Nghiên cứu xác định môt số chất cấm trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS/MS)

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

vectorstock.com/1593604

Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection

Nghiên cứu xác định môt số chất cấm trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS/MS) WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM

Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ KHÁNH HUYỀN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT CẤM TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2020

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG THỊ KHÁNH HUYỀN Mã sinh viên: 1501223

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT CẤM TRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỔI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. HVCH Ngô Thị Duyên 2. PGS. TS. Lê Đình Chi Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương

HÀ NỘI - 2020

LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương dưới sự hướng dẫn của HVCH Ngô Thị Duyên và TS. Lê Đình Chi. Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới HVCH Ngô Thị Duyên và TS. Lê Đình Chi, hai người thầy đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và góp ý giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo công tác tại Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương và các cán bộ khoa Mỹ phẩm của Viện đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, chăm sóc, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và gặt hái nhiều thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2020 Sinh viên Dương Thị Khánh Huyền

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT6 DANH MỤC CÁC BẢNG8 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ9 ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .........................................................................................3 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .....................................................................3 1.1.1. Đặc tính của các GLU nghiên cứu ...............................................................3 1.1.2. Vài nét về Glucocorticoid ..............................................................................5 1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ ...................................................................9 1.2.1. Hệ thống HPLC .............................................................................................9 1.2.2. Khối phổ ......................................................................................................10 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................15 2.1. Đối tượng, nguyên liệu và trang thiết bị nghiên cứu .....................................15 2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu ............................................................................15

2.1.2.

Chất chuẩn, dung môi, hóa chất.............................................................15

2.1.3.

Thiết bị, dụng cụ phân tích ....................................................................16

2.2. Nội dung nghiên cứu.........................................................................................16 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................16 2.3.1.

Quy trình xử lý mẫu ...............................................................................16

2.3.2.

Xây dựng phương pháp phân tích ..........................................................17

2.3.3.

Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng ...................................17

2.3.4. trường

Ứng dụng xác định các GLU trong một số mẫu mỹ phẩm có mặt trên thị ………………………………………………………………………...21

2.3.5.

Phương pháp xử lý số liệu .....................................................................21

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................22 3.1. Quy trình chuẩn bị mẫu ...................................................................................22 3.1.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu ......................................................................22 3.1.2. Chuẩn bị dung dịch nền mẫu .......................................................................23 3.1.3. Chuẩn bị chuẩn nội ......................................................................................23 3.1.4. Chuẩn bị mẫu chuẩn ....................................................................................23 3.1.5. Chuẩn bị mẫu thử ........................................................................................24 3.1.6. Chuẩn bị mẫu tự tạo ....................................................................................25

3.2. Xây dựng phương pháp phân tích ..................................................................25 3.2.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện khối phổ ....................................................25 3.2.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký ........................................................30 3.2.3. Khảo sát và lựa chọn chuẩn nội ...................................................................32 3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................................33 3.3.1. Sự phù hợp của hệ thống (system suitability) .............................................33 3.3.2. Độ đặc hiệu – chọn lọc (selectivity) ............................................................33 3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ..........................35 3.3.4. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (linearity)............................................36 3.3.5. Độ chính xác của phương pháp (accuracy) .................................................37 3.4. Kết quả xác định GLU trong các mẫu mỹ phẩm dạng kem trên thị trường ...................................................................................................................................38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................41 KẾT LUẬN ..............................................................................................................41 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO1 PHỤ LỤC3 Phụ lục 1: Danh mục mỹ phẩm được kiểm tra3 Phụ lục 2: Kết quả thẩm định5 2.1. Kết quả thẩm định độ chụm trung gian của phương pháp5 2.2. Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại6 Phụ lục 3: Sắc ký đồ một số mẫu mỹ phẩm trên thị trường8

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt APCI

Giải thích Atmospheric pressure chemical ionization (Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển)

APPI

Atmospheric pressure photoionization (Kỹ thuật ion hóa ánh sáng ở áp suất khí quyển)

ASEAN

Association of South East Asia’s Nations (Liên hiệp các quốc gia Đông Nam Á)

ACN

Acetonitril

BMD

Betamethason dipropionat

CBP

Clobetasol propionate

CTPT

Công thức phân tử

DAD

Diod array detector (Detector mảng diod)

DXA

Dexamethason acetat

ESI

Electrospray ionization (Ion hóa kiểu phun sương điện)

GLU

Glucocorticoid

GLP

Good laboratory practice (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm)

HPLC

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HQC IS KLPT LC – MS

Internal standard (Chuẩn nội) Khối lượng phân tử Liquid chromatography – mass spectrophometry (Sắc ký lỏng khối phổ)

LC – MS/MS Liquid chromatography – Tandem mass spectrophometry (Sắc ký lỏng khối phổ hai lần) LOD

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ

Limit of quantitation (Giới hạn định lượng)

MeOH

Methanol

MQC MRM

Multiple Reaction Monitoring

PRS

Prednison

RSD

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)

S/N

Signal/ noise

SD

Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

SKĐ

Sắc ký đồ

TAA

Triamcinolon acetonid

TB TLC

Trung bình Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng )

TLTK

Tài liệu tham khảo

USFDA

United states – Food and Drug administration (Cục quản lý thực phẩm, dược phẩm Mỹ)

v/v VKNTTW

Volume/Volume (thể tích/thể tích) Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1: Một số phương pháp phân tích Glucocorticoid trong mỹ phẩm ....................7 Bảng 2. 1: Thông tin chất chuẩn sử dụng ......................................................................15 Bảng 3. 1: Nồng độ đường chuẩn của các GLC ............................................................23 Bảng 3. 2: Điều kiện khối phổ của các chất phân tích ..................................................29 Bảng 3. 3: Các thông số tối ưu của MS .........................................................................29 Bảng 3. 4: Chương trình gradient dung môi ..................................................................31 Bảng 3. 5: Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6) ....................33 Bảng 3. 6: Kết quả so sánh thời gian lưu của các pic ở mẫu tự tạo và mẫu chuẩn .......34 Bảng 3. 7: Kết quả so sánh tỷ lệ cường độ ion ở mẫu tự tạo và mẫu chuẩn .................35 Bảng 3. 8: Giá trị LOD và LOQ của 5 glucocorticoid ..................................................35 Bảng 3. 9: Kết quả khảo sát đường chuẩn của prednison, dexamethason acetat, clobetason propionat ......................................................................................................36 Bảng 3. 10: Kết quả khảo sát đường chuẩn của betamethason dipropionate, triamcinolon acetonid. ...................................................................................................36 Bảng 3. 11: Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp (n=6) ..........................37 Bảng 3. 12: Kết quả độ chụm trung gian của phương pháp (n=12) ..............................38 Bảng 3. 13: Thông tin sử dụng để định tính các GLU ..................................................39 Bảng 3. 14: Kết quả xác định GLU trong mẫu mỹ phẩm thực tế ..................................39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của betamethason dipropionat ..........................................3 Hình 1. 2: Công thức cấu tạo của clobetasol propionat ...................................................3 Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của dexamethason acetat ..................................................4 Hình 1. 4: Công thức cấu tạo của triamcinolon acetonid ................................................4 Hình 1. 5: Công thức cấu tạo của prednison ...................................................................5 Hình 1. 6: Sơ đồ hệ thống HPLC.....................................................................................9 Hình 1. 7: Sơ đồ khối cấu tạo các bộ phận của một khối phổ kế ..................................11 Hình 1. 8: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI...........................................................12 Hình 1. 9: Sơ đồ bộ phân tích tứ cực. ............................................................................13 Hình 1. 10: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba. .....................................14 Hình 3. 1: Quy trình chuẩn bị mẫu thử ..........................................................................24 Hình 3. 2: Phổ khối MS của dung dịch chuẩn Betamethason dipropionat với chế độ ESI (+) ...........................................................................................................................26 Hình 3. 3: Giản đồ mối quan hệ giữa cone voltage và số lượng ion có số khôi 505,25 Da đi vào bộ phân phân tích khối. .................................................................................26 Hình 3. 4: Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [BMD-H]+ ...............................................27 Hình 3. 5: Giản đồ năng lượng phân mảnh (m/z 505,25 -> 337,13) .............................28 Hình 3. 6: Giản đồ năng lượng phân mảnh (m/z 505,25 -> 411,22) .............................28 Hình 3. 7: SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 µm), pha động MeOH : Acid formic 0,1% (70:30, v/v) ................................................30 Hình 3. 8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn khi sử dụng chương trình gradient ............................31 Hình 3. 9: Sắc ký đồ của chuẩn glibenclamid ...............................................................32 Hình 3. 10: Sắc ký đồ của các mẫu ...............................................................................34 Hình 3. 11: Sắc ký đồ và S/N tại LOD của một số chất đại diện ..................................35 Hình 3. 12: Sắc ký đồ và S/N tại LOQ của một số chất đại diện ..................................36

ĐẶT VẤN ĐỀ Glucocorticoid (GLU) là một nhóm thuốc được chỉ định rộng rãi trong rất nhiều bệnh với hiệu quả điều trị đáng kể và đôi khi là thuốc không thể thay thế. Trong da liễu, chúng được sử dụng để điều trị các bệnh như vẩy nến, viêm da, eczema… Chúng làm giảm viêm và có thể tạm dừng các triệu chứng viêm da do vẩy nến thể mảng nghiêm trọng. Để sử dụng tại chỗ, chúng có sẵn ở dạng kem, gel và thuốc mỡ với hiệu lực và tác dụng khác nhau. Tuy nhiên, khi điều trị kéo dài với các chế phẩm chứa GLU có thể dẫn đến một số tác dụng phụ toàn thân như tăng huyết áp, đái tháo đường, loãng xương, hội chứng Cushing…và khi dùng tại chỗ có thể dẫn đến viên da, rạn da, teo da vĩnh viễn… [3], [8]. Từ xa xưa con người đã có nhu cầu làm đẹp và đã biết làm đẹp. Ngày nay, khi xã hội phát triển, kinh tế phát triển thì nhu cầu làm đẹp ngày càng tăng cao; Trên thị trường có vô số loại mỹ phẩm với mức giá và chất lượng đa dạng để thỏa mãn nhu cầu mọi người. Với khả năng kháng viêm và ức chế miễn dịch, GLU dễ bị lợi dụng trộn trái phép vào các mỹ phẩm bôi da (12-15% mỹ phẩm được kiểm tra có chứa GLU trái phép [18], [19]) nhằm đem đến làn da hết mụn, láng mịn và trắng sáng không tỳ vết trong thời gian ngắn cho người dùng. Tuy nhiên đó chỉ là hiệu quá tức thời và bề nổi, nếu sử dụng trong thời gian dài điều này vô cùng nguy hiểm, có thể dẫn đến một số biến chứng như da bị bào mòn đến rất mỏng, nám kháng trị, vi khuẩn và nấm tăng sinh… gây ảnh hưởng đến thẩm mỹ và sức khỏe người sử dụng. Mỹ phẩm được sử dụng tiếp xúc trực tiếp với những bộ phận bên ngoài cơ thể, không có quy định về thời gian và liều lượng sử dụng, không có sự giám sát y tế; nên chỉ với lượng rất nhỏ GLU được đưa vào mỹ phẩm cũng có thể đem đến những tác dụng không mong muốn như trên. Chính vì vậy, theo hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong mỹ phẩm, GLU là một trong những nhóm chất được đưa vào danh mục chất không được phép dùng trong mỹ phẩm [13]. Như vậy, đòi hỏi cần có một phương pháp phân tích để sàng lọc các sản phẩm mỹ phẩm như kem, gel, thuốc mỡ có chứa GLU. Các nghiên cứu trước đó đã đưa ra một số phương pháp LC (TLC và HPLC với detector DAD) để phân tích các steroid này trong mỹ phẩm [5], [9]. Tuy nhiên, những phương pháp này còn một số nhược điểm như giới hạn phát hiện còn cao, độ đặc hiệu còn hạn chế [9]. Những tồn tại này cho thấy sự cần thiết phải nghiên cứu xây dựng một phương pháp có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hơn, 1

đảm bảo kết quả tin cậy hơn để kiểm tra các chất cấm nhóm GLU trong mỹ phẩm. Để góp phần giải quyết những tồn tại trên, nhóm nghiên cứu tiến hành thực nghiệm đề tài: “Nghiên cứu xác định môt số chất cấm trong mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ” với mục tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng được phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC – MS/MS) xác định một số chất cấm nhóm glucocorticoid trong mỹ phẩm dạng kem. 2. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định có hay không có các chất cấm nhóm glucocorticoid trong các mẫu mỹ phẩm trên thị trường nhằm đánh giá việc tuân thủ các quy định của cơ quan quản lý đối với mỹ phẩm của các đơn vị.

