BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THU HÀ
NGHIÊN CỨU LOẠI CAFEIN TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CHÈ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2019
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THU HÀ
1401169
NGHIÊN CỨU LOẠI CAFEIN TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CHÈ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS. Trần Trọng Biên Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược
HÀ NỘI – 2019
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn trân trọng và sâu sắc tới DS. Trần Trọng Biên, tổ Chiết xuất - bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ và tạo điệu kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Văn Hân, TS. Bùi Thị Thúy Luyện đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội, các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, động viên, giúp đỡ em những lúc khó khăn để em có thể đạt được kết quả ngày hôm nay. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thu Hà
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................. 2 1.1. Giới thiệu về cây Chè ................................................................................. 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố................................................................. 2 1.1.2. Tình hình sản xuất Chè tại Việt Nam.................................................. 2 1.1.3. Thành phần hóa học ............................................................................ 2 1.2. Một số nghiên cứu về loại cafein từ Chè xanh .......................................... 6 1.2.1. Loại cafein từ lá Chè ........................................................................... 6 1.2.2. Loại cafein từ dịch chiết lá Chè .......................................................... 8 1.3. Một số chất hấp phụ sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 9 1.3.1. Montmorillonit .................................................................................... 9 1.3.2. Nhựa macroporous ............................................................................ 13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................................................... 15 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị.............................................................. 15 2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................... 15 2.1.2. Chất chuẩn và hóa chất ..................................................................... 15 2.1.3. Thiết bị thí nghiệm ............................................................................ 17 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 17 2.3.1. Chiết xuất và điều chế cao thô .......................................................... 17 2.3.2. Quá trình hấp phụ .............................................................................. 18 2.3.3. Phương pháp định lượng cafein và EGCG ....................................... 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 21 3.1. Thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG trong lá Chè xanh ......................................................................................................................... 21
3.1.1. Độ đặc hiệu........................................................................................ 21 3.1.2. Độ thích hợp hệ thống ....................................................................... 22 3.1.3. Khoảng tuyến tính ............................................................................. 22 3.1.4. Độ lặp lại ........................................................................................... 23 3.1.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ....................................... 24 3.2. Nghiên cứu sàng lọc các chất hấp phụ ..................................................... 24 3.2.1. Tính chọn lọc của các chất hấp phụ .................................................. 25 3.3.2. So sánh các chất hấp phụ .................................................................. 26 3.3. Nghiên cứu loại cafein bằng MMT .......................................................... 26 3.3.1. Động học hấp phụ cafein trên MMT ................................................. 26 3.3.2. Đường hấp phụ đẳng nhiệt ................................................................ 29 3.3.3. Ảnh hưởng của pH dịch chiết ........................................................... 32 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................... 32 3.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol ....................................................... 33 3.4. Quy trình loại cafein................................................................................. 34 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................... 38 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
EGCG
Epigallocatechin gallat
HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)
LOD
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)
LOQ
Giới hạn định lượng (Litmit of Quantifitation)
RSD
Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)
tt/tt
Thể tích/thể tích
kl/tt
Khối lượng/thể tích
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả thời gian lưu và diện tích píc của dung dịch chuẩn hỗn hợp 22 Bảng 3.2. Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein và EGCG ....... 23 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng .................. 24 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian đến dung lượng hấp phụ của cafein trên MMT ................................................................................................................... 27 Bảng 3.5. Dữ liệu thực nghiệm mô hình giả bậc 1 ............................................. 28 Bảng 3.6. Dữ liệu thực nghiệm mô hình giả bậc 2 ............................................. 28 Bảng 3.7. Các thông số mô hình động học hấp phụ cafein trên MMT 4 ............ 29 Bảng 3.8. Kết quả thực nghiệm hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25oC ............................................................................................................................. 30 Bảng 3.9. Các thông số mô hình hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25°C ..................................................................................................................... 31 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH dịch chiết đến quá trình loại cafein ................... 32 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình loại cafein ........................... 33 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình loại cafein............... 34
DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số loại catechin .......................................... 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cafein ................................................................ 5 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của montmorillonit .................................................. 10 Hình 1.4. Các vị trí tương tác của montmorillonit .............................................. 11 Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu ............................................. 21 Hình 3.2. Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ ............. 23 Hình 3.3. Ảnh hưởng của các loại chất hấp phụ đến dung lượng hấp phụ cafein, EGCG và hệ số chọn lọc ..................................................................................... 25 Hình 3.4. Ảnh hưởng của các loại chất hấp phụ đến tỷ lệ cafein loại đi và tỷ lệ EGCG còn lại trong dịch chiết ............................................................................ 26 Hình 3.5. Động học hấp phụ cafein trên MMT 4 ................................................ 27 Hình 3.6. Đồ thị động học hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (a) và dịch chiết (b) trên MMT theo mô hình giả bậc 1. ................................................................ 28 Hình 3.7. Đồ thị động học hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (c) và dịch chiết (d) trên MMT theo mô hình giả bậc 2. ................................................................ 28 Hình 3.8. Đường đẳng nhiệt hấp phụ cafein trên MMT ở 25°C ......................... 30 Hình 3.9. Đồ thị hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25°C ................... 31 Hình 3.10. Đồ thị ảnh hưởng của pH dịch chiết đến quá trình loại cafein ......... 32 Hình 3.11. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình loại cafein .................. 33 Hình 3.12. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình loại cafein ..... 34 Hình 3.13. Sơ đồ tóm tắt quy trình loại cafein từ dịch chiết Chè ....................... 35 Hình 3.14. Cao loại cafein................................................................................... 35 Hình 3.15. Sắc ký đồ cao thô (a) và cao loại cafein lần 1,2,3 (b1, b2, b3) ......... 37 Hình 4.1. Minh họa cơ chế hấp phụ cafein trên montmorillonit ......................... 39 Hình 4.2. Dịch chiết Chè tự nhiên (1), dịch chiết có MMT và acid citric (2) và dịch chiết có MMT không có acid citric (3) sau khi lắc 1 giờ ............................ 40
ĐẶT VẤN ĐỀ Chè xanh (Camellia sinensis (L.) Kuntze), thuộc họ Chè - Theaceae, là loài cây được phát triển mạnh trên nhiều nước trên thế giới [2]. Trong Chè xanh, Catechin - nhóm các hợp chất polyphenol đã được biết đến với hoạt tính chống oxy hóa nổi bật giúp giảm thiểu nguy cơ nhiều bệnh như ung thư, tiểu đường, béo phì, lão hóa. Trong đó, epigallocatechin gallat (EGCG) là catechin chính trong Chè xanh với hàm lượng lớn nhất (khoảng 50% tổng lượng catechin) [16]. Tuy nhiên, trong lá Chè còn chứa một lượng lớn cafein (khoảng 2 %) với các tác động tiêu cực gồm rối loạn giấc ngủ, tăng huyết áp, rối loạn tiêu hóa, sẩy thai [6]. Do đó, nhu cầu sử dụng các sản phẩm chứa hàm lượng cafein thấp từ Chè xanh của người tiêu dùng hiện nay ngày càng gia tăng. Đến nay đã có nhiều phương pháp loại cafein dựa trên hai hướng tiếp cận là loại bỏ cafein từ lá Chè trong quá trình xử lý nguyên liệu và loại bỏ cafein trong dịch chiết Chè. Nhưng chưa có phương pháp nào thực sự hiệu quả vì hàm lượng cafein bị loại đi còn thấp hoặc ngoài cafein còn làm giảm đáng kể các chất khác như catechin trong Chè [32]. Trên thế giới hiện nay, các chất hấp phụ (như montmorillonit) đang ngày càng được phát triển và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực do khả năng hấp phụ chọn lọc, an toàn, kinh tế [25]. Nhằm ứng dụng phương pháp hấp phụ vào việc tạo ra sản phẩm cao Chè ít cafein, đề tài “Nghiên cứu loại cafein từ dịch chiết lá Chè bằng phương pháp hấp phụ” được thực hiện với mục tiêu: Khảo sát và lựa chọn được các thông số kỹ thuật thích hợp cho quá trình loại cafein từ dịch chiết lá Chè xanh bằng montmorillonit.
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây Chè 1.1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố Chè hay còn gọi là trà, có tên khoa học là Camellia sinensis (L.) O.Kuntze, thuộc họ Chè - Theaceae [2]. Chè là cây thân gỗ, mọc hoang, khi không cắt xén có thể cao tới 10 mét, đường kính thân lớn, có thể một người ôm không xuể. Đôi khi mọc thành rừng gỗ trên núi đá cao. Nhưng khi trồng, để phù hợp với việc thu hái, người ta thường cắt tỉa để cây chỉ cao ít nhất là 2 mét. Nhiều cành đâm ngay từ gốc. Lá mọc so le, không rụng. Hoa to trắng, mọc ở kẽ lá, mùi thơm, nhiều nhị. Quả nang, thường có 3 ngăn nhưng chỉ có một hạt do các hạt khác teo đi [5]. Cây Chè được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới, tiêu biểu là Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Nhật Bản và một số nước châu Á. Ở nước ta, Chè được trồng khắp nơi, nhất là những vùng đồi, núi thấp, tương đối bằng phẳng. Cây thích nghi với khí hậu nhiệt đới, ưa ánh sáng, chịu hạn. Chè không kén đất, nhưng chất đất, nhất là các yếu tố vi lượng có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng, hương vị của Chè. Đây là nguyên nhân Chè được trồng chủ yếu ở Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà Giang, Phú Thọ, Lâm Đồng, Đắc Lắc… [4], [5]. 1.1.2. Tình hình sản xuất Chè tại Việt Nam Việt Nam là một nước có sản lượng Chè lớn. Năm 2018, tổng diện tích trồng Chè cả nước khoảng 134,7 nghìn hecta, sản lượng Chè búp đạt 1 triệu tấn, với rất nhiều loại Chè thương phẩm khác nhau, trong đó chủ yếu là Chè đen, còn lại là Chè xanh và các loại khác. Chè cũng là một trong những mặt hàng xuất khẩu quan trọng của Việt Nam [1], [4]. 1.1.3. Thành phần hóa học Thành phần hóa học của Chè biến đổi phụ thuộc vào giống, tuổi Chè, điều kiện đất đai, địa hình, kỹ thuật canh tác và mùa thu hoạch [2]. Trong búp Chè có polyphenol (30 - 36%), cafein (3 - 5%), protein, carbohydrat, theanin, acid amin, acid hữa cơ, chlorophyll, enzym, chất khoáng,… Trong đó, polyphenol (chủ yếu
2
là các catechin) và cafein là những thành phần quan trọng quyết định hương vị của sản phẩm [1]. 1.1.3.1. Catechin Cấu trúc: Catechin là tên gọi chung chỉ các flavonoid mang khung flavan-3-ol thường gặp trong lá Chè và còn được gọi là catechin Chè xanh, polyphenol Chè xanh. Trong cấu trúc của catechin có 2 C bất đối (C2 và C3), mỗi dẫn chất có 4 đồng phân nên có thể có 24 catechin khác nhau, tuy nhiên hiện nay mới có 12 catechin đã được được phân lập và xác định cấu trúc từ lá Chè xanh [1].
