Issuu

13-Nov-18

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chương 3. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

13-Nov-18

High High Pressure Price Liquid Liquid Chromatography Chromatography High Perfomance Liquid Chromatography

Chương CƠ 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode) a Russian-Italian botanist 1903, Tswett Михаи́л Семёнович Цвет F: flow rate (mL/min) time (min) - Sắc ký pha thuận có pha tĩnh phân cực hơn phaT:động

13-Nov-18

Chương CƠ 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode)

Pha tĩnh

Silic dioxyd (silica)..

Pha tĩnh

Silica trên nền mạch Cacbon.

cyano (-CH2 – (CH2)2 – CN); amino (-CH2 – (CH2)2 – NH2); diol (-CH2CH2 – CH(OH)CH2OH) R là các nhánh có các nhóm chức phân cực Độ phân cực tăng dần từ -cyano đến diol.

13-Nov-18

Thành phần

Dung môi chủ yếu (làm pha động )

Pha động

Dung môi phụ Thay đổi tR

Không phân cực Phân cực hoặc hơi phân cực. Các dung môi thường không hấp thu trong vùng UV

Chương CƠ 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 3.1. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode)

Cơ chế lưu giữ: sắc kí hấp phụ Cơ chế lưu giữ: Chất phân tích cạnh tranh với các phân tử của pha động được hấp phụ ở các tâm hoạt động của pha tĩnh. Lực liên kết giữa pha tĩnh và chất phân tích chủ yếu là lực tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, liên kết hidrogen.

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CƠ SỞ THUYẾT SẮC KÝ 3.1. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1.1. Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode) Sắc ký pha đảo có pha tĩnh kém phân cực hơn pha động. Áp dụng cho các chất ít phân cực (háo dầu). Chất tan càng kỵ nước càng bị giữ lại mạnh.

Pha tĩnh

Chế tạo từ silica, tác dụng với clorosilan tạo ra dẫn xuất siloxan như cột ở pha thuận nhưng điều khác biệt là R là các gốc HC no không phân cực, hoặc gốc phenyl

- CH2 – (CH2)16- CH3 : gốc octadecyl . Cột C18 (ODS) - CH2 – (CH2) 6- CH3 : gốc ocyl . Cột C8 - CH2 – (CH2) 2- CH3 : gốc butyl Cột C4 - CH2 – (CH2) 2- C6H5 : gốc phenyl propyl . Cột phenyl.

Chương CƠ 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.1. Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode)

Pha động

Dung môi hữu cơ, dung mội hữu cơ và nước, hoặc dung môi hưu cơ và đệm

Các dung môi hữu cơ thường sử dụng là Methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) hay THF (Tetrahydrofuran (CH2)4O ). Thành phân nước trong pha động tăng thì lực rửa giải giảm. Khi sử dụng dung dịch đệm, những thông số quan trọng: nồng độ đệm và pH ; Thành phần dung dịch đệm và dung môi hữu cơ

13-Nov-18

Chương Chương 3CƠ 3 SẮC SẮC KÝ KÝLÝ LỎNG LỎNG HIỆU HIỆU NĂNG NĂNG CAO CAO (HPLC) (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.1. Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode)

Cơ chế lưu giữ

Pha tĩnh không phân cực , Liên kết giữa pha tĩnh và chất tan là liên kết kị nước: phần ít phân cực của chất phân tích được gắn trên pha tĩnh Nếu phân tử chất tan có nhiều dây Cacbon, nhóm thơm. tính kỵ nước mạnh hơn, Chất tan sẽ bi lưu giữ mạnh trong cột Nếu mẫu có nhiểu nhóm cacboxyl, nhóm amino, nhóm hydroxyl tính kỵ nước yếu hơn. Chất tan sẽ ít bị lưu giữ và ra nhanh hơn.

Chương 3CƠ SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

a.Khái niệm

Dựa vào lực hút trái dấu của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên pha tĩnh. Chất trao đổi cation và chất trao đổi anion là polymer không tan trong nước mang các nhóm trao đổi ion được gọi là chất trao đổi ion (ion exchangers) hoặc nhựa trao đổi (ion exchange resins)

Tương tác giữa nhựa trao đổi ion và ion tích điện trái dấu

13-Nov-18

Chương 3CƠ SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

b. Pha tĩnh và pha động

Pha tĩnh - Nhựa trao đổi cation Loại acid mạnh

Loại acid yếu

Nhựa trao đổi anion Base mạnh

Base yếu

Chương 3CƠ SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.3. Sắc ký trao đổi ion Pha Tĩnh Nhựa trao đổi Cation

b. Pha tĩnh và pha động

• Mang nhóm acid sulfonic (R-SO3- H+) . phân ly hoàn toàn , không phụ thuộc pH AXIT - + + • MẠNH R- C6H5-SO3 H → R- C6H5-SO3 + H . AXIT YẾU

• mang nhóm R-COOH • chỉ hoạt động trong một khoảng pH>PKa để tồn tại dưới dạng anion mới có thể tham gia trao đổi ion .

• ở pH nào cationit mạnh cũng có thể tồn tại dưới KHÁC dạng anion, còn cationit yếu chỉ mang điện tích ở NHAU pH>pKa và lúc đó mới hoạt động được

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CƠ SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

b. Pha tĩnh và pha động

Nhựa trao đổi Anion có nhóm base amin liên kết với phân tử polymer Chất trao đổi base mạnh có nhóm amin bậc bốn [RN(CH3)3+ OH- ]. Dạng base yếu có nhóm amin bậc hai hoặc bậc ba

Chương CƠ 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

b. Pha tĩnh và pha động

R có thể là nền silica hay nền Polimer hữu cơ

Nhựa trao đổi cation trên nền silica

Nhựa trao đổi cation trên nền polymer

13-Nov-18

Chương CƠ 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 3.1.3. Sắc ký trao đổi ion

b. Pha tĩnh và pha động

Pha động là Dung dịch có ion rửa giải pha trong nước hoặc đệm Ion rửa giải là ion có thể đẩy các ion bị giữ trên pha tĩnh ra Dung dịch đệm giữ cho PH của dung dịch rửa giải có giá trị ổn định để cho chất phân tích tồn tại dạng ion và nếu là cột yếu thì cột hoạt động được (tồn tại nhóm chức mang điện tích)

Chương CƠ 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 1.7.3. Sắc ký trao đổi ion

c. Cơ chế lưu giữ

Bản chất lực tương tác : Lực tĩnh điện Đầu tiên các ion trong pha động tương tác với pha tĩnh bị giữ lại trên pha tĩnh.

