Issuu

SẮC KÝ LỎNG TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC

vectorstock.com/1593604

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

Xây dựng phương pháp định lượng vitamin B6 và cystin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỖ KHẮC HUY

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VITAMIN B6 VÀ CYSTIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỖ KHẮC HUY Mã sinh viên: 1501215

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG VITAMIN B6 VÀ CYSTIN TRONG CHẾ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC THÂN NƢỚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. ThS. Vũ Ngân Bình 2. TS. Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

HÀ NỘI - 2020

LỜI CẢM ƠN Khóa luận này đƣợc hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, dƣới sự hƣớng dẫn, tận tình chỉ bảo của ThS. Vũ Ngân Bình và TS. Đặng Thị Ngọc Lan. Lời đầu tiên, tôi xin đƣợc phép gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến những ngƣời đã hƣớng dẫn tôi hoàn thành khóa luận này: ThS. Vũ Ngân Bình, TS. Đặng Thị Ngọc Lan và PGS. TS. Phạm Thị Thanh Hà. Các cô luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, luôn nhiệt tình giải đáp mọi thắc mắc, luôn khích lệ tinh thần, động viên tôi mỗi khi gặp khó khăn, cũng nhƣ gợi ý những hƣớng giải quyết những vấn đề tôi gặp phải. Tiếp theo, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô của bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, những ngƣời đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, ngƣời thân và gia đình đã luôn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, xin kính chúc các thầy cô luôn có một sức khỏe dồi dào, luôn hạnh phúc và thành công trong tƣơng lai. Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên

Đỗ Khắc Huy

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................................. DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ........................................................................... ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................2 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu .....................................................................2 1.1.1. Tổng quan về cystin ........................................................................................2 1.1.2. Tổng quan về vitamin B6 ...............................................................................3 1.1.3. Chế phẩm hai thành phần chứa cystin và vitamin B6 ....................................4 1.1.4. Một số phƣơng pháp phân tích cystin và vitamin B6 .....................................5 1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc ...................................................10 1.2.1. Pha tĩnh .........................................................................................................10 1.2.2. Pha động .......................................................................................................10 1.2.3. Cơ chế tách ...................................................................................................11 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................................................................................13 2.1. Nguyên liệu .........................................................................................................13 2.1.1. Mẫu thử .........................................................................................................13 2.2.2. Hóa chất ........................................................................................................13 2.2.3. Thiết bị, dụng cụ ...........................................................................................14 2.3. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................14 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.....................................................................................14 2.4.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn ......................................................................14 2.4.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu .......................................................................15 2.4.3. Khảo sát điều kiện sắc ký .............................................................................15 2.4.4. Thẩm định quy trình .....................................................................................17 2.4.5. Áp dụng phƣơng pháp ..................................................................................21 2.4.6. Xử lý kết quả.................................................................................................21 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................22 3.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu thử........................................................................22 3.1.1. Khảo sát dung môi pha mẫu .........................................................................22 3.1.2. Khảo sát thể tích dung môi pha mẫu ............................................................23

3.1.3. Khảo sát thời gian siêu âm ............................................................................24 3.1.4. Khảo sát thời gian lắc xoáy...........................................................................25 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký ....................................................................................27 3.2.2. Khảo sát pha động ........................................................................................27 3.2.1. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện ......................................................................29 3.4. Phƣơng pháp phân tích cystin và vitamin B6 .....................................................30 3.5. Thẩm định phƣơng pháp .....................................................................................31 3.5.1. Độ phù hợp hệ thống ....................................................................................31 3.5.2. Độ chọn lọc ...................................................................................................31 3.5.3. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính. .............................................................33 3.5.4. Độ chính xác của phƣơng pháp ....................................................................33 3.5.5. Độ đúng của phƣơng pháp ............................................................................34 3.3. Đánh giá độ ổn định của mẫu..............................................................................36 3.6. Ứng dụng phƣơng pháp phân tích chế phẩm viên nén bao phim trên thị trƣờng ....................................................................................................................................37 3.7. Nhận xét và bàn luận ...........................................................................................38 3.7.1. Nhận xét về quá trình xử lý mẫu ..................................................................38 3.7.2. Nhận xét về xây dựng và thẩm định phƣơng pháp .......................................39 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................42 4.1. Kết luận ...............................................................................................................42 4.2. Kiến nghị .............................................................................................................43 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................44 PHỤ LỤC ..................................................................................................................PL-1 Danh mục các phụ lục ............................................................................................PL-1 Phụ lục 1: Sắc kí đồ thẩm định độ phù hợp hệ thống ............................................PL-2 Phụ lục 2: Sắc kí đồ thẩm định độ chọn lọc ...........................................................PL-6 Phụ lục 3: Chồng phổ độ tinh khiết của cystin và vitamin B6 với pic trong sắc kí đồ chuẩn ....................................................................................................................PL-10

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

HPLC

HILIC NPLC

High Performance liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Hydrophilic Interaction Liquid

Sắc ký lỏng tƣơng tác thân

Chromatography

nƣớc

Normal Phase Liquid

Sắc ký lỏng pha thuận

Chromatography RPLC

Reversed Phase Liquid

Sắc ký lỏng pha đảo

Chromatography PITC

Phenylisothiocyanate

Phenylisothiocyanat

Ultraviolet

Tử ngoại

UV-VIS

Ultraviolet – Visible

Tử ngoại – khả kiến

RSD (%)

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối

Standard Deviation

Độ lệch chuẩn

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1

Một số phƣơng pháp phân tích cystin và vitamin B6

Bảng 2.1.

Quy trình pha dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp

Bảng 2.2

Quy trình pha các mẫu thử thêm chuẩn

Bảng 3.1

Kết quả khảo sát dung môi pha mẫu

Bảng 3.2

Kết quả khảo sát thể tích dung môi pha mẫu

Bảng 3.3

Kết quả khảo sát thời gian siêu âm

Bảng 3.4

Kết quả khảo sát thời gian lắc xoáy

Bảng 3.5

Kết quả độ phù hợp hệ thống

Bảng 3.6

Kết quả đƣờng chuẩn

Bảng 3.7

Kết quả độ chính xác của phƣơng pháp

Bảng 3.8

Kết quả độ đúng của cystin

Bảng 3.9

Kết quả độ đúng của vitamin B6

Bảng 3.10

Kết quả định lƣợng cystin trong chế phẩm Cystine B6 Bailleul

Bảng 3.11

Kết quả định lƣợng vitamin B6 trong chế phẩm Cystine B6

Bailleul

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1

Công thức cấu tạo của cystin

Hình 1.2

Công thức cấu tạo của pyridoxin hydroclorid

Hình 2.1

Hình ảnh chế phẩm viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul

Hình 3.1

Quy trình chuẩn bị mẫu thử

Hình 3.2

Kết quả khảo sát thành phần pha động trên cột silica

Hình 3.3

Kết quả khảo sát nồng độ muối CH3COONH4

Hình 3.4

Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động CH3COONH4 50 mM

Hình 3.5

Phổ hấp thụ UV của cystin và vitamin B6

Hình 3.6

Kết quả độ chọn lọc ở bƣớc sóng 250 nm

Hình 3.7

Kết quả độ chọn lọc ở bƣớc sóng 286 nm

Hình 3.8

Kết quả đánh giá độ ổn định của mẫu

Hình 4.1

Sắc kí đồ dung dịch chuẩn cystin ở bƣớc sóng 210 nm

ĐẶT VẤN ĐỀ Sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc là một công cụ rất hữu ích trong phân tích. Từ khi ra đời, kĩ thuật này đã nhanh chóng chứng tỏ đƣợc giá trị của mình, đặc biệt là trong phân tích các chất phân cực nhƣ acid amin. Đối với các kĩ thuật sắc kí lỏng thông thƣờng, việc phân tích các chất phân cực thƣờng gặp nhiều khó khăn. Sắc kí pha thuận có khả năng lƣu giữ các chất phân tích phân cực tƣơng đối tốt, nhƣng các dung môi đƣợc sử dụng thƣờng không thân thiện với môi trƣờng hoặc khó hòa tan các chất phân tích phân cực. Sắc kí pha đảo đƣợc sử dụng phổ biến hơn, khi sử dụng các dung môi thân nƣớc ít độc hại hơn. Tuy vậy, nhƣợc điểm lớn nhất của sắc kí pha đảo là kém lƣu giữ các chất phân cực, do đó, hiệu lực tách các chất phân cực thƣờng không cao. Sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc đƣợc ra đời với khả năng cải thiện đƣợc nhƣợc điểm của cả sắc kí lỏng pha thuận và pha đảo. Kĩ thuật này sử dụng pha động phân cực và pha tĩnh phân cực, do đó có khả năng lƣu giữ các chất phân tích tốt hơn sắc kí pha đảo, và đồng thời, những dung môi thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ nƣớc hay acetonitril hòa tan các chất phân tích tốt hơn, và cũng thân thiện hơn với môi trƣờng. Hiện nay, trên thị trƣờng có nhiều sản phẩm chứa đồng thời các acid amin và các chất phân cực khác. Một trong số đó là chế phẩm chứa cystin và vitamin B6 hỗ trợ điều trị cystathionin – niệu tiên phát. Có nhiều phƣơng pháp định lƣợng cystin cũng nhƣ vitamin B6 đơn thành phần, tuy nhiên, chƣa có phƣơng pháp nào định lƣợng đồng thời 2 chất này trong chế phẩm hai thành phần. Chính vì thế, tôi thực hiện đề tài “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng vitamin B6 và cystin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc” trên đối tƣợng cụ thể là viên nén chứa 2 thành phần là cystin và vitamin B6. Với các mục tiêu nhƣ sau: - Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp phân tích cystin và vitamin B6 bằng sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc. - Ứng dụng phƣơng pháp trên để định lƣợng cystin và vitamin B6 trong chế phẩm hai thành phần.

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1. Tổng quan về cystin Cystin là dạng dimer oxy hóa của acid amin cystein, trong đó, 2 phân tử cystein đƣợc liên kết với nhau bằng cầu nối disulfid. Đây là liên kết phổ biến trong phân tử protein, có vai trò ổn định cấu trúc của chúng [5]. Cystin là một acid amin tự nhiên, là một phần của các protein sinh học trong các mô và tổ chức: 2,1% trong não, gan, tim, thận; 22% trong móng; 19% trong tóc. Nhờ trong cấu trúc phân tử có cầu nối disulfid (-S-S-), cystin là một thành phần cơ bản của các tổ chức giàu keratin, giúp thúc đẩy quá trình tổng hợp keratin trong tóc và móng [4]. Cystin có công thức cấu tạo nhƣ hình 1.1:

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của cystin Danh pháp: (2R)-2-amino-3-[[(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]disulfanyl]propanoic acid. Tên khác: Cistina. Công thức phân tử: C6H12N2O4S2. Phân tử lƣợng: 240,3 g/mol. LogP = -5,08, pKa1 = 1, pKa2 = 2,1, pKa3 = 8,02, pKa4 = 8,71. pI = 5,02 [7]. Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng, không mùi. Bảo quản: Ở nhiệt độ phòng [22]. * Độ tan: - Trong nƣớc: Cystin ít tan trong nƣớc (190 g/L ở 20oC) [17] tƣơng đƣơng khoảng 0,791 mM. - Trong môi trƣờng acid và kiềm: Cystin tan tốt hơn trong môi trƣờng acid và kiềm ở pH < 2 hoặc pH > 8 [22]. * Độ ổn định của cystin trong dung dịch: 2

- Trong môi trƣờng nƣớc, cystin trải qua quá trình thủy phân tạo thành cystein [21]. Các phản ứng thủy phân đƣợc thể hiện dƣới đây: R – S – S – R + H2O = Hợp chất trung gian = R – SH + R – S – OH

