XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC KHÁNG HISTAMIN H1 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC KHÁNG HISTAMIN H1 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG HPLC và HPTLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LAN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC KHÁNG HISTAMIN H1 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG HPLC và HPTLC

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2020

LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị cán bộ, sự ủng hộ của gia đình và bạn bè. Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, là người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin được cảm ơn các thầy cô bộ môn Hóa phân tích- Độc chất, bộ môn Dược học cổ truyền và các anh chị cán bộ Viện Công nghệ Dược Phẩm Quốc Gia đã chỉ bảo, hỗ trợ và tạo điều kiện cho tôi về thiết bị, máy móc để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học, cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 10 tháng 03 năm 2020

Trần Thị Lan

MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................. iii DANH MỤC CÁC BẢNG ....................................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ v ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ............................................................. 3 1.1.1.Nhóm thuốc kháng histamin H1 ................................................................ 3 1.1.2. Một số nghiên cứu phát hiện thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược ................................................................................. 5 1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu ................................................... 12 1.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC).................................. 12 1.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) .................. 13 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu .................................... 14 2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn ............................................................................. 14 2.1.2. Máy móc - trang thiết bị ......................................................................... 14 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 15 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 15 2.2.1. Chuẩn bị nền mẫu ................................................................................... 15 2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích........................................................... 15 2.2.3. Xử lý mẫu ............................................................................................... 17 2.2.4. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng ........................................... 17 2.2.5. Ứng dụng phân tích các mẫu thu thập được ........................................... 19 2.3. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 19 Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ........................................................ 20 3.1. Xây dựng phương pháp phân tích .............................................................. 20 3.1.1. Xây dựng phương pháp HPLC ............................................................... 20

i

3.1.2. Xây dựng phương pháp HPTLC ............................................................. 24 3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu.................................................................... 27 3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ........................................................... 29 3.3.1. Thẩm định phương pháp HPLC.............................................................. 29 3.3.2. Thẩm định phương pháp HPTLC ........................................................... 35 3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành trên thị trường . 41 3.4.1. Kết quả phân tích mẫu thực bằng HPTLC ............................................. 41 3.4.2. Kết quả phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPLC .......................... 45 Chương 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 48 4.1. Tạo nền mẫu ................................................................................................. 48 4.2. Xây dựng phương pháp phân tích .............................................................. 49 4.2.1. Lựa chọn phương pháp phân tích ........................................................... 49 4.2.2. Xây dựng phương pháp sắc ký ............................................................... 50 4.2.3. Lựa chọn xử lý mẫu ................................................................................ 51 4.3. Thẩm định phương pháp............................................................................. 51 4.4. Ứng dụng....................................................................................................... 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 54 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 54 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 56 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 64

ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt ACN AOAC

AR

Tiếng Anh hoặc tên khoa học Acetonitrile

Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà hóa phân Chemists

tích chính thống

Analytical Reagent

Thuốc thử phân tích

Chuẩn

Chuẩn Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương

VKNTTW CIN

Cinnarizin

CLO

Clorpheniramin maleat

CYP

Cyproheptadin hydroclorid

HPLC

Tiếng Việt

High

Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Performance

Chromatography HPTLC

High Performance

Thin Layer Sắc ký lớp mỏng hiệu năng

Chromatography ICH

International

cao Conference

on Hội nghị hòa hợp quốc tế

Harmonisation LC – MS/MS

Liquid Chromatography – Mass Sắc ký lỏng hai lần khối phổ Spectrometry/ Mass Spectrometry

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng

LOR

Loratadin

MeOH

Methanol

PA

Tinh khiết phân tích

Pure Analysis

PRO

Promethazin hydroclorid

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

S/N

Signal/Noise

Tín hiệu/Nhiễu

TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký lớp mỏng

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nghiên cứu phân tích một số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược............................................................................................ 7 Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu ............................................... 14 Bảng 3. 1. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3) ..................................................... 28 Bảng 3. 2. Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống HPLC ............................. 30 Bảng 3. 3. Kết quả đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính bằng HPLC....................... 31 Bảng 3. 4. Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác trên 3 nền mẫu (HPLC) ........ 33 Bảng 3. 5. Kết quả xác định LOD, LOQ của phương pháp HPLC............................. 34 Bảng 3. 6. Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống HPTLC ........................... 37 Bảng 3. 7. Kết quả đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính bằng HPTLC .................... 38 Bảng 3. 8. Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác trên 3 nền mẫu (HPTLC) ...... 39 Bảng 3. 9. Kết quả xác định LOD, LOQ bằng HPTLC............................................... 40 Bảng 3. 10. Kết quả định tính trên mẫu thực bằng phương pháp HPTLC ................. 42 Bảng 3. 11. Kết quả định lượng các mẫu thực dương tính bằng HPTLC .................. 43 Bảng 3. 12. Kết quả định tính trên mẫu thực bằng phương pháp HPLC ................... 45 Bảng 3. 13. Kết quả định lượng các mẫu thực dương tính bằng HPLC ..................... 46

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3. 1. Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động HPLC ...................................................... 21 Hình 3. 2. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động .................................................. 21 Hình 3. 3. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký HPLC ........................................... 22 Hình 3. 4. Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu trên máy HPLC ....................... 23 Hình 3. 5. Sắc ký đồ khảo sát pha động HPTLC ........................................................ 24 Hình 3. 6. Sắc ký đồ lựa chọn tỉ lệ thành phần pha động HPTLC ............................. 25 Hình 3. 7. Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu (phương pháp HPTLC) ......... 26 Hình 3. 8. Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết ................................................. 27 Hình 3. 9. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu .......................................................................... 29 Hình 3. 10. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp HPLC ....................... 30 Hình 3. 11. Sắc ký đồ xác định LOD của phương pháp HPLC (nền N3) ................... 34 Hình 3. 12. Sắc ký đồ và sắc đồ analog đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp HPTLC ........................................................................................................................ 36 Hình 3. 13. Sắc ký đồ analog xác định LOD trên nền viên nang (N3) (HPTLC) ....... 40 Hình 3. 14. Sắc ký đồ phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPTLC ..................... 41 Hình 3. 15. Sắc ký đồ HPTLC analog của mẫu dương tính M22 (a) và chồng phổ UV tại vị trí có Rf = 0,26 ( vết CLO) của M22 và CLO chuẩn (b) .................................... 44 Hình 3. 16. Sắc ký đồ HPLC mẫu dương tính M22 (a) và chồng phổ UV tại tại vị trí có tR = 6,016 ( pic CLO) của M22 và CLO chuẩn (b) ................................................ 47

v

ĐẶT VẤN ĐỀ Với đặc điểm khí hậu nhiệt đới ẩm và tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng ở Việt Nam, tỉ lệ người mắc các bệnh dị ứng đang tăng nhanh [42], [56]. Thuốc chỉ điều trị triệu chứng nên bệnh tái đi tái lại. Bên cạnh sử dụng thuốc hóa dược, người bị dị ứng hay tìm và sử dụng chế phẩm đông dược, với “niềm tin” rằng các chế phẩm này an toàn và ít tác dụng phụ. Tuy nhiên, vì lợi nhuận nhiều người sản xuất trộn thêm thuốc hóa dược để bệnh của người dùng mau giảm triệu chứng, bán được số lượng nhiều. Việc này là một mối quan tâm lớn không những của cơ quan quản lý mà còn của cộng đồng khi có nhiều báo cáo về các rủi ro ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe mà nguyên nhân là từ các chế phẩm đông dược được khẳng định là "hoàn toàn tự nhiên". Nhóm thuốc hóa dược để điều trị dị ứng hay sử dụng là nhóm kháng histamin H1. Các dược chất thuộc nhóm thuốc này có giá rẻ, tác dụng nhanh, mạnh ở mức liều thấp nên khả năng các chất này được trộn trong các chế phẩm đông dược trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng, cảm cúm…là rất cao và khó bị phát hiện. Ngoài ra chúng còn có tác dụng an thần, chống nôn, chống đau đầu (cinarizin), kích thích ăn ngon (cyproheptadin hydroclorid)… Tuy nhiên, các thuốc thuộc nhóm này đều có thể gây những tác dụng phụ, đặc biệt khi được trộn lẫn vào các chế phẩm đông dược và được dùng trong thời gian kéo dài. Các tác dụng phụ thường gặp như: buồn ngủ, ngủ gà, mệt mỏi, chóng mặt, tăng co giật ở trẻ em, khô miệng, khô họng, khô mũi, gây ăn kém ngon, buồn nôn, tiêu chảy… [4-6]. Do đó, việc phát triển các phương pháp phân tích phát hiện các chất trộn trái phép là rất quan trọng để đảm bảo chất lượng của thuốc đông dược và thực phẩm chức năng phục vụ tốt công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Các quy trình phát hiện thành phần thuốc đông dược rất phức tạp và thách thức. Phương pháp hay được sử dụng trong phát hiện thuốc hóa dược nói chung và các thuốc hóa dược kháng histamin H1 nói riêng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược thường là LC-MS [30], LC-MS-MS [14], [19], [38], [39],[53],[54], GC –MS [41] với độ đặc hiệu cao và LOD thấp. Tuy nhiên hệ thống LC-MS rất đắt tiền và không phổ biến so với HPLC hoặc HPTLC.

1

Xuất phát từ thực tế đó, đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC và HPTLC” được thực hiện với mục tiêu: 1. Xây dựng được các quy trình định tính, định lượng đồng thời một số thuốc kháng histamin H1 (Cinarizin, Clorpheniramin maleat, Cyproheptadin hydroclorid, Loratadin, Promethazin hydroclorid) trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC và HPTLC. 2. Áp dụng các quy trình đã xây dựng được để xác định các thuốc kháng histamin H1 trên trộn lẫn trong một số chế phẩm đông dược ( nếu có).

2

Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.1.1.Nhóm thuốc kháng histamin H1 ❖ Tác dụng: [4], [6] • Cơ trơn : giãn cơ trơn khí quản, tiêu hóa. • Mao mạch : giảm tính thấm mao mạch. • Thần kinh trung ương : ức chế, các thuốc kháng hitamin H1 thế hệ 2 không có hoặc ít có tác dụng này. • Kháng cholinergic: chống nôn, chống say tàu xe • Kháng α-adrenergic: đặc biệt là dẫn xuất phenothizin ( promethazin), gây giãn mạch, hạ huyết áp thế đứng. • Kháng serotonin: điển hình là cyproheptadin, do đó có thể dùng để điều trị hội chứng serotonin hoặc dùng ngắn hạn để tăng cảm giác thèm ăn. • Gây tê tại chỗ: đặc biệt là promethazin và diphenhydramin. ❖ Tác dụng không mong muốn: [4], [6] Tác dụng không mong muốn hay gặp nhất của thuốc kháng histamine H1 thế hệ 1 là an thần, gây ngủ, kháng cholinergic gây khô miệng, họng, mũi. Ngoài ra còn gây căng ngực, hồi hộp, đau đầu, khó tiêu; trên hệ tiêu hóa: ăn kém ngon, nôn, buồn nôn, tiêu chảy; ức chế thần kinh trung ương, gây chóng mặt, mệt mỏi,buồn ngủ, ù tai, bồn chồn, tăng co giật (động kinh) ở trẻ em. Thế hệ 2 ít gặp các tác dụng này. Các thuốc thuộc nhóm này đều có thể gây những tác dụng phụ, hay gặp ở trẻ em và người cao tuổi hoặc khi điều trị dài ngày hặc dùng liều cao . Đặc biệt khi được trộn lẫn vào các chế phẩm đông dược và được dùng trong thời gian kéo dài. ❖ Cấu trúc, tính chất vật lý, liều dùng của các thuốc nghiên cứu • Cinarizin - Công thức cấu tạo: [8]

C26H28N2 ( M= 368,5)

3

- Tên khoa học: (E)-1- ( diphenylmethyl)-4-(3- phenylprop-2-enyl) piperazin [8]. - Tính chất: Bột màu trắng hay gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong methylen clorid, tan trong aceton, khó tan trong ethanol 96% [8] Liều lượng: Người lớn: 25 mg x 1-3 lần mỗi ngày. Trẻ em 5 - 12 tuổi: 1/2 liều

-

người lớn [4], [6] Clorpheniramin maleat - Công thức cấu tạo: [8]

C16H19ClN2.C4H4O4 (M=390,9) -

Tên khoa học: (RS) -3-(4 clorophenyl) - 3 - (2-pyridyl) propyldimethylamin

hydrogen maleat [8] -

Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, không mùi. Dễ tan trong nước, tan

trong ethanol 96 %, cloroform; ít tan trong ether và benzen [8]. -

Liều dùng: Người lớn: 4 mg cách 4-6 giờ/lần. Tối đa: 24 mg/ngày (người cao

tuổi tối đa 12mg/ngày) [5], [6] • Cyproheptadin hydroclorid - Công thức cấu tạo: [8]

C21H21N.HCl.3/2H2O (M= 350,9) - Tên khoa học: 4-(5H-dibenzo[a,d] cyclohepten-5-yliden)-1-methylpiperidin hydroclorid [8]. - Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng hoặc vàng nhạt, ít tan trong nước, dễ tan trong methanol, ít tan trong ethanol 96% [8]. - Liều dùng: Người lớn: 4 mg/lần x 3-4 lần/ngày. Tối đa 0,5 mg/kg/24 giờ [4].

4

• Loratadin - Công thức cấu tạo:

C22H23ClN2O2 (M=382.9) - Tên khoa học: Ethyl 4-(8-chloro-5,6-dihydro-11H-benzo[5,6]cyclohepta[1,2-b] pyridin-11-ylidene)-1-piperidinecarboxylat. - Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, có tính chất đa hình. Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton và methanol [6]. - Liều dùng : Người lớn và trẻ em từ 12 tuổi trở lên : dùng 1 lần trong ngày, liều 10mg [5] • Promethazin hydroclorid - Công thức cấu tạo:[8]

C17H20N2S. HCl (M=320,9)

-

Tên khoa học:

(2RS)-N,N-dimethyl-1-10H-phenothiazin-10-yl)propan-2-amin

hydroclorid[8]. -

Tính chất: Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Rất dễ tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96% và dicloromethan. Chảy ở nhiệt độ 222C, kèm theo phân hủy [8].

-

Liều dùng : Người lớn ngày uống 2-3 lần, mỗi lần 25 mg sau ăn [4].

5

1.1.2. Một số nghiên cứu phát hiện thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược Nhóm thuốc chống dị ứng kháng histamin H1 hay bị trộn vào các chế phẩm đông dược vì tác dụng chống dị ứng và tác dụng an thần của nó. Một số nghiên cứu gần đây [22] đã thuyết phục FDA ban hành lệnh cấm hoặc hạn chế bán một số chế phẩm có nguồn gốc thảo dược có chứa hoạt chất hoá dược, phổ biến ở các nhóm PDE-5, corticoid, NSAID, glucocorticoid, kháng histamin H1…Cụ thể đó là Nhân sâm “She Lian Wan” với tuyên bố hỗ trợ giảm đau khớp, viêm khớp, và bệnh gút, nhưng đã phát hiện có chứa 2 hóa dược là dexamethason và clorpheniramin [59]. Hay “Saurean Fong Sep Lin” được quảng cáo dùng cho trường hợp đau lưng và chấn thương, nhưng dương tính với dexamethason và cyproheptadin [60] … Ở Trung Quốc, YE Lin-hu và cộng sự sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát 7 kháng histamin H1 bao gồm loratadin, diphenhydramin hydroclorid, cyproheptadin

hydroclorid,

cetirizin

hydroclorid,

promethazin

hydroclorid,

mizolastin, and clorpheniramin maleat trên 9 loại chế phẩm thảo dược, kết quả đã xác định 4 mẫu chế phẩm dương tính với các kháng histamin H1 trên [54]. N. Song và cộng sự cũng đã sử dụng phương pháp LC-MS/MS, xác định được 12 loại hóa dược được thêm vào trà thảo dược một cách bất hợp pháp, trong đó phát hiện có clorpheniramin maleat [53]. Ở Hàn Quốc, Jung Yeon Kim và cộng sự sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát trên 117 mẫu chế phẩm đông dược dùng chăm sóc sức khỏe và đã phát hiện 1 mẫu chứa diphenhydramin [39]. Tại Việt Nam, chế phẩm đông dược có mặt trên thị trường trong nước hiện nay rất đa dạng, nhiều thành phần, khó kiểm soát vì được bán qua nhiều kênh khác nhau như trong quầy thuốc, nhà thuốc, cửa hàng bán các sản phẩm chăm sóc sức khỏe, qua mạng internet, đa cấp, siêu thị, … nên có thể có nguy cơ các sản phẩm này bị trộn thêm các thuốc hóa dược gây ra tác dụng không mong muốn khi sử dụng cho người dùng.