2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Đặc tính của các GLU nghiên cứu [4] a. Betamethason dipropionat

Hình 1. 1: Công thức cấu tạo của betamethason dipropionat - Công thức phân tử: C28H37FO7 - Phân tử lượng: 504,6 - Betamethason dipropionat là 9-fluoro-11β-hydroxy-16β-methyl-3,20dioxopregna-1,4-dien-17,21-diyl dipropionat - Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng. Không tan trong nước, dễ tan trong aceton và methylen clorid, hơi tan trong ethanol 96%. b. Clobetasol propionat

Hình 1. 2: Công thức cấu tạo của clobetasol propionat - Công thức phân tử: C25H32ClFO5 - Phân tử lượng: 467,0 - Clobetasol propionat là 17-(2-chloroacetyl)-9-fluoro-11-hydroxy-10,13,16trimethyl-3-oxo-6,7,8,11,12,14,15,16-octahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl propanoat

3

- Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng. Không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol 96%. c. Dexamethason acetat

Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của dexamethason acetat - Công thức phân tử: C24H31FO6 - Phân tử lượng: 434,5 - Dexamethason acetat là 9-fluoro-11β,17-dihydroxy-16α-methyl-3,20dioxopregna-1,4-dien-21-yl acetat - Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình. Không tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96%, khó tan trong methylen clorid. d. Triamcinolon acetonid

Hình 1. 4: Công thức cấu tạo của triamcinolon acetonid - Công thức phân tử: C24H31FO6 - Phân tử lượng: 434,5 - Triamcinolon acetonid là 12-fluoro-11-hydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-6,6,9,13tetramethyl-5,7-dioxapentacyclo[10.8.0.02,9.04,8.013,18]icosa-14,17-dien-16-on - Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình. Không tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%.

4

e. Prednison

Hình 1. 5: Công thức cấu tạo của prednison - Công thức phân tử: C21H26O5 - Phân tử lượng: 358,4 - Prednison là 17,21-dihydroxypregna-1,4-dien-3,11,20-trien - Tính chất lý hóa: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng, đa hình. Không tan trong nước, khó tan trong ethanol 96% và methylen clorid. 1.1.2. Vài nét về Glucocorticoid a. Tác dụng của GLU [8] - Ở nồng độ sinh lý, GLU cần cho cân bằng nội mô, tăng sức chống đỡ của cơ thể với stress và duy trì các chức năng khác của cơ thể. - GLU tác dụng trên chuyển hóa glucid (làm tăng tạo glucose), chuyển hóa protid (tăng dị hóa protid), chuyển hóa lipid (thay đổi sự phân bố lipid trong cơ thể), chuyển hóa muối nước (tăng tái hấp thu Na+ , tăng thải trừ H+ và K+ ). - GLU còn tác dụng trên các cơ quan, tổ chức như thần kinh trung ương, máu, tiêu hóa, tổ chức hạt và hệ tim mạch. - GLU có tác dụng chống viêm, chống dị ứng, ức chế miễn dịch. b. Tác dụng không mong muốn [8] - Phù, tăng huyết áp do giữ nước và natri. - Loét dạ dày, tá tràng. - Vết thương chậm lên sẹo, dễ nhiễm trùng. - Tăng đường huyết gây đái đáo đường hoặc làm nặng thêm bệnh đái tháo đường. - Nhược cơ, teo cơ, mỏi cơ. - Loãng xương, xốp xương. - Rối loạn phân bố mỡ. 5

- Suy thượng thận cấp khi ngừng thuốc đột ngột. - Khi dùng tại chỗ có thể gây mỏng da, viêm da, teo da vĩnh viễn, rạn da, bệnh vảy nến thể mủ, trứng cá đỏ … Chính vì những tác dụng không mong muốn tại chỗ như trên nên các chất thuộc nhóm Glucocorticoid là những chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm do Hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm quy định (Số thự tự 300 trong Annex 2) c. Một số phương pháp phân tích: - Định tính bằng các phản ứng hóa học chung đặc trưng cho GLU: + Bị oxy hóa với tác nhân H2SO4 đặc, có màu đỏ (thường kèm huỳnh quang). Khi pha loãng với nước, màu biến mất [2], [11]. + Cho phản ứng với phenylhydrazin trong môi trường acid cho dẫn chất pheninhydrazon có màu vàng [2], [11]. - Định tính bằng phương pháp quang phổ: + Quang phổ hồng ngoại (IR): bằng cách so sánh phổ IR của chất phân tích với phổ IR của chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích. Phương pháp này thường được áp dụng để định tính nguyên liệu và một vài chế phẩm đơn chất. + Quang phổ UV-VIS: tạo dẫn chất với xanh tetrazolium cho sản phẩm có màu, đo quang ở vùng khả kiến (400 – 760 nm). - Các phương pháp sắc ký: Sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao detector UV-VIS [2], [11] hay khối phổ thường để dùng để xác định các GLU trong các chế phẩm. - Phương pháp hòa hợp ASEAN ACM SIN 01, ASEAN ACM 007 đã đưa ra quy trình định tính và định lượng GLU trong mỹ phẩm bằng TLC và HPLC [6], [12]. d. Các nghiên cứu xác định GLU trong mỹ phẩm: Có nhiều nghiên cứu đã xây dựng phương pháp để phát hiện và xác định các GLU trong mỹ phẩm bằng nhiều phương pháp khác nhau như TLC [9], HPLC với detector UV – VIS [5], [12] hay LC – MS/MS [15], [17], [18], [19]. Tóm tắt một số phương pháp định tính, định lượng GLU được trình bày trong bảng 1.1.

6

Bảng 1. 1: Một số phương pháp phân tích Glucocorticoid trong mỹ phẩm STT

Đối tượng nghiên cứu

Phương

Kết quả phân tích

TLTK

pháp phân tích 1

Xác định hydrocortison TLC và

- LOD: 20 – 50 µg/g

acetat, dexamethason,

- LOQ: 70 – 160 µg/g

HPLC

betamethason,

- Thời gian phân tích:

betamethason 17-

35 phút

[12]

valerat và triamcinolon acetonid trong mỹ phẩm 2

Xác định

TLC

- LOD: 200 µg/g

[9]

HPLC

- Khoảng tuyến tính:

[5]

dexamethason, prednisolon acetat, fluocinolon acetonid, hydrocortison acetat, cortison acetat trong mỹ phẩm 3

Phân tích đồng thời 12 Glucocorticoid thông

0,2 – 1,2 µg/ml

thường trong mỹ phẩm

- LOD: 0,1 – 2,0 µg/g - LOQ: 0,3 – 6,0 µg/g - Thời gian phân tích: 60 phút

4

Xác định đồng thời 6

LC – MS

- Khoảng tuyến tính:

glucocorticoid

0,3 – 100,0 µg/ml

(betamethason 17-

- LOD: 12 - 35 ng/ml

valerat, betamethason,

- LOQ: 35 - 95 ng/ml

beclomethason

- Thời gian phân tích:

dipropionat,

30 phút

methylprednisolon, budesonid, flunisolid) 7

[15]

trong dược phẩm vs trong mỹ phẩm giả. Định lượng

5

LC – MS/MS

- Khoảng tuyến tính:

prednisolon,

0,1 – 10 µg/ml

hydrocortison,

- LOD: 1,4 – 2,4 ng/ml

betamethason,

- LOQ: 4,7 – 8,0 ng/ml

dexamethason,

- Thời gian phân tích:

triamcinolon acetonid

25 phút

[19]

trong các mỹ phẩm điều trị eczema, viêm da tiết bã, vẩy nến Xác định 10

6

LC – MS/MS

- Khoảng tuyến

glucocorticoid trong

tính:0,005 – 0,250

mỹ phẩm bất hợp pháp

µg/ml

[16]

- LOD: 0,085 – 0,109 µg/g - LOQ: 0,102 – 0,212 µg/g - Thời gian phân tích: 10 phút Xác định 43

7

LC – MS/MS

- Khoảng tuyến tính:

glucocorticoid bị cấm

0,1 – 2,0 µg/ml

trong mỹ phẩm

- LOD: 0,8 – 30,0

[18]

ng/ml - LOQ: 2,5 – 90,0 ng/ml - Thời gian phân tích: 25 phút Phương pháp TLC với ưu điểm tiến hành đơn giản, chi phí thấp, dễ dàng so sánh kết quả trên cùng một bản mỏng. Tuy nhiên giới hạn phát hiện còn cao, độ đặc hiệu còn hạn chế. 8

Phương pháp HPLC độ đặc hiệu đã cải thiện hơn so với phương pháp TLC, song giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng còn cao, chưa phù hợp để phân tích các chất cấm (thường được thêm vào với lượng nhỏ) trong mỹ phẩm. Phương pháp LC – MS/MS có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, khoảng tuyến tính rộng. Tuy nhiên các nghiên cứu đã tiến hành có thời gian phân tích còn dài.

1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phân sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và khả năng phân tích khối phổ (m/z) của bộ phân khối phổ (MS). LC – MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng được ứng dụng ngày càng rộng rãi vì có tính chọn lọc và độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10-14gam, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu gần giống nhau mà các phương pháp sắc ký lỏng thông thường không làm được [7]. 1.2.1. Hệ thống HPLC HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa chất phân tích qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [1]. Cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao:

Hình 1. 6: Sơ đồ hệ thống HPLC

9

Hệ thống gồm có: - Hệ thống cấp pha động - Bơm cao áp - Bộ phận tiêm mẫu - Cột sắc ký - Detector - Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống. 1.2.2. Khối phổ a. Cơ sở lý thuyết của phương pháp khối phổ [1], [7] Phương pháp phổ khối lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit) hoặc bằng Dalton. 1 amu bằng 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro. Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện (detector). Quá trình phân tích khối và phát hiện được thực hiện trong môi trường chân không (áp suất khoảng 10-5 đến 10-8 Torr). Đối với các hợp chất hữu cơ: Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) bằng các phần tử mang năng lượng cao theo sơ đồ sau: + Ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích: M + e → M+ + 2e (>95%) → M2+ + 3e → M+ Phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích: ABCD + e* → ABn+ + C + DmSự phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích tuân theo định luật bảo toàn khối lượng. Năng lượng bắn phá (năng lượng ion hóa) là một yếu tố quyết định sự phân mảnh của các hợp chất. Khi năng lượng bắn phá mẫu (khoảng 10 eV) bằng với năng lượng ion hóa phân tử sẽ gây nên sự ion hóa phân tử. 10

Nếu năng lượng ion hóa tăng lên (30-50 eV) sẽ bẻ gãy một số liên kết trong phân tử, tạo ra nhiều mảnh. Đó là các ion hoặc phân tử trung hòa có khối lượng bé hơn. Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có mặt của những nhóm chức đặc thù, cung cấp nhưng thông tin hữu ích về cấu tạo hoặc nhận dạng của chất phân tích. b. Cấu tạo và nguyên lý vận hành của một khối phổ kế [1], [7]

Hình 1. 7: Sơ đồ khối cấu tạo các bộ phận của một khối phổ kế Một khối phổ kế bao gồm các bộ phận chính: Bộ phận nạp mẫu – đưa mẫu vào (inlet), bộ phân ion hóa (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện ion (detector) và ghi/ xử lý số liệu (data system). ❖ Bộ phận nạp mẫu: Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối phổ. Với LC – MS mẫu phân tích được nạp vào MS gián tiếp thông qua hệ thống HPLC. ❖ Nguồn ion hóa: Ion hóa phân tử trung hòa thành các ion mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phân tử mang năng lượng cao. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn (hội tụ). Việc tăng tốc được thự hiện bởi một điện thế (2-10 kV), khi ra khỏi buồng ion hóa các ion phân tử có tốc độ đạt cao nhất. Việc thu gọn thành chùm ion được thực hiện bởi một điện trường phụ để khi vào phần phân tích khối là một dòng ion tập trung, đồng nhất. Có nhiều loại nguồn ion hóa sử dụng các kỹ thuật ion hóa khác nhau: - Kỹ thuật ion hóa va chạm điện tử (Electron Impact ionization) - Kỹ thuật ion hóa hóa học (Chemica ionization) 11

- Kỹ thuật ion hóa điện trường (Field ionization) - Kỹ thuật bắn phá nhanh nguyên tử (Fast Atom Bombardment) - Kỹ thuật phản hấp thụ và ion hóa bằng tia laser - Kỹ thuật ion hóa phun sương điện (ESI - Electron Spray Ionization) - Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI - Atmospheric pressure chemical ionization) - Kỹ thuật ion hóa ánh sáng ở áp suất khí quyển (APPI – Atmospheric pressure photoionization) Trong số các kỹ thuật trên thì kỹ thuật ion hóa phun sương điện ESI được dùng phổ biến nhất trong các máy LC – MS. Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt. Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương. Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi vào bộ phận phân tích khối.

