Issuu

SẮC KÝ LỌC GEL GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TRẦN THANH TUẤN

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

GIỚI THIỆU:

Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phân tử. Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết hóa học nên thành phần của dung môi giải li (buffer) không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li (resolution). Sắc kí gel phù hợp với những phân tử sinh học nhạy cảm với pH, nồng độ ion kim loại, môi trường khắc nghiệt.

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Hình I.1 Sắc ký gel

1. Hạt gel hình cầu. 2. Mẫu được đưa vào cột. 3. Pha động kéo mẫu di chuyển qua cột. Phân tử sẽ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp, những phân tử nhỏ đi vào sâu trong lỗ xốp và bị giữ lại trong một lâu hơn.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

4. Pha động qua cột liên tục, các phân tử lớn không thể chui vào các lỗ xốp nên đi ra khỏi cột trước. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp nên ra khỏi cột sau. Quá trình phân tách bằng phương pháp sắc kí gel (gel filtration) Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm (packed bed). Đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu đặc tính bền vật lý, bền hóa học và trơ. Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua (buffer). Dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem như là pha tĩnh và chất lỏng bên ngoài được xem là pha động. II.

LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL: II.1. Đặc điểm của quá trình:

Kết quả của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đổ giải li hay phổ đồ sắc kí cho thấy sự khác nhau về nồng độ (liên quan đến mức độ hấp thụ tia UV ở vùng 280 nm) của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li khỏi cột dựa trên trật tự về kích thước phân tử. Trên giản đồ chia ra làm 3 loại phân tử. Những phân tử không vào mạng lưới đệm mà được giải li thẳng ra khỏi cột với cùng tốc độ của dòng lưu chất của pha động (buffer) ở thể tích Vo (xét trên một đơn vị thể tích cột), gọi là thể tích khoảng trống (void volume). Những phân tử có một phần đi vào mạng lưới đệm silicagel, rồi mới giải li ra khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ hơn sẽ ra trước. Và còn lại là những phân tử được giữ hoàn toàn trong mạng lưới lỗ xốp và đi ra khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột Vt(total column volume) của pha động đi qua cột. Hình II.1 Phổ đồ sắc ký

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của chúng, Ve (elution volume) được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc kí. Có 3 cách để xác định Ve: Khi thể tích của mẫu quá nhỏ so với thể tích lớp đệm thì Veđược xác định từ vị trí ban đầucủa mẫu đến vị trí caonhất củamũi sắc kí. Khi thể tích của mẫu lớn,không thể bỏ qua so với thể tíchlớp đệm thì Veđược xác định từ vị trí một nữa thể tíchmẫu đếnvị trí cao nhất của mũi sắc kí. Khi thể tích mẫu quá lớn, tạonên mũi sắc kí có vùng phẳngngang, thể tích Veđược xácđịnh từ vị trí bắt đầu của mẫuđến vị trí của điểm uốnở phầnđang tăng lên của mũi giải li.

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Hình II.2 Cách xác định thể tích giải li Ve

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Bởi vì mũi đối xứng phổ biến trong sắc kígel, do đó Ve dễ dàng xác định. Tuy nhiên Ve không hoàn toàn phản ánh cách thức di chuyển của các cấu tử khi qua cột bởi vì Ve sẽ thay đổi phụ thuộc vào Vt tổng thể tích của lớp đệm và cách nhồi cột. Sự giải li của mẫu được đặc trưng bởi hệ số phân bố Kd. Kd =

Kdđặc trưng cho phần pha tĩnh mà xảy ra sự khuếch tán của những loại phân tử khác nhau. Vo là thể tích khoảng trống, chính là thể tích của những phân tử trong pha độngkhông chui vào được mạng lưới lỗ xốp do kích thước lớn và di chuyển thẳng qua cột bằng thể tích của pha động (buffer). Cột được nhồi tốt thì thể tích Vo xấp xỉ 30% thể tích cột. Vs là thể tích pha tĩnh bằng Vi là thể tích pha động bên trong mạng lưới (chỉ chứa các phân tử kích thước nhỏ). Trong thực tế Vi rất khó xác định do phải xác định thể tích mạng lưới gel (thể tích vật liệu rắn hình thành mạng lưới), do đó để thuận tiện thì Vi được thaythế bằngVt - Vo. Hình II.3 Biểu đồ thể hiện V0 và Vt

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Do thay Vi bằng Vt - Vo, do đó ta có giá trị Kav, nó không thực sự đúng với giá trị hệ số phân bố Kd. Nhưng đối với mỗi loại gel riêng thì có tỉ lệ giữa Kav:Kd, và tỉ lệ này không phụ thuộc bản chất và nồng độ của mẫu. Kav =

