XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

vectorstock.com/27117080

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC-PDA WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

.

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC-PDA Mã số: <Mã số đề tài>

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt

Tp. Hồ Chí Minh, 02/2019

.

.

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CYNARIN, ACID CLOROGENIC, CYNAROSID VÀ SCOLYMOSID TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC-PDA Mã số: <Mã số đề tài>

Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Nguyễn Thị Ánh Nguyệt

Tp. Hồ Chí Minh, 02/2019 .

.i

DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI 1. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt 2. Trần Văn Quyền

.

.ii

MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI .................... i MỤC LỤC ............................................................................................................................ii DANH MỤC BẢNG............................................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................. v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................................vii ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................... viii CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.............................................................................................. 10 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI CYNARA .......................................................... 10 1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................................... 10 1.1.2. Hình thái thực vật ...................................................................................................... 11 1.1.3. Phân bố sinh thái ........................................................................................................ 14 1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến, bảo quản ................................................................ 14 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI CYNARA ...................................................... 15 1.2.1. Dẫn xuất caffeoylquinic ............................................................................................. 15 1.2.2. Flavonoid ................................................................................................................... 16 1.2.3. Sesquiterpen lacton .................................................................................................... 17 1.2.4. Inulin .......................................................................................................................... 18 1.2.5. Các thành phần khác .................................................................................................. 18 1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA ACTISÔ ...................................................................... 19 1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa ............................................................................................ 19 1.3.2. Tác dụng trên gan mật ............................................................................................... 19 1.3.3. Tác dụng làm giảm cholesterol .................................................................................. 20 1.3.4. Tác dụng kháng khuẩn – kháng nấm ......................................................................... 20 1.3.5. Tác dụng trên tim mạch ............................................................................................. 20 1.3.6. Tác dụng trên hệ tiêu hóa ........................................................................................... 21 1.3.7. Tác dụng kháng viêm................................................................................................. 21 1.3.8. Tác dụng kháng ung thư ............................................................................................ 21 1.3.9. Tác dụng kháng HIV.................................................................................................. 21 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM ACTISÔ ........................ 22 1.4.1. Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV .......................................................................... 22 1.4.2. Tiêu chuẩn Dược điển Anh, Dược điển Châu Âu ...................................................... 22

.

.iii

1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT PHENOL TRONG ACTISÔ BẰNG HPLC ......................................................................................... 24 1.5. MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÀ TÚI LỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG ................................... 28 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................... 30 1.6. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 30 1.6.1. Nguyên liệu ................................................................................................................ 30 1.6.2. Dung môi, hóa chất .................................................................................................... 31 1.6.3. Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................................ 31 1.7. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 32 1.7.1. Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic, scolymosid, cynarosid trong lá Actisô bằng UPLC ............................................................. 32 1.7.2. Đánh giá quy trình định lượng ................................................................................... 35 CHƯƠNG 2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................................... 41 2.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CY, AC, SCO, CR TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG UPLC-PDA ......................................................................... 41 2.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký UPLC ............................................................................... 41 2.1.2. Khảo sát điều kiện chiết xuất lá Actisô...................................................................... 48 2.1.3. Quy trình định lượng CY, AC, CR và SCO .............................................................. 53 2.2. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ................................................................... 54 2.2.1. Khảo sát độ tinh khiết của các chất đối chiếu ............................................................ 54 2.2.2. Tính tương thích của hệ thống ................................................................................... 57 2.2.3. Tính tuyến tính ........................................................................................................... 59 2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)......................................... 61 2.2.5. Khảo sát tính chọn lọc ............................................................................................... 62 2.2.6. Khảo sát độ lặp lại ..................................................................................................... 63 2.2.7. Khảo sát độ đúng ....................................................................................................... 66 2.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AC, CY, SCO, CR TRONG ACTISÔ ................................................................................................ 68 CHƯƠNG 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 75 3.1. KẾT LUẬN................................................................................................................... 75 3.2. ĐỀ NGHỊ ...................................................................................................................... 75 CHƯƠNG 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 77

.

.iv

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số loài trong chi Cynara .............................................................................. 10 Bảng 1.2. Các đặc điểm hình thái của 9 kiểu gen của loài Actisô trồng ............................ 12 Bảng 1.3. Chương trình HPLC phân tích các hợp chất phenol ........................................... 25 Bảng 1.4. Một số điều kiện định lượng các hợp chất trong Actisô bằng HPLC ................ 26 Bảng 2.5. Một số chế phẩm trên thị trường ......................................................................... 30 Bảng 2.6. Đánh giá độ chính xác theo nồng độ chất phân tích ........................................... 38 Bảng 2.7. Mối liên quan giữa tỷ lệ phục hồi và nồng độ chất phân tích ............................. 39 Bảng 3.8. Chương trình chạy tiệm tiến được lựa chọn ....................................................... 45 Bảng 3.9. Bảng so sánh 2 điều kiện HPLC và UPLC ......................................................... 48 Bảng 3.10. Bảng độ tan của AC, CY, SCO, CR ................................................................. 49 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết của AC, CY, SCO, CR ................................... 50 Bảng 3.12. Bảng khảo sát thời gian chiết của AC, CY, SCO, CR ..................................... 51 Bảng 3.13. Bảng khảo sát số lần chiết của AC, CY, SCO và CR ....................................... 52 Bảng 2.14. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của hợp chất đã phân lập ................................. 55 Bảng 2.15. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của cynarosid phân lập .................................... 56 Bảng 3.16. Độ tinh khiết của các chất chuẩn ...................................................................... 57 Bảng 3.17. Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu thử ......................... 57 Bảng 3.18. Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu chuẩn ..................... 58 Bảng 3.21. Kết quả khảo sát LOD và LOQ của AC, CY, SCO, CR ................................... 62 Bảng 3.22. Độ lặp lại acid clorogenic ................................................................................. 64 Bảng 3.23. Độ lặp lại của cynarin ....................................................................................... 64 Bảng 3.24. Độ lặp lại của scolymosid ................................................................................. 65 Bảng 3.25. Độ lặp lại của cynarosid .................................................................................... 65 Bảng 3.26. Tóm tắt độ lặp lại và hàm lượng của các chất định lượng ............................... 65 Bảng 3.27. Kết quả độ đúng của acid clorogenic ................................................................ 66 Bảng 3.28. Kết quả độ đúng của cynarin .......................................................................... 66 Bảng 3.29. Kết quả độ đúng của scolymosid ...................................................................... 67 Bảng 3.30. Kết quả độ đúng của cynarosid ......................................................................... 67 Bảng 31. Tóm tắt tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng ................................................. 67

.

.v

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vị trí phân loại của Actisô .................................................................................. 10 Hình 1.2. Vị trí phân loại của Actisô trong loài Cynara cardunculus L. ............................ 11 Hình 1.3. Các thế hệ lai F1 của Cynara Cardunculus L. .................................................... 13 Hình 1.4. Dẫn xuất của acid caffeoylquinic ........................................................................ 16 Hình 1.5. Dẫn xuất Flavonoid. ............................................................................................ 17 Hình 1.6. Dẫn xuất Sesquiterpen lacton. ............................................................................. 17 Hình 1.7. Sắc ký đồ dịch chiết hoa đầu của Actisô ............................................................. 25 Hình 1.8. Sắc ký đồ dịch chiết lá và hoa Actisô .................................................................. 26 Hình 1.9. Một số chế phẩm trên thị trường ......................................................................... 29 Hình 3.10. Sắc ký đồ của AC, CY, SCO, CYR chuẩn ở bước sóng 323 nm ...................... 41 Hình 3.11. Sắc ký đồ của AC,CY, SCO, CYR chuẩn ở bước sóng 349 nm ....................... 41 Hình 3.12. Phổ hấp thu UV của acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid ........ 42 Hình 3.13. SKĐ khảo sát dung môi pha động..................................................................... 42 Hình 3.14. SKĐ khảo sát chương trình chạy ...................................................................... 44 Hình 3.15. SKĐ khảo sát tốc độ dòng ................................................................................. 45 Hình 3.16. SKĐ khảo sát nhiệt độ cột ................................................................................. 46 Hình 3.17. SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp HPLC ........................ 47 Hình 3.18. SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp UPLC ........................ 47 Hình 3.19. Biểu đồ độ tan của AC, CY, SCO và CR .......................................................... 48 Hình 3.20. SKĐ của 2 dung môi chiết EtOH 70% và Nước ............................................... 49 Hình 3.21. Biểu đồ nhiệt độ chiết AC, CY,SCO và CR ..................................................... 50 Hình 3.22. SKĐ của 2 nhiệt độ chiết 60 oC và 100 oC ........................................................ 50 Hình 3.23. Biểu đồ thời gian chiết AC, CY, SCO và CR ................................................... 51 Hình 3.24. Biêu đồ các lần chiết AC, CY, SCO và CR ...................................................... 52 Hình 2.25. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của acid clorogenic phân lập.............. 55 Hình 2.26. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của cynarosid phân lập....................... 56 Hình 3.28. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử............................... 57 Hình 3.29. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn .......................... 57 Hình 3.30. Đường tuyến tính của acid clorogenic .............................................................. 59 Hình 3.31. Đường tuyến tính của cynarin ........................................................................... 60

.

.vi

Hình 3.32. Đường tuyến tính của scolymosid ..................................................................... 60 Hình 3.33. Đường tuyến tính của cynarosid ....................................................................... 61 Hình 3.34. sắc ký đồ của acid clorogenic ở nồng độ LOD ................................................. 62 Hình 3.35. Sắc ký đồ của cynarin ở nồng độ LOD ............................................................. 62 Hình 3.36. Sắc ký đồ của cynarosid ở nồng độ LOD.......................................................... 62 Hình 3.37. Sắc ký đồ của acid scolymosid ở nồng độ LOD ............................................... 62 Hình 3.38. Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc ....................................................................... 62 Hình 3.39. Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của acid clorogenic.......................................... 63 Hình 3.40. Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarin ...................................................... 63 Hình 3.41. Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của scolymosid ................................................ 63 Hình 3.42. Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarosid................................................... 63 Hình 3.43. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của acid clorogenic và cynarin ........................... 64 Hình 3.44. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của scolymosid và cynarosid .............................. 64 Hình 3.45. Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên hàm lượng lá tím ......................................... 69 Hình 3.46. Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên lá trắng ........................................................ 69 Hình 3.47. Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến hàm lượng lá tím ....................................... 70 Hình 3.48. Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến hàm lượng lá trắng .................................... 70 Hình 3.49. Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến hàm lượng lá tím .................................... 71 Hình 3.50. Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến hàm lượng lá trắng ................................. 71

.

. vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt

Chữ nguyên

ACN

Acetonitril

MeOH

Methanol

EtOH

Ethanol

DĐVN

Dược điển Việt Nam

LOD

Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of Quantitation (Giới hạn định lượng)

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

PDA

Photo Diod Array Detector (Đầu dò dãy diod quang)

to

Nhiệt độ

UV-Vis

Ultraviolet and Visible (Tử ngoại khả kiến)

SKĐ

Sắc ký đồ

AC

Acid clorogenic

CY

Cynarin

SCO

Scolymosid

CYR,CR

Cynarosid

.

. iii

ĐẶT VẤN ĐỀ Actisô (Cynara scolymus L.) là loại cây thảo sống nhiều năm có nguồn gốc từ miền nam Châu Âu. Diện tích trồng Actisô khoảng 125.000 ha/năm và sản lượng hàng năm là 1,42 triệu tấn. Trong đó, Tây Ban Nha (25.000 ha), Ý (50.000 ha) và Pháp (13.000 ha) đóng góp vào khoảng 75% tổng diện tích trồng [40]. Trên thế giới, Actisô được dùng làm thuốc và thực phẩm chức năng để trị các bệnh về gan, mật. Ngoài ra, theo những nghiên cứu gần đây, dịch chiết lá Actisô còn có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng u, kháng HIV… Nhìn chung, ở nước ngoài có rất nhiều công trình nghiên cứu về cây Actisô, điển hình có các nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý, phương pháp định tính, định lượng các hợp chất chính (các flavonoid và dẫn xuất acid caffeoyl quinic), và một số thử nghiệm trên lâm sàng như hiệu quả làm giảm triệu chứng khó tiêu và hạ cholesterol [41]. Tại Việt Nam, rất nhiều chế phẩm từ Actisô với số lượng và chất lượng khác nhau, đa dạng về hình thức từ trà túi lọc đến các dạng thuốc viên, thuốc sủi, thuốc nước để uống. Do đó, việc kiểm tra chất lượng của các sản phẩm này cần được quan tâm. Dược điển Việt Nam IV định lượng cynarin bằng phương pháp đo phổ tử ngoại (UV). Tuy nhiên phương pháp này có độ chọn lọc không cao vì trong lá Actisô ngoài cynarin còn có các đồng phân khác đều có cùng phổ UV. Vì vậy, cần một phương pháp hiện đại để định lượng chính xác hàm lượng hoạt chất có trong Actisô. Ngoài ra, cũng cần định lượng acid clorogenic, scolymosid và cynarosid – không những là các chất chứa hàm lượng đáng kể trong Actisô mà còn có tác dụng đáng chú ý của Actisô như tác dụng chống oxy hoá và hạ cholesterol. Nhóm nghiên cứu đã có công trình công bố định lượng đồng thời 4 chất trên bằng phương pháp PDAHPLC [44]. Tuy nhiên, ngày nay hệ thống máy UHPLC ra đời với nhiều ưu điểm hơn so với HPLC là tốc độ phân tích nhanh, độ nhạy và độ phân giải tốt hơn, tiết kiệm dung môi. Gần đây, với nhu cầu phân tích ngày càng nhiều nên một số nơi như trung tâm kiểm nghiệm, viện kiểm nghiệm các tỉnh thành và một số xí nghiệp bắt đầu có nhu cầu sử dụng hệ thống này và sẽ tăng dần trong tương lai.

.

.ix

Do đó để có thể đáp ứng được với nhu cầu trên, đề tài “Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid trong lá Actisô bằng phương pháp UPLC-PDA” được thực hiện với các mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng qui trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic, cynarosid, scolymosid có trong lá Actisô bằng UPLC-PDA 2. Khảo sát hàm lượng hoạt chất theo các điều kiện làm khô khác nhau. 3. Khảo sát sự thay đổi hàm lượng thay đổi hoạt chất theo từng thời vụ thu hái khác nhau. 4. Khảo sát sự thay đổi hàm lượng hoạt chất theo từng bộ phận cây. 5. Đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong một số chế phẩm từ lá Actisô

.

. 10

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CHI CYNARA 1.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại ngành thực vật hạt kín của A. L. Takhtajan công bố năm 1987 và đã sửa đổi năm 2009, vị trí của chi Cynara thuộc họ Asteraceae như sau (Hình 1.1) [9], [31] Bảng 1.1. Một số loài trong chi Cynara Một số loài trong chi Cynara [16], [32] 1.

Cynara alba Boiss. ex DC.

2.

Cynara algarbiensis Coss. ex Mariz

3.

Cynara auranitica Post

4.

Cynara baetica (Spreng.) Pau

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliosida)

Phân lớp Cúc 5.

Cynara cardunculus L.

6.

Cynara cornigera Lindl.

7.

Cynara Cyrenaica Maire & Weiller

8.

Cynara humilis L.

9.

Cynara hystrix Ball

10.

Cynara kurdica Handel-Mazzetti

11.

Cynara pygmaea Willd

12.

Cynara senneni Pau ex Sennen

13.

Cynara sibthorpiana Boiss. & Heldr. Diagn

14.

Cynara syriaca Boiss.

(Asteridae) Liên bộ Cúc (Asteranae) Bộ Cúc (Asterales) Họ Cúc (Asteraceae)

Chi Cynara L. Hình 1.1. Vị trí phân loại của Actisô

Trong cách phân loại trước đây, theo Rottenberg và Zohary (1996) Cynara cardunculus L. var sylvestris (Lamk) Fiori là tổ tiên của Actisô trồng hiện nay (globe Artichoke) [var. Sativa Moris, var. Scolymus (L.) Fiori, ssp. scolymus (L.) Hegi] và rau ca đông lá rậm (leafy cardoon) hay rau ca đông trồng (cultivated

.

. 11

cardoon) (var. altilis DC) [42]. Dựa trên nghiên cứu về đặc điểm hình thái của cây Actisô, Wiklund và cộng sự (1992) đã khẳng định rằng Actisô trồng (globe Artichoke), rau ca đông lá rậm (leafy cardoon) và rau ca đông dại (wild cardoon) đều cùng 1 loài duy nhất là Cynara cardunculus L.. Gần đây, Pignone và Sonnante (2004) đã nghiên cứu về sinh hóa và chất đánh dấu hóa học để phân loại Cynara cardunculus L. như mô tả ở Hình 1.2, gần giống với cách phân loại của Wiklund (1992): Cynara cardunculus L.

var. scolymus (L.) Fiori

var. sylvestris (Lam.) Fiori

var. altilis DC

Actisô trồng

Actisô dại

Actisô lá rậm

(Globe Artichoke)

(Wild Artichoke)

(Leafy cardoon)

Hình 1.2. Vị trí phân loại của Actisô trong loài Cynara cardunculus L.

Trong đó, Cynara cardunculus var. sylvestris (Lam.) Fiori là tổ tiên của 2 loài var. scolymus (L.) Fiori và var. altilis DC.

1.1.2. Hình thái thực vật Tên nước ngoài: artichaut (Pháp), artichoke (Anh), artischoke (Đức). Tên Việt nam: Actisô Tên khoa học: Cynara scolymus L. Họ Asteraceae. Nguồn gốc: Actisô là một loại thực vật cổ xưa có thể ăn được, gần với chi carduus. Về nguồn gốc, loại thực vật này được tìm thấy ở khu vực phía bắc Châu phi. Cho đến thế kỷ 15, loài này mới được đưa từ Sicile vào Châu âu và được trồng ở Pháp, Anh và Đức. Cho đến đầu thế kỷ 20 thì mới thấy có những báo cáo sử dụng cây Actisô làm thuốc [29].

.

. 12

Thực vật học: là loại cây thân thảo lâu năm có nguồn gốc từ vùng Địa trung hải. Phần dưới đất là một thân rễ to với một hệ thống rễ chằng chịt. Thân cây thẳng đứng, có rãnh, phân nhánh và dài từ 1m đến 1,5 m. Trong năm đầu tiên, các lá xếp theo hình hoa thị, lá to rộng, xanh xám, xẻ thùy sâu, gân lá nổi, không có gai, trắng và có lông ở mặt dưới. Năm thứ hai xuất hiện thân cây, phía trên thân có những lá to hoàn chỉnh, các lá nhỏ dần từ gốc đến ngọn và tận cùng là những lá không có cuống. Lá có thể dài đến 1 m. Các hoa màu xanh tím, hình ống, đặt trên một cụm hoa màu xanh lá cây hoặc màu tím (hoa đầu). Các hoa lưỡng tính và thường xuất hiện trong năm thứ hai. Đầu cụm hoa rất lớn, có đường kính hơn 10 cm bao gồm một đế hoa, với sợi lông tua tủa, tụm lại ở đế hoa và tủa ra ở đầu. Quả hình trứng, nhẵn bóng, màu nâu sẫm, có mào lông trắng. Hạt không có nội nhũ [7], [29]. Hình thái thực vật của Actisô rất đa dạng tùy theo giống và kiểu gen khác nhau. Sara Lombardo và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về mặt sinh học và hình thái sinh học của loài dựa trên 9 kiểu gen. Bảng 1.2 cho thấy các kiểu gen ảnh hưởng đến kích thước, hình dạng (chỉ số chiều dài/ đường kính) của hoa và màu sắc bên trong ngoài của lá bắc. [43] Bảng 1.2. Các đặc điểm hình thái của 9 kiểu gen của loài Actisô trồng Kiểu gen

Khối lượng tươi

tỉ lệ chiều dài/ đường kính

Màu lá bắc ngoài

Màu lá bắc trong

Concerto

201 ± 4

1,25 ± 0,08

tím đậm

vàng lá mạ

Harmony F1

225 ± 17

1,15 ± 0,01

xanh lá

vàng

Madrigal F1

219 ± 37

1,15 ± 0,03

xanh lá

Romanesco clone C3

144 ± 5

1,05 ± 0,03

tím ánh xanh lá

vàng vàng lá mạ ánh tím

Tema 2000

167 ± 3

1,25 ± 0,03

tím đậm

Tempo

176 ± 66

1,30 ± 0,03

Tondo di Paestum

210 ± 50

1,00 ± 0,02

Violet de Provence

125 ± 1

1,45 ± 0,10

Violetto di Sicilia

122 ± 22

1,45 ± 0,05

.

tím ánh xanh lá tím ánh xanh lá nhạt tím ánh xanh lá xanh lá ánh tím

Lá bắc không gai không gai nhưng có đầu nhọn không gai không gai

vàng ánh tím

không gai nhưng có đầu nhọn

vàng tím

không gai

vàng tím

không gai

vàng tím

không gai

vàng lá mạ

không gai

. 13

Trên thế giới, có 3 cây phổ biến là Actisô trồng var. scolymus (globe Artichoke-hoa tròn), rau ca đông trồng var. altilis (cultivated cardoon – hoa dài) và tổ tiên của chúng var. sylvestris. Trong đó, Actisô hoa tròn (globe Artichoke) thường được trồng để lấy hoa trưởng thành còn Actisô hoa dài (cultivated cardoon) thường lấy lá tươi và thân. Ngày nay, xuất hiện nhiều thế hệ lai F1 của chúng đa dạng về hình dạng và có giống tốt (xem Hình 1.3) [10]. Cynara cardunculus

x var. scolymus ‘Romanesco C3’

var. altilis ‘Altilis 41’

(Globe artichoke)

(cultivated cardoon)

Các thế hệ lai F1 Hình 1.3. Các thế hệ lai F1 của Cynara Cardunculus L.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.14

1.1.3. Phân bố sinh thái Phân bố: Actisô là giống cây tự nhiên của lưu vực Địa Trung Hải và được biết đến từ thế kỷ thứ tư trước công nguyên như thức ăn và còn được sử dụng làm thuốc. Người Ả Rập đóng vai trò quan trọng trong việc di thực loài này đến vùng Nam Địa Trung Hải vào thời Trung Cổ. Actisô có vị trí quan trọng trong ngành nông nghiệp của vùng Địa Trung Hải với hơn 800.000 ha đất trồng trọt và sản lượng thu họach hàng năm lên đến khoảng 770.000 tấn (chiếm 70% sản lượng toàn cầu). Italia dẫn đầu thế giới về sản lượng Actisô (474.000 tấn/năm), tiếp đến là Tây Ban Nha (215.000 tấn/năm), Pháp (55.000 tấn/năm), Hy Lạp (25.000 tấn/năm). Actisô cũng được trồng ở vùng Cận Đông (Thổ Nhĩ Kỳ và Iran), Bắc Phi (Ai Cập, Morocco, Algeria, Tunisia), Nam Mỹ (Argentina, Chilê và Pêru), Hoa Kỳ (chủ yếu là ở vùng California) và còn được trồng ở Trung Quốc [25]. Ở Việt Nam, Actisô được người Pháp di thực vào thế kỷ thứ 19 và được trồng ở Sapa (Lào Cai), Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và Đà Lạt (Lâm Đồng). Trồng trọt: Actisô ưa khí hậu ẩm mát quanh năm. Nhiệt độ thích hợp khoảng 15–18 ºC. Ở Việt nam, thường trồng ở độ cao 1.000–1.500 m so với mặt biển. Actisô là cây sinh trưởng mạnh, cho nên cần chọn đất dày màu, thoát nước và bón nhiều phân. Ở Việt nam, Actisô chủ yếu được trồng bằng chồi nhánh và hiện nay chưa thể thu hoạch hạt và trồng bằng hạt. Sau khi làm đất nhỏ, lên luống cao 20-25 cm, mặt luống rộng 40 cm, bổ hốc cách nhau 70-80 cm thành một hàng giữa luống. Dùng 10-15 tấn phân chuồng mục để bón lót cho 1 ha, thúc bằng nước phân chuồng hoặc phân đạm 2-3 lần tùy tình hình sinh trưởng của cây. Tưới thúc lần thứ nhất 15 ngày sau khi trồng, lần thứ hai cách lần trước khoảng 20 ngày. Nếu tưới thúc bằng đạm thì dùng 80-100 kg urê/ha pha thành dung dịch 2%, tưới vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát. Cần làm cỏ vun xới kết hợp khi tưới thúc [3].

1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến, bảo quản Ngoài việc dùng đế hoa và lá bắc để ăn người ta còn dùng thân và lá tươi của Actisô

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.15

làm thuốc. Lá tươi được thu hái lúc sắp hoặc đang ra hoa, rọc bỏ sống lá, sấy hay phơi khô. Lá tươi và khô dùng dưới hình thức thuốc sắc 5 – 10%, hoặc cao lòng 2 – 10 g / ngày. Có khi chế thành cao mềm hay cao khô để làm thuốc viên, thuốc tiêm dưới da, tiêm tĩnh mạch. Ngoài ra, còn dùng dưới dạng cao lỏng đặc biệt với hình thức nhỏ giọt, ngày uống 1 – 3 lần, mỗi lần 10 – 40 giọt [4]. Actisô được bảo quản ở nhiệt độ khoảng 5 oC trong 10 ngày, nếu sau 10 ngày thì hàm lượng các chất sẽ giảm đáng kể [4].

1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI CYNARA 1.2.1. Dẫn xuất caffeoylquinic Dẫn xuất acid caffeoylquinic được biết đến nhiều nhất trong Actisô là cynarin (acid 1,3-dicaffeylquinic), dù không phải là chất chiếm hàm lượng cao nhất. Hợp chất này được phân lập từ dịch chiết lá Actisô và được mô tả lần đầu tiên bởi Panizzi và Scarpati (1954) [25]. Cynarin (acid 1,3 – dicaffeoylquinic): cynarin là diester caffeic của acid quinic, là dẫn xuất acid caffeoylquinic được biết đến nhiều nhất và được xem là hoạt chất chính trong Actisô mặc dù không phải là chất chiếm hàm lượng cao nhất (Hàm lượng cynarin trong dịch chiết methanol rất thấp chỉ khoảng 1,5%). Hợp chất này được phân lập từ dịch chiết lá Actisô và được mô tả lần đầu tiên bởi Panizzi và Scarpati, đã được các tác giả người Ý phân lập ở dạng tinh khiết (1954) [25]. Trong một số tài liệu trước đây cho rằng cynarin tồn tại trong lá tươi là acid 1,3dicaffeoylquinic rất dễ bị chuyển thành 1,5-dicaffeoylquinic trong quá trình sắc với nước và các sản phẩm phân hủy của cynarin như acid caffeic (acid 3,4-dihydroxy cinnamic), acid clorogenic (acid 5-O-caffeylquinic) và acid neo-clorogenic (acid 3O- caffeylquinic) [7]. Tuy nhiên, rất nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng cynarin không phải là chất nguyên thủy trong cây mà nó là chất artifact được hình thành trong quá trình chiết xuất với nước nóng [24], [26], [33]. Dẫn xuất acid caffeoylquinic là thành phần polyphenol chính với acid clorogenic là

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.16

chất có hàm lượng cao nhất (39%), tiếp đến là acid 1,5–O–dicaffeoylquinic (21%) và acid 3,4-O–dicaffeoylquinic (11%) tính trên tổng hàm lượng acid caffeoylquinic. Hàm lượng các chất này phụ thuộc dung môi, pH, nhiệt độ trong quá trình chiết xuất [25]. OH HO

OR5

4 5

R4O

COOH

2 3

1

OR3

OR1

R=

O

R1

R3

R4

R5

Tên hợp chất

R

H

H

H

acid pseudoclorogenic

H

R

H

H

acid neoclorogenic

H

H

H

R

acid clorogenic

H

H

R

H

acid cryptoclorogenic

R

R

H

H

cynarin

H

R

R

H

acid 3,4-di-O-caffeoylquinic

R

H

H

R

acid 1,5-di-O-caffeoylquinic

H

R

H

R

acid 3,5-di-O-caffeoylquinic

H

H

R

R

acid 4,5-di-O-caffeoylquinic

Hình 1.4. Dẫn xuất của acid caffeoylquinic

1.2.2. Flavonoid Trong Actisô có chứa các dẫn chất của nhóm flavon như apigenin, luteolin và các dẫn chất của nhóm anthocyanidin như cyanidin, peonidin và delphinidin. Apigenin và luteolin glycosid được tìm thấy ở cả lá và hoa trong khi đó các sắc tố anthocyanidin chỉ tìm thấy ở hoa. Những chất này được xem là thành phần chính trong tổng lượng các chất phenolic (khoảng 10% hoặc ít hơn) trong mô Actisô. Luteolin là chất chống oxy hóa mạnh có tác dụng bảo vệ các lipoprotein trọng lượng phân tử thấp khỏi các tác nhân oxy hóa trong khi đó các sắc tố anthocyanin ngoài tác dụng cải thiện sức khỏe còn đóng vai trò quan trọng trong các thực vật dùng làm thức ăn do đó được chấp nhận làm màu thực phẩm [25].

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.17

R1

R2

Rutinose

OH

Luteolin – O – 7 rutinosid

Glucose

OH

Luteolin – O – 7 glucosid

Ruttinose

H

Apigenin – O – 7 rutinosid

Glucose

H

Apigenin – O – 7 glucosid

Tên hợp chất

Hình 1.5. Dẫn xuất Flavonoid.

Các dẫn chất của luteolin bao gồm: – Cynarosid (luteolin 7-O-β-glycopyranosid). – Scolymosid [luteolin-7-O-[β-D-glucopyranosyl-(2→1)-α-L-rhamnopyranosyl]. – Cynarotriosid (luteolin-7- rutinosid, 3’-glucose). Ngoài ra, tùy theo loài còn có dẫn chất khác luteolin như apigenin 7-O-rutinosid, apigenin 7-O-glucosid hay các dẫn chất của naringenin (narirutin) như narigenin 7O- glucosid [23].

1.2.3. Sesquiterpen lacton O

Cynaropicrin

OH

R= O

Aguerin

R=

Grosheimin

Hình 1.6. Dẫn xuất Sesquiterpen lacton.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.18

Sesquiterpen lacton là hợp chất chính tạo nên vị đắng của cây. Schneider và Thiele đã báo cáo rằng hợp chất này chỉ có trong các phần màu xanh của cây như lá, mà hoàn toàn không có trong rễ. Lượng sesquiterpen lacton chiếm 2,55% (trọng lượng khô) trong dịch chiết lá Actisô [22]. Gồm 2 Sesquiterpen lacton chính là cynaropicrin

và grosheimin. Ngoài ra, còn có sesequiterpen

B- selinen và

caryphyllen [28].

1.2.4. Inulin Inulin chủ yếu được tìm thấy trong cây hai lá mầm thuộc họ Asteraceae gồm những loài phổ biến như rau Diếp xoăn (Cichorium intybus L.), Actisô (C. scolymus), Bồ công anh (Taraxacum officinale), Thược dược (Dalia variabilis), Lê đất (Polymia sonchifolia). Inulin trong Actisô có chiều dài chuỗi lên đến 200 phân tử fructose (thuộc nhóm fructan) liên kết với nhau theo liên kết β-2,1 và β-2,6 dưới dạng mạch thẳng hoặc mạch nhánh. Inulin trong Actisô được xem là chất có mức độ trùng hợp phân tử cao nhất trong giới thực vật [25]. Các dược liệu giàu inulin đang trở thành loại thực phẩm chức năng được ưa thích nhờ những lợi ích tiềm năng đối với sức khỏe con người. Vì con người không có enzym tiêu hóa fructan nên khi xuống đại tràng, chất này đóng vai trò như chất nền cho sự phát triển của hệ vi khuẩn. Chế độ ăn giàu fructan có tác dụng kích thích bifidobacteria một cách chọn lọc, giúp chúng phát triển và nhờ đó làm giảm sự tạo thành những chất gây khối u. Một lí do khác khiến inulin được ưa dùng là nhờ có ảnh hưởng nhất định đến thành phần hệ vi sinh vật trong ruột và có hiệu quả tốt đối với việc hấp thu chất khoáng, lipid trong máu và ngăn ngừa ung thư đại tràng. Ngoài ra, inulin là chất có lượng calori thấp nên còn được sử dụng để sản xuất thực phẩm giảm béo [25].

1.2.5. Các thành phần khác Actisô cũng có chứa chất xơ, calcium, phosphor, kali, acid folic, vitamin C, niacin, thiamin, nguyên tố vi lượng và carrotenoid.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.19

Trong Actisô còn có một số loại enzym như oxidase, peroxidase, cynarase, ascorbinase và ribulose-1,5-diphosphate carboxylase. Đặc biệt, Actisô có chứa nhiều polyphenol oxidase. Các enzym hoạt động mạnh ở pH 4-7,6 và dễ phá hủy hoạt chất trong quá trình phơi, sấy và chế biến. Tinh dầu với các thành phần như beta – selinen, caryophyllen, eugenol, phenylacetaldehyd và decanal. Acid béo no và không no như acid stearic, acid palmitic, acid oleic và acid linoleic. Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy lá Actisô còn chứa các carbohydrat như: fructose, saccarose, glucose, hemicellulose…[35]. Tổng cộng có 15 axit amin được tìm thấy trong lá Actisô. Chín trong số này là rất cần thiết gồm: valin, threonin, methionin, isoleucin, leucin, lysin, phenylalanin, histidin, arginin. Hàm lượng các axit amin toàn phần là 58,29%, trong đó axit amin thiết yếu chiếm 4,71%) [36].

1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA ACTISÔ 1.3.1. Tác dụng chống oxy hóa Một nghiên cứu được thực hiện trên bạch cầu của những người thường xuyên chịu tác động oxy hóa cao, đã xác định được dịch chiết của lá Actisô có tính chống oxy hóa ở nồng độ từ 1 – 10 mg/ml, quá nồng độ này hoạt tính chống oxy hóa sẽ giảm. Nghiên cứu tương tự khác vào năm 2002 trên các tế bào nội mạc mạch máu trong ống nghiệm cũng đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của Actisô. Ngoài ra, thử nghiệm cho thấy, phân đoạn n-butanol của dịch chiết lá có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [27].

1.3.2. Tác dụng trên gan mật Trên in vitro, dịch chiết Actisô có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột khỏi sự phá hủy màng tế bào. Ngoài ra, ở nồng độ 100 g/ml, dịch chiết lá Actisô (có chứa 27% acid caffeoylquinic và 7% flavonoid) còn giúp làm tăng đáng kể hoạt động của tế bào

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.20

gan HepG2 sau khi ủ 48 giờ. Cũng tại nồng độ này dịch chiết Actisô được chứng minh làm giảm tổn thương tế bào do ethanol gây ra (nồng độ 50 milimol) [17]. Ngoài ra, ở nồng độ 250 mg/kg/ngày (đường uống) Actisô đã được chứng minh có khả năng bảo vệ tế bào gan khỏi tác hại của paracetamol [34].

1.3.3. Tác dụng làm giảm cholesterol Dịch chiết lá Actisô có tác dụng ngăn cản sinh tổng hợp cholesterol ở gan. Tác dụng này là nhờ luteolin làm giảm đặc tính của HMG-CoA (enzym xúc tác quá trình sinh tổng hợp cholesterol). Hơn nữa, acid clorogenic và luteolin có thể ngăn cản quá trình gây xơ cứng động mạch nhờ ngăn cản sự oxy hoá LDL. Nói chung, Actisô làm giảm cholesterol theo 2 cơ chế song song là giảm sinh tổng hợp cholesterol và ngăn chặn sự oxy hoá LDL khi sử dụng 1280 mg dịch chiết Actisô đã được tiêu chuẩn hóa trong 12 tuần [30].

1.3.4. Tác dụng kháng khuẩn – kháng nấm Ba dịch chiết chloroform, Ethyl acetat, và n – butanol của lá Actisô đều có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm. Trong đó, có 4 vi khuẩn gram dương là: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Agrobacterium tumefaciens, và Micrococcus luteus, 2 vi khuẩn gram âm là: Escherichia coli, Salmonella typhimurium. Cùng 3 nấm men là: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, và 2 nấm mốc Aspergillus niger, Penicillium oxalicum. Trong số đó, axit chlorogenic, cynarin, luteolin-7-rutinoside, và cynaroside có tác dụng tương đối cao hơn so với các hợp chất khác; và có hiệu quả hơn với nấm. Nồng độ ức chế tối thiểu của các hợp chất này là từ 50 đến 200 g/mL. [38].

1.3.5. Tác dụng trên tim mạch Rossoni và cộng sự (2005) đã chứng minh Cynara cardunculus có thể làm tăng sự sản xuất nitric oxid nên làm giãn mạch máu ở các tế bào nội mô động mạch chủ của thú vật thí nghiệm. Các tác giả cũng chứng minh được rằng luteolin và apigenin có tác dụng trên sự giãn động mạch chủ khi thêm vào thành phần để tắm xông hơi. Li và cộng sự (2004) đã nghiên cứu và chứng minh được sở dĩ có sự tăng hàm lượng

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.21

nitric oxid là do enzym tổng hợp nitric oxid (nitric oxide synthase: eNOS). Các flavonoid trong Actisô đã làm tăng hoạt tính của eNOS. Thử nghiệm cũng đã chứng minh rằng chỉ có luteolin và cynarosid có tác dụng làm tăng hoạt tính của eNOS nhưng cynarin và acid clorogenic lại không có tác dụng này. Tác dụng làm hạ lipid huyết, chống oxy hóa và làm tăng quá trình sao chép của các gen tổng hợp nitric-oxid của Actisô giúp ích cho việc điều trị các bệnh về tim mạch [25].

1.3.6. Tác dụng trên hệ tiêu hóa Với liều 125 – 500 mg/kg, Actisô được chứng minh có khả năng chống lại tác hại của ethanol trên hệ tiêu hóa. Mặt khác, ở liều 1000 – 2000 mg/kg, Actisô có thể ngăn cản tổn thương niêm mạc dạ dày do stress gây ra [21]. Nghiên cứu cho thấy dịch chiết Actisô có lợi ích trong việc điều trị các bệnh rối loạn tiêu hóa. Các hợp chất cynarosid trong Actisô có tác dụng tăng co thắt hồi tràng, thông qua thụ thể của chất trung gian hóa học là serotonin [39]. Dịch chiết lá Actisô được sử dụng để điều trị các bệnh dạ dày – ruột chủ yếu dựa vào tác động chống lại chứng khó tiêu gián tiếp thông qua đặc tính tẩy xổ. Tác dụng tấy xổ của Actisô tương tự các hợp chất acid dehydrocholic [25].

1.3.7. Tác dụng kháng viêm Luteolin có tính kháng viêm và kháng dị ứng do có tác dụng ức chế sự thành lập COX – 2, PGE2 và lipopolysaccaride (LPS). Luteolin còn ức chế xanthin oxidase ở liều 100 µmol/L, ức chế lipoxygenase, ức chế sự sản sinh quá mức của α – TNF là những chất gây viêm và gây chết tế bào [32].

1.3.8. Tác dụng kháng ung thư Với nồng độ từ 10 – 100 M, acid clorogenic có tác dụng ức chế mạnh glucose-6phosphattranslocase (một yếu tố liên quan đến kiểu hình xâm lấn của các tế bào u não). Hơn nữa, acid clorogenic còn có tác dụng ức chế sự di căn của tế bào gây ra bởi sphingosin – 1 phosphat (S1P) – chất gây gián phân cho tế bào u nguyên bào xốp [14].

1.3.9. Tác dụng kháng HIV

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.22

Nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng hợp chất 1,5 – dicaffeoylquinic acid có trong Actisô có khả năng ức chế mạnh mẽ và không độc hại HIV – 1 intergrase, một enzym cần thiết cho sự xâm nhập của bộ gen HIV vào tế bào vật chủ [15].

1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KIỂM NGHIỆM ACTISÔ 1.4.1. Tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV Định lượng bằng phương pháp đo quang UV-Vis Cân chính xác khoảng 3 g dược liệu và cắt nhỏ hoặc xay thành bột thô. Làm ẩm với ethanol 96% (TT) trong 30 phút, cho vào bình Soxhlet chiết với ethanol 70% (TT) trên cách thuỷ cho tới hết hoạt chất (thử bằng phản ứng định tính A: dịch thử không xuất hiện màu hồng cánh sen). Cất thu hồi dung môi. Cắn còn lại thêm 20 ml nước cất, lọc qua giấy lọc. Cho dịch lọc vào ống quay ly tâm và thêm 20 ml dung dịch chì acetat 10% (TT), khuấy đều. Ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút, trong 15 phút. Gạn bỏ lớp nước. Thêm vào cắn 5 ml dung dịch acid acetic 10% (TT) và 25 ml dung dịch acid sulfuric 0,05 M (TT) .Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100 ml, lắc đều trong 30 phút. Thêm nước cất đến vạch . Lấy 20 ml hỗn hợp vào ống ly tâm và ly tâm như trên. Lấy chính xác 1 ml dung dịch trong ở phía trên, cho vào bình định mức 50 ml. Thêm methanol (TT) đến vạch. Đo độ hấp thu cực đại ở bước sóng 325 nm. Mẫu trắng là methanol (TT). Hàm lượng hoạt chất trong dược liệu được tính theo công thức sau: A x 10000/616 x P A: Độ hấp thu của mẫu đo. 616: Độ hấp thu của dung dịch cynarin 1% trong methanol (TT) ở bước sóng 325 nm. P: Khối lượng dược liệu thô (đã trừ độ ẩm). Dược liệu phải chứa không ít hơn 0,1% hoạt chất tính theo cynarin [6].

1.4.2. Tiêu chuẩn Dược điển Anh, Dược điển Châu Âu Phải chứa tối thiểu 0,8% acid chlorogenic (C16H18O9) (thuốc khô).

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.23

Định lượng bằng phương pháp HPLC-UV  Chuẩn bị mẫu thử: Dung dịch thử: Để 0,500 g thuốc bột (1000), thêm 50 ml methanol và đun hồi lưu trên cách thủy ở 70 °C trong 1 giờ. Ly tâm và chuyển phần nổi vào bình định mức 200 ml. Lặp lại và pha loãng thành 200 ml với nước cất. Dung dịch đối chiếu: Hòa tan 5,0 mg acid clorogenic trong 50 ml methanol. Chuyển 5,0 ml dung dịch này vào bình định mức, thêm 5 ml methanol và pha loãng thành 20 ml bằng nước.  Điều kiện sắc ký: – Cột sắc ký: 250 mm x 4,6 mm; 5 µm. – Nhiệt độ cột 40 oC. – Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút. – Bước sóng phát hiện: 330 nm. – Pha động: acid phosphoric – nước (0,5: 99,5) (Kênh A); acid phosphoric: acetonitril (0,5: 99,5) (Kênh B). –

Phát hiện: ở bước sóng 330 nm.

– Thể tích tiêm: 25 ml. – Chương trình chạy: Thời gian

Kênh A

Kênh B

0 -1

92

8

1 -20

9275

825

20-33

75

25

33 -35

750

25100

35 - 37

092

1008

37 - 47

92

8

Dung dịch thử: Sắc ký đồ thu được là tương tự như trên sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Tính hàm lượng phần trăm của axit chlorogenic sử dụng các biểu thức sau đây:

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.24

A1: diện tích của pic acit clorogenic của mẫu thử A2: diện tích của pic acid clorogenic của dung dịch đối chiếu m1: khối lượng của thuốc được kiểm tra trong các dung dịch thử (gam) m2: khối lượng của acid clorogenic trong dung dịch đối chiếu (gam) p: hàm lượng phần trăm của acid clorogenic của dung dịch đối chiếu [14].

1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC HỢP CHẤT PHENOL TRONG ACTISÔ BẰNG HPLC Hiện nay có nhiều phương pháp định tính và định lượng polyphenol từ Actisô và chế phẩm bằng phương pháp HPLC: Katrin Schutz và cộng sự (2004) [20] đã xây dựng phương pháp định tính, định lượng acid caffeoyquinic và flavonoid trong hoa đầu Actisô như sau: 4 g hoa đầu đông lạnh được cắt nhỏ, chiết xuất bằng MeOH 60%, khuấy trộn trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc rồi bốc hơi ở 30 oC, hòa tan cắn trong nước và điều chỉnh đến pH 7. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25 ml và điều chỉnh đến vạch, chỉnh pH đến 7 trước khi mẫu được tinh khiết hoá bằng cột SPE-C18. Hoạt hoá cột với 5 ml methanol và rửa lại 10 ml nước, sau đó nạp 4 ml mẫu. Các dẫn xuất của acid hydroxycinnamic lần lượt được rửa giải với 50 ml methanol 10% (phân đoạn 1), rồi đến 50 ml methanol 100% (phân đoạn 2). Các phân đoạn được loại hết dung môi đến cắn rồi hoà lại với methanol 50%. Khai triển trên HPLC với cột Phenomenex ODS, Hydro-Synergi C18 (150 × 3 mm; 4 µm), thể tích tiêm mẫu là 5 μl, phát hiện ở bước sóng 280 nm (narirutin), 320 nm (acid hydroxy cinnamic), 330 nm (dẫn xuất của apigenin) và 350 nm (dẫn xuất luteolin), nhiệt độ cột 25 oC, với điều kiện được nêu ở Bảng 1.3. Kết quả phân tích được trình bày ở Hình 1.7.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.25

Đỉnh: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22.

Phân đoạn I

Phân đoạn II

a

acid 1-O-caffeoylquinic acid 3-O-caffeoylquinic acid clorogenic acid 4-O-caffeoylquinic acid caffeic cynarin luteolin 7-O-glucuronide acid dicaffeoylquinic acid 3,4-di-O-caffeoylquinic acid 3,5-di-O-caffeoylquinic acid 1,5-di-O-caffeoylquinic apigenin 7-O-glucuronide acid 4,5-di-O-caffeoylquinic nia luteolin 7-O-rutinoside luteolin 7-O-glucoside nia nia narirutin naringenin 7-O-glucoside apigenin 7-O-rutinoside apigenin 7-O-glucoside

not indentified: chưa xác định

Hình 1.7. Sắc ký đồ dịch chiết hoa đầu của Actisô

Bảng 1.3. Chương trình HPLC phân tích các hợp chất phenol trong dịch chiết hoa đầu của Actisô Thời gian (phút) 0 20 30 45 65 70 75 83 85

Tốc dộ dòng (ml/phút) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

2% AA/ H2O (%) 90 82 76 70 70 45 45 0 0

0,5% AA/H2O-ACN (50:50) (%) 10 18 24 30 30 55 55 100 100

James E. Simon và cộng sự (2003) [25] đã định tính và định lượng thành phần polyphenol trong Actisô như sau: cân chính xác khoảng 500-1000 mg lá khô hoặc

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.26

hoa đầu vào bình định mức 100 ml, thêm 70 ml methanol 60%, siêu âm 25 phút, sau đó để ổn định ở nhiệt độ phòng và điều chỉnh bằng methanol 60% cho đủ thể tích, lọc qua màng lọc milipore 0,45 μm. Khai triển HPLC được thực hiện trên cột Phenomenex ODS3 (150× 3,2 mm; 5µm), phát hiện ở bước sóng 330 nm, pha động gồm 0,2% H3PO4/H2O (A) và acetonitril (B) với chương trình gradient như sau: 6% B (0’), 6-30% B (20’), 30% B (5’). Chạy thêm 10 phút để ổn định cột. Tổng thời gian phân tích là 35 phút, tốc độ dòng 1,2 ml/phút. B

A

Hình 1.8. Sắc ký đồ dịch chiết lá và hoa Actisô Dịch chiết lá (A); Dịch chiết hoa đầu (B)

Một số điều kiện HPLC trong phân tích các hợp hợp chất phenol trong Actisô được trình bày tóm tắt trong Bảng 1.4. Bảng 1.4. Một số điều kiện định lượng các hợp chất trong Actisô bằng HPLC Máy

Cột sắc ký (to cột)

Pha động

Chế độ chạy Tổng thời gian phân tích (TRT)

Tốc độ dòng

λmax (nm)

Tài liệu

Shimadzu HPLC-DAD

LiChrospher C18 (250 x 4,6 mm, 5µm, 100Ao) (25oC)

Gradient: 8-48% B (35’). TRT: 35’

1,0 ml/phút

254, 320

[11]

HewlettPackard HP-

Phenomenex C18 (150 x 3,2 mm,

Dung môi A: 0,3% FA/H2O Dung môi B: iProACN-MeOH-0,3% FA/H2O (18:30:12:40) Dung môi A: 0,2% H3PO4/H2O

Gradient: 6% -30% B (20’), 30% B

1,2 ml/phút

330

[22]

DAD

Dung môi B: ACN

(15’). TRT: 35’

HewlettPackard HP-

5µm, 100 Ao) (25oC) Luna C18 (250 x 2 mm, 5

Dung môi A: 0,03% TFA/H2O

Gradient: 10-36% B (35’). TRT: 35’

0,2 ml/phút

330 và

[23]

DAD

µm). (25oC)

Dung môi B: ACN

.

210

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.27

Agilent 1100DAD

1100

HPLC

(HewlettPackard, Waldbronn, Germany)

Zorbax Eclipse (250 x 4,6 mm,

Dung môi A: 0,1% AA/H2O

Gradient: 8-15% B (20’), 15-30% B

5µm) (25oC)

Dung môi B: ACN

(10’) TRT: 30’

Phenomenex C18

Dung môi A:

Gradient:

ODS (Torrance, CA) (150 x 3,0 mm, 4 µm) (25oC) + tiền cột ODS

2% AA/ H2O Dung môi B: 0,5 % AA/ACN (1:1)

B (20’), 18-24% B (10’), 24-30% B (15’), 30% B (20’), 30-55 % B (5’), 55-

Phenomenex Prodigy ODS3 (Torrance, CA) (250 cm x 4,6

Dung môi A: 0,2% FA/H2O Dung môi B: ACN/MeOH (60:40)

mm, 5 µm) (25oC)

Beckman Gold. HPLC-UV

Khromasil KR 100-5 C18 (250 cm x 4,6 mm) (25oC)

Waters 2695 UPLC-ESIMS/MS

Fused core C18 (Halo 50 x 2,1 mm; 2,7 μm) (25oC)

Perkin-Elmer HPLC-PDA HPLC-FL

LiChrosorb C18 (Merck) (250 x 4 mm, 7 μm) (25oC)

330

[13]

[14]

0,4

280;

ml/phút

320; 330; 350

0,8 ml/phút

330, 280

[16]

1 ml/phút

280

[23]

100% B (5’), 100% B (8’), 100-10% B (2’). TRT: 90’

C18 (4 x 3 mm) (25oC)

Perkin-Elmer, HPLC-UV/Vis 200

10-18%

1,0 ml/phút

Dung môi A: 0,1% TFA Dung môi B: 0,1%TFA/ACN 95%/H2O Dung môi A: 0,1% FA/H2O Dung môi B: ACN Dung môi A: AA-H2O (5:95) Dung môi B: MeOH

Gradient: 20-30% B (6’), 30-40% B (10’), 40-50% B (8’), 50-90% B (8’), 90% B (3’), 9020% B (3’) TRT: 38’ Gradient: 10-50% B (30’), 50-100% B (5’), 100% B (2’), 100-10% B (10’). TRT: 54’ Gradient: 5% B (0’), 12% B (1’), 18% B (3’), 90% B (4’), 60% B (5’). TRT: 14’ Gradient 1: 1540% B (20’), 40% B (25’-30’), 40-63% B (30’-45’), 63% B (47’), 63-99% (47’-

0,8 ml/phút

[27]

1 ml/phút

325; 265 (λex) 345 (λem).

[29]

0,5 ml/phút

254

[28]

51’) TRT: 51’ Gradient 2: 10% B, 10-40% B(25’), 4099% B (25’-40’). Gilson HPLCUV/Vis

Platinum EPS C18 100 metallic (250 x 4,6 mm; 5 μm)

.

Dung môi: MeOH-H2O-H3PO4

TRT: 40’ Đẳng 400:600:5 TRT: 170’

môi:

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.28

HP 1090 L LC-PDA LC-DAD LC-API-MS

LiChrosorb C18 (250 x 4 mm; Merck) + tiền cột LiChrosorb C18 (10 x 4 mm, Merck)

Dung môi A: H2O Dung môi B: ACN

Merck-Hitachi L-7420 HPLC-UV/Vis

LiChroCART (Hewlett-Packard) C18 (250 x 4 mm; 5 μm).

Dung môi A: H2O:FA (95:5) Dung môi MeOH

Merck-Hitachi Lachrom HPLC-UV/Vis

Lichrospher C18 (250 x 4 mm; 5 μm), (30oC)

Dung môi A: AA/H2O (pH 2) Dung môi B: ACN

Agilent Technologies 1100 HPLC/UV/Vis

Hypersil ODS C18 (250 x 4,6 mm; 4 μm)

Dung môi A: 0,2% H2SO4/H2O Dung môi B: ACN

B:

Gradient: 12% B (0,1’), 12-18% B (9,9’), 18% B (5’), 1845% B (15’), 45100% B (5’), 100% B (7’), 100-12% B (8’). TRT: 50’ Gradient: 5-20% B (5’), 20-25% B (45’), 25-30% B (10’), 80% B (2’); TRT: 62’ Gradient: 8-70% B (50’). TRT: 50’

Gradient: 15% B(12’), 15-40% B (2’), 40-60% B (4’), 60-80% B (2’), 8090% B (4’), 90-100% B (4’). TRT: 28’

1,3 ml/phút

[21]

1 ml/phút

330

[25]

0,4 ml/phút

326

[32]

0,5 ml/phút

280

[28]

Chú thích: λex (bước sóng kích thích); λem (bước sóng phát xạ); TRT: total running time

1.5. MỘT SỐ CHẾ PHẨM TRÀ TÚI LỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG

ATISO

ATISÔ

TRÀ ATISÔ

Cơ sở sản xuất Tâm Châu

Cơ sở sản xuất trà Hùng Phát

Sản phẩm của Big C

Trà LadoActiso Công ty cổ phần dược phẩm Lâm Đồng

Actisô nhân sâm

.

Trà Atisô Cơ sở sản xuất Vĩnh Tiến

Trà tươi Actiso

Trà Atisô Công ty TNHH thương mại và dịch vụ Đại Gia

Trà Atisô

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.29

Cơ sở trà Hoàng Duy

Công ty cổ phần dược phẩm Lâm Đồng

Hình 1.9. Một số chế phẩm trên thị trường

.

Cơ sở trà Trâm Anh

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.30

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.6. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.6.1. Nguyên liệu Các chất đối chiếu là: cynarin (CY), acid clorogenic (AC), scolymosid (SCO), cynarosid (CR) đã được phân lập từ các đề tài trước của nhóm nghiên cứu [1], [8]. Trong đó CY, AC, CR đã được thiết lập chất chuẩn với hàm lượng tính trên nguyên trạng lần lượt là: 94,26%; 92,39%; 91,53%. Lá Actisô: Lá tươi của 2 giống lá tím và trắng được thu hái ở phường 5, Tp. Đà lạt vào tháng 3/2017, các lá được chọn là những lá to, già nằm ở gốc của thân cây. Sau khi thu hái lá được rửa sạch, làm khô bằng 3 phương pháp khác nhau gồm phơi âm can, phơi trực tiếp dưới ánh nắng, sấy ở 50-60 oC. Trong đó, giống lá trắng phơi âm can được dùng làm nguyên liệu để xây dựng quy trình định lượng. Ngoài ra, lá trắng và tím thu hái vào tháng 3, 4, 5, 6 tương ứng với độ tuổi của cây là 6, 7, 8, 9 tháng tuổi được dùng để đánh giá hàm lượng hoạt chất theo từng thời vụ thu hái. Rễ và Hoa: được thu hái ở phường 5, Tp. Đà lạt vào tháng 3/2017, sau đó rửa sạch, phơi âm can đến khô (độ ẩm dược liệu dưới 13%). Tất cả các nguyên liệu trên được xay nhỏ, rây qua 2 cỡ rây 0,3 mm và 0,125 mm, lấy phần bột qua rây 0,3 mm nhưng không qua rây 0,125 mm. Một số chế phẩm dạng trà được mua trên thị trường có các thành phần được trình bày ở Bảng 2.3 Bảng 2.5. Một số chế phẩm trên thị trường STT

Ký hiệu mẫu

Thành phẩn

1

HP

Actisô 100%

2

HD

70% Actisô, 30%sâm

3

DG

Atisô, cỏ ngọt

4

VT

40 %Rễ, 40% thân, 10%hoa, cam thảo

5

LDX

Lá tươi 100%

6

LDD

Cao Actisô, Lá Actisô, thảo quyết minh

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.31

7

TC

Hoa Actisô

8

TA

60% Hoa, 20% thân, 20% rễ Actisô

9

BC

Rễ, thân Actisô

10

TB

Thân và lá 50%, rễ 35%, hoa 7%, cỏ ngọt 8%

1.6.2. Dung môi, hóa chất Dung môi HPLC: acetonitril (Merck), methanol (Merck), acid formic (Merck), nước cất 2 lần. Dung môi khác: methanol, ethanol, ethyl acetat, nước cất

1.6.3. Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị trong nghiên cứu hóa học -

Cân phân tích 5 số lẻ CP-2250 (Sartorius).

-

Máy xác định độ ẩm MA-45 (Sartorius).

-

Bể siêu âm Sonorex RK - 1028H (Bandelin, Đức).

-

Bếp cách thủy Memmert WB -14 (Đức).

Các thiết bị sắc ký − Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Acquity UPLC (Waters), đầu dò PDA (Waters). − Cột sắc ký: CORTECS C18 (100 × 4,6 mm; 2,7 μm) − Phần mềm EMPOWER truy xuất hình ảnh, số liệu cho định tính, định lượng trên máy UPLC. Dụng cụ nghiên cứu Bình lắng gạn, bình định mức, bình nón nút mài, micro pipette, pipette chính xác, vial thuỷ tinh 20 ml, ống eppendorf (1,5 ml và 15 ml)...và các dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm. Xử lý số liệu: Phần mềm SBSS, Microsoft Excel 2007 để phân tích thống kê, kiểm định sự khác nhau giữa các biến bằng phân tích phương sai (anova), dùng t-test để kiểm định 2 giá trị trung bình.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.32

1.7. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.7.1. Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời cynarin, acid clorogenic, scolymosid, cynarosid trong lá Actisô bằng UPLC 1.7.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký Tiêu chí lựa chọn chương trình rửa giải: So sánh các sắc ký đồ và các thông số sắc ký của mẫu thử và mẫu chuẩn để lựa chọn điều kiện pha động tối ưu nhất. Lựa chọn chương trình dung môi dựa trên các tiêu chí sau:  Pic tách tốt (Rs ≥ 1,5); cân đối và ít kéo đuôi (0,8 ≤ As ≤ 1,5)  Đỉnh cần định lượng đạt độ tinh khiết pic (giá trị purity angle < purity thresold)  Thời gian lưu ngắn  Tổng thời gian phân tích ngắn (bao gồm thời gian phân tích, rửa và cân bằng cột)  Độ lặp lại tốt Bước sóng phát hiện: khai triển mẫu chuẩn cynarin, acid clorogenic, scolymosid, và cynarosid trên UPLC-PDA với dải bước sóng phát hiện từ 200 - 400 nm. Chọn bước sóng có đỉnh hấp thu cực đại và ổn định.. Khảo sát hệ dung môi: tiến hành thăm dò nồng độ acid thêm vào trong pha động để cho các pic tách gọn và hạn chế kéo đuôi  Nước acid formic 0,1% ( D) – ACN (C)  Nước acid formic 0,2% ( D) – ACN (C) Chương trình rửa giải: khai triển trên mẫu thử, khảo sát chế độ rửa giải sao cho các pic của cynarin, acid clorogenic, scolymosid, và cynarosid tách rõ so với pic kế cận, ngoài ra pic cần định lượng phải đạt các thông số sắc ký như độ tinh khiết pic, hệ số kéo đuôi (As), độ phân giải, hệ số dung lượng, số đĩa lý thuyết… Tốc độ dòng: triển khai trên mẫu thử với chương trình đã được lựa chọn như trên ở tốc độ dòng khác nhau (0,3 ml/phút; 0,35 ml/phút; 0,4 ml/phút; 0,45 ml/phút và 0,5 ml/phút). So sánh sắc ký đồ UPLC để chọn tốc độ dòng thích hợp.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.33

Nhiệt độ cột: triển khai trên mẫu thử với chương trình rửa giải và tốc độ dòng đã được lựa chọn với các nhiệt độ cột là 27 oC, 30 oC, 35 oC, 40 oC và lựa chọn nhiệt độ cột theo những tiêu chí đã đặt ra.

1.7.1.2. Khảo sát quy trình chiết xuất trên mẫu thử a. Khảo sát dung môi chiết xuất Lựa chọn dung môi chiết được nhiều hoạt chất cần định lượng và ít tạp chất nhất. Vì hợp chất cần chiết ở đây là polyphenol nên lựa chọn 4 loại dung môi là: nước, ethanol, methanol với nồng độ khác nhau và ethyl acetat. Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá Actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi khảo sát (methanol 40%, 70%, 100%; ethanol 40%, 70%, 96%; ethyl acetat và nước), lắc đều. Đun cách thủy trong 45 phút (các vial ngập trong nước ở 100 oC). Lấy vial ra để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn. Thể tích tiêm mẫu 3 μl. So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR trong dung môi khảo sát. b. Khảo sát nhiệt độ chiết Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi đã được khảo sát lắc đều. Đun trong bếp cách thủy ở 60 oC, 80 oC và 100 oC trong 45 phút. Lấy vial ra để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn. Thể tích tiêm mẫu 3 μl. So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR ở các nhiệt độ chiết xuất cần khảo sát. c. Khảo sát thời gian chiết Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi đã được khảo sát lắc đều. Đun trong bếp cách thủy ở nhiệt độ đã khảo sát ở trên trong 30 phút, 45 phút, 1 giờ, 1 giờ 30 phút, 2 giờ, 2 giờ 30 phút. Lấy vial ra để

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.34

nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn. Thể tích tiêm mẫu 3 μl. So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR ở các thời gian chiết xuất cần khảo sát. d. Khảo sát số lần chiết để chiết kiệt hoạt chất Tiến hành: cân chính xác 100 mg bột lá actisô vào vial 20 ml, thêm 10 ml dung môi đã được khảo sát lắc đều. Đun trong bếp cách thủy ở nhiệt độ và thời gian đã khảo sát ở trên. Lấy vial ra để nguội ở nhiệt độ phòng, lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Thêm dung môi cho đủ thể tích bình, lọc qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 μm trước khi khai triển trên UPLC theo điều kiện đã lựa chọn. Bã dược liệu dược chiết tiếp 3 lần nữa, mỗi lần 5 ml nước cất, thực hiện điều kiện tương tự như trên thu được dịch chiết 2, dịch chiết 3, dịch chiết 4. Thể tích tiêm mẫu 3 μl. So sánh diện tích pic của AC, CY, SCO, CR của 4 lần chiết.

1.7.1.3. Quy trình định lượng được xây dựng Chiết xuất: Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá khô Actisô cho vào vial 20 ml. Thêm khoảng 10 ml nước sôi. Chiết trong cách thủy ở 100 oC trong 90 phút. Lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Bã dược liệu được chiết tiếp lần 1 lần nữa với 5 ml nước sôi với cùng điều kiện như trên, lọc dịch chiết cho vào bình định mức, bổ sung nước đến vạch, lọc mẫu qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 µm trước khi tiến hành triển khai UPLC. Mẫu chuẩn: Hỗn hợp chuẩn CY, AC, SCO với nồng độ mỗi chất là 25 ppm trong methanol, riêng CR (25 ppm) được pha trong methanol 60%, siêu âm ở 80 oC. Định lượng: Mẫu thử và chuẩn (n = 3) sau khi lọc được tiêm vào hệ thống UPLC với điều kiện sắc ký như sau 

Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Acquity UPLC (Waters)



Đầu dò PDA, bước sóng phát hiện là 323 nm (CY, AC) và 349 nm (SCO, CR)

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.35



Cột sắc ký: CORTECS C18 (100 × 4,6 mm; 2,7 μm)



Pha động: nước acid fomic 0,2% (D) – ACN (C). Chương trình rửa giải tiệm tiến như sau: 10-14% C (2 phút); 14% C (4 phút); 14-17% C (0,5 phút); 17-19% C (2 phút); 19-20% C (5 phút); 20-21% C (1 phút); 21-22% C (6 phút); 20-10% C (0,5 phút);10% C (2,5 phút).



Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.



Lượng mẫu tiêm: 3 μl



Nhiệt độ cột: 27 oC



Thời gian phân tích: 23 phút.

Hàm lượng của CY, AC, SCO và CR trong lá và các chế phẩm Actisô được tính theo công thức: X

Trong đó:

k St  Cc   p  100 m (1  h) Sc

X : Hàm lượng của chất định lượng có trong dược liệu (%)

Sc: Diện tích đỉnh thu được của mẫu chuẩn (μV × s) St: Diện tích đỉnh thu được của mẫu thử (μV × s) Cc: Nồng độ của mẫu chuẩn (mg/ml) k: Độ pha loãng của mẫu đo (ml) m: Khối lượng cao (mg) h : độ ẩm của dược liệu p : độ tinh khiết của chất chuẩn (%)

1.7.2. Đánh giá quy trình định lượng 1.7.2.1. Kiểm tinh khiết chất đối chiếu Các chất đối chiếu được pha với methanol và tiến hành HPLC với điều kiện là: 595% ACN (20 phút); 95% ACN (5 phút), 95-5% ACN (5 phút), 5% ACN (5 phút). Sử dụng công cụ tính tích phân tự động để tính hàm lượng % của chất đối chiếu dựa vào phần trăm diện tích đỉnh và các đỉnh này phải đạt độ tinh khiết pic.

1.7.2.2. Tính tương thích hệ thống

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.36

Mục đích: để đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năng phù hợp có thể xác định độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống sắc ký đối với phép phân tích thực hiện. Tính tương thích được thực hiện bằng cách chạy lặp lại 6 lần trên 1 mẫu chuẩn và 1 mẫu thử theo các điều kiện đã được xác định. Ghi nhận các thông số sau: − Rt : thời gian lưu (phút) − S: diện tích đỉnh − N: số đĩa lý thuyết biểu kiến của cột sắc ký = hiệu năng cột − k’: hệ số dung lượng (capacity factor) − α : hệ số chọn lọc (seperation factor) − As: hệ số đối xứng = hệ số kéo đuôi (Asymmetry factor) − Rs: độ phân giải (resolution) Tính tương thích hệ thống đạt yêu cầu khi: − Rt, S: RSD% ≤ 2 − k’ ≥ 1,0 − 1,05 ≤ α ≤ 2,0 − 0,8 ≤ As≤ 1,5 − Rs >1,5 − N ≥ 2000

1.7.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính Pha các dung dịch mẹ: -

Dung dịch chuẩn acid clorogenic 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg acid clorogenic vào bình định mức 5 ml, hòa tan và điền vừa đủ thể tích bằng methanol .

-

Dung dịch chuẩn cynarin 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg cynarin vào bình định mức 5 ml, thêm methanol đến vạch .

-

Dung dịch chuẩn scolymosid 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg scolymosid vào bình định mức 5 ml, bổ sung thể tích vừa đủ bằng methanol .

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.37

-

Dung dịch chuẩn cynarosid 1 mg/ml: cân chính xác khoảng 5 mg cynarosid vào bình định mức 5 ml, thêm methanol 60%, siêu âm ở 80 oC đến khi tan hoàn toàn, và điền đủ thể tích bằng methanol 60% .

Pha dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu (dung dịch 1): Lấy 1 ml dung dịch mẹ đã pha ở trên cho vào bình định mức 5 ml, điền vừa đủ thể tích bằng methanol thu được dung dịch có nồng độ mỗi chất là 0,2 mg/ml (dung dịch 1). Từ dung dịch 1, pha các giai mẫu có nồng độ (ppm) của acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và cynarosid tương ứng như sau: Chất đối chiếu

dd 2

dd 3

dd 4

dd 5

dd 6

dd 7

dd 8

Acid clorogenic

100

50

25

10

5

2,5

0,1

Cynarin

100

50

25

10

5

2,5

0,1

Scolymosid

100

50

25

10

5

2,5

0,1

Cynarosid

100

50

25

10

5

2,5

0,1

Ghi chú: dd là dung dịch, đơn vị là ppm

Tiến hành triển khai trên UPLC 3 lần cho mỗi dung dịch chuẩn đối chiếu với điều kiện sắc ký đã khảo sát. Xác định sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của các dung dịch. Dùng phần mềm Excel để biện luận và đưa ra phương trình hồi qui tuyến tính.

1.7.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Tiến hành đo tín hiệu thu được từ mẫu chuẩn có nồng độ xác định. Giả sử tín hiệu tạp nhiễu đường nền thu được từ mẫu trắng là N, tín hiệu của pic chuẩn trong mẫu chuẩn A có nồng độ nhất định thu được là S. Thiết lập tỷ lệ S/N. LOD có S/N = 2/1 hay 3/1 và LOQ có S/N = 9/1 hay 10/1 là chấp nhận được. Từ tín hiệu S tính nồng độ đem đo và suy ra LOD, LOQ.

1.7.2.5. Khảo sát tính chọn lọc Qui trình được tiến hành xác định tính đặc hiệu như sau: − Dung dịch mẫu trắng: dung dịch methanol 60 % . − Dung dịch hỗn hợp chất đối chiếu: cynarin, acid clorogenic, scolymosid, cynarosid.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.38

− Dung dịch mẫu thử: tiến hành như qui trình chiết xuất đã khảo sát . − Dung dịch thử thêm chuẩn: thêm 100 µl hỗn hợp chuẩn vào 100 µl dung dịch thử. Triển khai trên HPLC 4 dung dịch trên với điều kiện đã khảo sát, quan sát và so sánh thời gian lưu, phổ UV và pic của các chất định lượng trong các mẫu trên. Yêu cầu: − Thời gian lưu của thành phần cần định lượng trong mẫu thử phải tương đương thời gian lưu của mẫu đối chiếu, đồng thời mẫu trắng không có đỉnh trùng với đỉnh của thành phần cần định lượng. − Phổ UV của cynarin, acid clorogenic, scolymosid và cynarosid trong mẫu chuẩn, mẫu thử và thử thêm chuẩn phải tương đương nhau. − Khi thêm 1 lượng chất đối chiếu vào mẫu thử, diện tích đỉnh của hợp chất cần định lượng phải tăng lên so với trước khi thêm chất đối chiếu và pic của chất cần định lượng phải đạt độ tinh khiết pic.

1.7.2.6. Khảo sát độ lặp lại Độ lặp lại để đánh giá mức độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm khi phương pháp được áp dụng lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu. Độ lặp lại của phương pháp phân tích thường được thể hiện bằng độ lệch chuẩn (standard deviation-SD) hay độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation-RSD) của 1 loạt các lần đo mẫu. Để xác định độ lặp lại, người ta thường tiến hành định lượng 6 lần trong cùng 1 điều kiện và tính độ lệch chuẩn tương đối RSD%. Giá trị RSD thay đổi tuỳ theo hàm lượng % chất phân tích có trong mẫu thử [19] (xem Bảng 2.9). Bảng 2.6. Đánh giá độ chính xác theo nồng độ chất phân tích Hàm lượng

Tỷ số

Đơn vị

nồng độ

tương ứng

100

1

100%

1,3

10

10-1

10%

2,8

1

10-2

1%

2,7

0,1

10-3

0,1%

3,7

0,01

10-4

100 ppm

5,3

chất phân tích (%)

.

RSD%

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.39

Hàm lượng

Tỷ số

Đơn vị

nồng độ

tương ứng

0,001

10-5

10 ppm

7,3

0,0001

10-6

1 ppm

11

0,00001

10-7

100 ppb

15

0,000001

10-8

10 ppb

21

chất phân tích (%)

RSD%

1.7.2.7. Khảo sát độ đúng hay độ phục hồi Xác định hàm lượng cynarin, acid clorogenic, scolymosid và cynarosid trong mẫu thử bằng phương pháp đã khảo sát và sau đó thêm chất đối chiếu vào dược liệu. Lượng chuẩn thêm vào bằng 80%, 100% và 120% hàm lượng các chất này so với nồng độ định lượng, thực hiện 3 lần cho mỗi nồng độ. Các mẫu được xử lý và phân tích theo điều kiện sắc ký đã chọn. Từ đó xác định tỉ lệ phục hồi Y. Tỉ lệ phục hồi tính theo công thức:

Y  Trong đó:



X r  X a 

 100

Xr: lượng tìm thấy.

Xa: lượng thêm vào.

Tỷ lệ phục hồi được đánh giá tuỳ theo hàm lượng của chất định lượng có trong mẫu thử [19] (xem Bảng 2.10) Bảng 2.7. Mối liên quan giữa tỷ lệ phục hồi và nồng độ chất phân tích Nồng độ

Tỷ số

Đơn vị

Tỷ lệ

nồng độ

tương ứng

phục hồi (%)

100

1

100 %

98 – 102

10

10-1

10 %

98 – 102

1

10-2

1%

97 – 103

0,1

10-3

0,1 %

95 – 105

0,01

10-4

100 ppm

90 – 107

0,001

10-5

10 ppm

80 – 110

0,0001

10-6

1 ppm

80 – 110

0,00001

10-7

100 ppb

80 – 110

0,000001

10-8

chất phân tích (%)

.

10 pb

60 – 115

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.40

1.7.2.8. Định lượng cynarin, acid clorogenic, scolymosid, và cynarosid Lá, gân lá, hoa, rễ của cây Actisô được tiến hành định lượng theo quy trình đã xây dựng. Hàm lượng của cynarin, acid clorogenic, scolymosid và cynarosid trong lá và các chế phẩm Actisô được tính theo công thức: X

Trong đó:

St k  Cc   p  100 Sc m (1  h)

X : Hàm lượng của chất định lượng có trong dược liệu (%) Sc: Diện tích đỉnh thu được của mẫu chuẩn (μV × s) St: Diện tích đỉnh thu được của mẫu thử (μV × s) Cc: Nồng độ của mẫu chuẩn (mg/ml) k: Độ pha loãng của mẫu đo (ml) m: Khối lượng cao (mg) h : độ ẩm của dược liệu p : độ tinh khiết của chất chuẩn (%)

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.41

CHƯƠNG 2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 2.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CY, AC, SCO, CR TRONG LÁ ACTISÔ BẰNG UPLC-PDA 2.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký UPLC  Khảo sát bước sóng phát hiện Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả trình bày ở Hình 3.12. – Hình 3.14. 323 nm

Hình 3.10. Sắc ký đồ của AC, CY, SCO, CYR chuẩn ở bước sóng 323 nm

349 nm

Hình 3.11. Sắc ký đồ của AC,CY,SCO,CYR chuẩn ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.42

Hình 3.12. Phổ hấp thu UV của acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid

Nhận xét: -

Acid clorogenic có đỉnh hấp thu cực đại tại 217,5; 241,2; và 325,7 nm.

-

Cynarin có đỉnh hấp thu cực đại tại 217,5; 242,4; và 322,1 nm.

-

Scolymosid có đỉnh hấp thu cực đại tại 254,2 và 349,1 nm.

-

Cynarosid có đỉnh hấp thu cực đại tại 254,2 và 349,1 nm.

Nhận thấy, ở bước sóng 347 – 349nm, scolymosid va cynarosid đạt độ hấp thu cao nhất nhưng 2 pic acid clorogenic và cynarin khá thấp trong khi ở bước sóng 320 – 326 nm, cynarin và acid clorogenic đều có độ hấp thu cao nhất. Do vậy, để định lượng chính xác hàm lượng các chất trong lá, chọn bước sóng 323 nm làm bước sóng phát hiện đồng thời acid clorogenic, cynarin và bước sóng 349 nm làm bước sóng phát hiện đồng thời scolymosid và cynarosid.  Khảo sát hệ dung môi pha động Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả trình bày ở Hình 3.15. Acid formic 0,1%

Acid formic 0,2%

4 8

4

8

Hình 3.13. SKĐ khảo sát dung môi pha động

Nhận xét: acid fomic 0,1% không tách được pic CR với pic 8. Hơn nữa, khả năng tách của pic AC với pic 4 kém hơn so với acid formic 0,2%. Do vậy, chọn pha động

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.43

có chứa acid formic 0,2%.  Khảo sát chương trình chạy Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả trình bày ở Hình 3.16. Điều kiện A AC

A

CY SCO

4

CR

\ Điều kiện B: AC

BB

4

Điều kiện C:

CY SCO CR

AC

CC 4

CY

SCO CR

8

Điều kiện D: AC

D 4

.

CY

SCO CR

8

8

8

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.44

Điều kiện E: AC

E

4

CY

SCO

CR

8

Hình 3.14. SKĐ khảo sát chương trình chạy

Pha động là nước acid formic 0,2% (D) - ACN (C). Các chương trình tiệm tiến khảo sát bao gồm: -

Điều kiện A: 10-12% C (2 phút); 12-15% C (5 phút); 15-17% C (1 phút); 17% C (7 phút); 1725% C (1 phút); 25% C (4 phút); 25-10% C ( 0,5 phút); 10% C (4,5 phút)

-

Điều kiện B: 10-14% C (2 phút); 14% C (4 phút); 14-17% C (1 phút); 17% C (8 phút); 17-25% C (1 phút); 25-10% C ( 0,5 phút); 10% C (2,5 phút).

-

Điều kiện C: 10-15% C (2 phút); 15% C (4 phút); 15-18% C (1 phút); 18% C (6 phút); 18-25% C (1 phút); 25% C (3 phút); 25-10% C ( 0,5 phút); 10% C (4,5 phút)

-

Điều kiện D: 10-12% C (2 phút); 12-14% C (4 phút); 14-15% C (0,5 phút); 15-19% C (1,5 phút phút); 19% C (11 phút); 19-22% C (1 phút); 22-10% C (0,5 phút); 10% C (3,5 phút).

-

Điều kiện E: 10-14% C (2 phút); 14% C (4 phút); 14-17% C (0,5 phút); 17-19% C (1,5 phút); 1920% C (5 phút); 20-21% C (1 phút); 21-22% C (6 phút); 22-10% C (0,5 phút); 10% C (2,5 phút).

Nhận xét: -

Điều kiện A: pic AC tách rõ với pic 4. Tuy nhiên, các pic có thời gian lưu tương đối dài và pic CR chưa tách được với pic 8.

-

Điều kiện B, C, D: pic AC và pic 4 tách rõ, thời gian lưu của các pic phía sau đã được cải thiện. Tuy nhiên pic CR và pic 8 vẫn chưa tách được.

-

Điều kiện E:tất cả các pic định lượng đều tách khá tốt với pic kế cận (Rs > 1,5), các thông số sắc ký gồm hệ số kéo đuôi, độ tinh khiết pic đều đạt yêu cầu. .

Kết luận: chọn điều kiện E, chương trình tiệm tiến được mô tả ở Bảng 3.11.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.45

Bảng 3.8. Chương trình chạy tiệm tiến được lựa chọn

Phút

Tốc độ dòng (ml/phút)

Kênh C (%) Acetonitril acid formic 0,1%

Kênh D (%) Nước acid formic 0,2%

0

0,4

10

90

2

0,4

14

86

6

0,4

14

86

6,5

0,4

17

83

8

0,4

19

81

13

0,4

20

80

14

0,4

21

79

20

0,4

22

78

20,5

0,4

10

90

23

0,4

10

90

 Khảo sát tốc độ dòng Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả trình bày ở Hình 3.17. AC

0,3 ml/phút

AC

0,35 ml/phút

CY

SCO

0,4 ml/phút

AC

CY

CY

CR

SCO

AC

CR

0,45 ml/phút

CY SCO CR

CR SCO

Hình 3.15. SKĐ khảo sát tốc độ dòng

Nhận xét: tốc độ dòng càng thấp (0,3 ml/phút) thì thời gian lưu càng tăng. Ở tốc độ dòng càng cao (0,45 hay 0,5 ml/phút) pic CR càng khó tách với pic 8. Tốc độ dòng

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.46

0,35 và 0,4ml/phút tách khá tốt pic tuy nhiên 0,4 ml/phút cho thời gian lưu ngắn hơn, tiêt kiệm thời gian. Vì thế chọn tốc độ dòng 0,4 ml/phút.  Khảo sát nhiệt độ cột Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả trình bày ở Hình 3.18. 27 oC

AC

AC

CY

CY SCO CR

AC

35 oC

CY

SCO

30 oC

SCO

CR

40 oC

AC

CR

CY

SCO

CR

Hình 3.16. SKĐ khảo sát nhiệt độ cột

Nhận xét: mặc dù ở 30 oC, 35 oC, 40 oC thì thời gian lưu được rút ngắn lại nhưng không đáng kể. ở nhiệt độ cao làm khó việc tách pic CYR với pic 8 hơn. Kết luận: lựa chọn nhiệt độ cột 27 oC. Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký: 

Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Acquity UPLC (Waters)



Đầu dò PDA



Bước sóng phát hiện: 323 nm và 349 nm



Cột sắc ký: CORTECS C18 (100 × 4,6 mm; 2,7 μm)



Pha động: nước acid fomic 0,2% (D) – ACN (C). Chương trình rửa giải tiệm tiến như sau: 10-14% C (2 phút); 14% C (4 phút); 14-17% C (0,5 phút); 17-19% C (2 phút); 19-20% C (5 phút); 20-21% C (1 phút); 21-22% C (6 phút); 20-10% C (0,5 phút);10% C (2,5 phút).

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.47



Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.



Lượng mẫu tiêm: 3 μl



Nhiệt độ cột: 27 oC



Thời gian phân tích: 23 phút.

So sánh HPLC và UPLC ứng dụng trong định tính, định lượng AC, CY, SCO, CR trong lá Actisô: Điều kiện phân tích và SKĐ định lượng AC, CY, SCO và CR bằng phương pháp HPLC của nhóm nghiên cứu đã thực hiện năm 2011 [5]: 

Máy HPLC Waters 2695 (Alliance), Đầu dò PDA 2996



Bước sóng phát hiện: 323 nm (AC và CY), 349 nm (SCO và CR).



Cột sắc ký Sunfire C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm)



Pha động: nước acid formic 0,1% (A) – ACN (B). Chương trình rửa giải: 8-15% B (20 phút); 15% B (1 phút); 15-30% B (9 phút); 30% B (5 phút); 30-8% B (1 phút); 8% (9 phút).



Tốc độ dòng: 1 ml/phút.



Lượng mẫu tiêm: 30 μl



Nhiệt độ cột: 25 oC



Thời gian phân tích: 45 phút HPLC AC

CY SCO

CR

Hình 3.17. SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp HPLC UPLC

AC

CY

SCO

CR

Hình 3.18. SKĐ định lượng AC, CY,SCO, CR bằng phương pháp UPLC

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.48

Nhận xét: Phương pháp định lượng bằng UPLC có thời gian phân tích nhanh hơn (23 phút so với HPLC là 45 phút). Ngoài ra, tốc độ dòng UPLC (0,4 ml/phút) thấp hơn HPLC (1 ml/phút) do đó tiết kiệm được dung môi hơn. Bên cạnh đó, phương pháp UPLC có độ nhạy và độ phân giải tốt hơn nên tách các chất tốt hơn. Cụ thể, ở điều kiện HPLC pic cynarosid không tách được với pic 8 (xem Hình 3.19-20) là một dẫn xuất của luteolin vì cho phổ UV tương tự luteolin. Trong khi đó, điều kiện UPLC đã tách được 2 pic này do đó kết quả định lượng sẽ chính xác hơn. Bảng 3.9. Bảng so sánh 2 điều kiện HPLC và UPLC

HPLC

UPLC

Khả năng tách pic

pic CR chưa tách ra được pic 8

pic CR đã tách hoàn toàn với pic 8

Thời gian phân tích

45 phút

23 phút

Tốc độ dòng

1 ml/phút

0,4 ml/phút

Lượng tiêm mẫu

30 μl

3 μl

2.1.2. Khảo sát điều kiện chiết xuất lá Actisô 2.1.2.1. Khảo sát dung môi chiết Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả được trình bày ở Hình 3.21-3.22. và Bảng 3.13.

Hình 3.19. Biểu đồ độ tan của AC, CY, SCO và CR

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.49

Bảng 3.10. Bảng độ tan của AC, CY, SCO, CR Dung môi

AC

CY

SCO

CR

MeOH 40%

965262

28791

166483

261317

MeOH 70%

1115768

11697

202251

345587

MeOH 100%

675368

9768

176082

292887

EtOH 40%

985080

13941

176309

286870

EtOH 70%

974344

15833

183871

298059

EtOH 96%

828104

16497

189404

285026

EA

92937

0

22559

14130

Nước

727934

140069

146280

209853

AC

SCO CR CY

Hình 3.20. SKĐ của 2 dung môi chiết EtOH 70% và Nước *đường màu đỏ: dung môi chiết là nước *đường màu xanh lá: dung môi chiết là EtOH 70%

Nhận xét: methanol 70% chiết được nhiều nhất 3 chất là AC, SCO và CR nhưng lại chiết được rất ít CY, tín hiệu pic CY gần như không thấy trên sắc ký đồ (Hình 3.22) nên rất khó định lượng. Trong khi đó nước là dung môi chiết tốt nhất đối với CY nên cho tín hiệu pic khá rõ. Mặc dù nước không phải là dung môi chiết tốt nhất cho 3 chất còn lại nhưng 3 chất này tan cũng tương đối tốt trong nước và cho tín hiệu pic rõ trên sắc ký đồ. Do đó chọn dung môi chiết xuất là nước.

2.1.2.2. Khảo sát nhiệt độ chiết Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả được trình bày ở Hình 3.23-3.24 và Bảng 3.14. Kết quả cho thấy ở 3 nhiệt độ khảo sát (60 oC, 80 oC và 100 oC) cho thấy hàm lượng SCO và CR chiết được gần như nhau. Ở 60 oC, hàm lượng AC chiết được nhiều

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.50

nhất nhưng lại chiết được CY ít nhất vì thế tín hiệu pic không rõ trên sắc ký đồ nên rất khó định lượng. Trong khi đó, ở 100 oC cho tín hiệu pic của CY khá cao và pic của AC cũng tương đối rõ (Hình 3.24). Do đó chọn nhiệt độ chiết ở 100 oC. Bảng 3.11. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết của AC, CY, SCO, CR Nhiệt độ

AC

CY

SCO

CR

60 độ

934623

27588

148737

178087

80 độ

714838

59083

147630

179904

100 độ

727934

140069

146280

209854

Hình 3.21. Biểu đồ nhiệt độ chiết AC, CY,SCO và CR AC

SCO

CR

CY

Hình 3.22. SKĐ của 2 nhiệt độ chiết 60 oC và 100 oC *đường xanh: chiết 100 oC – đường đỏ: chiết 60 oC

2.1.2.3. Khảo sát thời gian chiết Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả được trình bày ở Hình 3.25. và Bảng 3.15.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.51

Bảng 3.12. Bảng khảo sát thời gian chiết của AC, CY, SCO, CR Thời gian (phút)

AC

CY

SCO

CR

30

788687

114098

145589

198504

45

727934

140069

146280

209854

60

735565

213016

149949

210846

90

643841

289338

148779

219783

120

612213

364595

149437

223340

150

552364

392267

145022

218444

Hình 3.23. Biểu đồ thời gian chiết AC, CY, SCO và CR

Nhận xét: SCO và CR: hàm lượng chiết gần như không thay đổi theo thời gian từ 30-150p AC và CY: có sự thay đổi hàm lượng chiết ngược nhau theo thời gian (xem Hình 3.25). Thời gian chiết càng lâu thì hàm lượng CY càng tăng nhưng AC càng giảm. Ở thời gian 45 và 60 phút hàm lượng AC bắt đầu giảm và hàm lượng cynarin tăng nhưng chưa nhiều, diện tích đỉnh còn rất thấp do đó quy trình định lượng sẽ có độ đúng và độ chính xác không cao. Ở thời gian chiết 90 phút cho diện tích đỉnh của CY cao gấp 3 lần so với 30 phút, do đó chọn 90 phút là thời gian chiết xuất định lượng. Các thời gian sau 90 phút mặc dù hàm lượng CY cao nhưng không chọn do tốn nhiều thời gian.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.52

2.1.2.4. Khảo sát số lần chiết Tiến hành như mục 2.2.1.1. Kết quả cho thấy, sau 2 lần chiết cho hàm lượng acid clorogenic, cynarin, scolymosid chiết được trên 97% và cynarosid trên 94%. Do đó chọn số lần chiết là 2 lần (xem Hình 3.26 và Bảng 3.16) Bảng 3.13. Bảng khảo sát số lần chiết của AC, CY, SCO và CR Lần chiết

AC

CY

SCO

CR

lần 1

630013

328379

149905

242909

lần 2

27010

31032

17383

39616

lần 3

6754

2448

4680

14959

lần 4

3983

597

873

2451

% lần 1

94,35

90,60

86,73

80,99

% lần 2

4,04

8,56

10,06

13,21

% lần 3

1,01

0,67

2,71

5,00

% lần 4

0,60

0,16

0,51

0,82

Tổng (%) lần chiết 1 và 2

98,35

99,16

96,79

94,2

Hình 3.24. Biêu đồ các lần chiết AC, CY, SCO và CR

Quy trình chiết xuất đã khảo sát: Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá khô Actisô cho vào vial 20 ml. Thêm khoảng 10 ml nước sôi. Chiết trong cách thủy ở 100 oC trong 90 phút. Lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Bã dược liệu được chiết tiếp lần 1 lần nữa với 5 ml nước sôi với cùng điều kiện như trên, lọc dịch chiết cho vào bình định mức, bổ sung nước đến vạch, lọc mẫu qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 µm trước khi tiến hành triển khai UPLC.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.53

2.1.3. Quy trình định lượng CY, AC, CR và SCO Chiết xuất: Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá khô Actisô cho vào vial 20 ml. Thêm khoảng 10 ml nước sôi. Chiết trong cách thủy ở 100 oC trong 90 phút. Lọc dịch chiết qua bông vào bình định mức 25 ml. Bã dược liệu được chiết tiếp lần 1 lần nữa với 5 ml nước sôi với cùng điều kiện như trên, lọc dịch chiết cho vào bình định mức, bổ sung nước đến vạch, lọc mẫu qua màng lọc milipore cellulose acetat 0,22 µm trước khi tiến hành triển khai UPLC. Mẫu chuẩn: Hỗn hợp chuẩn CY, AC, SCO với nồng độ mỗi chất là 25 ppm trong methanol, riêng CR (25 ppm) được pha trong methanol 60%, siêu âm ở 80 oC. Định lượng: Mẫu thử và chuẩn (n = 3) sau khi lọc được tiêm vào hệ thống UPLC với điều kiện sắc ký như sau 

Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng Acquity UPLC (Waters)



Đầu dò PDA, bước sóng phát hiện là 323 nm (CY, AC) và 349 nm (SCO, CR)



Cột sắc ký: CORTECS C18 (100 × 4,6 mm; 2,7 μm)



Pha động: nước acid fomic 0,2% (D) – ACN (C). Chương trình rửa giải tiệm tiến như sau: 10-14% C (2 phút); 14% C (4 phút); 14-17% C (0,5 phút); 17-19% C (2 phút); 19-20% C (5 phút); 20-21% C (1 phút); 21-22% C (6 phút); 20-10% C (0,5 phút);10% C (2,5 phút).



Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút.



Lượng mẫu tiêm: 3 μl



Nhiệt độ cột: 27 oC



Thời gian phân tích: 23 phút.

Hàm lượng của CY, AC, SCO và CR trong lá và các chế phẩm Actisô được tính theo công thức: X

.

St k  Cc   p  100 Sc m (1  h)

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.54

Trong đó:

X : Hàm lượng của chất định lượng có trong dược liệu (%)

Sc: Diện tích đỉnh thu được của mẫu chuẩn (μV × s) St: Diện tích đỉnh thu được của mẫu thử (μV × s) Cc: Nồng độ của mẫu chuẩn (mg/ml) k: Độ pha loãng của mẫu đo (ml) m: Khối lượng cao (mg) h : độ ẩm của dược liệu p : độ tinh khiết của chất chuẩn (%)

2.2. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 2.2.1. Khảo sát độ tinh khiết của các chất đối chiếu Các chất đối chiếu cynarin (CY), acid clorogenic (AC), scolymosid (SCO), cynarosid (CR) đã được thử tinh khiết trên UPLC với hàm lượng lần lượt là: 98,24%; 99,55%; 98,89%, 91,53%.  Khảo sát độ tinh khiết của cynarin

Hình 2.19. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập được

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.55

Bảng 2.10. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của hợp chất đã phân lập

STT

Tên pic

tR

Diện tích đỉnh

% Diện tích đỉnh

1

Cynarin

9,082

6537273

98,24

2

9,479

67520

1,01

3

30,436

49866

0,75

Nhận xét: hàm lượng tạp có trong cynarin điều chế tính theo % diện tích pic là 1,76 %.  Khảo sát độ tinh khiết của acid chlorogenic

Hình 2.25. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của acid clorogenic phân lập Bảng 2.14. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của hợp chất đã phân lập STT

Tên pic

tR

Diện tích đỉnh

% diện tích đỉnh

1

Acid clorogenic

11,788

14660699

99,55

2

Tạp

12,356

66773

0,45

Kết luận: độ tinh khiết của acid chlorogenic trên HPLC là 99,55%.  Khảo sát độ tinh khiết của cynarosid

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.56

Hình 2.26. Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của cynarosid phân lập Bảng 2.15. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của cynarosid phân lập STT

Tên pic

tR

Diện tích đỉnh

% diện tích đỉnh

1

Cynarosid

15,853

12959063

98,89

2

Tạp

15,237

145135

1,11

Kết luận: độ tinh khiết của cynarosid phân lập là 98,89 %.  Khảo sát độ tinh khiết của scolymosid

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.57

Hình 3.27. SKĐ kiểm tra độ tinh khiết của scolymosid Bảng 3.16. Độ tinh khiết của các chất chuẩn acid clorogenic

cynarin

scolymosid

cynarosid

99,55%

98,24%

98,89%

91,53%

Độ tinh khiết

2.2.2. Tính tương thích của hệ thống Tiến hành: mẫu chuẩn và mẫu thử được chuẩn bị như ở Mục 2.2.2.1. Triển khai trên UPLC như điều kiện đã khảo sát, bơm 6 lần liên tiếp trên cùng một mẫu chuẩn và mẫu thử. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.17 – 3.18, Hình 3.27 – 3.28, phụ lục 1 và phụ lục 2.

Hình 3.28. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu thử

Hình 3.29. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống của mẫu chuẩn

Bảng 3.17. Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu thử Rt

S

k’

Rs

As

α

N

A.clorogenic

5,6

774333

2,7

11,8

1,4

1,4

41284

Cynarin

8,5

180756

4,7

18,0

1,1

1,6

33730

Scolymosid

11,8

155092

6,9

22,4

1,1

1,5

176959

Cynarosid

12,7

210675

7,5

6,9

1,1

1,1

118398

RSD ≤ 2

RSD ≤ 2

k’ ≥ 1

Rs > 1,5

0,8 ≤ As ≤1,5

1,05 ≤ α ≤ 2,0

N≥ 2000

Yêu cầu

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.58

Bảng 3.18. Kết quả giá trị trung bình của thông số các pic trong mẫu chuẩn Rt

S

k’

A.clorogenic

5,7

668078

2,8

Cynarin

9,0

935151

5,0

20,4

1,1

1,8

29809

Scolymosid

12,0

366852

7,0

18,9

1,2

1,4

185083

Cynarosid

13,0

470240

7,7

7,4

1,1

1,1

128090

RSD ≤ 2

RSD ≤ 2

k’ ≥ 1

Rs > 1,5

0,8 ≤ As ≤1,5

1,05 ≤ α ≤ 2,0

N≥ 2000

Yêu cầu

Rs

As

α

N

1,5

33098

Nhận xét: RSD của các thông số diện tích đỉnh (S), thời gian lưu (tR) đều < 2%, các thông số khác đều đạt yêu cầu định lượng. Khảo sát độ ổn định của chương trình rửa giải: Mẫu thử và mẫu chuẩn được tiêm lặp lại 6 lần và triển khai rửa giải với điều kiện sắc ký đã khảo sát. Kết quả được trình bày ở bảng sau: Bảng 19. Khảo sát độ ổn định của chương trình rửa giải trên mẫu thử Thời gian lưu (tR)

STT

Diện tích đỉnh (S)

AC

CY

SCO

CR

AC

CY

SCO

CR

1.

5,59

8,60

11,84

12,74

773.404

178.963

154.003

209.965

2.

5,56

8,53

11,83

12,73

777.087

181.076

154.367

211.568

3.

5,56

8,51

11,82

12,71

774.404

181.141

157.446

211.277

4.

5,56

8,52

11,81

12,70

771.054

180.546

156.783

210.664

5.

5,55

8,48

11,81

12,70

776.915

181.662

154.075

210.258

6.

5,55

8,48

11,79

12,67

773.137

181.148

153.880

210.320

TB

5,56

8,52

11,82

12,71

774.334

180756

155.092

210.675

Std.Dev.

0,013

0,045

0,018

0,025

2337,8

947,2

1588,6

626,6

RSD

0,2

0,5

0,2

0,2

0,3

0,5

1,0

0,3

Bảng 20. Khảo sát độ ổn định của chương trình rửa giải trên mẫu chuẩn Thời gian lưu (tR)

STT

Diện tích đỉnh (S) (C = 0,25 mg/ml)

AC

CY

SCO

CR

AC

CY

SCO

CR

1.

5,70

9,07

12,05

13,00

665.864

936.096

366.819

470.688

2.

5,71

9,09

12,05

13,00

661.851

931.423

365.316

467.496

3.

5,68

9,02

12,04

12,99

668.965

932.135

365.235

468.196

4.

5,69

9,03

12,05

13,00

669.823

931.605

365.896

469.206

5.

5,69

9,02

12,03

12,97

671.848

935.974

367.675

470.745

6.

5,66

8,95

12,00

12,94

670.118

943.672

370.174

475.106

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.59

TB

5,69

9,03

12,04

12,98

668.078

935.151

366.852

470.240

Std.Dev.

0,015

0,049

0,021

0,027

3630,1

4684,8

1876,3

2716,7

RSD

0,3

0,5

0,2

0,2

0,5

0,5

0,5

0,6

Kết luận: thời gian lưu và diện tích đỉnh của CY, AC, SCO, CR trong mẫu thử và mẫu chuẩn của 6 lần tiêm có độ lặp lại cao với RSD trong khoảng từ 0,2-1.

2.2.3. Tính tuyến tính Tiến hành như Mục 3.2.2. Kết quả được trình bày ở Hình 3.29 – 3.32  Đường tuyến tính của acid clorogenic: Nồng độ (ug/ml)

S đỉnh

1

22792

2,5

63362

5

129474

10

265368

25

634589

50

1213620

100

2382295

200

4565796

Hình 3.30. Đường tuyến tính của acid clorogenic

Dùng phần mềm Excel để tính toán: Phương trình tương quan hồi quy: y = 228634x + 35104

R2 = 0,9994

Trắc nghiệm F: tính tương thích của phương trình hồi quy: F0,05= 5,98737761 F = 10668 > F0.05: phương trình tương thích với độ tin cậy 95%. Trắc nghiệm t: ý nghĩa của các hệ số:

t0,05 = 2,4469119

Hệ số b có t = 1,943698 < t0,05: hệ số b không có ý nghĩa. Hệ số a có t = 103,286 > t0,05: hệ số a có ý nghĩa. Vậy phương trình tuyến tính của acid clorogenic là: ŷ = 22863x

 Đường tuyến tính của cynarin: Nồng độ (ug/ml)

S đỉnh

1

25491

2,5

88831

5

181755

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.60

10

372343

25

887701

50

1671152

100

3265820

200

6226377

Hình 3.31. Đường tuyến tính của cynarin

Dùng phần mềm Excel để tính toán: Phương trình tương quan hồi quy: y = 31174x + 56579

R2 = 0,9992

Trắc nghiệm F: tính tương thích của phương trình hồi quy F0,05= 5,98737761 F = 7787,408 > F0.05: phương trình tương thích với độ tin cậy 95%. Trắc nghiệm t: ý nghĩa của các hệ số t0,05 = 2,44691185 Hệ số b có t = 1,963008 < t0,05: hệ số b không có ý nghĩa. Hệ số a có t = 88,24629 > t0,05: hệ số a có ý nghĩa. Vậy phương trình tuyến tính của cynarin là: ŷ = 31174x

 Đường tuyến tính của scolymosid: Nồng độ (ug/ml)

S đỉnh

1

21166

2,5

53891

5

107695

10

216935

25

509788

50

955247

100

1867258

200

3548279

Hình 3.32. Đường tuyến tính của scolymosid

Dùng phần mềm Excel để tính toán: Phương trình tương quan hồi quy: y = 17747x + 37107 R2 = 0,9992 Trắc nghiệm F: tính tương thích của phương trình hồi quy F0,05= 5,98737761 F = 7487,52 > F0.05: phương trình tương thích với độ tin cậy 95%. Trắc nghiệm t: ý nghĩa của các hệ số

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.61

t0,05 = 2,44691185 Hệ số b có t = 2,217477 < t0,05: hệ số b không có ý nghĩa. Hệ số a có t = 86,53046 > t0,05: hệ số a có ý nghĩa. Vậy phương trình tuyến tính của scolymosid là: ŷ = 17747x

 Đường tuyến tính của cynarosid: Nồng độ (ug/ml)

S đỉnh

1

27192

2,5

68510

5

136913

10

277426

25

653179

50

1221937

100

2388065

200

4540301

Hình 3.33. Đường tuyến tính của cynarosid

Dùng phần mềm Excel để tính toán: Phương trình tương quan hồi quy: y = 22708x + 47247

R2 = 0,9992

Trắc nghiệm F: tính tương thích của phương trình hồi quy F0,05= 5,98737761 F = 7527,809 > F0,05: phương trình tương thích với độ tin cậy 95%. Trắc nghiệm t: ý nghĩa của các hệ số t0,05 = 2,44691185 Hệ số b có t = 2,212531 < t0,05: hệ số b không có ý nghĩa. Hệ số a có t = 86,76295 > t0,05: hệ số a có ý nghĩa. Vậy phương trình tuyến tính của acid clorogenic là: ŷ = 22708x

2.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Tiến hành như Mục 3.2.3. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.19 và Hình 3.33– 3.36.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.62

Hình 3.34. sắc ký đồ của acid clorogenic ở nồng độ LOD

Hình 3.35. Sắc ký đồ của cynarin ở nồng độ LOD

Hình 3.36. Sắc ký đồ của cynarosid ở nồng độ LOD

Hình 3.37. Sắc ký đồ của acid scolymosid ở nồng độ LOD

Bảng 3.21. Kết quả khảo sát LOD và LOQ của AC, CY, SCO, CR Acid clorgenic

Cynarin

Scolymosid

cynarosid

LOD (ppm)

0,03

0,03

0,06

0,06

LOQ (ppm)

0,13

0,13

0,25

0,25

2.2.5. Khảo sát tính chọn lọc Thực hiện theo Mục 3.2.5. Kết quả được trình bày ở Hình 3.37 – 3.41 Mẫu thử Mẫu chuẩn Mẫu thử thêm chuẩn Mẫu trắng

Hình 3.38. Sắc ký đồ khảo sát tính chọn lọc

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.63

A

C

B Hình 3.39 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của acid clorogenic

B

A

C

Hình 3.40 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarin

C

B

A

Hình 3.41 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của scolymosid

A

C

B Hình 3.42 Phổ UV khảo sát tính chọn lọc của cynarosid (A) Mẫu thử

(B) Mẫu chuẩn

(C) Mẫu thử thêm chuẩn

Nhận xét: Qui trình đạt độ chọn lọc do thời gian lưu, phổ UV của pic cynarin, acid clorogenic, scolymosid, cynarosid trong các dung dịch chuẩn, thử và thử thêm chuẩn tương đương nhau. Mẫu trắng không có tín hiệu của 4 pic này. Pic của cynarin, acid clorogenic, scolymosid, cynarosid không có thành phần nào khác khi sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic.

2.2.6. Khảo sát độ lặp lại

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.64

Tiến hành với 6 mẫu thử như Mục 2.2.2.4. Mỗi mẫu tiến hành sắc ký 1 lần ở điều kiện đã chọn. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.21 – 3.24 và Hình 3.42 – 3.43. 349 nm

323 nm

Hình 3.43. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của acid clorogenic và cynarin

Hình 3.44. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại của scolymosid và cynarosid

Bảng 3.22. Độ lặp lại acid clorogenic STT mẫu (Mn)

Khối lượng mẫu cân (g)

Diện tích đỉnh

Hàm lượng %

M1

100,12

703558

0,706

M2

100,17

694259

0,696

M3

100,2

691291

0,693

M4

100,07

677854

0,681

M5

100,16

680256

0,682

M6

100,00

685600

0,689

e = ± 0,024

TB

100,12

688803

0,691

Khoảng tin cậy:

SD %

9559

0,009

X% = 0,691 ± 0,024

RSD %

1,39

1,367

Xử lý kết quả n=6 TB = 0,701% SD = 0,010% RSD = 1,37% P = 0,95; t = 2,57

Bảng 3.23. Độ lặp lại của cynarin STT mẫu (Mn)

Khối lượng mẫu cân (g)

M1

100,12

334391

0,233

n=6

M2

100,17

340872

0,238

TB = 0,232%

M3

100,20

324297

0,226

SD = 0,005

M4

100,07

334367

0,233

RSD = 2,16 %

M5

100,16

323670

0,226

P = 0,95; t = 2,57

M6

100,00

337718

0,236

e = ± 0,013

TB

100,12

332552

0,232

7066

0,005

SD %

.

Diện tích đỉnh

Hàm lượng %

Xử lý kết quả

Khoảng tin cậy: X% = 0,232 ± 0,013

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.65

STT mẫu (Mn)

Khối lượng mẫu cân (g)

RSD %

Diện tích đỉnh

Hàm lượng %

2,12

2,16

Xử lý kết quả

Bảng 3.24. Độ lặp lại của scolymosid STT mẫu (Mn)

Khối lượng mẫu cân (g)

Diện tích đỉnh

Hàm lượng %

M1

100,12

275480

0,350

M2

100,17

266091

0,338

M3

100,20

260600

0,331

M4

100,07

257117

0,327

M5

100,16

259447

0,330

M6

100,00

260853

0,332

e = ± 0,022

TB

100,12

263265

0,335

Khoảng tin cậy:

SD %

6671

0,008

X% = 0,335 ± 0,022

RSD %

2,53

2,52

Xử lý kết quả n=6 TB = 0,335 % SD = 0,008 % RSD = 2,52 % P = 0,95; t = 2,57

Bảng 3.25. Độ lặp lại của cynarosid STT mẫu (Mn)

Khối lượng mẫu cân (g)

Diện tích đỉnh

Hàm lượng %

M1

100,12

424248

0,416

M2

100,17

423768

0,415

M3

100,20

417865

0,409

M4

100,07

412864

0,405

M5

100,16

417800

0,409

M6

100,00

405460

0,398

e = ± 0,017

TB

100,12

417001

0,409

Khoảng tin cậy:

SD %

7071

0,007

X% = 0,409 ± 0,017

RSD %

1,70

1,64

Xử lý kết quả n=6 TB = 0,409 % SD = 0,007 % RSD = 1,64 % P = 0,95; t = 2,57

Tóm tắt kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình định lượng như sau: Bảng 3.26. Tóm tắt độ lặp lại và hàm lượng của các chất định lượng

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.66

Acid clorogenic

Cynarin

Scolymosid

Cynarosid

RSD %

1,37

2,16

2,52

1,64

Yêu cầu

≤ 3,7 %

≤ 3,7 %

≤ 3,7 %

≤ 3,7 %

Đánh giá

Đạt

Đạt

Đạt

Đạt

0,691 ± 0,024

0,232 ± 0,013

0,335 ± 0,022

0,409 ± 0,017

Hàm lượng %

Nhận xét: Đánh giá độ lặp lại của quy trình định lượng các chất có nồng độ từ 0,1% - 1% có giá trị RSD% từ 3,7% - 2,7% là phù hợp. [2]

2.2.7. Khảo sát độ đúng Tiến hành như Mục 3.2.6. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.26 – 3.29 Bảng 3.27. Kết quả độ đúng của acid clorogenic % Chuẩn thêm vào

80

100

120

KL cân (mg)

KL (mg) sẵn có

KL (mg) thêm vào

KL (mg) tìm thấy (LT)

KL (mg) tìm thấy (TT)

Tỉ lệ (%) phục hồi

100,23

0,691

0,553

1,244

1,172

94,23

100,21

0,691

0,553

1,244

1,182

95,00

100,13

0,691

0,552

1,243

1,176

94,65

100,3

0,692

0,692

1,383

1,315

95,07

100,31

0,692

0,693

1,385

1,329

95,99

100,5

0,693

0,690

1,384

1,361

98,38

100,12

0,690

0,829

1,519

1,437

94,59

100,2

0,691

0,829

1,520

1,443

94,94

100,5

0,693

0,832

1,525

1,482

97,19

Bảng 3.28. Kết quả độ đúng của cynarin Chuẩn thêm vào (%) 80

100

120

.

KL cân (mg)

KL (mg) sẵn có

KL (mg) thêm vào

KL (mg) tìm thấy (LT)

KL (mg) tìm thấy (TT)

Tỉ lệ (%) phục hồi

100,23

0,335

0,268

0,602

0,598

99,29

100,21

0,335

0,268

0,602

0,603

100,05

100,13

0,335

0,268

0,603

0,600

99,54

100,3

0,334

0,334

0,669

0,656

98,16

100,31

0,334

0,334

0,668

0,659

98,71

100,5

0,334

0,335

0,669

0,660

98,75

100,12

0,335

0,402

0,737

0,701

95,05

100,2

0,335

0,402

0,736

0,706

95,93

100,5

0,334

0,400

0,734

0,707

96,30

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.67

Bảng 3.29. Kết quả độ đúng của scolymosid Chuẩn thêm vào (%) 80

100

120

KL cân (mg)

KL (mg) sẵn có

KL (mg) thêm vào

KL (mg) tìm thấy (LT)

KL (mg) tìm thấy (TT)

Tỉ lệ (%) phục hồi

100,23 100,21 100,13 100,3 100,31 100,5 100,12 100,2 100,5

0,335 0,335 0,335 0,334 0,334 0,334 0,335 0,335 0,334

0,268 0,268 0,268 0,334 0,334 0,335 0,402 0,402 0,400

0,602 0,602 0,603 0,669 0,668 0,669 0,737 0,736 0,734

0,598 0,603 0,600 0,656 0,659 0,660 0,701 0,706 0,707

99,29 100,05 99,54 98,16 98,71 98,75 95,05 95,93 96,30

Bảng 3.30. Kết quả độ đúng của cynarosid Chuẩn thêm vào (%)

80

100

120

KL cân (mg)

KL (mg) sẵn có

KL (mg) thêm vào

KL (mg) tìm thấy (LT)

KL (mg) tìm thấy (TT)

Tỉ lệ (%) phục hồi

100,23

0,409

0,328

0,737

0,779

105,69

100,21

0,409

0,327

0,737

0,785

106,53

100,13 100,3 100,31 100,5 100,12 100,2 100,5

0,409 0,410 0,410 0,411 0,409 0,409 0,411

0,327 0,410 0,411 0,409 0,491 0,491 0,493

0,736 0,820 0,820 0,820 0,900 0,901 0,903

0,783 0,829 0,832 0,834 0,897 0,900 0,902

106,31 101,12 101,40 101,79 99,66 99,93 99,91

Chú thích: KL: khối lượng, LT: lý thuyết, TT: thực tế.

Kết quả tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng đồng thời acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid được tóm tắt như sau: Bảng 31. Tóm tắt tỷ lệ phục hồi của quy trình định lượng

Tỷ lệ phục hồi (%) Yêu cầu (%) Đánh giá

Acid clorogenic

Cynarin

Scolymosid

Cynarosid

95,56

98,23

97,98

102,48

95 – 105

95 – 105

95 – 105

95 – 105

Đạt

Đạt

Đạt

Đạt

 Phương pháp định lượng đạt các yêu cầu sau đây: -

Đạt tính tương thích hệ thống.

-

Khoảng tuyến tính của acid clorogenic, cynarin, scolymosid, cynarosid thuộc

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.68

khoảng từ 1 – 200 g/ml. -

Giới hạn phát hiện (LOD) của acid clorogenic là 0,03125 g/ml; cynarin là 0,03125 g/ml tại bước sóng 323 nm; scolymosid là 0,0625 g/ml; cynarosid là 0,0625g/ml tại bước sóng 349 nm.

-

Giới hạn định lượng là (LOQ) của acid clorogenic là 0,125 g/ml; cynarin là 0,125 g/ml; scolymosid là 0,25 g/ml; cynarosid là 0,25 g/ml.

-

Có độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu.

Do đó, phương pháp xây dựng chính xác, đáng tin cậy khi dùng để đánh giá hàm lượng acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và cynarosid trong lá khô Actisô.

2.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỂ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AC, CY, SCO, CR TRONG ACTISÔ Tiến hành như Mục 3.3.1., mỗi mẫu được chiết 6 lần và tiến hành phân tích trên UPLC với điều kiện đã khảo sát. Kết quả được xử lý thống kê với phép kiểm ANOVA bằng phần mềm SPSS để kiểm định sự khác nhau giữa các biến, dùng ttest trong Microsoft excel 2007 để so sánh 2 giá trị trung bình. Kết quả định lượng hàm lượng AC, CY, SCO và CR được thể hiện Bảng 3.31 Bảng 3.32. Kết quả định lượng CY, AC, SCO, CR trong các mẫu thử giống

Lá trắng

STT

Mẫu thử

độ ẩm

%SCO

%CR

1

tháng 3

9,43

0,691 ± 0,005

0,232 ± 0,001

0,335 ± 0,005

0,409 ± 0,005

2

tháng 4

11,46

0,537 ± 0,014

0,237 ± 0,002

0,345 ± 0,004

0,322 ± 0,004

3

tháng 5

12,09

0,508 ± 0,035

0,121 ± 0,006

0,399 ± 0,011

0,278 ± 0,006

4

tháng 6

12,69

0,724 ± 0,031

0,341 ± 0,013

0,506 ± 0,005

0,411 ± 0,004

5

phơi âm can

9,43

0,691 ± 0,004

0,232 ± 0,002

0,335 ± 0,003

0,409 ± 0,003

6

phơi nắng

12,28

0,739 ± 0,010

0,175 ± 0,002

0,406 ± 0,006

0,49 ± 0,006

7

sấy 50 độ

12,77

0,604 ± 0,005

0,034 ± 0,000

0,253 ± 0,001

0,075 ± 0,000

8

lá

9,43

0,691 ± 0,005

0,232 ± 0,001

0,335 ± 0,005

0,409 ± 0,005

.

%AC

%CY

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.69

giống

Lá tím

*

STT

Mẫu thử

độ ẩm

%AC

%CY

%SCO

%CR

9

rễ

12,83

0,044 ± 0,001

0,013 ± 0,001

nd

nd

10

hoa

12,82

0,382 ± 0,028

0,104 ± 0,004

nd

nd

11

tháng 3

12,09

0,792 ± 0,005

0,141 ± 0,001

0,489 ± 0,005

0,259 ± 0,002

12

tháng 4

10,57

0,413 ± 0,014

0,049 ± 0,002

0,54 ± 0,004

0,237 ± 0,002

13

tháng 5

12,22

0,756 ± 0,035

0,084 ± 0,006

0,524 ± 0,011

0,208 ± 0,006

14

tháng 6

12,33

1,535 ± 0,031

0,25 ± 0,013

0,692 ± 0,005

0,326 ± 0,004

15

phơi âm can

12,09

0,792 ± 0,005

0,141 ± 0,001

0,489 ± 0,005

0,259 ± 0,002

16

phơi nắng

12,52

1,139 ± 0,006

0,099 ± 0,002

0,467 ± 0,006

0,246 ± 0,002

17

sấy 50 độ

12,34

0,158 ± 0,001

0,014 ± 0,000

0,185 ± 0,001

0,095 ± 0,001

18

lá

12,09

0,792 ± 0,005

0,141 ± 0,001

0,489 ± 0,005

0,259 ± 0,002

19

rễ

12,82

0,055 ± 0,001

0,02 ± 0,001

nd

nd

20

hoa

11,92

0,161 ± 0,028

0,072 ± 0,004

nd

nd

n.d.: không phát hiện được

 So sánh hàm lượng CY, AC, SCO, CR trong các bộ phận dùng khác nhau của Actisô Xét trên các bộ phận dùng khác nhau (lá, rễ, hoa) của Actisô trắng và Actisô tím phơi âm can ở tháng 3, hàm lượng các chất trong các bộ phận của cây khác nhau có ý nghĩa (sig < 0,05). Trong đó, hàm lượng các chất AC, CY, SCO và CR đạt cao nhất ở lá, sau đó đến hoa và cuối cùng là rễ (Xem Hình 3.44-3.45). Hai flavonoid cynarosid và scolymosid không phát hiện được trong rễ và hoa có thể do hàm lượng quá thấp.

Lá tím

Hình 3.45. Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên hàm lượng lá tím

.

Lá trắng

Hình 3.46. Ảnh hưởng của bộ phận dùng lên lá trắng

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.70

Anova P < 0,05

Anova P < 0,05

 So sánh sự thay đổi hàm lượng CY, AC, SCO, CR trong lá Actisô theo các điều kiện làm khô khác nhau. Xét trên các mẫu lá tím và lá trắng tháng 3 được làm khô ở các điều kiện khác nhau (phơi âm can, phơi nắng, sấy ở 50 oC), kết quả thể hiện các điều kiện này có ảnh hưởng đến hàm lượng các chất trong Actisô (sig < 0,05). Cynarin đạt cao nhất khi phơi âm can, trong khi đó hàm lượng acid clorogenic nhiều nhất khi phơi nắng. Hàm lượng hai flavonoid là cynarosid và scolymosid không bị ảnh hưởng bởi điều kiện phơi vì còn phụ thuộc vào giống lá trắng hay tím. Phương pháp sấy trong tủ sấy 50 oC cho hàm lượng thấp nhất (xem Hình 3.46 và 3.47).

Lá tím

Hình 3.47. Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến hàm lượng lá tím

Lá trắng

Hình 3.48. Ảnh hưởng của điều kiện phơi đến hàm lượng lá trắng

 So sánh sự thay đổi hàm lượng CY, AC, SCO, CR trong lá Actisô theo từng thời vụ thu hái

Lá tím

.

Lá trắng

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.71

Hình 3.49. Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến hàm lượng lá tím

Hình 3.50. Ảnh hưởng của tháng thu hoạch đến hàm lượng lá trắng

Xét trên các mẫu lá tím và lá trắng được phơi âm can thu hoạch ở các tháng khác nhau, kết quả cho thấy thời vụ thu hái ảnh hưởng có ý nghĩa đến hàm lượng các chất trong lá Actisô. Nhìn chung, hàm lượng AC, CY, SCO, CR đều đạt cao nhất vào tháng 3, tháng 6, thấp hơn ở tháng 4 và tháng 5 (xem Hình 3.48 và 3.49). Tuy nhiên vẫn chưa thể kết luận chắc chắn tháng nào thu hái cho hàm lượng các chất cao nhất vì chưa đủ cơ sở dữ liệu.

 Định lượng các chế phẩm trên thị trường bằng phương pháp định lượng đã xây dựng Chuẩn bị mẫu: Tiến hành như Mục 3.3.1. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.54-3.55 và Bảng 3.32

Hình 3.54. Biểu đồ kiểm nghiệm một số chế phẩm trên thị trường Bảng 3.333. Kết quả định lượng 1 số chế phẩm STT

Chế phẩm

1

HP

2

HD

ĐỘ ẨM %

% AC

% CY

% SCO

% CR

Actisô 100%

12,16

0,09

0,06

n.d

n.d

Actisô, sâm

8,57

n.d

n.d

n.d

n.d

Thành phần

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.72

3

DG

Atisô, cỏ ngọt

5,26

0,03

0,06

n.d

n.d

4

VT

Rễ, thân, hoa, cam thảo

7,06

0,03

0,02

n.d

n.d

5

LDX

Lá tươi 100%

6,52

0,42

0,06

0,37

0,21

6

LDD

Cao Actisô, Lá Actisô, thảo quyết minh

7,54

0,09

0,11

n.d

n.d

7

TC

Hoa Actisô

7,09

0,02

n.d

n.d

n.d

8

TA

Hoa, thân, rễ Actisô

7,69

0,03

0,01

n.d

n.d

9

BC

Rễ, thân Actisô

6,93

0,01

n.d

n.d

n.d

Thân và lá , rễ, hoa, cỏ ngọt

6,18

0,07

0,02

0,01

0,01

Actisô 100%

9,80

0,87

0,47

0,54

0,32

10

TB

11

WL3 (*)

(*)

: Lá khô Actisô được thu hái vào tháng 3 năm 2015

n.d.: không phát hiện được

HD

HP

DG

LDX

.

VT

LDD

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.73

TC

BC

TA

TB

Hình 3.55. Sắc ký đồ kiểm nghiệm một số chế phẩm trên thị trường

Nhận xét: Tóm tắt các bộ phận dùng trong thành phần của các chế phẩm như sau: Hoa: TC Lá: HD, HP, DG, LDX, TB Thân, rễ, hoa: VT, TA, TB Thân và rễ: BC Qua Bảng 3.32 rút ra một số nhận xét sau: Đa số các chế phẩm đều chứa acid clorogenic (trừ HD). Tuy nhiên, hàm lượng acid clorogenic rất thấp. Nhóm chế phẩm mà trong thành phần công thức không có lá Actisô, thì hàm lượng acid clorogenic thấp hơn các chế phẩm còn lại (VT 0,03%; TC 0,02%; TA 0,03%; BC 0,01%). Trong khi đó, các sản phẩm trong thành phần công thức có lá Actisô cho hàm lượng acid clorogenic cao hơn (LDX 0,42%; HP 0,09%; TB 0,07%). Riêng chế phẩm LDD, có hàm lượng acid clorogenic 0,09 %, có thể là do trong công thức có chứa cao đặc Actisô, sản phẩm của DG chỉ chứa 0,03% acid clorogenic và HD không phát hiện pic acid clorogenic cũng như các pic cynarin scolymosid, cynarosid (tuy trong công thức có lá Actisô) có thể do chất

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.74

lượng hay việc xử lý, bảo quản nguyên liệu không đạt yêu cầu. Hàm lượng cynarin trong các chế phẩm là rất thấp (dưới 0,1%), một số sản phẩm không phát hiện pic cynarin (HD, TC, BC). Trong các sản phẩm có cynarin, thì đa số trong thành phần đều có lá Actisô, chỉ có sản phẩm của TA không có lá và hàm lượng cynarin chỉ chứa 0,01 %. Riêng sản phẩm của LDD chứa 0,11% cynarin, nguyên nhân có thể do trong thành phần công thức có chứa cao Actisô. Scolymosid và cynarosid hầu như không phát hiện trong các chế phẩm, trừ sản phẩm của LDX (scolymosid 0,37%; cynarosid 0,21%) và TB (scolymosid 0,01%; cynarosid 0,01%). Nguyên nhân có thể do LDX có thành phần 100% là lá Actisô, TB trong công thức còn có các thành phần khác. Các chế phẩm khác tuy trong thành phần công thức cũng có lá Actisô (HP, LDD) nhưng không phát hiện được pic scolymosid và cynarosid có thể do quá trình thu hái, bảo quản cũng như sơ chế chưa phù hợp nênkhông có scolymosid và cynarosid. Vậy, các chế phẩm có thành phần là lá cho hàm lượng acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và cynarosid cao hơn các chế phẩm có thành phần là hoa. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hanen Falleh và cộng sự [15]. Chế phẩm có nguồn gốc từ lá là LDX chứa hàm lượng acid clorogenic, scolymosid và cynarosid cao nhất so với các chế phẩm khác. Tuy nhiên, so với mẫu lá khô Actisô (WL3) – là nguyên liệu của đề tài này, thì hàm lượng acid clorogenic trong LDX kém hơn 2 lần, cynarin kém gần 8 lần, scolymosid và cynarosid kém 1,5 lần. Nguyên nhân là mẫu nguyên liệu của đề tài đã qua quá trình xử lý sau khi thu hái. Trong khi đó mẫu LDX có thể do nguồn nguyên liệu chưa được xử lý hoặc quá trình phơi sấy, xử lý, và bảo quản nguyên liệu không đạt yêu cầu. Kết luận: Trong sản xuất trà và cao thuốc Actisô, chỉ nên sử dụng nguyên liệu lá Actisô, vì các bộ phận khác cho hàm lượng acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và cynarosid rất thấp. Ngoài ra, thì lá sau khi thu hái phải qua xử lý thích hợp mới cho hàm lượng hoạt chất cao.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.75

CHƯƠNG 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 3.1. KẾT LUẬN Qua quá trình thực hiện, đề tài đã thu được các kết quả như sau: a. Đã xây dựng được quy trình chiết xuất acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và cynarosid trong Actisô. Phương pháp định tính, định lượng đồng thời acid clorogenic, cynarin, scolymosid, và cynarosid trong lá khô Actisô đạt các kết quả sau: -

Có tính tương thích hệ thống.

-

Khoảng tuyến tính của acid clorogenic, cynarin, scolymosid, cynarosid thuộc khoảng từ 1 – 100 g/ml.

-

Giới hạn phát hiện (LOD) của acid clorogenic là 0,03125 g/ml; cynarin là 0,03125

g/ml; scolymosid là 0,0625 g/ml; cynarosid là 0,0625g/ml. -

Giới hạn định lượng là (LOQ) của acid clorogenic là 0,125 g/ml; cynarin là 0,125

g/ml; scolymosid là 0,25 g/ml; cynarosid là 0,25 g/ml. -

Có độ lặp lại và độ đúng đạt yêu cầu.

b. Đã ứng dụng quy trình định lượng để khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng AC, CY, SCO và CR trong lá Actisô. -

Hàm lượng các chất AC, CY, SCO và CR đạt cao nhất ở lá, sau đó đến hoa và cuối cùng là rễ.

-

Cynarin đạt cao nhất khi phơi âm can, trong khi đó hàm lượng acid clorogenic nhiều nhất khi phơi nắng. Hàm lượng hai flavonoid là cynarosid và scolymosid không bị ảnh hưởng bởi điều kiện phơi vì còn phụ thuộc vào giống lá trắng hay tím. Phương pháp sấy trong tủ sấy 50 oC cho hàm lượng các chất thấp nhất.

-

Hàm lượng các chất AC, CY, SCO và CR hầu như rất thấp, đôi khi không tìm thấy trong một số chế phẩm trên thị trường.

3.2. ĐỀ NGHỊ Quy trình định lượng này có thể được ứng dụng cho những đề tài tiếp theo gồm:

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.76

-

Tiếp tục khảo sát sự thay đổi hàm lượng của acid clorogenic, cynarin, scolymosid và cynarosid vào các tháng tiếp theo.

-

Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến hàm lượng các chất.

-

Định lượng hàm lượng các chất trong thân và gân lá.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.77

CHƯƠNG 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Nguyễn Thị Duyên Anh (2015), "Phân lập và thiết lập chất chuẩn cynarin từ lá actisô", Khóa luận tốt nghiệp DSDH. Vĩnh Định Đặng Văn HòaKiểm Nghiệm Thuốc, Nhà xuất bản giáo dục việt nam. Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, pp. 79-81. Đỗ Tất Lợi Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (2011), Nghiên cứu phận lập và xây dựng phương pháp đánh giá một vài polyphenol trong Actisô, ĐHYD TpHCM. Bộ Y tế (2010), Dược Điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội, pp. 681 - 682. Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng Dược Liệu, Đại học Y dược TpHCM, pp. 307-311. Lê Phan Kim Trang (2016), "Phân lập và thiết lập chất chuẩn acid clorogenic và cynarosid từ lá actisô (cynara scolymus l. Asteraceae)", Khóa luận tốt nghiệp DSDH.

TIẾNG ANH 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

C. H. Blum-Silva et al. (2016), "Qualitative and quantitative analysis data of the major constituents of Ilex paraguariensis leaves by UPLC-PDA and QTOF-MS", Data Brief. 8, pp. 295-299. E. Portis et al. (2012), "Genetic mapping and identification of QTL for earliness in the globe artichoke/cultivated cardoon complex", BMC Res Notes. 5, pp. 252. M. Wang et al. (2003), "Analysis of antioxidative phenolic compounds in artichoke (Cynara scolymus L.)", J Agric Food Chem. 51 (3), pp. 601-608. F. Ferreres A. Gil-Izquierdo, et al. (2001), "The effect of storage temperatures on vitamin C and phenolics content of artichoke Cynara scolymus L. heads", Innovative Food Science & Emerging Technologies. 2, pp. 199 - 202. Sajid Ali (2011), Leaf Yield and Polyphenols of Artichoke (Cynara cardunculus L.) Influenced by Harvest Frequency and Herbicide Stress Giessen. Borhane Annabi Anissa Belkaid, et al. (2006), "The chemopreventive properties of clorogenic acid reveal a potential new role for the microsomal glucose-6-phosphate translocase in brain tumor progression", Cancer Cell International. 27, pp. 6-7. Guifang Dou Bo Yang, et al. (2005), "Metabolic profile of 1,5-dicaffeoyquinic acid in rats, an in vivo and in vitro study", Drug metabolism and disposition. 33 (7), pp. 930 -936. Mabberley D.J. (1987), The Plant Book, A portable dictionary of the higher plants, Cambridge University Press, pp. 706. Andreas Hensel Gesine Löhr, et al. (2009), "In vitro investigations of Cynara scolymus L. extract on cell physiology of HepG2 liver cells", Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 45 (201 - 208). Chedly Abdelly Hanen Falleh, et al. (2008), "Phenolic composition of Cynara cardunculusL. organs, and their biological activities", C. R. Biologies. 331, pp. 372–379.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.78

19. 20. 21. 22. 23.

24.

25. 26. 27. 28.

29. 30.

31. 32. 33. 34. 35.

Ludwig Huber (2007), "Validation and qualification in analytical laboratories", second edition, pp. pp. 144 - 146. Giancarlo Colelli Ilde Ricci, et al. (2013), "Influence of pre-cutting operations on quality of fresh-cut artichokes (Cynara scolymus L.): Effect of harvest dates", Postharvest Biology and Technology, pp. 90–96. Kazuo Ishida (2010), "Effects of Artichoke Leaf Extract on Acute Gastric Mucosal Injury in Rats", Biol. Pharm. Bull. 33 (2), pp. pp. 223—229. Jan G. Lammers Jan Fritsche, et al. (2002), "Isolation, characterization and determination of minor artichoke (Cynara scolymus L.) leaf extract compounds", Eur Food Res Technol. 215, pp. 149–157. Anddresschieber Katrinschutz, et al. (2004), "Identification and Quantification of Caffeoylquinic Acids and Flavonoids from Artichoke (Cynara scolymus L.) Heads, Juice, and Pomace by HPLC-DAD-ESI/MS", Agric. Food Chem. 52 (13), pp. 4090 −4096. Reasschieber Katrinschutz, et al. (2006), "Quantitative Determination of Phenolic Compounds in Artichoke-Based Dietary Supplements and Pharmaceuticals by High-Performance Liquid Chromatography", Agric. Food Chem. 2006. 54 (23), pp. 8812−8817. Paul A.K. Lattanzio V., et al. (2009), "Globe artichoke: A functional food and source of nutraceutical ingredients", Journal of functional food. I, pp. 131-144. M. Escobar M. Lutz, et al. (2011), "Chemical composition and antioxidant properties of mature and baby artichokes (Cynara scolymus L.), raw and cooked", Food Composition and Analysis. 24, pp. 49–54. Seyhan G.V. Meriçli A.H. (2006), "Constituents of Cynara syriaca leaves", Pharmaceutical Biology. 44 (9), pp. 643-645. Abdul Mutalib A.G Nasser (2012), "Phytochemical Study of Cynara scolymus L. (Artichoke) (Asteraceae) Cultivated in Iraq, Detection and Identification of Phenolic Acid Compounds Cynarin and Chlorogenic Acid ", Iraqi J Pharm Sci. 21 (1), pp. 6 - 13. R Le Jeune P.Goetz (2007), "Artichaut, Cynara scoIymus", Phy t ot he´ r ap i e. 5, pp. 219 - 222. Hugh C. R. Simpson Rafe Bundy, et al. (2008), "Artichoke leaf extract (Cynara scolymus) reduces plasma cholesterol in otherwise healthy hypercholesterolemic adults: A randominzed, double blind placebo controlled tria", Phytomedicine. 15, pp. 668-675. James L. Reveal (2011), "Summary of recent systems of Angiosperm classification", Kew Bulletin. 66, pp. 1-44. M. K. Bellue Robbins W.W., W. S. Ball. (1970), Weeds of California, State of California, Dept. of Agriculture, pp. 547. Vincenzo Fogliano Rosalia Ferracane, et al. (2008), "Effects of Different Cooking Methods on Antioxidant Profile, Antioxidant Capacity, and Physical Characteristics of Artichoke", Agric. Food Chem. 56 (18), pp. 8601–8608. Nancy H. Ibrahim Souria M. Donya (2012), "Antimutagenic Potential of Cynara scolymus, Cupressus sempervirens and Eugenia jambolana Against ParacetamolInduced liver cytotoxicity. ", Journal of American Science. 8 (1), pp. 1 - 7. V. A. Chelombit ′ko T. V. Orlovskaya, et al. (2007), "Carbohydrat from Cynara scolymus", Chemistry of Natural Compounds. 43 (1), pp. 107 - 108.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.79

36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45.

V. A. Chelombit ′ko T. V. Orlovskaya, et al. (2007), "Chemical Composition of Cynara scolymus Leaves", Chemistry of Natural Compounds. 43 (2), pp. 239 - 240. Irene Morone V. Lattanzio (1979), "Variations of the orthodiphenol content of Cynara scolymus L. during the plant growing seasons ", Experientia. 35, pp. 993 994. Raymond Lo Xiangfeng Zhu, et al. (2004), "Phenolic Compounds from the Leaf Extract of Artichoke (Cynara scolymus L.) and Their Antimicrobial Activities", Agric. Food Chem. 52 (24), pp. 7272−7278. K. Bauer E.J. Verspohl, et al. (2008), "Effect of two artichoke extracts (36_U and 36_EB) on rat ileum (with respect to bowel syndrome) and the peristaltic threshold", Phytomedicine(1002-1009). Jan Fritsche et al. (2002), "Isolation, characterization and determination of minor artichoke (Cynara scolymus L.) leaf extract compounds", European food research and technology. 215 (2), pp. 149-157. Vincenzo Lattanzio et al. (2009), "Globe artichoke: a functional food and source of nutraceutical ingredients", Journal of Functional Foods. 1 (2), pp. 131-144. Tong Kwee Lim (2012), Edible medicinal and non-medicinal plants, Vol. 7, Springer. Sara Lombardo et al. (2010), "Influence of genotype, harvest time and plant part on polyphenolic composition of globe artichoke [Cynara cardunculus L. var. scolymus (L.) Fiori]", Food Chem. 119 (3), pp. 1175-1181. DT. Thoai Truc NT. Anh Nguyet, P. Dong Phuong (2015), "Simultaneous quantification of chlorogenic acid, cynarin, scolymoside, cynaroside from Artichoke leaves by HPLC-PDA", Proceeding of Asean Pharm Net I Conference. Solvita Zeipiņa et al. (2015), Influence of agroecological factors on artichoke yield and quality, Annual 21st International Scientific Conference:" Research for Rural Development" Volume 1, Jelgava, Latvia, 13-15 May 2015, Latvia University of Agriculture, pp. 77-81.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

PHỤ LỤC Phụ lục 1.

Tương thích hệ thống mẫu thử .................................................................... PL1

Phụ lục 2.

Tương thích hệ thống mẫu chuẩn ................................................................ PL4

Phụ lục 3.

Độ lặp lại .................................................................................................... PL6

Phụ lục 4.

Độ đúng ...................................................................................................... PL8

Phụ lục 5.

Tính tuyến tính ........................................................................................ PL10

Phụ lục 6.

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 3 ...................................................... PL15

Phụ lục 7.

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 4 ...................................................... PL16

Phụ lục 8.

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 5 ...................................................... PL17

Phụ lục 9.

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 6 ...................................................... PL18

Phụ lục 10. Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 3.......................................................... PL19 Phụ lục 11. Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 4.......................................................... PL20 Phụ lục 12. Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 5.......................................................... PL21 Phụ lục 13. Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 6.......................................................... PL22 Phụ lục 14. Dữ liệu uplc của mẫu hoa trắng ................................................................. PL23 Phụ lục 15. Dữ liệu uplc của mẫu hoa tím.................................................................... PL24 Phụ lục 16. Dữ liệu uplc của mẫu rễ trắng ................................................................... PL25 Phụ lục 17. Dữ liệu uplc của mẫu rễ tím ...................................................................... PL26 Phụ lục 18. Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng phơi nắng................................................... PL27 Phụ lục 19. Dữ liệu uplc của mấu lá trắng sấy ở 50 độ ................................................ PL28 Phụ lục 20. Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng phơi âm can ............................................... PL29 Phụ lục 21. Dữ liệu uplc của lá tím phơi nắng ............................................................. PL30 Phụ lục 22. Dữ liệu uplc của mẫu lá tím sấy 50 độ ........................................................... 31 Phụ lục 23. Dữ liệu uplc của lá tím phơi âm can ............................................................... 32

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL1

Phụ Lục 1.

Tương thích hệ thống mẫu thử

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL2

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL3

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL4

Phụ Lục 2.

Tương thích hệ thống mẫu chuẩn

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL5

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL6

Phụ Lục 3.

Độ lặp lại

SKĐ ở bước sóng 323 nm

SKĐ ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL7

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL8

Phụ Lục 4.

Độ đúng

SKĐ ở bước sóng 323 nm

SKĐ ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL9

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL10

Phụ Lục 5.

Tính tuyến tính

SKĐ ở bước sóng 323 nm

SKĐ ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL11

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL12

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL13

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL14

Độ chọn lọc

Phụ Lục 6.

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL15

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 3

Phụ Lục 7.

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL16

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 4

Phụ Lục 8.

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL17

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 5

Phụ Lục 9.

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL18

Phụ Lục 10.

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng tháng 6

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL19

Phụ Lục 11.

Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 3

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL20

Phụ Lục 12.

Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 4

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL21

Phụ Lục 13.

Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 5

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL22

Phụ Lục 14.

Dữ liệu uplc của mẫu lá tím tháng 6

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL23

Phụ Lục 15.

Dữ liệu uplc của mẫu hoa trắng

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL24

Phụ Lục 16.

Dữ liệu uplc của mẫu hoa tím

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL25

Phụ Lục 17.

Dữ liệu uplc của mẫu rễ trắng

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL26

Phụ Lục 18.

Dữ liệu uplc của mẫu rễ tím

SKĐ ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL27

Phụ Lục 19.

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng phơi nắng

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL28

Phụ Lục 20.

Dữ liệu uplc của mấu lá trắng sấy ở 50 độ

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL29

Phụ Lục 21.

Dữ liệu uplc của mẫu lá trắng phơi âm can

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL30

Phụ Lục 22.

Dữ liệu uplc của lá tím phơi nắng

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL31

Phụ Lục 23.

Dữ liệu uplc của mẫu lá tím sấy 50 độ

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.

Bản quyền tài liệu thuộc về Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh. PL32

Phụ Lục 24.

Dữ liệu uplc của lá tím phơi âm can

SKĐ của mẫu ở bước sóng 323 nm

SKĐ của mẫu ở bước sóng 349 nm

.