Hình 1. 8: Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI ❖ Bộ phận phân tích khối: Các ion hình thành ở nguồn ion hóa có khối lượng m và điện tích z (tỷ số m/z được gọi là số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối có nhiệm

12

v᝼ tĂĄch cĂĄc ion cĂł sáť‘ kháť‘i m/z khĂĄc nhau thĂ nh tᝍng phần riĂŞng biᝇt nháť? tĂĄc d᝼ng cᝧa tᝍ trĆ°áť?ng, Ä‘iᝇn trĆ°áť?ng trĆ°áť›c khi Ä‘áşżn báť™ pháş­n phĂĄt hiᝇn vĂ xáť­ lĂ˝ sáť‘ liᝇu. CĂł tháťƒ phân báť™ pháş­n phân tĂ­ch kháť‘i thĂ nh 4 loấi: Báť™ phân tĂ­ch tᝍ, báť™ phân tĂ­ch tᝊ cáťąc, báť™ phân tĂ­ch tháť?i gian bay vĂ báť™ phân tĂ­ch cáť™ng hĆ°áť&#x;ng ion cyclotron. Trong Ä‘Ăł, báť™ phân tĂ­ch tᝊ cáťąc bao gáť“m báť™ phân tĂ­ch tᝊ cáťąc Ä‘ĆĄn, báť™ phân tĂ­ch tᝊ cáťąc cháş­p ba vĂ bẍy ion kiáťƒu tᝊ cáťąc. Báť™ tᝊ cáťąc (quadrupole) gáť“m 4 cáťąc báşąng kim loấi đạt song song vĂ sĂĄt nhau, hai thanh Ä‘áť‘i nhau cĂł Ä‘iᝇn tĂ­ch báşąng nhau. CĂł máť™t khoảng khĂ´ng giᝯa 4 cáťąc Ä‘áťƒ cĂĄc ion bay qua. Dòng Ä‘iᝇn máť™t chiáť u vĂ Ä‘iᝇn tháşż xoay chiáť u cao tần đưᝣc đạt vĂ o tᝍng cạp Ä‘áť‘i diᝇn cᝧa tᝊ cáťąc. Cả hai trĆ°áť?ng Ä‘áť u khĂ´ng lĂ m tăng táť‘c dòng ion tᝍ nguáť“n Ä‘i ra nhĆ°ng lĂ m chĂşng dao Ä‘áť™ng quanh tr᝼c trung tâm khi chuyáťƒn Ä‘áť™ng vĂ chᝉ cĂĄc ion cĂł sáť‘ kháť‘i nhẼt Ä‘áť‹nh máť›i Ä‘áşżn báť™ pháş­n phĂĄt hiᝇn. Chᝉ cĂĄc dao Ä‘áť™ng cᝧa cĂĄc ion cĂł m/z đạc biᝇt khĂ´ng tăng lĂŞn theo biĂŞn Ä‘áť™ dao Ä‘áť™ng vĂ cĂł tháťƒ Ä‘i qua tâm tᝊ cáťąc dáť?c theo tr᝼c. CĂĄc ion khĂĄc cĂł biĂŞn Ä‘áť™ dao Ä‘áť™ng tăng sáş˝ va Ä‘áş­p vĂ o thĂ nh cĂĄc Ä‘iᝇn cáťąc trĆ°áť›c khi cĂł tháťƒ vưᝣt qua cĂĄc Ä‘iᝇn cáťąc Ä‘i vĂ o detector. PhĆ°ĆĄng trĂŹnh táť•ng quĂĄt cᝧa tᝊ cáťąc nhĆ° sau: đ?‘š đ?‘‰ =đ??ž 2 2 đ?‘§ đ?‘&#x; đ?‘“ Trong Ä‘Ăł: K: háşąng sáť‘, V: Ä‘iᝇn ĂĄp tần sáť‘ cao, r: khoảng cĂĄch 2 Ä‘iᝇn cáťąc Ä‘áť‘i nhau, f: tần sáť‘ dao Ä‘áť™ng ion. Báşąng cĂĄch thay Ä‘áť•i tần sáť‘ vĂ tháşż cᝧa cĂĄc cáťąc, cĂĄc ion cĂł tᝡ sáť‘ m/z khĂĄc nhau cĂł tháťƒ vưᝣt qua khoảng khĂ´ng Ä‘áťƒ Ä‘áşżn detector váť›i khoảng tháť?i gian khĂĄc nhau (cĂĄc ion đưᝣc tĂĄch theo sáť‘ kháť‘i cᝧa chĂşng).

HÏnh 1. 9: Sƥ đᝓ b᝙ phân tích tᝊ c᝹c.

13

Độ phân giải phổ kế tứ cực thông thường đạt từ 500-1000, muốn nâng cao độ phân giải, thường phải nối 2-3 bộ tứ cực với nhau (độ phân giải có thể đạt tới 20000). Phổ khối tứ cực chập ba, gồm 3 bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2 và Q3.

Hình 1. 10: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba. Trong đó: Q1: Bộ tứ cực thứ nhất, có nhiệm vụ tách các ion. Lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để đưa vào tứ cực Q2. Q2: Bộ tứ cực thứ hai, ở điều kiện áp suất cao, các ion mẹ bị phân mảnh do va chạm với các khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He. Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions). Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả ion do Q1 chuyển đến. Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3. Q3: Bộ tứ cực thứ ba, làm nhiệm vụ tách các ion con được chuyển từ Q2 đến để đi tới bộ phận phát hiện. Thiết bị khối phổ ba tứ cực gọi là máy khối phổ hai lần (LC – MS/MS). ❖ Bộ phận phát hiện: Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận này cho phép phát hiện và khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ. Sắc ký lỏng khối phổ LC – MS là kỹ thuật phân tích tập hợp khả năng phân tách cao của LC và khả phát hiện, định lượng chính xác của MS. Do đó được ứng dụng rộng rãi trong phân tích.

14

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, nguyên liệu và trang thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu trắng: Nền mẫu dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích là các mẫu kem dưỡng da không chứa các GLU cần nghiên cứu được chuẩn bị bởi khoa Nghiên cứu phát triển, viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương. Công thức bào chế các mẫu nền dựa trên công thức của 3 mẫu kem: + Kem dưỡng ẩm Cetaphil moisturizing cream. + Kem dưỡng trắng và giảm nếp nhăn Rebirth. + Kem dưỡng trắng và giảm thâm nám ban đêm Za true white ex night cream - Mẫu thử: Các sản phẩm mỹ phẩm dạng kem, dung dịch được sử dụng với mục đích dưỡng trắng da, giảm thâm nám, trị mụn… đang lưu hành tại thị trường Việt Nam. (Thông tin chi tiết được thể hiện ở phụ lục 1) - Mẫu chuẩn tự tạo: là nền mẫu có chứa chuẩn GLU bằng cách thêm các chuẩn này vào mẫu nền với các nồng độ nhất định. 2.1.2. Chất chuẩn, dung môi, hóa chất - Chất chuẩn: Thông tin các chất chuẩn sử dụng trong quá trình nghiên cứu được thể hiện ở bảng 2.1. Bảng 2. 1: Thông tin chất chuẩn sử dụng Tên chất chuẩn

Nguồn gốc VKNTTW

Số lô

Hàm lượng

WS.0217235.02

Dexamethason acetat (DXA)

VKNTTW

200014

Triamcinolon acetonid (TAA)

VKNTTW

WS.0116086.01

Betamethason dipropionat (BMD) Clobetason propionat (CBP)

VKNTTW

107216

99,19% (nguyên trạng) 99,6% (nguyên trạng) 98,35% (nguyên trạng) 99,44%

VKNTTW

WS.0212170.02 (07.12)

Prednison (PRS)

15

99,60% (nguyên trạng)

Độ ẩm

0,21%

- Dung môi, hóa chất: Dung môi tinh khiết sắc ký: methanol (MeOH) (Merck, Đức), acetonitril (ACN) (Merck, Đức); hóa chất loại tinh khiết sắc ký: acid formic (Fisher, Mỹ), amoniacetat (Fisher, Mỹ); nước cất hai lần được lọc qua hệ thống loại ion. 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ phân tích - Máy sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối thiết bị khối phổ có bộ phận phân tích khối kiểu ghép nối ba tứ cực Xevo TQD với nguồn ion hóa kiểu phun sương điện (ESI) (Water, Mỹ) - Cân phân tích Mettler Toledo MS 105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg). - Máy li tâm Sigma 4 – 16 KS – Mỹ - Máy lắc xoáy IKA MS3 basic – Đức - Micropipet Eppendorf – Đức: 10 – 100 µl, 100 – 1000 µl. - Bình định mức, pipet thủy tinh class A… Tất cả các thiết bị phân tích tại khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm (Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) đều được kiểm tra, hiệu chuẩn định kỳ đáp ứng tiêu chuẩn GLP và ISO/IEC 17025.

2.2. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát, xây dựng phương pháp phân tích xác định 5 GLU trong mỹ phẩm dạng kem sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. - Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: Sự phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu – chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, độ đúng, độ lặp lại và độ chụm trung gian theo hướng dẫn của FDA. - Ứng dụng phương pháp trên xác định các GLU trong các mẫu mỹ phẩm dạng kem trên thị trường.

2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Quy trình xử lý mẫu Dựa vào tính chất hóa lý của các GLU phân tích và tham khảo các nghiên cứu đã công bố, tiến hành khảo sát chiết các GLU từ nền mẫu như sau: - Khảo sát dung môi chiết mẫu: sử dụng các dung môi chiết: MeOH, hỗn hợp MeOH – H2O (90:10), hỗn hợp MeOH – H2O (50:50), ACN.

16

- Khảo sát phương pháp chiết: Sau khi tiến hành lựa chọn dung môi chiết, khảo sát các kỹ thuật phân tán mẫu (lắc xoáy, lắc siêu âm, đun cách thủy 60oC) và phương pháp làm trong dung dịch phân tích (lọc trực tiếp, ngâm nước đá, ngâm nước đá kết hợp siêu âm). Từ kết quả khảo sát, lựa chọn quy trình xử lý mẫu có thể chiết các GLU với độ thu hồi cao, ổn định và không gây ra ảnh hưởng của nền mẫu khi phân tích. 2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau: - Khảo sát điều kiện khối phổ: Lựa chọn điều kiện nguồn ion hóa, ion mẹ, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn ion con để định tính, định lượng. Khảo sát, tìm điều kiện khối phổ phân tích đồng thời các GLU đang nghiên cứu. - Khảo sát điều kiện sắc ký: Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên các cột sắc ký mang pha tĩnh C18 hoặc C8 của các hãng khác nhau, trên các hệ pha động gồm dung môi hữu cơ (ACN hoặc MeOH) phối hợp với dung dịch đệm (acid formic 0,001%; amoni format 2 mM) theo các tỷ lệ khác nhau, các chương trình rửa giải khác nhau (đẳng dòng hoặc gradient). Lựa chọn điều kiện để có thể tách và phát hiện đồng thời các chất phân tích, các píc nhỏ gọn, cân xứng, thời gian phân tích không quá dài. - Khảo sát lựa chọn chuẩn nội: Dựa trên cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý của các chất để tiến hành lựa chọn chuẩn nội cho phương pháp. Chuẩn nội được lựa chọn phải đảm bảo bền vững, có thể tham gia quá trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng chuẩn. Dự kiến chất chuẩn nội lựa chọn gồm có: glibenclamid, telmisartan, cloramphenicol, pyridoxin hydrochlorid. 2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng Tiến hành thẩm định phương pháp phân tích các chất cấm nhóm GLU bằng kỹ thuật LC – MS/MS theo hướng dẫn của USFDA [20] về thẩm định phương pháp phân tích trong mỹ phẩm. Các chỉ tiêu cần thẩm định gồm: sự phù hợp của hệ thống, độ đặc hiệu – chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, đường chuẩn – khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chụm trung gian. a. Sự phù hợp của hệ thống (system suitability): Sự phù hợp của hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị.