1
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của một số loại catechin
Về cấu tạo, các catechin có thể chia thành 2 nhóm: epicatechin (đồng phân 2R và 3R) và nonepicatechin (catechin), cũng có thể phân thành catechin tự do và catechin ester hóa [1].
3
Catechin Chè xanh chủ yếu là các epicatechin, trong đó EGCG chiếm 10 50% tổng lượng catechin. Nonepicatechin chỉ chiếm một lượng nhỏ. Hàm lượng mỗi catechin trong các giống Chè và các bộ phận của Chè khác nhau, giảm dần theo thứ tự EGCG > EGC > ECG >EC [1]. Tính chất: Catechin là các hợp chất không màu, kết tinh hình kim hoặc hình lăng trụ, có vị chát. Tan trong nước và một số dung môi hữu cơ [1]. Catechin có tính khử mạnh, dễ bị oxy hóa, nhạy cảm với enzym oxy hóa trong lá Chè. Catechin kém bền với môi trường acid mạnh, phân hủy nhanh trong khoảng pH từ 4 đến 8, đặc biệt kém bền trong môi trường pH > 8. Catechin bền vững nhất trong môi trường acid nhẹ (pH ~ 4). Ngoài ra, catechin còn kém bền với nhiệt độ (> 80oC) [1]. Do vậy để tăng độ ổn định của catechin trong quá trình chiết xuất, cần kiểm soát chất lượng nước, nhiệt độ chiết xuất ,bổ sung các chất chống oxy hóa, ổn định và điều chỉnh pH (EDTA, acid ascorbic, acid citric…) [1]. Tác dụng dược lý: Tác dụng nổi bật nhất của các catechin là khả năng chống oxy hóa. Trong đó EGCG là chất có hoạt tính cao nhất, hoạt tính chống oxy hóa của EGCG cao gấp 100 lần vitamin C và cao hơn 25 lần so với vitamin E [13]. Ngoài ra, catechin còn có tác dụng chống ung thư, diệt khuẩn, kháng viêm, kháng virus, giảm cholesterol, chống lão hóa, tiểu đường [16]. Do vậy, catechin Chè xanh được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và dinh dưỡng. 1.1.3.2. Cafein Trong lá Chè, cafein là alkaloid chính (2,5 - 4,5%), ngoài ra còn có lượng rất nhỏ theophyllin, theobromin, adenin và xanthin [2]. Thông thường, một cốc trà 250 ml chứa 10 - 45 mg cafein, và hàm lượng này thay đổi tùy theo lượng trà, thể tích nước, nhiệt độ pha và thời gian hãm trà [35].
4
2
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cafein
Công thức phân tử: C8H10N4O2. Trọng lượng phân tử: 194,2 [3]. Tính chất: Cafein ở dưới dạng tinh thể trắng, mịn hay bột kết tinh trắng, không mùi, vị hơi đắng, nóng chảy ở 234oC - 238°C. Khi đun nóng ở 100oC cafein sẽ mất nước và thăng hoa ở khoảng 200oC [3]. Cafein hơi tan trong nước, dễ tan trong nước sôi, cloroform, khó tan trong ethanol và ether, tan trong các dung dịch acid và trong các dung dịch đậm đặc của benzoat hay salicylat kiềm. Dung dịch cafein trong nước có phản ứng trung tính với giấy quỳ [3]. Cafein là một chất có hoạt tính base yếu, chỉ tạo muối với các acid mạnh và các muối này không bền, dễ bị phân ly. Trong môi trường kiềm, cafein dễ bị phân hủy thành chất có độc tính là cafeidin [3]. Tác dụng dược lý: Cafein được biết đến là hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh trung ương, do vậy khi cơ thể tiêu thụ hàm lượng thấp, cafein mang lại nhiều tác dụng có lợi như làm tăng sự tỉnh táo và giảm mệt mỏi [3], [33]. Tuy nhiên, nếu tiêu thụ cafein thường xuyên dù ở hàm lượng thấp cũng sẽ gây ra các tác dụng không mong muốn như tăng cảm giác hồi hộp, lo âu, mất ngủ, mệt mỏi, kích ứng đường tiêu hóa, tăng huyết áp, nhịp tim nhanh, đẻ non và sẩy thai [6], [11]. Giới hạn về liều: EFSA tuyên bố rằng tiêu thụ 5 mg/kg trọng lượng cơ thể có thể tạo ra những thay đổi hành vi nhất thời như tăng hưng phấn, khó chịu, hồi hộp hoặc lo lắng ở trẻ em. Bộ Y tế Canada đã có khuyến nghị hạn chế lượng cafein của trẻ em (45mg
5
đối với trẻ em từ 4 - 6 tuổi; 62,5 mg: 7 - 9 tuổi; và 85 mg: 10 - 12 tuổi), đối với thanh thiếu niên (> 13 tuổi) không quá 2,5 mg/kg trọng lượng cơ thể [8]. Phụ nữ có thai cũng là một đối tượng nhạy cảm với cafein, có một số khuyến nghị của các cơ quan quản lý về hạn chế lượng cafein trong thai kỳ từ 200 đến 300 mg/ngày. Khuyến cáo giới hạn lượng cafein tiêu thụ cũng được đưa ra cho những đối tượng có tình trạng sức khỏe đặc biệt như tăng huyết áp, tiểu đường type II hoặc rối loạn nhịp tim [8]. Việc tranh luận về rủi ro tiền ẩn của cafein ngày càng tăng trong cộng đồng khoa học [8]. Mặc dù có một số tác dụng dược lý nhất định, nhưng sử dụng thường xuyên và quá mức cafein gây ra nhiều tác dụng bất lợi như trên. Cùng với sự phát triển của đời sống xã hội, hiện nay nhu cầu về các loại sản phẩm chứa hàm lượng cafein thấp từ Chè (lá Chè loại cafein, cao Chè loại cafein) là rất lớn. Do vậy, việc sản xuất ra sản phẩm cao khô Chè có hàm lượng cafein thấp đã thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học. 1.2. Một số nghiên cứu về loại cafein từ Chè xanh Các nghiên cứu về loại cafein trên Chè xanh chủ yếu dựa trên hai hướng tiếp cận: một là loại bỏ cafein từ lá Chè trong quá trình xử lý nguyên vật liệu và hai là loại bỏ cafein trong dịch chiết Chè [32]. Sau đây là các phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để loại cafein. 1.2.1. Loại cafein từ lá Chè 1.2.1.1. Loại cafein bằng dung môi hữu cơ Phương pháp này dựa trên khả năng hòa tan chọn lọc của các dung môi hữu cơ đối với cafein so với catechin để chiết loại bỏ cafein. Độ tan của cafein trong dung môi hữu cơ gấp khoảng 10 lần so với trong nước ở nhiệt độ phòng [30]. Một số dung môi được sử dụng trong khoảng những năm 1970 là cloroform, methylen chlorid, dichloromethane, ethyl acetat [35]. Ưu điểm của phương pháp này là chi phí vận hành tương đối thấp. Tuy nhiên, một số thành phần khác có lợi cho sức khỏe đặc biệt là EGCG cũng bị loại bỏ cùng với cafein [7], kèm theo việc sử dụng một lượng lớn các dung môi hữu cơ độc hại và tồn dư dung môi trong sản phẩm
6
có thể gây nên các vấn đề liên quan đến môi trường và sức khỏe người tiêu dùng [21]. Gần đây, một dung môi hữu cơ khác thân thiện hơn với môi trường đã được nghiên cứu khả năng loại bỏ cafein là ethyl lactat cho thấy tính chọn lọc với cafein khá cao. Hơn nữa, ethyl lactate đã được phê duyệt bởi Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) là dược phẩm và phụ gia thực phẩm [34]. Tuy nhiên, đây là dung môi phân hủy sinh học nên đắt tiền và chưa được ứng dụng nhiều. 1.2.1.2. Loại cafein bằng nước nóng Phương pháp dựa vào tính tan tốt của cafein trong nước nóng để chiết loại bỏ cafein trong lá Chè xanh. Nước là một dung môi an toàn, thân thiện với môi trường, tương đối rẻ tiền và dễ tiếp cận hơn so với các dung môi hữu cơ. Chè sau khi khử cafein bằng nước cũng giảm thiểu bị mất đi hương vị so với khử cafein bằng dung môi hữu cơ [35]. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất loại cafein là nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu để loại cafein trong lá Chè tươi là nhiệt độ 100°C, trong 3 phút và tỷ lệ lá Chè với nước là 1:20 (kl/tt). Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng với mẫu lá Chè tươi, vì một phần lớn catechin cũng bị mất đi khi thử nghiệm trên các mẫu lá Chè khô. Quá trình sấy khô và rây có thể phá hủy các tế bào lá dẫn đến một số thành phần hóa học trong lá Chè bao gồm catechin và cafein được ép ra trên bề mặt của lá. Trong trường hợp này, catechin và cafein dễ dàng hòa tan trong nước khi lá Chè khô được xử lý nước nóng [19]. 1.2.1.3. Loại cafein bằng vi sinh vật và enzym Cơ chế của phương pháp này là vi sinh vật dùng cafein làm nguồn carbon và nitơ cho quá trình sinh trường và phát triển, từ đó giúp giảm hàm lượng cafein trong lá Chè. Các chủng cho tác dụng tốt là Bacillus sp. Mặc dù có ưu điểm là thân thiện môi trường, không tồn dư hóa chất, không gây độc hại nhưng phương pháp này rất khó để nâng cấp quy mô và đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt các điều
7
kiện như chủng vi sinh vật, hàm lượng cafein ban đầu, nhiệt độ tiến hành, thời gian ủ [12], [28]. 1.2.1.4. Loại cafein bằng công nghệ biến đổi gen Con đường sinh tổng hợp cafein trong Chè được đề xuất liên quan đến 3 enzym N-methyltransferase gồm xanthosin methyltransferase, 7-N methylxanthin methyltransferase và 3, 7-dimethylxanthin methyltransferase. Hai bước cuối trong quá trình này được xúc tác bởi enzym có tên gọi cafein synthase. Do đó, một phương pháp loại cafein được để xuất là tiến hành bất hoạt mRNA sau quá trình dịch mã của cafein synthase mRNA. Các giống Chè biến đổi gen cho thấy mức độ giảm biểu hiện gen cafein synthase và làm giảm 44 - 61% lượng cafein và 46 - 67% lượng theobromin so với nhóm chứng [22]. Tuy nhiên, đây là công nghệ mới cần được tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm, kiểm chứng về mức độ hiệu quả và các ảnh hưởng của thực vật biến đổi gen đến sức khỏe con người. 1.2.1.5. Loại cafein bằng dung môi siêu tới hạn Sử dụng dung môi siêu tới hạn là phương pháp hiện đại để loại cafein từ lá Chè xanh. Quá trình được tiến hành như sau: lá Chè được nghiền thành các tiểu phân có kích thước nhỏ (< 1 mm), sau đó trộn với đồng dung môi (ví dụ ethanol 95%) để tăng hiệu suất chiết cafein và nạp vào bình chiết. CO2 lỏng được bơm theo áp suất định trước, qua hệ thống gia nhiệt và chảy vào bình chiết. Cafein hòa tan trong CO2 siêu tới hạn và được chảy qua bình tách, tại đây, cafein được tách khỏi khí CO2 bằng cách giảm áp suất. Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất loại cafein như kích thước nguyên liệu, hàm lượng cafein trong nguyên liệu ban đầu, loại và lượng đồng dung môi sử dụng, áp suất, nhiệt độ và tốc độ dòng CO2 [26]. Ưu điểm của phương pháp này là không tồn dư dung môi do CO2 dễ dàng được loại bỏ, ít làm phân hủy các catechin và giữ lại được mùi vị đặc trưng của lá Chè [14]. Tuy nhiên phương pháp xử lý này phức tạp và tốn kém hơn so với dung môi lỏng nên chưa được áp dụng nhiều trong thực tế. 1.2.2. Loại cafein từ dịch chiết lá Chè 1.2.2.1. Loại cafein bằng kỹ thuật chiết phân bố lỏng lỏng