II.2. Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp: Hệ số phân bố Kav liên quan đếnkích thước của phân tử. Tỉ trọng và kích thước giống nhau của các phân tử mô tả mối quan hệ giữa giá trị Kav và log Mr (khối lượng phân tử). Trên một vùng xem xét thì mối quan hệ này là đường thẳng. Chọn lựa phương pháp sắc kí gel chỉ phụ thuộc hoàn toàn vào sự phân bố kích thước lỗ xốp và được mô tả bởi đường cong chọn lọc. Bằng cách vẽ đường cong đi qua những điểm giá trị Kav ứng với log Mr của các protein chuẩn có thể xây dựng được đường cong chọn lọc. Hình II.4: Đường cong chọn lọc của superdex 30, Superdex 75, Superdex 200

Phương pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lượng phân tử lớn được giải li ở thể tích khoảng trống Vo (Kav = 0) với mũi giản rộng ít nhất và thời gian là tối thiểu. Những hợp chất có khối lượng phân tử nhỏ nhất được giải li gần giá trị Vt (Kav= 1) + Nếu Kav > 1, có thể phân tử bị mắc kẹt trong mạng lưới gel do kích thước quá nhỏ (Ve > Vt). 5

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

SĆ°u táş§m báť&#x;i GV. Nguyáť…n Thanh TĂş # Google.com/+DáşĄyKĂ¨mQuyNhĆĄn SáşŽC KĂ? LáťŒC GEL

+ Náşżu Kav < 0, cĂł tháťƒ trong cáť™t Ä‘ĂŁ xuáşĽt hiáť‡n nháťŻng kĂŞnh, rĂŁnh mĂ cĂĄc phĂ˘n táť cĂł tháťƒ cháşŁy táşŻt qua cáť™t (Ve < Vo). II.3. Ä?áť™ giáşŁi li: Ä?áť™ giáşŁi li cho biáşżt Ä‘áť™ phĂ˘n tĂĄch giáťŻa cĂĄc mĹŠi, cháť‹uáşŁnh hĆ°áť&#x;ng báť&#x;i nhiáť u yáşżu táť‘nhĆ°táť‰ láť‡ giáťŻa tháťƒ tĂch máşŤu vĂ tháťƒ tĂch cáť™t, táť‘c Ä‘áť™ dĂ˛ng, thĂ´ng sáť‘ cáť™t, kĂch thĆ°áť›c háşĄt, sáťą phĂ˘n báť‘kĂch thĆ°áť›c háşĄt, táť‰ tráť?ng láť›p Ä‘áť‡m, Ä‘áť™ xáť‘p cáť§a háşĄt, Ä‘áť™ nháť› t cáť§a pha Ä‘áť™ng. Hiáť‡u quáşŁ cáť§a quĂĄ trĂŹnh sáşŻc kĂ gel pháťĽ thuáť™c vĂ o cháť§ yáşżu vĂ o cĂĄc Ä‘iáť u kiáť‡n láťąa cháť?n sao cho Ä‘áť™ cháť?n láť?c háťŁp lĂ vĂ trĂĄnh nháťŻng mĹŠi giáşŁn ráť™ng trong quĂĄ trĂŹnh phĂ˘n tĂĄch. Ä?áť™ giáşŁi li Ä‘Ć°áťŁc xĂĄc Ä‘áť‹nh báşąng biáťƒu tháťŠc: Rs =

( )

+ Vr1 vĂ Vr2 lĂ tháťƒ tĂch giáşŁi li cáť§a 2 mĹŠi gáş§n nhau. + W1 vĂ W2 lĂ Ä‘áť™ ráť™ng tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i cáť§a mĹŠi. HĂŹnh II.5: ThĂ´ng sáť‘ Ä‘Ć°áťŁc sáť dáťĽng Ä‘áťƒ xĂĄc Ä‘áť‹nh Ä‘áť™ giáşŁi li

Ä?áť™ giáşŁi li lĂ hĂ m cáť§a Ä‘áť™ cháť?n láť?c cáť§a phĆ°ĆĄng phĂĄp vĂ hiáť‡u quáşŁ cáť§a phĆ°ĆĄng phĂĄptáşĄo ra nháťŻng mĹŠi háşšp. HĂŹnh II.6: Sáťą pháťĽ thuáť™c cáť§a Ä‘áť™ giáşŁi li vĂ o Ä‘áť™ cháť?n láť?c vĂ Ä‘áť™ ráť™ng cáť§a mĹŠi