(1)

(Nhƣ R – S – OH2 – S – R) 2R – S – OH = R – SH + R – S – O2H

(2)

R – S – OH + R – S – O2H = R – SH + R – S – O3H

(3)

3 phƣơng trình phản ứng trên có thể đƣợc viết gộp lại thành 1 phƣơng trình nhƣ sau: 3R – S – S – R + 3H2O = 5R – SH + R – S – O3H

(4)

- Trong môi trƣờng acid và kiềm, cystin không bền. Shinohara và Kilpatrick [21] đã khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên tốc độ thủy phân của cystin, trong đó có pH, nhiệt độ và sự xuất hiện của 1 số ion kim loại nhƣ sắt hay đồng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: (1) Cystin trong dung dịch HCl không bền và bị thủy phân dần dần theo thời gian. (2) Trong môi trƣờng sục khí nitơ, dung dịch vẫn trải qua quá trình tƣơng tự, và vẫn có thể xảy ra trong bóng tối. Ion kim loại nhƣ sắt hay đồng không ảnh hƣởng đến quá trình này. (3) Sản phẩm chủ yếu thu đƣợc là cystein, bắt nguồn từ sự thủy phân cystin. (4) Dung dịch cystin trong kiềm trải qua quá trình tƣơng tự ở tốc độ nhanh hơn nhiều so với dung dịch cystin trong HCl. Nhận xét: - Cystin là chất phân cực, tuy nhiên độ tan trong nƣớc không cao. Mặt khác, công thức của cystin chỉ chứa hai liên kết đôi không liên hợp nên khả năng hấp thụ UV-VIS không mạnh. Do đó, để có thể phát hiện cystin bằng detector UV-VIS cần phải lựa chọn dung môi pha mẫu phù hợp để có dung dịch đạt nồng độ đủ lớn và khả năng hấp thụ UV phù hợp. - Cystin trong dung dịch không ổn định và pH dung dịch có ảnh hƣởng đến tốc độ thủy phân cystin. Do đó, khi lựa chọn dung môi pha mẫu, bên cạnh độ tan cần cân nhắc đến độ ổn định của cystin. 1.1.2. Tổng quan về vitamin B6 Vitamin B6 là vitamin nhóm B tan trong nƣớc, tồn tại dƣới 3 dạng: Pyridoxal, pyridoxin và pyridoxamin, khi vào cơ thể biến đổi thành dạng hoạt động pyridoxal 3

phosphat và pyridoxamin phosphat. Hai chất này hoạt động nhƣ những coenzym trong chuyển hóa protein, glucid và lipid [2]. Pyridoxin thƣờng đƣợc bào chế dƣới dạng pyridoxin hydroclorid, có công thức cấu tạo nhƣ hình 1.2:

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của pyridoxin hydroclorid Danh pháp: (5-hydroxy-6-methylpyridin-3,4-diyl)dimethanol. Công thức phân tử: C8H11NO3. Phân tử lƣợng: 205,6 g/mol. LogP = -0,77. Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng hoặc gẩn nhƣ trắng. Dễ tan trong nƣớc, khó tan trong ethanol 96 %. Bảo quản: Ở nhiệt độ phòng [3]. Khả năng hấp thụ quang tốt do trong công thức có chứa nhóm mang màu. Độ ổn định: Vitamin B6 trong dung dịch nƣớc có pH 6,8 hoặc cao hơn không ổn định khi tiếp xúc với các bức xạ khả kiến [12]. Do đó cần bảo quản tránh ánh sáng. 1.1.3. Chế phẩm hai thành phần chứa cystin và vitamin B6 Trên thị trƣờng có những chế phẩm viên uống chứa cystin và vitamin B6 nhằm mục đích hỗ trợ những ngƣời mắc cystathionin - niệu tiên phát. Cystathionin – niệu tiên phát là một rối loạn chuyển hóa, dẫn đến sự có mặt của cystathionin trong nƣớc tiểu. Cystathionin là 1 chất trung gian trong quá trình tổng hợp cystein và cystin từ methionin trong cơ thể. Ngƣời mắc cystathionin – niệu sẽ thiếu hụt cystathionin do mất qua nƣớc tiểu, dẫn đến thiểu hụt cystin [20]. Mặt khác cystathionin - niệu tiên phát có thể đáp ứng với liều cao pyridoxin [2]. Do đó, những chế phẩm này vừa có tác dụng bổ sung cystin ngoại sinh, vừa bổ sung cystin nội sinh. Ở Việt Nam cũng có chế phẩm viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul với hàm lƣợng cystin 500,00 mg và pyridoxin hydroclorid 50,00 mg và chế phẩm Ceteco Cystine B6 với hàm lƣợng cystin 500 mg và pyridoxin hydroclorid 1000 mcg.

1.1.4. Một số phương pháp phân tích cystin và vitamin B6 Cystin là 1 acid amin có lƣu huỳnh, có thể tham gia phản ứng oxy hóa khử. Do đó có thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn độ oxy hóa khử với kali bromat, sau đó chuẩn độ thừa trừ với natri thiosulfat để định lƣợng nguyên liệu cystin nhƣ trong dƣợc điển Mỹ [25]. Ngoài ra, rất nhiều các kĩ thuật khác nhau cũng đã đƣợc sử dụng để phân tích cystin, đa phần là kèm theo cả cystein trong mẫu. Các kĩ thuật HPLC thƣờng đƣợc sử dụng là trao đổi ion [13], RPLC kèm theo dẫn xuất hóa trƣớc cột với PITC (phenylisothiocyanat). Dẫn xuất hóa nhằm hai mục tiêu: (1) để làm cho acid amin kỵ nƣớc hơn và (2) để có thể phát hiện bằng cách sử dụng độ hấp thụ hoặc huỳnh quang [18]. Về vitamin B6, do có vòng thơm nên có khả năng hấp thụ quang. Chính vì thế, kĩ thuật đo quang có thể đƣợc sử dụng để định lƣợng chế phẩm thuốc tiêm và viên nén nhƣ trong dƣợc điển Việt Nam V [3]. Vitamin B6 cũng có vòng pyridin, do đó có tính base, và có thể chuẩn độ bằng acid trong môi trƣờng khan để định lƣợng nguyên liệu pyridoxin hydroclorid [3]. Đối với HPLC, các kĩ thuật RPLC đƣợc sử dụng khá phổ biến với các cột C18 [16, 23]. Một một số phƣơng pháp nghiên cứu phân tích cystin và vitamin B6 đƣợc trình bày trong bảng 1.1.

Bảng 1.1. Một số phƣơng pháp phân tích cystin và vitamin B6 STT

Tác giả

Nền mẫu

Đối tƣợng

Kỹ thuật

Cystin Dƣợc điển Mỹ

Nguyên

[25]

liệu

Cystin

Chuẩn độ. Thực hiện phản ứng cystin với kali bromat, chuẩn độ kali bromat dƣ bằng natri thiosulfat, chỉ thị đo màu.

Molnár-Perl

và

cộng sự [16]

Dịch thủy phân

Cystein,

HPLC.

cystin

Pha động: Dung dịch natri acetat pH 7,2,

protein

ACN, methanol. Pha tĩnh: cột Hypersil ODS.

Dẫn xuất hóa trƣớc cột với PITC (phenylisothiocyanat). Inglis và cộng sự

Protein

[13] 3

Cystein,

Sắc kí trao đổi ion.

cystin,

Pha tĩnh: cột Aminex A6 resin (58 x 0,9

tryptophan

cm). Pha động: Hệ đệm pH 3,26 ( Natri citrat 0,2 M), pH 4,26 (Natri citrat 0,2 M) và pH 9 (0,12 M maleat, 1,35 M Na).

Thannhauser cộng sự [23]

và

Protein

Cystein,

RPLC.

Cystin

Cột 4.6x300 mm Nova Pack C18. Pha động: Hệ đệm Pico-Tag.

Dẫn xuất hóa trƣớc cột với PITC (Phenylisothiocyanat).

Vitamin B6

Dƣợc điển Việt Nguyên liệu Pyridoxin

Chuẩn độ đo thế trong môi trƣờng khan.

Nam V [3]

Dung môi: Acid formic, acid acetic khan.

hydroclorid

Dung dịch chuẩn: Acid percloric 0,1 N.

Dƣợc điển Việt

Chế phẩm

Pyridoxin

Nam V [3]

thuốc tiêm

hydroclorid

Đo quang.

và viên nén Ronal Bartzartt và cộng sự [8] 7

Đồ uống

Pyridoxin

dinh dƣỡng,

RPLC. Cột: C18.

chế phẩm

Pha động: Ethanol, nƣớc, acid acetic.

viên nén

Khoảng làm việc: 4,4029.10-5 M 7,8081.10-4 M.

Amaro và cộng sự

Sữa bột

Pyridoxin

[6]

RPLC. Cột: Phenomenex Synergi Hidro RP 80R. Pha động: Dung dịch acid sulfuric 0,015

M, có chứa 0,005 M acid tricloro acetic. Khoảng làm việc: 0,04 μg/mL – 0,09 μg/mL.

Nhận xét: - Phân tích riêng vitamin B6: Đối với chế phẩm một thành phần, các phƣơng pháp đƣợc sử dụng thƣờng đơn giản, dễ làm nhƣ đo quang. Đối với chế phẩm nhiều thành phần, sắc ký pha đảo thƣờng đƣợc sử dụng với hệ dung môi nhiều nƣớc, thậm chí 100% nƣớc do vitamin B6 phân cực. - Phân tích riêng cystin: Các phƣơng pháp đƣợc sử dụng khá đa dạng nhƣ chuẩn độ trong môi trƣờng khan, sắc ký trao đổi ion (do có khả năng phân ly tạo ion), dẫn xuất hoá và phân tích bằng sắc ký lỏng pha đảo. - Phân tích hỗn hợp: Hiện nay chƣa có công bố nào phân tích đồng thời cystin và vitamin B6 trong cùng một phƣơng pháp. Thông thƣờng, khi phân tích acid amin và các chất có độ phân cực trung bình nhƣ vitamin B6, 2 phƣơng pháp khác nhau sẽ đƣợc sử dụng. Một phƣơng pháp RPLC dẫn xuất hóa trƣớc cột với các acid amin và một phƣơng pháp RPLC trực tiếp với vitamin B6. Sắc ký lỏng tƣơng tác thân nƣớc là kỹ thuật sắc ký có lƣu giữ tốt với các chất phân cực nhƣ acid amin, đồng thời cũng có khả năng lƣu giữ các chất có độ phân cực trung bình nhƣ vitamin B6. Trong công thức của cystin có lƣu huỳnh nên có khả năng hấp thụ quang nên nghiên cứu sử dụng HILIC 9

