PHÂN LẬP ALCALOID TỪ PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA CAO ALCALOID TOÀN PHẦN CHIẾT TỪ LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

∗∗∗

∗∗∗

LƯƠNG THỊ HỒNG NHỊ LƯƠNG THỊ HỒNG NHỊ

PHÂN LẬP ALCALOID TỪ PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA CAO ALCALOID TOÀN PHẦN

PHÂN LẬP ALCALOID TỪ PHÂN ĐOẠN

CHIẾT TỪ LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG

PHÂN CỰC CỦA CAO ALCALOID TOÀN PHẦN

Crinum latifolium L.Amaryllidaceae

CHIẾT TỪ LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L.Amaryllidaceae KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Thầy hướng dẫn: ThS. NGUYỄN HỮU LẠC THỦY PGS.TS. VÕ THỊ BẠCH HUỆ

Thành phố Hồ Chí Minh 2014 Thành phố Hồ Chí Minh 2014

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

MỤC LỤC CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................1 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 2.1. TRINH NỮ HOÀNG CUNG ...........................................................................3 2.1.1. Thực vật học ...............................................................................................3 2.1.2. Bộ phận dùng .............................................................................................4 2.1.3. Thành phần hóa học ...................................................................................4 2.2. TỔNG QUAN VỀ ALCALOID .......................................................................9 2.2.1. Định nghĩa : Max Polonovski (1910) .........................................................9 2.2.2. Tính chất...................................................................................................10 2.2.3. Các phương pháp chiết xuất alcaloid .......................................................11 2.2.4. Định tính alcaloid .....................................................................................12 2.2.5. Định lượng alcaloid ..................................................................................12 2.3. SILICA GEL−GHÉP .....................................................................................12 2.3.1. Khái niệm, phân loại ................................................................................12 2.3.2. Cơ chế hoạt động của silica gel RP-8 và RP-18 ......................................12 2.4. CÁC KĨ THUẬT SẮC KÍ ..............................................................................14 2.4.1. Sắc kí lớp mỏng........................................................................................14 2.4.2. Sắc kí cột ..................................................................................................15 2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ NGHIỆM THƯỜNG ĐƯỢC ỨNG DỤNG TRONG BIỆN GIẢI CẤU TRÚC.........................................................................17 2.5.1. UV-Vis .....................................................................................................17 2.5.2. IR ..............................................................................................................18 2.5.3. MS ............................................................................................................18 2.5.4. NMR .........................................................................................................18 CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................19 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................19 3.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................................19 3.1.2. Dung môi – hóa chất ................................................................................19 3.1.3. Trang thiết bị ............................................................................................19 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................20 3.2.1. Khảo sát các phân đoạn alcaloid tách từ cao ethyl acetat ........................22 3.2.2. Tách alcaloid phân cực bằng kĩ thuật sắc kí cột chân không pha đảo .....22 3.2.3. Xác định cấu trúc các hợp chất alcaloid phân lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm ................................................................................................22 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..............................................................23

N Ễ I

N À Đ

N Á O

-

Í L

A Ó H

4.1. KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN ALCALOID TÁCH TỪ CAO ETHYL ACETAT ................................................................................................................23 4.1.1. Chọn lựa những phân đoạn phân cực .......................................................23 4.1.2. Kiểm tra cao toàn phần của các phân đoạn phân cực ..............................26 4.2. TÁCH PHÂN ĐOẠN ALCALOID BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÍ CỘT CHÂN KHÔNG PHA ĐẢO ..............................................................................................26 4.2.1. Tiến hành tách cao toàn phần qua cột sắc kí chân không pha đảo...........26 4.2.2. Kiểm tra alcaloid trong các ống ...............................................................27 4.2.3. Cao cloroform ..........................................................................................29 4.2.4. Cao n-butanol ...........................................................................................31 4.2.5. Nhận xét ...................................................................................................33 4.3. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT ALCALOID .......................34 4.3.1. Quy ước gọi tên các hợp chất alcaloid .....................................................34 4.3.2. Phân lập và tinh chế hợp chất alcaloid AL-1 trong cao cloroform ..........34 4.3.3. Phân lập và tinh chế hợp chất alcaloid AL-2 trong cao n-butanol ...........35 4.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC AL-1 VÀ AL-2 .....................................................37 4.4.1. Khảo sát cấu trúc AL-1 ............................................................................37 4.4.2. Khảo sát cấu trúc AL-2 ............................................................................47 4.5. BÀN LUẬN ....................................................................................................50 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................52 5.1. KẾT LUẬN.....................................................................................................52 5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................52

N

0 0 1

0B

T

N Ầ R

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

HƠ

N

T

T

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2014

Final essay for the degree of BS Pharm. – Academic year 2013 – 2014

PHÂN LẬP ALCALOID TỪ PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA CAO ALCALOID TOÀN PHẦN CHIẾT TỪ LÁ TRINH NỮ HOÀNG CUNG Crinum latifolium L.Amaryllidaceae

ISOLATED ALCALOID FROM THE SEGMENT POLARITY OF THE TOTAL ALCALOID EXTRACTED FROM PLANT Crinum latifolium L.Amaryllidaceae

N

Luong Thi Hong Nhi

Lương Thị Hồng Nhị

Pro.Ass. Vo Thi Bach Hue

PGS.TS.Võ Thị Bạch Huệ

Introduction

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Mở đầu và đặt vấn đề Lá cây Trinh nữ hoàng cung từ lâu đã được biết đến do có nhiều tác dụng sinh học như kháng khối u và được dùng để điều trị u xơ tử cung, u phì đại lành tính tuyến tiền liệt, dự phòng biến chứng do phì đại tuyến tiền liệt. Những tác dụng này được nhiều công trình khoa học chứng minh là do nhóm hợp chất alcaloid. Bộ môn HPTKN cũng đã tiến hành chiết và tách được một số alcaloid từ cây TNHC nhưng các alcaloid này đều là các alcaloid kém phân cực đến phân cực trung bình, do đó đề tài này được tiến hành nhằm mục đích tiếp tục chiết và tách alcaloid phân cực mạnh. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

B 0 0 0 1

Đối tượng nghiên cứu là phân đoạn phân cực của cao alcaloid toàn phần chiết từ lá TNHC. Phương pháp nghiên cứu được tiến hành qua các giai đoạn: khảo sát các phân đoạn alcaloid tách từ cao ethyl acetat, tách alcaloid phân cực bằng kĩ thuật sắc kí cột chân không pha đảo, xác định cấu trúc các alcaloid phân cập được bằng các phương pháp phổ nghiệm.

Í-

Kết quả và bàn luận

-L

A Ó H

Từ phân đoạn phân cực của cao alklaoid toàn phần thu được 2 alcaloid là AL-1 và AL-2. AL-1 đã được đo các phổ UV, IR, MS, NMR, tuy nhiên cấu trúc AL-1 vẫn chưa xác định được và đang được tiếp tục nghiên cứu. AL-2 đã được đo các phổ UV, IR, MS và đang được tiếp tục tiến hành đo phổ NMR. Kết luận

N À Đ

T

Đề tài đã phân lập và tinh chế được 2 alcaloid có độ phân cực mạnh là AL-1 và AL2 và cũng đã tiến hành xác định cấu trúc của Al-1 bằng các phương pháp phổ nghiệm (UV, IR, MS, NMR)

N Ễ I

N

Supervisor: Master. Nguyen Huu Lac Thuy

Thầy hướng dẫn : ThS.Nguyễn Hữu Lạc Thủy

N Á O

Y U Q P.

HƠ

T

N Ầ R

O Ạ Đ

T

Crinum latifolium L. has long been known by many biological effects such as antitumor and is used to treat uterine fibroids, benign tumors enlarged prostate, complications from preventive hypertrophic prostate. These effects are more scientific work is demonstrated by the group of alcaloids. HPTKN Department also conducted a number of extracts and isolated alcaloids from Crinum latifolium L. but this alcaloid alcaloids are less polarized and polarizing average, so this topic was conducted for the purpose of extracting and separating continue alcaloid strongly polarized.

NG HƯ

Materials and methods Materals research is polarized segments of high alcaloid extracted from the leaves of Crinum latifolium L full. Research methodology is conducted through the stages: survey segments alcaloid isolated from ethyl acetate high, separated by alcaloid polarization technique phase vacuum flash chromatography island structure determination of alcaloids hierarchies by the spectroscopic methods. Results and discussion From high fractional polarization of alklaoid total was obtained AL-1 and AL-2. AL-1 has been measuring the UV, IR, MS, NMR, however, AL-1 structure has not yet been identified and are being studied further. AL-2 has been measured the UV, IR, MS and is continuing to conduct NMR spectrometer. Conclusion Chapter has been isolated and purified the two alcaloids have strong polarization AL-1 and AL-2 and also the determination of the structure of Al-1 by spectroscopic methods (UV, IR, MS, NMR)

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC BẢNG

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt δ AchE 1 H-1H COSY CHCl3 D Dd DĐVN DEPT HMBC

Chữ nguyên

Nghĩa Tiếng Việt độ dời hóa học

Acetylcholinesterase Correlated Spectroscopy Cloroform Doublet doublets of doublet

1

1

phổ tương quan H – H đỉnh đôi đỉnh đôi kép Dược điển Việt Nam

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HPTKN

Hóa phân tích kiểm nghiệm

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation Infrared Coupling constant Multiplet Mass Spectroscopy Nuclear Magnetic Resonance parts per million Reverse Phase

IR J M MS NMR Ppm RP

phổ hồng ngoại hằng số ghép đỉnh đa phổ khối cộng hưởng từ hạt nhân phần triệu pha đảo

Singlet

S SKLM STH T Td TT TNHC UV VLC

đỉnh đơn sắc kí lớp mỏng siêu tới hạn đỉnh ba

Triplet Triplet of doublet Ultraviolet Vacuum Liquid Chromatography

N Ễ I

N À Đ

N Á O

-

Í L

A Ó H

N

HƠ

Bảng 2.1. Các alcaloid được phân lập từ cây TNHC .................................................5 Bảng 2.2. Các cơ chế áp dụng của silica gel-ghép ...................................................14 Bảng 4.1.Khối lượng cao trong các phân đoạn phân cực .........................................24 Bảng 4.2. Kết quả các ống dịch chiết cloroform ......................................................28 Bảng 4.3. Kết quả các ống dịch chiết n-butanol .......................................................31 Bảng 4.4. Các dữ liệu phổ NMR (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1 ......................41

0 0 1

0B

N Ầ R

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

N

T

T

thuốc thử Trinh nữ hoàng cung tử ngoại sắc ký cột chân không

T

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Hình 4.31. Phổ HMBC (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1 .....................................46 Hình 4.32.Sắc kí đồ của AL-2 ..................................................................................48 Hình 4.33. Phổ UV (MeOH) của AL-2 ....................................................................49 Hình 4.34. Phổ IR (KBr) của AL-2 ..........................................................................49 Hình 4.35. Phổ EI-MS+ của AL-2 ............................................................................50