8
Phương pháp này sử dụng độ tan và sự phân bố chọn lọc của các hợp chất catechin và cafein trong các dung môi. Dịch chiết nước từ lá Chè được chiết phân bố với dung môi hữu cơ (ethyl acetat), sau đó pha ethyl acetat tiếp tục được chiết phân bố với dung dịch acid citric. Trong đó catechin sẽ thu được ở pha ethyl acetat, cafein bị giữ lại ở pha dung dịch acid citric với 78,8% lượng cafein được loại bỏ [9], [29]. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là sử dụng lượng lớn các dung môi hữu cơ độc hại, quy trình gồm nhiều bước, khó nâng quy mô, hiệu suất thu hồi và hàm lượng catechin thu được không cao. 1.2.2.2. Loại cafein bằng các chất hấp phụ chọn lọc Đây là phương pháp được nghiên cứu nhiều nhất trong những năm gần đây nhằm loại bỏ chọn lọc cafein khỏi dịch chiết lá Chè. Đã có nhiều nhóm chất hấp phụ từ tự nhiên đến tổng hợp đã được nghiên cứu như than hoạt [37], cyclodextrin [10], nhựa hấp phụ macroporous [31], vật liệu trao đổi ion [32]. Ưu điểm lớn nhất của nhóm phương pháp này là việc không sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại. Một số chất hấp phụ có dung lượng hấp phụ cao, chọn lọc với cafein, có thể tái sử dụng tốt và dễ dàng nâng quy mô. Tuy nhiên cafein có các tính chất lý hóa kích thước phân tử và độ tan tương tự như các catechin trong lá Chè, do đó việc loại bỏ triệt để thành phần này rất khó khăn. Trong nhiều trường hợp cần kết hợp các phương pháp khác nhau như khử cafein một phần từ nguyên liệu ban đầu và kỹ thuật hấp phụ [37], chiết phân bố lỏng lỏng và kỹ thuật hấp phụ [20]. Các kỹ thuật này có thể tiến hành lần lượt hoặc kết hợp trong cùng một bước tinh chế với trung tâm là phương pháp hấp phụ trên chất mang. 1.3. Một số chất hấp phụ sử dụng trong nghiên cứu 1.3.1. Montmorillonit Montmorillonit (MMT) là một khoáng sét đa chức năng, thành phần chính của bentonit, thuộc họ smectit, được hình thành do sự phong hóa tro núi lửa [23]. MMT với các tính chất độc đáo như trương nở và hấp phụ đã được ứng dụng rộng rãi trong y tế và nhiều lĩnh vực trong công nghiệp [27].
9
1.3.1.1. Cấu trúc Tinh thể MMT có cấu trúc lớp 2:1, mỗi một lớp gồm 3 tầng xếp chồng lên nhau với 2 tấm silica tứ diện (tetrahedral silicate - Si4O6(OH)4) kẹp 1 tấm nhôm oxyd bát diện (octahedral alumina - Al(OH)6), bề dày và bề rộng của mỗi lớp tương ứng khoảng 1 và 100 -1000 nm [25]. Công thức hóa học được đề xuất là Si8Al3.5Mg0.5O20(OH)4. Nếu thay thế đồng hình phân tử trung tâm Si4+ bởi Al3+ và phân tử trung tâm Al3+ bởi Mg2+ hoặc Fe2+ sẽ tạo ra những lớp có bề mặt tích điện âm. Bề mặt mang điện tích được cân bằng qua việc hấp phụ các cation như Li+, Na+, Ca2+. Những cation này có thể dễ dàng thay thế bằng khác cation hữu cơ hoặc vô cơ khác, liên quan đến tính chất ưa nước, trương nở, hấp phụ của montmorillonit. MMT cũng mang các nhóm hydroxyl trên bề mặt giúp tăng cường khả năng hấp phụ các phân tử mục tiêu bằng các liên kết yếu như liên kết hydro [27].
3
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của montmorillonit
1.3.1.2. Tính chất Tính ưa nước và trương nở Một trong những tính chất vật lý độc đáo của MMT là tính ưa nước và trương nở trong nước. Do bề mặt lớp MMT tích điện âm nên H3O+ sinh ra từ sự tự ion
10
hóa của nước có thể dễ dàng xâm nhập vào lớp xen kẽ. Trạng thái vật lý của MMT có thể thay đổi từ chất rắn khan thành dạng ngậm nước, bán rắn, gel và huyền phù tùy thuộc vào sự gia tăng hàm lượng nước. Trong đó sự thay đổi trạng thái vật lý từ chất rắn khan sang dạng gel được gọi là sự trương nở. Sự trương nở này phụ thuộc vào khoáng vật học, kích thước, điện tích âm và năng lượng hydrat hóa của các cation trao đổi. Vd: Natri montmorillonit có khả năng tăng thể tích lên tới 20 lần sau khi hấp phụ nước [25], [27]. Tính hấp phụ Một đặc tính khác của MMT là sự hấp phụ. Bởi vì giữa các lớp 2:1 của MMT có chứa cation trao đổi, một số phân tử xen kẽ vào giữa các lớp bằng cách trao đổi ion. Các phân tử với độ phân cự khác nhau chẳng hạn như alcol mạch ngắn, glycerol, carbohydrat, ethylen glycol, aliphatic amin, aromatic amin và các chất màu hữu cơ, được hấp phụ mạnh trên bề mặt của các lớp của MMT. Mặt khác, các phân tử không phân cực, như nitơ, argon và ethan không kết hợp được với MMT. Cụ thể, các phân tử này có thể được hấp phụ trên bề mặt nhưng không thể xâm nhập vào các lớp kẽ [27].
4
Hình 1.4. Các vị trí tương tác của montmorillonit
Các cơ chế hấp phụ MMT với các phân tử được đề xuất như tạo liên kết hydro, tương tác lưỡng cực - lưỡng cực, tương tác ion - lưỡng cực, liên kết cộng
11
hóa trị, tạo cặp ion, tương tác ion - pi và trao đổi ion với các vị trí liên kết như bề mặt, cạnh, khoảng cách giữa các lớp [15]. 1.3.1.3. Ứng dụng của montmorillonit MMT là một khoáng sét đa chức năng và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Trong đó, tùy nhu cầu sử dụng mà có các yêu cầu khác nhau về cách khai thác, hoạt hóa, biến tính và chất lượng MMT. Trong y học MMT là dạng khoáng sét đã được tinh chế để có thể sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. MMT hấp phụ tốt các độc tố như các ion kim loại nặng (As, Cd, Pb, Mn, Ni và Cr), các anion độc, aflatoxin, các hợp chất nitro thơm gây ung thư, virus (ví dụ: rotavirus, coronavirus), làm lành vết thương (các vết loét ở đường tiêu hóa, hội chứng viêm da tiếp xúc). Từ đó MMT có thể dùng như một phương pháp chữa bệnh, giải độc. Một trong số các sản phẩm thương mại chứa khoáng sét cấu trúc MMT đã được phát triển và có sẵn trên thị trường dùng trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp tính là SMECTA® [27]. Trong công nghiệp dược phẩm Ứng dụng nổi bật nhất của MMT là làm tá dược và chất mang trong các hệ đưa thuốc. Phức hợp MMT - dược chất có thể được tạo thành bằng kỹ thuật hấp phụ từ dung dịch, đun chảy hoặc nghiền [27]. Trong một báo cáo, tỷ lệ sống sót của Lactobacillus casei trong đường tiêu hóa tăng lên khi được cố định vào natri montmorillonit [18]. Ngoài ra MMT còn có thể kết hợp với nhiều polyme tự nhiên và tổng hợp tạo thành các vật liệu composit với các đặc tính mới làm thay đổi tính chất và động học giải phóng, hấp thu của nhiều dược chất [27]. Trong các ngành công nghiệp khác MMT được sử dụng để hấp phụ các chất gây ô nhiễm (các cation kim loại nặng, các chất màu,…) trong môi trường nước, không khí, dung môi hữu cơ. MMT còn được sử dụng làm tác nhân hấp phụ protein, làm trong rượu, nước ép hoa quả và dầu ăn. Ngoài ra nó còn là tác nhân hấp phụ các độc tố, bổ sung vi
12
lượng và ứng dụng trong sản xuất thức ăn cho động vật. MMT cũng được sử dụng trong công nghiệp khoan dầu, nông nghiệp, xây dựng [23], [27]. 1.3.2. Nhựa macroporous Nhựa macroporous là các polyme liên kết chéo, không ion hóa, đặc trưng bởi số lượng lớn các lỗ xốp (đường kính > 50 Å) và có khả năng hấp phụ các phân tử nhỏ. Nhựa được sản xuất bằng cách polyme hóa các monome (thường sử dụng styren divinylbenzen) với sự có mặt của các chất độn (porogens) không polyme hóa như toluen, n-heptan, isooctan và isobutanol. Các chất độn có thể trộn lẫn với hỗn hợp monome, không hoà tan polyme, có khả năng bay hơi ở những điều kiện nhất định sau khi kết thúc quá trình polyme hoá để lại những lỗ hổng trong cấu trúc polyme. Khả năng hấp phụ chọn lọc của nhựa macroporous phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: bản chất polyme, đường kính lỗ xốp, diện tích bề mặt riêng, độ phân cực, các nhóm chức đặc trưng của nhựa; khối lượng phân tử, kích thước và độ phân cực của chất tan và các điều kiện tiến hành (nồng độ, pH dịch chiết, nhiệt độ hấp phụ, dung môi,…). Xét theo độ phân cực, nhựa macroporous được chia làm 4 loại: không phân cực (D101, H103,…); phân cực yếu (AB-8, HPD722,…); phân cực trung bình (ADS-17, XAD-8,…); phân cực mạnh (NKA-2, DA201,…) [17], [24]. Nhựa macroporous được phát triển và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, trong lĩnh vực chiết xuất nhựa macroporous được ứng dụng để tinh chế, phân lập các hoạt chất tinh khiết, làm giàu hoạt chất trong các cao dược liệu. Trong đó có nhiều ưu điểm như: cấu trúc đa dạng, khả năng lặp lại và ổn định tốt, phần lớn đều sử dụng các dung môi “xanh” như nước và ethanol, có thể tái sử dụng, phù hợp với nhiều nhóm hoạt chất, chi phí vận hành rẻ, phù hợp khi triển khai ở quy mô lớn [17]. Cho đến nay, phương pháp hấp phụ đang ngày càng trở nên phổ biến đặc biệt trong lĩnh vực dược phẩm cùng với sự khám phá ngày càng đa dạng các chất hấp phụ trong tự nhiên và tổng hợp nhân tạo. Việt Nam hiện nay là quốc gia có ưu thế về sản xuất và phát triển Chè, tuy nhiên các sản phẩm từ Chè vẫn dừng lại ở mức độ đơn giản như Chè xanh, Chè đen, Chè Oolong. Để ứng dụng trong dược phẩm, 13
yêu cầu cao Chè cần được kiểm soát, chuẩn hóa về nhiều yếu tố như nguyên liệu đầu vào, quy trình sản xuất, các chỉ tiêu chất lượng,…. Với mong muốn đa dạng hóa và nâng cao chất lượng các sản phẩm từ Chè, tạo tiền đề ứng dụng các sản phẩm đó trong dược phẩm, nghiên cứu này bước đầu xây dựng quy trình loại cafein từ dịch chiết lá Chè xanh quy mô phòng thí nghiệm bằng công nghệ đơn giản và mang tính ứng dụng cao, sản phẩm được đánh giá hàm lượng các hoạt chất bằng phương pháp phân tích hiện đại như HPLC.
