do que deve ser remediado. Este é o caso dos vetores clínicos portadores dos genes CFTR, fator VIII ou IX, β-hemoglobina, administrados em ensaios de terapia gênica para o tratamento de fibrose cística, hemofilia e talassemia, respectivamente. A intervenção de patologias multigênicas são as que mais se beneficiam da versatilidade de modificações genéticas que os vetores de transferência podem causar. De fato, enquanto a aplicação de vetores de transferência gênica para o tratamento de doenças monogênicas é restrita a um único gene alvo de tratamento, o tratamento de anomalias multigênicas aceita diversas opções de genes terapêuticos. Para exemplificar o amplo espectro de possibilidades, vejamos algumas das estratégias de modificação genética para tratamento do câncer. O vetor de transferência gênica pode devolver (reparar) a expressão de um gene supressor de tumor, como p53, para células tumorais. O transcriptoma da célula tumoral também pode ganhar a expressão de um gene suicida, capaz de tornar o câncer sensível a quimioterápicos. Uma nova opção é aplicar a tecnologia de RNA de interferência ou short harpin RNA (shRNA), para bloquear a expressão de proteínas oncogênicas (epithelial growth factor – EGF) ou fatores angiogênicos (vascular endotelial growth factor – VEGF).

22.5.1.2 Ambiente celular A interação entre o vetor de transferência gênica e a célula-alvo precisa ser eficiente. A matriz extracelular pode participar do processo de transdução viral, favorecendo a ligação de partículas virais com específicos receptores celulares. Por outro lado, o ambiente intracelular influencia os elementos regulatórios do vetor, principalmente sequências promotoras da expressão

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do gene exógeno. Não basta expressar o transgene: o ambiente intracelular deve estar adequado para produção, endereçamento e secreção (quando relevante) da proteína transgênica.

22.5.1.3 A via de transferência Via de transferência está associada com o protocolo de administração do vetor viral. A escolha da rota de transferência gênica depende da patologia, do tecido alvo e do vetor. As rotas mais utilizadas são as vias ex vivo ou in situ. Na via ex vivo, a transdução acontece fora do organismo do paciente. Células são removidas do paciente (autólogo) ou obtidas de bancos de células (alogênico), cultivadas, transduzidas in vitro, e então selecionadas e transplantadas no organismo do paciente. Esse tipo de transdução é frequentemente usado para modificar geneticamente células derivadas do tecido hematopoiético. Como o procedimento permite certa seleção de células transduzidas, o título viral não tem o mesmo impacto sobre a eficiência de transdução, como acontece na via in situ. No procedimento in situ, a transdução ocorre diretamente no organismo. Essa rota de administração viral in situ é muito similar à adotada para medicamentos em geral. A aplicação pode ser local (intramuscular, cardíaca, ocular, tumoral ou subcutânea) ou sistêmica (intravenosa). Os vetores podem ser injetados, borrifados (vias aéreas) ou com aplicação tópica. Um requisito importante para viabilizar a administração in situ são preparações virais de alto título. A administração de vetores virais diretamente no organismo do paciente deve levar em consideração algumas propriedades do tecido-alvo. Exemplificando: o tecido pulmonar e as vias respiratórias são de fácil acesso, bem vascularizados e particularmente vulneráveis à transdução com adenovírus. O tecido hepático é rico em capilares fenestrados que aumentam a eficiência de transdução in situ; o tecido retiniano, além da excelente vascularização, é altamente organizado e transparente, características que favorecem o direcionamento e monitoramento da injeção.

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Tabela 22.2 Comparação entre os principais vetores virais utilizados para a transferência gênica terapêutica, destacando-se suas vantagens e desvantagens

ONCORETROVÍRUS

LENTIVÍRUS

ADENOVÍRUS

ADENO-ASSOCIADO

GENOMA

ssRNA

ssRNA

dsDNA

ssDNA

TAMANHO DO GENOMA

3-9 kb

8-10 kb

39-38 kb

5 kb

TAMANHO DO INSERTO

< 8 kb

8 kb

8-30 kb

4 kb

REVESTIMENTO

Envelopado

Envelopado

Não-envelopado

Não-envelopado

INTERAÇÃO COM O GENOMA HOSPEDEIRO

Integrativo

Integrativo

Episomal

Semi-integrativo

EXPRESSÃO DO TRANSGENE

A longo prazo

A longo prazo

Transiente

Potencialmente a longo prazo

IMUNOGENICIDADE

Baixa

Baixa

Alta

Baixa

PROTOCOLOS CLÍNICOS

385 (19%)

67 (3%)

456 (23%)

105 (5,3%)

22.5.2 Sequências regulatórias A central de controle, o “cérebro”, dos vetores de transferência gênica é o cassete de expressão o qual contém o elemento promotor, o gene exógeno e o sinal de poliadenilação. Exemplos de cassetes de expressão podem ser encontrados em várias figuras deste capítulo (por exemplo, na Figura 22.4). Promotores são sequências regulatórias localizadas na região 5’ de um gene com papel de controle da transcrição gênica. Associação de fator de transcrição celular com um promotor aciona a maquinaria de transcrição gênica, via ativação de RNA polimerase, levando à síntese de novo RNA mensageiro (RNAm). O sinal de poliadenilação adiciona uma cauda de adenosina no RNAm, sendo uma modificação pós-transcricional necessária para o processamento do transcrito. Particularmente, nos vetores derivados de retrovírus, o sinal de poliadenilação está presente no long terminal repeat (LTR). Nos vetores de transferência, o gene de interesse está inserido no formato de um cDNA. O cDNA é uma sequência de DNA sintetizada a partir de RNAm maduro, do qual todos os introns já foram removidos, ou seja, contêm apenas exons. A enzima transcriptase reversa catalisa a reação de síntese de cDNA, tendo RNAm como molde. Outras sequências funcionais de

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ácidos nucleicos, não codificadoras de proteína, como microRNA, shRNA ou aptameros, também podem participar dos cassetes de expressão na posição 3’ do elemento promotor. O tipo de inserto pode interferir na escolha dos elementos regulatórios. De modo simplificado, quando o produto de expressão é uma proteína ou microRNA, praticamente qualquer promotor dependente de RNA polimerase II pode ser utilizado. Promotores dependentes de RNA polimerase III, como U6 ou H1, são utilizados para dirigir a expressão de shRNA.

22.5.3 Promotores: uma oportunidade para a especificidade O promotor faz parte do desenho básico do vetor de transferência gênica. Além de direcionar expressão, também cria oportunidade para dar especificidade. Como mostra a Tabela 22.3, os promotores são classificados em quatro categorias: constitutivos, reguláveis, específicos para tecidos e condicionais. Tabela 22.3 Classificação dos promotores mais utilizados em vetores de transferência gênica. STRATEGY

Constitutive

SOURCE

EXAMPLE

Viral

CMV SV40 LTR (MoMLV, RSV)

Eukaryotic

PGK EF1α Ubiquitin-c β-Actin Elf4a1

Composite

CAG βAct/RU5 SV40/hFerH/mEF1

Target

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Tissue specific

SOURCE

EXAMPLE

Hematopoietic cells

B29 CD14 CD42 CD45 CD68

Endothelial cells

Flt1 Endoglin vWF

Muscle

MCK Mb Desmin Myosin

Liver

ApoE hAAT

Neuronal

GFAP SYN1 NSE

Lung

SP1

Proliferation

E2F-1

Transformed cells

Telomerase Survivin PSA, Probasin (prostate) Tyrosinase (melanoma) Osteocalcin (osteocarcinoma) α-fetoprotein (hepatocellular carcinoma)

Hypoxia

HRE (hypoxic response element) HIF1α (as a transcription factor) HIF1α ODD (oxygen dependent degradation domain)

Conditional

Agent

Inducible

Cooperative Combined

Tetracycline/doxycycline

Tet/On Tet/Off

Ecdysone, ponasterone

Ecdysone

Heat

Hsp70

Radiation

Egr1

Chemotherapy

MDR1

p53

pCLPG

Os promotores constitutivos são aqueles que sustentam a expressão do inserto sem a necessidade de indução. Promotores constitutivos virais são populares nos vetores utilizados em estudos básicos e clínicos de

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transferência gênica. Os promotores de origem viral são fortes indutores de expressão, têm tamanho compacto, facilitando a construção do vetor, e estão adaptados para promover expressão gênica em células de mamíferos de variadas origens histológicas. Entre os promotores constitutivos mais comuns, estão: promotor derivado de citomegalovírus (CMV), promotor do vírus símio 40 (SV40), promotor da sequência LTR do vírus do sarcoma de Rous (LTR-RSV), promotor da sequência LTR do vírus da leucemia murina de Moloney (LTR-MoMLV), promotor do fator de elongação 1-α (EF1-α), entre outros18. Os promotores reguláveis permitem o controle da expressão gênica de maneira temporal e quantitativa, por exemplo, úteis na modulação da expressão de proteínas tóxicas19. A ação dos promotores reguláveis depende de um fator regulador, dentre os quais o mais comum são antibióticos que podem ser facilmente adicionados ou removidos do meio de cultura celular. Por exemplo, no sistema Tet-Off a expressão do transgene é bloqueada quando o antibiótico tetraciclina é adicionado ao meio. Um sistema oposto é Tet-On, em que a expressão depende da presença de tetraciclina. Em ambos os sistemas, Tet-Off e Tet-On, a tetraciclina é o agente regulador do promotor20. A Figura 22.4 descreve o funcionamento do sistema de expressão regulada. Especificidade é um dos desafios dos protocolos de transferência gênica, principalmente na transdução in situ na qual diversos tipos celulares diferentes podem receber o novo gene21. A expressão do gene de interesse apenas nas células-alvo é, ao menos em teoria, segura, e pode burlar a toxicidade indesejada em células que não são alvo do tratamento. O promotor específico é uma promessa de especificidade para o processo de transferência gênica in situ, e será útil na aplicação clínica de vetores de transferência gênica, como no caso da terapia gênica do câncer, na qual o procedimento tem como meta matar apenas as células tumorais, preservando as células não tumorais do paciente. Entre os promotores específicos já testados em protocolos de terapia gênica do câncer, destacam-se: (1) o promotor do gene para α-fetoproteína (AFP) ativo no carcinoma hepatocelular; (2) o promotor do gene para antígeno carcino-embrional (CEA) e (3) o promotor do gene para proteína survivin. CEA e survivin são proteínas expressas em diversos tipos de tumores, incluindo carcinoma de mama, pulmão, ovário e colorretal, entre outros22. Vetores de transferência gênica com promotores que respondem a fatores de transcrição celulares também podem garantir especificidade tempo-espacial de expressão do transgene 22,23. Uma opção são os promotores