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1.Các bộ phận của cây Trinh nữ hoàng cung .................................................3 Hình 2.2.Sắc ký đồ định danh một số vết có trong cao toàn phần từ lá TNHC. ........6 Hình 2.3.Bề mặt của silica gel RP-18 trước và sau khi được hoạt hóa ....................13 Hình 3.1. Qui trình thực hiện của nhóm nghiên cứu TNHC (2013) ........................20 Hình 3.2.Qui trình phân lập alcaloid từ các phân đoạn phân cực ............................21 Hình 4.1. SKLM kiểm tra 25 phân đoạn của nhóm TNHC .....................................24 Hình 4.2.SKLM so sánh F3 với các phân đoạn 22, 23, 24 ........................................25 Hình 4.3. SKLM vết cao toàn phần phân cực ..........................................................25 Hình 4.4. SKLM kiểm tra vết cao toàn phần phân cực ............................................26 Hình 4.5.Cột sắc kí chân không triển khai tách cao toàn phần phân cực .................27 Hình 4.6.SKLM (UV 254) các ống dịch chiết cloroform ........................................28 Hình 4.7.SKLM (TT Dragendorff) các ống dịch chiết cloroform ...........................29 Hình 4.8. SKLM kiểm tra các ống 1 – 4 ..................................................................30 Hình 4.9.SKLM kiểm tra các ống từ 5 – 11 .............................................................30 Hình 4.10. SKLM cao cloroform .............................................................................31 Hình 4.11. SKLM các ống dịch chiết n-butanol.......................................................32 Hình 4.12. SKLM cao n-butanol ..............................................................................33 Hình 4.13. SKLM cao toàn phần, cao cloroform và cao n-butanol .........................33 Hình 4.14. Sơ đồ tinh chế AL-1 ...............................................................................34 Hình 4.15. SKLM kiểm tra vết AL-1 .......................................................................35 Hình 4.16. Sơ đồ tinh chế AL-2 ...............................................................................36 Hình 4.17. SKLM kiểm tra vết AL-2 .......................................................................37 Hình 4.18. Sắc kí đồ của AL-1 .................................................................................38 Hình 4.19. Phổ UV (MeOH) của AL-1 ....................................................................39 Hình 4.20. Phổ IR (KBr) của AL-1 ..........................................................................39 Hình 4.21. Phổ EI-MS+ của AL-1.............................................................................40 Hình 4.22. Phổ 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) của AL-1 .........................................42 Hình 4.23. Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của AL-1 ..........................................42 Hình 4.24. Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của AL-1 ..........................................43 Hình 4.25. Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của AL-1 ..........................................43 Hình 4.26. Phổ DEPT (MeOD, 125 MHz) của AL-1 ..............................................44 Hình 4.27. Phổ 1H-1H- COSY (MeOD, 500 MHz, vùng < 4,2 ppm) của AL-1 ......44 Hình 4.28. Phổ HSQC (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1 ......................................45 Hình 4.29. Phổ HSQC (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1 ......................................45 Hình 4.30.Phổ HMBC (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1 ......................................46

N Ễ I

N À Đ

N Á O

-

Í L

A Ó H

N

Y U Q P.

HƠ

N

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Hình PL1.1. Sơ đồ chiết cao alcaloid toàn phần bằng phương pháp SFE Hình PL1.2. Cao alcaloid toàn phần Hình PL1.3. Vết cao alcaloid toàn phần Hình PL1.4. SKLM để kiểm tra dịch chiết từ cao alcaloid toàn phần

0 0 1

0B

N Ầ R

NG HƯ

O Ạ Đ

T

T

T

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 1

CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ

LỜI CẢM ƠN

N

HƠ

Trải qua khoảng thời gian 5 năm học tại Khoa Dược – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí

Hiện nay, khuynh hướng quay trở về với các điều trị có nguồn gốc từ thiên nhiên

Minh, em đã học hỏi được rất nhiều kiến thức chuyên ngành, kinh nghiệm quý báu

đang là đề tài hấp dẫn của các nhà khoa học. Thuốc có nguồn gốc từ dược liệu

từ Quý Thầy Cô. Đó sẽ là hành trang, là nền tảng vững chắc để em thêm vững bước

không những có giá thành không cao mà còn có tác dụng trị liệu tương đương với

trong tương lai.

các thuốc tân dược thường có nhiều độc tính và tác dụng phụ. Đối với Việt Nam,

Y U Q P.

N

một quốc gia có thực – động vật phong phú thì đây hẳn là một thuận lợi vô cùng lớn

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

cho chúng ta trong quá trình tìm kiếm những vị thuốc mới.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Th.S Nguyễn Hữu Lạc Thủy

tác dụng nổi trội của các cây trong họ dược liệu Amaryllidaceae, chi Crinum và

PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ

nhất là cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium)

Đã tận tình hướng dẫn, luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian

NG HƯ

Lá cây TNHC có nhiều tác dụng sinh học như kháng khuẩn, kháng viêm, kháng

thực hiện đề tài.

khối u và được dùng trong điều trị u xơ tử cung, u phì đại tuyến tiền liệt lành tính,

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến

ẦN

TS. Phạm Đông Phương đã đóng góp ý kiến, giúp cho khóa luận của em hoàn thiện hơn.

nhiều lời khuyên quý báu.

ÓA

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô, Anh, Chị, cùng các bạn sinh viên tại Bộ

-H

môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Í L -

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đã luôn động viên, chia sẻ

N Á O

cùng em.

N À Đ

T

0B

0 0 1

Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy TS. Nguyễn Viết Kình đã tận tình giúp đỡ, cho em

N Ễ I

O Ạ Đ

T

Trong những năm 80, các nhà khoa học trên khắp thế giới đã bắt đầu biết đến những

TR

ngoài ra tác dụng làm giảm và chấm dứt các triệu chứng rối loạn tiểu tiện, dự phòng biến chứng do phì đại tuyến tiền liệt cũng đã được nghiên cứu. Gần đây, nhiều bài báo quốc tế có đề cập tới hoạt tính kháng AchE (invitro) của các cây thuộc chi Crinum và hướng đến tác dụng đó là những chất thuộc nhóm alcaloid. Tuy nhiên, các hợp chất tự nhiên trong cây TNHC cũng rất nhiều và đa dạng (các hợp chất alcaloid, flavonoid, coumarin, phytosterol) nên việc chiết tách ra các alcaloid tinh khiết thường gặp rất nhiều khó khăn. Trong những năm vừa qua, nhóm nghiên cứu về cây TNHC của Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm đã cố gắng tiến hành chiết và tách một số alcaloid từ cây TNHC từ kém phân cực đến phân cực trung bình.Theo hướng đó, nhằm tiếp tục chiết xuất và phân lập alcaloid trong phân đoạn rất phân cực, chúng tôi thực hiện đề tài : “Phân lập alcaloid từ phân đoạn phân cực của cao alcaloid toàn phần chiết từ

Sinh viên Lương Thị Hồng Nhị TP. HCM, tháng 7/2014

lá TNHC (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae)” với các mục tiêu như sau :

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 2

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 3

1. Khảo sát các phân đoạn alcaloid tách từ cao ethyl acetat

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2. Tách alcaloid từ phân đoạn phân cực bằng kĩ thuật sắc kí cột chân không pha 3. Phân lập và tinh chế hợp chất alcaloid

2.1.1. Thực vật học

4. Khảo sát cấu trúc alcaloid đã phân lập được bằng các phương pháp phổ

2.1.1.1.Tên khoa học

nghiệm (UV, IR, MS, NMR)

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N Ễ I

Y U Q P.

N

Crinum latifolium L. Amaryllidaceae (Họ Thủy tiên) [1], [2], [3], [7].

0B

N À Đ

N

HƠ

2.1. TRINH NỮ HOÀNG CUNG

đảo

N Á O

T

-L

Í-

A Ó H

0 0 1

N Ầ R

NG HƯ

O Ạ Đ

T

Toàn cây

Lá

Hoa

Cụm hoa

T

Hình 2.1 Các bộ phận của cây Trinh nữ hoàng cung

2.1.1.2. Tên khác [1], [2], [5], [7], [11]. Tỏi lơi, Tỏi lơi lá rộng, Náng lá rộng, Hoàng cung trinh nữ, Tây nam vvăn châu lan, Thập bát học sĩ (Trung Quốc), Tỏi Thái Lan.

2.1.1.3. Mô tả thực vật Trinh nữ hoàng cung là một loại cây cỏ lớn. Thân hành như củ hành tây to, đường kính 10 - 15 cm, phủ bởi những vảy hình bản to, dày, màu trắng. Bẹ lá úp vào nhau

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 4

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 5

thành một thân giả dài 10 - 15 cm. Lá mọc thẳng từ thân hành, hình dải dài từ 40 -

Trần Văn Sung và cộng sự, năm 1997 đã phân lập được từ thân hành TNHC 5

100 cm, rộng 3 - 8 cm, mép lá nguyên, lượn sóng, đầu nhọn hoặc tù. Gân lá song

alcaloid, trong đó L-lycorin và pratorin được nhận dạng bằng phổ khối lượng và

song, mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới có một gân nổi rất rõ, đầu bẹ lá nơi sát

phổ cộng hưởng từ hạt nhân [4].

đất có màu đỏ tím.

Trong luận án tiến sĩ năm 2000, NCS. Võ Thị Bạch Huệ lần đầu tiên phân lập và

Hoa mọc thành tán gồm 6 - 18 hoa, trên một cán hoa dài 30 - 60 cm. Lá bắc rộng,

định danh được hợp chất 6-hydroxycrinamidin và cũng là lần đầu tiên chất này

hình thìa dài 7 cm, màu lục, đầu nhọn. Cánh hoa màu trắng có điểm màu tím đỏ dọc

được tìm thấy trong tự nhiên [4].

theo cánh, bao gồm 6 phiến bằng nhau, hàn liền 1/3 thành ống hẹp, khi nở đầu

Năm 2003, Nguyễn Hữu Lạc Thủy (khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ

phiến quăn lại. Nhị 6, bầu hạ. Quả gần hình cầu (ít gặp). Từ thân hành mọc rất

Chí Minh) đã phân lập được 2 alcaloid là undulatin và 6-hydroxyundulatin. Trong

nhiều củ con có thể tách ra để trồng riêng dễ dàng [1], [3], [4], [6], [7].

đó, 6-hydroxyundulatin lần đầu tiên được phân lập từ Crinum latifolium L. [12].

Y U Q P.

N

T

Bảng 2.1 Các alcaloid được phân lập từ cây TNHC

Mùa hoa quả: tháng 8-9.

2.1.2. Bộ phận dùng Lá và thân hành [1].

ẦN

2.1.3. Thành phần hóa học 2.1.3.1. Alcaloid Từ những năm 1984- 1994 đã có rất nhiều công trình khoa học nghiên cứu về thành phần hóa học của TNHC, trong đó alcaloid được nghiên cứu nhiều nhất [19].

ÓA

0B

0 0 1

Nhà khoa học Ấn Độ Ghosal năm 1984 đã lập và xác định từ hoa một glucoalcaloid có tên latisolin, cùng với Shibnath còn phân lập được từ thân hành lúc cây đang ra

-H

TR

NG HƯ STT

Tên khoa học

1

Buphanidrin

2

Powellin

3

Ambellin

4

6-hydroxybuphanidrin

5

6-hydroxypowellin

6

Undulatin

7

Crinamidin

8

6-hydroxyundulatin

9

1β,2β-epoxyambellin

hoa 2 alcaloid pyrrolophenanthrindon là pratorimin và pratosin cùng với các chất đã biết như pratorimin, ambellin và lycorin [30], [31].

LÍ

Ghosal (1986) công bố 2 alcaloid có tác dụng chống ung thư là crinafolin và crinafolidin [21].

N Á O

-

10 11

Năm 1989, Ghosal tiếp tục chiết được từ hoa 2 alcaloid mới có nhân pyrrolo

12

phenanthrindin là 2-epilycorin và 2-epipancrassidin [32].