14
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu Lá Chè xanh tươi được thu mua tại Đại Từ, Thái Nguyên tháng năm 2018 và được giám định tên khoa học tại bộ môn Thực Vật, trường Đại học Dược Hà Nội. Mẫu lá Chè được rửa sạch bằng nước, sấy khô trong tủ sấy tĩnh ở 50oC đến hàm ẩm dưới 5% (khoảng 2 ngày) xay nhỏ (1 - 2 mm) và bảo quản trong túi PE kín ở điều kiện phòng thí nghiệm. 2.1.2. Chất chuẩn và hóa chất Chất chuẩn - Cafein chuẩn: hàm lượng 98,73%, lô MUST-17060110 (Chengdu Must Biological Technology Co., Ltd.). - EGCG chuẩn: hàm lượng 99,78%, lô MUST-17060113 (Chengdu Must Biological Technology Co., Ltd.). - Cafein nguyên liệu: hàm lượng 99,20% (Ấn Độ). Các chất hấp phụ - Nhựa macroporous: D101, HPD826, H103, X5 từ Anhui Sanxing Resin Technology Co., Ltd. (Trung Quốc). - Montmorillonit: Các mẫu MMT được cung cấp bởi Clariant Company (Ấn Độ). - Than hoạt (kích thước 0,5 - 1 mm) từ Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Trung Quốc). Nhựa macroporous được xử lý bằng cách ngâm rửa với ethanol 96% nhiều lần, sau đó rửa sạch lại bằng nước cất. MMT và than hoạt được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. 5
6
15
Bảng 2.1. Các đặc tính lý hóa của nhựa macroporous
7
Diện tích
Kích
Kích
bề mặt
thước lỗ
thước hạt
(m2/g)
xốp (nm)
(mm)
400-450
10-11
0,3-1,3
Acrylat Dimethylmethacrylat
500-600
9-10
0,3-1,3
H103
Styren
Divinylbenzen
900-1100
8,4-9,4
0,3-1,25
X5
Styren
Divinylbenzen
500-600
9-10
0,3-1,25
Nhựa
Chất
macroporous
nền
D101
Styren
HPD826
Liên kết chéo
Divinylbenzen
Độ phân cực Không phân cực Phân cực Không phân cực Không phân cực
Bảng 2.2. Các đặc tính lý hóa của các khoáng sét tự nhiên Tỷ lệ các thành phần chính
Thể
Kích
Diện tích bề
chất
thước
mặt (m2/g)
SiO2
Fe2O3
Al2O3
MgO
CaO
1
Bột
50-63 µm
300
68,25
3,43
11,60
1,90
1,55
2
Bột
40-54 µm
250
61,94
7,12
16,14
1,25
2,24
3
Bột
51-68 µm
320
65,35
5,05
15,03
1,56
2,44
4
Bột
55-60 µm
500
55-65
1-2
4-8
-
-
5
Bột
55-68 µm
400
52-60
1-2
3-8
-
-
6
Bột
70-75 µm
270
55,42
5,73
7,94
5,85
5,47
7
Hạt
0,5-5 mm
-
62,23
4,25
10,54
-
-
8
Hạt
0,5-5 mm
-
58,34
5,23
15,34
-
-
MMT
16
Hóa chất 8
Bảng 2.3. Danh mục hóa chất sử dụng
STT
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
1
Methanol
Fisher (Hàn Quốc)
HPLC
2
Acid phosphoric
Merck (Đức)
Tinh khiết hóa học
3
Nước cất
Việt Nam
-
4
Ethanol 96%
Việt Nam
Tinh khiết hóa học
5
Acid citric khan
Trung Quốc
Tinh khiết hóa học
2.1.3. Thiết bị thí nghiệm - Bình chiết dược liệu bằng inox dung tích 10 Lít (Việt Nam). - Máy cô quay chân không IKA® RV8 (Đức). - Máy phun sấy Buchi B290 (Thụy Sỹ). - Máy đông khô Christ® Alpha 1-LD (Đức). - Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản). - Máy ly tâm lạnh HERMLE Larbotechnik GmbH-Z326k (Đức). - Máy lắc điều nhiệt Shaker Incubator, LSI-100B (Nhật Bản). - Máy khuấy cơ WiseStir HS-120A (Trung Quốc). - Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S d = 0,1 mg (Thụy Sỹ). - Các dụng cụ kiểm nghiệm khác. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG bằng HPLC. - Nghiên cứu sàng lọc chất hấp phụ cho quá trình loại cafein từ dịch chiết Chè. - Khảo sát và lựa chọn được các thông số cho quá trình loại cafein bằng kỹ thuật hấp phụ trên MMT. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Chiết xuất và điều chế cao thô Cân 1,0 kg lá Chè khô, chiết 3 lần × 10,0 L dung môi ethanol 50%, 25°C trong 12 giờ. Gộp các dịch chiết và cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm (500 mbar, 70°C) đến khi còn 1/3 thể tích và phun sấy tạo cao khô với các điều kiện: nhiệt độ đầu vào 140°C, nhiệt độ đầu ra 67 - 70°C, tốc độ bơm 30 - 35%, áp suất 17
phun dáť‹ch 100%, ĂĄp suẼt khĂ nĂłng 400 - 600 mbar, ĂĄp suẼt khà âm -40 mbar. Dáť‹ch chiáşżt Chè xanh áť&#x; cĂĄc náť“ng Ä‘áť™ khĂĄc nhau đưᝣc tấo thĂ nh báşąng cĂĄch hòa tan cao khĂ´ trong tháťƒ tĂch vᝍa đᝧ nĆ°áť›c cẼt (náşżu khĂ´ng chĂş thĂch gĂŹ thĂŞm). 2.3.2. QuĂĄ trĂŹnh hẼp ph᝼ 2.3.2.1. Thiáşżt káşż thĂ nghiᝇm hẼp ph᝼ Trong cĂĄc bĂŹnh nĂłn giáť‘ng nhau dung tĂch 100 ml, cho máť™t lưᝣng chẼt hẼp ph᝼ vĂ 20 ml dáť‹ch chiáşżt (hoạc dung dáť‹ch cafein) cĂł náť“ng Ä‘áť™ thĂch hᝣp, Ä‘áşy kĂn vĂ lắc trĂŞn mĂĄy lắc ngang áť&#x; 150 vòng/phĂşt trong Ä‘iáť u kiᝇn nhiᝇt Ä‘áť™ vĂ tháť?i gian khảo sĂĄt. XĂĄc Ä‘áť‹nh náť“ng Ä‘áť™ EGCG vĂ /hoạc cafein trong dáť‹ch sau hẼp ph᝼ báşąng HPLC. Dung lưᝣng hẼp ph᝼ cân báşąng (Qe, mg/g) vĂ hᝇ sáť‘ cháť?n láť?c cᝧa cĂĄc chẼt hẼp ph᝼ (K BA ) Ä‘áť‘i váť›i cafein vĂ EGCG đưᝣc tĂnh theo cĂĄc cĂ´ng thᝊc: Qe =
Co Ă— Vo − đ??śđ?‘’ Ă— đ?‘‰1 B R B /R A , KA = W CB /CA
Trong Ä‘Ăł: Co, Ce lần lưᝣt lĂ náť“ng Ä‘áť™ cafein hoạc EGCG trong dáť‹ch chiáşżt trĆ°áť›c hẼp ph᝼, sau hẼp ph᝼ (mg/ml); Vo, V1 lần lưᝣt lĂ tháťƒ tĂch dáť‹ch chiáşżt trĆ°áť›c hẼp ph᝼, sau hẼp ph᝼ (ml); W lĂ kháť‘i lưᝣng chẼt hẼp ph᝼ (g); A vĂ B tĆ°ĆĄng ᝊng lĂ EGCG vĂ cafein; CA , CB tĆ°ĆĄng ᝊng lĂ náť“ng Ä‘áť™ (mg/ml) cᝧa A vĂ B trong dáť‹ch chiáşżt sau hẼp ph᝼; R A , R B lần lưᝣt lĂ lưᝣng chẼt A vĂ B đưᝣc hẼp ph᝼ trong 1 gam chẼt hẼp ph᝼ (mg/g) tấi tháť?i Ä‘iáťƒm cân báşąng. 2.3.2.2. Ä?áť™ng háť?c hẼp ph᝼ Ä?áť™ng háť?c hẼp ph᝼ cafein trĂŞn cĂĄc chẼt hẼp ph᝼ đưᝣc nghiĂŞn cᝊu dáťąa vĂ o cĂĄc mĂ´ hĂŹnh Ä‘áť™ng háť?c hẼp ph᝼ cĆĄ bản sau: - MĂ´ hĂŹnh giả báşc 1 (pseudo-first-order): ln(Qe-Qt) = lnQe - k1t - MĂ´ hĂŹnh giả báşc 2 (pseudo-second-order): t/Qt = 1/k2Qe2 + t/Qe Trong Ä‘Ăł: k1 (h-1 hoạc phĂşt-1), k2 (mg/g.h-1 hoạc mg/g.phĂşt-1) lĂ háşąng sáť‘ táť‘c Ä‘áť™ cᝧa mĂ´ hĂŹnh giả báşc 1 vĂ giả báşc 2 tĆ°ĆĄng ᝊng. Qe vĂ Qt lĂ dung lưᝣng hẼp ph᝼ (mg/g) tấi tháť?i Ä‘iáťƒm cân báşąng vĂ tấi tháť?i Ä‘iáťƒm t tĆ°ĆĄng ᝊng. 2.3.2.3. Ä?Ć°áť?ng hẼp ph᝼ Ä‘áşłng nhiᝇt MĂ´ hĂŹnh Ä‘áşłng nhiᝇt hẼp ph᝼ Langmuir vĂ Freudlich thĆ°áť?ng đưᝣc sáť d᝼ng Ä‘áťƒ mĂ´ tả bản chẼt cᝧa quĂĄ trĂŹnh hẼp ph᝼ chẼt tan trong dung dáť‹ch trĂŞn báť mạt rắn. MĂ´
18
hình Langmuir giả thiết rằng các chất tan được hấp phụ theo từng lớp đơn phân tử, năng lượng hấp phụ phân bố đồng nhất và không có sự tương tác giữa các phân tử chất đã được hấp phụ. Trong khi đó, mô hình Freundlich có thể mô tả quá trình hấp phụ từng lớp đơn phân tử như mô hình Langmuir hoặc đa phân tử với giả thiết đưa ra là sự phân bố không đồng nhất của các vị trí hấp phụ ở những mức năng lượng hấp phụ khác nhau. Bản chất sự hấp phụ cafein trên các chất hấp phụ được nghiên cứu dựa vào các phương trình sau: - Mô hình Langmuir: Ce/Qe = Ce/Qm + 1/(QmKL) - Mô hình Freundlich: lnQe = lnKF + 1/n × lnCe Trong đó: Ce và Qe tương tự như các công thức ở mục 2.3.2.1; KL (ml/mg) và KF tương ứng là hằng số Langmuir và Freundlich; 1/n là hằng số kinh nghiệm; Qm là dung lượng hấp phụ cực đại (mg/g chất hấp phụ). 2.3.3. Phương pháp định lượng cafein và EGCG 2.3.3.1. Phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký - Cột C18 InertSustain® (250 × 4,6 mm, 5 μm). - Pha động: MeOH - Nước - Acid phosphoric (20 : 79,9 : 0,1, tt/tt). - Tốc độ dòng: 1ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Detector quang phổ tử ngoại bước sóng 280 nm. Chuẩn bị mẫu Mẫu chuẩn: Dung dịch chuẩn hỗn hợp hoặc chuẩn đơn trong nước có nồng độ nằm trong khoảng từ 8,0 đến 200,0 μg/ml đối với cafein và từ 12,0 đến 300,0 μg/ml đối với EGCG. Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 200 mg bột lá Chè xanh cho vào bình nón dung tích 100 ml, chiết 2 lần × 40 ml ethanol 50% ở nhiệt độ 50oC, mỗi lần 30 phút, dịch chiết được để nguội về nhiệt độ phòng và gộp vào bình định mức 100 ml, bổ sung nước cất đến vạch, lắc đều, pha loãng đến nồng độ thích hợp và lọc qua màng lọc 0,45 µm. Nồng độ cafein (hoặc EGCG) trong các mẫu thử được tính theo đường chuẩn. 19