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Figura 22.4 Promotores regulados por tetraciclina. Em (A), é representado o sistema Tet-Off, em que a proteína transativadora (tTA) se liga aos sete domínios TetO, combinado a uma sequência promotora mínima (CMV), resultando em expressão do transgene. Na presença de tetraciclina, a proteína tTA perde a afinidade com o domínio TetO, e a transcrição acaba não ocorrendo. Em (B), é representado o sistema Tet-On, em que a proteína transativadora mutada (rtTA) precisa interagir com tetraciclina para se ligar ao domínio TetO e ativar a transcrição.

de proteínas mitóticas, como do fator de transcrição E2F-1, responsável pela ativação de cascata de genes da maquinaria de replicação do DNA21,23. Strauss e colaboradores23 demonstraram que o vetor lentiviral com cassete de expressão controlado pelo promotor do gene E2F-1 permite a expressão do transgene anticâncer apenas nas células mitóticas. Neste cenário, a especificidade do promotor é para células em mitose. Trata-se de uma estratégia anticâncer válida, considerando aplicação direta do vetor no tumor, local com predomínio de células mitóticas.

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22.6 A TECNOLOGIA DA TRANSFERÊNCIA E A TERAPIA GÊNICA: CONCEITOS AVANÇADOS Os veículos de transferência gênica podem ser classificados em vetores não virais e vetores virais. Os vetores de origem não virais utilizam processos físicos de transfecção (eletroporação) ou químicos (fosfato de cálcio, lipofecção) para entrar nas células-alvo24. Já nos vetores virais o processo é biológico. Cabe salientar aqui que o termo infecção não pode ser aplicado quando o vetor viral utilizado é incompetente para se replicar. Vírus são eficientes vetores biológicos, e não restam dúvidas de que os sistemas virais são os melhores veículos de transferência gênica. Diversos vírus selvagens transferem material genético para células humanas como parte de seu ciclo de replicação. Esses vírus inserem seus genes nas células -alvo, induzem a célula infectada a produzir muitas cópias virais, às vezes matando a célula hospedeira ou brotando a progênie e, então, novos vírus são liberados. A essência da estratégia da terapia gênica é modificar esses vírus, em outras palavras, “domesticá-los ou “adestrá-los”, substituindo os genes que o vírus usa para acometer as células infectadas por genes “bons” ou genes terapêuticos. Os vírus recombinantes construídos nos laboratórios são capazes de transferir e expressar o gene com potencial terapêutico nas células-alvo do paciente, sem os efeitos deletérios de uma infecção viral selvagem. A função primordial de um vetor de transferência gênica com potencial terapêutico é promover a expressão de proteína funcional que resulte na cura, ou melhoria dos sintomas, de uma doença grave. Hoje, existe um sólido arsenal de vetores virais, muitos dos quais com identidade de medicamento biológico. No campo da intervenção gênica, os vetores virais têm sido os maiores impulsionadores, verdadeiros motores, conduzindo a pesquisa básica até a clínica. De 1989 a julho de 2013, foram executados um total de 1.970 protocolos clínicos de terapia gênica, sendo que 69% (1.358 protocolos) deles utilizaram vetores virais. Retrovírus, adenovírus, lentivírus e vírus adeno-associado pertencem à classe de vetores mais requisitados. Mais da metade (52,5%) do total de protocolos clínicos de terapia gênica utiliza pelo menos um desses quatro vetores virais. Restringindo para o grupo de protocolos que aplica vetores virais, cerca de 76% utiliza pelo menos um desses quatro tipos de vírus. Cada vetor ou sistema viral tem vantagens e desvantagens que precisam ser adequadamente avaliadas. De modo geral, os principais critérios para a escolha de um vetor viral são: (1) tamanho suficiente para transportar o gene de interesse; (2) quando introduzido na célula-alvo, o nível e o tempo

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de expressão do transgene devem ser adequados para o efetivo tratamento da doença; (3) o vetor deve atingir com eficiência o tecido/células-alvo; (4) o vírus não deve estimular a resposta imunológica do paciente e (5) o vírus deve ser de fácil produção.

22.6.1 Retrovírus Vetores retrovirais derivados de MoMLV estão em segundo lugar (19,1%) na listagem geral dos vetores mais populares de terapia gênica, o que decorre do grande volume de conhecimento acumulado sobre a biologia e a história – os primeiros pacientes tratados com terapia gênica receberam vetores retrovirais. O retrovírus (também conhecido como gama retrovírus, onco retrovírus ou retrovírus do tipo C) tem um genoma simples e transduz apenas células mitóticas de diversos tipos e origens 25. A via clássica de transdução de retrovírus é a ex vivo. Produções de retrovírus têm um título entre 10 6 a 107 de partículas virais por mililitro, o que praticamente inviabiliza a sua aplicação direta no paciente. A transdução ex vivo cria um sistema no qual a maioria das células estão em divisão, o que aumenta a chance de integração e seleção das células transduzidas, enriquecendo o número de células tratadas transplantadas no paciente. O maior risco está no caso de integração em região promotora indesejável, que pode, por exemplo, causar a ativação de oncogene26. Os retrovírus são vetores envelopados com genoma formado por simples fita de RNA. Após a transdução da célula-alvo, a enzima transcriptase reversa, codificada pelo próprio vírus, converte o RNA viral em DNA que será integrado ao genoma hospedeiro. A capacidade de integração desses vetores é considerada sua principal vantagem, garantindo expressão estável e duradoura. Os genes necessários para a integração são flanqueados por LTR, a mesma sequência com papel promotor de expressão. Muitos vetores retrovirais recombinantes possuem promotores sintéticos adicionados em seus LTR virais25. Outro componente importante do genoma desses vetores é a sequência de empacotamento (Ψ), que determina a porção do RNA que será empacotada na forma de partícula viral (Figura 22.5). Para aumentar a segurança dos sistemas de produção de vetores retrovirais, as sequências de empacotamento da partícula viral ficam em outro vetor; dessa forma, o genoma viral está dividido entre dois vetores, e esses vetores encontram-se apenas nas células empacotadoras. A produção da partícula viral requer cotransfecção

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da célula empacotadora com pelo menos dois vetores (um vetor com o gene de interesse e outro contendo os genes de empacotamento e da transcriptase reversa). Como apenas o vetor portador do gene de interesse contém a sequência Ψ, apenas o RNA proveniente desse vetor é empacotado nas partículas virais, garantindo que não sejam produzidos vírus replicativos25.

Figura 22.5 Princípio da produção de partículas retrovirais pseudotipadas. Os genes relacionados com o empacotamento e o envelope viral são fornecidos em plasmídeos separados do plasmídeo contendo o vetor de transferência gênica (transgene). Para que ocorra a produção da partícula viral, é feita a cotransfecção de todos os plasmídeos dentro da célula produtora. Note que apenas o vetor de transferência contém a sequência psi (Ψ) necessária para o empacotamento do genoma viral na progênie. Assim, os genes estruturais não fazem parte do vírus produzido, impedindo que as partículas virais sejam capazes de se replicarem dentro da célula-alvo.

Recentemente, vetores lentivirais têm demonstrado boa eficácia na transdução de diferentes tipos de células primárias 27 e oferecem vantagens não encontradas no sistema retroviral tradicional. Os lentivírus derivam do vírus da imunodeficiência humana (HIV) 28. Diferentemente dos gama retrovírus, possuem um genoma mais complexo, são capazes de transduzir células mitóticas e pós-mitóticas e não têm preferência por integração em regiões próximas de promotor26,29. Os lentivírus self-inactivating (SIN) estão atualmente em uso. Esse vetor sofreu uma deleção em sua porção 3’ LTR que inativa o promotor viral, agora a expressão do transgene depende de um promotor interno. Esta modificação no LTR diminui os malefícios da presença do enhancer viral, elevando a segurança do uso desse vetor. A Figura 22.6 compara os cassetes de expressão básicos de vetor retrovírus versus vetor lentiviral27,29. Preparações de lentivírus podem ser concentradas, o que resulta

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em produção de lentivírus com título de 10 9 partículas virais por mililitro, superior ao das preparações de retrovírus, o que viabiliza alguns ensaios com transdução in situ. Uma das principais desvantagens dos lentivírus é sua produção em protocolo transiente, uma necessidade decorrente da toxicidade dos genes lentivirais: p24 e glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). Isto significa que a cada lote de produção de lentivírus, entre três e quatro plasmídeos de empacotamento (gag, pol, env e VSV-G) são utilizados na cotransfecção da linhagem produtora. Variabilidade na taxa de transfecção de cada plasmídeo resulta em significativas diferenças no título e qualidade de cada preparação viral30.