13

N À Đ

O Ạ Đ

N

HƠ

T

Công thức cấu tạo

Epoxy-3,7-dimethoxycrinan11-one 6-hydroxycrinamidin Dihydro-oxodemethoxyhaemanthamin Crinan-3α-ol

Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2002) đã xác định được 15 alcaloid bằng GC - MS. Hầu hết các alcaloid thuộc nhóm Crinin (Bảng 2.1) [34].

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 6

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 7

vết TP: cao toàn phần

14

15

vết 2: 1,2-epoxy-6-ethoxy-

N

3,7-dimethoxycrinin

Augustamin vết 3: 6-ethoxybuphanidrin

vết 4:augustamin

vết 6: 6-hydroxyundulatin

vết 7: 6-hydroxybuphanidrin

vết 9: 6-hydroxycrinamidin

vết 10: 6-hydroxypowellin

Oxoassoanin

Jonh Refaat, Mohamed S. Kamel năm 2012 đã tổng hợp lại những alcaloid nhóm

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

vết 1: hippadin

O Ạ Đ

T

Q P.

HƠ

vết 5: undulatin

UY

N

vết 8: crinamidin

vết 11: 1,2,3-trihydroxy-7methoxycrinin

Từ cao lá TNHC, Bộ môn HPTKN, khoa Dược, Đại học Y Dược tp Hồ Chí Minh

crinin đã phân lập được từ trước đến nay từ các bộ phận khác nhau, bao gồm: 11-

đã phân lập một số alcaloid tiêu biểu được trình bày trên sắc kí đồ (Hình 2.2).

O-acetylambellin (C20H23NO6), 11-O-acetyl-1,2-β-

NG HƯ

2.1.3.2. Flavonoid

epoxyambellin(C20H23NO7), 3-O-acetylhamayn (C18H19NO5), crinafolidin (C19H23NO6), crinafolin (C18H21NO6), crinamin (C17H19NO4), crinin

Nguyễn Hải Nam, Nguyễn Tiến Vững, Yong Kim, Young Jae You, Dong Ho

(C16H17NO3), hamayn (C16H17NO4) [24].

Hong, Hwan Mook Kim, Byung Zun Ahn đã phân lập và xác định cấu trúc của các

UV 254

UV 365

N Á O

ẦN

-

LÍ

ÓA

B 0 0 0 1

-H

TT Dragendorff

Hình 2.2 Sắc ký đồ định danh một số vết có trong cao toàn phần từ lá TNHC. Dung môi khai triển cloroform – methanol – ammoniac (6,5 : 1 : 0,05). Các vết chấm:

N Ễ I

N À Đ

T

TR

flavonoid: 4’,7-dihydroxy-3-vinyloxyflavan, 4’,7-dihydroxyflavan, 2',4',7trihydroxydihydrochalcon, 3',5,6-trihydroxy-4',7,8-trimethoxyflavon [27]. Mai Đình Trị, Nguyễn Công Hào đã chiết tách và phân lập được kaempferol-3-O-β-Dglucopyranosid và kaempferol-3,4’-di-O-β-D-glucopyranosid từ lá tươi TNHC [4].

2.1.3.3. Các thành phần khác Thân rễ chứa 2 glucan: glucan A và glucan B có khoảng 110 gốc của glucose. Ở Việt Nam, theo Nguyễn Hoàng và cs (1997) TNHC có 11 alcaloid, 11 acid amin, acid hữu cơ. Các acid amin là phenylalanin, 1-leucin, dl-valin và 1-arginin monohydroclorid [4], [24].

2.1.4.Tác dụng dược lí [19], [20], [23], [25], [29], [33] Cao methanol của rễ, thân và cao chiết alcaloid toàn phần của TNHC đều có tác dụng ức chế sự phân bào, kìm hãm sự tăng trưởng của rễ hành ta; hoạt tính của cao TNHC bằng hoặc hơn 50% so với hoạt tính của colchicin ở cùng nồng độ.

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 8

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 9

Trên mô hình gây u báng thực nghiệm bằng cách cấy truyền vào khoang bụng chuột

AChE liên quan đến đặc điểm cấu trúc trong các loại khung khác nhau, các alcaloid

6

thuộc galanthamin và nhóm lycorin có tác dụng ức chế AChE cao nhất

panacrin (chế phẩm thuốc bào chế từ hỗn hợp 3 dược liệu : lá TNHC, củ tam thất và

2.1.5.Công dụng [19]

lá đu đủ) có tác dụng làm giảm sinh khối của u hay giảm tổng số tế bào ung thư

HƠ

N

TNHC được dùng trong dân gian để chữa ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư

đồng thời làm giảm chỉ số gián phân của tế bào ung thư. Ngoài ra thuốc còn hạn chế

Y U Q P.

tuyến tiền liệt. Lá thái nhỏ, với liều dùng mỗi ngày 3-5 lá, sao vàng sắc uống. Cũng

sự di căn của tế bào ung thư từ u đùi lên gan, phổi, lách (trong thử nghiệm gây ung

có người dùng điều trị ung thư dạ dày, phổi, gan và chữa đau dạ dày. Ở các tỉnh

thư ở đùi chuột nhắt). Thuốc có tác dụng kéo dài thời gian sống của chuột mang ung

T

phía nam TNHC được dùng phổ biến chữa bệnh đường tiết niệu.

thư được điều trị gần gấp đôi so với chuột đối chứng mang ung thư.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

nhắt trắng tế bào u báng sarcoma TG – 180 với lượng 10 tế bào/ l chuột. Chế phẩm

O Ạ Đ

Dùng ngoài, lá và thân hành giã nát, hơ nóng dùng xoa bóp làm xung huyết da chữa

Cao chiết bằng nước nóng từ TNHC (1-8 mg/ml) có tác dụng kích thích sự sinh sản

tê thấp, đau nhức.

của tế bào lympho T, và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp các tế bào CD4+T

NG HƯ

trong thử nghiệm in vitro trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi

Ở Ấn Độ, nhân dân dùng thân hành cây TNHC xào nóng, giã đắp trị thấp khớp,

người.

mụn nhọt và áp xe để gây mưng mủ. Dịch ép lá làm thuốc nhỏ tai trị đau tai. Ở Campuchia người dân dùng cây TNHC để trị bệnh phụ khoa.

Một số alcaloid trong cây TNHC có hoạt tính sinh học. Lycorin ức chế sự tổng hợp

ẦN

protein và DNA của tế bào chuột, và ức chế sự phát triển của u báng cấy ở chuột. trong thử nghiệm in vitro lycorin làm giảm khả năng sống của các tế bào u. Lycorin ức chế sinh tổng hợp vitamin C trong cây cỏ, làm ngừng sự phát triển virus gây

B 0 0 0 1

bệnh bại liệt, ức chế sự tổng hợp các tiền chất cần cho sự sinh trưởng của virus gây bệnh bại liệt, và enzym poliopeptidase. Lycorin có độc tính cấp tính thấp.

A Ó H

TR

2.1.6. Một vài chế phẩm chứa TNHC - Trà túi lọc Trinh nữ hoàng cung - Công ty cổ phần Dược liệu Trung ương 2. -Viên bao phim Tadimax (TNHC, Tri mẫu, Ích mẫu, Hoàng bá, Đào nhân, Trạch tả, Xích thược, Quế nhục) - Công ty cổ phần Dược phẩm Đà Nẵng. - Viên nang Nga phụ khang (TNHC, Hoàng cầm, Khương hoàng) - Công ty TNHH

Lycorin–O–glycosid ở mức liều microgam gây kích thích tế bào lympho chuột nhắt

tư vấn Y dược quốc tế.

trắng, điều hòa miễn dịch. Pseudolycorin có tác dụng làm ngừng sự phát triển của tế

- Viên bao đường TNHC (TNHC, Tam thất) - Công ty cổ phần dược phẩm Hoa Sen.

Í-

bào Hela, ngăn cản sự tổng hợp protein trong tế bào u báng và làm chậm lại quá

- Viên nang Crila - Công ty cổ phần Dược liệu Trung ương 2.

trình tổng hợp DNA. Hippadin làm ức chế một cách hồi phục sự thụ tinh của chuột

- Viên bao phim OPCrilati - Công ty cổ phần Dược phẩm OPC.

cống đực; 1,2 - β – epoxyambellin có tác dụng hoạt hóa tế bào lympho lách chuột

- Viên nang Cyroma - Công ty cổ phần Dược vật tư Y tế Hải Dương.

N Á O

-L

nhắt. Hỗn hợp ambellin và 1,2-β–epoxyambellin gây hoạt hóa tế bào lympho giống như chất concanavalin A.

T

23 alcaloidđược phân lập từ các loài thuộc họ Amaryllidaceae thuộc loại: lycorin,

N À Đ

2.2. TỔNG QUAN VỀ ALCALOID 2.2.1. Định nghĩa : Max Polonovski (1910)

homolycorin, haemanthamin, galanthamin, tazettin…và các khung đã được thử nghiệm khả năng ức chế AChE. Những kết quả này cho thấy rằng tác dụng ức chế

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 10

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 11

2.2.3. Các phương pháp chiết xuất alcaloid [16]

Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có chứa nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi gặp trong động vật, thường có

HƠ

chọn lọc nhằm thu được cao chiết có chất lượng tốt nhất: nhiều hoạt chất, ít tạp

N

2.2.2. Tính chất [6]

chất, đặc biệt là những tạp chất có ảnh hưởng đến quá trình tách các chất.

2.2.1.1. Tính chất vật lý

Alcaloid trong cây thường tồn tại dưới dạng muối hòa tan với acid hữu cơ hoặc vô chung là alcaloid dạng base tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực còn alcaloid

xác định. Một số alcaloid không đo được điểm chảy do bị phân hủy ở nhiệt độ thấp

chiết xuất phù hợp cũng như chuyển dạng nhiều lần để loại phần nào tạp chất ra

capsaisin, piperin, chavicin…

dụng thường là chiết ngấm kiệt, chiết bằng dụng cụ Sohxlet, đun hồi lưu hay ngâm

như berberin, palmatin, chelidonin. - Độ tan: alcaloid base tan tốt trong dung môi hữu cơ như: cồn, benzen, methanol,

môi hữu cơ thích hợp để chiết xuất và tinh chế alcaloid.

B 0 0 0 1

- Năng suất quay cực: phần lớn alcaloid có khả năng quay, thường tả truyền.

ÓA

2.2.1.2. Tính chất hóa học

-H

Hầu như alcaloid đều có tính base yếu, có thể giải phóng alcaloid ra khỏi muối của

LÍ

nó bằng kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, MgO, carbonat kiềm, NaOH…

-

Tác dụng với các acid, alcaloid cho các muối tương ứng.

N Á O

Alcaloid kết hợp với kim loại nặng (Hg, Bi, Pt…) tạo ra muối phức. Alcaloid cho phản ứng với thuốc thử chung:

T

- Thuốc thử Mayer (K2HgI4 – Kalitetraiodomercurat): cho tủa trắng hay vàng nhạt.

N À Đ

NG HƯ

khỏi dịch chiết trước khi phân lập các alcaloid.Các phương pháp chiết xuất được sử

- Màu sắc: hầu hết các alcaloid đều không màu trừ một số ít alcaloid có màu vàng

Dựa vào độ tan khác nhau của alcaloid base và muối alcaloid người ta sử dụng dung

O Ạ Đ

dạng base và dạng muối alcaloid trong dung môi, người ta lựa chọn phương pháp

- Mùi vị: đa số alcaloid không có mùi, có vị đắng và môt số ít có vị cay như

tan trong các dung môi hữu cơ ít phân cực.