2.3.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng Độ đặc hiệu: Tiêm lần lượt dung dịch mẫu trắng, mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ và so sánh các píc thu được. Yêu cầu: - Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không được xuất hiện tín hiệu píc của chất phân tích tại thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ mẫu chuẩn. - Trên sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện tín hiệu của chất phân tích tại thời gian lưu trùng với sắc ký đồ của mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp. - Độ phân giải giữa 2 píc cafein và EGCG có Rs ≥ 1,5. Độ thích hợp hệ thống: Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích píc sắc ký. Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích píc giữa các lần tiêm mẫu ≤ 2%. Khoảng tuyến tính: Tiến hành chạy sắc ký các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau, ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích píc. Lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu thị mối tương quan giữa diện tích và nồng độ chất phân tích bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Yêu cầu: hệ số hồi quy tuyến tính R phải đạt yêu cầu: 0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤ R2 ≤ 1. Độ lặp lại: Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần một mẫu thử, ghi lại thời gian lưu và diện tích píc sắc ký. Yêu cầu: RSD của thời gian lưu và diện tích píc giữa các lần tiêm mẫu ≤ 2%. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: Pha loãng dần một dung dịch chuẩn, ghi lại sắc ký đồ và xác định tỷ lệ tín hiệu píc/nhiễu đường nền (S/N), giới hạn phát hiện LOD được xác định tại nồng độ có S/N ~ 3 và giới hạn định lượng LOQ được xác định tại nồng độ có S/N ~ 10.
20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thẩm định phương pháp định lượng cafein và EGCG trong lá Chè xanh 3.1.1. Độ đặc hiệu Tiến hành chạy HPLC các mẫu sau: mẫu trắng (nước cất), chuẩn cafein 20 µg/ml, chuẩn EGCG 80 µg/ml, chuẩn hỗn hợp (cafein 20 µg/ml, EGCG 60 µg/ml) và mẫu thử dịch chiết Chè thu được các sắc ký đồ như Hình 3.1.
9
Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC thẩm định độ đặc hiệu
Cafein có thời gian lưu khoảng 18 phút, EGCG có thời gian lưu khoảng 21 phút. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu píc tại các thời gian lưu này và trên sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp và mẫu thử có tín hiệu píc của 2 hoạt chất tại các thời gian lưu tương ứng.
21
Ngoài ra, độ phân giải giữa 2 píc cafein và EGCG trên sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp và mẫu thử là 4,834 và 3,662 tương ứng (đều lớn hơn 1,5) chứng tỏ 2 píc tách nhau hoàn toàn. Như vậy, phương pháp HPLC đã được lựa chọn có tính đặc hiệu phù hợp cho phân tích cafein và EGGC trong lá Chè xanh. 3.1.2. Độ thích hợp hệ thống Với mẫu chuẩn hỗn hợp cafein 8 µg/ml và EGCG 80 µg/ml, kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống được thể hiện trong Bảng 3.1. 10
Bảng 3.1. Kết quả thời gian lưu và diện tích píc của dung dịch chuẩn hỗn hợp Cafein EGCG 11
Thời gian lưu
Diện tích píc
Thời gian lưu
Diện tích píc
(phút)
(mAU.s)
(phút)
(mAU.s)
1
18,509
507008
20,370
3618581
2
18,619
518919
20,856
3690915
3
18,311
511128
20,789
3694934
4
18,541
503511
20,548
3770358
5
18,403
509984
20,978
3689647
6
17,988
501668
21,001
3631101
Trung bình
18,395
508703
20,757
3682589
RSD (%)
1,23
1,22
1,20
1,47
Số thứ tự
Độ chênh lệch của diện tích píc và thời gian lưu của cafein và EGCG đều có RSD < 2%, cho thấy các điều kiện sắc ký đã lựa chọn và hệ thống HPLC là phù hợp. 3.1.3. Khoảng tuyến tính Kết quả khảo sát sự tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein và EGCG được thể hiện trong Bảng 3.2 và Hình 3.2. Đường chuẩn của cafein và EGCG đều cho giá trị R2 > 0,99 thể hiện độ tuyến tính cao giữa diện tích píc và nồng độ chất phân tích, đảm bảo thực hiện phép phân tích định lượng HPLC.
22
Bảng 3.2. Mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ cafein và EGCG
12
Cafein Nồng độ
Diện tích píc
Nồng độ
Diện tích píc
(μg/ml)
(mAU.s)
(μg/ml)
(mAU.s)
1
0,5
33161
5,0
317445
2
1,0
64129
10,0
638891
3
2,0
132468
20,0
1074501
4
4,0
256463
40,0
1945721
5
8,0
505467
80,0
3688161
6
20,0
1261854
200,0
8915481
hồi quy
y = 62930x + 3254,6
y = 43765x + 173938
1,000
0,9999
R2 1400000
10000000
Cafein
1200000 1000000 800000 600000
y = 62930x + 3254.6 R² = 1
400000 200000
Diện tích píc (mAu.s)
Phương trình
Diện tích píc (mAu.s)
EGCG
6000000 4000000
5
10
15
0
20
0
Nồng độ (µg/ml)
13
y = 43765x + 173938 R² = 0,9999
2000000
0 0
EGCG
8000000
50
100
150
200
Nồng độ (µg/ml)
Hình 3.2. Đường chuẩn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ
3.1.4. Độ lặp lại Tiêm lặp lại 6 lần một mẫu thử, kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp được thể hiện ở Bảng 3.3. Trị số RSD của thời gian lưu và diện tích pic của cafein và EGCG đều nhỏ hơn 2% cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt.
23
14
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp định lượng Cafein
EGCG
Thời gian lưu
Diện tích píc
Thời gian lưu
Diện tích píc
(phút)
(mAU.s)
(phút)
(mAU.s)
1
17,809
1073065
21,542
1964324
2
18,241
1087642
21,234
1977534
3
18,442
1056234
20,682
1923276
4
18,354
1103894
20,487
1945273
5
17,706
1063421
20,872
1913028
6
18,202
1085429
21,123
1951203
Trung bình
18,126
1078281
20,990
1945773
RSD (%)
1,65
1,62
1,84
1,25
Số thứ tự
3.1.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Tiến hành xác định LOD và LOQ theo hướng dẫn ở mục 2.3.3.2, thu được kết quả như sau: - Với cafein, tại nồng độ 0,05 µg/ml và 0,2 µg/ml cho tỷ lệ S/N xấp xỉ bằng 3 và 10 tương ứng, do đó LOD = 0,05 µg/ml, LOQ = 0,2 µg/ml. - Với EGCG, tại nồng độ 0,2 µg/ml và 0,5 µg/ml cho tỷ lệ S/N xấp xỉ bằng 3 và 10 tương ứng, do đó LOD = 0,2 µg/ml, LOQ = 0,5 µg/ml. Như vậy, phương pháp HPLC xây dựng để định lượng cafein và EGCG trong các mẫu thử đã đáp ứng được các chỉ tiêu cơ bản của một phép định lượng về độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, đặc biệt trong mẫu dược liệu với nhiều thành phần phức tạp. 3.2. Nghiên cứu sàng lọc các chất hấp phụ Với mẫu lá Chè nguyên liệu định lượng được hàm lượng EGCG 7,0 ± 0,45% và cafein 2,0 ± 0,25% (tính theo khối lượng nguyên liệu khô). Tiến hành chiết 1,0 kg lá Chè, dịch chiết sau phun sấy thu được 250,0 g cao khô Chè có hàm lượng cafein và EGCG tương ứng là 5,0 và 19,0%. Cao chiết này được sử dụng để nghiên cứu quá trình loại cafein trong các khảo sát tiếp theo (mục 2.3.1). 24
3.2.1. Tính chọn lọc của các chất hấp phụ Tiến hành thí nghiệm theo mô tả ở mục 2.3.2.1 trên 8 loại hạt MMT, 4 loại nhựa macroporous và than hoạt. Cho vào các bình nón 20 ml dịch chiết (nồng độ cafein 0,5 mg/ml) và một trong các loại chất hấp phụ tương ứng như sau: MMT (0,7 g), than hoạt (0,15 g), nhựa macroporous (0,4 g), thời gian hấp phụ 180 phút, nhiệt độ 25°C. Kết quả đánh giá sơ bộ các chất hấp phụ được thể hiện ở Hình 3.3 cho thấy: Dung lượng hấp phụ cafein của than hoạt (33,0 mg/g) và các nhựa macroporous (20 - 25 mg/g) cao hơn khoảng 2 lần so với nhóm khoáng sét tự nhiên (~ 13,0 - 14,0 mg/g). Tuy nhiên hệ số chọn lọc cafein của 2 loại chất hấp phụ này đều khá thấp, lần lượt là 110 và 44 đối với than hoạt và nhựa macroporous D101 (chất hấp phụ có hệ số K BA cao nhất trong các nhựa macroporous). Đối với 8 mẫu MMT, các mẫu MMT có dung lượng hấp phụ cafein tương đối giống nhau nhưng dung lượng hấp phụ EGCG rất khác nhau (dao động từ 4,5 đến 30,0 mg/g), điều này dẫn tới sự khác nhau về tính chọn lọc hấp phụ với cafein, trong đó mẫu MMT 4 có hệ số chọn lọc với cafein cao nhất (K BA = 1153). Cafein
EGCG
Hệ số chọn lọc cafein 1200
120
1000
Qe (mg/g)
100
800
80 600 60 400
40
200
20 0
Hệ số chọn lọc cafein
140
0
Chất hấp phụ 15
Hình 3.3. Ảnh hưởng của các loại chất hấp phụ đến dung lượng hấp phụ cafein, EGCG và hệ số chọn lọc
25
3.3.2. So sánh các chất hấp phụ Để thấy rõ hơn tính chọn lọc hấp phụ của MMT 4 với cafein, các thí nghiệm tiếp theo được thực hiện với lượng chất hấp phụ được thay đổi trong khoảng 0,06 - 0,7 g với MMT 4; 0,02 - 0,2 g với than hoạt. Mối quan hệ giữa tỷ lệ cafein loại đi và tỷ lệ EGCG còn lại trong dịch chiết khi thay đổi tỷ lệ chất hấp phụ được thể hiện ở Hình 3.4. Tỷ lệ EGCG còn lại (%)
120 100 80 60 40
MMT 4
20
Than hoạt
0 0
20
40
60
80
100
Tỷ lệ cafein loại đi (%)
16
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các loại chất hấp phụ đến tỷ lệ cafein loại đi và tỷ lệ EGCG còn lại trong dịch chiết Kết quả cho thấy khi tăng lượng chất hấp phụ làm tăng tỷ lệ cafein loại đi
đồng thời làm giảm tỷ lệ EGCG còn lại trong dịch chiết, tuy nhiên mức độ thay đổi rất khác nhau giữa các chất hấp phụ. Trong đó, than hoạt làm giảm mạnh tỷ lệ EGCG còn lại (~ 50%), MMT 4 vẫn duy trì được tỷ lệ EGCG khá cao trong dịch chiết (~ 90%). Do đó MMT 4 được lựa chọn làm chất hấp phụ cafein trong dịch chiết Chè trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Nghiên cứu loại cafein bằng MMT 3.3.1. Động học hấp phụ cafein trên MMT Khảo sát ảnh hưởng của thời gian (10 - 120 phút) đến quá trình hấp phụ cafein trên MMT 4 ở nhiệt độ 25°C, nồng độ cafein 0,5 mg/ml. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.4 và Hình 3.5.