6

Năm 2017, Sở Y tế thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện cơ sở đông y Nhơn Tâm Tế (quận 12) đang lưu giữ và bày bán nhiều mặt hàng được cho là thuốc mà kết quả kiểm nghiệm cho thấy có chứa corticoid và cyproheptadin [58]. Ngoài ra, có một số phát hiện chế phẩm đông dược trộn hóa dược của nước ngoài lưu hành trên thị trường Việt Nam. Năm 2007: phát hiện “Thuốc Dân tộc cứu nhân vật”, sản xuất tại Campuchia, trộn 5 loại hóa dược dexamethason, diazepam, paracetamol, clopheniramin và cyproheptadin. Thuốc tăng phì hoàn của Đài Loan có trộn cyproheptadin và dexamethason [9]. Từ những thực trạng trên có thể thấy rõ tình hình trộn trái phép thuốc hóa dược trong chế phẩm đông dược đang xảy ra nhiều và phức tạp, không chỉ ở nhiều nước trên thế giới mà ở cả Việt Nam. Một số nghiên cứu phân tích phát hiện các thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược, được trình bày trong bảng 1.1. Bảng 1.1 Các nghiên cứu phân tích một số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược Hoạt chất và mẫu thử

Phương pháp phân tích

Kết quả phân

Tài

tích

liệu

- LOD: 0,1µg/L

[53]

Clorpheniramin

UHPLC – MS/MS

maleat

Cột XBridge BEH C18 (100 mm x đến 2,1 g/L

- Mẫu thử: Trà 2,1 mm; 3,5 μm) thảo dược

- LOQ: 0,4g/L

Pha động : acetonitril/ formic acid đến 8,0 g/L - Độ thu hồi:

0,1% (tt/tt)

-Dung môi chiết: ACN, tinh chế 62,7% - 95,2% bằng kỹ thuật QuEChERS và lọc qua màng lọc 0,22 µm. 22 loại thuốc

LC-ESI-MS / MS

kháng histamin

Cột: Acquity UPLC BEH C18 đến 6,0 µg/L

H1

(100x2,1 mm; 1,7 µm)

-

- LOD: 0,006

- LOQ: 0,008

Mẫu thử: Pha động: 0,1% acid formic trong đến 12,0 µg/L

Viên nang, viên nước (kênh A) và 0,1% acid formic - Độ thu hồi:

7

[39]

nén, dạng lỏng trong acetonitril (kênh B). Chế độ 89,7% - 111,8% và

bột

thảo gradient

dược

- 1/117 mẫu chứa

Detector: ESI-MS.

diphenhydramin

- Dung môi chiết: Methanol, siêu âm 10 phút và lọc qua màng lọc FTFE 0,22 µm Loratadin, Diphenhydramin

LC-MS/MS Cột:

Agilent

- LOD: 0,5-2,5 Eclipse

Plus ng/mL

Cyproheptadin

C18（2,1mm×50mm; 3,5 μm）

- LOQ: 1-5ng/mL

Cetirizin

Tốc độ dòng: 0,4 mL/·phút

- Độ thu hồi:

Promethazin

Pha động: 0,1% acid formic trong 86,2% -112,5%

Mizolastin

acetonitril : 0,1% acid formic trong - 4/9 chế phẩm

Clorpheniramin -

Mẫu thử:

[54]

nước

được phát hiện

Detector: ESI-MS.

dương tính với

Viên nén, thuốc - Dung môi chiết: Methanol 80%, thuốc kháng mỡ, kem Brompheniramin, Clorpheniramin, Cinarizin, Diphenhydramin

siêu âm 30 phút, ly tâm -

histamin H1. - LOD từ 10 -

GC/MS :

+ Cột: Silica, Agilent HP-5MS (30 1000 μg/g m x 0,25 mm i.d. 0,25 μm ) + Chương trình nhiệt độ lò:

- Mẫu thử: Viên 80oC ở 6oC/ phút cho đến khi đạt nang, viên nén ,

120oC, tăng 8oC/ phút cho đến khi

hoàn, bột, dung

đạt 300oC trong 29 phút.

dịch, cao dán

+ Khí mang: heli (tốc độ dòng = 1,4 ml / phút), hydrogen (1,0 ml/phút) + Nhiệt độ đầu phun: 250°C + Chế độ ion hóa: EI + Chế độ quét phổ: SIM + Chế độ tiêm mẫu: Không chia

8

[41]

dòng - Chiết mẫu bằng ethanol. Tác động: Siêu âm, lắc quay, ly tâm Clorpheniramin

LC-MS/MS

- LOD: 5 pg đến

maleat

Cột: Superspher 100 RP-18 (125 × 3

1 ng/mL

-

Mẫu thử : mm; 4 µm), cột bảo vệ: Superspher

Viên nang, viên 100 RP-18 (4 × 4 mm; 4 µm) nén, bột, dung

Thể tích tiêm: 25 µl

dịch

Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

[19]

- Độ thu hồi: 63100%

Pha động: ACN và dung dịch đệm amoni format 10 mM (pH 3,0). Gradient pha động Detector: ESI-MS - Chiết mẫu bằng MeOH hoặc isopropanol : diclormethan (1:9) Tác động: Siêu âm, lắc xoáy, ly tâm 23 loại thuốc

UHPLC-Q/TOF-MS

- LOD: 0,02 đến

kháng histamin

Cột: Waters ACQUITY® UPLC

16,04 ng/mL

H1

BEH C18 (150×2,1 mm, 1,7μm).

- Độ thu hồi:

-

Mẫu thử : Thể tích tiêm: 2µL

81,6-124,7%

Dạng lỏng, viên

Tốc độ dòng: 0,30 mL/phút

nang, viên nén,

Pha động: 0,1% acid formic trong

bột.

nước và 0,1% acid formic trong acetonitril. Detector: Q/TOF – MS -Mẫu được thêm dung dịch Na2CO3 pH=10, dịch thu được đem chiết lỏng lỏng với ethyl acetat. Lấy phần dịch thân dầu đem cô cắn rồi hòa tan cắn

9

[38]

vào hỗn hợp dung dịch acid formic 0,1% : MeOH (1:1). Tác động: siêu âm, lắc xoáy, ly tâm Clorpheniramin

LC-IT/TOF-MS

maleat.

Cột: Agilent ZORBAX Eclipse AAA mg/kg

-

- LOD: 0,1

[30]

Mẫu thử : (150 mm × 4,5 mm; 5 μm).

Viên nén, nang

Pha động: 0,1% acid acetic trong

cứng, nang

nước và 0,1% acid acetic trong

mềm, dạng lỏng, acetonitril. Thể tích tiêm: 10 µl

gel.

Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. Detector: IT/TOF-MS - Mẫu chiết bằng MeOH Tác động: ly tâm, lắc xoáy Clorpheniramin

Phương pháp HPLC:

Clorpheniramin

maleat

- Cột: C 18 (4,6 × 150 mm, 5 μm)

maleat được phát

-

Mẫu thử : - Pha động: acetonitril và amoni

Dạng lỏng, viên

acetat 0,02M chứa 0,1% acid acetic.

[55]

hiện trong 1 số mẫu.

nang cứng , viên Gradient pha động nang mềm, viên

- Tốc độ dòng: 1 ml /phút

nén, bột.

- Nhiệt độ cột: 25°C - Bước sóng phát hiện: 220 nm

Clorpheniramin

LC-MS/MS chế độ ESI (+)

maleat,

- Cột InertSustain AQ-C18 (100 mm 0,165 ng/mL

cyproheptadin

x 2,1 mm; 3,0 µm)

hydroclorid,

- Pha động gồm acid formic 0,1% ng/mL

loratadin.

trong nước (A) và acetonitril (B); chế - Độ thu hồi:

-

Mẫu thử:

Viên nang,

- LOD: 0,083 -

- LOQ: 0,25-0,5

độ pha động: gradient -Thể tích tiêm 2 µl

80-110% - Phát hiện 2/9

10

[14]

thuốc bột, cốm,

- Tốc độ dòng 0,3 ml/phút và thời mẫu chứa

hoàn

gian phân tích 12 phút.

clorpheniramin

- Chiết mẫu bằng MeOH

maleat

Clorpheniramin

TLC

maleat,

- Pha tĩnh: Bản mỏng silicagel µg/mL

cyproheptadin

GF254

- Phát hiện 7/15

hydroclorid,

- Pha động : Cloroform – methanol –

mẫu

loratadin

acid acetic – amoniac (9,5 : 0,5 :

clorpheniramin

0,2 : 0,05)

maleat

Mẫu thử:

-

-LOD:

Viên nang,

-Thể tích chấm: 2 µl

thuốc bột, cốm,

- Bước sóng phát hiện: 254 nm

hoàn

- Chiết mẫu bằng MeOH

50-100 [3]

chứa

Tác động: Siêu âm, lắc xoáy, ly tâm Như vậy, công bố nghiên cứu phát hiện các thuốc kháng histamin H1 trộn trong thuốc đông dược bằng sắc ký lớp mỏng rất ít và mới dừng ở mức sàng lọc, phát hiện định tính [3]. Còn qui trình định lượng thuốc hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC đối với thuốc kháng histamin H1 mới chỉ xây dựng đối với CLO [55] nên cần mở rộng trên những chất khác trong nhóm. Đa số các nghiên cứu định lượng dùng phương pháp LC-MS [30], LC-MS-MS [14], [19], [38], [39],[53],[54], GC –MS [41]…, phương pháp này cho độ đặc hiệu, độ nhạy cao, nhưng hệ thống MS rất đắt tiền và không phổ biến ở các phòng phân tích như HPLC và HPTLC. Đặc biệt, hiện nay hệ thống HPTLC được trang bị bộ phận phát hiện, xử lý số liệu cho phép nâng cao khả năng định tính bằng quét phổ, chồng phổ và định lượng với sai số chấp nhận được do đó việc phát triển phương pháp HPTLC rất có ý nghĩa trong công tác kiểm tra, giám sát ban đầu. Vì vậy, nghiên cứu này sẽ phát triển phương pháp HPTLC và HPLC là các phương pháp khoa học, đáng tin cậy, dễ áp dụng rộng rãi để có thể phát hiện thuốc kháng histamin H1 trong chế phẩm đông dược, góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược đối với nhóm thuốc này

11

nhằm đảm bảo chất lượng thuốc, bảo vệ sức khỏe cho người dân và giữ uy tín cho các sản phẩm đông dược lưu hành trên thị trường. 1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 1.2.1. Phương pháp HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1]. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và được cho qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục gọi là pha động. Tốc độ di chuyển của các chất là khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan giữa ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [2].

1.2.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 1.2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật sắc ký dùng để tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10 - 30 µm, được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất, dày khoảng 250 µm trên giá đỡ làm bằng thuỷ tinh, nhôm hoặc chất dẻo. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh là silica, dẫn chất siloxan, cellulose, nhôm oxyd, gel sephadex, ... trong đó được dùng phổ biến nhất là silica (SiO 2) và nhôm oxyd [1],[2]. Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần, thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký. Cơ chế tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế, tùy thuộc vào tính chất của hai pha. Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2 - 3 dung môi. Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn. Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng, có vị trí khác nhau trên bản mỏng. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các

12

chất phân tích là hệ số lưu giữ R f . Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường di chuyển của pha động [1]. Rf = d R /dM dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết chất phân tích (cm). dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm). Rf : có giá trị dao động giữa 0 và 1. 1.2.2.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ( HPTLC) HPTLC là một hình thức hiện đại của TLC (sắc ký lớp mỏng). Pha tĩnh trong HPTLC là những hạt chất hấp phụ kích thước nhỏ, đồng đều nên tăng cường khả năng tách. Hơn nữa, HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra. Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao. Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích. Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa. Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng.

13

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu STT

Nguyên vật liệu

1

Cinarizin

2

3 Chất

Tiêu chuẩn

Nguồn gốc

Chất đối

Chuẩn VKNTHCM

chiếu

99,7%, SKS: QT082060916

Clorpheniramin

Chất đối

Chuẩn VKNTTW

maleat

chiếu

99,75%, SKS 0209032

Cyproheptadin

Chất đối

Hydroclorid

chiếu

chuẩn 4

Loratadin

Chất đối chiếu

Chuẩn VKNTTW 100,64%, độ ẩm 7,6%, SKS: 0102126 Chuẩn VKNTTW 99,24%, độ ẩm 0,02% , SKS: 0108242 Chuẩn VKNTTW

Promethazin

Chất đối

hydroclorid

chiếu

6

Acetonitril

HPLC

Merck - Đức

7

Aceton

AR

Trung Quốc

Hóa

8

Cyclohexan

AR

Trung Quốc

chất

9

Triethylamin

PA

Merck - Đức

PA

Merck - Đức

5

10

Natri heptansulfonat

99,65%, độ ẩm 0,13%, SKS : 0204085

2.1.2. Máy móc - trang thiết bị - Bản mỏng TLC và HPTLC silica gel 60 GF254 của Merck- Đức - Cân phân tích METTLER TOLEDO– AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1 mg) - Cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg)

14

- Máy HPLC –DAD: Hệ thống HPLC Shimadzu 20AD với detector UV-PDA, Nhật - Hệ thống máy HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thụy Sỹ): máy chấm sắc ký bản mỏng tự động, máy triển khai sắc ký, buồng chụp ảnh sắc ký, phần mềm xử lý kết quả winCATS. - Máy đuổi dung môi bằng khí Nitơ Hanon – Đài Loan - Máy lắc xoáy Vortex ZX3 – Ý - Máy lọc hút chân không - Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức - Máy siêu âm DAIHAN WUC – A22H – Hàn Quốc - Tủ sấy MEMMERT ULM 500 – Đức - Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, micropipet, mao quản, ống ly tâm,… 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu thử : 25 mẫu chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng dạng bào chế viên nén, viên nang cứng, viên hoàn, thuốc bột được sử dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các trường hợp mề đay, mẫn ngứa, dị ứng, đau đầu, kích thích ăn ngon để tăng cân đang lưu hành tại Việt Nam. Các mẫu được mã hóa ngẫu nhiên từ M01 -> M25. - Mẫu nền : gồm 3 nền mẫu dạng viên hoàn, bột cốm, viên nang cứng, dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được xây dựng dựa trên nguyên lý y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đã công bố và một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, mề đay có thị phần lớn trên thị trường Việt Nam hiện nay. - Mẫu tự tạo : Mẫu nền có thêm các chất chuẩn nghiên cứu với tỉ lệ nhất định. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuẩn bị nền mẫu - Nền N1 (viên hoàn): Dựa vào bài thuốc cổ tryền Ngân kiều tán trong sách Ôn bệnh điều biện và Dược điển Việt Nam V, gia giảm thành phần của bài thuốc cho

15

phù hợp với tác dụng điều trị, gồm 9 loại dược liệu như sau: kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, bạc hà, đạm trúc diệp, kinh giới tuệ, lô căn, ngưu bàng tử, cam thảo. Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều, vê thành viên, bao màu, sấy khô, đóng gói. - Nền 2 (bột cốm): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Liên kiều bại độc tán trong sách Thương hàn toàn sinh tập gồm 14 loại dược liệu như sau: liên kiều, chi tử, khương hoạt, huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy, hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử. Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu, thêm tá dược tạo khối ẩm, xát hạt qua rây, sấy hạt, sửa hạt, đóng gói. - Nền 3 (viên nang): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Tiêu phong tán trong sách Y tông kim giám, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với tác dụng điều trị, gồm 11 loại dược liệu như sau: kinh giới, phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền thoái, sinh địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo. Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều tạo khối ẩm, rây qua rây tạo hạt, sấy hạt, thêm tá dược thích hợp, đóng nang 2.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích 2.2.2.1. Phương pháp HPLC Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau: - Khảo sát và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu. - Khảo sát điều kiện sắc ký: tham khảo điều kiện phân tích trong công bố [7], [16], [36], [46]. Lựa chọn pha động và tỉ lệ pha động, cột sắc ký, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng, bước sóng phát hiện để có thể tách và phát hiện đồng thời các chất nghiên cứu ở nồng độ ppm, pic gọn, thời gian phân tích không quá dài. 2.2.2.2. Phương pháp HPTLC - Pha tĩnh: bản mỏng TLC và HPTLC silica gel 60 GF254 với các kích thước khác nhau. - Pha động: Pha riêng các dung dịch chuẩn CIN, CLO, CYP, LOR, PRO có nồng độ khoảng 1 mg/ml trong methanol. Phân tích trên bản mỏng TLC hoặc HPTLC