22.6.2 Adenovírus Adenovírus ocupam a primeira posição entre os vetores mais utilizados: 23,5% dos estudos clínicos aplicam adenovírus. Em 1993, foram conduzidos os primeiros protocolos clínicos com adenovírus, e entre as indicações estavam câncer de pulmão e a fibrose cística, uma doença monogênica. Adenovírus transduzem diversos tipos celulares e acomodam grandes insertos de DNA. Adenovírus são os vetores de escolha quando é preciso que o vetor alcance grande número de células, quando integração e expressão duradoura não são requisitos. Preparações de adenovírus atingem rotineiramente títulos superiores a 1012 a 1013 partículas virais por mililitro, viabilizando a via de transdução in situ. A grande desvantagem dos adenovírus está na resposta imunológica facilmente estimulada por esses vetores. Entretanto, adenovírus de última geração estão sendo testados e prometem revolver este problema31. Adenovírus são vírus não envelopados e com genoma na forma de DNA fita dupla. Quatro genes de replicação viral (E1, 2, 3 e 4), expressos nas fases iniciais do ciclo de vida viral, e mais cinco genes de expressão tardia (L1, 2, 3, 4 e 5), que codificam para proteínas estruturais, formam o genoma dos adenovírus31. Visando à aplicação segura dos vetores adenovirais, a grande maioria possui deleções nos genes de E1, E3 e E2 ou E4 o que os torna incapazes de replicar na célula hospedeira (Figura 22.6). Para a produção desses vetores é necessário que os genes E1 e E2 ou E4 estejam presentes na célula produtora, viabilizando a replicação de partículas adenovirais. Em outras palavras, a replicação de adenovírus recombinantes é restrita à célula produtora que fornece os genes E1a e E1b em trans32. A interação entre adenovírus e a célula alvo depende na presença do receptor coxsackievirus-adenovirus

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Figura 22.6 Comparação entre os genomas de um representante dos gama retrovírus (A) e de um representante dos lentivírus (B), mostrando a diferença entre as duas estruturas. Os genes gag, pol e env codificam os genes estruturais da partícula viral, e as sequências LTR atuam como promotores. (C) Representação esquemática do genoma adenoviral selvagem. E1 a E4: genes expressos na fase inicial do ciclo de vida viral; L1 a L5: genes expressos tardiamente; ITRs: repetições terminais invertidas; Ψ: sinal de empacotamento; MLP: promotor tardio.

(CAR) e moléculas de integrinas33. Após transdução da célula-alvo, os adenovírus permanecem na forma epissomal, ou seja, não integram.

22.6.3 Vírus adeno-associado (AAV) Vírus adeno-associado é um dos mais recentes protagonistas da transferência gênica. Trata-se de vírus com genoma compacto, não envelopado e não patogênico. O genoma do AAV é fita simples de DNA, contendo os genes cap e rep que codificam para as proteínas estruturais e regulatórias, respectivamente. Estes genes são flanqueados por sequências ITR (inverted terminal repeats) que funcionam como promotores34. São capazes de infectar diferentes tipos celulares e de integrar ao genoma hospedeiro de maneira pouco eficiente, mas, preferencialmente em regiões específicas do cromossomo 19 humano 35. O AAV selvagem não replica sem a presença de um vírus helper, como um adenovírus, que fornece fatores essenciais para sua multiplicação, esta característica justifica o nome "vírus adeno-associado". No vetor recombinante derivado do AAV, o genoma limita o tamanho do transgene a ser incluído, não podendo ultrapassar 4,7 kb36. Também, o genoma encapsulado no vírus recombinante não codifica os genes rep e cap.

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Como consequência, a falta de expressão de rep inviabiliza a integração viral. Dessa forma, AAV recombinantes são produzidos pela cotransfecção de linhagem empacotadora com vetor contendo o gene de interesse, outro vetor contendo os genes rep e cap, e ainda um vetor portador de certos genes adenovirais ajudam a habilitar a replicação do AAV37. Devido à dependência em processo de transfecção, a produção de AAV pode ser difícil de realizar em escala larga.

22.6.4 Direcionamento transducional – Modificação do vírus Vírus selvagens evoluíram com seus respectivos hospedeiros e desenvolveram mecanismos para infectar e replicar em determinados tipos celulares. Adenovírus têm tropismo (direcionamento) por células do epitélio respiratório e células hepáticas, enquanto o vírus Herpes simplex tem afinidade pelas células neuronais. Esse tropismo dos vírus depende de receptores celulares e de proteínas estruturais virais. Os vetores adenovirais dependem principalmente da proteína da fibra para se direcionarem aos seus respectivos receptores celulares. No caso dos adenovírus tipo 2 e 5 o principal receptor celular é CAR, já os adenovírus 3 e 35 utilizam CD46 como receptor. O tropismo dos vetores retrovirais é determinado em grande parte pelo envelope viral. Os retrovírus com envelope ecotrópico transduzem preferencialmente células de murinos, enquanto os retrovírus com envelope anfotrópico transduzem células da grande maioria dos mamíferos, incluindo células humanas. O direcionamento de HIV depende em parte do receptor celular CD4, presente em linfócitos T. Porém, o vetor lentiviral recombinante, derivado do HIV, perdeu esse tropismo25. Embora os vetores apresentem tropismo específico para determinado tipo celular, alterações das proteínas virais estruturais podem alterar o padrão de transdução, e os vírus ganham habilidade para transduzir uma nova gama de células. A modificação do tropismo dos vetores virais representa um passo importante para viabilizar sua aplicação clínica. Entre as alterações mais relevantes estão a pseudotipagem e alterações das proteínas virais (Figura 22.7).

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Figura 22.7 Alteração do direcionamento viral. (a) Pseudotipagem. Adenovírus baseado no genoma do sorotipo 5 com proteína da fibra de adenovírus do sorotipo 3; retrovírus expressando no envelope a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular. (b) Alteração das proteínas virais. A proteína da fibra adenoviral apresenta uma cauda, uma haste e uma região globular. A região globular é responsável por mediar a interação com os receptores celulares e pode ser substituída, por exemplo, pela sequência variável de uma cadeia simples de anticorpo contra o receptor celular de interesse, ou podem ser incorporados pequenos peptídeos, como o tripeptídeo arginina-glicina-ácido aspártico (RGD). (c) Uso de adaptadores. Podem ser usados anticorpos biespecíficos, que se ligam em uma extremidade a proteínas virais e na outra extremidade a receptores celulares. A partícula viral também pode ser envolvida por moléculas, como o polietileno-glicol (PEG).

22.6.4.1 Pseudotipagem Pseudotipagem é basicamente o empacotamento de um vírus com um envelope de outro. Os vírus envelopados, como os retrovírus e lentivírus, podem ser pseudotipados com a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). A incorporação dessa proteína no envelope viral favorece a transdução de diversos tipos celulares, além de conferir resistência à estrutura da partícula viral, facilitando o processo de purificação38,39.

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Os vírus não envelopados, como adenovírus, apresentam uma maior especificidade na montagem da partícula viral, e na pseudotipagem temos a incorporação de proteínas de sorotipos diferentes de um mesmo vírus. Para a formação de um novo capsídeo adenoviral, a proteína de fibra dos sorotipos 3 e 35 pode ser usada no lugar da proteína de fibra dos sorotipos 2 e 5, mudando o tropismo do vírus de células que expressam CAR para células CD46 positivas40,41. A pseudotipagem do AAV2 com proteínas da estrutura do capsídeo do AAV6 ou 8 têm sido empregada para aumentar a eficiência da transferência gênica no tecido muscular esquelético e hepatócitos42,43, abrindo uma perspectiva promissora para a administração sistêmica de AAV.

22.6.4.2 Alteração das proteínas virais Uma opção para direcionar o tropismo dos vetores virais envolve a modificação genética de proteínas virais que interagem com os receptores nas células alvos. Por exemplo, sequências codificadoras de anticorpos de cadeia simples específicos para receptores de fatores de crescimento ou de citocinas podem ser incorporadas aos vetores, favorecendo a interação do vírus com uma célula específica44, 45. Com adenovírus, resultados promissores foram obtidos com a incorporação de pequenos polipeptídeos na proteína da fibra. Por exemplo, o tripeptídeo arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), é suficiente para direcionar entrada do vírus na célula mediada por integrinas. Portanto, este adenovírus modificado não depende na presença do CAR para seu tropismo e pode transduzir uma ampla gama de tecidos. Em outra estratégia, as proteínas do hexon do adenovírus também podem ser modificadas para impedir sua ligação com fatores que sequestram a partícula viral, como anticorpos anti-adenovirais, assim protegendo o vetor e evitando sua destruição46, 47.

22.7 POSSIBILIDADES TERAPÊUTICAS E/OU INDUSTRIAIS Embora a maior parte das terapias gênicas ainda esteja buscando aprovação e licença para aplicação clínica, existem muitos ensaios em andamento prometendo que, nos próximos anos, novos produtos possam ser aprovados e utilizados clinicamente. A Tabela 22.4 mostra alguns dos estudos clínicos

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em diferentes fases, envolvendo diversos vetores de transferência, e a abordagem utilizada para algumas indicações. A aprovação comercial na União Europeia de Glybera (produzido pela empresa uniQure BV), em 2012, abriu o mercado e a clínica ocidental para o uso da terapia gênica50-52. Tabela 22.4 Correlação entre indicações, abordagem terapêutica, vetores e fase de estudo clínico. INDICAÇÕES

ABORDAGEM

VETOR UTILIZADO

FASE DE ESTUDO

Expressão da citosina deaminase

Oncoretrovírus

Fase 1/2

Expressão da timidina quinase de Herpes Simplex

Adenovírus

Fase1

Imunodeficiências primárias

Reposição do gene Adenosina deaminase (ADA) funcional

Oncoretrovírus

Fase 1/2

β-talassemia e anemia falciforme

Reposição do gene globina em células-tronco hematopoiéticas

Lentivírus

Fase 1/2

Leucemia de células B e linfomas

Células T tratadas ex-vivo com estratégia de Receptores de células T quiméricos

Lentivírus

Fase 1

Glioma

Câncer de cabeça e pescoço

Expressão do gene p53

Adenovírus não replicativo

Fase 4

Mesotelioma pleural, câncer de cólon, glioma

Expressão de Interferon-beta

Adenovírus

Fase 1/2

Deficiência de LPL

Reposição do gene lipoproteína lipase (LPL)

Vírus Adeno-associado

Fase 3

Expressão de fator neurotrófico, neuturin

Vírus Adeno-associado

Fase 1/2

Expressão de três genes necessários para a biossíntese de dopamina, injetado no cérebro

Lentivírus

Fase 1/2

Amaurose congênita de Leber

Expressão da proteína de pigmento de retina específica de epitélio de 65 kd (RPE65)

Vírus Adeno-associado

Fase 1/2

Melanoma

Genes HLA-B7 e beta-2 microglobulina injetados nos tumores

Plasmídeo

Fase 3

Parkinson

22.7.1 Exemplos de protocolos clínicos envolvendo modificação genética de células-tronco hematopoiéticas Células-tronco hematopoiéticas (CTH) derivam de populações celulares que expressam o antígeno de superfície CD34 e são encontradas na medula óssea, no sangue periférico e no sangue do cordão umbilical. CTH são células progenitoras capazes de se diferenciar em diversas linhagens hematopoiéticas. A modificação genética de CTH é uma estratégia eficiente para o tratamento de doenças do tecido hematopoiético. A população de células CD34+ é purificada a partir das células coletadas da medula ou

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do sangue periférico do paciente, expandidas e transduzidas ex vivo com o vetor viral carregando o gene terapêutico e devolvidas para o paciente. Devido ao potencial proliferativo das CTH e à necessidade de conservação do gene terapêutico na progênie celular, os vetores capazes de integrar ao genoma, como os vetores retrovirais ou lentivirais, são os mais indicados para modificar células CTH. Diversas doenças monogênicas têm chances de serem curadas com essa estratégia, entre as principais estão as imunodeficiências primárias e as talassemias.