26
17
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian đến dung lượng hấp phụ của 18
cafein trên MMT Qt (mg/g)
Thời gian (phút)
0
10
15
30
45
60
90
120
Dung dịch cafein 0,00 11,43 14,14 14,16 14,17 14,19 14,20
14,20
Dịch chiết
14,11
0,00 11,00 13,37 13,68 13,71 13,93 14,04
16,00
Qt (mg/g)
12,00
Dung dịch cafein
8,00
Dịch chiết
4,00 0,00 0
20
40
60
80
100
120
Thời gian (phút) 19
Hình 3.5. Động học hấp phụ cafein trên MMT 4
Có thể thấy, quá trình hấp phụ cafein đặc trưng bởi 2 giai đoạn: hấp phụ nhanh trong 20 phút đầu (> 99% lượng cafein được hấp phụ) và hấp phụ rất chậm trong 100 phút tiếp theo. Thời gian đạt cân bằng hấp phụ và trị số Qe tương tự giữa dịch chiết và dung dịch cafein, lần lượt là 20 phút và 14,2 mg/g. Do đó, thời gian hấp phụ được lựa chọn là 20 phút cho các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi khớp dữ liệu thực nghiệm với mô hình động học hấp phụ cơ bản ở mục 2.3.2.2, kết quả thể hiện như sau:
27
Mô hình giả bậc 1 Bảng 3.5. Dữ liệu thực nghiệm mô hình giả bậc 1
20
ln(Qe-Qt) Thời gian (phút)
0
10
Dung dịch cafein 2,66
21
3,00 2,00 1,00 0,00 -1,00 0 -2,00 -3,00 -4,00 -5,00
2,65
30
45
90
120
-2,23 -2,41 -2,54 -2,74 -3,00 -3,00
1,16
-0,18 -0,66 -0,72 -1,30 -1,81 -2,39 3,00
(a)
100
(b)
2,00
y = -0,0358x + 0,1273 R² = 0,4873 50
60
1,04
ln (Qe-Qt)
ln (Qe-Qt)
Dịch chiết
15
150
y = -0,0344x + 1,1862 R² = 0,7732
1,00 0,00 -1,00
0
50
100
150
-2,00 -3,00 -4,00
t (phút)
t (phút)
Hình 3.6. Đồ thị động học hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (a) và dịch chiết (b) trên MMT theo mô hình giả bậc 1.
22
Mô hình giả bậc 2 Bảng 3.6. Dữ liệu thực nghiệm mô hình giả bậc 2
23
t/Qt (phút.g.mg-1) Thời gian (phút)
0
Dung dịch cafein 0,00 Dịch chiết 10,00
0,00
10
15
30
45
60
90
120
0,88
1,06
2,12
3,18
4,23
6,34
8,45
0,91
1,12
2,19
3,28
4,31
6,41
8,51
8,00
6,00 y = 0,0696x + 0,0686 R² = 0,9996
4,00
t/Qt
t/Qt
8,00
2,00
6,00 y = 0,0697x + 0,134 R² = 0,9998
4,00 2,00
0,00
0,00 0
24
(d)
10,00
(c)
50
t (phút)
100
150
0
50 t (phút) 100
150
Hình 3.7. Đồ thị động học hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (c) và 25
dịch chiết (d) trên MMT theo mô hình giả bậc 2.
28
26
Bảng 3.7. Các thông số mô hình động học hấp phụ cafein trên MMT 4
Mô hình
Mẫu
Thực nghiệm
Thông số mô hình Phương trình
k
Qe (mg/g)
R2
Dung dịch
-
-
14,25
-
Dịch chiết
-
-
14,20
-
Mô hình Dung dịch y = -0,0358x + 0,1273
0,0358
1,14
0,4873
giả bậc 1 Dịch chiết y = -0,0344x + 1,1862
0,0344
3,27
0,7732
Mô hình Dung dịch
y = 0,0696x + 0,0686
0,0706
14,37
0,9996
giả bậc 2 Dịch chiết
y = 0,0697x + 0,1340
0,0362
14,35
0,9998
Mức độ tuyến tính của các giá trị thực nghiệm theo mô hình được đánh giá bằng hệ số tin cậy R2. Mô hình giả bậc 1 cho giá trị R2 tương ứng là 0,4873 và 0,7732 với dung dịch cafein và dịch chiết Chè. Còn mô hình giả bậc 2 tương ứng là 0,9996 và 0,9998 lớn hơn so với mô hình bậc 1 và gần với đơn vị hơn. Đồng thời, mô hình giả bậc 2 cho giá trị Qe (lần lượt là 14,37 và 14,35 với dung dịch cafein và dịch chiết) tương đương với giá trị Qe thực nghiệm (lần lượt là 14,25 và 14,20 mg/g với dung dịch cafein và dịch chiết) trong khi mô hình giả bậc 1 cho giá trị Qe chênh lệch rất lớn với thực nghiệm (lần lượt là 1,14 và 3,27 mg/g với dung dịch cafein và dịch chiết). Từ đó có thể kết luận mô hình giả bậc 2 mô tả quá trình hấp phụ cafein trên MMT 4 theo thời gian phù hợp hơn so với mô hình giả bậc 1. 3.3.2. Đường hấp phụ đẳng nhiệt Tiến hành thí nghiệm theo mô tả ở mục 2.3.2.1 với 20 ml dịch chiết (hoặc dung dịch cafein) có nồng độ cafein ban đầu (Co) thay đổi từ 0,14 đến 0,7 mg/ml, 0,7 g MMT 4, pH 4, thời gian hấp phụ là 20 phút, nhiệt độ 25oC.
29
Bảng 3.8. Kết quả thực nghiệm hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25oC
Dung dịch cafein
Dịch chiết
Co (µg/ml)
140
300
500
600
700
Ce (µg/ml)
0,162
0,82
2
4,88
8,02
Qe (mg/g)
4,00
8,55
14,23
17,00
19,77
Ce (µg/ml)
0,5
1,5
5
8
15
Qe (mg/g)
3,99
8,53
14,14
16,91
19,57
Qe (mg cafein/g MMT)
25 20 15 Dung dịch cafein Dịch chiết
10 5 0 0
27
0,003
0,006 0,009 Ce (mg/ml)
0,012
0,015
Hình 3.8. Đường đẳng nhiệt hấp phụ cafein trên MMT ở 25°C
Bảng 3.8 cho thấy khi tăng Co từ 140 đến 500 µg/ml, Ce thay đổi từ 0,162 lên 2 µg/ml đối với dung dịch cafein và từ 0,5 lên 5,0 µg/ml đối với dịch chiết, Qe tăng đáng kể (gần 4 lần). Sau đó, Qe tiếp tục tăng chậm theo chiều tăng của Ce. Với mục tiêu giảm tối đa lượng cafein còn lại đồng thời đạt được dung lượng hấp phụ cao, nồng độ dịch chiết được lựa chọn là 10 mg/ml (tương ứng với nồng độ cafein ban đầu là 0,5 mg/ml) cho các thí nghiệm tiếp theo. Dữ liệu thực nghiệm được khớp với mô hình hấp phụ đẳng nhiệt Langmuir và Freundlich ở mục 2.3.2.3 cho kết quả như hình sau:
30
0,0008
(a)
0,0004
Ce /Qe (g/mL)
Ce /Qe (g/mL)
0,0005
0,0003 0,0002
y = 0,0458x + 5E-05 R² = 0,9926
0,0001
(b)
0,0006 0,0004
y = 0,044x + 0,0001 R² = 0,9977
0,0002 0
0 0
0,002
0,004
0,006
0,008
0
0,01
0,003
Ce (mg/ml)
0,006
0,009
0,012
0,015
Ce (mg/ml)
Đồ thị đẳng nhiệt Langmuir hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (a) và dịch chiết (b).