17

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn S4 (được chuẩn bị như trong bảng 3.1). Ghi lại sắc ký đồ, xác định các thông số đặc trưng của mỗi pic, tỷ lệ diện tích giữa các pic hoạt chất so với pic chuẩn nội và tỷ lệ diện tích của hai ion con. Sự phù hợp của hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích. b. Độ đặc hiệu – chọn lọc (selectivity): - Tính đặc hiệu/chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành phần khác có trong mẫu. Với phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống phân tích. Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác. - Cách thực hiện: + Phân tích mẫu trắng, lặp lại tối thiểu 6 lần. Mẫu trắng phải không có tín hiệu của chất phân tích. + Phân tích mẫu tự tạo ở nồng độ/hàm lượng gần LOQ, lặp lại tối thiểu 6 lần. So sánh với mẫu trắng, phải cho tín hiệu của chất phân tích. + Phân tích mẫu chuẩn, các chất phân tích phải được nhận diện rõ ràng và không bị ảnh hưởng bởi các chất khác. - Với phương pháp LC – MS/MS sử dụng kỹ thuật MRM, độ chọn lọc đạt yêu cầu khi: Có 2 ion con đặc trưng và tỷ lệ cường độ tuyệt đối so với mẫu chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện không chênh lệch quá 10% [21]. c. Giới hạn phát hiện (Limit of Detection): - Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được. - Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) để xác định LOD: Phân tích mẫu chuẩn hoặc mẫu tự tạo ở nồng độ khác nhau thấp dần. Xác định tỷ lệ giữa tín hiệu chiều cao pic (S) của chất cần phân tích và cường độ nhiễu nền (N) tại lân cận pic chất cần phân tích. Nồng độ chất cần phân tích tại đó S/N xấp xỉ 3 được coi là LOD. d. Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation): - LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn. 18

- LOQ cĹŠng cĂł tháťƒ xĂĄc Ä‘áť‹nh dáťąa trĂŞn tᝡ lᝇ tĂ­n hiᝇu trĂŞn nhiáť…u, dáťąa vĂ o Ä‘Ć°áť?ng chuẊn hoạc dáťąa vĂ o cĂ´ng thᝊc: LOQ = 3,3 x LOD. e. Khoảng tuyáşżn tĂ­nh vĂ Ä‘Ć°áť?ng chuẊn (Linearity): - Khoảng tuyáşżn tĂ­nh lĂ khoảng náť“ng Ä‘áť™ áť&#x; Ä‘Ăł cĂł sáťą ph᝼ thuáť™c tuyáşżn tĂ­nh giᝯa tĂ­n hiᝇu Ä‘o đưᝣc vĂ náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch. Khoảng tuyáşżn tĂ­nh phải cĂł táť‘i thiáťƒu 5 náť“ng Ä‘áť™ khĂĄc nhau, bắt đầu tᝍ giáť›i hấn Ä‘áť‹nh lưᝣng (Ä‘iáťƒm thẼp nhẼt) vĂ káşżt thĂşc lĂ giáť›i hấn tuyáşżn tĂ­nh (Ä‘iáťƒm cao nhẼt). - Ä?Ć°áť?ng chuẊn biáťƒu diáť…n máť‘i quan hᝇ giᝯa tĂ­n hiᝇu Ä‘o cᝧa thiáşżt báť‹ vĂ náť“ng Ä‘áť™ cᝧa chẼt phân tĂ­ch cĂł trong mẍu. Tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch theo quy trĂŹnh Ä‘ĂŁ xây dáťąng dĂŁy dung dáť‹ch chuẊn háť—n hᝣp áť&#x; 7 náť“ng Ä‘áť™ khĂĄc nhau. Khảo sĂĄt sáťą tĆ°ĆĄng quan giᝯa tᝡ lᝇ diᝇn tĂ­ch pic vĂ náť“ng Ä‘áť™ cĂĄc chẼt trong mẍu báşąng phĆ°ĆĄng phĂĄp háť“i quy tuyáşżn tĂ­nh. Ä?ĂĄnh giĂĄ Ä‘Ć°áť?ng chuẊn dáťąa vĂ o hᝇ sáť‘ háť“i quy tuyáşżn tĂ­nh vĂ Ä‘áť™ chᝇch cĂĄc Ä‘iáťƒm náť“ng Ä‘áť™ dĂšng xây dáťąng Ä‘Ć°áť?ng chuẊn. + Hᝇ sáť‘ háť“i quy tuyáşżn tĂ­nh: r ≼ 0,995 + Ä?áť™ chᝇch cᝧa cĂĄc Ä‘iáťƒm náť“ng Ä‘áť™ dĂšng xây dáťąng Ä‘Ć°áť?ng chuẊn: KhĂ´ng đưᝣc vưᝣt quĂĄ Âą 15% cho tẼt cả cĂĄc náť“ng Ä‘áť™, riĂŞng áť&#x; náť“ng Ä‘áť™ LOQ cĂł tháťƒ chẼp nháş­n giáť›i hấn Âą 20% [10]. TĂ­nh cĂĄc giĂĄ tráť‹ Ä‘áť™ chᝇch theo cĂ´ng thᝊc sau: ∆đ?‘– (%) =

đ??śđ?‘Ą − đ??śđ?‘? Ă— 100 đ??śđ?‘?

Trong Ä‘Ăł: ∆i (%): Ä?áť™ chᝇch cᝧa tᝍng Ä‘iáťƒm chuẊn dĂšng xây dáťąng Ä‘Ć°áť?ng chuẊn Ct: Náť“ng Ä‘áť™ xĂĄc Ä‘áť‹nh đưᝣc tᝍ Ä‘Ć°áť?ng chuẊn cᝧa cĂĄc Ä‘iáťƒm chuẊn Ci: Náť“ng Ä‘áť™ lĂ˝ thuyáşżt cᝧa cĂĄc Ä‘iáťƒm chuẊn. f. Ä?áť™ chĂ­nh xĂĄc (accuracy): Ä?áť™ chĂ­nh xĂĄc cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp (accuracy) lĂ sáťą káşżt hᝣp cᝧa Ä‘áť™ Ä‘Ăşng (trueness) vĂ Ä‘áť™ ch᝼m (precision). * Ä?áť™ Ä‘Ăşng cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp: lĂ khĂĄi niᝇm chᝉ mᝊc Ä‘áť™ gần nhau giᝯa cĂĄc giĂĄ tráť‹ trung bĂŹnh cᝧa káşżt quả tháť­ nghiᝇm vĂ giĂĄ tráť‹ tháťąc hoạc giĂĄ tráť‹ đưᝣc chẼp nháş­n lĂ Ä‘Ăşng. Ä?áť™ thu háť“i (Ä‘ĂĄnh giĂĄ Ä‘áť™ Ä‘Ăşng): lĂ tᝡ lᝇ phần trăm giᝯa giĂĄ tráť‹ thu đưᝣc so váť›i giĂĄ tráť‹ lĂ˝ thuyáşżt.

19

Tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch cĂĄc mẍu táťą tấo áť&#x; 3 mᝊc náť“ng Ä‘áť™: náť“ng Ä‘áť™ LOQ, náť“ng Ä‘áť™ trung bĂŹnh (MQC) vĂ náť“ng Ä‘áť™ cao (HQC). Tấi máť—i náť“ng Ä‘áť™, tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch 6 mẍu Ä‘áť™c láş­p. Ä?áť™ thu háť“i đưᝣc tĂ­nh theo cĂ´ng thᝊc: đ?‘… (%) =

đ??śđ?‘Ąđ?‘Ą Ă— 100 đ??śđ?‘?

Trong Ä‘Ăł: R (%): Ä?áť™ thu háť“i Cc: Náť“ng Ä‘áť™ chuẊn thĂŞm vĂ o (lĂ˝ thuyáşżt) Ctt: Náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂ­ch trong mẍu placebo thĂŞm chuẊn * Ä?áť™ ch᝼m cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp: tháťƒ hiᝇn mᝊc Ä‘áť™ dao Ä‘áť™ng cᝧa cĂĄc káşżt quả tháť­ nghiᝇm Ä‘áť™c láş­p quanh giĂĄ tráť‹ trung bĂŹnh. + Ä?áť™ lạp lấi cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp (repeatability): Ä?áť™ lạp lấi diáť…n tả Ä‘áť™ chĂ­nh xĂĄc cᝧa máť™t quy trĂŹnh phân tĂ­ch trong cĂšng Ä‘iáť u kiᝇn thĂ­ nghiᝇm trong khoảng tháť?i gian ngắn. Tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch lạp lấi tấi 3 mᝊc náť“ng Ä‘áť™: náť“ng Ä‘áť™ LOQ, náť“ng Ä‘áť™ trung bĂŹnh (MQC) vĂ náť“ng Ä‘áť™ cao (HQC). Tấi máť—i náť“ng Ä‘áť™, tiáşżn hĂ nh phân tĂ­ch 6 mẍu Ä‘áť™c láş­p. XĂĄc Ä‘áť‹nh Ä‘áť™ lᝇch tĆ°ĆĄng tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i RSD (%) cᝧa káşżt quả phân tĂ­ch. + Ä?áť™ ch᝼m trung gian (intermediate precision): Báť‘ trĂ­ thĂ­ nghiᝇm tĆ°ĆĄng táťą phần Ä‘áť™ lạp lấi cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp nhĆ°ng tiáşżn hĂ nh vĂ o tháť?i gian khĂĄc, Ä‘áť•i kiáťƒm nghiᝇm viĂŞn. Ä?áť™ lᝇch chuẊn tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i đưᝣc tĂ­nh theo cĂ´ng thᝊc: đ?‘…đ?‘†đ??ˇ (%) = đ?‘†đ??ˇ = √

đ?‘†đ??ˇ Ă— 100 đ?‘ĽĚ…

∑đ?‘›đ?‘–=1(đ?‘Ľđ?‘– − đ?‘Ľ )2 đ?‘›âˆ’1

Trong đó: xi: Nᝓng đ᝙ tính đưᝣc cᝧa lần th᝭ nghiᝇm thᝊ i. �̅ : Nᝓng đ᝙ trung bÏnh tính đưᝣc cᝧa n lần th᝭ nghiᝇm. N: Sᝑ lần th᝭ nghiᝇm.

20

2.3.4. Ứng dụng xác định các GLU trong một số mẫu mỹ phẩm có mặt trên thị trường Áp dụng phương pháp đã xây dựng được để kiểm tra các chất nhóm GLU trong một số mẫu kem bôi da có mặt trên thị trường. Các mẫu kem được mua ở các cửa hàng và các siêu thị trên địa bàn Hà Nội. 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm có sẵn trong thiết bị LC – MS/MS. Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích dựa vào các hàm toán học, thống kê có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Office Excel để tính toán.

21

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Quy trình chuẩn bị mẫu 3.1.1. Khảo sát quy trình xử lý mẫu Dựa trên đặc điểm lý hóa của các GLU nghiên cứu, đặc điểm của nền mẫu mỹ phẩm và tham khảo các tài liệu, tiến hành khảo sát lựa chọn dung môi pha mẫu và quy trình xử lý mẫu như sau: - Xử lý nền mẫu mỹ phẩm với các kỹ thuật phân tán mẫu như lắc xoáy, lắc siêu âm và đặt trong nồi cách thủy 60oC với các dung môi MeOH, hỗn hợp MeOH: H2O tỷ lệ 9:1 (v/v) hoặc 1:1 (v/v) và ACN. Kết quả cho thấy: + Khi phân tán mẫu bằng lắc xoáy, mẫu khó phân tán, phần phân tán được dễ bám vào thành ống. Khi phân tán bằng lắc siêu âm, mẫu phân tán thành những tiểu phân nhỏ hơn nhưng hỗn hợp tạo thành đục. Khi phân tán bằng cách đặt trong cách thủy ở 60oC, tá dược rã hết, phân tán đều, hỗn hợp tạo thành trong hơn so với phân tán bằng lắc siêu âm. + Trong các dung môi hoặc hỗn hợp dung môi khảo sát thì với hỗn hợp MeOH: H2O tỷ lệ 9:1 (v/v) và ACN cho mẫu phân tán đều hơn cả. Như vậy, kỹ thuật phân tán bằng đặt trong nồi cách thủy 60oC với dung môi là hỗn hợp MeOH: H2O tỷ lệ 9:1 (v/v) hoặc ACN được lựa chọn để tiến hành tiếp tục nghiên cứu. - Khảo sát các kỹ thuật làm trong dung dịch trước khi tiêm vào hệ thống LC – MS như lọc trực tiếp, ngâm trong nước đá và ly tâm. Kết quả cho thấy: Khi lọc trực tiếp, màng lọc bị tắc, không thể lọc được; sau khi ngâm trong nước đá, phần lớn tá dược kết tụ lại nhưng chưa lắng xuống hoàn toàn nên vẫn khó lọc; sau khi ngâm trong nước đá và ly tâm, tá dược lắng xuống hoàn toàn, dịch lọc dễ dàng qua màng. - Áp dụng quy trình xử lý mẫu được chọn ở trên với 2 hệ dung môi là MeOH: H2O tỷ lệ 9:1 (v/v) và ACN, tiến hành khảo sát trên mẫu tự tạo. Kết quả cho thấy: với dung môi ACN, hình dáng pic bị biến dạng và cường độ tín hiệu thấp. Với hỗn hợp dung môi MeOH: H2O tỷ lệ 9:1 (v/v), pic thu được cân đối và cho tỷ lệ thu hồi cao. Như vậy, hỗn hợp MeOH: H2O tỷ lệ 9:1 (v/v) được chọn làm dung môi chiết GLU từ nền mẫu mỹ phẩm. 22