Sau đó khi cho chất phân tích qua cột, các ion cần phân tích có lực tương tác tĩnh điện mạnh hơn sẽ đẩy các ion pha động ra khỏi pha tĩnh

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CƠ SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 1.7.4. Sắc ký trao đổi ion

c. Cơ chế lưu giữ

Sắc ký đồ phân tích nước bằng sắc ký trao đổi ion

Chương CƠ 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 1.7.4. Sắc ký ghép cặp ion (Reversed phase ion pairing)

a. Khái niệm

là một biến thể của sắc ký pha đảo

Điều khác biệt trong sắc ký ghép cặp ion phải tạo điều kiện để chất phân tích phải ở dạng ion hóa hoàn toàn (bằng cách điều chỉnh pH) Nếu chất phân tích là acid yếu HA thì HA phải phân ly hoàn toàn thành H+ và A-. Nếu chất phân tích là baz yếu B thì B phải tác dụng với H+ để tạo thành BH+. Thêm 1 chất đối ion Q+, hay Q-

A- + Q+  [A-,Q+ ] BH+ + Q-  [BH+, Q- ]

Đuôi kỵ nước

Cặp ion có tính kỵ nước cao bị pha tĩnh giữ lại giống như một phân tử không điện tích

13-Nov-18

b. Cơ chế lưu giữ. Cặp ion [ A-,Q+], [ BH+,Q- ] được hình thành trong pha động như một hợp chất trung hòa được lưu giữ theo cơ chế như sắc kí pha đảo.

Chương 3 SẮC KÝLÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CƠ SỞ THUYẾT SẮC KÝ 1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 3.1. 1.7.4. Sắc ký ghép cặp ion (Reversed phase ion pairing)

c. Pha tĩnh và pha động

Pha tĩnh giống như pha tĩnh trong pha đảo Pha động : Pha động cũng là những dung môi như trong sắc ký pha đảo .

CÁC THÔNG SỐ QUAN TRỌNG -Loại chất ghép cặp - Nồng độ chất ghép cặp -pH của pha động -Nồng độ dung môi hữu cơ trong pha động

13-Nov-18

Sắc ký loại kích thước (SEC) 1. 2.

Ph©n t¸ch çc cÊu tö dùa trªn kÝch thíc ph©n tö Bao gåm 2 lo¹i: – SEC trong dung dÞch kþ nưíc: S¾c ký thÊm gel (GPC) – SEC trong dung dÞch nưíc : S¾c ký läc gel (GFC) 3. Kh«ng cã tư¬ng t¸c s¾c ký gi÷a çc cÊu tö ph©n tÝch vµ pha tÜnh cña cét – Çc ph©n tö mÉu khuyÕch t¸n vµo çc lç xèp cña h¹t nhåi – Çc ph©n tö ®ưîc t¸ch lo¹i dùa vµo sù kh¸c biÖt kÝch thưíc cña chóng tư¬ng ®èi so víi kÝch thưíc çc lç xèp : çc ph©n tö lín h¬n lç xèp kh«ng khuyÕch t¸n ®îc vµo , cßn çc ph©n tö nhá h¬n khuyÕch t¸n ®ưîc – Çc ph©n tö lín sÏ röa gi¶i trưíc, çc ph©n tö cµng nhá, cµng röa gi¶i chËm h¬n 4. Pha ®éng ®ưîc lùa chän chñ yÕu dùa trªn kh¶ n¨ng hßa tan çc cÊu tö ph©n tÝch 5. §ưîc sö dông chñ yÕu trong ph©n tÝch polymer vµ çc protein 23

C¬ chÕ t¸ch trong s¾c ký lo¹i kÝch thưíc

13-Nov-18

S¾c ký HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) 1.

Pha nh rất phân cực : Silica , NH2, Diol.. (tương tự NP-LC), nhưng pha động vẫn sử dụng nước trong thành phần. Bởi vậy HILIC còn được gọi là: ‘sắc ký lỏng pha thường trong dung dịch nước (aqueous normal phase HPLC)’.

Pha động thường bao gồm thành phần nước (đệm) chiếm từ 2 – 40 %. Dung môi hữu cơ thường là acetonitrile.

Thứ tự rửa giải : ngược với RP-LC: càng phân cực, càng lưu giữ

Cơ chế: §

Dựa trên phân bố giữa lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha nh với pha động

Dựa trên tương tác của các chất phân ch phân cực với các nhóm phân cực của pha nh

Tăng hàm lượng nước trong pha động à giảm khả năng lưu giữ

Ứng dụng với các chất rất phân cực, là một kỹ thuật bổ sung cho RP-LC. Kết hợp tốt với LC/MS.

Trong HILIC, nước là một dung môi mạnh !