22.7.1.1 Terapia gênica para imunodeficiências primárias As imunodeficiências primárias são doenças herdadas raras que acometem linhagens de células brancas do sangue. O transplante de CTH tem sido utilizado para tratamento destas doenças, entretanto existem obstáculos como a compatibilidade entre doador e receptor53,54. Nesse cenário, a utilização de CTH geneticamente modificadas é uma estratégia atrativa, pois tem o potencial de superar os problemas e limitações dos métodos tradicionais de tratamento. Entre as imunodeficiências primárias, a forma mais severa é conhecida pela sigla SCID (severe combined immunodeficiency), cujos pacientes apresentam uma deficiência no desenvolvimento de linfócitos T e no funcionamento dos linfócitos B, resultando em quadro clínico com infecções recorrentes. Diversos protocolos clínicos de terapia gênica foram desenvolvidos buscando-se o tratamento dessa doença. Os primeiros protocolos utilizaram vetores gama retrovírus para a transferência do gene ADA funcional, tendo sido utilizados para a modificação de linfócitos T10 ou, em estudos recentes, células CD34+ onde foi constatada a correção a longo prazo55-60, sendo que nos trabalhos mais recentes houve a correção em longo prazo da doença 58-60. No total, mais de quarenta pacientes foram tratados de maneira bem-sucedida com terapia gênica, sem a ocorrência de efeitos colaterais61. Outro tipo de SCID é a ligada ao X (X-linked severe combined immunodeficiency – X-SCID), que representa aproximadamente 50% dos casos de SCID53. Essa doença é causada por mutações no gene codificador para a cadeia gama do receptor de interleucina-2 (interleukin 2 receptor, gamma – IL2RG), também conhecida como cadeia γc, responsável pela diferenciação dos linfócitos T e células natural killer (NK), além de linfócitos B54. Os protocolos para X-SCID tiveram início em 2000 e usavam um vetor baseado em gama retrovírus para fazer a transferência do gene terapêutico

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IL2RG para células CD34+ obtidas dos pacientes. Dezoito crianças (de um total de vinte) tratadas recuperaram o número e a função dos linfócitos T. Entretanto, cinco crianças desenvolveram leucemia linfoide aguda (quatro crianças foram curadas com quimioterapia, mas uma delas veio a falecer). O desenvolvimento da leucemia foi atribuído à mutagênese insercional em decorrência da ativação do proto-oncogene LIM domain only 2 (LMO2) pelo LTR viral54. A doença granulomatosa crônica ligada ao X (X-CGD, X-linked chronic granulomatous disorder, também conhecida como síndrome de BridgesGood e síndrome Quie), é causada por um defeito no complexo de nicotinamida adenina dinucleotideofosfatase (NADPH), resultando em atividade deficiente dos neutrófilos62. Células CD34+ dos pacientes receberam vetor retroviral que carregava o gene terapêutico gp91phox. Apesar do sucesso inicial da terapia, o transgene foi silenciado, e os pacientes manifestaram quadro clínico compatível com mielodisplasia, devido à superexpressão do gene EVI1 ativada pelo vetor63. Recentemente, um protocolo clínico de terapia gênica para o tratamento da síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) usando CTH geneticamente modificadas com vetor retroviral foi realizado 64. Essa síndrome é um tipo raro de SCID, causada por mutação no gene WAS, que codifica uma proteína reguladora do citoesqueleto. Nove entre dez pacientes responderam ao tratamento com altos níveis de expressão da proteína WAS, indicando que a terapia funcionou. Infelizmente, quatro pacientes desenvolveram leucemia de células T, provavelmente relacionada à mutagênese insercional com ativação do oncogene LMO2, semelhante aos casos de X-SCID54. O protocolo clínico para tratamento gênico de WAS foi refeito, mas dessa vez utilizando vetor lentiviral na transferência do gene WAS para as células CD34+. O tratamento experimental de três crianças com o vetor lentiviral teve sucesso com melhoras no quadro clínico e nenhum efeito adverso (expansão clonal) relacionado com inserção do gene terapêutico65. Os protocolos clínicos aqui apresentados sugerem que o uso de vetores lentivirais pode trazer benefícios com menor risco. Entretanto, o número de intervenções com vetor lentiviral ainda é pequeno comparado com o grupo de pacientes tratados com retrovírus. Contudo, cada protocolo clínico de terapia gênica conduz a uma nova e importante descoberta na direção de tratamentos bem-sucedidos e sem efeitos colaterais.

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22.7.1.2 Terapia gênica para hemoglobinopatias As CTH modificadas também são utilizadas para o tratamento de hemoglobinopatias. A β-talassemia é uma das doenças monogênicas mais comuns, causada pela falta das cadeias β da hemoglobina, levando a um quadro de anemia severa. O tratamento convencional baseia-se em transfusões sanguíneas rotineiras66. Três pacientes foram tratados usando SIN lentivirais, e um desses pacientes teve uma boa resposta clínica67.

22.7.1.3 Terapia gênica para leucodistrofias Leucodistrofias são um grupo de doenças genéticas caracterizadas pela destruição da bainha de mielina, causando danos ao sistema nervoso. São conhecidos mais de trinta tipos da doença, sendo que grande parte não tem tratamento. O transplante de medula óssea pode ser realizado em alguns tipos da doença. O transplante de CTH geneticamente modificadas muitas vezes é a única possibilidade terapêutica. Com esta estratégia terapêutica espera-se que as células modificadas originem células da microglia e recuperem a bainha de mielina dos neurônios, corrigindo a doença68. Adrenoleucodistrofia ligada ao X (X-linked adrenoleukodystrophy – X-ALD) é um tipo de leucodistrofia causada por deficiência no gene ALD, que está envolvido com o transporte de adenosina trifosfato, causando a desmielinização. Recentemente, dois pacientes foram tratados em um protocolo de terapia gênica utilizando vetores lentivirais na transdução ex vivo de células CD34+. Após transplante, os pacientes foram acompanhados por mais de dois anos. Apesar da eficiência baixa de transdução, 10% das CTH, foi observada a estabilização ou regressão do processo de desmielinização, sem expansão clonal. O transplante de CTH modificadas é a única terapia para X-ALD, com resultados positivos até o momento69. A leucodistrofia metacromática (metachromatic leukodystrophy – MLD) é causada pela deficiência da enzima arilsulfatase A (arylsulfatase A – ARSA), levando à não degradação de lipídios. Pacientes com essa doença apresentam acúmulo de sulfatídios, o que ocasiona a destruição do sistema nervoso e a morte. Recentemente, foi descrito um protocolo de terapia gênica, envolvendo CTH geneticamente modificadas por vetor lentiviral expressando o gene ARSA. Nove pacientes foram tratados e, após 18 a 24 meses de acompanhamento, os três primeiros pacientes tratados exibiram reversão do quadro clínico70.

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22.7.2 Protocolos clínicos de terapia gênica do câncer O câncer é um dos líderes entre as principais causas de morte no mundo. A Organização Mundial de Saúde (OMS) projeta aumento da mortalidade relacionada ao câncer, que, em 2030, deve passar dos atuais 8 milhões para 13 milhões de óbitos por ano. Essa tendência indica que as estratégias disponíveis de prevenção e tratamento do câncer não estão sendo efetivas71. O primeiro protocolo clínico de terapia gênica do câncer foi submetido em 1993. Ao redor de 64% de todos os ensaios clínicos de terapia gênica têm como meta o tratamento do câncer, indicando que a terapia gênica do câncer não só é promissora, como é também uma alternativa cada vez mais próxima da clínica oncológica72. A terapia gênica lança mão tanto de vetores virais que integram (~ 40%) quanto de vetores virais que não integram (~ 55%). De forma simplificada, existem duas estratégias básicas: (1) tratar as células tumorais do paciente com genes capazes de induzir morte celular ou sensibilizar o tecido tumoral para os efeitos tóxicos da quimioterapia ou radioterapia; ou (2) direcionar o tratamento para as células não tumorais do paciente, com o objetivo de estimular a resposta imunológica do paciente contra células tumorais, ou, alternativamente, conferir aos tecidos mais sensíveis, como células hematopoiéticas, resistência aos efeitos da quimioterapia. Na primeira estratégia, a dose de vetor viral e volume de tecido tratado são fundamentais para o sucesso do tratamento, a transdução é in situ e células tumorais no organismo do paciente recebem o vetor. Na segunda, a integração do vetor é importante para a expressão estável e prolongada, o alvo da modificação gênica são as células normais do paciente e a transdução viral é ex vivo. Antes de apresentar alguns modelos e protocolos clínicos de terapia gênica do câncer, algumas características da doença maligna que interferem na estratégia terapêutica merecem ser comentadas. Diferentemente de doença monogênica, o gene terapêutico de escolha para o tratamento do câncer não precisa ser o gene defeituoso. Na etiologia da célula tumoral estão múltiplas mutações, e cada tumor apresenta um perfil mutacional diferente. Tumores de mesma classificação histológica podem ter um conjunto diferente de mutações. Está claro que o gene-alvo para tratamento do câncer não é tão óbvio como para doenças monogênicas. Vetores virais portadores de genes supressores de tumor são os que mais se aproximam do princípio de reposição do gene defeituoso. No tratamento de algumas doenças monogênicas, como hemofilia, imunodeficiências, entre outras, a remediação de uma pequena parcela de

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células-alvo, muitas vezes de 1%, pode levar a resultados satisfatórios, por exemplo reduzindo hemorragias ou recompondo a resposta imunológica, respectivamente. O mesmo não acontece com o tecido tumoral, em cujo caso o sucesso do vetor anticâncer depende da transdução do maior número possível de células tumorais, ou seja, a transferência de um gene citotóxico para 1% das células da massa tumoral não é suficiente e não resulta em resposta terapêutica efetiva. Nesse cenário, modificações ex vivo de células da linhagem hematopoiéticas do paciente com vetores retrovirais ou lentivirais portadores de genes para interleucinas ou antígenos tumorais têm sido utilizadas. Essa estratégia modifica células normais e conta com a participação do sistema imune do paciente para destruir células do câncer espalhadas por todo o organismo.