T

dạng muối tan trong dung môi phân cực. Do đó, dựa vào tính tan khác nhau của

hơn điểm chảy.

cloroform, ether…Trái lại, các muối alcaloid thì dễ tan trong nước, hầu như không

Y U Q P.

cơ hay dạng kết hợp với tanin. Alcaloid thường được chiết xuất dựa trên nguyên tắc

- Thể chất: alcaloid thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường, dễ kết tinh và có điểm chảy

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

Bột dược liệu được xay nhỏ vừa phải để quá trình chiết nhanh nhưng bảo đảm tính

tính dược lực mạnh và cho phản ứng với một số thuốc thử chung của alcaloid [6].

TR

ẦN

lạnh, chiết lỏng siêu tới hạn…Sau đây là vài sơ đồ chiết xuất alcaloid toàn phần:

2.2.3.1. Chiết xuất alcaloid bằng dung môi hữu cơ ở môi trường kiềm Bột dược liệu được làm ẩm bằng NH4OH, Na2CO3, NaOH …, sau đó được chiết bằng các dung môi hữu cơ, thu được dịch chiết chứa các alcaloid dạng base. Dịch chiết thu được lắc với dung dịch acid loãng thu được dịch chiết acid chứa các alcaloid dạng muối. Tiếp tục kiềm hóa dịch chiết thu được đến pH 9-10, sau đó chiết bằng dung môi hữu cơ và cô thu hồi dung môi thu được alcaloid toàn phần.

2.2.3.2. Chiết xuất bằng nước acid Bột dược liệu được ngâm vào trong dung dịch acid loãng thu được dịch chiết acid chứa các alcaloid dạng muối. Dịch chiết acid được kiềm hóa đến pH 9-10, sau đó chiết bằng dung môi hữu cơ và cô thu hồi dung môi thu được alcaloid toàn phần.

2.2.3.3. Chiết xuất bằng cồn acid

- Thuốc thử Bouchardat (iodo- iodide): cho tủa nâu.

Bột dược liệu được ngấm kiệt bằng cồn acid thu được dịch chiết cồn, sau đó trung

- Thuốc thử Dragendorff (KBiI4 – Kalitetraiodobismutat III): tủa vàng cam đến đỏ.

hòa bằng kiềm nhẹ, cô nhẹ còn 1/3 thể tích thu được dịch chiết acid. Kiềm hóa dịch

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 12

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 13

chiết acid đến pH 9-10, sau đó chiết bằng dung môi hữu cơ và cô thu hồi dung môi

Khi được ghép vào silica gel, mạch nhánh (C-8 hoặc C-18) sẽ đóng vai trò như một

thu được alcaloid toàn phần.

giá của pha tĩnh. Bình thường khi chưa được tẩm pha tĩnh (chưa được hoạt hóa) các

2.2.4. Định tính alcaloid

mạch nhánh này nằm hỗn độn và sát vào cấu trúc silica gel. Khi được tẩm pha tĩnh

N

HƠ

N

(được hoạt hóa) thì các mạch nhánh này sẽ duỗi ra tạo thành một hệ thống các bó

Thông thường, các alcaloid được định tính bằng phản ứng hóa học với thuốc thử

Y U Q P.

sợi (như các sợi trên bề mặt bàn chải) che phủ bên ngoài cấu trúc silica gel.

chung hoặc thuốc thử đặc hiệu hay bằng các phương pháp sắc ký.

2.2.5. Định lượng alcaloid

T

lớp dung môi được “tẩm” vào bó sợi

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Các phương pháp định lượng alcaloid trong dược liệu như phương pháp cân, phương pháp thể tích, phương pháp quang phổ định lượng alcaloid toàn phần có trong dược liệu hay kết hợp các phương pháp phân tách (thường là phương pháp sắc ký) với phương pháp định lượng (thường là các phương pháp quang phổ) để định

Hình 2.3 Bề mặt của silicagel RP-18 trước và sau khi được hoạt hóa

lượng riêng một hay một vài alcaloid nào đó trong hỗn hợp alcaloid toàn phần.

Hệ thống “bó sợi” này sẽ lưu giữ (tẩm) một lớp dung môi hữu cơ có trong thành

2.3. SILICA GEL−GHÉP [16]

ẦN

2.3.1. Khái niệm, phân loại Là silica gel mà nhiều nhóm Si–OH silanol được biến đổi thành nhóm Si–R, thành nhóm Si–O–R hoặc thành nhóm Si–O–Si–R (R được ghép vào silica gel).

NG HƯ

O Ạ Đ

0 0 1

0B

Khi –R là mạch hydrocarbon kém phân cực (gồm 2C hay 6C hay 8C hay 18C) ta có

TR

phần của pha động (ví dụ sẽ được tẩm với methanol khi pha động là hệ nước – methanol, tẩm với acetonitril khi pha động là nước – acetonitril). Lớp dung môi hữu cơ này sẽ giữ vai trò một pha tĩnh lỏng. Khi một pha động lỏng chứa mẫu đi qua hệ thống pha tĩnh lỏng này, một sự phân bố mẫu vào 2 pha sẽ được hình thành.

silica gel-ghép pha đảo (= silica gel pha đảo, RP). Đây là các chất phân bố không

Ngoài ra, bản thân các mạch sợi (lúc này đã được duỗi ra) của hệ thống silica gel-

phân cực.

ghép này cũng có tương tác với các mẫu kém phân cực, làm cho các mẫu kém phân

ÓA

-H

Khi –R là mạch phân cực (cyanopropyl −C3H6CN; aminopropyl −C3H6NH2 hoặc

Í L -

propandiol) ta có silica gel-ghép pha thuận. Đây là các chất hấp phụ yếu nếu so với silicagel-không ghép.

N Á O

Trong các silica gel-ghép thì loại silica gel RP (RP-8 và nhất là RP-18) được sử dụng nhiều trong kỹ thuật HPLC.Một số trường hợp cũng sử dụng đến các loại

T

silica gel-ghép NP (amino, diol, cyano), 3 loại này là các chất hấp phụ yếu.

N À Đ

2.3.2. Cơ chế hoạt động của silicagel RP-8 và RP-18

N Ễ I

cực này bị lưu giữ trong pha tĩnh lâu hơn. Như vậy, các silica gel-ghép pha đảo đều là những chất hoạt động chủ yếu theo cơ chế phân bố. Silica gel pha đảo được điều chế bằng các phản ứng silan-hóa từ silica gel pha thuận nhờ phản ứng với các dẫn chất silan có mạch hydrocarbon thẳng (R = –CH3; hoặc octyl −C8H17; hoặc octyldecyl −C18H37); mạch vòng như gốc phenyl (−C6H5). Ghi chú : Thực ra sự phân chia cơ chế ở đây cũng mang ý nghĩa tương đối, vì ngay cả ở silica gel-ghép vẫn có các cơ chế cạnh tranh khác. Ví dụ : còn cơ chế hấp phụ do các nhóm –OH silanol tự do còn sót lại. Hoặc ở trường hợp silica gel-ghép kiểu

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 14

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 15

diol đôi khi lại được dùng như là một chất rây phân tử, trong khi silica gel-ghép

Cơ chế chính trong SKLM là cơ chế hấp phụ.

kiểu diethylamino lại thường được sử dụng như là một chất trao đổi ion, silica gel-

2.4.1.2. Ứng dụng

ghép kiểu cyano và kiểu amino khi sử dụng dung môi kém phân cực lại có vai trò

Kỹ thuật SKLM hiện nay có nhiều ứng dụng, đặc biệt trong ngành nghiên cứu về

như một chất hấp phụ pha thuận.

các hợp chất tự nhiên.

Bảng 2.2 Các cơ chế áp dụng của silicagel ghép Silica gel-ghép

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

hấp phụ,

phân bố

-amino

hấp phụ,

phân bố,

-diamino

hấp phụ,

-diethylamino

N

- Cho biết đặc điểm của hợp chất vừa được phân lập.

rây phân tử

-cyano

Y U Q P.

- Định tính: so sánh một chất với chất chuẩn.

Cơ chế áp dụng

-diol

N

HƠ

T

- Sơ bộ xác định: trong hỗn hợp cần phân tách ban đầu có bao nhiêu hợp chất và

O Ạ Đ

tính phân cực của mỗi hợp chất trong mỗi hỗn hợp mẫu ban đầu. trao đổi ion

- Thăm dò hệ dung môi cho sắc ký cột.

trao đổi ion

- Theo dõi quá trình sắc ký cột: để nhận định các phân đoạn thu được từ sắc ký cột.

trao đổi ion

NG HƯ

- Xác định độ tinh khiết của một chất.

Trong pha đảo, trình tự dung môi sử dụng sẽ có độ phân cực giảm dần, và trình tự

- Kiểm nghiệm dược liệu: so sánh dịch chiết của dược liệu thử và dịch chiết dược

các chất tách ra khỏi hệ thống cũng sẽ có độ phân cực giảm dần (đảo hoàn toàn so

liệu chuẩn.

ẦN

với pha thuận). Trên thị trường hiện nay còn có rất nhiều loại silica gel-ghép khác nữa, chúng chủ yếu được sử dụng trong kỹ thuật HPLC.

2.4. CÁC KĨ THUẬT SẮC KÍ [16]

B 0 0 0 1

Sắc ký là một phương pháp vật lý, nhằm mục đích tác riêng các cấu tử của một hỗn

A Ó H

hợp nhờ vào sự phân chia của các cấu tử này giữa 2 pha (pha tĩnh và pha động). Trong đó, pha động di chuyển xuyên qua pha tĩnh theo một hướng nhất định.

2.4.1. Sắc kí lớp mỏng 2.4.1.1. Nguyên lý

N Á O

-L

Í-

Một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp mỏng chất hấp phụ (thường là

T

silicagel, nhôm oxid) tráng trên nền phẳng đóng vai trò là một pha tĩnh.

N À Đ

TR

- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu: bằng một quy trình chiết xuất nhất định, trong điều kiện sắc ký nhất định, sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu phải không đổi về số vết, Rf, hình dạng, màu sắc các vết, tỷ lệ tương đối giữa các vết. Sắc ký đồ được coi như là tài liệu không thể thiếu trong công tác xây dựng tiêu chuẩn dược liệu. - Theo dõi phản ứng, tối ưu hóa phản ứng.

2.4.2. Sắc kí cột 2.4.2.1. Sắc kí cột cổ điển Sắc ký cột nhằm mục đích phân lập nhiều hợp chất tinh khiết với khối lượng phân tử lớn từ một hỗn hợp gồm nhiều thành phần.

Nguyên lý: mẫu thử được nạp lên trên đầu cột chứa chất hấp phụ (thường là silicagel). Cột này đóng vai trò như một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha

Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển

động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử. Do các cấu

các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc ký đồ gồm

tử này có độ phân cực khác nhau, tạo thành các vết có vị trí khác nhau và ra khỏi

nhiều vết có Rf khác nhau.

cột tại các thời điểm khác nhau.

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 16

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 17

Các bước chuẩn bị:

- Bộ thu phân đoạn: gồm erlen hút, có khắc vạch thể tích, được gắn kín với đáy cột

-Mẫu thử: mẫu thử là ở dạng dung dịch khá đậm đặc trong một dung môi không

nhờ bộ joint cao su chuyên dụng hoặc nút cao su dễ tháo lắp, vòi erlen nối với bộ

quá phân cực so với hệ dung môi dùng để khai triển cột. Hoặc mẫu có thể ở dạng

tạo áp suất giảm, có thể điều chỉnh áp suất cho phù hợp nhờ một van xả.

bột khô bằng cách trộn mẫu với chất hấp.