3,5
(c)
3,5
(d)
3
3 y = 0,4677x + 5,0551 R² = 0,9699
2,5
lnQe
2,5 2
2 1,5
1,5
1
1 -10
-9
-8
-7
-6
-5
lnQe
y = 0.4149x + 5.0725 R² = 0.9768
-8
-4
-7
-6
-5
-4
lnCe
lnCe
Đồ thị đẳng nhiệt Freundlich hấp phụ cafein từ dung dịch cafein (c) và dịch chiết (d). 28
Hình 3.9. Đồ thị hấp phụ đẳng nhiệt của cafein trên MMT ở 25°C 29
Bảng 3.9. Các thông số mô hình hấp phụ đẳng nhiệt của 30
Mẫu
cafein trên MMT ở 25°C Mô hình Langmuir
Phương trình
R2
Dung dịch cafein
y = 0,0458x + 5E-05
0,9926
21,83
916,00
Dịch chiết Chè
y = 0,044x + 0,0001
0,9977
22,73
439,95
Mẫu
Qm (mg/g) KL (ml/mg)
Mô hình Freundlich Phương trình
R2
1/n
KF
Dung dịch cafein
y = 0,4149x + 5,0725
0,9768
0,4149
159,57
Dịch chiết Chè
y = 0,4677x + 5,0551
0,9699
0,4677
156,82
Mô hình Langmuir cho giá trị R2 tương ứng là 0,9966 và 0,9977 với dung dịch cafein và dịch chiết Chè cao hơn so với mô hình Freundlich là 0,9768 và
31
0,9699. Từ đó cho thấy quá trình hấp phụ cafein trên MMT 4 phù hợp với mô hình Langmuir hơn mô hình Freundlich. 3.3.3. Ảnh hưởng của pH dịch chiết Tiến hành thí nghiệm theo mô tả ở mục 2.3.2.1 với 20 ml dịch chiết có pH thay đổi từ 4 đến 7 (điều chỉnh bằng acid citric khan hoặc NaOH 0,1 N), thêm 0,7 g MMT 4, thời gian hấp phụ 20 phút, nhiệt độ 25oC. Thu được kết quả như sau: 31
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH dịch chiết đến quá trình loại cafein % còn lại
pH 4
91,1
0,9
14,2
5
86,7
1,5
14,1
6
85,2
1,6
14,1
7
70,5
5,0
13,6 Qe
6
14,3 14,1
4
13,9 2
Qe (mg/g)
% còn lại trong dịch chiết
% cafein
32
Qe (cafein)
EGCG cafein
13,7
0
13,5 4
5
pH
6
7
Hình 3.10. Đồ thị ảnh hưởng của pH dịch chiết đến quá trình loại cafein Kết quả cho thấy pH dịch chiết tăng làm tăng tỷ lệ cafein và giảm tỷ lệ EGCG
còn lại trong dịch chiết, tuy nhiên dung lượng hấp phụ cafein thay đổi không đáng kể trong khoảng từ 4 đến 6. Do đó dịch chiết Chè được điều chỉnh về giá trị pH 4 bằng acid citric cho quá trình loại cafein bằng MMT 4. 3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ Tiến hành thí nghiệm theo mô tả ở mục 2.3.2.1 với 20 ml dịch chiết có pH 4, 0,7 g MMT 4, thời gian hấp phụ 20 phút, nhiệt độ thay đổi từ 15 đến 45°C. Thu được kết quả như sau: 32
33
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình loại cafein Nhiệt độ (oC)
% còn lại
15
90,5
0,9
14,2
25
89,1
1,0
14,1
35
89,5
2,5
13,9
45
89,2
5,0
13,6 Qe
6
14,3 14,1
4
13,9 2
Qe (mg/g)
% còn lại trong dịch chiết
% cafein
34
Qe (cafein)
EGCG cafein
13,7
0
13,5 15
25 35 o Nhiệt độ ( C)
45
Hình 3.11. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình loại cafein Kết quả cho thấy, khi tăng nhiệt độ, dung lượng hấp phụ cafein ít bị thay đổi,
chứng tỏ MMT 4 hấp phụ ổn định cafein trong dịch chiết. Do đó, để giảm tỷ lệ cafein còn lại trong dịch chiết đồng thời đơn giản hóa trong thực nghiệm, nhiệt độ quá trình hấp phụ được duy trì khoảng 15 - 25°C. 3.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol Ethanol và hỗn hợp của nó với nước là các dung môi thường sử dụng để chiết xuất catechin Chè xanh. Do đó, cần khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol trong dịch chiết đến quá trình loại cafein bằng MMT 4. Tiến hành thí nghiệm theo mô tả ở mục 2.3.2.1 với 20 ml dịch chiết có pH 4, 0,7 g MMT 4, thời gian hấp phụ 20 phút, nhiệt độ 25°C.
33
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình loại cafein Nồng độ
% còn lại
ethanol (%)
EGCG cafein
Qe (cafein)
0
90,1
1,0
14,1
10
91,5
1,2
14,1
20
95,3
14,2
12,3
40
95,2
20,1
11,4
50
93,4
30,4
10,0
% cafein
40
Qe
15
30
13
20 11
10 0
Qe (mg/g)
% còn lại trong dịch chiết
35
9 0
10 20 40 Nồng độ ethanol (%)
50
Hình 3.12. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình loại cafein Kết quả cho thấy, tỷ lệ ethanol ở mức thấp (0-10%) ít ảnh hưởng đến tỷ lệ cafein và EGCG còn lại trong dịch chiết. Nhưng ở mức nồng độ ethanol cao hơn (20 - 50%), tăng tỷ lệ ethanol làm tăng tỷ lệ cafein còn lại đồng thời giảm giá trị Qe. Do đó, để tăng hiệu quả loại cafein, ethanol trong dịch chiết cần được loại bỏ trước khi hấp phụ lên MMT. 3.4. Quy trình loại cafein Từ kết quả của các thí nghiệm trên, các điều kiện loại cafein từ dịch chiết Chè bằng MMT được lựa chọn là: - Nồng độ dịch chiết 10 mg/ml (tương ứng với nồng độ cafein 0,5 mg/ml). - Tỷ lệ ethanol trong dịch chiết ≤ 10% (tt/tt). - Tỷ lệ chất hấp phụ MMT 4 là 3,5% (kl/tt). - Thời gian hấp phụ 20 phút. - pH 4 (điều chỉnh bằng acid citric khan).
34
- Nhiệt độ quá trình hấp phụ 15 - 25oC. Với 4 L dịch chiết (40 g chất rắn, cafein 0,5 mg/ml), điều chỉnh đến pH 4 bằng acid citric sau đó tiến hành loại cafein theo các điều kiện đã lựa chọn. Hỗn hợp sau hấp phụ được để lắng, gạn, lọc thu lấy dịch chiết loại cafein, cô đặc và đông khô thu được ~ 30 g cao Chè có hàm lượng EGCG là 22,2% và cafein là 0,08%. Sắc ký đồ và hình ảnh mẫu cao sau loại cafein được thể hiện ở Hình 3.14 và Hình 3.15. 4 L dịch chiết
(cafein 0,5 mg/ml, pH 4)
140,0 g MMT
Khuấy cơ 20 phút, 150 vòng/phút, 250C Lắng, gạn, lọc bỏ bã MMT
Dịch sau loại cafein (~3,5 L) Cô đặc còn khoảng 500 ml (70oC, 500 mbar)
Đông khô (làm lạnh -700C/24 giờ, thăng hoa 0,1 mbar)
Cao khô loại cafein (~ 30g, cafein ≤ 1%)
36
Hình 3.13. Sơ đồ tóm tắt quy trình loại cafein từ dịch chiết Chè
Hình 3.14. Cao loại cafein
35
(a)
(b1)
36
(b2)
(b3) 37
Hình 3.15. Sắc ký đồ cao thô (a) và cao loại cafein lần 1,2,3 (b1, b2, b3)
37
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN Về phương pháp định lượng cafein và EGCG trong lá Chè Phương pháp HPLC phân tích định lượng cafein và các catechin trong Chè xanh xây dựng dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu và đã được thẩm định các chỉ tiêu cơ bản như: độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng. Với điều kiện sắc ký không quá phức tạp, dễ dàng triền khai tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam, kết quả thẩm định đáp ứng các yêu cầu cơ bản của phép định lượng, cho phép xác định chính xác hàm lượng cafein và EGCG trong các mẫu thử. Về phương pháp loại cafein bằng MMT Các sản phẩm chứa hàm lượng cafein thấp và tốt cho sức khỏe là một chủ đề đã và đang thu hút được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học. Phương pháp hấp phụ trên chất mang là một phương pháp phổ biến hiện nay, dễ áp dụng với các ưu điểm như thân thiện với môi trường, khả năng hấp phụ ổn định và tính chọn lọc cao, một số chất hấp phụ có thể tái sử dụng tốt. Các đặc tính quan trọng của chất hấp phụ là tính chọn lọc và dung lượng hấp phụ. Kết quả mục 3.2 cho thấy, than hoạt và nhựa macroporous - những chất hấp phụ thường sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm và thực phẩm có dung lượng hấp phụ cafein và EGCG cao hơn nhóm khoáng sét tự nhiên, tuy nhiên hệ số chọn lọc đối với cafein của 2 nhóm tác nhân này đều thấp. Dung lượng hấp phụ cafein của 8 mẫu MMT là tương đương nhưng tính chọn lọc với cafein của MMT 4 là cao nhất (K BA =1153) trong các mẫu MMT khảo sát. Nguyên nhân có thể do sự khác nhau về các đặc tính lý hóa của các mẫu MMT sử dụng như công thức cấu tạo, kích thước hạt, diện tích bề mặt riêng, khoảng cách giữa các lớp (Bảng 2.2). Tiếp tục so sánh tính chọn lọc của MMT 4 với than hoạt và nhựa macroporous D101, nhận thấy để loại bỏ trên 99% lượng cafein trong dịch chiết có nồng độ cafein 0,5 mg/mL thì tỷ lệ EGCG còn lại trong dịch chiết là 90% với MMT 4, 55% với than hoạt. Kết luận tính chọn lọc của MMT 4 cao hơn than hoạt và nhựa macroporous. Bên cạnh đó, tỷ lệ (kl/tt) tối thiểu các chất hấp phụ cần là 3,5% với MMT 4, 1,5% với than hoạt và 2,0% với nhựa macroporous D101. 38
Trong đó, cafein đã được hấp phụ vào bề mặt và không gian giữa các lớp nhờ trao đổi ion và tương tác với các nhóm silanol và siloxan trên bề mặt của montmorillonit [36].