13-Nov-18

Các chÕ ®é ph©n tÝch HPLC vµ c¸c d¹ng mÉu tương ứng

13-Nov-18

B.) Low- and High-performance Liquid Chromatography:

Molecular mass

Many types of liquid chromatography are available, based on different stationary phase and mobile phase combinations. - each type may be further characterized based on its overall efficiency or performance

Các chÕ ®é ph©n tÝch HPLC vµ c¸c d¹ng mÉu tương ứng Loại HPLC

Pha tĩnh

Pha động

Dạng chất được tách

Pha đảo Ghép cặp ion Pha thuận Trao đổi ion Loại kích cỡ

13-Nov-18

Các chÕ ®é ph©n tÝch HPLC vµ c¸c d¹ng mÉu tương ứng Loại HPLC

Pha tĩnh

Pha động

Dạng chất được tách

Pha đảo

C18; C8; C4, C2

Nước/dm hữu cơ

Trung tính; Các Acid (base) yếu

Ghép cặp ion

C18; C8

Nước/dm hữu cơ; Hóa chất ghép cặp

Các Ion, base, acid

Pha thuận

Silica; Amino, Cyano Diol

Hữu cơ kém phân cực

Các chất ko tan trong nước; các đồng phân hữu cơ

Trao đổi ion

Nhựa trao đổi Cation; Anion

Nước/Đệm; Ion Ion; các Ion vô trái dấu cơ

Loại kích cỡ

Polystyrene Silica

Nước (GFC); Hữu cơ (GPC)

Các hợp chất polymer cao phân tử

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.2. HỆ THỐNG MÁY HPLC

3.2.1. SƠ ĐỒ KHỐI MÁY HPLC

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2. HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG 2.2.1. Khái niệm Là hệ thống chứa pha động để cung cấp cho hệ thống HPLC. Hệ thống này có thể có từ 1 đến 4 kênh (tương ứng với 1 đến 4 bình chứa thủy tinh ). Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2. HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG 2.2.1. Khái niệm

Điều kiện pha động

- Pha động phải tan lẫn vào nhau tốt . - Phải lọc qua màng lọc 0.45 μm để không làm nghẹt cột - Phải được khử khí hòa tan trong pha động. Khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền, có thể loại khí hòa tan bằng cách đánh siêu âm.

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2. HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG 2.2.1. Khái niệm

Điều kiện pha động

Bộ phận lọc đầu vào bằng thủy tinh hoặc thép không rỉ có lỗ xốp 10 μm,

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.2. HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG 3.2.2. Cách dùng pha động rửa giải

Những nhược điểm của của kỹ thuật đẳng dòng (isocratic)

• Độ phân giải thấp đối với những peak có hệ số lưu giữ k nhỏ (rửa giải sớm) • Độ phân giải thấp đối với những peak ra muộn: do peak bành rộng. • Với những dung dịch mẫu có nhiều cấu tử có k khác nhau, thời gian phân tích bị kéo dài • Cột hay bị ô nhiễm bởi những cấu tử có độ lưu giữ cao

13-Nov-18

Những ưu điểm của kỹ thuật gradient dung môi • Tăng cường độ phân giải • Tăng độ nhậy với những peak ra muộn (k lớn) • Có khả năng phân tích những mẫu phức tạp (các hệ số k khác biệt lớn) • Cải thiện dạng peak sắc ký • Giảm được thời gian phân tích, nhất là những mẫu có nhiều cấu tử có độ phân cực khác nhau • Tăng độ bền của cột do loại bỏ được các cấu tử có độ lưu giữ mạnh. 39

… và những nhược điểm • Thiết bị HPLC phức tạp hơn, giá thành cao hơn • Thời gian phân tích thực tế tăng thêm do phải cộng thêm thời gian cân bằng cột. Với chế độ cặp đôi ion, thời gian cân bằng cột có thể kéo dài. • Các hệ thiết bị LC khác nhau có thể tích trễ khác nhau làm ảnh hưởng tới sự chuyển giao phương pháp giữa các thiết bị • Một số detector hoặc ứng dụng không thể áp dụng gradient dung môi. • Nếu sử dụng van tỷ lệ, khả năng bị kết tủa muối ở van cao (cần gia tăng quá trình rửa) 40

13-Nov-18

So sánh isocratic và gradient

Trường hợp A, isocratic: dạng peak không cân xứng, nhất là các peak rửa giải sau khoảng10 phút. Trường hợp B, gradient, Các peak tách đồng đều và có dạng peak hẹp, cân đối. Chú ý: các cặp peak tại các điểm 1 và 2 trong trường hợp isocratic không tách đựơc như trong trường hợp rửa giải gradient. 41

Biểu đồ thay đổi thành phần dung môi hữu cơ trong kỹ thuật gradient (%B)

• Isocratic hold time: thời gian chờ ban đầu • Gradient time tG: thời gian gradient diễn ra • Purging: giai đoạn đuổi các cấu tử có độ lưu giữ cao • Conditioning: ổn định lại cột, trở về thành phần ban đầu • Equilibrium: cân bằng cột

13-Nov-18

Hệ số lưu giữ tương đối trong kỹ thuật gradient Do bản chất pha động thay đổi liên tục trong quá trình phân tích, do đó hệ số lưu giữ của các cấu tử cũng thay đổi, bỏi vậy ta không thể sử dụng hệ số lưu giữ k như trong rửa giải isocratics. Thay vào đó, ta sử dụng hệ số lưu giữ tương đối k* được xác định theo phương trình dưới đây:

Trong đó: tG: thời gian gradient (phút) F: tốc độ dòng (ml/ph) S: lấy bằng 4 (đại lượng này phụ thuộc vào bản chất các cấu tử phân tích, với các phân tử nhỏ, S có giá trị khoảng từ 4-6. Với protein hay peptide, S = 10 – 1000. ΔΦ : Vm:

sự thay đổi thành phần của dung môi B Thể tích rỗng của cột phân tích (~0.68πr2L)

Values of 2 < k* < 10 are desired. A good starting value for k* is 5. 44

13-Nov-18

Độ dốc gradient ảnh hưởng lên khả năng tách.

Tăng thời gian gradient từ 10 phút lên 60 phút làm giảm độ dốc gradient. Kết quả hai cặp peak 1,2 và 6,7 đã tách được hoàn toàn.