Hoạt động: nhờ áp suất hút vòi cột, dung môi chảy xuyên qua hệ thống (pha tĩnh và

-Chất hấp phụ: lượng chất hấp phụ thường gấp 30-60 lần lượng mẫu sẽ dùng, hoặc

mẫu) với lưu lượng lớn và được hứng ngay vào erlen hút.

gấp 100 – 200 lần nếu mẫu ít tạp. Chất hấp phụ thường là silica gel, dùng để phân

Các công đoạn thực hiện tương tự SKC cổ điển.

lập các chất có độ phân cực yếu đến trung bình.

Ưu điểm: so với SKC cổ điển, SKC chân không thực hiện nhanh hơn, nạp được

-Cột: là những ống hình trụ bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa hoặc không. Nếu cột

nhiều mẫu hơn, ít hao tổn dung môi, SKC chân không cũng tách khá tốt, trình tự ra

không có lưới thủy tinh xốp thì phải lót một lớp bông dày 1 – 2 cm.

khỏi cột khá giống trên lớp mỏng cùng loại nên dễ theo dõi.

Cột sử dụng có kích thước khác nhau tùy thuộc vào lượng chất đem phân tích.

Ứng dụng:

Thông thường, cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt.

Tách một hỗn hơp thành vài phân đoạn đơn giản có độ phân cực khác nhau.

Thực hiện

Cung cấp các phân đoạn có khối lượng khá lớn cho các thử nghiệm sinh học nhằm

N

N Ầ R

khô hoặc phương pháp hỗn dịch. -Nạp mẫu: dạng bột khô hoặc dạng dung dịch. -Nạp dung môi khai triển. -Khai triển cột. -Rửa giải và thu phân đoạn.

A Ó H

2.4.2.2. Sắc kí cột chân không (Vacuum Liquid Chromatography, VLC)

Í-

B 0 0 0 1

Sắc ký cột chân không (SKC chân không) là một kỹ thuật thay đổi từ SKC cổ điển.

-L

Về bản chất, SKC chân không là một dạng sắc ký hấp phụ trên cột pha thuận khai triển với tốc độ nhanh. Về khả năng tách, SKC chân không là một kỹ thuật đạt khả

N Á O

năng tách trung bình.

So với sắc ký cột cổ điển, SKC chân không sử dụng bộ dụng cụ có một số chi tiết kỹ thuật thay đổi.

N À Đ

T

N

T

định hướng việc phân lập các hoạt chất một cách tập trung hơn, ít lãng phí công sức,

-Nhồi chất hấp phụ vào cột: theo một trong hai phương pháp sau: phương pháp bột -Ổn định cột.

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

HƠ

T

thời gian và dung môi.

2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ NGHIỆM THƯỜNG ĐƯỢC ỨNG DỤNG TRONG BIỆN GIẢI CẤU TRÚC Trong quá trình chiết tách, phân lập các hợp chất từ thực vật, khi cần xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất này, cần phải thực hiện các phương pháp hóa lý (đo điểm nóng chảy, đo phổ UV, MS, IR, NMR, …).

2.5.1. UV-Vis [17] Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (UV-Vis) là phương pháp nhằm xác định độ hấp thụ của một dung dịch. Độ hấp thụ riêng của một chất trong một dung môi xác định và đo ở một bước sóng xác định là một đặc tính của chất đó. Phổ hấp thu tử ngoại khả kiến cung cấp thông tin về bước sóng hấp thu cực đại của hợp chất cần khảo sát

- Cột sắc ký: bằng thủy tinh hay sứ thành dày, có lưới xốp, đường kính cột lớn (5 – 10 cm), ngắn (20 – 40 cm), không có khóa.

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 18

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 19

2.5.2. IR [8] Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại (IR) là một trong những kỹ thuật phân

CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

tích rất hiệu quả. Phổ hồng ngoại cung cấp thông tin về các nhóm định chức trong

3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

phân tử. Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp này là nó cung

N

Phân đoạn phân cực của cao alcaloid toàn phần chiết từ lá cây TNHC (Crinum

phức tạp.

latifolium L.) được thu hái ở Bình Định tháng 10 năm 2010 (Phụ lục)

2.5.3. MS [8]

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Y U Q P.

3.1.1. Nguyên vật liệu

cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không đòi hỏi các phương pháp tính toán

N

HƠ

3.1.2. Dung môi – hóa chất

Khối phổ (mass spectroscopy – MS) là một kỹ thuật để đo khối lượng phân tử của

Các dung môi, hóa chất, thuốc thử đạt độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng.

một phân tử, cung cấp các thông tin về kích thước, công thức nguyên của phân tử.

Các dung môi: n-hexan, ether, cloroform, methanol, ammoniac, aceton, acid acetic

2.5.4. NMR [8]

NG HƯ

đạt tinh khiết loại PA do Trung Quốc sản xuất.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy khung sườn carbon – hydrogen và cấu trúc

3.1.3. Trang thiết bị

của hợp chất cần khảo sát. Độ nhạy của phương pháp này nhỏ hơn rất nhiều lần so

ẦN

với các phương pháp quang phổ như UV-Vis, IR; do đó cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử một cách chính xác.

0B

ÓA

N Ễ I

O Ạ Đ

T

N À Đ

N Á O

T

-L

H Í

0 0 1

TR

Trang thiết bị gồm có: - Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu 2500 - Nhật - Máy quang phổ hồng ngoại Fourrier transform infrared spectrophotometry FTIR 8201 PC Shimadzu – Nhật - Máy cô quay chân không Rotavapor R-3000 – Thụy Sĩ - Đèn UV 2 bước sóng 254 và 365 nm Vilber Lourmat – Pháp - Máy bơm hút chân không GP 129 JXK Panasonic – Malaysia. - Phổ khối được thực hiện trên máy LC-MS của Viện kiểm nghiệm Tp Hồ Chí Minh -Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo và ghi trên máy Bruker Avance 500MHz, dung môi MeOD tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hà Nội. Độ dịch chuyển hóa học tính theo thang delta (ppm) dựa theo chuẩn nội là tetramethylsilane TMS (C=0,00 ppm); (H= 0,00 ppm). - Các dụng cụ thủy tinh thường dùng trong phòng thí nghiệm. Khóa luận được thực hiện tại: Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 20

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 21

3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

N

Phân đoạn alcaloid phân cực (22, 23, 24)

Bột lá TNHC

HƠ

N

- Sắc kí cột chân không pha đảo -Dung môi nước – acid acetic (98:2)

Y U Q P.

Chiết SFE

Dịch chiết nước – acid acetic

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Cao alcaloid toàn phần -Phân bố lỏng – lỏng -Dung môi có độ phân cực tăng dần Cao ethyl acetat -Sắc kí cột chân không pha thuận -Dung môi có độ phân cực tăng dần

PĐ1

PĐ21

PĐ2

PĐ22

PĐ23

O Ạ Đ

T

- Kiềm hóa bằng NH4OH đến pH = 9 - Lắc với cloroform

PĐ25

PĐ24

0B

222 Phân đoạn alcaloid phân cực Hình 3.1 Qui trình thực hiện của nhóm nghiên cứu TNHC (2013)

ÓA

0 0 1

Bột lá TNHC sau khi tẩm cồn 96% được chiết bằng thiết bị chiết lỏng siêu tới hạn

điều kiện 200 bar, 50 oC với dung môi CO2 lỏng STH, thu được cao STH. Cao này

H Í

được hòa trong acid HCl 1%, dịch acid được kiềm hóa bằng NH4OH đến pH

-L

T

N Ầ R

NG HƯ

Dịch chiết nước – acid acetic - Lắc với n-butanol

Dịch chiết cloroform - Cô đến cắn Cao cloroform - Phân lập và tinh chế

Dịch chiết n-butanol - Cô đến cắn Cao n-butanol - Phân lập và tinh chế

khoảng 9-10, sau đó chiết với cloroform đến khi không còn phản ứng của alcaloid. Dịch cloroform được cô thu hồi dung môi đến cao đặc chứa alcaloid toàn phần. Cao

N Á O

Alcaloid tinh khiết

Alcaloid tinh khiết

UV, IR, MS, NMR

UV, IR, MS

alcaloid toàn phần được hòa tan lần lượt vào các dung môi có độ phân cực tăng dần, lọc lấy dịch chiết và cô thu hồi dung môi thu được cao alcaloid tương ứng với từng

N À Đ

T

loại dung môi. Lấy cao ethyl acetat, qua quá trình sắc kí cột chân không pha thuận thu được 25 phân đoạn.

N Ễ I

Hình 3.2 Qui trình phân lập alcaloid từ các phân đoạn phân cực

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 22

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 23

3.2.1. Khảo sát các phân đoạn alcaloid tách từ cao ethyl acetat

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Sử dụng phương pháp sắc kí lớp mỏng để kiểm tra và lựa chọn phân đoạn alcaloid

4.1. KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN ALCALOID TÁCH TỪ CAO

phân cực từ cao ethyl acetat.

ETHYL ACETAT

3.2.2. Tách alcaloid phân cực bằng kĩ thuật sắc kí cột chân không pha

4.1.1. Chọn lựa những phân đoạn phân cực

đảo

4.1.1.1. Tiến hành

Các bước tiến hành như sau:

Kiểm tra bằng SKLM

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Bước 1: Nạp silica gel pha đảo lên cột và ổn định cột.

O Ạ Đ

Y U Q P.

N

HƠ

N

T

Mục tiêu: Chọn những phân đoạn alcaloid phân cực

- Bước 2: Nạp mẫu với phương pháp nhồi cột khô. - Bước 3: Rửa giải bằng các hệ dung môi theo thứ tự độ phân cực giảm dần.

4.1.1.2. Kết quả

- Bước 4: Hứng các ống. Các ống này chứa alcaloid dạng muối. Kiềm hóa toàn bộ

Từ cao ethyl acetat qua quá trình sắc kí cột chân không pha thuận với các dung môi

thể tích của ống và chiết bằng CHCl3 hoặc n-butanol. Lấy lớp CHCl3 hoặc n-butanol

có độ phân cực tăng dần thu được 25 phân đoạn (Hình 3.1)

bốc hơi đến cắn.

N Ầ R

- Bước 5: Kiểm tra SKLM, gộp các ống giống nhau.

3.2.3. Xác định cấu trúc các hợp chất alcaloid phân lập được bằng các phương pháp phổ nghiệm

hợp chất đã phân lập được. Định danh các hợp chất dựa vào các thông số của các

A Ó H

0B

0 0 1

Sử dụng phương pháp phổ nghiệm MS, UV, IR, NMR để xác định cấu trúc của các

NG HƯ

T

phổ hoặc so sánh với các alcaloid chiết từ TNHC đã xác cấu trúc trong các tài liệu tham khảo.

N Ễ I

N À Đ

N Á O

-

Í L

T

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 24

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 25

N

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

F3

Hình 4.1 SKLM kiểm tra 25 phân đoạn của nhóm TNHC

O Ạ Đ

Y U Q P.

HƠ

N

T

Hình 4.2 SKLM so sánh F3 với các phân đoạn 22, 23, 24

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

NG HƯ

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

4.1.1.3. Nhận xét

Gộp cả 3 phân đoạn 22, 23, 24 thu được cao toàn phần phân cực có khối lượng

Từ Hình 4.1, các alcaloid trong các phân đoạn 22 – 25 phân cực hơn các alcaloid

N Ầ R

trong các phân đoạn 1 – 21. Do đó, các phân đoạn 22 – 25 được chọn để khảo sát. Tuy nhiên, khối lượng cao trong phân đoạn 25 quá nhỏ nên chỉ chọn các phân đoạn 22, 23, 24. Bảng 4.1 Khối lượng cao trong các phân đoạn phân cực Phân đoạn

Khối lượng cao (mg)

22

332,7

23

392,5

24

251,4

22 +23 + 24

976,6

N Á O

-

Í L

A Ó H

0 0 1

0B

977,6 mg.