16

silicagel 60 GF254 , thể tích chấm 1 µl. Dựa vào các tài liệu và các nghiên cứu đã công bố [3], [8], [16], [24], [25], [29], [44] khảo sát trên 4 hệ pha động gồm: + n-hexan: dicloromethan:triethylamin ( 5,5:4:0,5) + Cyclohexan: aceton: triethylamin (80:10:10) + Aceton: n-hexan: amoniac (45:55:5) + Ethylacetat: methanol: amoniac ( 80:20:8) - Sau khi triển khai sắc ký, tiến hành quét phổ lựa chọn bước sóng phát hiện phù hợp. - Lựa chọn hệ dung môi tách riêng các chất, các vết gọn, rõ nét. Sau đó, khảo sát tỷ lệ thành phần pha động để có pha động tối ưu. 2.2.3. Xử lý mẫu Dựa vào tính tan của các chất phân tích và một số nghiên cứu đã công bố tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc tân dược từ nền mẫu bằng các dung môi như : methanol, ethanol, methanol : nước (50 :50), acetonitril. Dựa trên công bố [3], [14], [54], nghiên cứu đã thực hiện xử lý mẫu như sau: - Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu. - Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng với khoảng 1/2 liều dùng vào ống ly tâm. - Thêm chính xác 25 ml dung môi chiết vào ống ly tâm. - Lắc xoáy 5 phút, sau đó siêu âm 10 phút ở nhiệt độ phòng. - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm, pha loãng bằng methanol tới nồng độ thích hợp. Tiến hành phân tích bằng HPLC. Đối với HPTLC: Quy trình xử lý mẫu tương tự như trên. Sau khi ly tâm, lấy chính xác 2,0 ml dịch trong, cô dưới luồng khí nitơ đến cắn. Hòa tan cắn bằng 1,0 ml methanol, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành phân tích bằng HPTLC. 2.2.4. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 [18] và ICH 2005 [34] trên 3 nền mẫu tự tạo chứa các chất phân tích với các chỉ tiêu: -

Độ đặc hiệu của phương pháp:

17

+ Thực hiện phân tích trên 3 nền mẫu, mỗi nền mẫu bao gồm 3 mẫu như sau: Mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn của 5 chất phân tích, mẫu nền và mẫu nền có thêm hỗn hợp chuẩn của 5 chất phân tích. + Yêu cầu: Trên sắc ký đồ mẫu nền không xuất hiện pic trùng với thời gian lưu hoặc Rf của các chất phân tích. Trên sắc ký đồ mẫu nền thêm chuẩn, các pic xuất hiện trùng thời gian lưu hoặc Rf với mẫu chuẩn. -

Độ thích hợp của hệ thống:

+ Phân tích lặp lại 6 lần mẫu dung dịch chuẩn hỗn hợp của 5 chất phân tích ở nồng độ xác định trong cùng điều kiện sắc ký. + Yêu cầu: diện tích pic và thời gian lưu ( hoặc Rf) thu được của 6 lần sắc ký lặp lại phải có giá trị RSD < 2%. -

Khoảng nồng độ tuyến tính:

+ Pha các dãy nồng độ trong khoảng nồng độ khảo sát của 5 chất phân tích ròi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó xây dựng phương trình đường hồi quy tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng. Từ đó thu được hệ số tương quan r. + Yêu cầu: Hệ số tương quan r ≥ 0,99 -

Độ đúng và độ chính xác:

+ Thực hiện trên 3 nền mẫu N1, N2, N3. Độ đúng và độ chính xác trong ngày được xác định bằng cách thêm chính xác lượng dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào nền mẫu ( tương ứng khoảng ½ liều dùng: nền N1 là 2,5g; N2 là 0,7 g; N3 là 1,6 g) ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao), lắc đều, để yên 15 phút. Sau đó, tiến hành xử lý mẫu theo điều kiện đã chọn. Tiến hành lặp lại 6 lần ở mỗi mức nồng độ. Độ đúng và độ chính xác khác ngày được tiến hành tương tự nhưng vào ngày phân tích khác. + Độ đúng: được xác định dựa vào tỉ lệ % của lượng chuẩn tìm lại của mỗi chất phân tích so với lượng chuẩn thêm vào. Yêu cầu: Độ đúng phải đạt theo yêu cầu của AOAC 2016 ở mức nồng độ thử nghiệm.

18

+ Độ chính xác của mỗi mức nồng độ được xác định thông qua đại lượng RSD của kết quả thu được 6 lần làm lặp lại ở mỗi mức nồng độ. Yêu cầu: Độ lặp lại phải đạt theo yêu cầu của AOAC 2016 ở mức nồng độ thử nghiệm. -

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (LOD, LOQ) :

Thêm lượng chuẩn hỗn hợp với lượng giảm dần vào mỗi nền mẫu. Xử lý mẫu theo quy trình đã lựa chọn và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Nồng độ tại đó cho tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) khoảng bằng 3 là LOD và nồng độ cho tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) khoảng bằng 10 là LOQ 2.2.5. Ứng dụng phân tích các mẫu thu thập được - Xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng. - Áp dụng phương pháp HPLC và HPTLC phát hiện các chất nghiên cứu (dựa vào các thông số thời gian lưu/ thừa số chậm, chồng phổ) trong một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng, đau đầu, kích thích ăn ngon thu thập trên thị trường (nếu có). - Xác định nồng độ các chất nghiên cứu trong các mẫu thử thu thập được dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng của các chất nghiên cứu (nếu có) được xây dựng trong cùng ngày phân tích. 2.3. Phương pháp xử lý số liệu - Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu được xử lí bằng phần mềm có sẵn trong thiết bị HPLC và HPTLC. - Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Excel để tính kết quả trung bình, độ lệch chuẩn (SD), phương sai, độ lệch chuẩn tương đối (RSD), độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp.

19

Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Xây dựng phương pháp phân tích Chuẩn bị các dung dịch: - Dung dịch chuẩn gốc đơn 1mg/ml: cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chuẩn CIN, CLO, CYP, LOR, PRO vào các bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức vừa đủ 10 ml bằng methanol . - Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 1mg/ml: cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chuẩn CIN, CLO, CYP, LOR, PRO vào 1 bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức vừa đủ 10 ml bằng methanol . - Dung dịch chuẩn đơn (10 µg/ml): Dùng micropipet hút chính xác 100 µl mỗi dung dịch chuẩn gốc đơn cho mỗi vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ thu được các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ chính xác khoảng 10 µg/ml. - Dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/ml: Dùng micropipet hút chính xác 100 µl dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp, cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ. 3.1.1. Xây dựng phương pháp HPLC 3.1.1.1. Lựa chọn hệ pha động Sử dụng điều kiện sắc ký: Cột Inertsil ODS- 3 (250 x 4,6mm; 5µm) , tốc độ dòng 1,4 ml/phút; thể tích tiêm 20 µl, bước sóng phát hiện 254 nm. Tiến hành phân tích các dung dịch chuẩn đơn (10 µg/ml) và dung dịch chuẩn hỗn hợp 10 µg/ml .Tiến hành khảo sát với các pha động khác nhau. Kết quả được trình bày ở hình 3.1

(a) Methanol: dd đệm acetate pH=3 (80:20)

20

(b) Acid formic 0,1% : ACN ( 30:70)

(c) ACN- dd KH2PO4 0,01 M (80-20)

(d) ACN- natri heptansulfonat 0,01 M (pH =2,8 bằng acid acetic băng) ( gradient )

Hình 3. 1. Sắc ký đồ khảo sát hệ pha động HPLC Nhận xét: - Hình (a): các pic ra sớm, thời gian lưu từ 2,2 – 10,4 phút. Các pic bị dính chân. - Hình (b): Các pic bị dính chân nhiều. - Hình (c): Ra nhiều pic, pic bị bể đầu. - Hình (d): Các pic có thời gian lưu từ 5,2 - 14,7 phút. Các pic nhỏ gọn, sắc nét, cân đối ( T˷ 1,0), tách nhau rõ ràng ( Rs > 2,0), cường độ tín hiệu pic phù hợp để phân tích. Vì vậy, hệ pha động gồm ACN- heptansulfonat natri 0,01 M (điều chỉnh đến pH =2,8 bằng acid acetic băng), chế độ gradient từ 0 - 17 phút ACN 38% -> 67% ; từ 17 – 20 phút ACN từ 67% -> 38% được lựa chọn để tiến hành phân tích.

* Tốc độ dòng pha động Tiêm vào hệ thống sắc ký hỗn hợp 5 chất nghiên cứu có nồng độ mỗi chất là 10 µg/ml với tốc độ dòng 1,3 ml/phút và 1,4 ml/phút. Kết quả được trình bày ở hình 3.2

(a) Tốc độ dòng 1,3 ml/phút

(b) Tốc độ dòng 1,4 ml/phút

Hình 3. 2. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động

21

Nhận xét: Ở cả 2 tốc độ dòng pha động khảo sát, các pic đều có hình dáng nhỏ gọn, cân xứng. Với tốc độ dòng 1,4 ml/phút, các chất phân tích rửa giải sớm hơn (thời gian lưu từ 5,2 – 14,5 phút). Với tốc độ dòng 1,3 ml/phút, các chất phân tích rửa giải chậm hơn (thời gian lưu từ 6,2 – 16,7). Khi phân tích mẫu đông dược với khoảng thời gian 5 phút đầu là thời gian rửa giải của nhiều thành phần trong dược liệu. Do đó, tiến hành lựa chọn tốc độ dòng pha động kéo dài được thời gian lưu của các chất phân tích, nhằm giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu. Vì vậy, lựa chọn tốc độ dòng 1,3 ml/phút để tiến hành nghiên

cứu tiếp theo. 3.1.1.2. Khảo sát cột sắc ký Tiến hành khảo sát trên các cột: (a) Hypersil C18 BDS (250 x 4,6mm; 5µm), (b) Inertsil ODS- 3 (250 x 4,6mm; 5µm),

(c) InertSustain AQ-C18 (250 x 4,6 mm, 5µm). Kết quả được trình bày ở hình 3.3

(a)

(b)

(c)

Hình 3. 3. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký HPLC Nhận xét: Sử dụng cột (a) Hypersil C18 BDS (250 x 4,6mm; 5µm) các pic hơi bị kéo chân, không cân đối. Cả 2 cột Inertsil ODS- 3 (250 x 4,6mm; 5µm) và InertSustain AQ- C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) đều cho các pic tách rời nhau, chân pic gọn, cân đối nhưng độ phân giải của 2 chất PRO và CYP lớn hơn khi tách trên cột InertSustain AQ- C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) do đó cột này được chọn cho nghiên cứu tiếp theo.

22

3.1.1.3. Bước sóng phát hiện Quét phổ UV từ bước sóng 200 – 400 nm tại vị trí pic của 5 chất phân tích trong sắc ký đồ của chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp. Kết quả được trình bày ở hình 3.4.

Hình 3. 4. Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu trên máy HPLC Nhận xét: CIN có hai cực đại hấp thụ ở 199 và 250 nm; CLO là 197 và 255 nm; CYP là 199 và 305 nm; LOR là 197, 214 và 253 nm; PRO là 197, 250 và 300 nm. Cả 4 chất CIN, CLO, LOR, PRO đều có cực đại hấp thụ khoảng 250 – 255 nm, tại khoảng này CYP cũng hấp thụ quang học mạnh do đó bước sóng 254 nm được lựa chọn để phát hiện cả 5 chất phân tích trong nghiên cứu này.

23

Từ kết quả khảo sát, điều kiện sắc ký được lựa chọn như sau: - Cột: InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) - Pha động: ACN- dung dịch heptansulfonat natri 0,01 M (điều chỉnh tới pH =2,8

bằng acid acetic băng); chạy chế độ gradient dung môi từ 0 - 17 phút ACN 38% -> 67% ; từ 17 – 20 phút ACN từ 67% -> 38%; - Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút; - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl; - Bước sóng phát hiện: 254 nm .

3.1.2. Xây dựng phương pháp HPTLC 3.1.2.1. Khảo sát hệ dung môi Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc đơn CLO, CYP, CIN, LOR, PRO và chuẩn gốc hỗn hợp 5 chất trong methanol có nồng độ 1 mg/ml. - Pha tĩnh: bản mỏng TLC silicagel 60 GF 254 (7 x 10 cm) - Thể tích chấm: 1 µl - Pha động:

+ Hệ 1: n-hexan: dicloromethan:triethylamin ( 5,5:4:0,5) + Hệ 2: Cyclohexan: aceton: triethylamin (80:10:10) + Hệ 3: Aceton: n-hexan: amoniac (45:55:5) + Hệ 4: Ethyl acetat: methanol: amoniac ( 80:20:8)

Kết quả được trình bày ở hình 3.5.

Hệ 1

Hệ 2

Hệ 3

Hình 3. 5. Sắc ký đồ khảo sát pha động HPTLC

24

Hệ 4

Nhận xét: Hệ 1 , hệ 4 vết PRO và CYP bị trùng nhau Hệ 3 Các vết tách nhau hoàn toàn. Vết CLO thấp sát vạch xuất phát. Hệ 2 Các vết gọn và tách nhau hoàn toàn. Rf = 0,2-0,8 Tiếp tục tiến hành thay đổi tỉ lệ thành phần hệ 2 để tìm pha động tối ưu nhất tách 5 chất CIN, CLO, CYP, LOR, PRO. Khảo sát hệ Cyclohexan: aceton: triethylamin với tỉ lệ thay đổi như sau: Hệ 2.1: 7 : 1,5: 1,5

Hệ 2.3: 8: 1,5: 0,5

Hệ 2.2: 8,5: 0,75: 0,75

Hệ 2.4: 8: 2 : 0,5

Kết quả được trình bày ở hình 3.6.

Hệ 2.1

Hệ 2.2

Hệ 2.3

Hệ 2.4

Hình 3. 6. Sắc ký đồ lựa chọn tỉ lệ thành phần pha động HPTLC Nhận xét: Hệ 2.4: Cyclohexan: aceton: triethylamin (8: 2: 0,5) có khả năng tách các chất tốt và Rf các chất nằm trong khoảng 0,2-0,8. 3.1.2.2. Bước sóng phát hiện Tiến hành quét phổ UV từ bước sóng 200 nm đến 400nm tại vị trí vết của 5 chất phân tích trong sắc ký đồ của chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp. Kết quả được trình bày ở hình 3.7.

25

Hình 3. 7. Phổ hấp thụ UV của các chất nghiên cứu (phương pháp HPTLC) Nhận xét: CIN có hai cực đại hấp thụ ở 254 nm; CLO là 224 và 250 nm; CYP là 226, 253 và 287 nm; LOR là 254 nm; PRO là 254 và 305 nm. Nên lựa chọn bước sóng 254 nm để phát hiện cả 5 chất phân tích do có đáp ứng cao và giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu. Từ các kết quả khảo sát điều kiện HPTLC được lựa chọn là: - Pha tĩnh: Bản mỏng HPTLC Silicagel 60 GF254 - Hệ dung môi khai triển : Cyclohexan: aceton: triethylamin (8: 2: 0,5) - Bước sóng phát hiện : 254nm. - Thể tích chấm: 5 µL - Không tiến hành bão hòa dung môi, thời gian để khô bản mỏng ngoài không khí sau triển khai là 15 phút.

26

3.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu Khảo sát dung môi chiết : methanol, ethanol, acetonitrile, methanol : nước (50 :50) . - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong methanol có nồng độ các chất CIN, CLO, CYP, LOR, PRO là 10 µg/ml. - Dung dịch mẫu tự tạo: Nghiền mịn và làm đồng nhất mẫu nền. Thêm chính xác dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp 1mg/ml vào mẫu nền sao cho sau xử lý có nồng độ các chất tương đương với dung dịch chuẩn. Lắc nhẹ, để bay hơi dung môi ở điều kiện phòng. Tiến hành chiết các mẫu theo quy trình đã nêu tại mục 2.2.3 sử dụng các loại dung môi chiết khác nhau. Mỗi dung môi tiến hành làm lặp lại 3 lần. Tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC, tính độ thu hồi dựa vào diện tích pic của chất phân tích của dung dịch mẫu tự tạo và dung dịch chuẩn hỗn hợp. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.8.