với detector UV để xây dựng phƣơng pháp tách và định lƣợng cystin và vitamin B6 trong chế phẩm. 1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc Sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc (Hydrophylic Interction Liqiud Chromatography – HILIC) đƣợc biết đến nhƣ một biến thể của sắc kí lỏng thông thƣờng, sử dụng pha tĩnh và pha động phân cực, có hiệu quả trong việc tách các chất phân cực và không tĩnh điện nhƣ các acid amin [15], và kháng sinh nhóm aminoglycosid [14],… Nhƣợc điểm của NPLC là dung môi pha động thƣờng độc hại và đắt tiền. RPLC cải thiện đƣợc nhƣợc điểm này, tuy vậy, khả năng lƣu giữ các chất phân tích phân cực thƣờng không cao. Với HILIC, pha tĩnh phân cực và dung môi pha động đƣợc sử dụng thƣờng là nƣớc và acetonitril (ACN), nhƣ vậy có thể khắc phục đƣợc cả nhƣợc điểm của NPLC và RPLC. 1.2.1. Pha tĩnh Bất kì bề mặt sắc kí phân cực nào cũng có thể sử dụng làm pha tĩnh trong HILIC. Những pha tĩnh điển hình nhất bao gồm silica không dẫn xuất hoặc silica gel đƣợc biến đổi với nhiều nhóm chức phân cực khác nhau. Ngoài ra, các pha tĩnh polymer cũng đƣợc sử dụng [9]. Tuy vậy, có thể do giá thành đắt, cũng nhƣ độ phân giải thấp hơn so với các cột silica nên số lƣợng cột polymer trên thị trƣờng, cũng nhƣ các nghiên cứu HILIC sử dụng cột polymer là không nhiều. 1.2.2. Pha động Trong HILIC, pha động phân cực chứa nƣớc, khi tiếp xúc với pha tĩnh phân cực sẽ tạo thành một lớp giàu nƣớc trên bề mặt pha tĩnh, tạo một hệ giống nhƣ chiết lỏng/lỏng (Lớp nƣớc ở trên bề mặt pha tĩnh và lớp dung môi pha động ít nƣớc kém phân cực hơn). Các chất phân tích sẽ đƣợc phân bố giữa 2 lớp chất lỏng này. Các pha động đƣợc sử dụng là các dung môi hữu cơ thân nƣớc nhƣ acetonitril (ACN) cùng một lƣợng nhỏ nƣớc hoặc đệm. Tuy nhiên, bất cứ dung môi không proton hóa đồng tan với nƣớc nào cũng có thể đƣợc sử dụng làm pha động trong HILIC [9]. Lƣợng nƣớc yêu cầu phải ít nhất 3% để đủ hydrat hóa các hạt pha tĩnh [19]. Bề dày của lớp nƣớc trên bề mặt pha tĩnh sẽ ảnh hƣởng lớn đến cơ chế lƣu giữ của các chất phân tích [11]. 10

HILIC có thể đƣợc thực hiện ở chế độ đẳng dòng với nồng độ dung môi hữu cơ cao; hoặc chế độ gradient với tỷ lệ cao dung môi hữu cơ khi bắt đầu và kết thúc với tỷ lệ thấp dung môi hữu cơ. pH của pha động ảnh hƣởng đến quá trình tách và thời gian lƣu do thay đổi sự phân cực của chất phân tích (với các chất phân tích acid và base) và pha động, đồng thời cũng có thể làm thay đổi trạng thái tồn tại của bề mặt pha tĩnh (với các pha tĩnh có thể bị ion hóa) [1]. Để ổn định pH pha động, các hệ đệm thƣờng đƣợc sử dụng, phổ biến là amoni acetat, amoni format, đệm phosphat,…. và pH thƣờng đƣợc giữ trong khoảng 38 trong hầu hết các trƣờng hợp [19] Nồng độ đệm cũng ảnh hƣởng đến quá trình tách do thay đổi tính phân cực của pha động, bề dày của lớp nƣớc trên bề mặt pha tĩnh và ảnh hƣởng đến tƣơng tác tĩnh điện của pha tĩnh và chất phân tích [11]. Nồng độ đệm hầu hết từ 5 đến 20 mM [19]. Tuy nhiên, cần chú ý với các pha động có đệm với tỉ lệ lớn ACN, dung dịch đệm có thể kết tủa. Do đó cần phải kiểm tra khả năng trộn lẫn trƣớc khi tiến hành. Các yếu tố thuộc về pha động cũng tác động tới sự cân xứng của pic sắc ký. Các pha động có lực ion hóa lớn cho kết quả pic cân xứng hơn [1]. Tác giả [1] đã sử dụng pha động acid formic 10 mM và TEA 5 mM cho kết quả pic cân xứng. 1.2.3. Cơ chế tách Các cơ chế tách trong HILIC là (1) Phân bố của chất phân tích giữa lớp nƣớc hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh và lớp dung môi pha động, (2) Hấp phụ của chất phân tích lên trên bề mặt của pha tĩnh, (3) Các tƣơng tác tĩnh điện của chất phân tích khi chất phân tích và pha tĩnh có tƣơng tác tĩnh điện [10, 11]. Các cơ chế có thể xảy ra rất đa dạng trong HILIC. Với các chất không tĩnh điện, chủ yếu cơ chế xảy ra là cơ chế phân bố [10]. Cơ chế hấp phụ xảy ra khi lớp nƣớc trên bề mặt pha tĩnh mỏng và có thể xuất hiện các tƣơng tác tại chỗ nhƣ tƣơng tác tĩnh điện hay tƣơng tác hydro với các vị trí nhóm chức có thể tham gia tƣơng tác này. Khi lớp nƣớc đủ dày, cơ chế chủ yếu xảy ra là cơ chế phân bố. Tùy vào cấu trúc của pha tĩnh và chất phân tích mà tƣơng tác có thể xảy ra rất đa dạng nhƣ tƣơng tác thân nƣớc, tĩnh điện, lƣỡng cực – lƣỡng cực, π – π… 11

Theo cơ chế này, khi pha động đi qua pha tĩnh, một phần của pha động sẽ tƣơng tác và tạo thành 1 lớp chất lỏng chứa nƣớc trên bề mặt pha tĩnh. Đây đƣợc coi nhƣ 1 phần của pha tĩnh. Chất phân tích khi đi qua cột sẽ phân bố giữa pha động và lớp chất lỏng này, do đó, chất phân tích càng phân cực sẽ càng đƣợc lƣu giữ lâu trong lớp nƣớc trên bề mặt pha tĩnh và thời gian lƣu càng dài. Nói cách khác, sự phân tách này dựa trên sự phân cực của các hợp chất và mức độ solvat hóa. Nếu pha tĩnh có mang điện tích, chất phân tích cũng có thể có thêm tƣơng tác tĩnh điện với pha tĩnh này. Nhƣ vậy, các chất kém phân cực sẽ đƣợc rửa giải nhanh hơn các chất phân cực. Nhƣ vậy, trong HILIC, các chất phân cực mạnh sẽ đƣợc lƣu giữ mạnh hơn và có thời gian lƣu dài hơn. HILIC phù hợp trong phân tích các chất phân cực. Sự lƣu giữ của chất phân tích trong HILIC sẽ phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ đặc điểm pha tĩnh, thành phần, tỉ lệ, pH, nồng độ của pha động [1].

CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Mẫu thử Chế phẩm nghiên cứu là viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul. Nhà sản xuất: Laboratories GALÉNIQUES VERNIN, 20, rue Louis Charles Vernin, 77190 Dammarie – Les – Lys – France; số lô sản xuất: VE2393; số đăng kí: VN-15897-12; hạn dùng: 01/06/2022.

Hình 2.1. Hình ảnh chế phẩm viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul Công thức của mỗi viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul nhƣ sau: - L-cystin: 500 mg - Pyridoxin hydroclorid: 50 mg - Tá dƣợc: Natri carboxymethylcellulose, bột talc, cellulose vi tinh thể (Avicel PH 102 ®), magnesi stearat, Sepifilm LP 010, Sepisperse AP3083 vàng, sáp carnauba. Ngoài ra còn nghiên cứu định lƣợng trên chế phẩm viên nén bao phim Ceteco Cystine B6. Hàm lƣợng cystin 500 mg, pyridoxin hydroclorid 1000 µg. Nhà sản xuất Công ty cổ phần Dƣợc Trung Ƣơng 3, số lô sản xuất: 01/0319; hạn dùng: 15/03/2022. 2.2.2. Hóa chất - Chuẩn đối chiếu: cystin (Sigma, 98,0%, C8755), pyridoxin hydroclorid (Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ƣơng, 99,56%, hàm ẩm 0,05%, 0306027) - Hóa chất: Acetonitril (Fisher, HPLC grade). Acid clohydric, natri hydroxyd, amoni acetat, acid formic, triethylamin, kali dihydrophosphat, acid phosphoric, natri acetat, natri citrat, acid citric. Nƣớc cất hai lần, dùng ngay sau khi cất. 13

2.2.3. Thiết bị, dụng cụ - Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm Chemstation. - Cột sắc ký: Cột Phenomenex; Luna 5u Silica (2) 250 x 4,6 mm; 5m, 100A; S/No: 465453-14; P/No: 00G-4274-E0. - Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức). - Phễu lọc Buchner, màng lọc cellulose 0,45 µm. - Cân phân tích A&D, Model GR-200, Nhật Bản, d = 0,1 mg. - Máy đo pH: Eutech, Singapore. - Micropipet 10-100 µL ABMATE pro, 100-1000 µL Nichipet EX. - Pipet chính xác 0,5 mL, 1 mL, 1,5 mL, 2 mL, 3 mL, 5 mL, 10 mL. - Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong, vial, chày và cối sứ. 2.3. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát quy trình xử lý mẫu. - Khảo sát điều kiện sắc kí phân tích cystin và vitamin B6 trong chế phẩm viên nén hai thành phần bằng sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc (HILIC). - Thẩm định phƣơng pháp dựa trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, độ ổn định hệ thống theo hƣớng dẫn của ICH Q2 (R1). - Ứng dụng phƣơng pháp trên xác định hàm lƣợng cystin và vitamin B6 trong chế phẩm viên nén hai thành phần. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc vitamin B6: Cân chính xác khoảng 10 mg pyridoxin hydroclorid chuẩn vào bình định mức 50,0 mL, hòa tan vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần rồi định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần, thu đƣợc dung dịch pyridoxin hydroclorid chuẩn 14

nồng độ khoảng 0,2 mg/mL (200 ppm). Từ dung dịch này, pha loãng thành các mức nồng độ 50 ppm và 40 ppm. - Dung dịch chuẩn gốc cystin: Cân chính xác khoảng 40 mg cystin chuẩn vào bình định mức 20,0 mL, thêm khoảng 18 mL dung dịch HCl 0,1M. Đem siêu âm 2 phút rồi lắc xoáy 20 phút, đến khi cystin tan hết. Định mức bằng dung dịch HCl 0,1M, thu đƣợc dung dịch cystin chuẩn nồng độ khoảng 2 mg/mL (2000 ppm). Từ dung dịch này, pha loãng thành các mức nồng độ 500 ppm và 400 ppm. 2.4.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu Tiến hành khảo sát dung môi pha mẫu là NaOH và HCl, thể tích dung môi, thời gian siêu âm, thời gian lắc xoáy mẫu thử. Dựa vào diện tích pic của chất phân tích để lựa chọn quy trình xử lý mẫu. 2.4.3. Khảo sát điều kiện sắc ký 2.4.3.1. Lựa chọn pha tĩnh Pha tĩnh đƣợc sử dụng là silica trần, không dẫn xuất hoá 2.4.3.2. Khảo sát pha động Tiến hành khảo sát thành phần, pH, tỷ lệ (v/v), nồng độ của pha động. Dựa vào khả năng tách các chất, mức độ ổn định của đƣờng nền, thời gian lƣu và hình dáng pic của chất phân tích để chọn pha động. Các pha động đƣợc khảo sát là hỗn hợp của 65-70% acetonitril và các dung dịch acid, muối sau: - Acid formic 10 mM; acid phosphoric 10 mM; acid citric 5-20 mM; acid formic 10 mM và TEA 5 mM; acid phosphoric 10 mM và TEA 5-15 mM. - Muối kali dihydrophosphat 20-40 mM, đệm phosphat pH 2,5; 3,5; 5,0. - Natri acetat 20 mM. - Natri citrat 5-20 mM, pH 2,5-5; Natri citrat 10 mM và TEA 10 mM. - Amoni acetat 15-40 mM. Các dung dịch trên đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: 15