3.1.2. Chuẩn bị dung dịch nền mẫu Cân khoảng 5 g nền mẫu (nền mẫu là các mẫu kem dưỡng da không chứa các GLU cần nghiên cứu được chuẩn bị bởi khoa Nghiên cứu phát triển, viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương) vào cốc có mỏ 100 ml, thêm khoảng 50 ml MeOH: H2O tỷ lệ 9:1 (v/v) dùng đũa thủy tinh phân tán đều kem trong cốc, đặt trên cách thủy ở 60oC trong 10 phút, thỉnh thoảng khuấy. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 500 ml, tráng rửa cốc với MeOH: H2O tỷ lệ 9:1 (v/v). Để nguội, thêm MeOH: H2O tỷ lệ 9:1 (v/v) vừa đủ đến vạch, lắc đều, để trong nước đá 30 phút, ly tâm ở 10000 vòng trong 10 phút, hút lấy lớp dịch trong. 3.1.3. Chuẩn bị chuẩn nội Cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn nội vào bình định mức 100 ml, hòa tan và vừa đủ bằng MeOH. Hút chính xác 0,1 ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 100 ml, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ 100 ng/ml. 3.1.4. Chuẩn bị mẫu chuẩn Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc đơn 100 µg/ml của mỗi GLU trong methanol. Từ các dung dịch chuẩn gốc này pha loãng thích hợp bằng methanol để thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc có nồng độ của các chất như sau: betamethason dipropionat (BMD) 400 ng/ml, clobetasol propionat (CBP) 600 ng/ml, prednison (PRS) và triamcinolon acetonid (TAA) 1000 ng/ml, dexamethason acetat (DXA) 1500 ng/ml. Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc trong dung dịch nền mẫu để thu được đường chuẩn theo bảng 3.1. Bảng 3. 1: Nồng độ đường chuẩn của các GLU Mẫu

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

Nồng độ PRS (ng/ml)

5

20

40

50

60

80

100

Nồng độ TAA (ng/ml)

5

20

40

50

60

80

100

Nồng độ DXA (ng/ml)

7,5

30

60

75

90

120

150

Nồng độ CBP (ng/ml)

3

12

24

30

36

50

60

Nồng độ BMD (ng/ml)

2

8

16

20

24

32

40

Vchuẩn gốc (ml)

0,1

0,4

0,8

1,0

1,2

1,6

2,0

VIS (ml)

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Bình định mức (ml)

20

20

20

20

20

20

20

23

3.1.5. Chuẩn bị mẫu thử Cân chính xác khoảng 0,2 g kem vào cốc có mỏ 20 ml, thêm chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn nội, thêm khoảng 5 ml hỗn hợp methanol: nước (9:1), dùng đũa thủy tinh phân tán đều kem trong cốc, đặt trên cách thủy ở 50 – 60oC trong 10 phút, thỉnh thoảng khuấy. Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 20 ml, tráng rửa cốc với hỗn hợp methanol: nước (9:1). Để nguội, thêm hỗn hợp methanol: nước (9:1) vừa đủ đến vạch, lắc đều, để trong nước đá 30 phút, ly tâm ở 10000 vòng trong 10 phút. Lọc lớp dịch trong qua màng lọc 0,2 µm. Quy trình tóm tắt chuẩn bị mẫu thử được trình bày trong hình 3.1. Cân chính xác 0.2g kem

+ 0.1 ml chuẩn nội + Khoảng 5ml MeOH:H2O (9:1) phân tán đều Đun cách thủy

Định mức vừa đủ bằng MeOH:H2O (9:1)

60˚C trong 10 phút Khuấy đều

Bình định mức 20ml

Để nguội

Ngâm trong nước đá

30 phút

Ly tâm

10000 vòng trong 10 phút

Lọc

Màng lọc 0.2µm

Hút lấy dịch trong

Hình 3. 1: Quy trình chuẩn bị mẫu thử

24

3.1.6. Chuẩn bị mẫu tự tạo Các mẫu tự tạo được chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc. Tiến hành chuẩn bị các mẫu tự tạo ở 3 nồng độ: LOQ, nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC) như sau: + Mẫu tự tạo ở LOQ: Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm 0,1 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc; 1,0 ml chuẩn nội và tiến hành theo quy trình phân tích. + Mẫu tự tạo ở nồng độ trung bình (MQC): Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm 1,0 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc; 1,0 ml chuẩn nội và và tiến hành theo quy trình phân tích. + Mẫu tự tạo ở nồng độ cao (HQC): Cân khoảng 0,2 g nền mẫu vào cốc có mỏ 20 ml; thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc; 1,0 ml chuẩn nội và tiến hành theo quy trình phân tích.

3.2. Xây dựng phương pháp phân tích 3.2.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện khối phổ Trong phương pháp phân tích LC – MS/MS, đầu tiên phải xác định được ion mẹ và ion con với từng GLU. Sử dụng kỹ thuật ion hóa ESI ở cả 2 chế độ âm và dương. Trong chế độ dương, các ion mẹ có thể được tạo thành bằng cách thêm một proton [MH]+, một số trường hợp thêm hai proton [M-2H]2+; Còn trong chế độ âm, các ion mẹ được tạo thành do mất đi 1 proton [M]-. Từ ion mẹ đã xác định được, tiến hành bắn phá để lựa chọn các ion con dùng trong định tính, định lượng. Sử dụng các dung dịch chuẩn đơn nồng độ 1 µg/ml, tiêm không qua cột vào hệ thống sắc ký để xác định ion mẹ và các ion con và tối ưu hóa các điều kiện khối phổ. a. Điều kiện khối phổ cho betamethason dipropionat * Xác định ion mẹ và tối ưu hóa điện thế tập trung ion (cone voltage) Phân tích phổ khối trên thiết bị LC – MS/MS với chế độ phân tích khối một lần, sử dụng kỹ thuật ghi toàn phổ tại tứ cực Q1 (full scan) và khảo sát trên nguồn ion hóa ESI ở chế đô điện tích dương và điện tích âm. Nhận xét: Ở chế độ ESI (+), betamethason dipropionat cho mảnh khối ion phân tử [M-H]+ với tỷ số m/z = 505,25 (phù hợp với cấu trúc phân tử betamethason dipropionat có KLPT = 504,6 khi nhận thêm 1 proton) có tín hiệu lớn nhất và ổn định.

25

Vì vậy, kỹ thuật ion hóa ESI (+) và ion mẹ có m/z = 505,25 được lựa chọn để tiến hành phân tích MS/MS tìm ion con và năng lượng phân mảnh thích hợp.

Hình 3. 2: Phổ khối MS của dung dịch chuẩn Betamethason dipropionat với chế độ ESI (+) Tiến hành tối ưu hóa điện thế tập trung ion (Cone voltage), để các ion [BMD-H]+ hình thành ở nguồn ESI được “tập trung” và đi vào bộ phận phân tích khối với số lượng nhiều nhất trong một thời gian ngắn. Dựa vào giản đồ mối quan hệ giữa điện thế ion tập trung và số lượng ion có m/z = 505,25 đi vào bộ phận phân tích khối, xác định được điện thế 24 V là điện thế tối ưu cần tìm.

Hình 3. 3: Giản đồ mối quan hệ giữa cone voltage và số lượng ion có số khôi 505,25 Da đi vào bộ phân phân tích khối. 26

* Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ: Tối ưu hóa các điều kiện của nguồn ion hóa với sự có mặt của hệ dung môi sắc ký. Tối ưu hóa các thông số: thế ion hóa, nhiệt độ hóa hơi, tốc độ khí hóa hơi. Kết quả khảo sát cho thấy: - Khi điện thế đầu phun tăng trên 3kV, cường độ vạch phổ 505,25 Da tăng nhưng đồng thời nhiễu đường nền tăng. Điều này, có thể do khi điện thế tăng có nhiều phần tử được tích điện hơn (bao gồm cả BMD và tạp chất) làm cho dòng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối tăng lên đồng thời các ion khác đi vào bộ phận phân tích khối cũng tăng lên. Khi điện thế dưới 2,5 kV, thì cường độ vạch phổ 505,25 Da thấp, làm giảm độ nhạy của phương pháp. - Khi đặt nhiệt độ đầu phun tăng lên, cường độ tín hiệu tăng lên và ngược lại. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng cao trên 500oC hoặc hạ thấp dưới 300oC, cường độ tín hiệu thu được đều thấp và không ổn định. - Tốc độ khí hóa hơi trên 900 l/h thì cường độ dòng ion mẹ giảm xuống, có thể do lượng ion mẹ đi vào bộ phân phân tích khối bị giảm vì một phần ion bị thổi qua đường thải cùng dung môi pha động. Còn khi tốc độ hóa hơi dưới 900 l/h, hơi nước bị ngưng tụ ở đầu phun khiến cường độ tín hiệu thấp và không ổn định. Từ kết quả thực nghiệm, các thông số của nguồn ESI (+) tối ưu cho phân tích BMD được xác định là: Điện thế đầu phun: 2,75 kV; nhiệt độ đầu phun: 500oC; tốc độ khí hóa hơi 900 l/h. * Xác định ion con và mức năng lượng phân mảnh Sau khi phân mảnh ion mẹ, phân tích khối lần thứ 2 được thực hiện tại tứ cực Q3 với chế độ ghi toàn phổ MS/MS để xác định số khối của các ion con tạo thành.

Hình 3. 4: Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [BMD-H]+ 27

Nhận xét: Trong số các ion con được tạo thành từ quá trình phân mảnh [BMDH]+, hai ion có tỷ số m/z = 337,13 và m/z = 411,22 có cường độ cao, ổn định nhất, lặp lại và đặc trưng cho quá trình phân mảnh của ion mẹ. Tiến hành khảo sát mức năng lượng tối ưu để phân mảnh (collision energy). Dựa vào giản đồ thể hiện mối quan hệ giữa mức năng lượng được cung cấp để phân mảnh [BMD-H]+ và số lượng ion con; 11 V và 9 V được chọn là năng lượng tối ưu lần lượt để phân mảnh hai cặp ion mẹ - con 505,25 – 337,13 và 505,25 – 411,22.