Hình 3. 8. Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi chiết

27

Bảng 3. 1. Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3) Ethanol

Methanol : nước (50:50)

Hoạt chất

Sc

St

H% ± RSD%

St

CIN CLO CYP LOR PRO

680446 147141 407412 341309 882022

536593 144440 333235 278669 696847

82,17 ± 1,13% 98,34 ± 1,29% 82,12 ± 6,08% 81,62 ± 2,09% 79,61 ± 1,67%

484109 144465 273972 226501 624880

CIN CLO CYP LOR PRO

680446 147141 407412 341309 882022

538093 141238 299318 255929 673243

81,31 ± 2,38% 96,77 ± 0,86% 72,65 ± 1,36% 70,98 ± 4,86% 73,29 ± 4,52%

463798 126420 275628 218548 621950

CIN CLO CYP LOR PRO

680446 147141 407412 341309 882022

552296 143841 340317 257721 656861

81,17 ± 2,89% 97,76 ± 1,63% 83,53 ± 6,99% 75,51 ± 4,61% 74,47 ± 6,05%

470643 143482 308569 219119 646787

H% ± RSD% Nền N1 ( Hoàn) 71,15 ± 0,92% 98,18 ± 2,13% 67,25 ± 1,20% 66,36 ± 3,78% 70,85 ± 1,76% Nền N2 (Cốm) 68,16 ± 2,68% 85,92 ± 2,50% 67,65 ± 1,29% 64,03 ± 2,48% 70,51 ± 1,44% Nền N3 (Nang) 69,17 ± 1,26% 97,51 ± 3,04% 75,74 ± 2,75% 64,20 ± 2,61% 73,33 ± 2,64%

28

Methanol

ACN

St

H% ± RSD%

St

H% ± RSD%

631109 145161 389829 339417 863001

96,65 ± 1,71% 98,83 ± 1,34% 96,06 ± 2,58% 99,41 ± 3,44% 98,97 ± 1,41%

555929 145160 283262 265551 664287

81,70 ± 4,03% 98,65 ± 1,44% 69,53 ± 6,15% 77,80 ± 1,87% 75,31 ± 4,11%

646241 144413 393408 329681 861052

98,96 ± 1,69% 98,32 ± 2,18% 96,94 ± 2,30% 96,56 ± 3,51% 98,37 ± 1,33%

538172 144941 286646 258412 664597

79,09 ± 5,31% 98,51 ± 1,79% 70,36 ± 4,84% 75,71 ± 3,97% 75,35 ± 0,79%

658426 144164 385481 332641 861764

100,32 ± 1,31% 98,15 ± 1,80% 94,99 ± 3,10% 97,43 ± 1,79% 98,93 ± 1,33%

544886 144459 289292 254361 663591

80,08 ± 3,12% 98,18 ± 1,18% 71,01 ± 6,23% 74,53 ± 4,19% 75,24 ± 2,91%

Nhận xét: Kết quả cho thấy: hiệu suất chiết của các dung môi không có sự khác biệt lớn trên 3 nền mẫu, tuy nhiên hiệu suất chiết của các dung môi khác nhau có sự chênh lệch đáng kể. Với dung môi chiết là methanol, hiệu suất chiết các chất phân tích khá đồng đều nhau từ 94,99% - 100,32% và cao hơn 3 dung môi còn lại. Do đó, chọn dung môi chiết mẫu là methanol. Sau quá trình khảo sát, lựa chọn điều kiện xử lý mẫu như sau: Chế phẩm đông dược Nghiền mịn, đồng nhất Cân lượng bột tương ứng ½ liều Thêm 25 ml methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm 10 phút, ly tâm 6000 vòng/phút x 10 phút Dịch chiết

Pha loãng bằng methanol tới nồng độ thích hợp. Lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành phân tích bằng HPLC

Lấy chính xác 2,0 ml dịch trong, cô dưới luồng khí nitơ đến cắn. Hòa tan cắn bằng 1,0 ml MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành phân tích bằng HPTLC.

Hình 3. 9. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 3.3.1. Thẩm định phương pháp HPLC 3.3.1.1. Độ đặc hiệu Chuẩn bị các dung dịch sau: - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Pha hỗn hợp chuẩn có nồng độ CIN, CLO, CYP, LOR, PRO là 10 µg/ml trong methanol. - Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị 3 dung dịch nền mẫu. Xử lý theo quy trình đã xây dựng ở mục 3.2. - Dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn: Thêm chuẩn vào 3 nền mẫu sao cho sau xử lý thu được các dung dịch có nồng độ tương tự với mẫu chuẩn. Xử lý theo quy trình đã xây dựng ở mục 3.2. - Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Kết quả được trình bày ở hình 3.10

29

Hình 3. 10. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp HPLC Nhận xét: Trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic trùng với thời gian lưu của các chất phân tích. Trên sắc ký đồ mẫu nền thêm chuẩn, các pic xuất hiện trùng thời gian lưu với mẫu chuẩn, các pic đều có hình dạng đẹp, cân đối, phổ UV-VIS tại đỉnh pic có dạng giống như của mẫu chuẩn (hệ số chồng phổ của mẫu nền thêm chuẩn và mẫu chuẩn lớn hơn 0,99). Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ đặc hiệu trên cả 3 nền mẫu N1, N2, N3. 3.3.1.2. Độ thích hợp hệ thống Tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 10µg/ml vào hệ thống HPLC, đánh giá độ biến thiên của diện tích pic và thời gian lưu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3. 2. Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống HPLC STT

CIN

tR (phút) 1 16,46 2 16,44 3 16,47 4 16,47 5 16,47 6 16,47 TB 16,46 RSD 0,07%

CLO

Spic (mAU) 674649 673396 680446 674243 671565 664050 673058 0,79%

tR (phút) 6,16 6,14 6,21 6,14 6,13 6,21 6,16 0,58%

Spic (mAU) 147181 147234 147141 147158 147373 147316 147234 0,06%

CYP tR (phút) 10,47 10,44 10,50 10,47 10,46 10,50 10,47 0,21%

30

Spic (mAU) 406465 406651 407412 406762 406285 407448 406837 0,12%

LOR tR (phút) 12,81 12,79 12,83 12,81 12,80 12,82 12,81 0,11%

Spic (mAU) 341057 340802 341309 340962 341126 341326 341097 0,06%

PRO tR (phút) 9,61 9,58 9,64 9,61 9,59 9,64 9,61 0,25%

Spic (mAU) 879273 878903 882022 880006 879601 880793 880100 0,13%

Nhận xét: Từ các kết quả bảng trên cho thấy: Thời gian lưu và diện tích pic thu được của 6 lần sắc kí lặp lại mẫu chuẩn của 5 chất có giá trị RSD thấp (< 1%), đạt yêu cầu theo AOAC 2016 và ICH 2005 (RSD ≤ 2,0 %). Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký là phù hợp để định lượng đồng thời CIN, CLO, CYP, LOR, PRO. 3.3.1.3. Khoảng nồng độ tuyến tính Từ dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp chất bằng methanol. Xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic của từng chất chuẩn với nồng độ các chất, được trình bày trong bảng 3.3 Bảng 3. 3. Kết quả đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính bằng HPLC STT

CIN

CLO

CYP

LOR

PRO

C Spic C Spic C Spic C Spic C Spic (ppm) (mAu.s) (ppm) (mAu.s) (ppm) (mAu.s) (ppm) (mAu.s)(ppm) (mAu.s) C1 C2 C3 C4 C5

3,14 214117 3,40 44664 2,97 124782 3,11 106454 3,03 270934 5,23 317822 5,67 68119 4,96 189572 5,18 159172 5,06 405464 10,47 653005 11,33 146882 9,91 405811 10,36 341417 10,11 875355 15,70 920184 17,00 198951 14,87 554259 15,54 476959 15,17 1221491 20,94 1198184 22,66 265625 19,83 738234 20,72 626342 20,22 1587364

C6

26,17 1460482 28,33 323744 24,78 894259 25,90 746959 25,28 1921491 Đường y = 54502x + y = 11234x y = 35510x + y = 28545x + y = 75270x 52254 + 9178 26906 25149 + 55511 chuẩn r

0,999

0,998

0,998

0,997

0,998

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát của CIN, CLO, CYP, LOR, PRO có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ của các chất, với hệ số tương quan r > 0,995.

31

3.3.1. 4. Độ đúng và độ chính xác Độ đúng và độ chính xác trong ngày được xác định bằng cách thêm chính xác lượng dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào nền mẫu ( tương ứng khoảng ½ liều dùng: nền N1 là 2,5g; N2 là 0,7 g; N3 là 1,6 g) ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao), lắc đều, để yên 15 phút. Sau đó, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng tại mục 3.2. Nồng độ chuẩn sau khi xử lý mẫu ở 3 mức lần lượt là 3 ppm-10ppm- 20 ppm. Tiến hành lặp lại 6 lần ở mỗi mức nồng độ. Độ đúng và độ chính xác khác ngày được tiến hành tương tự nhưng vào ngày phân tích khác. Phân tích bằng phương pháp HPLC với các điều kiện đã chọn. Lượng chuẩn tìm lại tính theo đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4

32

Bảng 3. 4. Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác trên 3 nền mẫu (HPLC)

Chất

Nền N1 ( Hoàn)

phân

m*

tích

(µg/g)

CIN

CLO

CYP

LOR

PRO

31,4 104,7 209,4 34,0 113,3 226,6 29,7 99,1 198,3 31,1 103,6 207,2 30,3 101,1 202,2

Ngày 1 %thu

Nền N2 ( Cốm) Ngày 2

RSD %thu

m*

RSD (µg/g)

hồi

%

hồi

%

90,9 92,6 94,5 95,1 99,8 98,4 99,2 103,1 98,0 98,7 98,4 93,6 94,8 97,1 95,0

2,6 1,2 1,3 4,8 2,3 1,5 4,0 2,0 1,3 3,8 2,4 1,5 1,4 1,0 3,6

92,8 94,1 94,3 95,3 100,7 98,4 97,7 102,8 100,8 96,9 101,4 93,7 97,8 97,5 96,9

1,6 1,2 1,2 2,1 2,4 1,4 4,6 1,9 2,5 1,4 4,5 1,6 4,2 1,6 1,6

112,1 373,9 747,9 121,4 404,6 809,3 106,1 353,9 708,2 111,1 370,0 740,0 108,2 361,1 722,1

Ngày 1 %thu

Nền N3 ( Nang) Ngày 2

RSD %thu

RSD

hồi

%

hồi

%

98,4 92,2 96,6 98,9 102,8 99,4 93,8 101,7 98,0 97,6 103,7 92,7 94,7 99,2 94,3

1,6 2,3 4,3 1,8 3,5 2,2 4,0 2,7 1,4 4,0 2,5 1,5 3,0 1,3 3,4

97,6 91,6 95,1 102,1 102,6 99,3 97,5 101,2 99,4 100,5 100,4 92,9 94,6 97,9 91,9

2,8 2,2 4,1 1,8 3,2 2,1 3,6 2,9 1,6 3,0 2,1 1,2 3,1 1,9 2,8

m*: lượng chuẩn thêm vào 1,0 g nền mẫu

33

m* (µg/g)

49,1 163,6 327,2 53,1 177,0 354,1 46,4 154,8 309,8 48,6 161,9 323,8 47,3 158,0 315,9

Ngày 1

Ngày 2

%thu RSD %thu

RSD

hồi

%

hồi

%

94,5 92,4 97,6 95,9 101,9 98,2 99,1 100,4 99,6 100,1 99,9 94,2 94,4 95,9 92,8

2,4 2,1 3,6 2,4 4,4 2,2 4,6 1,3 1,1 3,7 1,2 1,0 1,6 1,3 3,4

91,7 93,1 96,3 95,9 100,8 98,3 95,8 99,6 103,2 97,8 98,3 94,2 90,6 97,4 94,9

4,2 1,7 4,2 2,4 3,0 2,4 4,4 1,8 1,1 1,2 1,9 1,1 2,9 1,6 3,6

Nhận xét: Kết quả cho thấy trên cả 3 nền N1, N2, N3, phương pháp có độ đúng khá cao trong khoảng từ 90,6 % -103,7 % và RSD 1,0% - 4,8% đạt theo yêu cầu của AOAC 2016 ( tỷ lệ thu hồi 80 – 110% và độ lặp lại RSD < 7,3% ở mức nồng độ < 100 ppm; tỷ lệ thu hồi 90 -107%, RSD < 5,3% ở mức nồng độ 100ppm - < 0,1%) 3.3.1.5. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp được xác định bằng cách phân tích các mẫu nền thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau. Thêm lượng chuẩn hỗn hợp với lượng giảm dần vào mỗi nền mẫu. Xử lý mẫu theo quy trình đã nêu ở phần phương pháp nghiên cứu và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Nồng độ tại đó cho tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) khoảng bằng 3 là LOD và nồng độ cho tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) khoảng bằng 10 là LOQ . Kết quả được trình bày tại bảng 3.5 và minh họa ở hình 3.11.

Hình 3. 11. Sắc ký đồ xác định LOD của phương pháp HPLC (nền N3) Bảng 3. 5. Kết quả xác định LOD, LOQ của phương pháp HPLC Hoạt chất CIN CLO CYP LOR PRO

Nền N1 Nền N2 LOD LOQ LOD LOQ (ppm) (ppm) (ppm) (ppm) 0,3 1,0 0,3 1,0 0,1 0,3 0,3 1,0 0,3 1,0 0,3 1,0 0,1 0,3 0,3 1,0 0,2 0,5 0,3 1,0

34

Nền N3 LOD LOQ (ppm) (ppm) 0,3 1,0 0,3 1,0 0,3 1,0 0,3 1,0 0,3 1,0

LOD (ppm)

LOQ (ppm)

0,3 0,1 – 0,3 0,3 0,1 – 0,3 0,2 – 0,3

1,0 0,3 – 1,0 1,0 0,3 - 1,0 0,5 – 1,0

Nhận xét: Từ bảng 3.5 cho thấy LOD và LOQ rất thấp, thấp hơn nồng độ nhỏ nhất trong khoảng nồng độ tuyến tính đã xây dựng, LOD từ 0,1 đến 0,3 ppm; LOQ từ 0,3 đến 1,0 ppm trên 3 nền mẫu. Như vậy, phương pháp HPLC đã xây dựng có độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp (từ 0,1 ppm đến 0,3 ppm ở cả 3 nền mẫu); có mối tương quan tuyến tính giữa đáp ứng và nồng độ chất phân tích trong khoảng nồng độ khảo sát (hệ số tương quan r > 0,995); độ đúng (90,6% -103,7 %) và độ chính xác (RSD = 1,0% - 4,8%) đáp ứng yêu cầu của AOAC 2016 [18]. 3.3.2. Thẩm định phương pháp HPTLC 3.3.2.1. Độ đặc hiệu Chuẩn bị các dung dịch sau: - Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Pha hỗn hợp chuẩn có nồng độ CIN, CLO, CYP, LOR, PRO là 100 µg/ml trong methanol. - Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị 3 dung dịch nền mẫu. Xử lý theo quy trình đã xây dựng. - Dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn: Thêm chuẩn vào 3 nền mẫu sao cho sau xử lý thu được các dung dịch có nồng độ tương tự với mẫu chuẩn. Xử lý theo quy trình đã xây dựng. - Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Kết quả được trình bày ở hình 3.12 .

35

Sắc ký đồ

Nền hoàn ( N1)

Chuẩn + Nền hoàn (C/N1)

Chuẩn

Nền cốm ( N2)

Chuẩn + Nền cốm (C/N2)

Nền nang( N3)

Chuẩn + Nền nang (C/N3)

Hình 3. 12. Sắc ký đồ và sắc đồ analog đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp HPTLC Nhận xét: Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu nền thêm chuẩn xuất hiện các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, quãng đường đi với các vết chính trong sắc kí đồ của mẫu chuẩn. Sắc kí đồ của các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn, hệ số tinh khiết và hệ số chồng phổ của mẫu nền thêm chuẩn và mẫu chuẩn lớn hơn 0,99. Như vậy, phương pháp

36

phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ đặc hiệu trên cả 3 nền mẫu N1, N2, N3. 3.3.2.2. Độ thích hợp hệ thống Phân tích lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 100µg/ml trên hệ thống HPTLC với các điều kiện đã lựa chọn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6. Bảng 3. 6. Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống HPTLC STT

CIN Rf Spic 1 0,72 16703 2 0,73 16131 3 0,74 16070 4 0,74 16434 5 0,74 15908 6 0,75 16146 TB 0,74 16232 RSD% 1,40 1,77 Nhận xét:

CLO Rf Spic 0,27 11825 0,27 11990 0,27 12005 0,27 12007 0,28 11850 0,28 11817 0,27 11916 1,89 0,79

CYP Rf Spic 0,55 15002 0,55 15450 0,55 15614 0,56 15385 0,56 14972 0,57 15023 0,56 15241 1,47 1,81

LOR Rf Spic 0,35 16248 0,35 15956 0,35 15956 0,35 15935 0,36 16126 0,36 16084 0,35 16051 1,46 0,77

PRO Rf Spic 0,45 19128 0,46 19455 0,46 18916 0,46 18966 0,46 19543 0,47 19291 0,46 19216 1,37 1,34

Từ các kết quả bảng 3.6 cho thấy: Hệ số Rf và diện tích pic thu được của 6 lần phân tích lặp lại mẫu chuẩn của 5 chất có giá trị RSD < 2%, đạt yêu cầu theo AOAC 2016 [18] (RSD ≤ 2,0 %). Điều này chứng tỏ hệ thống HPTLC là phù hợp để định lượng đồng thời CIN, CLO, CYP, LOR, PRO. 3.3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính Từ dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp bằng methanol là 25 – 250 ppm. Tiến hành phân tích trên hệ thống HPTLC với các điều kiện đã lựa chọn, rồi xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic của từng chất chuẩn với nồng độ các chất, được thể hiện trong bảng 3.7

37

Bảng 3. 7. Kết quả đánh giá khoảng nồng độ tuyến tính bằng HPTLC STT

CIN CLO CYP LOR C Spic C Spic C Spic C (ppm) Spic (ppm) (ppm) (ppm) 1 26,17 6839 28,33 3045 24,78 5987 25,90 6462 2 52,34 10106 56,66 5053 49,56 9023 51,79 9785 3 104,69 16122 113,32 11570 99,13 14834 103,59 15509 4 157,03 20890 169,97 15826 148,69 18794 155,38 20079 5 209,37 26593 226,63 19732 198,26 23580 207,17 25664 6 261,71 32156 283,29 23863 247,82 28856 258,96 30059 Đường y = 106,0x + y = 82,54x + y = 100,2x + y = 100,7x + chuẩn 4441 1100 4010 4445 r

0,999

0,995

0,998

0,998

PRO C Spic (ppm) 25,28 8272 50,56 12023 101,11 18899 151,67 23754 202,23 30202 252,78 36375 y = 121,3x + 5740 0,998