Tính hệ số lưu giữ k* trong sắc ký lỏng gradient

Với các giá trị đã cho, ta tính được hệ só lưu giữ tương đối k* : k* = 25x2/(1.15x4x0.9x1.7) = 7,10 Với các cấu tử có phân tử lượng nhỏ, giá trị k* xấp xỉ 5 là được, vậy giá trị k*=7,1 ở trên là có thể chấp nhận được 46

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.3 BỘ KHỬ KHÍ ON LINE Mục đích : nhằm loại trừ các bọt khí nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động ngay trong quá trình chạy máy sắc ký Hoạt động : cho hai dung môi A và B . Dung môi đi vào ống polymer bên trong máy hút chân không, chân không sẽ kéo khí hòa tan đi xuyên qua thành ống , chất lỏng ở lại bên trong thành ống

Läc dung m«i vµ b¶o vÖ cét

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.4 HỆ THỐNG BƠM Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện Yêu cầu quá trình chia tách sắc ký Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) pump phải tạo dòng liên tục

Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phú

Tương hợp với các loại dung môi hữu cơ thông dụng, đệm, muối.

Khả năng cấp và trộn dung môi chính xác trong gradien (với pump đa kênh)

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

Vận hành ổn định, lặp lại

Dễ bảo trì và sửa chữa

2.4 HỆ THỐNG BƠM

- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt . Trong quá trình chạy sắc ký áp suất hiển thị là thông số vô cùng quan trọng biểu thị sự ổn định của hệ thống .

13-Nov-18

Các loại bơm: • Bơm piston dạng song song • Bơm piston dạng nối tiếp • Bơm màng

B¬m piston d¹ng song song Bơm gồm 2 piston giống nhau Làm việc luôn phiên: piston A đẩy thì piston B hút Đảm bảo liên tục có dòng dung môi đi vào hệ thống 52

13-Nov-18

B¬m piston d¹ng nèi tiÕp

Bơm gồm 2 piston bố trí nối tiếp, piston A lớn gấp đôi piston B Đảm bảo tạo dòng và áp suất ổn định cho hệ HPLC 53

Bé dËp xung (damper)

Chứa một chất lỏng có độ nén ép và ngăn với pha động bằng một màng ngăn Đảm bảo dập xung của bơm cao áp đạt thấp hơn 2% giá trị ban đầu Thường được gắn sensor áp suất 54

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.5 HỆ TIÊM MẪU

Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm 6 cổng có vòng chứa mẩu (sample loop). Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau : Thường dùng loại 0.50÷20 μl.

Tiêm bằng tay với Vòng mẫu có thể tích xác định or dùng micro xy lanh

Hệ bơm mẫu tự động theo chương trình định sẵn

Bộ phận tiêm mẫu bằng tay

Thao tác xoay van một cách dứt khoát Đường ống thải phải bố trí thấp hơn vòng loop và luôn hướng xuống dưới 56

13-Nov-18

ThiÕt bÞ b¬m mÉu tù ®éng

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.6. CỘT

Cột là nơi thực hiện quá trình tách sắc ký. Vật liệu : Trước đây cột được làm bằng thủy tinh , nhưng do nhu cầu hoạt động ở áp suất cao nên hiện nay đa số sử dụng cột làm bằng kim loại . Kích cỡ : Với thời gian cột trở nên ngắn hơn và hạt nhồi nhỏ hơn. Chiều dài cột thường sử dụng hiện nay 30 ÷ 250mm, với hạt nhồi đường kính 1.5 ÷ 5 μm .

13-Nov-18

Cột trong HPLC Các tiêu chí cơ bản của cột HPLC 

Phù hợp với chế độ phân tích



Khoảng pH làm việc



Khoảng nhiệt độ làm việc



Áp suất làm việc (có thể tới 1000 bar hoặc hơn).



Kích thước cột (L, ID)



Loại hạt nhồi: Silica hay Polymer



Kích thước và hình dạng hạt nhồi



Độ xốp (diện tích bề mặt/gram)



Kích thước lỗ xốp



Kiểu ốc đầu cột



...

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.6. CỘT

Cột gồm một ống hình trụ được nhồi đầy những hạt nhỏ hình cầu (thường có đường kính từ 1.5 – 5 μm ) Những hạt này hầu hết được làm bằng silica xốp, có những pore (khoảng trống ) riêng rẽ hình trụ có đường kính khoảng chừng 10nm phù hợp với những mẫu có phân tử nhỏ (M < 1000Da) Bên trong mỗi pore được bao phủ bởi lớp pha tĩnh, nhóm C18 được gắn vào các tiểu phân silica (Nếu là cột C18)

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.6. CỘT

Hạt được hình thành bằng cách kết tụ (aggregating) các tiểu phân hình cầu . Hạt tạo thành có kích thước lớn hơn và đường kính đều nhau. Các pore được hình thành do các khoảng trống giữa các tiểu phân. Bề mặt bên trong pore chiếm hơn 99% tổng diện tích bề mặt của hạt, Pha động bao quanh mỗi hạt khi nó chảy xuyên qua cột và các phân tử mẫu đi vào các pore bởi sự khuếch tán

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.6. CỘT

Để tăng tuổi thọ của cột người ta dùng cột bảo vệ (guard columns). Cột bảo vệ được lắp phía trước cột phân tích để lọc các tạp chất, không cho các tạp chất qua cột phân tích, tránh nhiễm bẩn cột , kéo dài thời gian sống của cột phân tích.Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại Trong sắc ký lỏng thường vận hành thiết bị ở nhiệt độ phòng không cần điều nhiệt cột. Tuy nhiên các máy sắc ký lỏng hiện đại thường được trang bị thêm hệ thống điều nhiệt cột có thể đến 1500C chính xác đến ± 0.10C 581325-U Ascentis® C18 HPLC Column 25 cm × 4.6 mm , 5 μm 1,240.85 SGD (1 SGD = 0.8021 USD)