22.7.2.1 Adenovírus p53 O p53, gene supressor de tumor, é frequentemente mutado em diversos tumores, independentemente do tipo histológico. O gene p53 participa tanto da origem quanto da manutenção do desenvolvimento tumoral. A proteína p53 é chamada de “guardiã do genoma”, porque é capaz de induzir a morte (apoptose) de células com danos no DNA e bloquear o ciclo celular73. Essas características fazem do gene p53 um excelente candidato a gene anticâncer, e este é um dos genes mais populares dos protocolos de terapia gênica do câncer. Em princípio, a expressão de p53 nas células tumorais leva à inibição da proliferação e induz a morte das células tumorais. Um dos primeiros vetores de terapia gênica usados na clínica para o tratamento do câncer foi um vetor expressando o gene p53. O vetor adenoviral codificando o produto do gene p53 selvagem, sob controle de promotor de CMV, denominado NGN 201-Advexin (Introgen Therapeutics Inc.), é um protótipo e foi usado em inúmeros protocolos clínicos de terapia gênica para o tratamento de diversos tipos de tumores. Em 2003, a companhia Shezhen SiBiono GenTech obteve licença para tratar câncer de cabeça e pescoço com adenovírus p53 (Gendicine). Apesar de o licenciamento de Gendicine estar restrito à China e não livre de críticas, Gendicine foi o primeiro medicamento de terapia gênica a obter licenciamento74. O aprimoramento de vetores portadores do potente gene supressor de tumor p53 tem recebido atenção. Uma das estratégias mais promissoras é a manipulação de sequências regulatórias da expressão de p53. Nosso grupo desenvolveu vetores virais nos quais a expressão do transgene está

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sob controle de p53. Quando um destes vetores é empregado, altos níveis de expressão são atingidos, o que confere uma vantagem para a inibição da proliferação de células tumorais e tratamento de muitos tipos de câncer75-77.

22.7.2.2 Timidina quinase (thymidine kinase – TK) Diversas estratégias que envolvem a transferência de genes suicidas (tóxicos) têm sido desenvolvidas. A transferência de gene com ação tóxica é aplicada quando a meta é destruir células indesejadas, como é o caso de células tumorais. O mais conhecido protocolo clínico com gene suicida aplica o gene HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase). O produto do gene TK, a enzima timidina quinase (Tk), fosforila a pró-droga ganciclovir, resultando em uma substância tóxica, o ganciclovir trifosfato, que interfere na síntese de DNA, resultando na morte das células que expressam Tk. Uma das características do gene suicida HSV-TK é o efeito bystander. A citotoxina (ganciclovir trifosfato) é uma molécula pequena e passa de uma célula para a vizinha via junções do tipo gap ou por fagocitose de vesículas geradas pelas células que estão morrendo. O efeito bystander promove a amplificação da resposta tecidual, de modo que mesmo células não transduzidas diretamente com o vírus portador do gene HSV-TK, mas que recebem da célula vizinha o produto tóxico, também acabam morrendo78, 79. Diferentes vetores já foram usados para expressar o gene HSV-TK, tanto vetores virais, quanto não virais. Em 2004, um vetor adenoviral expressando o gene HSV-TK (Cerepro), produzido pela empresa ArkTherapeutics recebeu licença para produção comercial na União Europeia, com indicação voltada para tratamento de tumores cerebrais80. Em 2010, o processo de comercialização foi cancelado, pois o vírus mostrou toxicidade e ausência de efeito terapêutico. Hoje, diversos protocolos que combinam adenovírus expressando HSV-TK com quimioterápicos têm resultados promissores81.

22.7.2.3 Vetores virais oncolíticos Os vírus oncolíticos são partículas virais que seletivamente replicam dentro de tumores, resultando na lise das células tumorais e na liberação de novas partículas virais que infectam e matam as células tumorais vizinhas82. Existem dois parâmetros-chave que precisam ser endereçados para poder maximizar a ação anticâncer de vírus oncolíticos: eficiência oncolítica e especificidade tumoral.

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Adenovírus oncolíticos têm sidos extensamente aplicados em ensaios clínicos de terapia gênica do câncer. O mais testado é o adenovírus oncolítico ONYX-015 (Pfizer Corp.), que não expressa a proteína viral E1B (55 KDa). ONYX-015 foi o primeiro adenovírus oncolítico usado em ensaios clínicos. Originalmente, acreditava-se que a replicação de ONYX-015 estava condicionada a falta de p53 funcional83, porque ONYX-015 não replica e não tem efeito em células normais portadores de p53 selvagem. Em 2004, foi demostrado que o real mecanismo de especificidade envolve a exportação de RNA viral apoiado na célula transformada 84. ONYX-015 já foi testado em protocolos clínicos de tratamento de câncer de cabeça e pescoço, gliomas, carcinomas de fígado, ovário, próstata, colorretal, pulmão e pâncreas 85. Uma versão modificada de ONYX-015, Oncorine, foi desenvolvida e licenciada para comercialização pela empresa chinesa Shanghai Sunway Biotech52. Apesar da interpretação confusa do mecanismo funcional de ONYX-015, o mecanismo estratégico de condicionar a replicação viral à presença de uma alteração específica de células tumorais tem sido intensamente explorado. Uma nova promessa entre os vetores oncolíticos é o adenovírus oncolítico Δ24, que apresenta deleção de 24 pares de bases no gene da proteína E1A, assim perdendo a capacidade de inativar a proteína de suscetibilidade ao retinoblastoma (Rb). A falta de interação entre a proteína E1AΔ24 com Rb faz com que o adenovírus oncolítico Δ24 replique apenas nas células que estão em divisão86.

22.7.2.4 Vetores expressando fator estimulador das colônias de granulócitos e macrófagos (granulocytemacrophage colony-stimulating factor – GM-CSF) GM-CSF é uma citocina, um fator de proliferação de células brancas do sangue, que estimula a produção de granulócitos e monócitos. GM-CSF é uma proteína secretada por células de defesa do organismo, macrófagos, células T, células NK, células endoteliais e fibroblastos. Como parte da resposta imune e inflamatória, os monócitos migram para o tecido-alvo, e, agora com a identidade de macrófagos, iniciam o processo de defesa tecidual. GM-CSF tem participação ativa na resposta antitumoral. A função estimuladora do sistema imunológico e a ativação de defesa, apontam para GM-CSF como bom candidato para aplicação em protocolos clínicos de terapia gênica do câncer. Diversos vetores virais carregando o gene GM-CSF

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têm sido clinicamente testados em protocolos destinados ao tratamento de vários tipos de câncer, incluindo o melanoma50. O vetor adenoviral oncolítico carregando o gene GM-CSF (CG0070), produzido pela empresa Cold Genesys, Inc. foi testado em fase I para câncer de bexiga e mostrou-se seguro 87. A FDA já aprovou seu teste para ensaios clínicos de fase II/III.

22.7.3 Iniciativas nacionais Desenvolvimento de vetores virais, elaboração de novas abordagens de terapia gênica e ensaios clínicos estão sendo realizados no Brasil. O Instituto do Milênio Rede de Terapia Gênica foi criado em 2005 e atuou na construção e produção de novos vetores virais e intensa pesquisa de aplicação de transferência gênica em modelos de tratamento de diversas patologias, incluindo neurodegeneração de retina, fibrose cística, câncer, isquemia, modificação genética de células-tronco hematopoiéticas e vacinas. Estudo que investigou a aplicação de terapia gênica para tratamento de isquemia mediada por ativação de angiogênese atingiu a fase I de protocolo clínico88. Em outras iniciativas envolvendo pesquisadores brasileiros, uma vacina anticâncer 89,90 e uma vacina contra HIV 91 foram testadas. Estes esforços, e muitos outros, têm chamado a atenção de pesquisadores internacionais e da American Society of Gene and Cell Therapy (ASGCT). Atualmente, a ASGCT está procurando meios para integrar os pesquisadores do Brasil e da América Latina a pesquisadores com interesse comum de outros continentes92. O campo da terapia gênica está ativo e em franco crescimento em nossa comunidade.