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ đã khảo sát của CIN, CLO, CYP, LOR, PRO có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ của các chất, với hệ số tương quan r ≥ 0,995, do đó có thể ứng dụng phương pháp để định lượng các chất phân tích có nồng độ trong khoảng nồng độ tuyến tính này. 3.3.2.4. Độ đúng và độ chính xác ( độ lặp lại) Độ đúng và độ chính xác trong ngày được xác định bằng cách thêm chính xác lượng dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào nền mẫu ( tương ứng khoảng ½ liều dùng) ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao), lắc đều, để yên 15 phút. Sau đó tiến hành xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng tại mục 3.2. Nồng độ chuẩn sau khi xử lý mẫu ở 3 mức lần lượt là 25 ppm -100ppm - 200ppm. Tiến hành lặp lại 6 lần ở mỗi mức nồng độ. Mỗi bản mỏng đều chấm dãy nồng độ chuẩn để tính toán kết quả. Độ đúng và độ chính xác khác ngày được tiến hành tương tự nhưng vào ngày phân tích khác. Phân tích bằng phương pháp HPTLC với các điều kiện đã chọn. Kết quả được trình bày trong bảng 3.8

38

Bảng 3. 8. Kết quả đánh giá độ đúng và độ chính xác trên 3 nền mẫu (HPTLC)

Chất

Nền N1 ( Hoàn)

phân

m*

tích

( µg/g)

CIN

CLO

CYP

LOR

PRO

130,9 523,4 1046,9 141,6 566,6 1133,2 123,9 495,6 991,3 129,5 517,9 1035,9 126,4 505,6 1011,1

Ngày 1 %thu

Nền N2 ( Cốm) Ngày 2

RSD %thu

RSD

hồi

%

hồi

%

96,0 96,1 98,6 96,5 97,9 99,0 93,1 97,3 93,0 96,6 102,1 97,4 93,5 96,1 96,2

4,4 4,2 1,8 5,1 4,8 1,6 2,0 1,5 1,4 3,5 1,5 1,4 3,3 4,9 1,1

94,4 93,5 98,2 95,3 95,6 97,7 96,1 101,2 96,7 96,3 96,6 98,8 98,1 97,3 100,5

2,8 2,6 1,9 2,7 3,4 1,9 5,0 2,9 4,2 4,5 4,5 1,5 3,2 4,2 2,5

m* ( µg/g)

467,3 1869,4 3738,8 505,9 2023,5 4047,0 442,5 1770,2 3540,3 462,4 1849,7 3699,5 451,4 1805,6 3611,2

Ngày 1 %thu

Nền N3 ( Nang) Ngày 2

RSD %thu RSD

hồi

%

hồi

%

98,4 99,8 99,2 96,9 99,6 99,4 97,8 100,4 98,1 99,7 100,4 99,7 99,8 99,3 99,2

2,7 3,5 1,8 3,8 2,5 1,1 4,3 3,4 2,1 3,4 1,9 3,1 4,5 2,1 2,2

96,3 101,3 98,1 97,6 98,9 99,4 96,1 101,2 98,8 96,6 98,9 99,4 96,6 101,6 97,5

4,5 2,3 1,4 4,6 3,3 3,2 3,9 3,3 2,4 4,6 2,6 1,7 3,7 1,8 2,4

m*: lượng chuẩn thêm vào 1,0 g nền mẫu

39

m* ( µg/g)

204,5 817,9 1635,7 221,3 885,3 1770,6 193,6 774,4 1548,9 202,3 809,3 1618,5 197,5 789,9 1579,9

Ngày 1 %thu

Ngày 2

RSD %thu

RSD

hồi

%

hồi

%

100,5 97,0 98,9 97,1 98,0 98,9 94,1 100,7 98,9 95,3 99,7 97,4 96,1 96,7 98,9

2,3 3,7 2,9 4,3 3,6 2,9 3,7 3,0 2,0 5,0 3,7 2,5 4,7 4,9 2,5

96,7 98,6 98,9 99,6 94,4 98,7 94,2 98,3 98,2 98,4 98,6 99,0 98,4 96,5 98,6

4,9 4,5 2,9 3,1 4,6 2,6 4,1 3,0 0,7 4,4 1,1 1,9 2,3 3,9 2,1

Nhận xét: Kết quả cho thấy trên cả 3 nền N1, N2, N3, phương pháp có độ đúng khá cao trong khoảng từ 93,0 % -102,1 % và RSD 0,7% - 5,1% đạt theo yêu cầu của AOAC 2016 ( tỷ lệ thu hồi 90 – 107% và độ lặp lại RSD < 5,3% ở mức nồng độ 100ppm - < 0,1%; tỷ lệ thu hồi 95 – 105% và độ lặp lại RSD < 3,7% ở mức nồng độ 0,1% - < 1% ) 3.3.2.5. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp được xác định bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ khác nhau. Thêm lượng chuẩn hỗn hợp với lượng giảm dần vào mỗi nền mẫu. Xử lý mẫu theo quy trình đã xây dựng tại mục 3.2 và tiến hành phân tích trên hệ thống HPTLC với các điều kiện đã chọn. Nồng độ tại đó cho tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) khoảng bằng 3 là LOD và nồng độ cho tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu nền(S/N) khoảng bằng 10 là LOQ . Kết quả được trình bày tại bảng 3.9 và hình 3.13.

Hình 3. 13. Sắc ký đồ analog xác định LOD trên nền viên nang (N3) (HPTLC) Bảng 3. 9. Kết quả xác định LOD, LOQ bằng HPTLC Hoạt chất

Nền N1 LOD LOQ

Nền N2 LOD LOQ

Nền N3 LOD LOQ

ppm (ng/vết) ppm (ng/vết) ppm (ng/vết) ppm (ng/vết) ppm (ng/vết) ppm (ng/vết)

CIN 2 CLO 2 CYP 2 LOR 2 PRO 2 Nhận xét: Từ

10 6 30 10 6 30 10 6 30 10 6 30 10 6 30 bảng 3.9 cho thấy

3 3 3 3 3 LOD

15 10 50 15 10 50 15 10 50 15 10 50 15 10 50 và LOQ thấp, thấp

trong khoảng nồng độ tuyến tính đã xây dựng.

40

2 2 2 2 2 hơn

10 6 10 6 10 6 10 6 10 6 nồng độ nhỏ

30 30 30 30 30 nhất

Như vậy, Phương pháp HPTLC đã xây dựng có độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp ( từ 10 đến 15 ng/vết ở cả 3 nền mẫu); có mối tương quan tuyến tính giữa đáp ứng và nồng độ chất phân tích trong khoảng nồng độ khảo sát (hệ số tương quan r ≥ 0,995); độ đúng (93,0 % -102,1 %) và độ chính xác (RSD = 0,7% - 5,1% ) đáp ứng yêu cầu của AOAC 2016 [18]. 3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực lưu hành trên thị trường Thu thập mẫu: 25 chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng, đau đầu,mất ngủ, kích thích ăn ngon, tăng cân ; từ các nguồn khác nhau, trong đó 2 chế phẩm được mua qua mạng internet; 8 chế phẩm được mua tại các nhà thuốc đông y; 15 chế phẩm còn lại do người sử dụng nghi ngờ gửi đến kiểm tra. Các mẫu được lưu hành ở Hà Nội, Nam Định, Thái Bình, Đà Nẵng, Khánh Hòa, An Giang; có số đăng ký hoặc không; bao gồm 3 chế phẩm hoàn cứng, 3 chế phẩm hoàn mềm, 6 chế phẩm viên nang cứng, 13 chế phẩm dạng bột. Tiến hành xử lý mẫu và phân tích các mẫu bằng hai phương pháp. 3.4.1. Kết quả phân tích mẫu thực bằng HPTLC Tiến hành xử lý các mẫu thử và phân tích theo quy trình đã xây dựng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.10, bảng 3.11 và thể hiện ở hình 3.14 và 3.15.

Hình 3. 14. Sắc ký đồ phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPTLC

41

Bảng 3. 10. Kết quả định tính trên mẫu thực bằng phương pháp HPTLC Mẫu thực M01 M02 M03 M04 M05 M06 M07 M08 M09 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25

Dạng bào Nguồn gốc CIN CLO CYP chế Bột Internet + Bột Internet + Nang cứng Lương y + + Nang cứng Lương y Bột Lương y Hoàn cứng Lương y Hoàn mềm Lương y Bột Lương y + Bột Lương y Bột Lương y Hoàn mềm Mẫu gửi Nang cứng Mẫu gửi Bột Mẫu gửi + Hoàn mềm Mẫu gửi + Bột Mẫu gửi Hoàn cứng Mẫu gửi + + Bột Mẫu gửi Bột Mẫu gửi Bột Mẫu gửi Hoàn cứng Mẫu gửi Bột Mẫu gửi + Nang cứng Mẫu gửi + Nang cứng Mẫu gửi Nang cứng Mẫu gửi Bột Mẫu gửi + (-): Không phát hiện (<LOD); (+): Phát hiện

42

LOR

PRO

+ -

+ -

Bảng 3. 11. Kết quả định lượng các mẫu thực dương tính bằng HPTLC Nguồn

Dạng bào

gốc

chế

M01

Internet

Bột

M02

Internet

Bột

M03

Lương y

Nang cứng

Mẫu thử

M08

Lương y

Bột

M12

Mẫu gửi

Nang cứng

M13

Mẫu gửi

Bột

M14

Mẫu gửi

Hoàn mềm

M16

Mẫu gửi

Hoàn cứng

M19

Mẫu gửi

Bột

M21

Mẫu gửi

Bột

M22

Mẫu gửi

Nang cứng

M25

Mẫu gửi

Bột

mTB

Liều

Chất

đơn vị

dùng

phát

(g)

/ngày

hiện

1gói

CLO

2 gói

CLO

6,34 3,23 0,56 2,23 0,54 4,98 5,67 0,25 6,56 4,38 0,25 5,65

6 viên

CIN CLO

2 gói

CLO

6 viên

PRO

2 gói

CYP

2 viên

CYP

50 viên

CIN CYP

2 gói

LOR

2 gói

CLO

10 viên

CLO

2 gói

CLO

43

Hệ số

Hệ số

match

purity

0,26

0,9923

0,26

Rf

Hàm Hàm lượng Hàm lượng lượng (mg/đơn vị (mg/liều 1 (mg/g)

mẫu)

ngày)

0,999

0,52

3,29

3,29

0,9984

0,998

0,84

2,71

5,41

0,70

0,9926

0,999

0,79

0,44

2,66

0,25

0,9912

0,999

0,94

0,53

3,15

0,27

0,9924

0,997

2,06

4,59

9,18

0,43

0,9959

1,000

1,67

0,90

5,42

0,53

0,9925

0,999

0,65

3,24

6,49

0,52

0,9931

0,999

0,36

2,06

4,12

0,71

0,9929

0,999

0,65

0,16

8,10

0,51

0,9947

0,998

0,09

0,02

1,10

0,35

0,9921

0,997

0,25

1,63

3,26

0,26

0,9929

0,999

2,08

9,10

9,10

0,26

0,9994

0,999

9,53

2,38

9,53

0,26

0,9927

0,999

0,18

1,00

1,99

(a)

(b)

Hình 3. 15. Sắc ký đồ HPTLC analog của mẫu dương tính M22 (a) và chồng phổ UV tại vị trí có Rf = 0,26 ( vết CLO) của M22 và CLO chuẩn (b) Nhận xét: Kết quả phân tích trên 25 mẫu chế phẩm đông dược thu thập được đã phát hiện 12 chế phẩm bị trộn trái phép với một số hoạt chất nghiên cứu. Các mẫu dương tính đều có hệ số tinh khiết của vết và hệ số chồng phổ của vết so với vết chuẩn đều lớn hơn 0,99. Trong đó , phát hiện 2 mẫu dương tính cinarizin, 3 mẫu dương tính với cyproheptadin hydroclorid , 7 mẫu dương tính với clorpheniramin maleat, 1 mẫu dương tính loratadin, 1 mẫu dương tính với promethazin .

44

3.4.2. Kết quả phân tích mẫu thực bằng phương pháp HPLC Tiến hành xử lí các mẫu thử và phân tích theo quy trình đã xây dựng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12, bảng 3.13 và hình 3.16. Bảng 3. 12. Kết quả định tính trên mẫu thực bằng phương pháp HPLC Mẫu thực M01 M02 M03 M04 M05 M06 M07 M08 M09 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25

Dạng bào Nguồn gốc CIN CLO CYP chế Bột Internet + Bột Internet + Nang cứng Lương y + + Nang cứng Lương y Bột Lương y Hoàn cứng Lương y Hoàn mềm Lương y Bột Lương y + Bột Lương y Bột Lương y Hoàn mềm Mẫu gửi Nang cứng Mẫu gửi Bột Mẫu gửi + Hoàn mềm Mẫu gửi + Bột Mẫu gửi Hoàn cứng Mẫu gửi + + Bột Mẫu gửi Bột Mẫu gửi Bột Mẫu gửi Hoàn cứng Mẫu gửi Bột Mẫu gửi + Nang cứng Mẫu gửi + Nang cứng Mẫu gửi Nang cứng Mẫu gửi Bột Mẫu gửi + (-): Không phát hiện (<LOD); (+): Phát hiện

45

LOR

PRO

+ -

+ -

Bảng 3. 13. Kết quả định lượng các mẫu thực dương tính bằng HPLC Nguồn

Dạng bào

gốc

chế

M01

Internet

Bột

M02

Internet

Bột

M03

Lương y

Nang cứng

Mẫu thử

M08

Lương y

Bột

M12

Mẫu gửi

Nang cứng

M13

Mẫu gửi

Bột

M14

Mẫu gửi

Hoàn mềm

M16

Mẫu gửi

Hoàn cứng

M19

Mẫu gửi

Bột

M21

Mẫu gửi

Bột

M22

Mẫu gửi

Nang cứng

M25

Mẫu gửi

Bột

mTB

Liều

Chất

đơn vị

dùng

phát

(g)

/ngày

hiện

1gói

CLO

2 gói

CLO

6,34 3,23 0,56 2,23 0,54 4,98 5,67 0,25 6,56 4,38 0,25 5,65

6 viên

CIN CLO

2 gói

CLO

6 viên

PRO

2 gói

CYP

2 viên

CYP

50

CIN

viên

CYP

2 gói

LOR

2 gói

CLO

10 viên

CLO

2 gói

CLO

46

tR

Hệ số match

Hàm

Hàm lượng Hàm lượng

lượng

(mg/đơn vị (mg/liều 1

(mg/g)

mẫu)

ngày)

6,035

0,9988

0,53

3,39

3,39

6,135

0,9922

0,91

2,95

5,90

16,437

0,9926

0,79

0,44

2,67

5,937

0,9997

0,95

0,53

3,20

5,839

0,9990

2,13

4,75

9,49

9,372

0,9919

1,82

0,98

5,89

10,265

0,9927

0,66

3,27

6,54

10,412

0,9991

0,40

2,26

4,52

16,725

0,9916

0,66

0,17

8,26

10,442

0,9989

0,09

0,02

1,07

12,799

0,9991

0,26

1,70

3,39

5,913

0,9979

2,13

9,32

9,32

6,016

0,9998

9,63

2,41

9,63

5,923

0,9997

0,18

1,02

2,03

196

200 (a)

300

400

500

755

658

487

0

392

244 261

500

309 329

mAU 1500 6.016/ 1.00 0.9998 clo.jcm/ 1.04 1000

600

700

nm

(b)

Hình 3. 16. Sắc ký đồ HPLC mẫu dương tính M22 (a) và chồng phổ UV tại tại vị trí có tR = 6,016 ( pic CLO) của M22 và CLO chuẩn (b) Nhận xét: Kết quả phân tích trên 25 mẫu chế phẩm đông dược thu thập được đã phát hiện 12 chế phẩm bị trộn trái phép với một số hoạt chất nghiên cứu. Các mẫu dương tính đều có hệ số chồng phổ của pic so với pic chuẩn đều lớn hơn 0,99. Trong đó, phát hiện 2 mẫu dương tính cinarizin, 3 mẫu dương tính với cyproheptadin hydroclorid , 7 mẫu dương tính với clorpheniramin maleat, 1 mẫu dương tính loratadin, 1 mẫu dương tính với promethazin .