13-Nov-18

Cột có pha tĩnh silica Cột silica có đặc điểm chịu áp suất cao tốt, dễ gắn các ligand để tạo thành các pha tĩnh khác nhau  Cột Silica: pha thường hoặc HILIC  Cột C18, C8, C4 , phenyl: RPC  Cột NH2, CN, Diol..: pha ngược, HILIC  Cột cho UHPLC (P >1000bar)  Chịu pH kém, thường từ 2-8 65

Cột polymer Cột HPLC polymer có đặc điểm chịu pH tốt, áp dụng nhiều trong sắc ký trao đổi ion, HILIC và GPC  Những pha tĩnh phổ biến là Polystyrene divinylbenzene, polyarcrylate, polyvinyl alcohol..  Người ta có thể gắn các nhóm chức khác nhau để tạo tính phân cực cho cột.  Với kích thước lỗ xốp lớn và có thể khống chế, được áp dụng nhiều trong GPC 66

13-Nov-18

Kích thước và hình dạng hạt nhồi Kích thước hạt nhồi càng nhỏ, hiệu năng tách hay số đĩa lý thuyết của cột càng cao. Tuy nhiên áp suất cột cũng tăng theo

Với các ứng dụng HPLC thông thường, ta thường sử dụng cột có hạt nhồi từ 3 – 5m. Các pha tĩnh có kích thước hạt nhỏ hơn thường áp dụng cho UHPLC. Cột polymer thường có kích thước hạt lớn do khả năng 67 chịu áp suất kém.

Ảnh hưởng kích thước hạt nhồi lên hiệu quả tách của cột

13-Nov-18

Ảnh hưởng của hình dạng hạt nhồi và kỹ thuật nhồi cột

Hạt nhồi hình cầu và nhồi đồng đều sẽ cho độ doãng peak nhỏ hơn

Khi cột bị sốc (rơi, va đập mạnh), hoặc frit cột bị nghẹt (một phần) hay cột bị nhiễm tạp, hiện tượng dòng chảy rối cũng làm giảm hiệu quả tách.

Thể tích ngoài cột ống dây mao quản và ốc nối

2 5 6

3 4

13-Nov-18

Phân tán do dòng chảy

Độ phân tán phụ thuộc vào kích thước mao quản và tốc độ dòng

13-Nov-18

Lắp đầu ferrule đúng quy cách

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.7. ĐẦU DÒ

2.7.1. Yêu cầu của detector Đáp ứng nhanh và lặp lại Độ nhạy cao Khoảng hoạt động tuyến tính rộng Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng Vận hành ổn định , sử dụng dễ dàng.

Một số detector sử dụng trong HPLC

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Detector UV - Vis (Fixed UV, VWD, MWD, DAD) Detector huỳnh quang FLD Detector ánh sáng tán xạ (ELSD) Detector chỉ số khúc xạ (RID) Detector điện hóa Detector khối phổ (MSD)

13-Nov-18

Các đặc tính của detector trong HPLC Nhiễu đường nền: là tín hiệu của detector khi không có mẫu. Một chỉ số quan trọng trong phân tích sắc ký là tỷ lệ tín hiệu/ nhiễu. Một peak được coi là peak tín hiệu nếu có tỷ lệ S/N >=2 (hoặc >=3).

Độ nhậy (sensitivity) • Độ nhậy S của detector được định nghĩa là tỷ số giữa chiều cao peak (E) và lượng chất (với detector nhậy khối lượng) hoặc nồng độ với detector nhậy nồng độ. Với detector nhậy khối lượng:

S

E M

Với detector nhậy nồng độ:

S

E C

13-Nov-18

Giới hạn phát hiện dưới LOD Giới hạn định lượng nhỏ nhất MDQ UNPAC đã định nghĩa giới hạn phát hiện dưới của một detector D theo công thức:

D

2N SWh

Với N là nhiễu đường nền, S là độ nhậy của detector Wh là độ rộng của peak tớn hiệu tớnh bằng giây Giới hạn định lượng nhỏ nhất MDQ thường có giá trị gấp 3 lần giới hạn phát hiện dưới LOD.

•

MDQ ~ 3 D

Khoảng động học và khoảng tuyến tính

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.7. ĐẦU DÒ

2.7.2. Detector UV Đây là detector được dùng phổ biến nhất trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thu bưc xạ UV-VIS của chất phân tích (190nm600nm). from column

to waste

Ảnh hưởng của thể tích flowcell lên độ phân giải sắc ký

13-Nov-18

Detector UV (UV-Vis) Định luật Beer :

Gọi T = ( IT/Io ) là độ truyền qua Gọi A = lg( Io/IT ) là hệ số hấp thụ Ta có A = cl Với : IT = Độ hấp thụ khi có mẫu Io = độ hấp thụ khi không có mẫu l = chiều dài flowcell c = nồng độ cấu tử phân tích = hệ số hấp thụ

Độ nhạy của detector UV phụ thuộc vào chiều dài flowcell và hằng, số  trong đó  phụ thuộc vào cường độ cực đại hấp thụ của cấu tử nghiên cứu. Lựa chọn đúng bước sóng cực đại hấp thụ của cấu tử phân tích sẽ cho độ nhậy lớn nhất.