NĆĄi báť“i dĆ°áťĄng kiáşżn tháťŠc ToĂĄn - LĂ˝ - HĂła cho háť?c sinh cáşĽp 2+3 / Diáť…n Ä?Ă n ToĂĄn - LĂ˝ - HĂła 1000B Tráş§n HĆ°ng Ä?áşĄo Tp.Quy NhĆĄn Táť‰nh BĂŹnh Ä?áť‹nh

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Hiệu quả của cột nhồi phụ thuộc vào việc tạo ra mũi hẹp đối xứng trong quá trìnhgiải li và được xác định dựatrên số đĩa lý thuyết trên đơn vị chiều dài (N): N = 5.54(Ve/W1/2)2 x 1000/L Trong đó: + Ve: thể tích mũi giải li. + W1/2: chiều rộng mũi tại một nửa chiều cao mũi. + L: chiều cao đệm. Hiệu quả có thể được cải thiện bằng cách giảm kích thước hạt, tuy nhiên kíchthước hạt nhỏ tạo trở lực lớn và tốc độ dòng giảm, dẫn đến thời gian tiến hành kéo dài. Độ đồng đều của lớp đệm và hạt nhồi sẽ ảnh hưởng đến độ đồng đều của dòngchảy qua cột và do đó sẽ ảnhhưởng đến hình dạng và độ rộng của mũi. Thiết bị sắc kí gel với độ đồng đều cao luôn cho mũi giải li hẹp. Loại sắc kí gel với kích thước hạt nhỏ tạo điều kiện cho các phân tử dễ dàng khuếch tán vào và ra khỏi hạt, giúp giảm thời gian đạt cân bằng giữa pha động và pha tĩnh, vì vậy cải thiện được độ giải li do giảm chiều rộng mũi. Sự pha loãng mẫu là không thể tránh khỏi bởi vì khi mẫu đi qua cột thì quá trình khuếch tán xảy ra. Để giảm tối thiểu việc pha loãng mẫu thì sử dụng thể tích mẫu tối đa trong giới hạn khoảng cách có thể phân tách. Nếu không có vùng giản rộng thì thể tích tối đa của mẫu có thể lớn bằng thể tích phân tách: VSep = VeB - VeA Tuy nhiên, do dòng khuếch tán xoáy, sự không cân bằng giữa pha tĩnh và phađộng, khuếch tán dọc theo lớp đệm, nên luôn có vùng giản rộng. Vì vậy thể tích mẫu luôn nhỏ hơn thể tích phân tách.

III.

PHÂN LOẠI GEL

Việc tách trong sắc ký gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian ba chiều.hạt gel phải có kích cỡ giống nhau, có tính trơ về mặt hóa học, bền về mặt cơ học, các lỗ rỗng tong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất. Mỗi loại gel có khả năng xác định trong việc tách 1 loại trọng lượng phân tử , tùy thuộc vào kích thước của lỗ rỗng trong hạt gel.các loại gel thương mại thường không chịu được tính acid hay base quá mạnh , lỗ rỗng không quá lớn vì sẽ làm giảm độ bền cơ học.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Có hai loại nguyên liệu chính để tạo gel la xerogel và acrogel. Xerogel là loại gel cổ điển , là một polimer được tạo mạng ngang ,khi cho tiếp xúc với dung môi , gel sẽ trương nở để trở thành mạng gel với các lỗ rỗng tương đối mềm.Trong hệ gel này các lỗ rỗng là khoảng trống giữa những chuỗi dây trong hệ thống mạng. Nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng ,cấu trúc gel bị xụp đỗ ,nếu cho dung môi trở lại ,đôi khi có thể khôi phục lại hệ mạng đó. Ngược lại aerogel là nguyên liệu rắn chắc và không phải là gel , thí dụ như thủy tinh có lỗ rỗng hoặc silica có lỗ rỗng. Đó là nguyên liệu rắn có lỗ rỗng , dung môi có thể chui vào các lỗ rỗng này ,nếu dung môi được loại khỏi hệ thống mạng , cấu trúc gel không bị sụp đỗ. Khi lựa chọn loại gel thích hợp cần xem xét hai yếu tố: + Mục tiêu của thí nghiệm (phân tích độ phân giải cao hay tách thành từng nhóm hợp chất) + Khối lượng phân tử của protein mục tiêu và chất bẩn Trên thị trường có 5 nhóm thông dụng là Superdex,Sephacryl, Superose và Sphadex và Sphadex LH-20 III.1 Superdex. Superdex là lựa chọn cho độ giải li cao,thời gian ngắn và độ thu hồi cao Từ phòng thí nghiệm đến qui mô công nghiệp ,Superdex là loại gel được lựa chọn đầu tiên cho độ giải li cao với thời gian ngắn và độ thu hồi tốt. Superdex là 1 loại composite dựa trên liên kết ngang giữa các hạt rỗng agarose đến mạng dextran bằng liên kết cộng hóa trị. Nó có độ bền và hóa học cao bởi mạng agarose liên kết ngang và có tính chất lọc gel tốt cho chuỗi dextran. Độ bền cơ học của Superdex cho phép những dung môi giải li có độ nhớt cao như urea 8M vẫn chảy qua được. Loại gel này có thể chịu đựng tốc độ dòng cao trong suốt quá trình ổn định hay lúc rửa cột. Tính bền giúp loại Superdex phù hợp cho sử dụng công nghiệp với tốc độ dòng cao, nhanh và hiệu quả làm sạch tai chỗ. Những tương tác giữa protein và gel Superdex được bỏ qua khi sử dụng dung môi với cường độ ion trong khoảng 0.15 M đến 1.5 M. Superdex được sản xuất vớt hai loại kích thước hạt với 4 độ chọn lọc khác nhau (Superdex Peptide , superdex 30, Superdex 75, Superdex 200). Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt kích thước 13 của Superdex Peptide,Superdex 30, Superdex 200 cho phân tích độ phân giải cao với thể tích mẫu nhỏ. 8

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Sử dụng cột nhồi sẵn hạt kích thước 34 của Superdex perep grade cho qui mô công nghiệp. Khi không biết khối lượng của protein quan tâm thì nên bắt đầu với Superdex 200. Superdex 200 hay Superdex 200 prep grade đặc biệt thích hợp cho việc phân tách kháng thể đơn dòng từ ddimerr và từ chất bẩn có khối lượng phân tử thấp.

III.2. Sephacryl Sephacryl là lựa chọn cho phân tách nhanh, độ thu hồi cao tại phòng thí nghiệm và qui mô công nghiệp. SephacrylSuperdex High Resolution (HR) thay thế cho superdex prep grade trong những ướng dụng đòi hỏi khoảng tuông đối rộng ,độ bền hóa học và chịu được tốc độ dòng cao là cho Sephacryl phù hợp cho sử dụng trong công nghiệp. Sephacryl HR là 1 loại composite được hình thành bởi liên kết ngang cộng hóa trị allyl dextran với N,N’-methylene bisacrylamide tạo nên mạng ưa nước có độ bền cơ học cao. Lỗ xốp của gel được xác định bởi thành phần dextran được điều khiển để đem lại 5 độ chọn lọc khác nhau. Độ bền cơ học của Sephacryl HR cho phép những dung môi có độ nhớt cao chảy qua. Sepacryl S-100 Hrcho hiệu suất 96% cho việc tách những chất: Blue Dextran 2000, ferritin, catalase, aldolase, BSA, ovalbumin, lactoglobulin A+B, chymotrypsinogen A, myoglobin, lysozyme, ribonuclease A và cytochrome C , cường độ tối thiểu ion nên sử dụng là 0,15 M. III.3.Superose Superose có thể dùng trong khoảng khối lượng phân tử rộng nhưng không phù hợp cho phân tách qui mô công nghiệp Superose là loại gel bền vật lí và hóa học cao, hình thành dựa trên liên kết ngang cùng phân tử lỗ xốp agarose. Một vài tương tác kị nước với gel làm cho những phân tử kị nước nhỏ, aromatic peptides, membrane proteins và lipoproteins có thể được giải li chậm hơn dự đoán. Tuy nhiên, trong 1 vài ứng dụng , những tương tác này có thể giúp làm tăng độ giải li của quá trình phân tách. III.4.Sephadex Sephadex được dùng để tách nhanh những nhóm có khối lượng phân tử nhỏ , khử muối, đổi dạng dung môi và làm sạch mẫu. Sephadex được tạo thành bởi liên kết ngang giữa dextran với epichlorohydrin. 9

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Những loại khác nhau của Sephadex là do mức độ khác nhau của liên kết ngang và vì vậy nó có những mức độ trương nở và độ chọn lọc khác nhau cho những kích thước phân tử đăc trưng. III.5.Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 được sản xuất dành riêng cho việc phân tách và tinh chế các hợp chất tự nhiên mà đòi hỏi sự có mặt của dung môi hữu cơ để duy trì độ bền cả chúng. Các hợp chất tự nhiên này là steroids, lipids và peptides có khối lượng phân tư thấp ( khoảng 35 amino acids). Các hợp chất thường được phân tách bằng sắc kí phân chia lỏng/lỏng hay sắc kí hấp thu. Sephadex LH-20có độ chọn lọc rất cao cho hợp chất có vòng thơm (aromatic). Nó được sư dụng trong phân tích và trong qui mô công nghiệp để phân tách những nhóm chất có tính chất tương tự nhau. Sephadex LH-20 được tạo nên từ những chuỗi hydroxypropylated dextran mà có liên kết ngang đến mạng lưới polysacharide. Loại này costheer trương nở trong nước và trong dung môi hữu cơ. Sephadex LH-20 phù hợp cho giai đoạn tinh chế ban đầu trước khi tinh chế với độ tinh khiết cao bằng sắc kí tao đổi ion hay sắc kí pha đảo hay nó có thể dùng cho giai đoạn tinh chế với độ tinh khiết cao đối với các đồng phân không đối quang (diastereoisomers). Sephadex LH-20có thể tách những cấu tử bằng sự phân chia giữa mạng gel và dung môi hữu cơ. Gel Sephadex LH-20 có cả tính ưu nước và kị nước.

IV. ỨNG DỤNG Ứng dụng của phương pháp sắc kí gel • Tách loại bỏ những nhóm phân tử (Group separation) Loại bỏ những phân tử nhỏ như muối, protein đánh dấu ra khỏi nhóm các phân tử lớn. Thường được sử dụng để tinh chế protein kết hợp khử muối và đổi dung môi. Sephadex G-10, G-25, G-50 được sử dụng cho nhóm này. • Phân tách với độ giải li cao (High resolution fractionation) Phân tách nhiều cấu tử trong một mẫu dựa trên sự khác nhau về kích thước. Mục đích là phân lập một hoặc nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử hoặc phân tích sự phân bố khối lượng của mẫu.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Phù hợp cho bước tách cuối cùng của việc tinh chế. Monomer có thể được tách khỏi tủa và mẫu có thể thay đổi dung môi phù hợp cho thử nghiệm hay dữ trữ.

IV.1. Khử muối – đổi dung môi – làm tang nồng độ protein Sự thẩm tách (Dialysis) là kỹ thuật thường được sử dụng trong việc loại bỏ muối hay những phân tử nhỏ và thay đổi dung môi. Tuy sự thẩm tách xảy ra chậm, đòi hỏi lượng dung môi lớn và có nhiều khả năng làm mất mẫu trong quá trình tiến hành, hay sự đứt gãy do protein bị phân giải hay là những liên kết khó kiểm soát ở mẫu và màng thẩm tách. Một kỹ thuật đơn giản hơn và nhanh hơn sử dụng cột sắc kí gel để phân tách dựa trên sự khác biệt về khối lượng phân tử để loại bỏ muối và những phân tử nhỏ. Cột được nhồi với SephadexTM G-25. Chỉ trong một bước, mẫu sẽ được loại bỏ muối, nhưng phân tử nhỏ và đổi dung môi mới. Thể tích mẫu cần loại muối lên tới 30% tổng thể tích cột. Tốc độ và năng suất cao của phương pháp cho phép những thể tích mẫu lớn vẫn được tiến hành nhanh và hiệu quả. Để loại muối cho lượng mẫu lớn có thể sử dụng nhiều cột được bán sẵn như HiTrap Desalting hay HiPrep 26/10 Desalting. Ví dụ: + 2 cột HiTrap Desalting thì thể tích mẫu có thể sử dụng là 3 ml hay 5 cột thì thể tích mẫu lên tới 7,5 ml. + 4 cột HiPrep 26/10 Desalting thì thể tích mẫu có thể sử dụng là 60 ml và thời gian tiến hành là 20 – 30 phút. Quá trình khử muối và đổi dung môi thường tốn khoảng 5 phút trên mẫu với hơn 95% mẫu được thu hồi (đối với hầu hết các protein). Nên sử dụng nồng độ muối tối thiểu 25 mM NaCl trong dung môi để chống lại sự tương tác ion. Nồng độ mẫu không ảnh hưởng quá trình phân tách miễn là nồng độ protein không vượt quá 70 mg/ml khi sử dụng dung môi có nước thông thường. Mẫu nên được hòa tan hoàn toàn, ly tâm hoặc lọc bỏ những phần rắn còn sót. Ví dụ quá trình khử muối:

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Quá trình khử muối protein nóng chảy (His)6 + Mẫu được khử muối trên cột HiTrap Desalting 5 ml với chương trình AKTA prime cài đặt sẵn. + Dung môi giải li là sodium photsophate 20 mM, sodium chloride 0,15 M, pH 7,0. + Tính hiệu đầu ra của protein được xác định bằng tia UV (280 nm) và tín hiệu đầu ra của mỗi chỗi được xác định bằng độ dãn điện. Quá trình khử muối ghép nhiều cột để tăng thể tích mẫu + Mẫu là 20 mg/ml BSA trong 50 mM sodium photsphate, 0,5 M sodium phloride, pH 7,0. + Sử dụng cột khử muối HiTrap Desalting (5 ml), lần lượt sử dụng 1,3,5 cột để tăng thể tích mẫu. + Dung mối giải li sodium photsphate 50 mM, sodium chloride 0,5 M, pH 7,0. + Tốc độ dòng là 5 ml/phút. + Tín hiệu đầu ra của protein được xác định bằng tia UV (280 nm) và tín hiệu và tín hiệu đầu ra của muối được xác định bằng độ dẫn điện. Hình IV.3. Quá trình scale up ghép nối tiếp nhiều cột cho ứng dụng khử muối. IV.2. Sắc kí gel trong chiến lược tinh chế. Để tinh chế ở mức độ cao hay khi không tìm được phối tử phù hợp cho phương pháp tinh chế một giai đoạn bằng cột ái lực, một phương pháp nhiều giai đoạn hiệu quả được phát triển để sử dụng cho quá trình tinh chế. Nó bao gồm sự bắt giữ (Capture), tinh chế trung gian (Intermediate Purication) và tinh chế ở mức độ cao (Polishing), phương pháp này gọi tắc là CIPP. CIPP được sử dụng cho công nghệ dược và nghiên cứu trong phòng thí nghiệm để đảm bảo phát triển một phương pháp nhanh, hiệu quả và chất lượng cao. Bắt giữ (Capture): mục tiêu chính là cô lập làm tăng nồng độ và làm bền sản phẩm cần tinh chế. Tinh chế trung gian (Intermediate): loại bỏ những chất bẩn lớn như các protein, acids nucleic, endotoxins và viruses.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Tinh chế ở mức độ cao (Polishing): Ở giai đoạn này các vết bẩn hầu như đã được loại bỏ, chỉ còn lại những chất lỏng dạng vết hay có tính chất gần giống với chất chính. Mục tiêu giai đoạn này là thu được chất lỏng hoàn toàn tinh khiết bằng cách loại bỏ hoàn toàn các vết bẩn còn lại. Trong đây sắc kí gel có thể sử dụng trong việc khử muối và đổi dung môi trong quá trình chuẩn bị mẫu đã trình bày ở trên và nó được sử dụng cho giai đoạn tinh chế ở mức độ cao. • Lựa chọn và kết hợp các kỹ thuật tinh chế. Năng suất (Capaciti): liên quan đến lượng mẫu có thể được sử lí khi tinh chế. Trong một số trường hợp lượng mẫu được giới hạn bởi tính thể tichs nhưng trong phương pháp sắc kí gel hay khi lượng chất bẩn nhiều hơn lượng mẫu. Tốc độ (Speed): hầu như quan trọng ở thời điểm bắt đầu tinh chế, ở đó chất bẩn như proteases phải được loại bỏ nhanh nhất có thể. Thu hồi (Recovery): khả năng thu hồi bị ảnh hưởng đến những điều kiện hoạt động trong thiết bị có thể làm phá vỡ cấu trúc của mẫu. Là yêu cầu quan trọng, làm tăng giá trị sản phẩm được tinh chế. Độ giải li (Resolution): đạt được nhờ vào việc lựa chọn kĩ thuật và hiệu quả của quá trình sắc kí. Độ giải li thường khó đạt được yêu cầu ở bước cuối vì khi đó tính chất của mẫu và tạp chất gần như giống nhau. Lựa chọn phương pháp đáp ứng mục tiêu cho các giai đoạn tinh chế. Chọn lựa kết hợp các phương pháp với nhau dựa trên ưu điểm của phương pháp và điều kiện của mẫu ở thời điểm ban đầu và khi kết thúc. Lượng mẫu tối thiểu xử lí phải ở giữa các bước tinh chế để tránh những yêu cầu về điều kiện của mẫu không phù hợp giữa 2 bước xử lí. Sản phẩm giải li ở cột đầu tiên phải ở trong điều kiện phù hợp cho việc xử lí ở cột tiếp theo. Ammonium sulfate thường được sử dụng cho việc làm trong và tăng nồng độ mẫu để mẫu ở môi trường nồng độ muối cao. Do đó nên chọn HIC trong giai đoạn bắt giữ vì HIC đòi hỏi lượng muối cao để tăng liên kết với đệm, nồng độ muối và tổng thể tích mẫu sẽ được giảm đáng kể sau khi giải li ra khỏi HIC pha loãng những phân đoạn của mẫu hay đổi dung môi thì dùng những cột sắc kí gel (khử muối) trước khi cho vào cột IEX và AC.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

Sắc kí gel không có liên kết giữa chất và mạng lướ gel, do đó không bị ảng hưởng bởi điều kiện dung môi, nhưng bị hạn chế bởi thể tích mẫu. Sắc kí gel phù hợp cho viếc sử dụng sau bất cứ kĩ thuật làm tăng nồng độ như IEX, HIC, AC bởi vì protein mục tiêu được giải li với thể tích giảm đi và thành phần từ dung môi không ảnh hưởng quá trình lọc gel. Ở bước bắc giữ, nên lựa chọn kỹ thuật có liên kết hiệu quả với protein mục tiêu và liên ket ít nhất có thể với chất bẩn. Một mẫu được tinh chế cần kết nối các kĩ thuật và có nhiều phương án lựa chọn. Ví dụ trong chiến lược IEX-HIC-GF , giai đoạn bắt giữ có thể lựa chọn theo sự khác nhau về điện tích (IEX), giai đoạn tinh chế trung gian có thể dựa trên sự khác nhau về tính kị nước (HIC), và giai đoạn tinh chế cuối cùng dựa trên sưh khác nhau về kích thước (GF).

• Sắc kí gel cho giai đoạn tinh chế tinh khiết cuối cùng Hầu hết sự phân tách dựa trên điện tích, tính kị nước, hay ái lực hóa học được sử dụng cho những giai đoạn trước bước cuối cùng trong chiến lược CIPP để phương pháp sắc kí gel độ phân giải cao sử dụng cho bước tinh chế cuối. Sản phẩm có thể được tinh chế và dổi dung môi rong một bước và dimer và các kết tủa được loại bỏ. Sắc kí gel là kĩ thuật sắc kí chậm và kích thước cột sẽ xác định thể tích mẫu. Việc sử dụng sắc kí gel sau những kĩ thuật khác một phần là để giảm thể tích mẫu để coa thể sử dụng cột kích thước nhỏ hơn. Loại gel cho bước này thường dung là Superdex. • Tinh chế kháng thể đơn dòng humainised IgG4 theo kỹ thuật CIPP. Humainesed IgG4 được lấy từ nuôi cấy tế bào u tủy và tinh chế bằng sự kết hợp sắc kí ái lực và lọc gel. Kháng thể được bắt giữ bởi sắc kí ái lực sử dụng MabSelectTM.Sắc kí gel trên cột Superdex 200 prep grade được sử dụng để tách các monomer từ diner và các polymer lớn. Trên phổ đồ sắc kí ta thấy sau khi tách mẫu bang sắc kí ái lực (đường số 3) ta nhận thấy vết của IgG4 rõ rang, hoàn toàn tách khỏi các vết của mẫu ban đầu, nhưng sự khác biệt giữa mẫu sau khi ra khỏi cột sắc kí gel (đã tách monomer ra khỏi dimer) và mẫu ở đường số 3 là không rõ rang trên SDS-PAGE. Nhưng khi giảm thể tích mẫu, thì ở vết H-chain ở đường số 2 và đường số 3 ta nhận thấy vết ở đường số 2 ( giải li ra khoie cột 14

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

sắc kí ái lực) vẫn còn đuôi dơ ở phía sau kéo theo còn ở đường số 3 trở đi (giải li ra khỏi cột sắc kí gel) thì hầu như không thấy. Điều đó cũng cho thấy khả năng tinh chế ở bước cuối cùng của cột sắc kí gel. IV.3. Xác định khối lượng phân tử và phân tích sự phân bố khối lượng phân tử. Không giống như kỹ thuật điện di, sắc kí gel cung cấp phương ơphaps để xác định khối lượng phân tử hay kích thước của protein tự nhiên hay protein biến tính dưới những điều kiện khác nhau về PH,nhiệt độ, ái lực các ion. Để xác định khối lượng phân tử, một vài mô hình lí thuyết được đưa ra để mô tả trạng thái của chất tan trong quá trình sắc kí gel. Hầu hết mô hình đều sử dụng sự phân bố của phân tử chất tan của hạt gel và chất lỏng xung quanh hoàn toàn là hiệu ứng không gian. Tuy nhiên trong thực tế những hợp chất tương đòng mô tả mối quan hệ hình chữ S giữa thể tích li giải khác nhau của chúng và logarit khối lượng phân tử của chúng. Do đó việc xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp sắc kí gel có thể thực hiện bằng cách so sánh thông số thể tích giải li (Vc) hay Kav của chất quan tâm với giá trị thu được từ chất chuẩn đã biết trước. Đường cong chuẩn được xây dựng bằng cách đo thế tích giải li của một vài chất chuẩn, tính giá trị Kav tương ứng và vẽ giá trị Kav tương ứng với logarit khối lương phân tử của chúng. Khối lượng phân tử của một chất chưa biết có thể xác định từ đường cong chuẩn khi đo giá trị Vc và tính giá trị Kav của chúng. Thông số giải li khác như V0, Vc/Vo, Kd cũng có thể được sử dụng để xây dựng đường cong chuẩn nhưng giá trị Kav thường được sử dụng vì nó ít bị ảnh hưởng bởi sai số do sự khác nhau về thông số và sự chuẩn bị cột; ngoài ra không đòi hỏi xác định chính xác giá trị Vi như đối với Kd. Để xác định khối lượng phân tử được chính xác thì chất chuẩn phải có cùng mối quan hệ giữa khối lượng phân tử và kích thước phân tử như chất cần xác định. Bộ chuẩn của Amersham Biosciences có những chất chuẩn protein dạng cầu tốt để xác định khối lượng phân tử protein. Độ chuẩn cho sắc kí gel đối với chất khối lượng phân tử nhỏ chứa 4 protein riêng biệt được làm khô lạnh với khối lượng phân tử trong khoảng 13700-67000 và Blue Dextran 2000 (Để xác định thể tích V0). Bộ chuẩn cho lọc gel đối với mối quan hệ giữa khối lượng phân tử và kích thước phân tử như chất cần xác định. Bộ chuẩn cho lọc gel đối với chất có khối lượng phân tử lớn chứa 4 protein riêng biệt được làm khô lạnh với khối lượng phân tử trong khoảng 158000 – 669000 và Blue Dextran 2000 (để xác định thể tích V0). Nhiều thông số quan trọng ảnh hưởng đến quá trình xác định khối lượng phân tử.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

+ Sử dụng phương pháp đối với vùng khối lượng phân tử phù hợp với phân tử quan tâm. Giá trị khối lượng phân tử mong muốn nên rơi vào phần đường thẳng của đường con chọn lọc. + Nên sử dụng cột đã được nhồi sẵn, nếu tự nhồi tsy phải rất cẩn thận. + Sử dụng chất chuẩn mới nhất, chọn lựa để cho khối lượng phân tử mong muốn đảm bảo nằm trong vùng chuẩn. Luôn bọc Blue Dextran trước khi sử dụng, sử dụng lượng mẫu 2% nhỏ hơn thể tích cột. + Sử dụng một độ pah động cho quá trình sắc kí mẫu và chất chuẩn. Sử dụng tốc độ dòng được đề nghị đối với các cột được nhồi sẵn. + Nếu khối lượng phân tử chưa biết hãy sử dụng phương pháp với khối lượng phân tử ở khoảng rộng như là Sephacryl HR. + Thực hiện việc xác định khối lượng phân tử từ trong urea, guanidine hydrochloride hay SDS biến đổi polypeptides và protein để duỗi mạch protein tránh những cấu trúc xoắn ngẫu nhiên giúp giảm sự khác nhau về cấu trúc của các protein. + Sai lệch của tỉ số Kav/logM có thể xảy ra nếu phân tử quan tâm không có hình dạng giống chất chuẩn. + Cột chuẩn có thể được sử dụng trong thời gian dài miễn là cột được giữ trong điều kiện tốt không bị khô.

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

TÀI LIỆU THAM KHẢO

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

1. Nguyễn Quốc Khương Anh. Luận văn: “ Sắc ký gel và ứng dụng” 2. Nguyễn Chí Dũng. Luận văn: “ Sắc ký lọc gel”

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định

www.daykemquynhon.ucoz.com Produced by Nguyen Thanh Tu

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn SẮC KÝ LỌC GEL

MỤC LỤC I. GIỚI THIỆU .............................................................................................................1 II. LÝ THUYẾT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÍ GEL .....................................................2 II.1. Đặc điểm của quá trình ................................................................................2 II.2. Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp .........................................5 II.3. Độ giải li ......................................................................................................5 III. PHÂN LOẠI GEL ....................................................................................................6 III.1. Superdex. .....................................................................................................7 III.2. Sephacyl .......................................................................................................8 III.3. Superose .......................................................................................................8 III.4. Sephadex ......................................................................................................8 III.5. Sephadex LH-20 ..........................................................................................9 IV. ỨNG DỤNG .............................................................................................................9 IV.1. Khử muối – đổi dung môi – làm tang nồng độ protein .............................10 IV.2. Sắc kí gel trong chiến lược tinh chế. .........................................................11 IV.3. Xác định khối lượng phân tử và phân tích sự phân bố khối lượng phân tử. .................................................15 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................16 MỤC LỤC ....................................................................................................................17

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định