47

Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Tạo nền mẫu Hiện nay trên thị trường có rất nhiều chế phẩm điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay mẩn ngứa, dị ứng với nhiều dạng bào chế khác nhau (viên hoàn, viên nén, viên nang, thuốc bột…). Nghiên cứu dựa vào các bài thuốc cổ phương và các bài thuốc gia truyền có thành phần gần giống các mẫu trên thị trường tiến hành bào chế 03 nền mẫu viên nang cứng, viên hoàn, bột cốm ; với liều lượng sau chế biến căn cứ vào liều dùng của các bài thuốc. Thành phần nền N1 (viên hoàn) dựa vào bài thuốc cổ truyền “Ngân kiều tán” trong sách Ôn bệnh điều biện, gồm 9 loại dược liệu có tác dụng tân lương, thấu biểu, thanh nhiệt, tiêu độc, như sau: kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, bạc hà, trúc diệp, kinh giới tuệ, đạm đậu xị, ngưu bàng tử, cam thảo. Thành phần nền mẫu N2 (bột cốm) dựa vào bài thuốc cổ truyền “Liên kiều bại độc tán” trong sách Thương biện toàn sinh tập gồm 14 loại dược liệu có tác dụng tư âm, phát hãn giải biểu, tán phong nhiệt trừ thấp như: liên kiều, chi tử, khương hoạt, huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy, hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử. Thành phần nền mẫu N3 (viên nang) dựa vào bài thuốc cổ truyền “Tiêu phong tán” trong sách Y tông kim giám, gia giảm thành phần của bài thuốc gồm 11 loại dược liệu như sau: kinh giới, phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền soái, sinh địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo có tác dụng khu phong, thanh nhiệt. Các nền mẫu này tương tự các sản phẩm được cấp số đăng ký lưu hành trên thị trường như “ Ngân kiều giải độc TW3” ( Công ty Cổ phần dược phẩm trung ương 3), “ Ngân kiều giải độc Xuân Quang” ( Công ty TNHH đông dược Xuân Quang), “Ngân kiều giải độc Favomin” (Công ty cổ phẩn Dược phẩm OPC), “Ngân kiều giải độc PV” (CTCP dược thảo Phúc Vinh), “ Ngân kiều giải độc-f” ( Công ty TNHH FITO PHARMA), “Thuốc bột giải nhiệt tiêu ban tán” (Cơ sở Phú Sơn), “Thanh nhiệt giải độc SXH” (Công ty cổ phần BV Pharma)… do đó 3 nền mẫu này

48

có tính đại diện nhất định cho các chế phẩm đông dược dạng rắn có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa. 4.2. Xây dựng phương pháp phân tích 4.2.1. Lựa chọn phương pháp phân tích Phương pháp HPTLC giữ được ưu điểm của TLC là phân tích khá đơn giản, tiến hành được đồng thời với số lượng mẫu lớn, mẫu không nhất thiết phải xử lý quá sạch trước khi tiêm, tiết kiệm thời gian phân tích và chi phí, cho kết quả nhanh, dễ triển khai ở các phòng phân tích. Ngoài ra, còn phát huy tính năng UV scanner, có thể quét phổ UV, đánh giá độ tinh khiết pic và hệ số chồng phổ với vết chuẩn, tương tự như định tính bằng HPLC-UV sẽ cho kết quả chính xác hơn, tín hiệu từ UV scanner cũng cho pic hấp thụ UV của từng vết, giúp định lượng nhanh nhóm chất phân tích trên bản mỏng. Phương pháp này phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao. Tuy nhiên khi chồng phổ, một số vết có cùng cực đại hấp thụ tại các bước sóng như chất chuẩn nhưng hình dạng pic không hoàn toàn trùng khớp (hệ số match không đạt). Nguyên nhân có thể là do các chất không tách khỏi hoàn toàn được dược liệu trong thành phần của chế phẩm đông dược. Phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm như có độ đặc hiệu, độ nhạy cao, độ chính xác đảm bảo đã và đang được ứng dụng nhiều trong phân tích thuốc. Đặc biệt, trong cấu trúc hóa học của CIN, CLO, CYP, LOR, PRO có chứa vòng thơm nên có khả năng hấp thụ UV, đây là cơ sở để có thể dễ dàng thực hiện phép định lượng bằng phương pháp HPLC với detector PDA. Các nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược chống dị ứng nhóm kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược cho đến nay vẫn còn hạn chế. Các nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng [3], mới dừng ở mức sàng lọc, phát hiện định tính. Các nghiên cứu định lượng chủ yếu sử dụng thiết bị GC-MS [41], LC-MS [38], LC-MS-MS [14], [39], [53], [54], các phương pháp này cho độ đặc hiệu, độ nhạy cao, nhưng hệ thống MS rất đắt tiền và không phổ biến ở các phòng phân tích như HPLC và HPTLC. Mặt khác, qui trình định lượng chất kháng

49

histamin H1trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC mới chỉ xây dựng đối với CLO [55] nên cần mở rộng trên những chất khác trong nhóm. Đào Thị Cẩm Minh và cộng sự đã phát triển phương pháp HPTLC định tính, định lượng các nhóm thuốc tiểu đường, glucocorticoid, các thuốc giảm đau chống viêm [10], [11] bị trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược,… Nhưng đối với thuốc kháng histamin H1, theo như tài liệu chúng tôi thu thập được, chưa có công bố nào định lượng các chất thuộc nhóm này trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược. Do đó việc phát triển phương pháp HPTLC rất có ý nghĩa trong công tác kiểm tra chất lượng thuốc. 4.2.2. Xây dựng phương pháp sắc ký Khi xây dựng phương pháp HPTLC, thành phần và tỷ lệ pha động được khảo sát dựa trên các tài liệu và các nghiên cứu đã công bố [3], [8], [16], [24], [25], [29], [44] và các dung môi thông thường, là n-hexan, dicloromethan, triethylamin, cyclohexan, aceton, amoniac, ethylacetat, methanol . Bản mỏng sử dụng là bản mỏng silicagel GF 254 loại dùng cho TLC và loại dùng cho HPTLC. Bốn hệ dung môi đã được khảo sát, kết quả hệ dung môi cyclohexan: aceton: triethylamin (80:10:10) được lựa chọn để phát hiện đồng thời 5 chất phân tích. Tiến hành thay đổi các thành phần cyclohexan, aceton, triethylamin tối ưu hóa điều kiện tách 5 chất phân tích. Kết quả với tỷ lệ Cyclohexan: aceton: triethylamin (8: 2: 0,5) có khả năng tách các chất tốt và Rf các chất nằm trong khoảng 0,2-0,8. Sử dụng bản mỏng HPTLC khi phân tích bằng phần mềm WinCATs cho các vết tách hẳn nhau và hình dạng các pic cân đối hơn so với sử dụng bản mòng TLC thông thường. Với phương pháp HPLC, tham khảo điều kiện phân tích trong công bố [7], [16], [36], [46] và kết quả khảo sát bằng thực nghiệm về cột tách, thành phần và tỷ lệ pha động, chế độ gradient, tốc độ dòng pha động, lựa chọn điều kiện tách phát hiện đồng thời 5 chất phân tích trên 3 nền mẫu viên nang, bột cốm, viên hoàn. Pha động được lựa chọn là ACN- natri heptansulfonat 0,01 M (điều chỉnh đến pH =2,8 bằng acid acetic băng) được thay đổi với các tỷ lệ khác nhau để có thể tách được các chất, hạn chế sự ảnh hưởng của nền mẫu. Tuy nhiên, khi sử dụng chương trình đẳng dòng thời gian lưu của chất cuối cùng được rửa giải là rất lâu. Để giảm thời gian phân

50

tích, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa và đã thiết lập được chế độ chạy gradient (từ 0 17 phút ACN 38% -> 67% ; từ 17 – 20 phút ACN từ 67% -> 38%) các pic có thời gian lưu từ 5,2 - 14,7 phút. Khi phân tích mẫu đông dược với khoảng thời gian 5 phút đầu là thời gian rửa giải của nhiều thành phần trong dược liệu. Do đó, tiến hành lựa chọn tốc độ dòng pha động kéo dài được thời gian lưu của các chất phân tích, nhằm giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu, nhưng vẫn giữ được pic cân đối, nhỏ gọn . Vì vậy, lựa chọn tốc độ dòng 1,3 ml/phút thì thời gian lưu chất đầu tiên là 6,0 phút. Lựa chọn bước sóng phát hiện các chất sao cho các chất có cường độ hấp thụ UV lớn, mà không bị ảnh hưởng nhiều bởi nền mẫu, do đó chọn bước sóng 254 nm là phù hợp. Với điều kiện sắc ký HPLC xây dựng được các pic nhỏ gọn, sắc nét, cân đối, tách nhau rõ ràng, cường độ tín hiệu pic phù hợp để phân tích 4.2.3. Lựa chọn xử lý mẫu Xử lý mẫu trong phân tích là bước quan trọng ảnh hưởng đến độ chính xác của phương pháp phân tích. Phương pháp xử lý mẫu được coi là tối ưu khi chiết được mẫu với hiệu suất cao nhất và hạn chế được tạp trong nền mẫu nhiều nhất. Với các nền mẫu chứa rất nhiều dược liệu thì việc tìm ra một phương pháp xử lý mẫu vừa nhanh chóng, tiết kiệm chi phí và phù hợp với điều kiện của hầu hết các phòng kiểm nghiệm là rất cần thiết. Sử dụng phương pháp chiết trực tiếp với các dung môi khảo sát là MeOH, ACN, C2H5OH, MeOH- H2O (50:50). Nghiên cứu đã sử dụng dung môi chiết là methanol với qui trình xử lý mẫu đơn giản, nhanh chóng, hiệu suất chiết 5 chất nghiên cứu cao đều nằm trong khoảng từ 94,99% - 100,32% và cao hơn 3 dung môi còn lại. 4.3. Thẩm định phương pháp Cả 2 phương pháp HPLC và HPTLC đều đạt các tiêu chí gồm độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ đúng và độ chính xác theo AOAC 2016 [18]. Nghiên cứu xây dựng khoảng tuyến tính của các chất nghiên cứu ở mức nồng độ khá thấp từ khoảng 3-25 µg/ml ( đối với HPLC) và 25-250 µg/ml ( đối với HPTLC). Với khoảng tuyến tính này có thể phát hiện được các hoạt chất nghiên cứu với tỷ lệ được trộn rất nhỏ trong mẫu.

51

Độ đặc hiệu được thẩm định trên 3 nền mẫu, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn. Kết quả sắc ký đồ cho thấy 2 phương pháp có độ đặc hiệu đảm bảo để phân tích đồng thời CIN, CLO, CYP, LOR, PRO trên nền các chế phẩm đông dược. Phương pháp HPTLC có LOD của nghiên cứu là 10 -15 ng/vết (2-3 ppm) có khả năng phát hiện các chất trộn trong chế phẩm đông dược ở mức 1/80 của liều điều trị. Còn phương pháp HPLC có LOD của nghiên cứu là 0,1 -0,3 µg/mL có khả năng phát hiện các chất trộn trong thuốc đông dược ở mức thấp hơn HPTLC khoảng 10 lần (1/800) của liều điều trị, nên có ý nghĩa thực tiễn cao. LOD của nghiên cứu phương pháp HPTLC (2-3 ppm) và HPLC ( 0,1-0,3 ppm) cao hơn kết quả LC-MS/MS đã được công bố: của Phạm Thị Thanh Tuyền (LOD của Clorpheniramin maleat, loratadin và cyproheptadin hydroclorid là 0,083 – 0,165ng/ml) [14], của Kim Eun Hye (LOD của Clorpheniramin maleat, loratadin, cyproheptadin hydroclorid, promethazin hydroclorid là 0,02 – 16,04 ng/ml) [38], của Bogusz M. J. ( LOD của Clorpheniramin maleat là 5 pg to 1 ng/ml) [19], của YE. Lin-hu (LOD của loratadin và cyproheptadin hydroclorid đều là 0,5 ng/ml)[54] và cao hơn kết quả GC/LS đã được công bố của Lin YP. (LOD của Clorpheniramin maleat, Cinnarizin từ 10 to 1000 μg/g) [41]. Tuy nhiên, giới hạn này thấp hơn kết quả TLC của Nguyễn Thị An (LOD của Clorpheniramin maleat, loratadin và cyproheptadin hydroclorid là 50-100 µg/mL ) [3]. Cả 2 phương pháp đều có thể mắc âm tính giả nếu nồng độ các chất trong mẫu thử dưới LOD, hoặc có thể dương tính giả nếu thành phần dược liệu có cùng tR (hoặc Rf) và hình dáng phổ UV so với chất phân tích. Do đó, cần so sánh thêm với phương pháp qui chiếu, có độ nhạy cao là LC-MS/MS để có thể đánh giá khách quan và khả năng của 2 phương pháp xây dựng được trong thực tiễn. 4.4. Ứng dụng Ứng dụng phương pháp HPTLC và HPLC phân tích các chất nghiên cứu trong 25 mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường, cho phép định tính các chất trong mẫu thực không chỉ dựa vào Rf ,thời gian lưu mà còn chồng phổ UV nên kết quả được khẳng định hơn. Nhiều mẫu khi dựa vào Rf (hoặc tR ) thì dương tính, nhưng khi chồng phổ UV thì hệ số match không đạt. Ví dụ như mẫu M12 sắc ký đồ với

52

phương pháp HPLC cho 3 pic CLO, PRO, CYP nhưng khi chồng phổ UV so với phổ chuẩn thì chỉ có pic PRO có hệ số match > 0,99; với phương pháp HPTLC cho 2 pic của CLO, PRO nhưng khi chồng phổ so với phổ chuẩn thì chỉ có vết PRO có hệ số match > 0,99. Như vậy, khả năng phát hiện của cả 2 phương pháp HPLC và HPTLC được nâng cao vì các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu đều có cả tính năng quét phổ (scanner – HPTLC và PDA – HPLC). Kết quả HPTLC và HPLC giống nhau khi phát hiện (định tính) trong 25 mẫu chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay mẩn ngứa có 12 mẫu gồm 2 mẫu dạng viên hoàn, 2 mẫu nang, 8 mẫu dạng bột dương tính. Trong đó, phát hiện 2 mẫu dương tính cinarizin , 3 mẫu dương tính với cyproheptadin hydroclorid , 7 mẫu dương tính với clorpheniramin maleat , 1 mẫu dương tính loratadin , 1 mẫu dương tính với promethazin . Có sự tương đương về kết quả là do thiết bị HPLC và HPTLC sử dụng đều dựa trên quãng đường đi (thời gian lưu tR/ thừa số chậm Rf) của chất phân tích được tách ra trong hỗn hợp và phổ. Kết quả định lượng HPTLC và HPLC, chênh lệch nhau không nhiều từ 0,030,49 mg/liều 1 ngày (khoảng 0,2 -8,8 %). Đây là sự sai khác có thể chấp nhận được với 2 phương pháp khác nhau, trên nền mẫu phức tạp. Lượng thuốc hóa dược trộn vào tương ứng với 10 - 80% liều điều trị do đó nếu dùng thời gian dài, không kiểm soát có thể gây tác dụng phụ cho người sử dụng. Các chế phẩm dương tính đều do người dùng nghi ngờ gửi tới (8/12 mẫu), mua qua mạng internet và mua tại nhà thuốc đông y (mỗi loại 2 mẫu). Các chế phẩm này đa số không có số đăng ký/ số công bố. Việc các sản phẩm không có số đăng ký được bán trôi nổi trên thị trường Việt Nam có chứa các hóa dược không khai báo đã được các nghiên cứu [3], [9], [10], [11],[12],[13], [14] .. đề cập đến. Do đó, cần đẩy mạnh kiểm tra các chế phẩm đông dược, đặc biệt đối với các chế phẩm không có số đăng ký, được bán qua các trang mạng internet, các sản phẩm của các lương y.

53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ các kết quả thu được, chúng tôi có những kết luận sau: 1. Đã xây dựng được phương pháp xác định CIN, CLO, CYP, LOR, PRO trộn trái phép trong chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, dị ứng bằng HPLC và HPTLC đơn giản, phù hợp với điều kiện hiện có của đa số đơn vị phân tích. Qui trình xử lý mẫu đơn giản với dung môi dễ kiếm là methanol cho hiệu suất chiết cao từ 95,0% - 100,3% . Các pha tĩnh thông thường là cột RP – C18 đối với HPLC và Silicagel 60 GF254 đối với HPTLC. Thời gian phân tích ngắn chỉ khoảng 20 phút đối với cả 2 phương pháp cho phép tách riêng biệt 5 chất với độ phân giải đảm bảo yêu cầu. 2. Hai phương pháp thẩm định theo hướng dẫn của AOAC (2016) đều đạt yêu cầu các tiêu chí gồm độ phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ đúng và độ chính xác. Cả hai phương pháp đều có độ đúng và độ chính xác đạt qui định ở mức nồng độ đánh giá, cụ thể là phương pháp HPTLC có độ đúng từ 93,0 % -102,1 % với độ chính xác có RSD = 0,7% - 5,1%; phương pháp HPLC có độ đúng từ 90,6% -103,7 % với độ chính xác có RSD = 1,0% - 4,8% đối với cả 5 chất nghiên cứu. Phương pháp có độ nhạy cao với LOD đối với phương pháp HPTLC và HPLC lần lượt là 10 -15 ng/vết và 0,3 -0,5 µg/ml cho phép phát hiện các chất phân tích trộn trong chế phẩm đông dược ứng với lượng 1/80 (HPTLC) và 1/800 (HPLC) liều điều trị. 3. Đã phát hiện 12/25 mẫu nghiên cứu dương tính với 5 thuốc kháng histamin H1 cinarizin, cyproheptadin hydroclorid, clorpheniramin maleat, loratadin, promethazin hydroclorid ở dạng bào chế bột, hoàn, nang. Các mẫu có thể chỉ trộn 1 thuốc (10/12 mẫu) hoặc thậm chí 2 thuốc (2/12 mẫu). Lượng các thuốc hóa dược được trộn vào chế phẩm đông dược khoảng 10–80% liều điều trị đối với cả 5 thuốc nghiên cứu. Đa số các mẫu dương tính là không có số đăng ký/ số công bố và được mua qua mạng internet, do đó người dùng cần cân nhắc khi sử dụng các sản phẩm không có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng, không có số đăng ký/ số công bố

54

KIẾN NGHỊ -

Ứng dụng phương pháp để kiểm tra các chế phẩm đông dược có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, đặc biệt là các chế phẩm không có số đăng kí và được bán qua mạng, nhà thuốc đông y.