22.7.4 Considerações sobre a translação da pesquisa básica em terapia gênica: o caminho entre a bancada do laboratório e o leito do paciente Protocolos clínicos de terapia gênica ainda estão em fase experimental. Existem alguns critérios para a seleção de doenças candidatas para tratamento gênico, incluindo: (1) doença incurável ou doença que requer tratamento durante toda a vida do paciente; (2) a expressão do gene terapêutico deve fazer a diferença; (3) órgão, tecido ou célula afetados conhecidos; (4) o gene terapêutico deve ter sido isolado e os mecanismos moleculares de

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ação do produto candidato a terapêutico devem ter sido descritos e analisados; (5) o gene terapêutico deve ser introduzido em substancial fração de células do tecido-alvo, de modo que o procedimento altere a progressão da doença; (6) órgão, tecido ou célula-alvo de tratamento clinicamente acessível; (7) disponibilidade técnica para avaliar e acompanhar a segurança do procedimento. De acordo com dados obtidos na base de dados Gene Therapy Clinical Trials Worldwide, disponibilizada pelo Journal of Gene Medicine em julho de 201372, as quatro mais frequentes indicações dos protocolos clínicos de terapia gênica em ordem decrescente são: câncer, doença monogênica, doença infecciosa e doença cardiovascular. A terapia gênica tem como meta curar uma doença por meio de modificação da informação genética das células do paciente. A função do vetor de transferência gênica é promover a expressão de proteína funcional com potencial terapêutico. Vírus são eficientes vetores biológicos, e não restam dúvidas de que os sistemas virais são os melhores veículos de transferência gênica. A escolha do vetor viral está diretamente relacionada à doença alvo do tratamento, quais células do corpo que os vírus precisam atingir e via de administração. A relação entre vetor viral e indicação clínica é apresentada na Figura 22.8, na qual se observa a distribuição do quarteto de vetores virais mais usados entre as indicações mais frequentes dos protocolos clínicos de terapia gênica. Adenovírus são os vetores preferidos dos ensaios voltados para o tratamento do câncer (~ 60% dos protocolos) e doenças cardiovasculares (~ 90% dos protocolos), enquanto os retrovírus são os

Figura 22.8 Distribuição do quarteto de vetores virais mais usados (retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associado e lentivírus) entre as indicações mais frequentes dos protocolos clínicos de terapia gênica: câncer e doença monogênica, infecciosa ou cardiovascular72.

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mais utilizados nos tratamentos de doenças monogênicas e infecciosas, respectivamente ~ 40% e ~ 60% dos ensaios clínicos. Um critério fundamental na escolha de vetor viral é a necessidade ou não de integração do transgene no genoma da célula alvo. A integração é essencial para uma estável modificação genética das células tratadas e a expressão duradoura do gene terapêutico. A integração e expressão do transgene codificado por vetor recombinante nas células primárias de um paciente ainda é um evento raro e não livre de riscos. Doenças monogênicas, como fibrose cística, requerem expressão sustentável do transgene. Isso significa que as células do epitélio respiratório tratadas ou “remediadas” devem reter, e expressar o gene terapêutico (idealmente de modo regulado) por toda a vida do paciente. Quando integrado, a cada divisão celular o gene terapêutico é transmitido para as células-filhas, resultando em tratamento definitivo da anomalia. Vetores retrovirais, lentivirais e vírus adeno-associados são boas escolhas quando a integração do gene terapêutico é recomendada. A Figura 22.9 destaca a marcante participação de vetores virais com habilidade para integrar o transgene nos protocolos clínicos direcionados ao tratamento de doenças monogênicas e infecciosas, enquanto vetores mantidos em forma epissomal como os adenovírus, lideram os ensaios clínicos de tratamento de câncer e doenças cardiovasculares. Após a integração, outro critério importante na escolha do vetor é a habilidade do vírus para transduzir células mitóticas e/ou pós-mitóticas. Esse parâmetro, em conjunto com o título das preparações virais, tem especial impacto sobre as vias de administração (ex vivo ou in situ). A Figura 22.10 mostra a relação entre vetor viral e indicação clínica ao longo dos 23 anos de protocolos experimentais de terapia gênica. Os estudos clínicos com as duas indicações mais frequentes, câncer e doença monogênica, estão relacionados com os dois vetores virais de maior popularidade, adenovírus e retrovírus. Atualmente, os adenovírus dominam os protocolos de terapia gênica do câncer. Mesmo com grandes obstáculos, 863 protocolos de terapia gênica do câncer estão abertos contra 104 protocolos voltados para o tratamento de doença monogênica, segundo a base de dados Gene Therapy Clinical Trials Worldwide, do Journal of Gene Medicine(em julho de 2013)72. Um dos aspectos marcantes da terapia gênica mediada por vetores virais tem sido a grande versatilidade de aplicações clínicas. Nos cinco primeiros anos de terapia gênica (entre 1989 e 1993), 62 protocolos clínicos de terapia gênica foram aprovados pela FDA com as mais variadas indicações, desde tratamento de doenças monogênicas até o câncer. Entre estes pioneiros

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Figura 22.9 Relação entre capacidade de integração do vetor viral e indicação clínica do protocolo de terapia gênica. Destaque para a participação de vetores virais com habilidade para integrar o transgene nos protocolos clínicos direcionados ao tratamento de doenças monogênicas e infecciosas, enquanto vetores mantidos em forma epissomal, como os adenovírus, lideram os ensaios clínicos de tratamento de câncer e doenças cardiovasculares72.

Figura 22.10 Relação entre vetor viral e indicação clínica ao longo dos 23 anos de protocolos clínicos de terapia gênica. Número de estudos clínicos com as duas indicações clínicas mais frequentes: câncer e doença monogênica versus os dois vetores virais de maior popularidade: adenovírus e retrovírus. Vetores retrovirais ainda são os mais populares no contexto geral dos protocolos de terapia gênica, e estão presentes tanto em ensaios clínicos voltados para tratamento de doença monogênica quanto do câncer72.

protocolos, 49 e 3 aplicaram vetor retroviral ou adenoviral, respectivamente. Em período recente, entre 2008 e 2012, temos listados 480 estudos clínicos aprovados/iniciados/concluídos, sendo que 83, 65, 48 e 31 protocolos clínicos utilizam respectivamente adenovírus, retrovírus, lentivírus ou vírus adeno-associado. A Figura 22.11 compara as indicações mais frequentes dos estudos de terapia gênica, aplicação do quarteto popular de vetores virais nos cinco primeiros anos de terapia gênica experimental com a situação nos últimos cinco anos. A Figura 22.12 mostra a distribuição geral ao longo

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dos 23 anos de protocolos clínicos de terapia gênica, revelando a entrada de vetores adenovirais no início da década de 1990 e vetores de vírus adeno -associados no final da década, seguida da introdução de vetores lentivirais após o ano 2000. A ponte entre o laboratório de pesquisa e a clínica médica é bem conhecida quando tratamos do desenvolvimento de um medicamento cujo princípio ativo é uma pequena molécula sintética, mas o mesmo não ocorre quando se trata de um medicamento biológico, como vetores virais. A completa caracterização de um produto biológico não é fácil e, rotineiramente factível, razão pela qual os testes de potencial biológico recebem maior ênfase nas análises de controle de qualidade de produtos biológicos. Mover um candidato a medicamento biológico produzido por células em um laboratório de pesquisa até produção e aplicação clínica é conhecido como pesquisa translacional. DiGiusto e Kiem 93 usam a expressão “vale da morte” para descrever este caminho, ao longo do qual muitos candidatos com potencial terapêutico são abandonados e nunca atingem a clínica médica. A pesquisa de desenvolvimento translacional tem sido dividida em três fases, conhecidas como T1, T2 e T3. T1 representa a etapa de prova de princípio da pesquisa básica; T2 é a execução de protocolos clínicos experimentais, que por sua vez é subdividida em fases de I até IV; e T3 que envolve a ampla produção e distribuição à população. Frequentemente, pensamos apenas no estágio T1 desse processo, mas todos os estágios são necessários para justificar os investimentos em pesquisa translacional. No estágio T1 encontra-se o desenvolvimento de vetores seguros, eficientes e direcionados para alvos específicos, quando possível. Nesta etapa também acontecem os estudos pré-clínicos, conduzidos em modelos animais relevantes. A flexibilidade das ferramentas de transferência gênica permite o desenvolvimento rápido de muitas e variadas estratégias intervencionais e produtos biotecnológicos. Do ponto de vista translacional, podemos dividir o vetor viral em dois segmentos: (1) vetor de transferência gênica, propriamente dito, o medicamento biológico e (2) componentes do sistema biológico de produção: vetores de empacotamento e linhagem empacotadora. Assim como ocorre com a descoberta de novo fármaco sintético, nos anos iniciais de investigação, o potencial terapêutico e a aplicação de vetores virais, seus progressos andam na direção de definição, toxicidade e limitação de uso do vetor como medicamento. Essa etapa é acompanhada por significante inovação e desenvolvimento de infraestrutura de suporte capaz de sustentar as etapas mais avançadas: T2 e T3. A Figura 22.13 exibe o caminho entre o laboratório de pesquisa até aplicação clínica de um vetor

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Figura 22.11 Comparação entre as indicações mais frequentes dos estudos de terapia gênica e uso de pelo menos um do quarteto popular de vetores virais nos cinco primeiros anos de terapia gênica experimental, com a situação nos últimos cinco anos. No contexto geral de todos os protocolos de terapia gênica, os dados mostram que na última década praticamente não existe predominância de um tipo de vetor72.

Figura 22.12 Distribuição geral do número de protocolos clínicos de terapia gênica ao longo dos 23 anos, revelando a entrada de vetores adenovirais no início da década de 1990, dos vetores de vírus adeno-associados no final da década 1990 e de vetores lentivirais após ano 200072.

viral terapêutico. Em julho de 2013, um total de 1.297 protocolos clínicos experimentais estavam abertos de acordo com dados fornecidos pelo Gene Therapy Clinical Trials Worldwide do Journal of Gene Medicine, sendo que retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associado e lentivírus estavam sendo utilizados em 626 (48%) dos protocolos clínicos experimentais abertos, contra 371 com transferência gênica não viral.

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Figura 22.13 Caminho entre o laboratório de pesquisa até aplicação clínica percorrido por um vetor viral candidato à aplicação clínica de terapia gênica.