Các nhóm chức có đáp ứng UV-Vis

13-Nov-18

Detector UV bước sóng cố định

Ưu điểm: • Giá thành hạ • Sử dụng đơn giản • Có thể đạt độ nhậy khá • Áp dụng cho các phân tích đơn giản, thường nhật Nhược điểm: • Bước sóng cố định không phù hợp với nhiều loại cấu tử • Không phát triển hoặc tối ưu được các phương pháp phân tích

Detector bước sóng biến đổi (VWD) UV Lamp

Cut-off filter Holmium oxide filter Slit

Sample diode

Mirror 1 Grating

Flow cell

Mirror 2 Reference diode

13-Nov-18

Detector mảng diode (DAD) và detector đa bước sóng (MWD) • Có độ nhậy cao • Có thể chạy nhiều bước sóng cùng một lúc (up to 8 channels) • Có thể lấy phổ online của các peak, giúp cho quá trình phân tích định tính. •Lập biểu đồ 3D • Ứng dụng tốt cho phát triển phương pháp mới. • Có thể lập thư viện phổ UV-Vis

Tungsten lamp

Deuterium lamp Diode Array

Lens

Lens system Holmium filter Detector cell

Optical slit

Grating

•…

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.7. ĐẦU DÒ

2.7.2. Detector UV Nếu đầu dò là diode array, có thể biểu diễn sắc ký đồ theo 3 trục toạ độ , A=f(tR, λ) (hình 2.18)

13-Nov-18

DAD

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.7. ĐẦU DÒ

2.7.2. Detector UV

13-Nov-18

Sơ đồ nguyên lý detector huỳnh quang

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.7. ĐẦU DÒ

2.7.3. Đầu dò huỳnh quang -Nhạy và chọn lọc. -Việc làm sạch mẫu có thể đơn giản hóa. - Buớc sóng ánh sáng kích thích chiếu vào mẫu khi đi qua flow cell. Các phân tử phát huỳnh quang -Khi một hợp chất phát huỳnh quang, bước sóng phát xạ mong muốn sẽ được tách ra bằng kính lọc hoặc bộ đơn sắc và chiếu vào tế bào quang điện

13-Nov-18

Chương 2

HỆ THỐNG MÁY HPLC

2.7.3. Đầu dò huỳnh quang

2.7. ĐẦU DÒ Ở đây tín hiệu quang được chuyển thành tín hiệu điện và ghi nhận bởi bộ phận ghi dữ liệu. Do sự phát huỳnh quang là phát ra tất cả các hướng nên ánh sáng phát xạ thường được bố trí vuông góc với ánh sáng kích thích để làm giảm nhiễu nền.

Quá trình phát huỳnh quang có một phần năng lượng bị mất nên bước sóng phát xạ luôn dài hơn hơn bước sóng kích thích.

Detector huỳnh quang •

Cường độ tia phát xạ huỳnh quang được tính theo công thức:

• • • • • •

Với: f = tỷ lệ phát xạ/hấp thụ Io = Cường độ tia kích thích l = độ dài flowcell c = nồng độ cấu tử phân tích k = hệ số hấp thụ

13-Nov-18

Các nhóm chức và các tác nhân tương ứng để tạo dẫn xuất huỳnh quang

Detector chỉ số khúc xạ (RID) • Dựa trên chỉ số khúc xạ khác nhau giữa chất phân tích và pha động • Phân tích được những cấu tử không mang nhóm mang mầu hoặc không phát huỳnh quang (đường) • Rất ảnh hưởng bởi nhiệt độ, thậm chí nhiệt độ sinh ra trong quá trình hấp phụ/giải hấp trong cột phân tích cũng có thể gây tác động • Không chạy được chế độ gradient dung môi

13-Nov-18

DETECTOR MS

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 3.3.1. Các đặc điểm của dung môi 3.3.1.1. UV cutoff

Khái niệm : UV cutoff là bước sóng mà tại đó độ hấp thu của dung môi trong cell đo 1cm là bằng 1 (so với không khí ) Một dung môi có UV cutoff cao hơn bước sóng làm việc có thể gây ra độ hấp thu nền cao .

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 3.3.1. Các đặc điểm của dung môi 3.3.1.1. UV cutoff

sắc ký pha đảo

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 3.3.1. Các đặc điểm của dung môi 3.3.1.1. UV cutoff

sắc ký pha thuận

13-Nov-18

Tính chất một số dung môi thường sử dụng trong hplc Dung môi n-hexane Iso octane Triethylamine (TEA) Toluene Benzene Dichloromethane(CH2Cl2) Chloroform (CHCl3) CCl4 THF Ethanol Isopropanol Acetone Acetonitrile Methanol Nước

Độ nhớt (cP, 20 oC) 0.313 0.5 0.38 0.65 0.65 0.44 0.57 0.97 0.55 1.2 2.35

Độ phân cực (Snyder) 0.0 0.4 1.8 2.3 3 3.4 3.4 – 4.4 1.7 4.2 5.2 4.3

0.32 0.37 0.6 1.0

5.4 6.2 6.6 9.0

Điểm sôi ( oC) 68.9 99.2 89.5 101.6 80.1 40 61.2 76.5 66 78.3 82.4117.7 56.3 81.6 64.7 100

UV cut off (nm) 195 197 – 210 285 280 232 245 265 212 – 230 205 – 210 210+ 330 190 205 180

RI 1.375 1.404 1.401 1.496 1.501 1.443 1.466 1.408 1.361 1.380 1.359 1.344 1.329 1.333

101

Biểu đồ độ trộn lẫn của các dung môi

102

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.1. Các đặc điểm của dung môi Acetonitril Nước Cyclohexane Hexane Methanol Ethanol Dietyl Ether Dichloromethane Chloroform Carbon Tet Tetrahydrofuran Toluene

3.3.1.1. UV cutoff 190 190 195 200 210 210 220 220 240 265 280 (220) 285

Ảnh hưởng bản chất dung môi hữu cơ tới độ lưu giữ và độ chọn lọc

104

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 3.3.1. Các đặc điểm của dung môi 3.3.1.2. Độ nhớt

Độ nhớt của dung mội ảnh hưởng đến áp suất cột. Độ nhớt tăng  áp suất cột tăng  đến hiệu năng tách của cột giảm Nguyên nhân : Khi độ nhớt tăng quá trình truyền khối giữa pha tĩnh và pha động bị chậm lại  peak bị bành rộng ra  hiệu năng tách giảm .