mức 100 mL; định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần, lắc đều. Với dung dịch có thêm TEA 5 mM, hút thêm chính xác 70 µL TEA rồi định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần. - Dung dịch H3PO4 gốc 100 mM: Hút chính xác 675 µL H3PO4 vào bình định mức 100 mL, định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần, lắc đều đƣợc dung dịch H3PO4 gốc 100 mM. Từ dung dịch này, pha loãng bằng nƣớc cất với tỉ lệ thích hợp để thu đƣợc các dung dịch H3PO4 có nồng độ 10 mM và 20 mM. Với dung dịch có thêm TEA 5 mM, 10 mM, 15 mM, hút thêm chính xác 70 µL, 140 µL, 210 µL TEA rồi định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần. - Dung dịch acid citric gốc 1000 mM: Cân chính xác khoảng 10,5070 g acid citric vào cốc có mỏ 50 mL. Thêm khoảng 20 mL nƣớc cất 2 lần, dùng đũa thủy tinh khuấy đều khoảng 10 phút đến khi tan hoàn toàn. Chuyển dịch trong cốc vào bình định mức 50 mL. Tráng cốc 2 lần, mỗi lần khoảng 10 mL nƣớc cất 2 lần, rồi đổ vào bình định mức trên. Định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần, trộn đều, đƣợc dung dịch acid citric gốc 1000 mM. Từ dung dịch này pha loãng bằng nƣớc cất với tỷ lệ thích hợp để đƣợc dung dịch acid citric 5-20 mM - Dung dịch KH2PO4 gốc 400 mM: Cân chính xác khoảng 6,528 g KH2PO4 vào bình định mức 100ml. Thêm khoảng 50 mL nƣớc cất 2 lần, lắc đều cho tan rồi định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần, lắc đều. Từ dung dịch này, pha loãng bằng nƣớc cất với tỉ lệ thích hợp để thu đƣợc các dung dịch KH2PO4 có nồng độ 20 mM và 40 mM. – Dung dịch đệm phosphat 20 mM pH 2,5; pH 3,5; pH 5,0: Hút chính xác 5,00 mL dung dịch KH2PO4 gốc 400 mM vào cốc có mỏ 100 mL, thêm khoảng 50 mL nƣớc cất 2 lần, khuấy đều, chỉnh pH đến 2,5; 3,5 và 5,0 bằng dung dịch H3PO4 20 mM. Chuyển dịch trong cốc vào bình định mức 100 mL, tráng lại cốc 2 lần bằng khoảng 10 mL nƣớc cất 2 lần rồi đổ vào bình định mức 100 mL trên. Định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần, lắc đều. - Dung dịch natri acetat gốc 100 mM: Cân chính xác khoảng 1,3610 g natri acetat vào cốc có mỏ 100 mL. Thêm khoảng 50 mL nƣớc cất 2 lần, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho tan. Chuyển dịch trong cốc vào bình định mức 100 mL. Tráng cốc 2 lần, mỗi lần khoảng 20 mL nƣớc cất 2 lần, rồi đổ vào bình định mức trên. Định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần, trộn đều, đƣợc dung dịch natri acetat gốc 100 mM. Từ dung dịch này, pha loãng bằng nƣớc cất với tỉ lệ thích hợp để đƣợc dung dịch natri acetat 20 mM. 16

- Dung dịch natri citrat gốc 1000 mM: Cân chính xác khoảng 5,8820 g natri citrat vào cốc có mỏ 100 mL. Thêm khoảng 50 mL nƣớc cất 2 lần, dùng đũa thủy tinh khuấy đều khoảng 10 phút, siêu âm 5 phút đến khi tan hoàn toàn. Chuyển dịch trong cốc vào bình định mức 100 mL. Tráng cốc 2 lần, mỗi lần khoảng 20 mL nƣớc cất 2 lần, rồi đổ vào bình định mức trên. Định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần, trộn đều. Từ dung dịch này pha loãng bằng nƣớc cất với tỷ lệ thích hợp để đƣợc dung dịch natri citrat 5-20 mM. Với dung dịch có thêm TEA 5 mM, hút thêm chính xác 70 µL TEA rồi định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần. - Dung dịch muối amoni acetat gốc 1000 mM: Cân chính xác khoảng 3,854 g amoni acetat vào cốc có mỏ, hòa tan bằng 30 mL nƣớc cất 2 lần, chuyển vào bình định mức 50,0 mL; thêm nƣớc cất 2 lần vừa đủ, lắc đều. Từ dung dịch này, pha loãng bằng nƣớc cất với tỉ lệ thích hợp để thu đƣợc các dung dịch amoni acetat có nồng độ 15 mM, 30 mM, và 50 mM. Các dung dịch trên đƣợc lọc qua màng 0,45 µm và siêu âm trƣớc khi sử dụng. 2.4.3.3. Khảo sát bước sóng phát hiện Tiến hành quét phổ trên pic của 2 chất chuẩn cystin và pyridoxin hydroclorid trong khoảng bƣớc sóng từ 210 đến 400 nm. Lựa chọn bƣớc sóng phù hợp của mỗi chất. 2.4.4. Thẩm định quy trình Sau khi lựa chọn đƣợc điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phƣơng pháp định lƣợng cystin và vitamin B6 bằng HILIC theo hƣớng dẫn của ICH Q2 (R1) trên các tiêu chí sau: Độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính, độ chính xác của phƣơng pháp, độ đúng của phƣơng pháp. a. Độ phù hợp hệ thống - Độ phù hợp hệ thống là ph p thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố nhƣ máy móc, thiết bị. - Thực hiện: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa cystin và vitamin B6 (chuẩn bị ở phần sau). Ghi lại các giá trị thời gian lƣu, diện tích pic. Tính tƣơng thích hệ thống đƣợc biểu thị qua độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD% của các đáp ứng phân tích.

- Yêu cầu: Các giá trị thời gian lƣu và diện tích pic của cystin và vitamin B6 có RSD% ≤ 2%. b. Độ chọn lọc - Tính chọn lọc của phƣơng pháp: là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác nhƣ tạp chất hoặc các chất cản trở khác. - Thực hiện: Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn đơn và chuẩn hỗn hợp cystin và vitamin B6, dung dịch thử, dung dịch thử thêm chuẩn 20%, dung môi pha mẫu (mẫu trắng) từ các thành phần của chế phẩm với chƣơng trình đã lựa chọn. Ghi lại các thông số thời gian lƣu và diện tích pic. - Yêu cầu: Thời gian lƣu pic cystin và vitamin B6 của dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp, dung dịch thử phải tƣơng đƣơng nhau. Pic trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu. Dung môi pha mẫu không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu của pic cystin và vitamin B6 trên sắc ký đồ của các dung dịch chuẩn. c. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính - Đƣờng chuẩn: là đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ các chất phân tích. - Khoảng tuyến tính của một phƣơng pháp phân tích: là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tín hiệu đo đƣợc và nồng độ chất phân tích. - Thực hiện: Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp, có nồng độ cystin và vitamin B6 lần lƣợt bằng 50%, 75%, 100%, 125%, và 150% nồng độ định lƣợng và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu đo đƣợc vào nồng độ. Viết phƣơng trình thể hiện mối tƣơng quan của diện tích pic theo nồng độ của mỗi chất. Đánh giá đƣờng chuẩn dựa vào hệ số tƣơng quan r. - Dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp cystin và vitamin B6 với các nồng độ bằng 50%, 75%, 100%, 125%, 150% nồng độ định lƣợng của chúng đƣợc chuẩn bị nhƣ sau: Hút chính xác x mL dung dịch chuẩn gốc cystin và x mL dung dịch chuẩn gốc vitamin B6 cho vào bình định mức thích hợp, định mức bằng ACN dùng để chạy sắc ký. Quy trình pha dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp đƣợc thể hiện dƣới bảng 2.1.

Bảng 2.1. Quy trình pha dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp Nồng độ

Mức

Nồng độ cystin

nồng độ

(ppm)

50%

200

0,5

75%

300

6,67

1,5

100%

400

125%

500

150%

600

3,33

1,5

Hệ số pha

vitamin B6

loãng

(ppm)

x (mL)

Định mức (mL)

d. Độ chính xác của phương pháp Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt ph p đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dƣới những điều kiện xác định. + Độ lặp lại của phƣơng pháp: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Tiến hành thí nghiệm 6 lần với cùng một nồng độ mẫu thử, xác định độ lệch tƣơng đối RSD (%) của hàm lƣợng. + Độ chính xác trung gian: Bố trí thí nghiệm tƣơng tự phần độ lặp lại của phƣơng pháp nhƣng tiến hành vào thời gian khác, đổi kiểm nghiệm viên và phân tích trên hệ sắc ký lỏng khác. Thực hiện: - Tiến hành định lƣợng 6 lần riêng biệt trên một mẫu thử và tính toán độ lệch chuẩn tƣơng đối. ( ) √

⃐

∑

(

̅)

Trong đó: xi: Nồng độ tính đƣợc của lần thử nghiệm thứ i. ̅ : Nồng độ trung bình tính đƣợc của N lần thử nghiệm. N: Số lần thử nghiệm. Yêu cầu: + Độ lặp lại: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) của hàm lƣợng cystin và vitamin B6 không quá 2%. 19

+ Độ chính xác trung gian: Chênh lệch kết quả giữa 6 lần thử trong cùng một ngày và 12 lần thử trong hai ngày khác nhau, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) của hàm lƣợng cystin và vitamin B6 không quá 3%. e. Độ đúng - Độ đúng của phƣơng pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận là đúng. - Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu đƣợc so với giá trị lý thuyết. - Thực hiện: Thêm vào mẫu thử đã đƣợc xác định hàm lƣợng hoạt chất một lƣợng chính xác chất chuẩn ở mức 80%, 100%, 125% so với hàm lƣợng cystin và vitamin B6 có trong mẫu khảo sát. Độ thu hồi đƣợc tính theo công thức ( ) R: độ thu hồi (%). : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn (µg/mL). Cn: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (µg/mL). : nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (µg/mL). - Yêu cầu: Tỷ lệ thu hồi (98 – 102%) ở mỗi mức nồng độ và giá trị RSD (%) của tỷ lệ thu hồi phải ≤ 2,0 % ở mỗi mức nồng độ. Chuẩn bị các dung dịch thẩm định nhƣ sau: - Chuẩn bị 03 mẫu dung dịch chuẩn vitamin B6 120 ppm: Hút chính xác 3,00 mL dung dịch chuẩn vitamin B6 200 ppm vào bình định mức 5 mL. Định mức vừa đủ bằng nƣớc cất 2 lần, đƣợc dung dịch vitamin B6 chuẩn 0,12 mg/mL (120 ppm). - Chuẩn bị 03 mẫu dung dịch chuẩn cystin 1200 ppm: Hút chính xác 3,00 mL dung dịch chuẩn cystin 200 ppm vào bình định mức 5 mL. Định mức vừa đủ dung dịch HCl 0,1 M, đƣợc dung dịch cystin chuẩn 1,2 mg/mL (1200 ppm). - Chuẩn bị 09 mẫu thử 50%: Cân chính xác khoảng 0,0512 (g) bột thuốc đã nghiền vào bình định mức 50 mL. Làm tƣơng tự các bƣớc siêu âm, lắc xoáy rồi định mức vừa đủ 50 mL nhƣ chuẩn bị dung dịch thử ở phần 3.1.1. Sau đó hút chính xác 5 mL dịch cho vào bình định mức 20 mL. - Chuẩn bị 09 mẫu thử 50% thêm chuẩn: Hút chính xác 5,00 mL dịch mẫu thử, và x mL dung dịch chuẩn vào bình định mức 20 mL. Trộn đều và định mức bằng ACN 20

chạy sắc ký. Hút dịch vào xylanh rồi lọc qua màng 0,45 µL vào vial, thu đƣợc 09 dung dịch ở mức nồng độ khoảng 80%, 100% và 125%. Bảng 2.2 dƣới đây mô tả cách pha của 9 dung dịch trên. Bảng 2.2. Quy trình pha các mẫu thử thêm chuẩn Bình