Não resta dúvida de que, entre as lições e conhecimentos gerados nos estudos de transferência gênica, o mais proeminente e desafiador tem sido a aplicação terapêutica. A grande maioria dos estudos clínicos, de fato, ainda não ultrapassa a fase I de prova de segurança. Os protocolos de fase I são conduzidos com número reduzido de pacientes, curto período de duração e em geral executados em um único centro de pesquisa. Protocolos clínicos de terapia gênica de fase I representam 59% do total de estudos, e apenas 0,1% atingiram a fase IV (última fase da etapa T2). Na verdade, este cenário não é muito diferente do observado no processo translacional de fármacos clássicos. As preparações de vírus como produtos biológicos também encontram a definição de droga e estão sujeitas a leis federais. A definição estatutária de vírus como vetores de terapia gênica é a de produto biológico, portanto sujeita à regulamentação de agências governamentais, como a Food and Drug Administration (FDA), nos Estados Unidos, e a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) no Brasil. Para que os avanços das pesquisas com vetores terapêuticos cheguem até a prática médica, alguns obstáculos devem ser ultrapassados, desde a criação de tecnologias de produção viral em alta escala em sistemas fechados, desenvolvimento de processos robustos de purificação, consistentes ensaios de controle de qualidade biológica, até a capacidade das agências reguladoras de lidar com as novas, crescentes e versáteis coleções de criativos vetores de transferência gênica.

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22.8 A TÉCNICA PASSO A PASSO 22.8.1 Protocolo de transferência e expressão gênica usando vetores lentivirais recombinantes 22.8.1.1 Considerações gerais Lentivírus é um dos mais populares e versáteis veículos de transferência gênica. Vetores lentivirais são amplamente utilizados em estudos cuja pergunta central é função gênica. Tanto ensaios de superexpressão quanto ensaios de silenciamento gênico (via shRNA) podem contar com a eficiência dos lentivírus. Como um típico retrovírus, os lentivírus integram a sequência transgênica no genoma-alvo, viabilizando estável e sustentada expressão. O sistema lentiviral tem como vantagens a eficiente transdução de células primárias, a transdução eficiente de células mitóticas e pós-mitóticas e a possibilidade de produção lentiviral concentrada, o que resulta em um título viral superior aos dos retrovírus clássicos. Hoje, existem vários sistemas lentivirais comerciais, e a escolha do melhor sistema é de extrema importância e depende das características do experimento. Na escolha do melhor sistema comercial, os seguintes pontos podem ser levantados: 1) Avaliar a necessidade de um gene marcador, como eGFP, dsRED, luciferase etc., e a necessidade de um gene de resistência a antibióticos. 2) Avaliar o promotor mais adequado ao estudo. 3) Fazer a escolha do melhor shRNA para o gene-alvo. Tipicamente, vários shRNA devem ser gerados e testados. 4) A expressão de mais de um transgene pelo mesmo vetor também é uma possibilidade que pode ser considerada 5) Quando o trabalho envolve genes tóxicos e genes que precisam ser expressos conforme determinanação, verificar a necessidade de se utilizar um sistema induzível, no qual a expressão gênica pode ser controlada temporalmente.

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22.8.1.2 Biossegurança Toda a manipulação (desde a produção até os ensaios funcionais), transporte e descarte de vetores lentivirais deve obedecer às normas de biossegurança da CTNBio * referentes ao trabalho com organismos geneticamente modificados de nível 2 de biossegurança. É importante: 1) Antes de iniciar os trabalhos, a área e o projeto devem ter permissão da CTNBio. As solicitações são encaminhadas via Comissão Interna de Biossegurança da Instituição (CIBio). 2) A compra e o transporte de lentivírus devem obedecer às normas da CTNBio. 3) Qualquer célula transduzida (in vitro ou in vivo) com vetor lentiviral passa a ter nível 2 de biossegurança. 4) Cuidado redobrado deve ser tomado quando o trabalho envolver o uso de vetores lentivirais portando shRNA que regulam genes envolvidos no controle do ciclo celular, bem como vetores portando oncogenes, devido aos seus possíveis efeitos nocivos, como indução de carcinogênese94.

22.8.1.3 Obtenção de partículas virais Tiscornia e colaboradores95 descreveram protocolo detalhado para a produção de lentivírus. Este clássico protocolo é popular e seguido pela maioria dos laboratórios. Os passos descritos a seguir partem do pressuposto de que as partículas virais já foram geradas.

22.8.1.4 Titulação O título viral indica a quantidade de partículas virais produzidas. Todas as preparações virais precisam ser tituladas. Mesmo que as partículas virais tenham sido obtidas prontas e com título conhecido, recomenda-se efetuar nova titulação, a fim de verificar se as partículas virais permanecem viáveis e com o título esperado. É importante notar que as partículas lentivirais devem ser armazenadas à temperatura de -80 °C, e ciclos de congelamento e descongelamento devem ser evitados, pois levam a uma diminuição de 50% do título viral. Para *

Ver www.ctnbio.gov.br.

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evitar maior perda do título, recomenda-se que diversas alíquotas sejam feitas após o primeiro descongelamento. Os vetores lentivirais, além do transgene de interesse do pesquisador, podem conter um gene que codifica uma proteína marcadora, seja uma proteína fluorescente (EGFP, DsRed, entre outras), ou uma proteína que confere resistência a antibiótico (neomicina, puromicina etc.), ou ambas. Quando presente, o gene marcador facilita e direciona a escolha do protocolo para titulação da preparação viral. Citometria de fluxo é o método de escolha para a titulação de vírus que expressam sequências de proteínas fluorescentes. Alternativamente, o protocolo de seleção de colônias resistentes a antibióticos é aplicado na rotina de titulação de vírus que expressam genes que criam tolerância ao tratamento com antibiótico. A detecção da proteína lentiviral p24 por enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) também é possível95, mas não será descrita neste trabalho.

Titulação viral utilizando citometria de fluxo 1) No dia anterior à transdução viral, plaquear 5 × 104 células da linhagem HT1080 (ATCC n. CCL-121) em cada poço de uma bandeja de 6 poços, utilizando 2 mL de meio de cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) suplementado com 10% de soro bovino por poço. A cultura é mantida a 37 °C, em atmosfera úmida com 5% de CO2 . Separar dois poços e reservar um como controle negativo, e o outro para verificação do número de células no dia da transdução. Preparar uma bandeja de 6 poços para cada estoque viral que deseja titular. Observação: outras linhagens celulares, incluído a célula alvo do estudo, podem ser utilizadas para a titulação. Para isso, ajustar os parâmetros, como meio e número de células utilizado, de forma que no dia seguinte cada poço tenha em torno de 40% a 50% de confluência. 2) Vinte e quatro horas após o plaqueamento, tripsinizar e contar o número de células presentes em um dos poços reservados. O número de células no momento da transdução será utilizado no cálculo do título viral. Realizar a transdução dos demais poços com amostras do vírus a ser titulado. 3) A transdução é realizada na presença de DMEM contendo 8 µg/ml de polibreno. Remover o meio de cultura de 5 poços restantes e adicione 0,7 ml de DMEM mais polibreno em cada poço. Em seguida, adicionar 25 µl, 50 µl, 100 µL e 150 µL do estoque viral respectivamente em cada um dos 4 poços. O quinto poço não receberá vírus, apenas DMEM com

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polibreno, e servirá como controle negativo da transdução viral. Manter a cultura na estufa durante 6 a 8 horas, mexendo a bandeja a cada 30 a 60 minutos. Observações: • Polibreno (brometo de hexadimetrina) é um composto policatiônico usado para neutralizar as cargas de interação, a fim de aumentar a ligação entre o capsídeo viral e a membrana celular. O polibreno pode ser tóxico, dependendo do tipo celular. Assim a concentração de uso pode ser determinada empiricamente, geralmente variando entre 1 µg/mL e 8 µg/mL. • Os valores sugeridos são referentes a uma produção viral não concentrada. Para produções virais concentradas (título esperado acima de 107 TU/mL – transducing units por mL), diluir o estoque viral 50 vezes antes de fazer a transdução. 4) Após o período de incubação descrito no passo 3, adicionar 1,5 ml de meio DMEM a cada poço e devolver as células à estufa por 48 horas. 5) Após 48 horas de transdução, verificar o número de células fluorescentes através de análise por citometria de fluxo (ver a seguir tópico sobre como preparar as células para análise por citometria de fluxo). Observação: as células transduzidas, fluorescentes podem ser identificadas e contadas usando microscópico de fluorescência. Contudo, o resultado poderá ser menos preciso. 6) Calcular o título utilizando a fórmula: Título = N° de células no dia da transdução × % de células transduzidas volume viral em ml Ex.: transduzindo-se 1 × 10 5 células com 5 µL de vírus, obteve-se uma proporção relativa de células transduzidas de 0,05 (5%). Logo: 1 × 106 TU/ mL. Observação: utilizar apenas os resultados dos poços que apresentaram entre 5% e 20% de células positivas.

Preparação das células para análise por citometria de fluxo 1) Separar tubos de poliestireno próprios para o citômetro, lembrando que cada placa ou poço no experimento deve ser colocado separadamente em um tubo. Etiquetar adequadamente. Adicionar aos tubos meio de cultura contendo soro, em volume igual ao utilizado para a tripsina. Por exemplo,

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se são necessários 500 µL de tripsina, adicionar ao tubo de poliestireno 500 µL de meio de cultura. 2) Remover o meio de cultura das placas onde se encontram as células que serão avaliadas por citometria de fluxo. Lavar as células com tampão fosfato-salina (PBS) 1X para remover sobras de meio e fazer a tripsinização das células. 3) Homogeneizar para desprender todas as células da placa e eliminar possíveis grumos de células e transferir as células em tripsina para seu respectivo tubo. 4) Centrifugar os tubos a 1.000 rpm por 5 minutos em centrífuga refrigerada a 4 °C. Descartar o sobrenadante. 5) Ressuspender as células em PBS 1X e manter as células a 4 °C ou no gelo. As células nesta condição devem ser analisadas em até 4 horas. Observação: o volume de tampão a ser adicionado depende da quantidade de células. Para análise por citometria, as células não devem estar muito concentradas ou muito diluídas. 6) Quando o gene marcador for EGFP, as células podem ser fixadas através da adição de paraformaldeído 4% em vez de PBS 1X. As células fixadas podem ser armazenadas a 4 °C por até uma semana. Anteriormente à leitura, o paraformaldeído deve ser removido: centrifugar as células fixadas a 1.000 rpm por 5 minutos a 4 °C, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em PBS 1X.