T

Alcaloid 6- hydroxypowellin (F3) là một trong những alcaloid phân cực đã được nhóm nghiên cứu TNHC phân lập được trong những năm qua. Khi so sánh với

T

alcaloid này thì các alcaloid của phân đoạn 22 – 24 đều phân cực hơn.

N Ễ I

N À Đ

Hình 4.3 SKLM vết cao toàn phần phân cực Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 26

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 27

4.1.2. Kiểm tra cao toàn phần của các phân đoạn phân cực

Bước 1: Nạp 12 g silica gelRP C18, hoạt hóa và ổn định cột bằng 30 ml methanol.

4.1.2.1. Tiến hành

Bước 2: Nạp 0,8 g mẫu theo phương pháp nhồi cột khô.

Tiến hành bằng phương pháp SKLM

Bước 3: Khai triển sắc kí cột chân không với hệ dung môi nước – acid acetic (98:2),

4.1.2.2. Kết quả

hứng mỗi ống 10 ml.

Cloroform-Methanol-Amoniac (7:1:0,05) Cloroform-Methanol-Amoniac (1:1:0,05)

N Ầ R

Hình 4.4 SKLM kiểm tra vết cao toàn phần phân cực

4.1.2.3. Nhận xét

B 0 0 0 1

Cao toàn phần phân cực cho những vết alcaloid dưới vết 6- hydroxypowellin làm alcaloid đối chiếu.

4.2. TÁCH PHÂN ĐOẠN ALCALOID BẰNG KĨ THUẬT SẮC KÍ CỘT

ÓA

CHÂN KHÔNG PHA ĐẢO

-H

4.2.1. Tiến hành tách cao toàn phần qua cột sắc kí chân không pha đảo 4.2.1.1. Điều kiện tiến hành Cột thủy tinh đường kính 20 x 3 cm

N Á O

Chất hấp phụ: 12 g silica gel RP C18

T

Chất phân tích: 800 mg (0,8 g) cao toàn phần

N À Đ

Dung môi khai triển: nước – acid acetic (98:2)

-

LÍ

T

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

N

HƠ

N

T

Hình 4.5 Cột sắc kí chân không triển khai tách cao toàn phần phân cực

4.2.1.3. Kết quả Sau khi triển khai kĩ thuật sắc kí cột chân không pha đảo thu được 87 ống.

4.2.2. Kiểm tra alcaloid trong các ống 4.2.2.1. Tiến hành Bước 1: Kiềm hóa từng ống đến pH 9 bằng NH4OH. Bước 2: Từng ống được lắc phân bố với cloroform. Dịch cloroform được bốc hơi đến cắn và kiểm tra vết alcaloid có trong mỗi ống bằng phương pháp SKLM.

4.2.2.2. Kết quả 87 ống cho kết quả ở Hình 4.6, Hình 4.7 và Bảng 4.2

4.2.1.2. Các bước thực hiện

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 28

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 29

Bảng 4.2 Kết quả các ống dịch chiết cloroform Phân

Ống

Hệ dung môi

N

Tỉ lệ

Màu sắc

Vết alcaloid

98:2

Vàng

Alcaloid phân cực

nhạt

mạnh

đoạn 1

1 – 11

Nước – Acid acetic

2

12 – 38

Nước – Acid

98:2

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

acetic

Vàng rất Alcaloid phân cực nhạt

mạnh + Tạp kém phân cực

3

39 – 87

Nước – Acid

98:2

acetic

Không

Tạp kém phân cực

màu

0B

N À Đ

N Á O

-

T

LÍ

-H

ÓA

0 0 1

T

N Ầ R

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

HƠ

N

T

Hình 4.7 SKLM (TT Dragendorff) các ống dịch chiết cloroform Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

4.2.2.3. Nhận xét Qua Hình 4.6 và Hình 4.7, từ ống 1 – 11 có các alcaloid phân cực mạnh.

4.2.3. Cao cloroform 4.2.3.1. Tiến hành Kiểm tra các ống từ 1 – 11 bằng SKLM

4.2.3.2. Kết quả

Hình 4.6 SKLM (UV 254) các ống dịch chiết cloroform

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 30

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 31

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

Hình 4.8 SKLM kiểm tra các ống 1 – 4

ẦN

N Á O

ÓA

B 0 0 0 1

-H

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

N À Đ

T

Hình 4.10 SKLM cao cloroform

TR

4.2.4. Cao n-butanol 4.2.4.1. Tiến hành Dịch chiết nước kiềm của 87 ống sau khi lắc với cloroform được tiếp tục lắc phân bố với n-butanol. Dịch n-butanol được bốc hơi đến cắn và kiểm tra vết alcaloid có trong mỗi ống bằng SKLM.

4.2.4.2. Kết quả Bảng 4.3 Kết quả các ống dịch chiết n-butanol Ống

Hệ dung môi

Tỉ lệ

Màu sắc

1 – 10

Nước – Acid

98:2

Vàng

Alcaloid phân cực + Tạp

nhạt

kém phân cực

acetic

Hình 4.9 SKLM kiểm tra các ống từ 5 – 11

4.2.3.3. Nhận xét

N

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

Í L -

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

HƠ

T

Có thể nhập cắn từ các ống 1 – 11 để tách alcaloid phân cực tan trong cloroform.

11 – 38

Nước – Acid

98:2

acetic 39 – 87

Nước – Acid acetic

Vết alcaloid

Vàng rất Alcaloid nhạt dần nhạt

98:2

Không

Không thấy có alcaloid

màu

Sau khi nhập thu được cao mới, gọi là cao clorofom có khối lượng 100 mg.

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 32

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 33

4.2.4.3. Nhận xét

N

Có thể nhập cắn từ ống 1 – 10 để tách alcaloid phân cực mạnh tan trong n-butanol.

HƠ

Sau khi nhập thu được cao mới gọi là cao n-butanol có khối lượng 50 mg.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

UV 254

ẦN

UV 365

N À Đ

N Á O

-

Í L

A Ó H

T

Hình 4.11 SKLM các ống dịch chiết n-butanol

B 0 0 0 1

TR

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

N

T

Hình 4.12 SKLM cao n-butanol

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

4.2.5. Nhận xét Từ 0,8 g cao toàn phần, qua kĩ thuật sắc kí cột chân không pha đảo thu được 100 mg cao clorofom và 50 mg cao n-butanol chứa các alcaloid có độ phân cực mạnh.

Hình 4.13 SKLM cao toàn phần, cao cloroform và cao n-butanol Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 34

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 35

4.3.2.2. Kết quả

4.3. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT ALCALOID

N

4.3.1. Quy ước gọi tên các hợp chất alcaloid Do alcaloid hướng đến là các alcaloid phân cực được phân lập từ 2 cao cloroform

Y U Q P.

và cao n-butanol nên : -

Alcaloid phân lập được từ cao cloroform gọi là AL-1

-

Alcaloid phân lập được từ cao n-butanol gọi là AL-2

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

4.3.2. Phân lập và tinh chế hợp chất alcaloid AL-1 trong cao cloroform 4.3.2.1. Tiến hành Cao cloroform được giữ lạnh ở nhiệt độ 0 – 50C, sau đó rửa nhanh cao cloroform lạnh bằng methanol lạnh (0 – 50C), lọc qua phễu thủy tinh xốp, thu được dịch màu vàng và AL-1 tinh khiết. Kiểm tra bằng SKLM, AL-1 cho vết tắt quang ở UV 254, không phát quang ở UV 365 và dương tính với thuốc thử Dragendorff.

Cao cloroform lạnh (100 mg) (0 – 50C) - Rửa nhanh bằng MeOH lạnh

ÓA

(0 – 50C) - Lọc qua phễu thủy tinh xốp

N Á O

AL-1 (40 mg)

N Ễ I

N À Đ

B 0 0 0 1

H Í

-L

T

ẦN

Dịch vàng

TR

NG HƯ

O Ạ Đ

HƠ

N

T

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05) Hình 4.15 SKLM kiểm tra vết AL-1

4.3.2.3. Nhận xét AL-1 không phát quang ở UV 365, cho vết tắt quang ở UV 254 và phản ứng dương tính với thuốc thử Dragendorff.

4.3.3. Phân lập và tinh chế hợp chất alcaloid AL-2 trong cao n-butanol 4.3.3.1. Tiến hành Cao n-butanol được giữ lạnh ở nhiệt độ 0 – 50C, sau đó rửa nhanh cao n-butanol lạnh bằng cloroform lạnh (0 – 50C), lọc qua phễu thủy tinh xốp, thu được dịch vang đậm và tủa vàng nhạt. Tiếp tục rửa nhanh tủa vàng nhạt bằng methanol lạnh (0 – 50C), lọc qua phễu thủy tinh xốp thì thu được dịch vàng nhạt và AL-2 tinh khiết. Kiểm tra bằng SKLM, AL-2 cho vết tắt quang ở UV 254, cho vết phát quang màu xanh ở UV 365 và cho màu đỏ cam với thuốc thử Dragendorff.

Hình 4.14 Sơ đồ tinh chế AL-1

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 36

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 37

4.3.3.2. Kết quả UV 254

UV365

Cao n-butanol lạnh

- Rửa nhanh bằng

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

cloroformlạnh (0 – 50C) -Lọc qua phễu thủy tinh xốp

Tủa vàng nhạt

- Rửa nhanh bằng methanol lạnh (0 – 50C) -Lọc qua phễu thủy tinh xốp

Í L -

-H

ÓA

Dịch vàng nhạt

AL-2 (10 mg)

N À Đ

N Á O

T

Hình 4.16 Sơ đồ tinh chế AL-2

N Ễ I

ẦN

Dịch vàng đậm

B 0 0 0 1

TR

NG HƯ

O Ạ Đ 1

N

Y U Q P.

(50 mg) (0 – 50C)

N

HƠ

TT Dragendorff

T

2

1

2

1

2

Hình 4.17 SKLM kiểm tra vết AL-2

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

4.3.3.3. Nhận xét AL-2 cho vết tắt quang ở UV 254, cho vết phát quang màu xanh ở UV 365 và phản ứng dương tính với thuốc thử Dragendorff.

4.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC AL-1 VÀ AL-2 4.4.1. Khảo sát cấu trúc AL-1 Mở đầu AL-1 là một alcaloid phân cực mạnh, thuộc phân đoạn phân cực tách từ cao ethyl acetat của cao alcaloid toàn phần chiết từ lá TNHC.

Mô tả AL-1 kết tinh (trong CHCl3) dưới dạng tinh thể hình kim không màu. AL-1 tan trong CHCl3, MeOH, kém tan trong n-hexan.

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 38

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 39

Tính chất

N

- Khi SKLM trên bản silica gel (Merck) với nhiều hệ dung môi, AL-1 vẫn cho duy

HƠ

nhất 1 vết. Vết trên bản mỏng này không phát quang dưới UV 365 nm, tắt quang rõ dưới UV 254, cho màu đỏ cam với thuốc thử Dragendorff.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

UV 365

UV 254

Y U Q P.

TT Dragendorff

Hình 4.18 Sắc kí đồ của AL-1 Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05) -Phổ UV (MeOH) của AL-1 cho λ max ở 287 nm.

A Ó H

0 0 1

0B

T

N Ầ R

NG HƯ

O Ạ Đ

N

T

Hình 4.19 Phổ UV (MeOH) của AL-1

-Phổ IR (KBr) của AL-1 cho các band dao động của hydroxy (3448), vòng thơm, nhóm chức carbonyl (1712).