Mức

V dung

Vcystin chuẩn

VB6 chuẩn

nồng độ

dịch thử

2000 ppm

1200 ppm

200 ppm

120 ppm

(%)

(mL)

100

125

STT

định mức (mL)

2.4.5. Áp dụng phương pháp Áp dụng phƣơng pháp trên tiến hành phân tích đồng thời cystin và vitamin B6 trong chế phẩm viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul. 2.4.6. Xử lý kết quả - Một số đặc trƣng thống kê: Các đặc trƣng thống kê đƣợc tính dựa vào dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel. Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV Độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD):

- Tƣơng quan hồi quy tuyến tính: Phƣơng trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích píc sắc ký và nồng độ chất phân tích: Y = aC + b Trong đó: Hệ số góc a: Hàm SLOPE; Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT; Hệ số tƣơng quan r: Hàm CORREL 21

CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu thử 3.1.1. Khảo sát dung môi pha mẫu - Dựa vào độ tan của cystin, tiến hành khảo sát 2 dung môi pha mẫu là dung dịch NaOH 0,1 M và dung dịch HCl 0,1 M. - Quy trình xử lý mẫu đƣợc áp dụng nhƣ sau: + Với mẫu pha trong NaOH, cân chính xác khoảng 0,2600 g bột chế phẩm đã nghiền mịn (tƣơng đƣơng 200 mg cystin) vào bình định mức 100,0 mL, thêm khoảng 20 mL dung dịch NaOH 0,1 M. Siêu âm 5 phút rồi định mức vừa đủ bằng dung môi pha mẫu tƣơng ứng, lắc đều. Hút chính xác 200 µL dịch này và 800 µL ACN, lọc qua màng 0,45 µm vào vial, đƣợc dung dịch cystin trong NaOH nồng độ 500 ppm. + Với mẫu pha trong HCl, cân chính xác khoảng 0,0512 g bột chế phẩm đã nghiền mịn (tƣơng đƣơng 40 mg cystin) vào bình định mức 50 mL. Thêm khoảng 40 mL dung dịch HCl 0,1 M. Siêu âm 5 phút sau đó lắc xoáy 30 giây rồi định mức vừa đủ bằng dung dịch HCl 0,1 M. Hút chính xác 625 µL dịch này và 325 µL ACN, lọc qua màng 0,45 µm vào vial, đƣợc dung dịch cystin trong HCl nồng độ 500 ppm. Chạy sắc kí các dung dịch này sau 0 phút, 15 phút, 30 phút. Ghi lại các diện tích pic của cystin. - Kết quả chạy sắc ký đƣợc thể hiện dƣới bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát dung môi pha mẫu Thời gian

Diện tích pic cystin pha trong NaOH

Diện tích pic cystin pha trong HCl

(phút)

(mAU.s)

416,8

1128,5

347,7

1129,0

254,3

1148,8

- Nhận xét: Với mẫu đƣợc pha trong dung dịch NaOH 0,1 M, nhận thấy có sự giảm dần diện tích pic cystin sau 30 phút, còn với mẫu đƣợc pha trong dung dịch HCl 0,1 M, hiện tƣợng trên không xảy ra. Do đó, lựa chọn dung môi pha mẫu là dung dịch HCl 0,1 M để tiếp tục tiến hành khảo sát. 22

3.1.2. Khảo sát thể tích dung môi pha mẫu - Do không có thông tin cụ thể về độ tan của cystin trong dung dịch HCl 0,1 M, mặt khác, hàm lƣợng cystin trong viên nén lớn (500 mg), nên cần khảo sát lƣợng thể tích dung môi có thể dùng để chiết đƣợc hết cystin trong mẫu thử. - Khảo sát các thể tích dung môi HCl 0,1 M dùng để hòa tan cystin trong khoảng 50 mg mẫu thử, tƣơng đƣơng với khoảng 40 mg cystin là 10 mL, 20 mL, 25 mL, 50 mL và thể tích dung môi HCl 0,1 M dùng để hòa tan cystin trong khoảng 12,5 mg mẫu thử, tƣơng đƣơng với khoảng 10 mg cystin là 20 mL (tƣơng đƣơng với 80 mL HCl cho 50 mg chế phẩm). - Tiến hành: Cân chính xác khoảng 50 mg bột chế phẩm đã nghiền mịn vào các bình định mức tƣơng ứng 10 mL, 20 mL, 25 mL, 50 mL. Thêm tƣơng ứng khoảng 8 mL, 15 mL, 20 mL và 45 mL dung dịch HCl 0,1 M vào các bình định mức trên. Lắc xoáy 5 phút, định mức vừa đủ bằng dung dịch HCl 0,1 M, lắc đều, thu đƣợc các dung dịch cystin với nồng độ tƣơng ứng khoảng 4000 ppm, 2000 ppm, 1600 ppm và 800 ppm. Pha loãng các dung dịch này về nồng độ 500 ppm bằng pha động và ACN chạy sắc ký. Với mẫu pha tƣơng đƣơng 80 mL dung dịch HCl / 50 mg mẫu thử, tiến hành bằng cách cân 12,5 mg chế phẩm đã nghiền, tƣơng đƣơng khoảng 10 mg cystin vào bình định mức 20 mL. Thêm khoảng 18 mL dung dịch HCl 0,1 M, lắc xoáy 5 phút rồi định mức vừa đủ bằng dung dịch HCl 0,1M, thu đƣợc dung dịch cystin có nồng độ 500 ppm. Mỗi dung dịch đƣợc pha loãng vào 1 vial, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm vào 1 vial và tiến hành chạy sắc kí Kết quả chạy sắc ký cho thấy, diện tích pic vitamin B6 gần nhƣ không thay đổi theo thể tích dung dịch HCl, còn diện tích pic của cystin thay đổi rõ rệt, kết quả đƣợc thể hiện dƣới bảng 3.2:

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thể tích dung môi pha mẫu Thể tích dung dịch HCl (mL)/50mg mẫu thử Diện tích pic cystin (mAU.s) 10

587,6

840,7

986,3

1252,2

1146,1

- Nhận xét: Nhƣ vậy có sự tăng rõ rệt diện tích pic cystin khi tăng thể tích dung môi HCl 0,1 M và đạt giá trị cao nhất tại 50 mL, khi tăng thể tích dung dịch HCl / 50 mg mẫu thử thì diện tích pic cũng không tăng. Do đó, lựa chọn thể tích dung môi 50 mL để tiếp tục tiến hành khảo sát. 3.1.3. Khảo sát thời gian siêu âm - Khảo sát các thời gian siêu âm: 0,5 phút, 2 phút, 5 phút. - Tiến hành: Cân chính xác khoảng 50 mg bột chế phẩm đã nghiền mịn vào 03 bình định mức 50 mL. Thêm khoảng 45 mL dung dịch HCl 0,1 M vào các bình định mức trên. Siêu âm tƣơng ứng 30 giây, 2 phút và 5 phút, định mức vừa đủ bằng dung dịch HCl 0,1 M, lắc đều, thu đƣợc các dung dịch cystin với nồng độ khoảng 800 ppm. Pha loãng các dung dịch này về nồng độ 500 ppm bằng pha động và ACN chạy sắc ký (tƣơng tự phần 3.1.2). - Kết quả chạy sắc ký đƣợc thể hiện dƣới bảng 3.3: Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thời gian siêu âm Mẫu

Thử

Thời gian siêu âm (phút) Diện tích pic cystin (mAU.s) 0,5

831,5

1117,1

1105,9

Chuẩn

1415,4

- Nhận xét: Nhƣ vậy có sự tăng rõ rệt diện tích pic cystin khi tăng thời gian siêu âm từ 0,5 lên 2 phút. Giữa 2 mẫu siêu âm 2 phút và 5 phút không có sự chêch lệch 24

đáng kể về diện tích pic cystin. Tuy nhiên, so sánh với mẫu chuẩn 500 ppm thì vẫn nhỏ hơn. Do đó, tiến hành khảo sát thời gian lắc xoáy tiếp với các mẫu thử sau khi siêu âm 2 phút và 5 phút. 3.1.4. Khảo sát thời gian lắc xoáy - Khảo sát các thời gian lắc xoáy 0,5 phút, 2 phút, 5 phút và 10 phút. - Tiến hành: Cân chính xác khoảng 50 mg bột chế phẩm đã nghiền mịn vào 03 bình định mức 50 mL. Thêm khoảng 45 mL dung dịch HCl 0,1 M vào các bình định mức trên. Siêu âm 5 phút, sau đó đem lắc xoáy tƣơng ứng 0,5 phút, 2 phút, 5 phút và 10 phút. Định mức vừa đủ bằng dung dịch HCl 0,1 M, lắc đều, thu đƣợc các dung dịch cystin với nồng độ khoảng 800 ppm. Pha loãng các dung dịch này về nồng độ 500 ppm bằng pha động và ACN chạy sắc ký (tƣơng tự phần 3.1.2). - Kết quả chạy sắc ký đƣợc thể hiện dƣới bảng 3.4: Bảng 3.4: Kết quả khảo sát thời gian lắc xoáy Thời gian siêu âm Thời gian lắc xoáy (phút) Diện tích pic cystin (mAU.s)

2 phút

5 phút

1312,5

1416,6

1574.9

0,5

1105,9

1250,4

1554

1543,7

- Nhận xét: Khi tăng thời gian lắc xoáy, diện tích pic cystin đều tăng trong cả 2 trƣờng hợp siêu âm 2 phút và 5 phút. So sánh giữa mẫu siêu âm 2 phút và 5 phút, mẫu siêu âm 2 phút cần lắc xoáy 10 phút mới đạt đƣợc diện tích pic tƣơng đƣơng mẫu chuẩn 500 ppm, trong khi mẫu siêu âm 5 phút chỉ cần lắc xoáy 5 phút đã có thể đạt đến diện tích pic của mẫu chuẩn 500 ppm. Do đó, để giảm thời gian xử lí mẫu, lựa chọn thời gian siêu âm là 5 phút và thời gian lắc xoáy là 5 phút.

Nhƣ vậy, quy trình xử lí mẫu đã đƣợc xây dựng nhƣ sau: Cạo lớp vỏ bao phim, nghiền mịn 20 viên chế phẩm, sau đó cân chính xác khoảng 0,0512 (g) bột chế phẩm đã nghiền (tƣơng ứng với khoảng 40 mg cystin và 4 mg vitamin B6) vào bình định mức 50 mL. Thêm khoảng 45 mL dung dịch HCl 0,1M, vừa thêm vừa lắc đều. Đem bình định mức cùng chế phẩm siêu âm 5 phút. Sau 5 phút lấy bình trong bể siêu âm ra đem lắc xoáy 5 phút, rồi định mức vừa đủ bằng dung dịch HCl 0,1 M. Trộn đều hỗn hợp trong bình định mức rồi dùng pipet chính xác hút 5,00 mL dịch vào bình định mức 10 mL, định mức vừa đủ bằng ACN dùng để chạy sắc ký. Trộn đều hỗn hợp trong bình. Hút dịch trong bình định mức 10 mL bằng xylanh rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm vào vial, thu đƣợc dung dịch thử dùng để định lƣợng cystin và vitamin B6 trong chế phẩm. Tóm tắt quy trình chuẩn bị mẫu thử đƣợc trình bày trong hình 3.1:

Hình 3.1: Quy trình chuẩn bị mẫu thử 26

3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 3.2.2. Khảo sát pha động 3.2.2.1. Khảo sát thành phần pha động - Khảo sát pha động là hỗn hợp của ACN 70% (v/v) và 1 trong các dung dịch sau: các dung dịch muối amoni acetat, acid formic, acid phosphoric, đệm phosphat, muối natri acetat, đệm citrat. Kết quả khảo sát cho thấy: - Khi sử dụng dung môi là các acid (acid formic và acid phosphoric, pic cystin và vitamin B6 bị chẻ. Khi thêm TEA vào, tuy có cái thiện hình dáng pic đáng kể nhƣng pic vẫn bị chẻ. - Khi sử dung môi pha động là các dung dịch muối, natri acetat, natri citrat và amoni acetat, kali dihydrophosphat thì các pic này không bị chẻ và cân xứng hơn. Dựa vào hình dáng pic của 2 chất phân tích, lựa chọn pha động là amoni acetat để tiếp tục tiến hành khảo sát. Đây cũng là pha động có khả năng tan tốt trong ACN, do đó cũng ít khả năng tủa lại với tỉ lệ ACN cao nhƣ trong HILIC. Hình 3.2 thể hiện kết quả khảo sát thành phần pha động.

Hình 3.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động trên cột silica: a) H3PO4 10 mM, b) HCOOH 10 mM, c) Natri citrat 10 mM, d) KH2PO4 20 mM, e) CH3COONa 20 mM, f) CH3COONH4 30 mM 3.2.2.2. Khảo sát nồng độ muối - Khảo sát các dung môi pha động gồm ACN 70% (v/v) và dung dịch amoni acetat 3 mức nồng độ là 15 mM, 30 mM, 50 mM của dung dịch amoni acetat. Kết quả khảo sát cho thấy, khi tăng nồng độ dung dịch amoni acetat từ 15 lên 50 mM, pic vitamin B6 và cystin đều trở nên cân xứng hơn, do đó lựa chọn nồng độ amoni acetat 50 mM để tiếp tục tiến hành khảo sát. Kết quả khảo sát các mức nồng đƣợc trình bày trong hình 3.3.

Hình 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ muối CH3COONH4: a) 15 mM, b) 50 mM 3.2.2.4. Khảo sát tỉ lệ thành phần pha động - Tiến hành khảo sát dung môi pha động gồm hỗn dợp dung môi ACN và dung dịch amoni acetat 50 mM ở 2 tỉ lệ 70:30 (v/v) và 65:35 (v/v). Kết quả khảo sát các mức tỉ lệ pha động đƣợc trình bày trong hình 3.4.

Hình 3.4. Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động CH3COONH4 50 mM: a) 70:30 b) 65:35 - Nhận xét: Tỉ lệ pha động chỉ ảnh hƣởng đến thời gian lƣu của chất phân tích chứ không ảnh hƣởng đến độ cân xứng của pic cystin và vitamin B6. Nhƣ vậy, để giảm thời gian phân tích cũng nhƣ tiết kiệm ACN, lựa chọn tỉ lệ pha động là 65:35 để tiếp tục tiến hành khảo sát. 3.2.1. Lựa chọn bước sóng phát hiện Tiến hành chạy sắc ký hỗn hợp chuẩn cystin và vitamin B6, pha động là hỗn hợp ACN và dung dịch muối amoni acetat nồng độ 30 mM tỉ lệ 65:35 (v/v), pha tĩnh là cột silica. Quét phổ trên pic của hai chất chuẩn trong khoảng bƣớc sóng từ 190 nm đến 400 nm thu đƣợc kết quả nhƣ trong hình 3.5.

286 nm

250 nm

a) Cystin

b) Vitamin B6

Hình 3.5. Phổ hấp thụ UV của a) cystin và b) vitamin B6 Nhận xét: - Từ phổ hấp thụ của cystin và vitamin B6 thấy rằng vitamin B6 có cực đại hấp thụ ở bƣớc sóng 286 nm, điều này phù hợp do pyridoxin có chứa vòng thơm nên lựa chọn bƣớc sóng 286 nm định lƣợng vitamin B6. - Cystin có cực đại hấp thụ tại bƣớc sóng 250 nm, phù hợp với các tài liệu tham khảo. Do đó lựa chọn bƣớc sóng 250 nm để định lƣợng cystin. - Ngoài ra, có thể khảo sát thêm bƣớc sóng 210 nm, vì ở bƣớc sóng này, độ hấp thụ của cả cystin và vitamin B6 đều đang ở mức cao, tuy nhiên, cần lƣu ý ảnh hƣởng của nền mẫu và dung môi. 3.4. Phƣơng pháp phân tích cystin và vitamin B6 Từ kết quả thực nghiệm trên, xây dựng phƣơng pháp phân tích cystin và vitamin B6 trong viên nén cụ thể nhƣ sau: - Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ cystin 400 ppm và vitamin B6 40 ppm nhƣ mục 2.4.1 và mẫu thử nhƣ mục 3.1. - Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: Cột Phenomenex Silica 4,6 x 250 mm; 5µm. + Pha động: Hỗn hợp ACN : amoni acetat 50 mM = 65:35 (v/v). + Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút. + Bƣớc sóng phát hiện: 250 nm đối với cystin và 286 nm đối với vitamin B6. + Thể tích tiêm mẫu: 50 µL.

3.5. Thẩm định phƣơng pháp 3.5.1. Độ phù hợp hệ thống Tiến hành chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp cystin và vitamin B6 nhƣ mục 3.1. Sau đó tiến hành chạy sắc kí mẫu này 06 lần theo phƣơng pháp đã đặt ra ở mục 3.4. Ghi lại các sắc kí đồ, thời gian lƣu và diện tích pic. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 và phụ lục 1: Bảng 3.5: Kết quả độ phù hợp hệ thống STT

Cystin

Vitamin B6

tR (phút)

S (mAU.s)

tR (phút)

S (mAU.s)

5,450

1093,7

3,006

2230,6

5,455

1093,8

3,007

2223,0

5,464

1080,4

3,008

2228,1

5,466

1089,9

3,007

2223,0

5,471

1072,1

3,007

2222,6

5,471

1084,0

3,008

2221,0

5,463

1085,7

3,007

2224,7

RSD (%)

0,16%

0,78%

0,03%

0,17%

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%) của các thông số phân tích đều dƣới 2%. Nhƣ vậy, phƣơng pháp đã đạt tiêu chuẩn về độ ổn định hệ thống với hai chất cystin và vitamin B6. 3.5.2. Độ chọn lọc Chuẩn bị các mẫu nhƣ trong mục 2.4.4 theo quy trình nhƣ trong mục 3.1. Sau đó tiến hành sắc kí theo phƣơng pháp ở mục 3.4. Kết quả đƣợc thể hiện dƣới hình 3.6, hình 3.7 và phụ lục 2:

Cystin

Hình 3.6. Kết quả độ chọn lọc ở bƣớc sóng 250 nm

Vitamin B6

Hình 3.7. Kết quả độ chọn lọc ở bƣớc sóng 286 nm Nhận xét: - Trên sắc ký đồ chuẩn cystin ở bƣớc sóng 250 nm xuất hiện pic ở 5,498 phút. - Trên sắc ký đồ chuẩn vitamin B6 ở bƣớc sóng 286 nm xuất hiện pic ở 3,021 phút. - Trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu (mẫu trắng) không có pic tại thời gian lƣu của hai chất phân tích trong mẫu chuẩn hỗn hợp và chuẩn đơn từng chất. - Trên sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp, và mẫu thử thêm 20% chuẩn có pic hai chất ứng với thời gian lƣu với pic trong chuẩn đơn thành phần. - Trên sắc ký đồ mẫu thử có pic tại thời gian lƣu tƣơng ứng với thời gian lƣu của hai chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp của cystin và vitamin B6. Hệ số chồng phổ của cystin và vitamin B6 so với pic trong sắc kí đồ chuẩn lần lƣợt là 999,995 và 999,944. Kết luận: Phƣơng pháp đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ chọn lọc với cystin và vitamin B6. Pic cystin có thời gian lƣu khoảng 5,498 phút, pic vitamin B6 có thời gian lƣu khoảng 3,021 phút. 32

3.5.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính. Chuẩn bị các mẫu nhƣ trong mục 2.4.4 theo quy trình nhƣ trong mục 3.1. Sau đó tiến hành sắc kí theo phƣơng pháp ở mục 3.4. Kết quả đƣợc thể hiện dƣới bảng 3.6: Bảng 3.6. Kết quả đƣờng chuẩn Cystin

Vitamin B6.HCl Diện tích pic

Nồng độ (ppm)

Diện tích pic

Nồng độ (ppm)

(mAU.s)

203,1

263,5

24,5

953,2

304,7

677,7

36,7

1425,2

406,2

1001,9

49,0

2101,6

507,8

1258,8

61,2

2480,1

609,3

1581,8

73,4

2889,5

y = 3,1685x – 330,34

y = 40,258x – 1,08

r = 0,997

r = 0,995

Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát, đã có sự tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của cystin và vitamin B6. - Với cystin: Có sự tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 203,10 đến 609,31 ppm; hệ số tƣơng quan r = 0,997. - Với vitamin B6: Có sự tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 24,48 đến 73,44 ppm; hệ số tƣơng quan r = 0,995. Kết luận: Phƣơng pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính đạt yêu cầu. 3.5.4. Độ chính xác của phương pháp Chuẩn bị các mẫu nhƣ trong mục 2.4.4 theo quy trình nhƣ trong mục 3.1. Sau đó tiến hành sắc kí theo phƣơng pháp ở mục 3.4. Kết quả đƣợc thể hiện dƣới bảng 3.7:

Bảng 3.7. Kết quả độ chính xác của phƣơng pháp Nồng độ Ngày

STT

mthử (g)

mẫu thử cystin (ppm)

Nồng độ % HL

mẫu thử

% HL

cystin

vitamin B6

(ppm)

0,0514

404,9

100,8

39,7

99,1

0,0515

402,8

100,1

39,9

99,2

0,0514

411,7

102,5

39,2

97,7

0,0515

414,1

102,9

38,5

95,8

0,0514

414,7

103,3

39,4

98,2

0,0515

406,3

101,0

38,6

95,9

TB1 (n = 6)

101,8%

97,6%

RSD1 (%)

1,27%

1,54%

0,0514

401,4

100,0

38,9

96,9

0,0513

395,4

98,7

39,2

97,7

0,0514

411,0

102,4

38,4

95,6

0,0513

390,2

97,4

39,2

97,8

0,0514

400,0

99,6

38,4

95,7

0,0514

402,8

100,3

37,9

94,4

TB2 (n = 6)

99,7%

96,4%

RSD2 (%)

1,68%

1,38%

TB (n = 12)

100,7%

97,0%

RSD (%)

1,77%

1,56%

Nhận xét: Độ lặp lại trong ngày của hàm lƣợng cystin và vitamin B6 đạt yêu cầu, thể hiện bởi RSD < 2% và độ lặp lại khác ngày của hàm lƣợng cystin và vitamin B6 đạt yêu cầu, thể hiện bởi RSD < 3% Kết luận: Phƣơng pháp khảo sát đạt về độ chính xác. 3.5.5. Độ đúng của phương pháp Chuẩn bị các mẫu nhƣ trong mục 2.4.4 theo quy trình nhƣ trong mục 3.1. Sau đó tiến hành sắc kí theo phƣơng pháp ở mục 3.4. Kết quả đƣợc thể hiện dƣới bảng 3.8 và 3.9:

Bảng 3.8. Kết quả độ đúng của cystin

STT

mthử (g)

Nồng độ

mẫu đo

cystin

đƣợc

thêm

(ppm)

Nồng độ cystin thu lại (ppm)

% thu hồi

Trung

RSD

(%)

bình (%)

(%)

100,0

0,91

101,2

0,98

98,9

0,32

0,0513

306,9

121,9

121,0

99,3

0,0513

306,6

121,9

123,1

101,0

0,0514

312,6

121,9

121,5

99,7

0,0514

391,6

203,1

205,7

101,3

0,0514

393,6

203,1

207,6

102,2

0,0516

389,5

203,1

203,6

100,2

0,0513

471,7

304,7

300,5

98,6

0,0513

487,1

304,7

301,2

98,9

0,0513

476,2

304,7

302,4

99,3

Bảng 3.9. Kết quả độ đúng của vitamin B6

STT

mthử (g)

Nồng độ

mẫu đo

vitamin B6

đƣợc (ppm)

thêm (ppm)

Nồng độ vitamin B6

% Thu hồi

Trung

RSD

thu lại

(%)

bình (%)

(%)

101,2

1,38

100,8

0,87

100,6

1,61

(ppm)

0,0513

33,1

14,7

14,6

99,6

0,0513

34,4

14,7

15,0

101,9

0,0514

34,4

14,7

15,0

102,1

0,0514

43,5

24,5

24,4

99,9

0,0514

43,9

24,5

24,9

101,6

0,0516

44,3

24,5

24,7

101,1

0,0513

54,8

36,7

36,3

98,9

0,0513

56,0

36,7

37,5

102,2

0,0513

55,5

36,7

37,0

100,8

Nhận xét: Các giá trị % thu hồi đều nằm trong khoảng 98-102% ở mỗi mẫu khảo sát, các giá trị RSD (%) cũng nhỏ hơn 2% ở mỗi mức nồng độ Kết luận: Phƣơng pháp khảo sát đạt về độ đúng

3.3. Đánh giá độ ổn định của mẫu - Tiến hành pha 01 mẫu thử và 01 mẫu chuẩn hỗn hợp 100% nhƣ phần 3.1. Chạy sắc kí các mẫu thử ở thời điểm 0 giờ, 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 15 giờ, mẫu chuẩn ở thời điểm 0 giờ, 0,5 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ và 8 giờ theo phƣơng pháp xây dựng đƣợc ở phần 3.4. Ghi lại diện tích pic tại các thời điểm và so sánh với mốc 0 giờ. - Đồ thị kết quả chạy sắc kí đƣợc thể hiện dƣới hình 3.8: ĐỘ Ổ N ĐỊNH DUNG DỊCH T H Ử Cystin trong mẫu thử

Vitamin B6 trong mẫu thử

PHẦN TRĂM (%)

110 100 90 80 70 0

0,5

THỜI ĐIỂM (GIỜ)

ĐỘ ỔN ĐỊNH DUNG DỊCH CHUẨN

PHẦN TRĂM (%)

Cystin trong mẫu chuẩn

Vitamin B6 trong mẫu chuẩn

105 100 95 90 85 0

0,5

THỜI ĐIỂM (GIỜ)

Hình 3.8. Kết quả đánh giá độ ổn định của mẫu - Nhận xét: Không có sự giảm đáng kể diện tích pic của hai chất phân tích trong 15 giờ đầu ở mẫu thử và trong 6 giờ đầu ở mẫu chuẩn. Đối với vitamin B6, không có sự giảm đáng kể diện tích pic ở mẫu chuẩn sau 8 giờ, và mẫu thử sau 15 giờ. Đối với cystin, từ 8 giờ bắt đầu có xu hƣớng giảm nồng độ trong mẫu thử (giảm 7,4%). Tuy nhiên, với mẫu thử, nồng độ cystin không giảm sau 15 giờ. Vì cystin là một chất có độ 36

ổn định không cao, có thể trong thành phần viên n n đã đƣợc bổ sung chất ổn định để hàm lƣợng cystin không bị giảm nhƣ với dung dịch chuẩn. - Kết luận: Mẫu thử có thể đƣợc xử lý và phân tích trong ngày, còn dung dịch chuẩn cần đƣợc phân tích trong 6 tiếng để đảm bảo độ ổn định của cystin. 3.6. Ứng dụng phƣơng pháp phân tích chế phẩm viên nén bao phim trên thị trƣờng Xác định khối lƣợng trung bình viên: Lấy 20 viên chế phẩm, cạo lớp vỏ bao phim bên ngoài rồi đem cân, đƣợc khối lƣợng trung bình viên mTB= 0,6400 (g), tƣơng đƣơng với 500 mg cystin và 50 mg pyridoxin hydroclorid. Nghiền 20 viên này với chày và cối sứ khô, trộn đều. - Từ chế phẩm Cystine B6 Bailleul (số lô SX VE2393) cân 03 mẫu thử độc lập. Tiến hành xử lí mẫu nhƣ mục 3.1, sau đó chạy sắc kí theo phƣơng pháp ở mục 3.4. - Chế phẩm viên nén bao phim Ceteco Cystine B6 với hàm lƣợng cystin 500 mg và pyridoxin hydroclorid 1000 µg cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự. Yêu cầu: - Theo chuyên luận riêng của viên nén vitamin B6 trong dƣợc điển Việt Nam V, hàm lƣợng pyridoxin hydroclorid từ 90% - 110% so với hàm lƣợng ghi trên nhãn [3], [24]. - Do không có chuyên luận riêng của cystin, lựa chọn tiêu chuẩn đánh giá viên n n theo chuyên luận chung của dƣợc điển Mỹ. Hàm lƣợng cystin từ 95% - 105% so với hàm lƣợng ghi trên nhãn [24]. Kết quả định lƣợng của cystin và vitamin B6 trong chế phẩm Cystine B6 Bailleul đƣợc trình bày trong bảng 3.10 và 3.11. Bảng 3.10. Kết quả định lƣợng cystin trong chế phẩm Cystine B6 Bailleul STT

mthử (g)

Nồng độ mẫu thử (ppm)

Hàm lƣợng cystin (%)

0,0514

414,7

103,3

0,0515

406,3

101,0

0,0515

402,8

100,1

Trung bình

101,5

Bảng 3.11. Kết quả định lƣợng vitamin B6 trong chế phẩm Cystine B6 Bailleul STT

mthử (g)

Nồng độ mẫu thử (ppm)

Hàm lƣợng vitamin B6. HCl (%)

0,0514

39,2

97,7

0,0515

38,6

95,9

0,0515

39,9

99,2

Trung bình

97,6

Kết luận: Chế phẩm đạt yêu cầu về hàm lƣợng vitamin B6 và cystin theo dƣợc điển Mỹ [24] và dƣợc điển Việt Nam V [3]. Định lƣợng chế phẩm Ceteco Cystine B6 thu đƣợc hàm lƣợng cystin là 95,02%, đạt chỉ tiêu về hàm lƣợng cystin theo dƣợc điển Mỹ. Trên sắc kí đồ của mẫu thử Ceteco Cystine B6 vẫn phát hiện pic của vitamin B6 và có thể định lƣợng đƣợc. Tuy nhiên, phƣơng pháp chƣa đƣợc thẩm định ở nồng độ này (bằng 1/50 nồng độ mẫu thử Cystine B6 Bailleul). Do đó, muốn định lƣợng vitamin B6 trong chế phẩm Ceteco Cystine B6, cần tiền hành thẩm định lại phƣơng pháp ở nồng độ này. 3.7. Nhận xét và bàn luận 3.7.1. Nhận xét về quá trình xử lý mẫu - Cystin ít tan trong nƣớc (190 g/L ở 20oC) [17] tƣơng đƣơng khoảng 0,791 mM và 190 ppm. Mặt khác, cystin hấp thụ quang khá k m. Do đó, nếu pha dung dịch cystin trong nƣớc, nồng độ thu đƣợc sẽ rất nhỏ, thậm chí có thể không lên pic ở bƣớc sóng cần đo và có thể ảnh hƣởng đến độ chính xác của phƣơng pháp. - Về lựa chọn dung môi pha mẫu: Cả NaOH và HCl đều có khả năng hòa tan cystin tốt. Tuy nhiên, mẫu pha trong NaOH bị phân hủy nhanh hơn mẫu pha trong HCl. Điều này tƣơng đồng với nghiên cứu của Shinohara và Kilpatrick [21]. - Trong quá trình khảo sát dung môi pha mẫu, mẫu đƣợc pha trong NaOH có sự giảm đáng kể diện tích pic cystin theo thời gian so với mẫu đƣợc pha trong HCl. Điều này có thể lý giải bởi độ ổn định của cystin. Cystin trong môi trƣờng nƣớc trải qua quá trình thủy phân tạo ra cystein [21]. Quá trình này xảy ra trong cả môi trƣờng acid và môi trƣờng kiềm. Tuy nhiên, trong môi trƣờng kiềm, quá trình thủy phân xảy ra nhanh hơn nhiều so với môi trƣờng acid [21]. Nhƣ vậy, với mẫu pha trong NaOH, cystin trải 38

qua sự thủy phân nhanh hơn nhiều mẫu đƣợc pha trong HCl, dẫn đến diện tích pic cystin bị giảm đáng kể sau 30 phút. Quá trình siêu âm cũng có thể ảnh hƣởng đến tốc độ của phản ứng. Do đó, chỉ nên chiết 1 lần mà không nên siêu âm nhiều lần. - Mặc dù cystin tan trong HCl tốt hơn so với nƣớc, tuy nhiên tốc độ hòa tan chậm, do đó cần kết hợp siêu âm và lắc xoáy để có thể hòa tan hết lƣợng cystin trong mẫu thử. - Vitamin B6 ổn định trong các điều kiện phân tích. Còn cystin trong mẫu chuẩn bị phân hủy một phần sau 8 giờ (Chỉ còn 92,6% so với thời điểm 0 giờ). Tốc độ phân hủy này là phù hợp để tiến hành phân tích mẫu trong ngày. Trong mẫu thử, cystin ổn định hơn. Điều này có thể do các thành phần khác trong mẫu thử làm tăng độ ổn định của cystin. Mẫu khá ổn định trong khoảng 15 giờ, do đó quy trình thẩm định không bị ảnh hƣởng nhiều bởi sự phân hủy cystin trong mẫu. - Trong quá trình khảo sát quy trình xử lí mẫu, khi siêu âm nhiều lần, bể siêu âm có thể nóng lên, làm tăng nhiệt độ mẫu khiến tăng tốc độ phân hủy cystin. Thể hiện bởi sự giảm diện tích pic cystin sau mỗi lần tiêm. Vì vậy cần chú ý thay nƣớc trong bể mỗi khi thấy nƣớc có ấm lên. - Cystin hấp thụ quang k m. Do đó, khi dùng detector DAD, cần định lƣợng ở nồng độ cao (400 ppm). Trong khi đó, vitamin B6 có nhóm mang màu và có khả năng hấp thụ quang tốt, do đó có thể định lƣợng ở nồng độ thấp (40 ppm). Nhƣ vậy, mặc dù tỉ lệ hàm lƣợng trong viên n n là 500 mg : 50 mg, nhƣng vẫn có thể định lƣợng đƣợc đồng thời cả hai chất mà chỉ cần xử lí mẫu một lần. Mặt khác, dectector đƣợc sử dụng là detector DAD, có thể định lƣợng chất phân tích ở đồng thời 2 bƣớc sóng. Nhƣ vậy có thể tránh khỏi ảnh hƣởng của nền mẫu. - Quy trình xử lí mẫu đơn giản và khắc phục đƣợc nhƣợc điểm độ tan và độ ổn định của cystin. 3.7.2. Nhận xét về xây dựng và thẩm định phương pháp - Sử dụng các pha động là hỗn hợp là ACN và các acid formic, acid phosphoric cho hình dáng pic không cân xứng nhất. Điều này tƣơng đồng với các nghiên cứu đã đƣợc