Titulação viral utilizando ensaio de seleção de colônias resistentes a antibiótico 1) Para cada estoque viral que desejar titular, plaquear 5 × 104 células da linhagem HT1080 (ATCC n. CCL-121) em cada poço de uma bandeja de 6 poços, utilizando 2 mL de meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino por poço. Plaquear mais dois poços ou duas placas de 35 mm que servirão como controles. Observação: outras linhagens celulares podem ser utilizadas para a titulação. 2) Vinte e quatro horas após o plaqueamento, iniciar o processo de transdução. Preparar diluições seriadas do estoque viral. Em um tubo adicione 1 µL do estoque viral em 999 µL de DMEM contendo 8 µg/mL de polibreno (diluição de 103 vezes). Em outro tubo, misturar 999 µL de DMEM com polibreno e 1 µL do vírus diluído anteriormente (diluição final 106 vezes). Remover o meio de plaqueamento dos 6 poços e adicionar nos

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3 primeiros poços 1 µL, 10 µL e 100 µL, respectivamente, da primeira diluição (103 X). Nos 3 poços restantes, adicionar 1 µL, 10 µL e 100 µL, respectivamente, da segunda diluição (106 X). Completar o volume adicionando 0,7 mL de DMEM contendo 8 µg/mL de polibreno por poço. Substituir o meio de plaqueamento das duas placas controles pelo meio de transdução (DMEM + 8 µg/mL de polibreno). Incubar as células a 37 °C, em atmosfera úmida com 5% de CO2 , durante 6 a 8 horas, mexendo a placa a cada 30 a 60 minutos. Em seguida, adicionar 1,5 mL de meio DMEM em cada poço ou placa de 35 mm. Observação: a diluição de 106 X só é necessária para produções virais concentradas, cujo título esperado seja maior que 107 TU/mL. 3) Após 24 horas da transdução, trocar o meio de cultura por meio DMEM suplementado com o antibiótico de seleção (geneticina, puromicina etc.). Se necessário, faça uma curva de concentração de antibiótico para identificar a concentração de antibiótico ideal, ou seja, a dose capaz de matar as células não transduzidas dentro de 4 a 7 dias. Observação: deve-se adicionar antibiótico a apenas uma das placas controles. O outro controle deve permanecer sem vírus e sem antibiótico. Este controle não deve morrer antes do fim da titulação. 4) Monitorar as células diariamente até a morte de todas as células da placa controle: sem vírus, porém com meio de seleção. Em média essa etapa de seleção é de sete dias. Cultivar as células em meio de seleção por mais 7 a 10 dias, até a formação de colônias. 5) Para determinar o número de colônias resistentes, aspirar o meio das placas e lavar com PBS 1X. Em seguida, fixar as colônias por 5 minutos à temperatura ambiente com metanol. Descartar o metanol, esperar secar e corar as colônias com solução a 1% de cristal violeta por 1 minuto. Remover o corante, lavar as placas com água destilada e contar as colônias. Determinar o título viral, expresso em cfu/ml ( do inglês, colony forming units/ml) Título =

N° colônias × fator de diluição volume de vírus usado na transdução em ml

Ex.: foram contadas 20 colônias, usando-se 1 µL de vírus, no poço contendo a diluição viral de 103 X, então: 2 × 107 cfu/ml.

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22.8.1.5 Determinação da multiplicidade de infecção (MOI) ideal A multiplicidade de infecção (MOI) indica o número de partículas virais apresentadas para cada célula durante a transdução. Por exemplo, uma MOI de 1 significa que existe uma partícula viral para cada célula no experimento. A MOI ideal depende da célula alvo, ou seja, diferentes linhagens celulares requerem diferentes MOI(s). A avaliação de MOI é um parâmetro importante na determinação da eficiência de transdução celular. A determinação da MOI capaz de atingir a transdução da maior porcentagem de células é fundamental na padronização de estudos funcionais. O protocolo a seguir é utilizado para traçar uma curva de MOI: 1) Plaquear as células de interesse com confluência entre 40% a 50%, utilizando o meio de cultura recomendado. Utilize bandejas de 6 ou 12 poços para plaqueamento. Separar dois poços para utilizar como controle: um que será o controle negativo da transdução e o outro que será utilizado para verificar o número de células presentes no dia da transdução. Incube as células a 37 °C, com 5% de CO2. 2) Vinte quatro horas depois, realizar a contagem do número de células presentes em um dos poços controle. Este número será utilizado para calcular o volume de vírus que será necessário para que a MOI desejada seja obtido. 3) Remova o meio de cada poço e adicione o volume da preparação viral que corresponda a diferentes MOI(s), de acordo com a curva de dose escolhida. Por exemplo: pode-se iniciar com os MOI(s) de 0, 1, 2, 5, 10, 20. Incubar as células a 37 °C, com 5% de CO2 , durante 6 a 8 horas, mexendo a placa a cada 30 a 60 minutos. Após o período de incubação, completar o volume de cada poço com meio de cultivo e devolver as células à estufa de CO2 . É essencial a utilização de preparações virais tituladas. O título pode ser um fator limitante na determinação do máximo MOI que pode ser utilizado. Observações: a) Para calcular a quantidade de vírus necessária para um determinado MOI, use a fórmula: N° de células × MOI Título O resultado é referente ao volume de vírus em ml. Ex., transduzindo-se 1x105 células com uma MOI desejada de 5, utilizando-se

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uma produção viral cujo título calculado foi de 1x106. Logo: 500 μL de vírus devem ser utilizados. b) Os valores de MOI sugeridos devem ser adequados à necessidade do estudo funcional. 4) Depois, completar o volume de meio das placas com meio suplementado com 8 µg/mL de polibreno (meio de transdução). O volume de meio deve ser o mínimo necessário para cobrir o fundo do poço. Por exemplo, cerca de 0,6 mL a 0,7 mL ou 0,2 mL a 0,3 mL para bandejas com 6 ou 12 poços, respectivamente. 5) A análise da eficiência de transdução pode ser feita de duas formas, dependendo das características do lentivírus, como acontece com a titulação: a) Se o vírus for portador de sequência que confira resistência a antibiótico, o ensaio de formação de colônia pode ser utilizado. Vinte e quatro horas após a transdução, o meio de cultura é suplementado com o antibiótico de seleção. As culturas são observadas diariamente, durante 10 a 14 dias, até identificação de colônias resistentes. Seguindo o mesmo protocolo da titulação utilizando ensaio de seleção de colônias resistentes a antibiótico, as colônias são coradas e contadas, para determinação da eficiência de transdução correspondente a cada MOI. Atenção: muitas vezes, quando a eficiência de transdução é alta, torna-se difícil individualizar colônias. Neste caso, repetir a curva com MOI(s) menores. b) Caso o vírus carregue como marcador o gene para proteína fluorescente, como eGFP, a curva de MOI pode ser traçada 48 horas após transdução. Nesse caso, a porcentagem de células fluorescentes (eGFP positivas) pode ser rapidamente determinada por meio de citometria de fluxo. Durante o planejamento de ensaios com vetores lentivirais, é preciso atentar ao fato de que uma MOI alto pode demandar um volume considerável de vírus. Por exemplo: algumas empresas comercializam partículas virais que são fornecidas com um título de 106 TU/mL; para se transduzir 10 6 células com um MOI de 5 utilizando este estoque viral (106 TU/mL), seriam necessários 5 mL de vírus no total. Embora possam ser obtidos títulos lentivirais por volta de 107 TU/mL a 108 TU/mL, sua obtenção pode ser laboriosa, ou ter um custo mais elevado caso o vírus seja adquirido comercialmente. Portanto, os trabalhos com vetores lentivirais devem ser planejados com cuidado, tendo sempre em mente a limitação dos estoques virais.

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Uma discussão interessante sobre MOI e eficiência de transdução pode ser encontrada no trabalho de Kustikova e colaboradores96. A Figura 22.14 apresenta um gráfico que exemplifica um experimento de curva de MOI para três linhagens diferentes.

Figura 22.14 Gráfico exemplificando a curva de MOI para três linhagens. No gráfico, é possível verificar a diferença quanto à capacidade de transdução do vírus de acordo com a linhagem estudada. No exemplo, verifica-se que a linhagem 3 pode ser facilmente transduzida, uma vez que uma MOI de 5 transduz aproximadamente 100% das células, enquanto na linhagem 2 a transdução é dificultada, pois um alto valor de MOI (20) não foi suficiente para transduzir 100% das células.

22.9 CONCLUSÕES A terapia gênica completou 23 anos de experiência clínica rodeada de vários exemplos de sucessos temperados com alguns casos nos quais efeitos colaterais foram observados. Contudo, na base tecnológica da transferência e de seu uso terapêutico estão trabalhos-chave e tentativas corajosas de usar DNA recombinante como fármaco. Protocolos clínicos experimentais de terapia gênica são factíveis e podem trazer benefícios para os pacientes. Demonstrações sólidas do potencial da terapia gênica começam a ser revelados. Na próxima década, as expectativas que sempre cercaram a terapia gênica serão alcançadas, e a terapia gênica será um acessível procedimento médico.

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22.10 PERSPECTIVAS FUTURAS Notícias recentes indicam que os primeiros tratamentos na base de transferência gênica devem ser aprovados para comercialização no futuro próximo97. Mesmo assim, o amadurecimento da terapia gênica ainda depende do aprimoramento das abordagens e dos vetores empregados. Esperamos que o sucesso da terapia gênica no exterior sirva como exemplo e impulso para expandir os esforços neste campo de estudo no Brasil.

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