Hình 3. 5: Giản đồ năng lượng phân mảnh (m/z 505,25 -> 337,13)

Hình 3. 6: Giản đồ năng lượng phân mảnh (m/z 505,25 -> 411,22)

28

Trong hai ion con được lựa chọn, ion có m/z = 411,22 Da có tín hiệu lớn và ổn định hơn nên được lựa chọn để định lượng. Như vậy, điều kiện khối phổ của betamethason dipropionat được lựa chọn là: ion mẹ có số khối là 505,25 Da, các ion con có số khối là 337,13 Da và 411,22 Da, điện thế tập trung ion mẹ là 24 V và năng lượng phân mảnh ion mẹ thành ion con tương ứng là 11 V và 9 V. b. Điều kiện khối phổ cho các GLU còn lại Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ cho các GLU còn lại tương tự như prednisolon thu được kết quả như bảng 3.2. Bảng 3. 2: Điều kiện khối phổ của các chất phân tích Tên chất phân tích

Mảnh ion mẹ (m/z)

Prednison

359,16

Thế tập trung ion (V) 34

Triamcinolon acetonid Dexamethason acetat Clobetason propionat Betamethason dipropionat

435,11

24

435,18

24

467,15

25

505,25

24

Năng lượng bắn phá (V)

Mảnh ion con (m/z)

Ghi chú

24 24 15 14 12 12 10 10 11 9

147,02 171,01 321,15 339,09 319,20 337,13 355,14 373,10 337,13 411,22

ĐL ĐL ĐL ĐL ĐL

Bảng 3. 3: Các thông số tối ưu của MS Số thứ tự

Thông số

Giá trị tối ưu

1

Thế ion hóa (kV)

2,75

2

Nhiệt độ hóa hơi (oC)

500

3

Tốc độ khí hóa hơi (l/h)

900

Các thông số tối ưu được lựa chọn ở bảng 3.2 và bảng 3.3 đã xác định được điều kiện khối phổ để phân tích các chất nghiên cứu. Các GLU nghiên cứu đều có ion mẹ ở dạng [M-H]+ có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z = M+1) cho cường độ lớn nhất. Từ đó mỗi chất phân tích được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con để định lượng và định tính. Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp

29

phân tích LC – MS/MS theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC) với số điểm nhận dạng (IP) là 4 (1 ion mẹ: 1 điểm và 2 ion con mỗi ion con: 1,5 điểm) [14]. 3.2.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký a. Lựa chọn pha tĩnh: Cột tách là bộ phận quan trọng của hệ thống sắc ký, đóng góp phần quan trọng quyết định quá trình sắc ký. Nhận thấy các GLU nghiên cứu đều là các hợp chất ít phân cực nên các cột sắc ký pha đảo C18 và C8 được lựa chọn để tiến hành khảo sát. Khảo sát trên các cột: Sunfire C18 (125 mm x 2,1 mm; 3,5 µm), Phenomenex C18 (150 mm x 4,6 mm; 5 µm), Acquity UPLC BEH C18 và C8 (100 mm x 2,1 mm; 1,7 µm và 50 mm x 2,1 mm; 1,7 µm). Sau quá trình thử nghiệm, nhận thấy cột Acquity UPLC BEH C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,7 µm) cho pic cân xứng, cho đáp ứng pic cao và thời gian phân tích phù hợp hơn so với những cột còn lại (Hình 3.7) nên đã được dùng để tách các GLU trong nghiên cứu này.

Hình 3. 7: SKĐ mẫu chuẩn khi sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 mm, 1,7 µm), pha động MeOH: Acid formic 0,1% (70:30, v/v) b. Khảo sát pha động: Trong LC – MS/MS, pha động không chỉ ảnh hưởng đến quá trình tách các chất mà nó còn ảnh hưởng đến quá trình ion hóa và tín hiệu của chất phân tích. Với pha tĩnh sử dụng là cột C18, không phân cực nên pha động phải là hệ dung môi phân cực. Do đó, pha động với 2 thành phần là (A) acetonitril hoặc methanol và (B) dung dịch acid formic 0,1% hoặc amoni format 2mM hoặc amoni acetat 10mM đã được sử dụng để khảo sát. Chuẩn hỗn hợp các GLU có nồng độ 100 µg/L được lựa chọn để khảo sát thành phần và chương trình pha động. 30

Kết quả khảo sát cho thấy hệ dung môi với thành phần methanol và acid formic 0,1% cho tín hiệu pic cao, sắc nét và cân đối nhất. Vì vậy, hệ dung môi methanol: acid formic 0,1% được sử dụng để tiếp tục nghiên cứu chương trình pha động. Sau quá trình tối ưu chương trình pha động để các pic thu được có cường độ tín hiệu cao và ổn định, chương trình gradient pha động được lựa chọn như trong bảng 3.4. Bảng 3. 4: Chương trình gradient dung môi Thời gian (phút)

Methanol (%)

Acid formic 0,1% (%)

0

20

80

1,0

72

28

6,5

72

28

7,0

90

10

7,1

20

80

10,0

20

80

Hình 3. 8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn khi sử dụng chương trình gradient 31

Tóm lại, từ kết quả nghiên cứu lựa chọn được các điều kiện sắc ký như sau: - Cột Acquity UPLC BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 µm) duy trì ở 40oC. - Tốc độ dòng pha động: 0,2 µl/ phút. - Thể tích tiêm mẫu: 5µl. - Pha động: Methanol : Acid formic 0,1% theo chương trình gradient dung môi ở bảng 3.4. - Thời gian phân tích: 10 phút. 3.2.3. Khảo sát và lựa chọn chuẩn nội Khảo sát lựa chọn chuẩn nội với các chất: glibenclamid, telmisartan, cloramphenicol, pyridoxin hydrochlorid. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ của từng chất này tương tự như betamethason dipropionat (mục 3.2.1.1). Nhận thấy glibenclamid và telmisartan có điều kiện khối phổ tương tự như các GLU phân tích, nên được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. Hai chất này khi tiến hành phân tích điều kiện khối phổ thì đều cho các mảnh ion bền vững, ổn định và cường độ tín hiệu cao. Khi áp dụng các điều kiện sắc ký của GLU thì cả 2 pic của glibenclamid và telmisartan có thời gian lưu nằm trong thời gian phân tích (10 phút); Tuy nhiên, glibenclamid cho pic đẹp, cân đối hơn. Đồng thời, khi áp dụng quy trình xử lý mẫu của GLU để chiết glibenclamid và telmisartan trong nền mẫu thì glibenclamid cho tỷ lệ thu hồi cao và ổn định hơn telmisartan.

Hình 3. 9: Sắc ký đồ của chuẩn glibenclamid Vì vậy glibenclamid (CTPT: C23H28ClN3O5S; KLPT: 493,0 g/mol) được lựa chọn làm chuẩn nội cho phương pháp LC – MS/MS định lượng đồng thời các GLU trong mỹ 32

phẩm. Điều kiện MS phân tích glibenclamid như sau: ion mẹ có số khối 494,04 Da; thế tập trung ion là 26 V; năng lượng phân mảnh ion ban đầu là 12 V và ion con có số khối là 368,97 Da.

3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 3.3.1. Sự phù hợp của hệ thống (system suitability) Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp các GLU S4 như bảng 3.1 (mục 3.1.5). Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần với điều kiện đã xác định trong mục 3.2. Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích pic. Kết quả sự phù hợp hệ thống được thể hiện trong bảng 3.5. Bảng 3. 5: Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC – MS/MS (n=6) Tên chất BMD CBP DXA TAA PRS

Thời gian lưu (RSD, %) 0,1 0,1 0,1 0 0

Diện tích pic ion con 1 (RSD, %) 2,1 1,4 2,4 4,3 1,7

Diện tích pic ion con 2 (RSD, %) 2,4 1,0 2,8 4,1 3,8

Tỷ lệ diện tích ion con định lượng so với chuẩn nội (RSD, %) 2,2 2,3 4,0 4,6 3,8

Nhận xét: Từ bảng 3.4 cho thấy RSD của thời gian lưu thấp (<1%) và RSD của các tỷ lệ diện tích pic dao động trong khoảng 1,0 – 4,6% tùy mỗi chất. Như vậy, hệ thống LC – MS/MS phù hợp để định tính, định lượng đồng thời các GLU theo yêu cầu của FDA [20]. 3.3.2. Độ đặc hiệu – chọn lọc (selectivity) Chuẩn bị nền mẫu, mẫu chuẩn S1 và mẫu tự tạo như mục 3.1. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần với điều kiện đã xác định trong mục 3.2. Kết quả thu được như sau:

(a)

(b)

33

(c) Hình 3. 10: Sắc ký đồ của các mẫu: (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, (c) mẫu tự tạo của triamcinolon acetonid - Sắc ký đồ đưa ra tại hình 3.9 cho thấy mẫu trắng không có tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích và chuẩn nội. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu tự tạo cho các pic GLU được nhận diện rõ ràng. - Sắc ký đồ của mẫu tự tạo cho thời gian lưu của các pic sắc ký tương ứng với thời gian lưu của các pic sắc ký trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn. Kết quả được thể hiện tại bảng 3.6. Bảng 3. 6: Kết quả so sánh thời gian lưu của các pic ở mẫu tự tạo và mẫu chuẩn Tên chất

Thời gian lưu-

Thời gian lưu-

Khoảng giá trị

Chênh lệch thời

Mẫu chuẩn

Mẫu tự tạo

thời gian lưu cho

gian lưu cho

(phút)

(phút)

phép

phép [20]

(TB ±SD) (n =6)

(TB ± SD) (n=6)

(phút)

PRS

3,30

3,30 ± 0,01

3,14 – 3,47

± 5%

TAA

3,70

3,70 ± 0,01

3,52 – 3,89

± 5%

DXA

4,00

3,99 ± 0,01

3,80 – 4,20

± 5%

CBP

4,87

4,86 ± 0,01

4,63 - 5,11

± 5%

BMD

5,61

5,62 ± 0,01

5,33 – 5,89

± 5%

- Trên sắc ký đồ mẫu tự tạo, mỗi chất đều cho tương ứng 2 ion con với tín hiệu rõ ràng, ổn định và tương ứng với mẫu chuẩn. Tỷ lệ cường độ ion thu được từ mẫu tự tạo so với mẫu chuẩn đạt yêu cầu của FDA [20]. Kết quả được thể hiện tại bảng 3.7.

34

Bảng 3. 7: Kết quả so sánh tỷ lệ cường độ ion ở mẫu tự tạo và mẫu chuẩn Tên chất

Tỷ lệ cường độ ionMẫu chuẩn (TB)

Tỷ lệ cường độ ion Mẫu tự tạo (TB ± SD)

PRS TAA DXA CBP BMD

0,59 0,53 0,76 0,74 0,39

0,59 ± 0,07 0,57 ± 0,04 0,75 ± 0,06 0,70 ± 0,05 0,38 ± 0,06

Khoảng giá trị tỷ lệ cường độ ion cho phép (so với giá trị TB trên mẫu chuẩn) 0,49 -0,69 0,43 – 0,63 0,66 – 0,86 0,64 – 0,84 0,29 – 0,49

Như vậy phương pháp phân tích đáp ứng yêu cầu về độ đặc hiệu – chọn lọc, thích hợp để phân tích đồng thời 5 GLU trong mỹ phẩm. 3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Xác định giới hạn phát hiên (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp bằng cách phân tích các mẫu tự tạo ở các nồng độ thấp dần và xác định giá trị tỷ số tín hiệu chiều cao pic và cường độ nhiễu nền (S/N). LOD được xác định tại nồng độ có S/N khoảng 3 và LOQ được xác định tại nồng độ có S/N khoảng 10. Kết quả thu được như sau: Bảng 3. 8: Giá trị LOD và LOQ của 5 glucocorticoid Tên chất BMD CBP DXA TAA PRS

LOD Trong dung dịch Trong mẫu (ng/ml) (µg/g) 0,8 0,1 1,2 0,1 3,1 0,3 2,0 0,2 2,0 0,2

LOQ Trong dung dịch Trong mẫu (ng/ml) (µg/g) 2,0 0,2 3,1 0,3 7,7 0,8 5,0 0,5 5,0 0,5

Hình 3. 11: Sắc ký đồ và S/N tại LOD của một số chất đại diện 35

Hình 3. 12: Sắc ký đồ và S/N tại LOQ của một số chất đại diện 3.3.4. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn (linearity) Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ các chất phân tích như Bảng 3.1 (mục 3.1.5). Xây dựng đường biểu diễn phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic và nồng độ các chất trong mẫu và tính độ chệch của các điểm dùng để xây dựng đường chuẩn. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.9 và Bảng 3.10. Bảng 3. 9: Kết quả khảo sát đường chuẩn của prednison, dexamethason acetat, clobetason propionat STT

Prednison

Dexamethason Clobetason acetat propionat Nồng độ Độ Nồng độ Độ Nồng độ Độ chệch (ng/ml) chệch (ng/ml) chệch (ng/ml) (%) (%) (%) S1 5,07 12,7 7,78 3,5 3,06 -10,4 S2 20,29 -8,1 31,11 -6,3 12,25 0,2 S3 40,59 -3,0 62,21 2,8 24,50 5,0 S4 50,74 5,8 77,76 1,7 30,63 1,9 S5 60,88 2,6 93,32 -0,5 36,75 2,8 S6 81,18 2,7 124,42 -0,8 49,00 0,1 S7 101,47 -0,9 155,53 0,0 61,25 1,0 Phương trình Y = 0,0323x – 0,0413 Y = 0,0210x + 0,0473 Y = 0,0517x – 0,0194 đường chuẩn Hệ số tương 0,9986 0,9997 0,9996 quan (R) Bảng 3. 10: Kết quả khảo sát đường chuẩn của betamethason dipropionate, triamcinolon acetonid. STT

S1 S2

Betamethason dipropionat Nồng độ Độ chệch (ng/ml) (%) 2,06 -14,1 8,22 -5,1 36

Triamcinolon acetonid Nồng độ Độ chệch (ng/ml) (%) 5,05 12,3 20,18 0,3

S3 S4 S5 S6 S7 Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan (R)