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.1. Các đặc điểm của dung môi

3.3.1.2. Độ nhớt

Khi gradient dung môi sẽ có 1 giá trị tỷ lệ mà độ nhớt lớn nhất. Để tăng hiệu năng tách cần tránh những hổn hợp như thế. ACN : độ nhớt thấp và UV cutoff bé nhất làm cho ACN là thành phần dung môi tốt nhất trong sắc ký pha đảo

13-Nov-18

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ nhớt của dung môi

107

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.1. Các đặc điểm của dung môi 3.3.1.3. Sự trộn lẫn dung môi

Trộn lẫn (Miscible) Hai thành phần có thể trộn lẫn vào nhau ở tất cả các tỷ lệ mà không tạo thành hai pha riêng biệt

Hòa tan ( Soluble) Một thành phần có mặt trong một dung môi ở một mức độ nào đó thì gọi là tan (Soluble) trong dung môi đó

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.1. Các đặc điểm của dung môi

3.3.1.1. UV cutoff

Ảnh hưởng của kích thước hạt, chiều dài cột, độ nhớt dung môi .. lên áp suất cột Phương trình Darcy

110

13-Nov-18

Ảnh hưởng của pH pha động lên độ lưu giữ trong RP-HPLC

111

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG

3.3.2.1. Yêu cầu của pha động

Pha động phải trơ với pha tĩnh đang sử dụng. Chất phân tích trong mẫu phải tan được trong pha động Pha động phải bền vững theo thời gian các dung mội khác nhau trong các pha động khác nhau phải tan lẫn vào nhau Khi thay đổi pha động Pha động phải có độ tinh khiết cao Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký Phải phù hợp với loại Detector càng rẻ càng tốt, và càng thân thiện với môi trường càng tốt

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG

3.3.2.2. Làm sạch dung môi

a/ Các điều cần lưu ý b/ Các loại màng lọc. c/ Lọc :

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG

3.3.2.2. Làm sach dung môi

a/ Các điều cần lưu ý Luôn luôn sử dụng dung môi loại HPLC Mua từ nhà cung cấp tin cậy Lọc dung môi

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG

3.3.2.2. Làm sach dung môi

c/ Lọc : Thường dùng hệ thống lọc áp suất thấp

Cellulose Acetate Membrane Filters are suitable for aqueous and many alcoholic media, low protein binding capacity, thermally stable up to 180℃.

13-Nov-18

Whatman 7404001 Nylon Membrane Circle, 0.45 um pore size, 13 mm,

WhatmanÂŽ PTFE membrane filters TE36 sheets, pore size 0.45 Îźm, ...

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG

Chế độ đẳng dòng 1 kênh

-Phối trộn pha động theo đúng tỷ lệ và thành phần mong muốn, - lọc bằng hệ thống lọc chân không với màng lọc có pore size thường là 0.45µm

3.3.2.2. Làm sạch dung môi

chế độ chế độ đẳng dòng nhiều kênh hoặc gradient lọc riêng từng loại dung môi Các loại dung mội này khi phối trộn vẫn có khả năng sẽ tủa (đặc biệt là đệm phốt phát trong môi trường hữu cơ) .  phải phối trộn với tỷ lệ muối đệm cao nhất (theo chương trình gradient đã nghiên cứu) trước ít nhất một ngày để quan sát

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG

3.3.2.3. Đuổi khí

Nguyên nhân : Trong dung mội sau khi lọc sẽ còn khí . Các bọt khí này khi chạy vào cột sẽ tạo ra các hạt khí làm ảnh hưởng đến quá trình sắc ký (peak bị bành rộng ). Cách làm: đặt chai chứa pha động vào trong bể siêu âm khoảng 15 phút (đối với dung mội hữu cơ) và 35 ‘ ( đối với dung mội nước) .

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG

3.3.2.3. Đuổi khí

Lưu ý: không nên đánh siêu âm quá lâu nếu trong thành phần pha động có chất dễ bay hơi (ví dụ như trifluoroacetic) Ảnh hưởng của việc khử khí lên peak sắc ký . Peak của một chuẩn amin sử dụng : a/ Pha động mới chuẩn bị xong 50H2O – 50MeOH -0.1 trifluoroacetic b/ sau 3 h sục khí c/ sau 8h sục khí

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.3. Chuẩn bị hệ thống HPLC trước khi tiêm mẫu vào 3.3.3.1. Lắp pha động vào hệ thống Yêu cầu của bình chứa pha động -Luôn luôn đậy kín cả khi đang dùng hoặc khi đang chứa dung môi -Không được chứa trong chai plastic , vì chất plastic và những hợp chất có khối lượng phân tử thấp sẽ khuếch tán vào chất lỏng. -Trong suốt để có thể kiểm soát mực chất lỏng trong bình thường xuyên (nên dùng chai thủy tinh trong ) - Nếu là bình chứa nước , cần kiểm soát thướng xuyên tránh vi khuẩn phát triển là nhiễm bẩn nước

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.3. Chuẩn bị hệ thống HPLC trước khi tiêm mẫu vào 3.3.3.2. Lắp cột vào hệ thống

Marvin C. McMaster tác giả cuốn “ HPLC A Practical User’s Guide” xuất bản năm 2007 do nhà xuất bản A John Wiley & Sons, Inc., Publication đã thống kê -80% các quá trình tách được thực hiện trên cột pha đảo - 10% là sắc ký loại cở (hầu hết là cho mẫu polymer và protein) , - 8% là sắc ký trao đổi ion, - 2% sắc ký pha thuận trên silica hoặc zirconium và alumina.

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.3. Chuẩn bị hệ thống HPLC trước khi tiêm mẫu vào 3.3.3.2. Lắp cột vào hệ thống a. Một số lưu ý khi sử dụng cột Duy trì pH của cột silica pha liên kết giữa 2 -8 (tốt hơn pH 2.5 ÷ 7.5) Luôn luôn rửa cột với dung mội mới hoặc dung môi trung gian (bridging solvent) nếu hai dung môi mới và cũ không trộn lẫn) Không chuyển từ dm hữu cơ sang dung dịch đệm hoặc ngược lại . Không làm shock cột Bảo quản cột

Vấn đề tăng áp suất Duy trì tuổi thọ cột

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.3. Chuẩn bị hệ thống HPLC trước khi tiêm mẫu vào 3.3.3.2. Lắp cột vào hệ thống

b. lắp cột

Mội cột có mũi tên chỉ hướng của dòng chảy đi qua, khi lắp cột vào hệ thống phải lắp đúng hướng mũi tên trùng với hướng của dòng chảy pha động, Nếu lắp ngược sẽ làm giảm hiệu năng tách của cột. Trước cột chính nên có một cột bảo vệ

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.3. Chuẩn bị hệ thống HPLC trước khi tiêm mẫu vào 3.3.3.2. Lắp cột vào hệ thống

c. Cân bằng cột

Trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký phải cân bằng cột

Cân bằng cột đến khi tín hiệu đường nền ổn định. Thời gian cân bằng cột tùy thuộc nhiều vào bản chất pha động

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.4. Chuẩn bị mẫu tiêm vào vào hệ thống HPLC

phenylalanine

Ảnh hưởng của thành phần dung môi pha mẫu lên dạng peak. Mẫu được hoà tan trong pha động với (a) 0%, (b) 30%, (c) 50%, (d) 70% ACN Pha động: đệm pH3.5 – ACN (92-8) , pha đảo, đầu dò UV 210nm

In 33% ACN

In 66% ACN In 100% ACN

Caffeine at 0.75 mg ml 1, 4 μl injection volume. Column: Luna 3 μm C18(2) 50×2.0 mm. Mobile phase: gradient 5 to 95% acetonitrile (with 0.1% formic acid) in 7.5 min at a flow-rate of 1 ml min 1

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.4. Chuẩn bị mẫu tiêm vào vào hệ thống HPLC Lương mẫu quá lớn peak sẽ bị bành rộng và không đối xứng, thời gian lưu sẽ thay đổi . tiêm 2mg acetophenone (peak đầu tiên ) và Veratrole . Điều kiện sắc ký cột 25cm, 3.2mm i.d.; pha tĩnh LiChrosorb SI 60 5 mm; Pha động : hexane– diethyl ether 9 : 1, tốc độ dòng 1 ml/min Đầu dò UV, 290 nm, Tiêm 2µg acetophenone (peak đầu tiên ) và Veratrole .

Caffeine 0.75 mg/ml in 100% ACN. Column: Luna 3 μm C18(2) 50x2.0 mm. Mobile phase: gradient 5 to 95% ACN (0.1% formic acid) in 7.5 min Flow-rate: 1 ml/min

Effect of sample injection volume for a given injection solvent composition.

13-Nov-18

Sample Solvent Strength

Maximum Injection Volume

100% Strong Solvent

≤ 10 µL

Stronger than mobile Phase

≤ 25 µL

Mobile Phase

≤ 15% of Peak Volume

Weaker than Mobile Phase

Large

Peak volume Baseline peak width (min.) x F mL/min

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.4. Chuẩn bị mẫu tiêm vào vào hệ thống HPLC Mẫu trước khi tiêm vào hệ thống HPLC phải lọc qua màng lọc 0.45µm hoặc nhỏ hơn để tránh làm nghẹt cột .

Sau khi tiêm mẫu vào ta sẽ có sắc ký đồ. Từ sắc ký đồ có thể định lượng và định tính

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.5. Chương trình isoractic và gradient pha động, gradient bước sóng 3.3.5.1. Rửa giải isocractic

Quá trình tách sắc ký lỏng mà thành phần pha động không thay đổi được gọi là rửa giải đẳng dòng (isocractic)

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.5. Chương trình isoractic và gradient pha động, gradient bước sóng 3. 3.5.2. Rửa giải gradient pha động Rửa giải gragient là thay đổi liên tục thành phân pha động trong suốt quá trình tách sao cho sự lưu giữ của peak sau là giảm liện tục tức là pha động có độ mạnh tăng đều đều trong suốt quá trình tách.

13-Nov-18

%B/min = (100-5)/20 = 4.75 %B/min

12.8

21.2

Isocratic analysis possible when scouting gradient: Î”tG < 0.25tG 8.4 min. > 0.25*20 = 5 min.

Values of 2 < k* < 10 are desired. A good starting value for k* is 5. 136

13-Nov-18

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.5. Chương trình isoractic và gradient pha động, gradient bước sóng 3. 3.5.2. Rửa giải gradient bước sóng Đầu dò UV Nếu như mẫu phân tích gồm nhiều chất khác nhau và một số chất có hấp thu bước sóng khác nhau thì ứng với một nhóm chất phải cài đặt bước sóng tương ứng để tăng độ nhạy của chất phân tích. Đầu dò DAD : Có thể chọn nhiều bước sóng để chạy mẫu cùng một lúc Đầu dò huỳnh quang Nếu là chất phát huỳnh quang thì có bước sóng phát xạ kích thích khác nhau thì ứng với một nhóm chất phải cài đặt bước sóng tương ứng để tăng độ nhạy của chất phân tích.

Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.3.5. Chương trình isoractic và gradient pha động, gradient bước sóng 3. 3.5.2. Rửa giải gradient bước sóng Chương trình 2 : Thời gian

Chương trình 1 ex/em: 324/366nm (OXO, NAL,FLU :

---)

-------

Bước sóng Bước sóng kích thích

phát xạ

(nm)

00.00

263 (OXO) 380

10.00

312 (NaL)

366

16.00

263

380

16.10

Stop

Flumequine

Oxolinic

Sarafloxacin

Enrofloxacin

Norfloxacin Ciprofloxacin

13-Nov-18

Quinolone

NOR

CIP

ENRO

SARA

OXO

FLU

tR (phÃºt)

5,925

6,726

7,892

8,707

10,396

14,054