công bố [1]. Khi thêm TEA, pic có cải thiện độ cân xứng, tuy nhiên vẫn chƣa thể khắc phục đƣợc triệt để nhƣ trong nghiên cứu của tác giả [1]. - Khi sử dụng pha động là hỗn hợp của ACN và các muối, pic thu đƣợc có hình dáng cân xứng hơn, tƣơng đồng với nghiên cứu đã đƣợc công bố [1]. Qua khảo sát đã chọn đƣợc hệ dung môi phù hợp là hỗn hợp ACN và dung dịch amoni acetat 50 mM. Đây cũng là dung môi có tính tƣơng thích cao [1]. - Khi tăng nồng độ muối, pic nhận đƣợc có độ cân xứng cao hơn, tƣơng đồng với nghiên cứu đã đƣợc công bố [1]. Nồng độ dung dịch amoni acetat là 50 mM, tỉ lệ thể tích trong pha động là 35%, tƣơng đƣơng 17,5 mM trong pha động. Đây cũng là nồng độ phù hợp với khuyến cáo [11]. - Tuy cystin bị phân hủy theo thời gian, tuy nhiên, sản phẩm phân hủy của cystin là cystein không ảnh hƣởng đến kết quả phân tích và định lƣợng, do mẫu chuẩn cystein không hiện pic ở bƣớc sóng 250 nm. Ở bƣớc sóng 210 nm, cystein hiện pic ở 1,926 phút và không trùng với thời gian lƣu của hai chất phân tích.

Hình 4.1. Sắc kí đồ dung dịch chuẩn cystin ở bƣớc sóng 210 nm - Pha động đƣợc sử dụng có tỉ lệ ACN cao (65%), nên khi phân tích với tốc độ dòng là 1,5 mL/phút, áp suất của hệ thống vẫn thấp (khoảng 55 bar). Nhƣ vậy, tuổi thọ của cột sẽ đƣợc k o dài hơn. Ngoài ra, trong HILIC, khi tăng tỉ lệ nƣớc từ 30% lên 35% (v/v) thì thời gian lƣu của cystin và vitamin B6 giảm xuống, nhờ đó có thể tiết kiệm dung môi, cũng nhƣ giảm thời gian phân tích. - Thời gian lƣu của cystin (logP = -5,08) là 5,498 phút, trong khi thời gian lƣu của vitamin B6 (logP = -0,77) là 3,021 phút. Điều này phù hợp với tính chất của HILIC khi chất có độ phân cực càng cao thì càng bị lƣu giữ mạnh bởi pha động [9]. 40

- Hệ số chắn của đƣờng chuẩn xây dựng đƣợc vẫn còn cao. Điều này vẫn chƣa thể lí giải đƣợc trong nghiên cứu này. Có khả năng do hệ thống mắc một sai số nào đó, hoặc do pic có độ cân xứng chƣa thực sự cao, dẫn đến lấy diện tích vẫn chƣa đƣợc chính xác.

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Nghiên cứu này đã đạt đƣợc 2 mục tiêu đề ra: - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp và thẩm định đạt yêu cầu phƣơng pháp phân tích đồng thời cystin và vitamin B6 trong chế phẩm bằng sắc kí lỏng tƣơng tác thân nƣớc. Điều kiện sắc kí xây dựng đƣợc: + Pha tĩnh: Cột Phenomenex Silica 4,6 x 250 mm; 5µm. + Pha động: hỗn hợp ACN : amoni acetat 50 mM có pH 5,5 = 65 : 35 (v/v). + Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút. + Bƣớc sóng phát hiện: 250 nm đối với cystin và 286 nm đối với vitamin B6. + Thể tích tiêm mẫu: 50 µL - Ứng dụng phƣơng pháp xây dựng đƣợc, định lƣợng chế phẩm viên nén bao phim Cystine B6 Bailleul đạt yêu cầu theo dƣợc điểm Mỹ và dƣợc điển Việt Nam V. Chế phẩm Ceteco cystine B6 đạt yêu cầu về hàm lƣợng cystin theo dƣợc điển Mỹ.

4.2. Kiến nghị Dựa trên kết quả nghiên cứu, tôi xin đƣa ra kiến nghị sau: Khảo sát tính thích hợp và áp dụng phƣơng pháp trên chế phẩm khác cũng 2 thành phần cystin và vitamin B6 nhƣng với tỉ lệ hoạt chất khác (hàm lƣợng cystin : pyridoxin hydroclorid = 500:1) để mở rộng phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1.

Vũ Ngân Bình, Lê Đình Hải, Vũ Thị Phƣơng Huế, Nguyễn Đình Tạo, Phạm Thị Thanh Hà (2020), "Nghiên Cứu Một Số Yếu Tố Ảnh Hƣởng Đến Sự Lƣu Giữ Và Hình Dáng Pic Khi Phân Tích Acid Amin Bằng Sắc Ký Lỏng Tƣơng Tác Thân Nƣớc", Nghiên Cứu Dược & Thông Tin Thuốc 2019, 10(4+5+6), tr. 27-33.

Bộ Y Tế (2018), Dược Thư Quốc Gia Việt Nam, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội, tr. 1217-1219.

Bộ Y Tế (2017), Dược Điển Việt Nam V, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội, tr. 812-814.

Bộ Y Tế / Cục Quản Lý Dƣợc (2017), "Tờ thông tin sản phẩm chế phẩm viên nang mềm Cystincap".

Nguyễn Văn Rƣ, Nguyễn Xuân Thắng (2015), Hóa Sinh Học, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội, tr. 41.

Tiếng Anh 6.

Amaro C. O., Flores C., Dias M. G., Lidon F. C. (2014), "Pyridoxine Analysis By High Performance Liquid Chromatography And Validation In Fortified Milk Powder", Acta Alimentaria, 43(10), pp. 297-305.

Anson M. L., Edsall J. T. (1945), Advances In Protein Chemistry, Academic Press Inc., New York., pp. 18.

Bartzatt R., Gajmer P., Nguyen M. H. C., Tran A. M. H. (2016), "Detection and Assay of Vitamin B6 (Pyridoxine Hydrochloride) Utilizing Isocratic High Performance Liquid Chromatography", Journal Of Scientific Research & Reports, 12(3), pp. 1-12.

Buszewski

B.,

Noga

(2012),

"Hydrophilic

Interaction

Liquid

Chromatography (HILIC) - A Powerful Separation Technique", Anal Bioanal Chem, 402, pp. 231-247. 10.

Dinh N. P., Jonsson T., Irgum K. (2011), "Probing The Interaction Mode In Hydrophilic Interaction Chromatography", Journal of Chromatography A, 1218, pp. 5880-5891. 44

11.

Greco G., Letzel T. (2013), "Main Interactions And Influences Of The Chromatographic

Parameters

HILIC

Separations",

Journal

Chromatographic Science, 51, pp. 684-693. 12.

Hochberg M., Melnick D., Oser B. L. (1944), "On The Stability Of Pyridoxine", The Journal of Biological Chemistry, 155, pp. 129-136.

13.

Inglis A. S., McMahon D. T. W., Roxburgh C. M., Takayanagi H. (1976), "Single Analysis for Cysteine, Cystine, and Tryptophan in Proteins", Analytical Biochemistry, 72, pp. 86-94.

14.

Kumar P., Rubies A., Companyรณ R., Centrich F. (2012), "Hydrophilic Interaction Chromatography For The Analysis Of Aminoglycosides", Journal Of Separation Science, 35, pp. 498-504.

15.

Li R., Zhang Y., Lee C. C, Lu R., Huang Y. (2010), "Development And Validation Of A Hydrophilic Interaction Liquid Chromatographic Method For Determination Of Aromatic Amines In Environmental Water", Journal of Chromatography A, 1217, pp. 1799-1805.

16.

Molnรกr-Perl I., Morvai M. (1992), "Cystine and Cysteine Analysis as the Same Phenylthiocarbamyl

Derivatives

HPLC

Protein

Hydrolyzates",

Chromatographia, 34, pp. 132-136. 17.

National Center for Biotechnology Information / PubChem (2004), "L-Cystine, CID:

67678",

Retrieved

June

20th,

2020,

from

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/67678. 18.

Rutherfurd S. M., Gilani G. S. (2009), "Amino Acid Analysis", Current Protocols In Science, 58, pp. 11.9.1-11.9.37.

19.

SeQuant A. (2008), Practical Guide to HILIC: A Tutorial and Application Book, Merck SeQuant AB, Umeรฅ, Sweden, pp. 1-29.

20.

Shaw K. N. F., Lieberman E., Koch R., Donnell G. N. (1967), "Cystathioninuria", The American Journal of Disease of Children, 113, pp. 119128.

21.

Shinohara K., Kilpatrick M. (1934), "The Stability Of Cystine In Acid Solution", The Journal of Biological Chemistry, 105, pp. 241-251.

22.

Sigma-Aldrich (2020), "C8755, Product Information Sheet".

23.

Thannhauser T. W., Sherwood R. W., Scheraga H. A. (1998), "Determination of the Cysteine and Cystine Content of Proteins by Amino Acid Analysis: Application

the

Characterization

Disulfide-Coupled

Folding

Intermediates", Journal of Protein Chemistry, 17, pp. 37-43. 24.

United States Pharmacopeial Convention (2017), USP 40 - NF 35, United States Pharmacopeial, USA, pp. 74.

25.

United States Pharmacopeial Convention (2012), USP 35 - NF 30, United States Pharmacopeial, USA, pp. 1264-1265.

PHỤ LỤC Danh mục các phụ lục Phụ lục 1: Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống ........................................................PL-1 Phụ lục 2: Sắc kí đồ độ chọn lọc ........................................................................PL-6 Phụ lục 3: Chồng phổ độ tinh khiết của cystin và vitamin B6 .......................PL-10

PL-1

Phụ lục 1: Sắc kí đồ thẩm định độ phù hợp hệ thống Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống ở bƣớc sóng 250 nm

Lần 1

Lần 2

Lần 3

PL-2

Lần 4

Lần 5

Lần 6

PL-3

Sắc kí đồ độ phù hợp hệ thống ở bƣớc sóng 286 nm

Lần 1

Lần 2

Lần 3

PL-4

Lần 4

Lần 5

Lần 6

PL-5

Phụ lục 2: Sắc kí đồ thẩm định độ chọn lọc Sắc kí đồ độ chọn lọc ở bƣớc sóng 250 nm

Mẫu trắng

Chuẩn cystein

Chuẩn đơn cystin

PL-6

Chuẩn hỗn hợp cystin và vitamin B6

Mẫu thử

Mẫu thử thêm chuẩn cystin

PL-7

Sắc kí đồ độ chọn lọc ở bƣớc sóng 286 nm

Mẫu trắng

Chuẩn đơn vitamin B6

Chuẩn hỗn hợp cystin + vitamin B6

PL-8

Mẫu thử

Mẫu thử thêm chuẩn vitamin B6

PL-9

Phụ lục 3: Chồng phổ độ tinh khiết của cystin và vitamin B6 với pic trong sắc kí đồ chuẩn

Chồng phổ cystin

Chồng phổ vitamin B6

PL-10