16,45 3,5 20,56 4,1 24,67 -1,2 32,90 4,2 41,12 -2,5 Y = 0,0733x – 0,0376

40,36 1,0 50,45 -3,7 60,54 -1,0 80,73 2,6 100,91 -9,4 Y = 0,0301x – 0,0264

0,9980

0,9988

Kết quả đưa ra tại bảng 3.9 và 3.10 cho thấy phương trình đường chuẩn của 5 GLU đều có hệ số tương quan lớn hơn 0,995. Do đó trong khoảng nồng độ khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ tương ứng. Nồng độ của cả 5 GLU xác định lại từ đường chuẩn so với giá trị lý thuyết đều nằm trong giới hạn cho phép (± 15% với tất cả các điểm của đường chuẩn, riêng tại nồng độ LOQ ± 20%) [10]. 3.3.5. Độ chính xác của phương pháp (accuracy) a. Độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp: Tiến hành sắc ký các mẫu tự tạo ở 3 mức nồng độ LOQ, MQC, HQC như mục 3.1.6, phân tích lặp lại 6 lần cho mỗi nồng độ. Các kết quả tính độ thu hồi (R) và độ lệch tương đối (RSD) được thể hiện trong Bảng 3.11. Bảng 3. 11: Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp (n=6) STT 1

Tên chất Prednison

2

Triamcinolon acetonid

3

Dexamethason acetat

4

Clobetason propionat

5

Betamethason dipropionat

Mức nồng độ LOQ MQC HQC LOQ MQC HQC LOQ MQC HQC LOQ MQC HQC LOQ MQC HQC

R (%) 98,8 ± 10,1 100,0 ± 7,7 97,4 ± 3,7 101,6 ± 9,0 96,8 ± 5,3 97,4 ± 3,4 104,9 ± 1,5 97,2 ± 3,1 97,4 ± 2,7 93,4 ± 5,5 97,5 ± 3,5 101,2 ± 4,0 97,1 ± 7,8 96,6 ± 4,2 97,9 ± 2,9

RSD (%) 10,2 7,7 3,8 8,9 5,5 3,5 11,0 3,2 2,7 5,9 3,5 3,9 8,1 4,4 3,0

Theo quy định của USFDA, độ thu hồi nằm trong khoảng từ 80 – 110% và RSD ≤ 8% ở MQC và HQC, RSD ≤ 11% ở LOQ. Kết quả thu được có độ đúng từ 87,9 –

37

107,7% và RSD từ 2,7 – 7,7% ở MQC, HQC và 5,9 – 11,0% ở LOQ; chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, độ lặp lại tốt khi phân tích GLU trong nền mẫu mỹ phẩm. b. Độ chụm trung gian của phương pháp (intermediate precision): Tiến hành tương tự như độ lặp lại của phương pháp nhưng tiến hành vào 2 ngày khác nhau. Kết quả độ chụm trung gian của phương pháp được thể hiện trong Bảng 3.12. Bảng 3. 12: Kết quả độ chụm trung gian của phương pháp (n=12) STT 1

Tên chất Prednison

2

Triamcinolon acetonid

3

Dexamethason acetat

4

Clobetason propionat

5

Betamethason dipropionat

Mức nồng độ LOQ MQC HQC LOQ MQC HQC LOQ MQC HQC LOQ MQC HQC LOQ MQC HQC

RSD (%) 9,5 6,3 3,4 8,9 4,5 3,1 9,9 3,4 3,4 9,0 4,0 3,1 10,5 4,5 2,8

Kết quả từ bảng 3.12 cho thấy ở các khoảng nồng độ LOQ, MQC, HQC của các mẫu tự tạo, phương pháp có độ chụm trung gian đạt yêu cầu quy định (giá trị RSD ≤ 8% ở nồng độ MQC, HQC và ≤ 11% ở nồng độ LOQ).

3.4. Kết quả xác định GLU trong các mẫu mỹ phẩm dạng kem trên thị trường Áp dụng phương pháp LC – MS/MS vừa xây dựng để phát hiện và xác định hàm lượng các GLU có mặt trái phép trong 24 mẫu mỹ phẩm dạng kem trên thị trường. Các mẫu kem được xử lý theo quy trình phân tích ở mục 3.1.4. Dựa trên các cơ sở sau để phân tích các mẫu: - Định tính: Tiến hành phân tích song song với chuẩn GLU tương ứng sử dụng kỹ thuật MRM. Khẳng định sự có mặt của GLU trong mẫu dựa trên các tiêu chí: 1-Xuất hiện pic tại cùng thời gian lưu với chuẩn GLU tương ứng (chênh lệch thời gian lưu không quá 5%). 38

2-Xuất hiện đồng thời cả 1 ion mẹ và 2 ion con theo dõi MRM. 3-Tỷ lệ cường độ giữa 2 ion con thu được trên mẫu thử phải nằm trong khoảng chênh lệch chấp nhận được so với tỷ lệ thu được trên chuẩn GLU tương ứng phân tích trong cùng ngày (xem bảng 3.13). Bảng 3. 13: Thông tin sử dụng để định tính các GLU Hoạt chất

Prednison Triamcinolon acetonid Dexamethason acetat Clobetasol propionat Betamethason dipropionat

Khoảng giá trị tỷ lệ cường độ 2 ion con cần thu được trên mẫu thử để kết luận sơ bộ có mặt GLU 0,507 – 0,707

Chênh lệch tỷ lệ cường độ 2 ion con thu được trên mẫu thử so với chuẩn phân tích đồng thời để kết luận có mặt GLU ± 10%

0,435 – 0,635

± 10%

0,666 – 0,866

± 10%

0,647 – 0,847

± 10%

0,289 – 0,489

± 10%

- Định lượng: Dựa vào lượng cân mẫu chuẩn, mẫu thử; tỷ lệ diện tích pic so với chuẩn nội của mẫu chuẩn, mẫu thử và độ pha loãng, tính ra hàm lượng GLU có mặt trong mẫu thử. Kết quả được tổng hợp trong bảng 3.14. Bảng 3. 14: Kết quả xác định GLU trong mẫu mỹ phẩm thực tế Mẫu

Chỉ tiêu phân tích (mg/g) Prednison Triamcinolon Dexamethason Clobetason

Betamethason

acetonid

acetat

propionat

dipropionat

M1

-

-

-

-

-

M2

-

-

-

-

-

M3

-

-

-

-

-

M4

-

-

-

-

-

M5

-

-

-

-

-

M6

-

-

-

-

-

M7

-

-

-

-

-

M8

-

-

-

-

-

39

M9

-

-

-

-

-

M10

-

-

-

-

-

M11

-

-

-

0,22

-

M12

-

-

-

-

-

M13

-

-

-

-

-

M14

-

-

-

-

-

M15

-

-

-

-

-

M16

-

0,51

-

-

-

M17

-

-

-

-

-

M18

-

-

0,53

-

-

M19

-

0,06

-

-

-

M20

-

-

-

-

-

M21

-

-

-

-

-

M22

-

-

-

-

-

M23

-

-

-

-

-

M24

-

-

-

-

0,57

Ghi chú: (-) là không phát hiện thấy. Kết quả đưa ra tại bảng 3.14 cho thấy trong 24 mẫu mỹ phẩm được kiểm tra, phát hiện 5 mẫu mỹ phẩm có chứa GLU có hàm lượng từ 0,06 – 0,57 mg/g.

40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau quá trình nghiên cứu, khóa luận đã đạt được các mục tiêu đề ra. Các kết quả đạt được cụ thể như sau: 1. Đã khảo sát và đưa ra quy trình xử lý mẫu tối ưu (Hình 3.1). 2. Đã xây dựng được phương pháp xác định đồng thời 05 GLU (prednison, triamcinolon acetonid, dexamethason acetat, clobetason propionat, betamethason dipropionat) trong mỹ phẩm bằng LC – MS/MS. Các điều kiện phân tích như sau: - Điều kiện khối phổ: Nguồn ion hóa ESI (+) với các thông số tối ưu và điều kiện khối phổ của các chất phân tích như trong bảng 3.2 và bảng 3.3. - Điều kiện sắc ký: + Pha động: methanol – dung dịch acid formic 0,1%, theo chương trình gradient dung môi ở bảng 3.4. + Cột Acquity UPLC BEH C18 (50 x 2,1 mm, 1,7 µm), duy trì ở 400C. + Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút. + Thể tích tiêm mẫu: 5 µl. - Chất chuẩn nội: Glibenclamid. 3. Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn của USFDA về thẩm định phương pháp phân tích trong mỹ phẩm. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện từ 0,8 – 3,1 (ng/ml), giới hạn định lượng từ 2,0 – 7,7 (ng/ml), khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chụm đều đạt yêu cầu, có khả năng định tính và định lượng đồng thời 05 GLU trong mỹ phẩm dạng kem. 4. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để kiểm tra sự có mặt của các GLU trong 24 mẫu mỹ phẩm dạng kem trên thị trường. Kết quả cho thấy 5 mẫu (21%) có chứa trái phép GLU.

KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu và phát triển phương pháp trên các chất khác cùng nhóm Glucocortioid, nhằm xây dựng một phương pháp có thể phát hiện đồng thời nhiều chất hơn, phát huy tối đa ưu thế của detector khối phổ. Cần kiểm tra chặt chẽ, rộng rãi hơn sự có mặt trái phép của các GLU trong mỹ phẩm.

41

TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1.

Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2012), Hóa phân tích tập 2, Nhà xuất bản Y học, tr. 107-121, 295-318.

2.

Trần Tử An, Trần Tích (2007), Hóa phân tích tập 1, Nhà xuất bản Y học, tr. 1925, 35-52.

3.

Bệnh viện Da liễu Trung ương "Các thương tổn da do Steroid tại chỗ".

4.

Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.

5.

Lê Thị Hường Hoa (2013), Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất cấm sử dụng trong mỹ phẩm, luận án Tiến sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

6.

Thái Nguyễn Hùng Thu, Lê Thị Hường Hoa (2019), Kiểm nghiệm mỹ phẩm, Nhà xuất bản Y học, tr. 77-82.

7.

Tạ Mạnh Hùng (2016), Nghiên cứu định lượng atenolol và các đồng phân đối quang trong một số chế phẩm thuốc và trong dịch sinh học, Luận án Tiến sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Hà Nội.

8.

Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2006), Dược lý học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 255-258.

9.

Hoàng Thanh Tâm (2008), Xây dựng phương pháp phát hiện một số chất thuộc nhóm glococorticoid trộn trái phép trong mỹ phẩm, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội.

10.

Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tr. 16-59.

11.

Vũ Phương Thảo (1993), Hóa dược, Nhà xuất bản y học, tr. 50-65.

II. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 12.

ASEAN Association of South East Asian nation (2005), Identification of hydrocortisone acetate, dexamethasone, betamethasone, betamethason 17valerate and triamcinolone acetonide in cosmetic products by TLC and HPLC.

13.

ASEAN Association of South East Asian nation (2019), Annex of the Asean cosmetics directive.

14.

Commission European (2002), "Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results", Official journal of the European Communities, 221, pp. 8-36.

15.

Fiori Jessica, Andrisano Vincenza (2014), "LCâ&#x20AC;&#x201C;MS method for the simultaneous determination of six glucocorticoids in pharmaceutical formulations and counterfeit cosmetic products", Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 91, pp. 185-192.

16.

Giaccone Vita, Polizzotto Giuseppe, et al. (2017), "Determination of ten corticosteroids in illegal cosmetic products by a simple, rapid, and highperformance LC-MS/MS method", International journal of analytical chemistry, 2017.

17.

HAURI Urs, HOHL Christopher (2004), "Determination of clandestine corticosteroids

in

cosmetics

with

LC/DAD/MS",

Mitteilungen

aus

Lebensmitteluntersuchung und Hygiene, 95(5), pp. 466-476. 18.

Kim Nam Sook, Yoo Geum Joo, et al. (2017), "Determination of 43 prohibited glucocorticoids in cosmetic products using a simultaneous LC-MS/MS method", Analytical methods, 9(13), pp. 2104-2115.

19.

Nam Yun Sik, Kwon Il Keun, et al. (2012), "Quantitative monitoring of corticosteroids in cosmetic products manufactured in Korea using LCâ&#x20AC;&#x201C;MS/MS", Forensic science international, 220(1-3), pp. e23-e28.

20.

United States Food and Drug administration (2019), Guideline for the validation of chemical methods in food, feed, cosmetics and veterinary products.

21.

United States Food and Drug administration (2003), Guidance for industry: Mass spectrometry for confirmation of the identity of animal drug residues.

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh mục mỹ phẩm được kiểm tra STT

Tên mẫu

Nơi sản xuất

Số lô

Hạn dùng

1

POND'S White beauty Kem dưỡng trắng hồng tinh khiết ban ngày Rebirth original placenta anti-wrinkle cream Olay natural white pinkish fairness whitening cream Curel kem dưỡng da cấp ẩm chuyên sâu Kem trị nám, tàn nhang Lotus special YC527 so white total solutions Kem dưỡng trắng và giảm thâm nám ban đêm ZA True white ex night cream Kem vitamin dưỡng trắng white perfect day cream Kem dưỡng da giữ ẩm Bạch Liên Herbal special Hanatural Kem dưỡng trắng giúp tái tạo da giữ ẩm- se khít lỗ chân lông Kem ngừa nám cao cấp One today

Công ty TNHH Quốc tế Unielever Việt Nam

12

04/01/2021

Lanopearl LTD Ltd, Australia

B D28KH

24/01/2022

P & G, Thái Lan

83444811J2

10/2021

Kao Corporation, Nhật Bản Công ty Cổ phần Nam Hải Long Thái Lan

2158

08/2021

040518lW1

05/04/2021

LOT02

07/2023

Shiseido Việt Nam

9014BF

14/01/2024

Loreal, Indonesia

M15350

13/01/2020

Công ty Cổ phần Nam Hải Long

210418HW1

21/04/2021

Công ty Dược Mỹ phẩm Elle Việt Nam

HSKCL25

14/11/2021

Công ty TNHH MTV SX và TM MP Đăng Dương Việt Nam Công ty TNHH Greenbon Việt Nam Thảo dược Đông Giang Đường, Việt Nam

01DD1915

05/2020

K21

01/05/2020

1

11/06/2021

2

3

4 5 6 7

8

9

10

11

12

13

Greenbon Night cream kem nghệ nếp đỏ Cao đặc trị nám- tàn nhang

14

15

16 17

18

19 20

21

22

23 24

Privia Kem dưỡng ẩm làm trắng da và chống nhăn Kem thuốc bắc dưỡng da-trị mụn night cream Thảo mộc dân tộc: Thanh mộc hương Hada Labo perfect white kem dưỡng trắng

Privia Co, Ltd Hàn Quốc Chi's natural Việt Nam

KD001

18/01/2023

Không có thông tin 01/11/2020

HTX dân tộc Dao Không có thông tin 01/2020 Yên Sơn, Ba Vì Công ty TNHH AV01 01/03/2022 RohtoMentholatumViệt Nam Kem đặc trị nám mụn Công ty TNHH 20180522 10/01/2022 Ngự y triều Nguyễn Đông dược Ngự y triều Nguyễn Kem bôi da Thuần Việt Nam Không có thông tin mộc Dr Mai herbal Công ty TNHH 012019.A00047355 12/10/2020 cosmetic TM DV SX Mỹ phẩm M.A.I Việt Nam Bio essence dòng sản L.D Waxson 007B 12/2021 phẩm dưỡng trắng Quanzhou chuyên sâu bio-white Trung Quốc chiết xuất tanaka và camellia Kem dưỡng da 7 tác Công ty Cổ phần 051217B1 12/5/2020 dụng Bạch Liên: Nam Hải Long Herbal Kem nám Bạch Liên: Công ty Cổ phần 030518LN1 5/3/2021 Lotus new night Nam Hải Long Kem khách gửi Không có thông tin

Phụ lục 2: Kết quả thẩm định 2.1. Kết quả thẩm định độ chụm trung gian của phương pháp Tên chất

Mẫu LOQ STT 1

2 3 PRS 4 5 6 TB* RSD* 1 2 3 TAA 4 5 6 TB* RSD* 1 2 3 DXA 4 5 6 TB* RSD* 1 2 3 4 CBP 5 6 TB* RSD* 1 2 3 BMD 4 5 6 TB* RSD*

Mẫu MQC

Tỷ lệa

Nồng độb

Thu hồic

Tỷ lệa

0,153 0,137 0,132 0,125 0,141 0,109

6,06 5,56 5,41 5,19 5,69 4,69

1,79 1,558 1,547 1,582 1,601 1,637

0,142 0,145 0,122 0,105 0,134 0,12

5,60 5,70 4,93 4,37 5,33 4,87

0,195 0,238 0,209 0,215 0,199 0,218

7,05 9,10 7,71 8,00 7,24 8,14

0,104 0,095 0,134 0,128 0,133 0,125

2,41 2,24 3,00 2,88 2,98 2,82

2,04 2,04 2,04 2,04 2,04 2,04

0,082 0,075 0,103 0,111 0,095 0,088

117,0 107,3 104,3 100,1 109,7 90,4 101,8 9,5 110,8 112,8 97,6 86,4 105,5 96,3 101,6 8,9 91,2 117,6 99,8 103,5 93,6 105,3 103,4 9,9 79,9 74,1 99,4 95,5 98,8 93,6 91,8 9,0 1,63 1,53 1,92 2,03 1,81 1,71 92,0 10,5

1,432 1,449 1,55 1,467 1,39 1,473

1,707 1,639 1,586 1,679 1,717 1,589

1,618 1,515 1,557 1,465 1,422 1,501

1,525 1,471 1,338 1,459 1,377 1,39

Nồng độb

Thu hồic

Mẫu HQC Tỷ lệa

Nồng độb

Thu hồic

57,22 110,4 3,23 102,22 98,6 49,97 96,4 3,427 108,38 104,6 49,63 95,8 3,201 101,31 97,7 50,72 97,9 3,33 105,34 101,6 51,31 99,0 3,187 100,88 97,3 52,44 101,2 3,199 101,25 97,7 100,0 98,5 6,3 3,4 48,60 96,1 2,801 94,23 93,2 49,17 97,3 2,789 93,83 92,8 52,53 103,9 2,883 96,97 95,9 49,77 98,4 2,941 98,90 97,8 47,20 93,4 2,99 100,53 99,4 49,97 98,8 2,956 99,40 98,3 97,4 96,8 4,5 3,1 79,05 102,2 3,325 156,10 100,9 75,81 98,1 3,408 160,05 103,5 73,29 94,8 3,211 150,67 97,4 77,71 100,5 3,19 149,67 96,8 79,52 102,9 3,446 161,86 104,7 73,43 95,0 3,378 158,62 102,6 98,1 99,2 3,4 3,4 32,10 106,4 3,087 60,90 100,9 30,08 99,7 3,202 63,16 104,6 30,90 102,4 3,001 59,22 98,1 29,10 96,4 3,114 61,43 101,8 28,25 93,6 3,007 59,33 98,3 29,80 98,8 3,125 61,65 102,1 98,5 101,1 4,0 3,1 21,40 104,9 2,953 40,96 100,4 20,66 101,3 3,038 42,12 103,2 18,84 92,3 2,844 39,47 96,7 20,49 100,4 2,909 40,36 98,9 19,37 94,9 3,005 41,67 102,1 19,55 95,8 2,878 39,93 97,9 97,5 98,9 4,3 2,8

(a): Tỷ lệ diện tích so với chuẩn nội. (b): Nồng độ tính lại từ đường chuẩn (ng/ml). (c): % thu hồi so với nồng độ thêm vào. 2.2. Kết quả thẩm định độ đúng, độ lặp lại Tên chất

PRS

TAA

DXA

CBP

Mẫu LOQ STT 1 2 3 4 5 6 TB RSD 1 2 3 4 5 6 TB RSD 1 2 3 4 5 6 TB RSD 1 2 3 4 5 6 TB RSD 1 2

Mẫu MQC

Tỷ Nồng Thu Tỷ Nồng lệa độb hồic lệa độb 0,171 5,61 108,3 1,738 56,16 0,175 5,74 110,8 1,735 56,06 0,163 5,35 103,3 1,627 52,58 0,147 4,84 93,4 1,558 50,35 0,142 4,68 90,3 1,421 45,94 0,136 4,48 86,5 1,538 49,71 98,8 10,2 0,156 5,64 110,9 1,433 51,25 0,161 5,82 114,4 1,503 53,75 0,128 4,64 91,2 1,347 48,18 0,135 4,89 96,1 1,338 47,86 0,139 5,04 98,9 1,344 48,07 0,138 5,00 98,2 1,297 46,39 101,6 8,9 0,208 9,95 127,2 1,676 76,68 0,169 8,18 104,5 1,737 79,45 0,151 7,36 94,1 1,711 78,27 0,163 7,91 101,0 1,632 74,68 0,167 8,09 103,4 1,629 74,55 0,16 7,77 99,3 1,598 73,14 104,9 11,0 0,111 2,81 92,9 1,592 30,75 0,111 2,81 92,9 1,56 30,15 0,127 3,11 102,9 1,486 28,75 0,106 2,72 89,8 1,437 27,83 0,101 2,62 86,6 1,541 29,79 0,115 2,89 95,4 1,536 29,70 93,4 5,9 0,069 2,17 106,1 1,534 20,04 0,070 2,18 106,7 1,620 21,09

Thu hồic 108,4 108,2 101,5 97,2 88,6 95,9 100,0 7,7 100,7 105,6 94,7 94,0 94,5 91,2 96,8 5,5 98,0 101,5 100,0 95,4 95,2 93,4 97,2 3,2 101,6 99,6 95,0 91,9 98,4 98,1 97,5 3,5 97,9 103,0

Mẫu HQC Tỷ Nồng Thu lệa độb hồic 3,285 106,06 102,3 3,194 103,13 99,5 3,015 97,35 93,9 3,041 98,19 94,7 3,009 97,16 93,7 3,21 103,65 100,0 97,4 3,8 2,776 99,21 97,5 2,628 93,93 92,3 2,837 101,39 99,6 2,698 96,43 94,7 2,8 100,07 98,3 2,9 103,64 101,8 97,4 3,5 3,279 149,55 95,5 3,398 154,95 99,0 3,415 155,73 99,5 3,185 145,27 92,8 3,4 155,05 99,0 3,388 154,50 98,7 97,4 2,7 3,316 63,28 104,5 3,146 60,08 99,2 3,2 61,09 100,9 3,046 58,19 96,1 3,4 64,87 107,2 3,149 60,13 99,3 101,2 3,9 3,160 39,87 97,4 3,075 38,83 94,9

3 BMD 4 5 6 TB RSD

0,056 0,042 0,041 0,046

2,01 1,84 1,83 1,89

98,3 90,0 89,4 92,4 97,1 8,1

1,521 1,400 1,493 1,507

(a): Tỷ lệ diện tích so với chuẩn nội. (b): Nồng độ tính lại từ đường chuẩn (ng/ml). (c): % thu hồi so với nồng độ thêm vào.

19,88 18,40 19,54 19,71

97,1 89,9 95,5 96,3 96,6 4,4

3,231 3,056 3,310 3,221

40,73 38,60 41,70 40,61

99,5 94,3 101,9 99,2 97,9 3,0

Phụ lục 3: Sắc ký đồ một số mẫu mỹ phẩm trên thị trường * Mẫu M18: MAU THU03-Mar-2020 M18-1

8: MRM of 2 Channels ES+ 435.18 > 337.13 (DEXAMETHASON ACETAT) 5.75e6

4.00

%

100

0 2.00

3.00

4.00

5.00

M18-1 4.00

7.00 8.00 8: MRM of 2 Channels ES+ 435.18 > 319.2 (DEXAMETHASON ACETAT) 4.38e6

%

100

6.00

0

Time 2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

* Mẫu M19: MAU THU03-Mar-2020 M19-1

7: MRM of 2 Channels ES+ 435.11 > 339.09 (TRIAMCINOLON ACETONID) 1.58e6

3.70

%

100

0 2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

4.00

5.00

6.00

M19-1 3.70

%

100

7.00 8.00 7: MRM of 2 Channels ES+ 435.11 > 321.15 (TRIAMCINOLON ACETONID) 8.58e5

0

Time 2.00

3.00

7.00

8.00

* Mẫu M24: 07-Mar-2020 KEM 2

13: MRM of 2 Channels ES+ 505.25 > 411.22 (BETAMETHASON DIPROPIONAT) 2.03e7

5.70

%

100

0 1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50

5.00

5.50

6.00

KEM 2 5.70

6.50 7.00 7.50 8.00 13: MRM of 2 Channels ES+ 505.25 > 337.13 (BETAMETHASON DIPROPIONAT) 7.93e6

%

100

0

Time 1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

4.00

4.50

5.00

5.50

6.00

6.50

7.00

7.50

8.00