-

Tiếp tục nghiên cứu và phát triển phương pháp HPTLC, HPLC trên các dược chất kháng histamin H1 khác và/ hoặc trên các nền mẫu đông dược ở các dạng bào chế khác như dạng dung dịch, siro, viên nang mềm,…

55

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Trần Tử An (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr.84-104. 2. Trần Tử An (2012), Hóa phân tích tập 2: Phân tích dụng cụ, Nhà xuất bản Y học, tr.168-214. 3. Nguyễn Thị An (2019), " Xây dựng phương pháp xác định các thuốc kháng histamine trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS và TLC", khóa luận tốt nghiệp dược sĩ 2019, trường đại học Dược Hà Nội. 4. Bộ Y tế (2018), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,tr.391, 445, 923, 1196. 5. Bộ Y tế (2009), Thuốc biệt dược và cách sử dụng, Nhà xuất bản Y học, tr.192, 206, 255,546, 782. 6. Bộ Y tế (2012), Dược lý học tập 2, Nhà xuất bản Y học, tr. 342-354. 7. Trần Thị Hoàng Chi, Trần Ngọc Thu, Huỳnh Ngọc Thụy & Trần Hùng (2011), "Định tính - định lượng dexamethason acetat và betamethason trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC", Tạp chí Dược liệu, 16(3), tr.201207. 8. Hội đồng Dược điển Việt Nam (2018), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, tr.265, 298, 322, 583, 798. 9. Nguyễn Đăng Lâm (2012), "Chất lượng dược liệu, đông dược trên thị trường hiện nay, những thách thức", Cây thuốc quý, 216, tr.4. 10. Đào Thị Cẩm Minh, Phạm Thị Thanh Hà, Vũ Tùng Lâm, Nguyễn Thế Anh, Phạm Thị Thanh Hà & Nguyễn Thị Kiều Anh (2019), "Định tính, định lượng thuốc hạ glucose huyết nhóm sulfunylurea trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao", Tạp chí Dược liệu, 24(6), tr.346-351. 11. Đào Thị Cẩm Minh, Nguyễn Thị Hà, Lê Thị Trâm, Phạm Thị Thanh Hà & Nguyễn Thị Kiều Anh (2016), "Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm đau, chống viêm trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng sắc ký

56

lớp mỏng hiệu năng cao", Tạp chí Nghiên cứu dược và thông tin thuốc, 4+5, tr.91-96. 12. Đào Thị Cẩm Minh, Thái Khoa Bảo Châu, Trần Tuấn Phong, Nguyễn Phúc Khánh Nhi, Trần Hữu Dũng, Phạm Thị Thanh Hà & Nguyễn Thị Kiều Anh (2018), "Xây dựng phương pháp phát hiện đồng thời một số thuốc giảm đau, kháng viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS", Tạp chí Dược học, 58(3), tr.18-22. 13. Trịnh Thị Quy & Đoàn Cao Sơn (2013), "Nghiên cứu phát hiện một số Glucocorticoid trộn trái phép trong thuốc đông dược bằng phương pháp HPLC", Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, 3, tr.13-18. 14. Phạm Thị Thanh Tuyền, Nguyễn Thị An, Đinh Thị Thanh Hải,Trần Thúy Hạnh, Nguyễn Thị Kiều Anh (2018), "Nghiên cứu phát hiện các thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS", Tạp chí Dược học,517 (3), tr. 70-74. Tiếng Anh 15. Agha ZM, Arayne MS, Najma S (2017), " HPLC method development, validation and its application to investigate in vitro effect of pioglitazone on the availability of H1 receptor antagonists" , J Associ Arab Univ Basic Appl Sci ,22, pp.70-75. 16. Ahmed Amal B, Abdelwahab Nada S, et al. (2017), "Simultaneous determination of Dimenhydrinate, Cinnarizine and Cinnarizine impurity by TLC and HPLC chromatographic methods", Bulletin of Faculty of Pharmacy, Cairo University, 55(1), pp. 163-169. 17. Au AM, Ko R, Boo FO, Hsu R, Perez G, Yang Z (2000)," Screening Methods for Drugs and Heavy Metals in Chinese Patent Medicines", Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 65(1),pp.112–119. 18. AOAC International (2016), "Guidelines for Standard Method Performance Requirements", AOAC Official Methods of Analysis, pp.1-18. 19.

Bogusz MJ, Hassan H, Al-Enazi E, Ibrahim Z & Al-Tufail M (2006), "Application of LC-ESI-MS-MS for detection of synthetic adulterants in herbal remedies", J Pharm Biomed Anal, 41(2), pp.554-564.

57

20. Burrows GW, Alliger CL (1983)," High-performance liquid chromatographic determination of cyproheptadine hydrochloride in tablet formulations", J Pharm Sci, 72, pp.1212-1213. 21.

Byard RW (2010), "A review of the potential forensic significance of traditional herbal medicines", J Forensic Sci, 55(1), pp.89-92.

22.

Calahan J, Howard D, Almalki AJ, Gupta MP & Calderon AI (2016), "Chemical Adulterants in Herbal Medicinal Products: A Review", Planta Med, 82(6), pp.505-515.

23. Cheng HL, Tseng M-C, Tsai P-L, Her GR (2001)," Analysis of Synthetic chemical

drugs

in

adulterated

electrophoresis/electrospray

Chinese

ionization

medicines

mass

by

capillary

spectrometry", Rapid

Communications in Mass Spectrometry,15(16), pp.1473–1480. 24. Cochin J, Daly JW (1963), "The use of thin-layer chromatography for the analysis of drugs. Identification and isolation of phenothiazine tranquilizers and of antihistaminics in body fluids and tissues", J Pharmacol Exp Ther ,139, pp.160–165 25. Curea E, Martinovici M (1975), "Thin-layer chromatography and UV spectrophotometry in qualitative and quantitative analysis of drugs. II. Determination of promethazine in the presence of caffeine (or codeine) in drug mixtures”, Ann Pharm Fr ,33(10), pp.505-511. 26. Dubey N, Siddiqui R, Jain DK (2012)," Simultaneous determination of paracetamol, phenylephrine hydrochloride and loratadine", Asian Journal of Chemistry , 24(11), pp. 5409- 5410 27. El-Kommos ME, El-Gizawy SM (2014), "Thin layer chromatography– densitometric determination of some non sedating antihistamines in combination with pseudoephedrine or acetaminophen in synthetic mixtures and in pharmaceutical formulations”, Biomed Chromatogr, 28(3), pp.391400. 28.

European

Commission

(2002),

"Commission

Decision

2002/657/EC

implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of

58

analytical methods and the interpretation of results", Official Journal of the European Communities, pp. 8-36. 29.

Farid Nehal F, Naguib Ibrahim A, et al. (2017), "TLC-Densitometric and RPHPLC Methods for Simultaneous Determination of Dexamethasone and Chlorpheniramine Maleate in the Presence of Methylparaben and Propylparaben", Journal of AOAC International, 100(1), pp. 51-58.

30.

Guo Bin, Wang Meiling, et al. (2015), "Wide-scope screening of illegal adulterants in dietary and herbal supplements via rapid polarity-switching and multistage accurate mass confirmation using an LC-IT/TOF hybrid instrument", Journal of agricultural and food chemistry, 63(31), pp. 69546967.

31. Haneef J, Shaharyar M, Husain A, Rashid M, Mishra R, Siddique NA & Pal M (2013), "Analytical methods for the detection of undeclared synthetic drugs in traditional herbal medicines as adulterants", Drug Test Anal, 5(8), pp.607613. 32.

Huang Yun-Qing, You Jing-Qing, et al. (2011), "Coupling frontal elution paper chromatography with desorption corona beam ionization mass spectrometry for rapid analysis of chlorphenamine in herbal medicines and dietary supplements", Journal of Chromatography A, 1218(41), pp. 73717376.

33.

Huang WF, Wen KC & Hsiao ML (1997), "Adulteration by Synthetic Therapeutic Substances of Traditional Chinese Medicines in Taiwan", The journal of Clinical Pharmacology, 37(4), pp.344-350.

34. International Conference on Harmonisation (2005), "Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology", ICH harmonised tripartite guideline, pp.1-13. 35.

Kam PCA & Liew S (2002), "Traditional Chinese herbal medicine and anaesthesia", Journal of the Association of Anaesthesia of Great Britain and Ireland, 57(11), pp.1083-1089.

59

36. Kapildev RJ(2016), " Analytical method development and validation of RP HPLC for simultaneously estimation of chlorpheniramine maleate, dextromethorphan hydrobromide, phenylephrine hydrobromide in cough syrup", Int J Adv Sci Engin Tech , 4, pp.35-39 37. Kesting J R, Huang J & Sorensen D (2010), "Identification of adulterants in a Chinese herbal medicine by LC-HRMS and LC-MS-SPE/NMR and comparative in vivo study with standards in a hypertensive rat model", J Pharm Biomed Anal, 51(3), pp.705-711. 38. Kim Eun Hye, Seo Hee Seung, et al. (2017), "Reliable screening and confirmation of 156 multi-class illegal adulterants in dietary supplements based on extracted common ion chromatograms by ultra-high-performance liquid

chromatography-quadrupole/time

of

flight-mass

spectrometry",

Journal of Chromatography A, 1491, pp. 43-56. 39. Kim Jung Yeon, Choi Ji Yeon, et al. (2015), "LC–MS/MS monitoring of 22 illegal antihistamine compounds in health food products from the Korean market", Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 58(1), pp. 137-147. 40. Ko Richard J (1998), "Adulterants in Asian patent medicines", New England Journal of Medicine, 339(12), pp. 847-847. 41. Lin YP, Lee YL, Hung CY, Chang CF, Chen Y (2018), " Detection of adulterated drugs in traditional Chinese medicine and dietary supplements using hydrogen as a carrier gas", PLoS One ,13(10), pp.0205371. 42. R Stanaszek & W Lechowicz (2001), "Pharmaceutical preparations in illicit drug cases", Problems of Forensic Sciences, XLVI, pp.152–157. 43. Ruby Pawankar (2014), "Allergic diseases and asthma: a global public health concern and a call to action", World Allergy Organization Journal, 7, pp.1-3. 44. Sane RT, Francis M, Khedkar S, Pawar S, Moghe A (2001)," Simultaneous HPTLC determination of pseudoephedrine sulfate and loratadine from their combined dosage form", Indian Drugs , 38(8), pp. 436–438.

60

45. Sehrawat R, Khatak M, Maithani M, Khatak S (2013), "Simultaneous determination of Chlorpheniramine Maleate, paracetamol and phenylephrine hydrochloride

in

tablet

dosage

form

by

high-performance

liquid

chromatography", Int J Drug Dev Res , 5, pp.258-263. 46.

Shasho H, A. A. Sakur, and S. Trefi (2018), “Separation and assay of four antihistamine drugs diphenhydramine, chlorpheniramine, cyproheptadine and fexofenadine in pharmaceutical forms by a single hplc method”. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 10 (4) , pp. 53-60.

47. Sher N, Siddiqui FA, Hasan N, Shafi N, Zubair A, Mirza AZ (2014), " Simultaneous determination of antihistamine anti-allergic drugs, cetirizine, domperidone, chlorphenamine maleate, loratadine, meclizine and buclizine in pharmaceutical formulations, human serum and pharmacokinetics application", Anal Methods , 6, pp.2704-2714. 48. The British Pharmacopoeia (2019), Her Majesty's, The Stationary Office, London, United Kingdom. 49. Ulavapalli KR, Sriramulu J, Mallu UR, Bobbarala V (2011), " Simultaneous determination

of

pseudoephedrine,

fexofenadine

and

loratadine

in

pharmaceutical products using high resolution RP-HPLC method", Journal of Pharmacy Research , 4(4), pp. 1219–1221. 50. United States Pharmacopeial Convention (2019), United States Pharmacopeia 42 National Formulary 37. 51. Vishal J, Mukesh CS (2016), " Validated RP-HPLC method for determining the levels of bromhexine HCl, chlorpheniramine maleate, dextromethorphan HBr and guaiphenesin in their pharmaceutical dosage forms",Journal of Taibah University for Science,10, pp.38-45.

61

Tiếng Trung 52. Fanhua C, Yumei Z, Xiaona Z (2015), " Determination of content and related substances of cyproheptadine hydrochloride tablets by HPLC", China Pharm ,18,pp.1827-1829. 53. Ningning S, Keming Z , Xianghong L , Tong S , Yu S & Nanyan T (2015), "Determination of twelve chemical drugs illegally added in herbal tea by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with modified QuEChERS", Chinese Journal of Chromatography, 33(10), pp.1026-1031. 54. YE. Lin-hu, X. Song, W.Li-sha, HE. Mei & C. Qi (2016), "Simultaneous determination of 7 antihistamine agents added into traditional Chinese medicine preparation by LC-MS/MS", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 36(11), pp.2022-2028.

55. Wang Tie-jie, Han Dong-qi, Lu Yi, Yin Guo & et al. (2015), "HPLC determination of 17 additive chemical components in traditional Chinese medicines and health food", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 35(7), pp.1223-1230. Trang web 56. Trung Anh (2015), “Hơn 1 tỉ người trên thế giới đang mắc bệnh dị ứng”. Địa chỉ truy cập: https://vov.vn/suc-khoe/hon-1-ti-nguoi-tren-the-gioi-dang-

mac-benh-di-ung-453245.vov. Ngày truy cập 16/07/2019 57. Bộ Y tế (2014), Điểm tin y tế ngày 12-14/10/2014, “Thanh tra Sở Y tế Hà Nội xử phạt 80 triệu đồng đối với chủ cơ sở lương y gia truyền Hà Tộc”. Địa chỉ truy cập: http://moh.gov.vn/news/Pages/DiemTinYTeTuCacBaoCaoV2.

aspx?ItemID=198&QAItemID=198&sId=1. Ngày truy cập 16/07/2019 58. Bộ Y tế (2017), Điểm tin y tế ngày 5/5/2017, “Sở Y tế thành phố Hồ Chí Minh sẽ công khai địa chỉ cơ sở đông y bán thuốc chứa corticoid”. Địa chỉ truy cập: http://moh.gov.vn/news/Pages/DiemTinYTeTuCacBaoCaoV2. aspx?