38
Hình 4.1. Minh họa cơ chế hấp phụ cafein trên montmorillonit
Các khảo sát tiếp theo về ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật cho thấy, quá trình hấp phụ cafein trên MMT 4 chịu ảnh hưởng mạnh bởi thời gian hấp phụ, nồng độ, pH dịch chiết, nồng độ ethanol và ít chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ. Cụ thể với thời gian hấp phụ, MMT 4 hấp phụ nhanh cafein trong dịch chiết Chè, thời gian đạt cân bằng hấp phụ khoảng 20 phút và không có sự khác biệt đáng kể khi so sánh với dung dịch cafein (Hình 3.5), điều này cho thấy quá trình hấp phụ cafein trên MMT 4 ít bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong dịch chiết. Động học hấp phụ cafein trên MMT tuân theo mô hình giả bậc 2 hơn mô hình giả bậc 1 do hệ số tương quan R2 cao hơn, đồng thời dung lượng hấp phụ dự đoán theo mô hình gần với giá trị thực nghiệm hơn (Bảng 3.7). Nghiên cứu quá trình hấp phụ đẳng nhiệt cho thấy, ở mức nồng độ dịch chiết loãng (Co từ 0,14 đến 0,50 mg/ml), tăng Co làm tăng dung lượng hấp phụ đến giá trị cân bằng (Qe ~ 14,2 mg/g) (Hình 3.8, Bảng 3.8). Tiếp tục tăng nồng độ dịch chiết chỉ làm tăng Ce và tăng nhẹ Qe có thể do các vị trí hấp phụ cafein trên MMT đã gần bão hòa. Đánh giá hệ số tin cậy R2 của dung dịch cafein và dịch chiết Chè trong mô hình Freundlich và mô hình Langmuir cho thấy cafein hấp phụ đơn lớp trên MMT theo mô hình Langmuir. Kết quả này tương tự với nhận xét của Shiono Takashi và cộng sự. 39
Với pH, cafein bản chất là một alcaloid, có tính base yếu. Do đó ở điều kiện pH thấp, tỷ lệ cafein điện ly nhiều hơn nên thuận lợi cho quá trình hấp phụ trên MMT theo cơ chế trao đổi ion. Điều này đã được thể hiện ở Hình 3.10 với tỉ lệ cafein còn lại trong dịch chiết giảm khi pH giảm. Đồng thời EGCG bền vững nhất trong môi trường acid nhẹ pH 3 - 4 và phân hủy nhanh trong môi trường pH cao, đây là nguyên nhân ở pH 7 ECGC giảm mạnh chỉ còn 70,5%. Do đó pH bằng 4 đã được lựa chọn cho thực nghiệm. Ngoài vai trò điều chỉnh pH, acid citric còn được biết đến là một chất ổn định tự nhiên được sử dụng trong thực phẩm và dược phẩm. Khi so sánh sự khác nhau về màu sắc của dịch chiết khi có và không có acid citric cho kết quả như Hình 4.2.
39
Hình 4.2. Dịch chiết Chè tự nhiên (1), dịch chiết có MMT và acid citric (2) và dịch chiết có MMT không có acid citric (3) sau khi lắc 1 giờ
Với mẫu không có acid citric, dịch chiết sau khi lắc với MMT bị sẫm màu rõ rệt do EGCG và các catechin bị oxy hóa trong thời gian hấp phụ. Ngược lại, mẫu có acid citric có màu sắc trong xanh, không bị biến màu trong thời gian hấp phụ cafein. Vì vậy, acid citric được sử dụng với vai trò điều chỉnh pH và hiệp đồng chống oxy hóa để bảo vệ EGCG và các catechin khác trong quá trình loại cafein bằng MMT. Với nồng độ ethanol, tăng tỷ lệ ethanol làm giảm độ phân cực của dung môi, giảm khả năng điện ly của cafein từ đó làm giảm khả năng hấp phụ của cafein trên MMT (Bảng 3.10). Do đó, dịch chiết với dung môi ethanol-nước cần được xử lý 40
thu hồi ethanol trước khi hấp phụ lên MMT nhằm đạt được hiệu suất loại cafein cao. Hiện nay đối với các sản phẩm Chè loại cafein, hàm lượng cafein tối đa được giới hạn ở mức 4 mg/g (tức 0,4%) đối với lá Chè và 10 mg/g (tức 1%) đối với Chè hòa tan [37]. Quá trình loại cafein bằng MMT 4 khi tiến hành ở quy mô lớn hơn cho kết quả khả quan, cao chiết thu được có màu sắc sáng hơn cao chưa loại cafein, hàm lượng cafein còn dưới 1%, tỷ lệ EGCG/cafein trong cao tăng gấp gần 40 lần. Đặc biệt, quy trình tiến hành đơn giản, nhanh chóng, kinh tế và thân thiện với môi trường.
41
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau quá trình nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra, cụ thể như sau: - Khảo sát và lựa chọn được các thông số kỹ thuật thích hợp cho quá trình loại cafein từ dịch chiết lá Chè xanh bằng montmorillonit: + Nồng độ cafein 0,5 mg/ml. + Tỷ lệ ethanol trong dịch chiết ≤ 10% (tt/tt). + Tỷ lệ chất hấp phụ MMT 4 là 3,5% (kl/tt). + Thời gian hấp phụ 20 phút. + pH 4 (điều chỉnh bằng acid citric khan). + Nhiệt độ quá trình hấp phụ 15-25oC. KIẾN NGHỊ Trên cơ sở các kết quả đã đạt được, đề tài có một số kiến nghị sau: - Làm giàu catechin trong cao Chè đã loại cafein. - Nghiên cứu thu hồi cafein sau quá trình hấp phụ.
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1.
Đỗ Hữu Nghị (2016), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu, Trường ĐH Dược Hà Nội, tr.119 - 124.
2.
Phạm Thanh Kỳ (2014), Dược liệu học tập II, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.132-134.
3.
Trần Đức Hậu (2014), Hóa Dược tập I, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.128-132.
4.
Đỗ Huy Bích (2006), 1000 Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập I, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr.419-422.
5.
Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr.187-188.
Tài liệu tiếng Anhq2w 6.
Abbott P.J. (1986), "Caffeine: a toxicological overview", Medical Journal of Australia, 145(10), pp. 518-521.
7.
Choung M.G., Hwang Y.S., et al. (2014), "Comparison of extraction and isolation efficiency of catechins and caffeine from green tea leaves using different solvent systems", International journal of food science & technology, 49(6), pp. 1572-1578.
8.
Chu Y.F. (2012), Coffee: emerging health effects and disease prevention, John Wiley & Sons, pp. 3-5.
9.
Dong J.J., Ye J.H., et al. (2011), "Isolation of antioxidant catechins from green tea and its decaffeination", Food and Bioproducts Processing, 89(1), pp. 62-66.
10.
Ernest KC (1988), "Novel decaffeination process using cyclodextrins", Applied microbiology and biotechnology, 28(6), pp. 546-552.
11.
Giannelli M., Doyle P., et al. (2003), "The effect of caffeine consumption and nausea on the risk of miscarriage", Paediatric and perinatal epidemiology, 17(4), pp. 316-323.
12.
Gokulakrishnan S., Chandraraj K., et al. (2005), "Microbial and enzymatic methods for the removal of caffeine", Enzyme and Microbial Technology, 37(2), pp. 225-232.
13.
Ho C.T., Che CW, et al. (1997), Natural antioxidants from tea, AOCS Press: Champaign, IL, pp. 213-223.
14.
Huang K.J., Wu J.J., et al. (2007), "Designed polar cosolvent-modified supercritical CO2 removing caffeine from and retaining catechins in green tea powder using response surface methodology", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55(22), pp. 9014-9020.
15.
Jayrajsinh S., Shankar G., et al. (2017), "Montmorillonite nanoclay as a multifaceted drug-delivery carrier: A review", Journal of Drug Delivery Science and Technology, 39, pp. 200-209.
16.
Khan N., Mukhtar H. (2007), "Tea polyphenols for health promotion", Life Sci, 81(7), pp. 519-33.
17.
Li J., Chase H.A. (2010), "Development of adsorptive (non-ionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologicallyactive natural products from plant sources", Natural product reports, 27(10), pp. 1493-1510.
18.
Li S., Jiang C., et al. (2014), "Lactobacillus casei immobilized onto montmorillonite: survivability in simulated gastrointestinal conditions, refrigeration and yogurt", Food research international, 64, pp. 822-830.
19.
Liang H., Liang Y., et al. (2007), "Decaffeination of fresh green tea leaf (Camellia sinensis) by hot water treatment", Food Chemistry, 101(4), pp. 1451-1456.
20.
Lin L., Zhang Y.Y., et al. (2019), "Highly simplified preparation of tea flavonoids from surplus tea leaves by the novel three-phase extraction and purification", Separation Science and Technology, pp. 1-6.
21.
Margolis G., Rushmore D.F., et al., Decaffeination of vegetable material. 1977, Google Patents.
22.
Mohanpuria P., Kumar V., et al. (2011), "Producing low-caffeine tea through post-transcriptional silencing of caffeine synthase mRNA", Plant molecular biology, 76(6), pp. 523-534.
23.
Murray H.H. (2000), "Traditional and new applications for kaolin, smectite, and palygorskite: a general overview", Applied clay science, 17(5-6), pp. 207-221.
24.
Okay O. (2000), "Macroporous copolymer networks", Progress in polymer science, 25(6), pp. 711-779.
25.
Onal M. (2006), "Physicochemical properties of bentonites: an overview", Commun. Fac. Sci. Univ. Ank. Series B, 52(2), pp. 7-12.
26.
Park H.S., Im N.G., et al. (2012), "Extraction behaviors of caffeine and chlorophylls in supercritical decaffeination of green tea leaves", LWT-Food Science and Technology, 45(1), pp. 73-78.
27.
Park J.H., Shin H.J., et al. (2016), "Application of montmorillonite in bentonite as a pharmaceutical excipient in drug delivery systems", Journal of Pharmaceutical Investigation, 46(4), pp. 363-375.
28.
Ramarethinam S., Rajalakshmi N. (2004), "Caffeine in tea plants [Camellia sinensis (L) O. Kuntze]: in situ lowering by Bacillus licheniformis (Weigmann) Chester", pp. 575-580
29.
Row K.H., Jin Y. (2006), "Recovery of catechin compounds from Korean tea by solvent extraction", Bioresource Technology, 97(5), pp. 790-793.
30.
Senol A., Aydin A. (2006), "Solid–liquid extraction of caffeine from tea waste using battery type extractor: process optimization", Journal of Food Engineering, 75(4), pp. 565-573.
31.
Sevillano D.M., Wielen L.AM, et al. (2014), "Resin selection for the separation of caffeine from green tea catechins", Food and bioproducts processing, 92(2), pp. 192-198.
32.
Shiono T., Yamamoto K., et al. (2017), "Selective decaffeination of tea extracts by montmorillonite", Journal of Food Engineering, 200, pp. 1321.
33.
Smith A. (2002), "Effects of caffeine on human behavior", Food and chemical toxicology, 40(9), pp. 1243-1255.
34.
Villanueva D., Luna P., et al. (2011), "Extraction of caffeine from green coffee beans using ethyl lactate", food processing, 1, pp. 3.
35.
Vuong Q.V., Roach P.D. (2014), "Caffeine in green tea: its removal and isolation", Separation & Purification Reviews, 43, pp. 155-174.
36.
Yamamoto K., Shiono T., et al. (2019), "Interaction of caffeine with montmorillonite", Particulate Science and Technology, 37(3), pp. 325-332.
37.
Ye J.H., Liang Y.R., et al. (2007), "Preparation of partially decaffeinated instant green tea", Journal of agricultural and food chemistry, 55(9), pp. 3498-3502.
PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phiếu giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu Phụ lục 2. Hình ảnh nguyên liệu và một số chất hấp phụ dùng trong nghiên cứu
Phụ lục 2. Hình ảnh nguyên liệu và một số chất hấp phụ dùng trong nghiên cứu
Phụ lục 2.1. Mẫu Chè nguyên liệu
Phụ lục 2.2. Hình ảnh các mẫu MMT
Phụ lục 2.3. Hình ảnh các mẫu nhựa macroporous