-

Í L

-Phổ khối EI-MS+ của AL-1 cho các phân mảnh có m/z 274, 296 phù hợp với sự

N Á O

phân mảnh của cấu trúc có M = 273. Một công thức cấu tạo phù hợp của AL-1 sẽ là C16H19NO3 = 273 (Ω = 8).

N Ễ I

N À Đ

T

Hình 4.20 Phổ IR (KBr) của AL-1

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 40

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 41

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Bảng 4.4 Các dữ liệu phổ NMR (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1

Hình 4.21 Phổ EI-MS+ của AL-1

Nhận định sơ bộ Rất có khả năng trong cấu trúc AL-1 có ít nhất: -

1 nhóm chức hydroxy linh động

-

1 nhóm chức carbonyl (ceton/este/lacton?)

-

1 vòng thơm

ẦN

Al-1 được tiếp tục đo phổ NMR (dung môi đo MeOD, máy Bruker Avance 500

B 0 0 0 1

MHz) với các kỹ thuật 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và COSY cho phép nhận định như sau, AL-1 có : -

1 nhóm CH3, khả năng là >N−CH3 (δC 43.0 ppm, δH 2.38 ppm)

-

5 nhóm CH2, nhưng không có nhóm methylen dioxy

-

3 nhóm CH

-

7 nhóm CIV ( trong số này có 1 ceton có δC 212.8 ppm)

-L

H Í

ÓA

TR

N Á O

N Ễ I

N À Đ

T

COSY (H → H-n)

DEPT

δC ppm

δH m, (J, Hz)

HMBC (H → C-n)

1

>C=O

212.8

−

−

2

=C−O

147.4

−

−

−

3

=C−O

142.1

−

−

−

4

=C<

133.6

−

−

−

5

=C<

131.4

−

−

6

=C<

128.0

−

−

7

CH

Đ

NG HƯ

Y U Q P.

T −

ẠO

−

6.59 d (8 Hz)

C3, C4, C10

116.6

6.62 d (8 Hz)

C2, C6

4.76 s

C1, C10, C11, C14,

4.09 d (14.5)

C1, C4, C10, C11, C12

3.63 d (14.5)

C2, C4, C6, C7, C11, C13

3.19 t (13.5)

C4, C6, C7, C11, C13

8

CH

9

CH

89.4

10

−O−CH2

60.7

>N−CH2

55.4

12

C

49.5

−

13

>N-CH3

43.0

2.38 s

C10, C11, C12

2.23 m 14

>CH2

37.4

C13, C16

1.81 m

C4, C11, C12

2.32 m >CH2

36.3

C1 , C12

1.94 m

C1 , C4

2.40 m >CH2

30.0

C4

1.92 m

C1

11

15

16

Ơ H N

123.9

3.08 d (14.0)

Khai thác thông tin trên các phổ đồ NMR của AL-1, cho phép lập bảng dữ liệu NMR của AL-1 theo Bảng 4.4 sau đây:

N

Pos.

−

C16

−

−

−

−

Ghi chú : Tín hiệu của C-12 (δC 49.5 ppm) bị lẫn trong dung môi đo (MeOD), được phát hiện nhờ quan sát phổ HMBC ( có cross peak giữa δC 49.5 ppm và δH 1.81; 2.32; 2.38 ppm.

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 42

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 43

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Các phổ đồ quan trọng của AL-1 được ghi nhận như sau

N

0B

N À Đ

N Á O

-

Í L

N

T

Hình 4.24 Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của AL-1

Hình 4.22 Phổ 13C-NMR (MeOD, 125 MHz) của AL-1

A Ó H

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

HƠ

0 0 1

N Ầ R

T

T

Hình 4.23 Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của AL-1

N Ễ I

Hình 4.25 Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của AL-1

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 44

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 45

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

Hình 4.26 Phổ DEPT (MeOD, 125 MHz) của AL-1

0B

1

N Ễ I

N À Đ

N Á O

-

Í L

A Ó H

0 0 1

N Ầ R

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

HƠ

N

T

Hình 4.28 Phổ HSQC (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1

T

T

1

Hình 4.27 Phổ H- H- COSY (MeOD, 500 MHz, vùng < 4,2 ppm) của AL-1

Hình 4.29 Phổ HSQC (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 46

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 47

Với các thông tin khai thác được thì AL-1 (C16H19NO3 = 273) có:

N

-

1 nhóm CH3, có khả năng là CH2−N−CH3

-

5 nhóm CH2, trong đó có 1 −CH2O− và rất có thể có 1 −N−CH2 cùng 3 CH2 sp3

-

Y U Q P.

HƠ

N

3 nhóm CH, trong đó có 1 cặp =CH− kế cận nhau trong vòng ( vòng thơm?) với J = 8 Hz cùng 1 nhóm CH−O có δC downfield khá mạnh (tới 89.4 ppm).

T

−CHO− này thì không có H lân cận (δH 4.76 s)

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

-

O Ạ Đ

1 nhóm ceton cùng 6 CIV khác, trong 6 CIV này chỉ có 1 CIVsp3 (δC 49.5 ppm). Còn lại 5 CIV thuộc vòng thơm với ít nhất 2 CIV này gắn oxy (δC 147.4

NG HƯ

và 142.1 ppm)

AL-1 không được có: Hình 4.30 Phổ HMBC (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1

0B

N À Đ

N Á O

-

LÍ

ÓA

-H

T

Hình 4.31 Phổ HMBC (MeOD, máy 500 MHz) của AL-1

N Ễ I

0 0 1

T

N Ầ R

-

Nhóm methylendioxy vòng

-

OMe, ester

-

CMe, lacton

Số vòng + số ∆ của AL-1 là Ω = 8 Với (1× CH3) + (5×CH2) + (3×CH) + ( 6×CIV) + (1 ceton) thì AL-1 đã xuất hiện ít nhất C16H16NO, còn lại 3H và 2O. 2O này phải ở vòng thơm (C2 và C3) nhưng phải có O−CH2 (C10). Với các chi tiết này chúng tôi tra cứu tất cả những công thức của alcaloid trong TNHC nói riêng cũng như các alcaloid trong chi Crinum và họ Amaryllidaceae nói chung nhưng vẫn chưa thấy công thức phù hợp với AL-1. Việc tra cứu dữ liệu trong thư viện phổ của máy Bruker Avance 500 (Viện Hóa học Hà Nội) cũng chưa gặp cấu trúc phù hợp. Việc khảo sát công thức hóa học của AL-1 vẫn đang được tiếp tục.

4.4.2. Khảo sát cấu trúc AL-2 Mở đầu

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 48

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 49

AL-2 là một alcaloid phân cực mạnh, thuộc phân đoạn phân cực tách từ cao ethyl

-Phổ khối EI-MS+ của AL-2 cho các phân mảnh có m/z 290, 312 phù hợp với sự

acetat của cao alcaloid toàn phần chiết từ lá TNHC.

phân mảnh của cấu trúc có M = 289.

Mô tả AL-2 kết tinh (trong MeOH) dưới dạng tinh thể hình kim không màu.

Y U Q P.

AL-2 tan trong n-butanol, methanol

Tính chất

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

-Khi SKLM trên bản silica gel (Merck) với nhiều hệ dung môi, AL-2 vẫn cho duy nhất 1 vết. Vết trên bản mỏng này cho vết phát quang màu xanh dưới UV 365, tắt quang rõ dưới UV 254, cho màu đỏ cam với thuốc thử Dragendorff. UV 365

UV 254

TT Dragendorff

-

Í L

A Ó H

B 0 0 0 1

T

N Ầ R

NG HƯ

O Ạ Đ

N

HƠ

N

T

Hình 4.33 Phổ UV (MeOH) của AL-2

Hình 4.32 Sắc kí đồ của AL-2

N Á O

Dung môi Cloroform – Methanol – Amoniac (1:1:0,05)

T

-Phổ UV (MeOH) của AL-2 cho λ max ở 289 nm

N À Đ

-Phổ IR (KBr) của AL-2 cho các band dao động của hydroxy (3423), nhóm chức carbonyl (1706).

N Ễ I

Hình 4.34 Phổ IR (KBr) của AL-2

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 50

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 51

-AL-2 vì lượng chất tinh khiết quá ít không đủ để đo phổ NMR nên không thể

N

biện giải cấu trúc.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hình 4.35 Phổ EI-MS+ của AL-2

4.5. BÀN LUẬN Về tách phân đoạn sắc ký cột chân không với chất hấp phụ là silica gel pha đảo - Tiến hành sắc ký cột chân không với silica gel pha đảo thì tiết kiệm được dung môi hữu cơ, dung môi dùng là nước – acid acetic (98:2), ít độc hại. Đồng thời, các alcaloid cần phân lập là các alcaloid có độ phân cực mạnh nên với kĩ thuật sắc kí cột

N Ầ R

chân không pha đảo sẽ ra khỏi cột ở thời gian sớm hơn, tiết kiệm được rất nhiều thời gian và công sức.

0B

-Vì lượng cao toàn phần phân cực quá ít (0,8 g) nên nếu triển khai bằng kĩ thuật sắc kí cột chân không pha thuận sẽ bị hấp phụ một phần, làm giảm hiệu suất tách alcaloid đi nhiều lần.

A Ó H

0 0 1

NG HƯ

O Ạ Đ

Y U Q P.

HƠ

N

T

T

-Đối với dịch chiết cloroform và dịch chiết n-butanol, những phân đoạn sau (những phân đoạn không được gộp lại để phân lập và tinh chế alcaloid) chứa lượng cao quá

Í L

ít và có nhiều tạp kém phân cực nên không được gộp lại.

Về biện giải cấu trúc AL-1, AL-2

N Á O

-

-AL-1 mặc dù đã xác định hết tất cả các dữ liệu phổ nhưng vì trong thời gian ngắn không thể giải ra chính xác cấu trúc AL-1. Cho đến nay, chưa có tài liệu chi Crinum

T

công bố dữ liệu phổ NMR của 1 chất trùng với AL-1. Do đó, có khả năng AL-1 là

N À Đ

chất mới được phân lập từ lá TNHC nói riêng và trong chi Crinum nói chung.

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 52

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

5.1. KẾT LUẬN

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

Sau một thời gian thực hiện khóa luận, đề tài đã đạt được một số kết quả sau:

[1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở

thuật, Hà Nội, tr. 265, 787-789.

ký cột cổ điển, sắc ký cột chân không, sắc ký lớp mỏng và các phương pháp xác

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

định hợp chất hữu cơ. Về thực nghiệm, đề tài đã đạt được một số kết quả phù hợp

T

[3] Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, Quyển III, Nhà xuất bản trẻ Tp.

với mục tiêu ban đầu như sau:

O Ạ Đ

HCM, tr. 500.

Tách 0.8 g cao methanol toàn phần bằng kĩ thuật sắc kí cột chân không pha

[4] Võ Thị Bạch Huệ (1999), Góp phần nghiên cứu các cây thuốc có tác dụng trị

đảo thu được 2 cao mới có chứa các alcaloid có độ phân cực mạnh là cao

ung thư – Chuyên khảo cây Trinh nữ hoàng cung, luận án Tiến sĩ dược học,

NG HƯ

trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh.

cloroform và cao n-butanol.

[5] Trần Công Khánh (1998), “Đặc điểm thực vật của cây Hoàng cung trinh nữ

Phân lập và tinh chế được 2 alcaloid có độ phân cực mạnh từ cao cloroform

ẦN

và cao n-butanol, đó là AL-1 và AL-2 -

Y U Q P.