ItemID=613&QAItemID=613&sId=1. Ngày truy cập 16/07/2019

62

59.

https://www.fda.gov/drugs/medication-health-fraud/public-notificationginseng-she-lian-wan-contains-hidden-drug-ingredients. Ngày truy cập 16/07/2019

60.

https://www.fda.gov/drugs/medication-health-fraud/public-notificationsaurean-fong-sep-lin-contains-hidden-drug-ingredients. Ngày truy cập 16/07/2019

63

PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 1A. HPLC

64

65

66

67

68

69

1B. HPTLC

Sắc ký đồ chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp

70

71

72

73

PHỤ LỤC 2: SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT KHOẢNG NỒNG ĐỘ TUYẾN TÍNH 2A. HPLC

74

75

76

77

78

79

2B. HPTLC

Sắc ký đồ khoảng nồng độ tuyến tính ( HPTLC)

80

81

82

83

PHỤ LỤC 3: SẮC KÝ ĐỒ LOD VÀ LOQ 3A. HPLC

84

85

86

87

88

89

90

91

3B. HPTLC

Sắc ký đồ LOD – LOQ (HPTLC)

92

93

94

95

PHỤ LỤC 4: SẮC KÝ ĐỒ VÀ CHỒNG PHỔ PHÂN TÍCH MẪU THỰC DƯƠNG TÍNH 4A. HPLC 4.1. Mẫu M01

197

Hình PL4A.1.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M01

mAU 1000 6.035/ 1.00 0.9988 clo.jcm/ 0.78

0 200

761

485

245 262

500

300

400

500

600

Hình PL4A.1.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí CLO

96

700

nm

4.2. Mẫu M02

197

Hình PL4A.2.1.Sắc ký đồmẫu dương tính M02

0 200

302

247 262

250

760

mAU 750 6.135/ 1.00 0.9922 clo.jcm/ 0.54 500

300

400

500

600

700

Hình PL4A.2.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí CLO

97

nm

4.3. Mẫu M03

198

Hình PL4A.3.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M03

200

300

400

500

600

700

0 200

nm

300

400

500

658

728 755

634 655

380 384 410

303 329

0

486

100

250

600

749

239 250

199

mAU 16.437/ 1.00 0.9926 200 cin.jcm/ 0.95

mAU 750 5.937/ 1.00 0.9997 clophe.jcm/ 0.97 500

700 nm

Hình PL4A.3.2. Kết quả chồng phổ tại

Hình PL4A.3.3. Kết quả chồng

vị trí CLO

phổ tại vị trí CIN

98

4.4. Mẫu M08

198

Hình PL4A.4.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M08

mAU 5.839/ 1.00 0.9900 clo.jcm/ 0.67

300

754

589

0 200

429

371

249 257

500

400

500

600

Hình PL4A.4.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí CLO

99

700

nm

4.5. Mẫu M12

197

Hình PL4A.5.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M12

462 487

274 300

500 0 200

300

400

500

655 666

224

250

mAU 9.372/ 1.00 0.9919 1000 pro.jcm/ 1.06

600

Hình PL4A.5.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí PRO

100

700

nm

4.6. Mẫu M13

Hình PL4A.6.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M13

Hình PL4A.6.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí CYP

101

4.7. Mẫu M14

Hình PL4A.7.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M14

Hình PL4A.7.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí CYP

102

4.8. Mẫu M16

199

Hình PL4A.8.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M16

mAU 500 10.442/ 1.00 0.9989 cypro.jcm/ 0.85

200

300

400

500

656

484

0

363

263 285

250

600

700 nm

Hình PL4A.8.1. Kết quả chồng phổ tại

Hình PL4A.8.3. Kết quả chồng

vị trí CYP

phổ tại vị trí CIN

103

4.9. Mẫu M19

Hình PL4A.9.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M19

Hình PL4A.9.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí LOR

104

4.10. Mẫu M21

199

Hình PL4A.10.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M21

200

300

400

500

754

622 642 655

0

582

441

250

480 485

mAU 750 5.913/ 1.00 0.9979 clophe.jcm/ 1.00 500

600

700

Hình PL4A.10.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí CLO

105

nm

4.11. Mẫu M22

196

Hình PL4A.11.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M22

200

300

400

500

755

658

487

0

392

244 261

500

309 329

mAU 1500 6.016/ 1.00 0.9998 clo.jcm/ 1.04 1000

600

700

Hình PL4A.11.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí CLO

106

nm

4.12. Mẫu M25

Hình PL4A.12.1.Sắc ký đồ mẫu dương tính M25 199

mAU 750 5.923/ 1.00 0.9997 clophe.jcm/ 0.97 500

200

300

400

500

600

752

637 657

582

485

0

435

303 324

250

700

Hình PL4A.12.2. Kết quả chồng phổ tại vị trí CLO

107

nm

4B. HPTLC

Hình PL4B.1. Sắc ký đồ bản mỏng phân tích các mẫu thực

Hình PL4B.2. Sắc ký đồ analog của mẫu chuẩn

Hình PL4B.3. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M01 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CLO) của M01 và CLO chuẩn

108

Hình PL4B.4. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M02 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CLO) của M02 và CLO chuẩn

Hình PL4B.5. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M03 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CLO,CIN) của M03 và CLO, CIN chuẩn

Hình PL4B.6. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M08 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CLO) của M08 và CLO chuẩn 109

Hình PL4B.7. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M12 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết PRO) của M12 và PRO chuẩn

Hình PL4B.8. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M13 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CYP) của M13 và CYP chuẩn

Hình PL4B.9. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M14 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CYP) của M14 và CYP chuẩn 110

Hình PL4B.10. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M16 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CYP,CIN) của M16 và CYP, CIN chuẩn

Hình PL4B.11. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M19 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết LOR) của M19 và LOR chuẩn

Hình PL4B.12. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M21 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CLO) của M21 và CLO chuẩn 111

Hình PL4B.13. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M22 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CLO) của M22 và CLO chuẩn

Hình PL4B.14. Sắc ký đồ analog của mẫu dương tính M25 và chồng phổ UV tại vị trí có Rf ( vết CLO) của M25 và CLO chuẩn

112

PHỤ LỤC 5: DANH MỤC CÁC CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC ĐƯỢC PHÂN TÍCH Bảng PL5. Danh mục mẫu thực chế phẩm đông dược được phân tích ST Nguồ T

Tên thuốc

Số lô, hạn dùng, nơi sản xuất

n gốc/

Liều dùng

Cách mua 1

Intern Đặc trị chữa et

Số lô: Không có

2

bệnh

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

(Bột)

SĐK: Không có

1/2

Nhà sản xuất: Đông y gia truyền – gói/lần Khánh Hòa 2

Intern Thuốc đặc trị et

Số lô: Không có

2-3

viêm mũi thấp

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

khớp

SĐK: Không có

1 gói/lần

(Bột)

Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền – Y học dân tộc Thị trấn Trà Sư – Khánh Hòa

3

Lươn

Đặc trị bệnh

Số lô: Không có

gy

ngoài da - Đông Hạn dùng: Không có

lần/ngày

y gia truyền

SĐK: Không có

3

Phúc Thanh

Nhà sản xuất: Đông y gia truyền

viên/lần

Đường – (Viên

Phúc Thanh Đường – Hà Nội

2

nang cứng) 4

Lươn

Đặc trị bệnh

Số lô: Không có

2

gy

ngoài da)

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

(Nang cứng)

SĐK: Không có

3

Nhà sản xuất: Đông y gia truyền

viên/lần

113

Hà Nội

5

Lươn

Không có tên

Số lô: Không có

3

gy

(thuốc đặc trị

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

mề đay)

SĐK: Không có

3

(Bột)

Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y

thìa/lần

gia truyền Khương Viên – Hà Nội 6

Lươn

Không có tên

Số lô: Không có

3

gy

(thuốc đặc trị

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

mề đay, dị ứng)

SĐK: Không có

1 muỗng

(Hoàn cứng)

Nhà sản xuất: Nhà thuốc Đức Phú

canh/lần

Đường – Đà Nẵng 7

Lươn

Không có tên

Số lô: Không có

2

gy

(thuốc đặc trị

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

mề đay)

SĐK: Không có

2

(Hoàn mềm)

Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y

viên/lần

gia truyền Đức Hưng – Hà Nội 8

Lươn

Trị viêm mũi

Số lô: Không có

2

gy

(Bột)

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

SĐK: Không có

1 gói/lần

Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền Đông y Đỗ Thái Nam – An Giang 9

Lươn

Không có tên

Số lô: Không có

2

gy

(thuốc đặc trị

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

mề đay, dị ứng)

SĐK: Không có

1 muỗng

(Bột)

Nhà sản xuất: Hiệu thuốc bắc

cafe/lần

Xuân Phước Đường - Đà Nẵng

114

10 Lươn gy

Không có tên

Số lô: Không có

1

(thuốc trị ngứa

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

mề đay)

SĐK: Không có

1/5

(Bột)

Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền –

gói/lần

Hà Tĩnh 11 Mẫu gửi

Tiêu độc mát

Số lô: Không có

2

gan

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

(Hoàn mềm)

SĐK: Không có

3

Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền –

viên/lần

Hà Nội 12 Mẫu gửi

Không có tên

Số lô: Không có

2

(thuốc trị ngứa

Hạn dùng: Không có

lần/ngày

mề đay)

SĐK: Không có

3

(Nang cứng)

Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền –

viên/lần

Hà Nội 13 Mẫu gửi

BVGV-3

Số lô: Không có

2

(thuốc bổ can

Hạn dùng: 25/11/2020

lần/ngày

thận, tráng

SĐK: Không có

1 gói/

dương, tăng

Nhà sản xuất:

lần

cường sinh lực)

Thuốc đông y gia truyền- Hà Nội

(Bột) 14

15

Mẫu

Không có tên

Số lô: Không có

2 lần/ngày

gửi

(thuốc tiêu độc

Hạn dùng: Không có

1 viên/lần

giải nhiệt, mát

SĐK: Không có

gan thận)

Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia

(Hoàn mềm)

truyền Hồng Phúc – Hà Nội

Mẫu

Không có tên

Số lô: Không có

2 lần/ ngày

gửi

(Thuốc trị mẩn

Hạn dùng: Không có

1 gói/lần

ngứa, mề đay, dị SĐK: Không có

115

16

ứng)

Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia

(Bột)

truyền Thanh Thanh – Hà Nội

Mẫu

TTGV-3

Số lô: Không có

2 lần/ngày

gửi

(thuốc khu

Hạn dùng: 25/11/2020

30-50

phong, trừ thấp,

SĐK: Không có

viên/ lần

tiêu viêm, hóa

Nhà sản xuất:

đàm, tán ứ,

Thuốc đông y gia truyền – Hà Nội

thông kinh lạc) ( Hoàn cứng) 17

Mẫu

Không có tên

Số lô: Không có

2 lần/ ngày

gửi

(Thuốc trị mẩn

Hạn dùng: Không có

1 gói/lần

ngứa, mề đay, dị SĐK: Không có

18

ứng)

Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia

(Bột)

truyền – Nam Định

Mẫu

Không có tên

Số lô: Không có

2 lần/ ngày

gửi

(Thuốc trị mẩn

Hạn dùng: Không có

1 gói/lần

ngứa, mề đay, dị SĐK: Không có

19

ứng)

Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia

(Bột)

truyền – Thái Bình

Mẫu

Trị viêm mũi

Số lô: Không có

2 lần/ngày

gửi

(Bột)

Hạn dùng: Không có

1 gói/lần

SĐK: Không có Nhà sản xuất: An Giang

20

Mẫu

Không có tên

Số lô: Không có

2 lần/ ngày

gửi

(Thuốc trị cảm,

Hạn dùng: Không có

20 viên/lần

ho, sổ mũi, viêm SĐK: Không có

21

Mẫu

họng)

Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia

(Hoàn cứng)

truyền Thanh Thanh – Hà Nội

Trân châu mạo

Số lô: Không có

116

2 gói chia

gửi

khải tán

NSX: 10/08/2018

(Hoàn cứng)

Hạn dùng: 10/08/2021

2 lần/ngày

SĐK: V118-H12-18 Nhà sản xuất: Không có ( An Giang) 22

Mẫu

Viêm mũi xoang Số lô: Không có

10 viên/

gửi

(nang cứng)

ngày/ 2 lần

NSX: 10/05/2017 Hạn dùng: 10/05/2020 SĐK: Không có Nhà sản xuất: Cơ sở sản xuất kinh doanh Đặng Thiên Phúc- An Giang

23

Mẫu

Không có tên

Số lô: Không có

2 lần/ ngày

gửi

(Thuốc trị mẩn

Hạn dùng: Không có

2 viên/lần

ngứa, mề đay, dị SĐK: Không có

24

Mẫu gửi

25

Mẫu gửi

ứng)

Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia

(Nang cứng)

truyền– Hà Nội

Không có tên (thuốc trị cảm cúm, sổ mũi, viêm họng, ho đờm) (Nang cứng) Không có tên (thuốc đặc trị mề đay) (Bột)

Số lô: Không có 2 lần/ ngày Hạn dùng: Không có 2 viên/lần SĐK: Không có Nhà sản xuất: Nhà thuốc đông y gia truyền– Hà Nội Số lô: Không có Hạn dùng: 20 ngày kể từ ngày sản xuất SĐK: Không có Nhà sản xuất: Thuốc gia truyền 17 Trần Xuân Soạn – Hà Nội

117

2 lần/ngày 1 gói/lần

PHỤ LỤC 6 : CÔNG THỨC CÁC BÀI THUỐC VÀ HÌNH ẢNH CÁC NỀN MẪU XÂY DỰNG Bảng PL6. Các nền mẫu nghiên cứu STT Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Tên khoa học Nền N1: ( viên hoàn ) Ngân kiều tán Kim ngân hoa Flos Lonicerae Liên kiều Fructus Forsythiae Cát cánh Radix Platycodi Bạc hà Herba Menthae Đạm trúc diệp Herba Lophatheri Cam thảo Radix Glycyrrhizae Kinh giới tuệ Herba Ocimi saneticristataae Đạm đậu xị Sojae praeparatum Ngưu bàng tử Fuctus Arctii Nền N2: ( bột cốm ) Liên kiều bại độc tán Liên kiều Fructus Forsythiae Chi tử Fructus Gardeniae Khương hoạt Rhizoma et Radix Notopterygii Huyền sâm Radix Scrophulariae Bạc hà Herba Menthae Phòng phong Radix Saposhnikoviae divaricatae Sài hồ Radix Bupleuri Cát cánh Radix Platycodi Thăng ma Rhizoma Cimicifugae Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii Đương quy Radix Angelicae sinensis Hoàng cầm Radix Scutellariae Bạch thược Radix Paeoniae lactiflorae Ngưu bàng tử Fructus Arctii Nền N3: ( Viên nang ) Tiêu phong tán gia giảm Kinh giới Spica Elsholtziae Phòng phong Radix Saposhnikoviae divaricatae Ngưu bàng tử Fructus Arctii Thuyền thoái Periostracum Cicadae Sinh địa Radix Rehmanniae glutinosae Đan bì Cortex Paeoniae suffruticosae Bạch thược Radix Paeoniae lactiflorae Thổ phục linh Smilax glabra Ké đầu ngựa Fructus Xanthii strumarii Bồ công anh Herba Taraxaci Cam thảo Radix Glycyrrhizae

118

Khối lượng 40 g 40 g 24 g 24 g 16 g 20 g 16 g 20 g 24 g 12 g 12 g 10 g 10 g 8g 10 g 12 g 10 g 10 g 10 g 12 g 10 g 10 g 8g 16 g 12 g 12 g 8g 16 g 8g 8g 16 g 8g 12 g 8 g

- Nền 1 (viên hoàn) Tiến hành trên 5 thang thuốc theo tỷ lệ các thành phần trong bảng 3.1. + Điều chế cao đặc dược liệu: Cân các thành phần kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, trúc diệp, đạm đậu xị, ngưu bàng tử, cam thảo. Thái nhỏ, thêm nước ngập dược liệu, đun sôi. Giảm nhiệt độ, tiếp tục đun sôi trong 3 tiếng, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu. Sau đó, lọc qua vải lọc thu được dịch chiết lần 1. Thêm tiếp nước vào bã dược liệu lần 1 đến ngập, đun sôi. Giảm nhiệt độ, tiếp tục đun sôi trong 2 tiếng, thỉnh thoảng bổ sung nước để đảm bảo nước ngập dược liệu. Sau đó, lọc qua vải lọc thu được dịch chiết lần 2. Gộp dịch lọc lần 1 và lần 2, cô đến khi thành cao đặc. + Điều chế bột mịn dược liệu: Cân các thành phần bạc hà, kinh giới tuệ, thái nhỏ, sấy khô rồi xay thành bột mịn, rây qua rây kích thước 0,2 mm, đồng nhất mẫu . + Trộn bột dược liệu đều với cao đặc dược liệu tạo khối ẩm, vê tròn thành viên rồi sấy khô viên. Bao màu bằng dịch bao màu (hòa tan than hoạt, bột talc vào siro tỷ lệ 1:1) đến khi viên có màu đồng nhất, sấy khô viên và đóng gói. Khối lượng trung bình 1 gói (1 liều): 5,0064 g. - Nền 2 (bột cốm) Tiến hành trên 10 thang thuốc theo tỷ lệ các thành phần trong bảng 3.1. - Điều chế cao đặc dược liệu: Thái nhỏ, thêm nước ngập dược liệu, nấu thành cao đặc theo quy trình tương tự nền 1. Bổ sung glucose và tá dược dính polyvidon/ethanol 96% vào cao đặc tạo khối ẩm. Xát hạt qua rây 1,0 mm rồi sấy ở nhiệt độ 60˚C đến khi cốm khô. Sửa hạt qua rây 1,25 mm thu được bột cốm tan, đóng gói. Khối lượng trung bình 1 gói (1 liều): 1,4058 g. - Nền 3 (viên nang cứng) Tiến hành trên 10 thang thuốc theo tỷ lệ các thành phần trong bảng 3.1. - Điều chế cao đặc dược liệu: Cân các thành phần trừ kinh giới. Thái nhỏ, thêm nước ngập dược liệu, nấu thành cao đặc theo quy trình tương tự ở nền 1. - Điều chế bột mịn dược liệu: Cân thành phần kinh giới thái nhỏ, sấy khô rồi xay thành bột min, rây qua rây kích thước 0,2 mm, làm đồng nhất.

119

- Trộn bột dược liệu đều với cao đặc dược liệu tạo khối ẩm, rây qua rây 1,0 mm tạo hạt, sấy hạt ở nhiệt độ 60˚C đến khi có hàm ẩm thích hợp. Trộn hạt với tá dược trơn (bột talc, magnise sterat tỷ lệ 1%) và đóng nang số 0. Khối lượng trung bình 1 viên: 0,6494 g. Khối lượng 1 liều (5 viên): 3,247 g.

Hình PL6.1. Nền N1 – viên hoàn

Hình PL6.2. Nền N2 – bột cốm

Hình PL6.3. Nền N3 – viên nang

120