[2] Võ Văn Chi, (2003), Từ điển thực vật thông dụng, Tập I, NXB Khoa học và kỹ

alcaloid có trong cây, nhóm hợp chất alcaloid, các kỹ thuật chiết xuất, kỹ thuật sắc

-

N

Việt Nam, tập II, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội, tr. 1018-1020.

Tham khảo một số tài liệu có liên quan đến đề tài TNHC như các thành phần

-

N

HƠ

Xác định cấu trúc của AL-1 bằng các phương pháp phổ nghiệm (UV, IR, MS, NMR)

0B

5.2. ĐỀ NGHỊ Nếu được tiếp tục tiến hành đề tài, chúng tôi sẽ: -Dùng Xray để biện giải cấu trúc AL-1.

A Ó H

0 0 1

-Tiến hành đo phổ NMR của AL-2, sau đó biện giải cấu trúc của AL-2.

Í-

-Tiến hành phân lập alcaloid từ các phân đoạn còn lại để bổ sung thêm vào danh

-L

sách các alcaloid chiết từ lá cây TNHC được trồng tại Việt nam.

N Á O

- Tiến hành phân lập các alcaloid đơn chất với khối lượng lớn dùng làm chất chuẩn.

TR

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)”, Tạp chí Dược liệu, 3, 1998, tr. 67-68.

[6] Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học, tập II, NXB Y học, Hà Nội, tr. 14-16. [7] Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam,NXB Y học, Hà Nội, tr. 511-512. [8] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM. [9] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM. [10] Nguyễn Hồng Thiên Thanh (2011), Chiết tách và phân lập alcaloid từ cao lá Trinh nữ hoàng cung, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, tr. 3. [11] Phạm Thiệp, Lê Văn Thuần, Bùi Xuân Chương (2000), Cây thuốc, bài thuốc và biệt dược, NXB Y học, tr. 315-316.

- Thử nghiệm tác dụng dược lý hoặc tác dụng sinh học của các hợp chất alcaloid

[12] Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Nguyễn Thị Thuận, Trần Phi Hoàng Yến, Võ Thị

tinh khiết đã phân lập được (đặc biệt trong phân đoạn phân cực mạnh)để chứng

Bạch Huệ (2012), “Khảo sát tác động kháng suy giảm trí nhớ theo hướng

minh hoạt tính của các alcaloid chiết từ cây TNHC.

kháng cholinesterase của cao chiết từ cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum

N Ễ I

N À Đ

T

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

latifolium L. Amaryllidaceae) trên chuột nhắt trắng”, Tạp chí Dược học, 437,

[23] James McNulty a, Jerald J. Nair (2009), “Structure-activity studies on the

tr. 17-24.

II,Crinumalcaloids:

Crinine-type

Alcaloids”,International

Journal

of

Pharmaceutical sciences and research, 3(9), 3091-3100.

Việt Tuyền(2005), "Phân lập và xác định cấu trúc một số alcaloid của lá Trinh

T

[25] Marcel Jenny, Angela Wondrak (2011), “Crinum Latifolium Leave Extracts

nữ hoàng cung Crinum latifolium L. Amaryllidaceae", Hội nghị Khoa học và

O Ạ Đ

Suppress Immune Activation Cascades in Peripheral Blood Mononuclear Cells

công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc, (3), tr. 426-429.

and Proliferation of Prostate Tumor Cells”,Scientia Pharmaceutica, 79, 323–

[15] Bộ môn Dược liệu −Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2006), Giáo

[26] Nguyen H, NAM and You Y, JAE (2009), “NF-κB Inhibitory Activities of the

[16] Bộ môn Dược liệu −Trường Đai học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2006),

Methanol Extracts and some Constituents there in of some Vietnamese

Phương pháp nghiên cứu dược liệu, tr. 51–104.

N Ầ R

[17] Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm −Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh (2007), Giáo trình hóa phân tích, tập I, tr. 112-127. TÀI LIỆU TIẾNG ANH [18] Adewusi E,A, et al, (2012), “Cytotoxicity and AChEI activity of an isolated

ÓA

[19] C. W. Fenell, J. Van Staden (2001), “Crinum species in traditional and modern

H Í

medicine”, Journal of Ethnopharmacology, 78, 15-26.

0B

0 0 1

crinine alcaloid from Boophane disticha (Amaryllidaceae)”, Journal of Ethnopharmacology, 143, 572-578.

NG HƯ 335.

trình nhận thức dược liệu, tr. 188-189.

-L

[20] E. Zvetkova, et al (2001), “Aqueous extracts of Crinum latifolium and Camellia sinensis”,International Immunopharmacology, 2143–2150. [21] GhosalS. et al(1986), “Crinafoline and Crinafolidine, two anti-tumor alcaloids from Crinum latifolium”, Journal Chemical Research, S, 312 – 313. [22] Istvan Zupko, Borvala Rethy, Judit Hohmann, Joseph Molnar, Imre Ocsovszki

N À Đ

Y U Q P.

(2012), “Crinum; an endless source of bioactive principles: a review, Part

[14] Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Minh Vương, Nguyễn Lê

T

N

[24] John Refaat, Mohamed S. Kamel, Mahmoud A, Ramadan and Ahmed A. Ali

nghệ trẻ Đại học Y Dược Tp. HCM lần thứ 19, 10, tr. 39-43.

N Á O

HƠ

cells”, Phytochemistry, 70, 913–919.

trúc alcaloid của Trinh nữ hoàng cung”, Báo cáo tại Hội nghị Khoa học công

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

N

lycorine pharmacophore: A potent inducer of apoptosis in human leukemia

[13] Nguyễn Hữu Lạc Thủy, Võ Thị Bạch Huệ (2006), “Phân lập và xác định cấu

and George Falkay (2009), “Antitumor activity of alcaloids derived from

T

Medicinal Plants”, Scientia Pharmaceutica, 77, 389–399.

[27] Nguyen H.N, et al., (2004), “New constituents from Crinum latifolium with inhibitory effects against tube-like formation of human umbilical venous endothelial cell”, Natural Product Research, 18(6), 485-491. [28] Nguyen T.N.Tram, et al., (2002), “Review Crinum L.(Amaryllidaceae)”, Fitoterapia, 73, 183-208. [29] Nguyen Thi Ngoc Tram, I. Yanchev, E. Zvetkova, J. Dineva, E. Katzarova, P. Shalamanov G. Kostov, D. Svilenov, I. Ilieva (2001), “Retarded growth of chemically induced with 20-methylcholanthrene tumours in rats under the action of cold-hot aqueous extracts ( decoctions ) from Vietnamese plant Crinum latifolium ( L .)” Experimental Pathology And Parasitology, 9–12. [30] Shibnath Ghosal, Kulwant S, Saini and August W,Frahm (1983), “Alcaloids of Crinum Latifolium”, Phytochemistry, 22(10), 2305 – 2309. [31] Shibnath Ghosal, Kulwant S, Saini and Sushma (1985), “Crinumalcaloids: their chemistry and biology”, Phytochemistry, 24(10), pp. 2141 – 2156.

Amaryllidaceae species”, in vivo230, 41-48.

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

PHỤ LỤC

[32] Shibnath Ghosal, Sankara Unnikrishnan and Sushil K,Singh (1989), “Occurrence of two epimeric alcaloids and metabolism compared with

“Acetylcholinesterase inhibitory activity of some Amaryllidaceae alcaloids [34] Tram NG. TH. NG.,et al. (2002) “GC-MS of Crinum latifolium L.Alcaloids”,

T

O Ạ Đ

Bã dược liệu

NG HƯ

Ngấm kiệt bằng

ẦN

N Ễ I

N À Đ

N Á O

T

-L

H Í

N

CO2 / Cồn 96%

Z. naturforsch, 57c, pp. 239-242.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Y U Q P.

Bột lá TNHC

and Narcissus extracts”, Life Science,71, 2521–2529.

ÓA

HƠ

Chiết cao alcaloid toàn phần từ lá cây TNHC bằng phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn

[33] Susana Lo´pez, Jaume Bastida, Francesc Viladomat, Carles Codina (2002),

B 0 0 0 1

N

PHÂN ĐOẠN PHÂN CỰC CỦA CAO ALCALOID

lycorine in Crinum latzfolzum”, Phytochemistry, 28(9), 2585 – 2587.

TR

Dịch chiết SFE

Thu hồi dung môi

cồn 50% + HCl 1%

Dịch chiết cồn – acid - dd NH4OH đđ, pH≈ 7 - Lắng, lọc - BM đến còn 1/3 thể tích

Dịch lọc - dd NH4OH đđ, pH≈ 9-10 - Chiết bằng CHCl3

Dịch CHCl3 Thu hồi dung môi

Cao alcaloid sau SFE

Cao SFE HCl 1% Siêu âm, lọc

Dịch acid - dd NH4OH đđ, pH≈ 9-10 - Chiết bằng CHCl3

Dịch CHCl3 Thu hồi dung môi

Cao alcaloid toàn phần

Hình PL1.1. Sơ đồ chiết cao alcaloid toàn phần bằng phương pháp SFE

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Từ 100 kg bột lá TNHC thu được 10 kg cao STH. Sau đó, chiết được 150g cao AL-

Vết 1: dịch chiết ethyl acetat

STH hiệu suất chiết 0,15%.

Vết 2: dịch chiết cloroform

N

Vết 3: dịch chiết erther ethylic

Y U Q P.

Vết 4: dịch chiết n-hexan

HƠ

N

Tách phân đoạn alcaloid phân cực bằng kĩ thuật sắc kí cột chân không pha thuận

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Điều kiện tiến hành:

O Ạ Đ

T

- Cột thủy tinh đường kính 50 x 4 cm - Mẫu phân tích: 3 g cao ethyl acetat

NG HƯ

- Chất hấp phụ: 90 g silica gel (Merck) cỡ hạt 0,015 - 0,04 mm. Hình PL1.2. Cao alcaloid toàn phần

Hình PL1.3. Vết cao alcaloid toàn phần

- Dung môi khai triển: n-hexan, hỗn hợp n-hexan và cloroform, cloroform và

Dung môi khai triển cloroform-methanol– ammoniac (9:1 : 0,05)

N Ầ R

Nhận xét : Cao có thể chất vàng óng, đồng nhất và có mùi thơm đặc trưng Tách phân đoạn alcaloid phân cực bằng phương pháp phân bố lỏng – lỏng

0B

Hòa 5 g cao alcaloid toàn phần vào 20 ml các dung môi được chọn: n-hexan, ether

0 0 1

ehtylic, cloroform và ethyl acetat. Lọc lấy dịch chiết, cắn sau lọc được thực hiện lặp

lại 3 lần. Dịch lọc được thu hồi dung môi để được cao alcaloid tương ứng với từng loại

A Ó H

dung môi. Kiểm tra các dịch chiết cao bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng.

N À Đ

N Á O

-

Í L

T

methanol.

Các bước tiến hành: - Nạp chất hấp phụ là silica gel pha thuận lên cột ổn định cột bằng 250 ml n-hexan. - Nạp mẫu theo phương pháp nhồi cột khô. - Khai triển cột bằng các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần dần: n-hexan, hỗn hợp n-hexan và cloroform, cloroform và methanol. - Hứng các phân đoạn, mỗi phân đoạn 20 ml. Kết quả: Qua quá trình tách phân đoạn alcaloid bằng kĩ thuật sắc kí cột chân không pha thuận với các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần thu được 25 phân đoạn.

T

Hình PL1.4. SKLM để kiểm tra dịch chiết từ cao alcaloid toàn phần Dung môi khai triển aceton – cloroform – ammoniac (10: 3: 0,05).

N Ễ I

D

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial