Issuu

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HƢƠNG MÃ SINH VIÊN: 1101243

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HƢƠNG MÃ SINH VIÊN : 1101243

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh 2. ThS. Ngô Minh Thúy Nơi thực hiện: Bộ môn Vật lý – Hóa lý

HÀ NỘI - 2016

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

LỜI CẢM ƠN

người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt cho tôi những

kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh,

Để có thể hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng

lời cảm ơn đến ThS. Ngô Minh Thúy, người đã luôn giúp đỡ tôi giải

ẠO

quyết những tình huống cấp bách và khó khăn trong suốt quá trình thực

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

hiện khóa luận này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật

H Ư

viên tại Bộ môn Vật lý – Hóa lý và Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại khóa luận tốt nghiệp đúng hạn.

TR ẦN

học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành

Tôi rất cảm ơn công ty Traphaco đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi có đầy

10 00

đủ hóa chất và nguyên vật liệu để tôi hoàn thành khóa luận này với kết

quả tốt nhất.

Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn mọi người trong gia đình và bạn bè

-L

Í-

đã dành cho tôi những tình cảm, sự cổ vũ và động viên trong cuộc sống

Hà Nôi, ngày 12 tháng 05 năm 2016

Sinh viên Nguyễn Thu Hƣơng

IỄ N

ÀN

ÁN

và học tập.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

kinh nghiệm nghiên cứu khoa học quý báu. Tôi cũng xin trân trọng gửi

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Mục ục LỜI CÁM ƠN

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 2

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1

1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume .................................................. 2 1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume ................................... 2

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume ....................... 2

1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam .......................... 3

1.1.2. Đặc điểm loài Gynostemmsa pentaphyllum .................................... 3

H Ư

1.1.2.1. Đặc điểm thực vật: .................................................................... 3

TR ẦN

1.1.2.2. Thành phần hóa học của G. Pentaphyllum: .............................. 4 1.1.2.3. Phân bố:..................................................................................... 5

1.1.3. Tác dụng dược lý và độc tính .......................................................... 5

10 00

1.1.4. Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng. ................... 6

1.2. ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT TRONG GIẢO CỔ LAM ............. 6

1.2.1. Phương pháp cân ............................................................................ 7

-L

Í-

1.2.2. Phương pháp đo quang ................................................................... 7

ÁN

1.2.3. Phương pháp HPLC........................................................................ 9

IỄ N

ÀN

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN ( UVVIS) .............................................................................................................. 11

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM ................................................... 2

1.3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS. .................................................................... 11 1.3.2. Định luật Lambert-Beer................................................................. 11 1.3.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một thành phần .......................................................................................... 13

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 16

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ .................................................... 16 2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................... 16

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................ 17

2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, thuốc thử .................................................... 16

2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích ................................................. 17

ẠO

2.2.2. Thẩm định phương pháp................................................................ 17

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

2.2.3. Phân tích mẫu thực ........................................................................ 18

2.2.4. Xử lý số liệu .................................................................................. 18

H Ư

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ...................... 19

TR ẦN

3. 1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG . 19 3.1.1. Lựa chọn điều kiện đo quang ........................................................ 19

10 00

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu .................................... 20 3.1.3. Quy trình phân tích ........................................................................ 24

3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ............................... 25

Í-

3.2.1. Tính chọn lọc ................................................................................. 25

-L

3.2.3. Độ lặp lại ....................................................................................... 28

ÁN

3.2.4. Độ đúng ......................................................................................... 30

ÀN

3.3. PHÂN TÍCH MẪU THỰC ............................................................... 31

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................... 17

IỄ N

3.4. BÀN LUẬN ......................................................................................... 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................... 37 1. Kết uận .................................................................................................... 37 2. Đề xuất ..................................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MeOH: Methanol

n-BuOH: n-Buthanol

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

U Y

G: Gynostemma

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

TÊN BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Các mẫu dược liệu Giảo cổ lam dùng trong nghiên cứu

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tuyến tính của quy trình định lượng

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu M01

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp

Bảng 3.5. Kết quả hàm lượng saponin toàn phần tính theo Gypenoside XVII trong các mẫu thử

Ơ H

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

H Ư

TR ẦN B 10 00 A Ó H Í-L ÁN

U Y

ẠO

IỄ N

ÀN

STT

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

DANH MỤC CÁC BẢNG

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.2. Cơ chế phản ứng tạo màu

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của gypenoside XVII

Hình 1.4. Nguyên tắc của định luật Lambert-Beer

Hình 1.5. Đồ thị của phương pháp đường chuẩn A = f (C)

Hình 1.6. Đồ thị của phương pháp thêm đường chuẩn

Hình 3.1. Phổ hấp thụ của gypenoside XVII

Hình 3.2. Kết quả khảo sát kỹ thuật chiết

Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết

Hình 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết

Hình 3.5. Kết quả khảo sát điều kiện tinh chế saponin (n = 3)

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ saponin gypenoside XVII và độ hấp thụ

20 21

10 00

Í-L ÁN

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

TR ẦN

H Ư

ẠO

IỄ N

ÀN

Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic (a); Protopanaxadiol (b)

U Y

TRANG

TÊN HÌNH

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

STT

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

dược ngày càng tăng. Việt Nam có ưu thế về nguồn cây phong phú và lịch sử

Hiện nay, xu hướng tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo

U Y

lâu đời sử dụng dược liệu trong phòng và điều trị bệnh, cũng như bổ dưỡng

một cây được dùng phổ biến trong dân gian làm thuốc, chè uống và thức ăn.

ẠO

Có nhiều nghiên cứu cho thấy chế phẩm G. Pentaphyllum rất có lợi cho sức

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

khỏe như điều trị bệnh tim mạch, bệnh tiểu đường, ung thư, viêm gan, các

bệnh thần kinh và có thể giúp giảm bớt căng thẳng, chống viêm, giảm mệt

H Ư

mỏi, hạ cholesterol và triacylglycerol. Chất có hoạt tính trong G. Pentaphyllum có thể là polysaccharide, flavonoid, saponin, carotenoid,

hoạt tính sinh học chính.

TR ẦN

clorophyl và sterol. Trong đó, flavonoid và saponin được coi là nhóm chất có

10 00

Do có tác dụng tốt cho sức khỏe nên sản phẩm của G. Pentaphyllum được tiêu thụ mạnh trên thị trường ở nhiều nước châu Á, châu Âu và cả ở Hoa Kỳ.

Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng có sự khác nhau lớn về thành phần hóa

học của các sản phẩm chứa G. Pentaphyllum lưu hành trên thị trường. Sự khác

Í-

nhau về thành phần hóa học có thể dẫn đến hiệu lực điều trị, liều, độ ổn định,

-L

hạn dùng, độ an toàn... rất khác nhau, do đó cần thiết phải kiểm soát chất

ÁN

lượng của sản phẩm. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, khóa luận “định lượng

IỄ N

ÀN

saponin toàn phần trong giảo cổ lam” được thực hiện với hai mục tiêu: -

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

nâng cao sức khỏe của người dân. Gỉao cổ lam hay Bổ đắng ( Việt Nam ) là

Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần

trong dược liệu Gỉao cổ lam bằng phương pháp quang phổ dùng Gypenoside XVII làm chất đối chiếu. -

Đánh giá hàm lượng saponin toàn phần trong một số mẫu

Giảo cổ lam thu thập được.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM

1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume

ẠO

Theo các tài liệu Thực vật dược và phân loại thực vật, Cây cỏ Việt Nam

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

[15], chi Gynostemma Blume được xếp vào họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí).

Vị trí của chi Gynostemma Blume trong hệ thống phân loại thực vật dược

H Ư

như sau:

Ngành Ngọc lan Magnoliophyta



Lớp Ngọc lan Magnoliopsida



Phân lớp Sổ Dilleniidae



Liên bộ Hoa tím Violanae



Bộ Bí Cucurbitales



Họ Bầu bí Cucurbitaceae



Chi Gynostemma.

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN



IỄ N

ÀN

1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume

Chi Gynostemma Blume được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa

trên đặc điểm hình thái của loài G. simplicifolium. Từ đó đến nay, đã có thêm nhiều loài được mô tả. Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc điểm chung

như sau [15], [30]: Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm. Lá kép, ít khi là lá đơn, lá khía răng cưa. Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có 3 lá bắc con, cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe, chia 5

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 3

thùy, ngắn. Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột. Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2

1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam

Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea. Tại Trung

Quốc có 14 loài (trong đó có 9 loài đặc thù). Tính đến nay đã có 3 loài thuộc

chi Gynostemma được công bố ở Việt Nam là Gynostemmsa pentaphyllum

H Ư

(Thunb.) Makino, Gynostemma laxum (Wall.) Cogn và Gynostemma longipes

TR ẦN

C.Y. Wu in C.Y. WU & S.K. Chen [16]. Loài G. pentaphyllum, loài phổ biến

10 00

1.1.2. Đặc điểm loài Gynostemmsa pentaphyllum

1.1.2.1. Đặc điểm thực vật:

Cây thảo, mọc leo, thân cành mảnh, có góc cạnh, không lông hoặc lông thưa

Í-

thớt ở mấu. Lá kép chân vịt – bàn đạp, 5 – 7 lá chét dài 3 – 9cm, rộng 1,5 –

-L

3cm, mép lá có răng cưa.Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [10]. Cụm hoa đực

ÁN

dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1 – 4 mm; ống đài rất ngắn, thùy đài

hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu dục hoặc

ÀN

mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5. Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

dẹt 2 bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi.

nhất và được sử dụng làm thuốc.

đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2 – 3 hạt hình trứng hơi

ô. Nhụy: bầu hình cầu nhỏ, 2 – 3 ngăn, 2 – 3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2 – 3

IỄ N

đực. Hoa cái có đài và tràng giống hoa đực, bầu hình cầu 2 – 3 ô, vòi nhụy 3, nhị lép 5, ngắn. Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5 – 6 mm, khi chín

màu đen. Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu, đỉnh tù, gốc hình tim dẹt. Mùa hoa tháng 3 – 10, quả tháng 4 – 12 [3], [9], [10]. Cây mọc trên đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m [10].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 4

1.1.2.2. Thành phần hóa học của G. Pentaphyllum: Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam

Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino được phân lập và nhận dạng cấu

thuộc nhóm dammaran (hình 1.1.a). Đã có trên 100 saponin trong thành phần

U Y

trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại protopanaxadiol trong ginsenoside

Rb3 (Gypenoside IV), Rd (Gypenoside VIII), F2 [33], Rg3, malonyl-Rb1 và

ẠO

malonyl-Rd [25]. Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [33] (hình

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

1b). Những ginsenoside đó chiếm khoảng 25% tổng gypenoside toàn phần

trong cây và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm

H Ư

thấy ngoài họ Araliaceae [32]. Một số Gypenoside XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài Gymnema sylvestre (Retz) Schult [19].

TR ẦN

Các saponin còn lại chiếm phần lớn các gypenoside được phát hiện lần đầu ở

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

của Panax ginseng C. A. Mayer là Rb1 (Gypenoside III) [24], [25], Rc [33],

Hình 1. 1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic (a); Protopanaxadiol (b)

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 5

- Giảo cổ lam gồm 2 loại có vị ngọt và vị đắng. Nghiên cứu của tác giả [30] so sánh thành phần các ginsenoside Rb1, Rb3, Rd, and F2 và saponin 20(S)-

lượng 4 ginsenoside và 20(S)-panaxadiol trong Gỉao cổ lam, vị ngọt lớn hơn

panaxadiol trong dịch thủy phân của G.Pentaphyllum. Kết quả cho thấy hàm

U Y

nhiều so với Giảo cổ lam vị đắng.

(rhamno)-hexoside, kaempferol 3-O-di-p-coumaroylh-exoside, kaempferol 3-

ẠO

O-di-p-coumaroylhexoside, quercetin-rhamno-hexoside, rutin, kaempferol-

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

rhamno-hexoside, kaempferol-3-O-rutinoside, quercetin and kaempferol [18].

H Ư

1.1.2.3. Phân bố:

- Loài G. pentaphyllum, loài phổ biến nhất và được sử dụng làm thuốc, phân

TR ẦN

bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản

và Việt Nam.

Về tác dụng dược lý

10 00

1.1.3. Tác dụng dược lý và độc tính

Trên thế giới loài G. pentaphyllum đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh

Í-

học, bao gồm tác dụng hạ đường huyết [12], [28], [34], điều trị bệnh tim mạch

-L

[29], viêm gan [21], các bệnh thần kinh [13] và có thể làm giảm bớt căng thẳng

ÁN

[17], [22], chống viêm [21], [23] giảm mệt mỏi [31]. Đặc biệt, tác dụng hạ

cholesterol và triacylglycerol [7], [14] đã được nghiên cứu thử nghiệm lâm

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

- Flavonoid trong Giảo cổ lam cũng được xác định, gồm có quercetin-di-

IỄ N

ÀN

sàng và được sử dụng làm thuốc tại Trung Quốc, Nhật Bản. Các nghiên cứu về loài G. pentaphyllum ở Việt Nam cũng cho thấy dược

liệu Giảo cổ lam có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường huyết, chống khối u [6] và tăng đáp ứng miễn dịch [7].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 6

Về độc tính Nhóm

tác

giả

Thái

Lan

Natthakarn

Chiranthanut,

Supanimit

Gynostemma pentaphyllum Makino trên chuột thí nghiệm kết quả không phát

Teekachunhatean và cộng sự (2013) đã đánh giá độc tính của dịch chiết

hiện gây độc) [26].

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ghi nhận nào về độc tính của dược liệu này được công bố.

Thực tế cho thấy, Giảo cổ lam đã được dùng từ lâu đời nhưng vẫn chưa có

1.1.4. Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng.

H Ư

Giảo cổ lam được dùng chủ yếu dưới 2 dạng là trà giảo cổ lam và viên nang

TR ẦN

giảo cổ lam. Các sản phẩm này đều là thực phẩm chức năng, giúp hỗ trợ điều trị bệnh mỡ máu cao, huyết áp cao, tiểu đường tuýp II. Ngoài ra các chế phẩm còn tăng lưu thông máu, hỗ trợ điều trị đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, giúp dễ

10 00

ngủ, ngủ sâu giấc, tăng khả năng làm việc, giảm căng thẳng, mệt mỏi. Các sản phẩm từ Giảo cổ lam được lưu thông rộng rãi trên thị trường như

Giảo cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Thiên Bảo, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ

lam Tam Đảo… Các sản phẩm từ Giảo cổ lam cũng được lưu thông nhiều tại

-L

Í-

các nước châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, châu Âu,

ÁN

Mỹ,… Hiện nay, công ty Traphaco đang nghiên cứu để sản xuất dạng chế

phẩm thuốc.

IỄ N

ÀN

1.2. ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT TRONG GIẢO CỔ LAM

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

hiện được liều gây độc trên chuột (liều 750 mg dược liệu/kg chuột không phát

Các tài liệu công bố gần đây đã khẳng định thành phần hoạt chất chính

trong dược liệu Giảo cổ lam là saponin, flavonoid và các polysaccharid. Các nghiên cứu đã phát hiện được khoảng hơn 100 saponin trong Giảo cổ lam, hầu hết các chất này đều có khung dammaran, tuy vậy, không có chất nào chiếm đa số. Có nhiều phương pháp xác định hàm lượng saponin trong các mẫu giảo cổ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 7

lam như phương pháp cân, phương pháp quang phổ, phương pháp HPLC.

Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (qua rây số 355) đã xác định độ ẩm

1.2.1. Phương pháp cân

U Y

cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform đến khi dịch

Lọc, lấy dịch lọc cất thu hồi dung môi đến còn khoảng 10 ml, rót từ từ vào 100 ml

ẠO

aceton, khuấy đều. Lọc lấy tủa, hòa tan tủa trong 50 ml nước nóng, đun cách thủy

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

cho tan hết. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn và chiết saponin bằng n-butanol 8 lần,

mỗi lần với 25 ml n-butanol. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi, cô cách thủy

H Ư

TR ẦN

saponin toàn phần theo dược liệu khô [1].

đến khô. Sấy cắn ở 60oC đến khối lượng không đổi. Cân và tính hàm lượng

1.2.2. Phương pháp đo quang

Phương pháp đo quang có nhiều ưu thế khi áp dụng cho những hoạt chất

10 00

trong nhóm có cùng dạng cấu trúc, cùng tác dụng sinh học. Đa số các saponin ít có nối đôi nên thường chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 210 - 195 nm.

Để có thể định lượng được cần thực hiện phản ứng với các thuốc thử khác

nhau tùy theo cấu trúc của saponin, sản phẩm tạo thành có khả năng hấp thụ ở

-L

Í-

vùng khả kiến. Đo độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng, dựa vào chuẩn làm

ÁN

trong cùng điều kiện, tính được hàm lượng saponin toàn phần.

Đối với nhóm triterpenoid có thể dùng thuốc thử vanillin – sulfuric; các

ÀN

saponin cho màu tím với thuốc thử này. Một số nghiên cứu phản ứng màu của

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

chiết không còn màu. Loại bỏ dịch cloroform. Chiết bằng methanol trong 2 giờ.

phản ứng loại H2O tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với Vanillin/acid sulfuric đặc. Cơ chế trình bày theo hình 1.2.

IỄ N

saponin khung dammaran, cho thấy chính nhóm OH tại C3 là nguyên nhân gây

Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị Diệp Thanh [4] sử dụng ethanol 70% chiết saponin từ 10 g dược liệu bằng chiết siêu âm, cất thu hồi

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 8

dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, sấy ở 60oC đến cắn khô. Hòa tan cắn trong nước cất và cho hấp phụ vào cột chứa Diaion HP-20 theo tỉ lệ 1:4 (thể

80% đến kiệt saponin (khoảng 200 ml). Thu dịch MeOH 80%, bốc hơi đến

tích/thể tích). Để yên 1 giờ, rửa lần lượt bằng nước cất, MeOH 20% và MeOH

U Y

cắn. Hòa tan cắn thu được bằng MeOH và đem phản ứng với thuốc thử

80oC trong 10 phút. Làm lạnh nhanh bằng nước đá và đo quang ở bước sóng

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

550 nm. Tính kết quả saponin toàn phần dựa vào chuẩn ginsenoside Rb1.

Hình 1. 2. Cơ chế phản ứng tạo màu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

vanillin/acid acetic băng 3% và acid perchloric 70%, đặt lên bể điều nhiệt ở

Zhuohong Xie, et al., (2010), sử dụng ethanol tuyệt đối chiết 12 g dược liệu

(đã được làm nhỏ tới kích thước 40 mesh) bằng Soxhlet, dịch chiết cho phản ứng với thuốc thử vanillin/ acid acetic 5% và acid perchloric 70%. Để hỗn hợp ở 60oC trong 15 phút Làm lạnh nhanh bằng nước đá và đo quang ở bước sóng 550 nm. Tính kết quả saponin toàn phần dựa vào chuẩn là dịch chiết

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 9

gypenoside [36]

Đây là phương pháp hiện nay được sử dụng nhiều trong định tính, định

1.2.3. Phương pháp HPLC

lượng các chất nói chung và saponin nói riêng. Người ta có thể định lượng 1

cho định lượng 1 nhóm hoạt chất trong dược liệu cần chọn được 1 chất chỉ thị (marker) có tác dụng hoặc chỉ thị phân tích – điều này rất khó giải quyết trong

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

định lượng saponin ở Giảo cổ lam vì hiện nay chưa phát hiện chất nào có tác

dụng nổi trội hoặc có hàm lượng lớn nhất.

H Ư

Dược điển Hồng Kông, chuyên luận “Gynostemmatis Herba” đối với Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino (Cucurbitaceae) tiến hành định

TR ẦN

lượng panaxadiol trong mẫu dược liệu bằng cách hoạt chất được chiết bằng methanol, sau đó cô dưới áp suất giảm được cắn. Hòa tan cắn trong acid

hydrocloric (29,5% kl/tt) và đun hồi lưu trong 4 giờ. Để nguội và chiết bằng

10 00

dicloromethan. Cô dưới áp suất giảm được cắn. Hòa tan cắn trong methanol và

tiến hành phân tích bằng HPLC với detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ESLD).

Yêu cầu hàm lượng panaxadiol (C30H52O3) không nhỏ hơn 0,094% tính theo

Í-

dược liệu khô. Tuy nhiên, các công bố thu thập được và khảo sát sơ bộ bằng

-L

thực nghiệm của nhóm nghiên cứu chúng tôi thì không phát hiện có panaxadiol

ÁN

trong các mẫu Giảo cổ lam Việt Nam dùng trong nghiên cứu.

Tác giả Lu, J.G., et al., [20] đã so sánh hàm lượng các chất có trong

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

thành phần hay đồng thời nhiều thành phần trong hỗn hợp. Để có thể áp dụng

IỄ N

ÀN

Gynostemma pentaphyllum vị ngọt và vị đắng. Nhóm nghiên cứu sử dụng

UPLC-Q-TOF-MS và HPLC-ELSD để định tính và định lượng các saponin trong 21 mẫu dược liệu. Kết quả đã chỉ ra rằng 10/10 mẫu Giảo cổ lam đắng hàm lượng 4 ginsenoside Rb1, Rb3, Rd, F2 hầu như không có hoặc rất thấp trung bình 8,3 µg/g so với 823,9 µg/g của 11 mẫu Giảo cổ lam ngọt. Cụ thể là 10/10 mẫu không có Rb1, Rb3, Rd 5/10 mẫu không có, 5/10 mẫu có Rd nhưng hàm lượng thấp hơn rất nhiều so với loại Giảo cổ lam ngọt (từ 3,6 – 33,7 g/g

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 10

so với 129 – 835 g/g – 11 mẫu nghiên cứu), F2 7/10 mẫu không có, 3/10 mẫu có F2 nhưng hàm lượng thấp hơn rất nhiều so với loại Giảo cổ lam ngọt (từ 2,5

rong et al. [27] dùng HPLC với detectơ UV đo ở bước sóng 203 nm định lượng

– 11,2 µg/g so với 8,4 – 476,2 µg/g– 11 mẫu nghiên cứu).Tác giả SHI Mei-

3 ginsenoside Rb1, Rb3, Rd và gypenoside XVII, XLIX trong 32 mẫu

Trung Quốc kết quả cho thấy khoảng 2/3 số mẫu không có chứa Rb1, Rb3, đa

ẠO

số các mẫu đều có Gypenoside XVII và XLIX và Rd.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Tác giả Kao, T.H., et al., đã xác định được 34 gypenoside trong

Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng LC-MS/MS [18].

H Ư

Từ những tài liệu thu thập được, chúng tôi thấy rằng trong Giảo cổ lam có

TR ẦN

rất nhiều saponin (gypenoside) nhưng không có saponin gypenoside nào có hàm lượng đủ lớn hoặc tác dụng dược lý nổi bật để làm đối tượng định lượng do đó lựa chọn đối tượng định lượng là nhóm chất saponin sẽ phản ánh chất

10 00

lượng của dược liệu Giảo cổ lam khách quan hơn. Chất đối chiếu sử dụng là

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

trình bày ở hình 1.3.

một gypenoside có trong Giảo cổ lam là gypenoside XVII với cấu trúc được

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Gynostemma pentaphyllum ngọt và đắng thu hái tại các cùng khác nhau ở

Hình 1. 3. Công thức cấu tạo của gypenoside XVII

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 11

Tên khoa học: 3β-(β-D-Glucopyranosyloxy)-12β-hydroxy-5α-dammar-24en-20-yl

6-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside;(3beta,12beta)-3Glucopyranosyloxy)-12-hydroxydammar-24-en-20-yl-6-O-beta-D-

glucopyranosyl-beta-D-glucopyranoside.

(beta-D

Độ tan: Gypenoside XVII tan trong pyridin, methanol, ethanol.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN ( UV-VIS)

H Ư

1.3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS.

TR ẦN

Khi tia bức xạ tương tác với vật chất có thể xảy ra một số quá trình: phản xạ, hấp thụ, tán xạ, huỳnh quang và quang hóa. Khi đo quang phổ tử ngoại

khả kiến, người ta mong muốn chỉ có quá trình hấp thụ xảy ra. Vì bức xạ điện

10 00

từ là các hạt mang năng lượng nên khi phân tử hấp thụ, nó sẽ kích thích hệ electron của phân tử và làm tăng nội năng của nó. Năng lượng tổng của một

phân tử bao gồm: năng lượng chuyển động tịnh tiến của phân tử ( Et ), năng

lượng của điện tử ( Ee ), năng lượng của các dao động ( Ev ) và năng lượng

-L

Í-

của chuyển động quay ( Er ) E_tổng = Et + Ee + Ev + Er

ÁN

Phương trình biểu diễn:

(Ee >> Ev >> Er)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Trọng lượng phân tử: 947.158

U Y

Công thức phân tử: C48H82O18

ÀN

Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại – khả kiến có thể làm thay đổi mức năng lượng

IỄ N

điện tử Ee và là nguồn gốc của phổ UV-VIS. Do đó phổ UV-VIS được gọi là

phổ điện tử.

1.3.2. Định luật Lambert-Beer.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 12

Định luật là cơ sở lý thuyết cho phép định lượng bằng quang phổ UV-VIS. Khi chiếu một chùm tia sáng đơn sắc bước sóng  với cường độ ánh sáng I0 đi qua

dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày l thì cường độ ánh sáng sau đó chỉ

TR ẦN

Hình 1. 4. Nguyên tắc của định uật Lambert-Beer

10 00

I = I0.10-.l.C

Mối quan hệ giữa I và I0 được biểu diễn bằng biểu thức:

Trong đó:  là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch, chỉ phụ thuộc vào bản chất

chất tan và bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch.

Í-

T=I/Io.100% được gọi là độ truyền qua.

ÁN

-L

A=(Io-I)/Io.100% được gọi là độ hấp thụ.

Độ lớn của độ truyền qua T hay độ hấp thụ A phụ thuộc bản chất của chất

IỄ N

ÀN

tan, chiều dày lớp mỏng và nồng độ của dung dịch.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

U Y

còn lại I.

* Điều kiện áp dụng định luật: - Chùm tia sáng phải đơn sắc. - Dung dịch phải có nồng độ nằm trong khoảng thích hợp. - Dung dịch phải trong suốt - Chất thử phải bền trong dung dịch (khoảng 10-20’) và phải bền dưới tác

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 13

dụng của ánh sáng UV-VIS.

Đối với dung dịch một thành phần có thể sử dụng các kĩ thuật định lượng

1.3.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một thành phần

 Tính toán trực tiếp từ mật độ quang đo đƣợc.

ẠO

- Với các chất có mật độ hấp thụ riêng biết trước chính xác và ổn định ở một

H Ư

- Nồng độ dung dịch tính theo công thức sau:

trong dung môi tương ứng tại bước sóng này.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

bước sóng nào đó, người ta có thể đo mật độ quang của dung dịch chất đó

TR ẦN

A = ε.l.C => C =

- Muốn áp dụng công thức thì máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước

10 00

sóng và mật độ quang, dung dịch phải trong suốt và có nồng độ đáp ứng của

định luật Lambert – Beer.

 So sánh với dung dịch chuẩn.

-L

Í-

- Để xác định nồng độ Ct của dung dịch thử, ta tiến hành đo đông thời mật độ

ÁN

quang At của dung dịch thử và Ac của dung dịch chuẩn có nồng độ Cc biết

trước trong cùng điều kiện thỏa mãn định luật Lambert – Beer.

IỄ N

ÀN

- Nồng độ dung dịch thử được tính theo công thức sau:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

 Kỹ thuật đƣờng chuẩn.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 14

- Chuẩn bị từ 5-8 dung dịch chuẩn có nồng độ xác định và nằm trong khoảng tuyến tính của định luật Lambert – Beer.

- Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn và vẽ đồ thị biểu diễn mối tương

quan giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch chuẩn. Từ đó rút ra

- Tiến hành đo đồng thời mật độ quang At của dung dịch thử có nồng độ Ct.

Dựa vào phương trình đường chuẩn thiết lập được ở trên ta tính được Ct khi đã

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

biết At.

- Trường hợp dãy chuẩn không tuân theo định luật Lambert – Beer (đường

chuẩn cong) thì cần làm thêm một số điểm chuẩn nữa với nồng độ gần nhau

10 00

TR ẦN

H Ư

hơn (khác nhau không quá 10%).

-L

Í-

Hình 1.5. Đồ thị của phƣơng pháp đƣờng chuẩn A = f (C)

ÁN

 Kỹ thuật thêm chuẩn.

- Thêm chính xác một được dung dịch chuẩn có nồng độ Cc xác định vào dung dịch thử cần xác định nồng độ Ct.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

được phương trình đường chuẩn.

- Nồng độ dung dịch thử được tính theo côgn thức sau:

IỄ N

ÀN

- Tiến hành đo mật độ quang của 2 dung dịch trong cùng điều kiện thỏa mãn định luật Lambert – Beer.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 15

 Kỹ thuật thêm đƣờng chuẩn. - Thêm những thể tích giống nhau của dãy thử vào dung dịch chuẩn chứa

những lượng khác nhau và chính xác của dãy chuẩn.

- Tiến hành đo mật độ quang của cả dãy nồng độ vừa thêm thử và xây dựng

thêm vào.

- Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành cho ta nồng độ của chất cần định

ẠO H

10 00

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

lượng:

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

Hình 1.6. Đồ thị của phƣơng pháp thêm đƣờng chuẩn

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang với lượng chất chuẩn

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 16

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

Các mẫu Giảo cổ lam sử dụng trong nghiên cứu được xác định tên khoa học

(Gynostemma petaphyllum (Thunb.) Makino var. pentaphyllum) tại Lào Cai,

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Hòa Bình và mẫu thu trên thị trường ... Bao gồm:

M02

M03

M04

Nguồn gốc Lào Cai

Mô tả

TR ẦN

M01

H Ư

Nơi thu hái/

TT Tên mẫu

Bảng 2.1. Các mẫu Giảo cổ am dùng trong nghiên cứu

5 lá, bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược

liệu

7 lá, bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược

10 00

Lào Cai

liệu

-L

Í-

Thị trường Hòa Bình

Bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược liệu Bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược liệu

ÁN

2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, thuốc thử

ÀN

- Chất chuẩn: Gypenoside XVII hàm lượng 98,0%, Số lô: CFS201502 của

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

2.1.1. Nguyên liệu

IỄ N

Wuhan Chemfaces Biochemical Co. Ltd, Trung Quốc. - Hóa chất, thuốc thử: vanilin (Reagent Plus – Sigma Aldrich, Mỹ), acid acetic băng (Fluka, Mỹ), acid perchloric (ACS reagent – Sigma Aldrich, Mỹ),

methanol, ethyl acetat và n-butanol (Merck, Đức). Các hóa chất, thuốc thử đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 17

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị

- Tủ sấy SHELLAB, Mĩ.

- Cân phân tích Metller Toledo (d = 0,01 mg), Thụy sỹ.

- Pipet tự động 100 - 1000 µl.

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Máy quang phổ UV- VIS Hitachi U-1900 Nhật Bản.

- Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200, Canada.

- Bể điều nhiệt Sartorius, Đức.

H Ư

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

TR ẦN

2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích

* Khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết m ẫu

10 00

- Phương pháp chiết: chiết hoạt chất trong mẫu thử bằng phương pháp Soxhlet và siêu âm. L ựa chọn phương pháp cho hi ệu

suất chiết cao với thời gian ngắn.

- Dung môi chiết: sử dụng các dung môi methanol, aceton và

-L

Í-

ethanol. Lựa chọn dung môi cho hiệu suất chiết cao nhất.

ÁN

- Thời gian chiết: chiết mẫu với thời gian chiết khác nhau. L ựa

chọn phương pháp cho hi ệu suất chiết cao.

IỄ N

ÀN

* Điều kiện phản ứng và đo quang

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

- Máy đo hàm ẩm Precisa XM 60, Thụy sỹ.

Dựa vào tài liệu [2] đánh giá lại các điều kiện phân tích thay

đổi nếu cần thiết.

2.2.2. Thẩm định phương pháp Thẩm định phương pháp phân tích theo hướng dẫn của AOAC với các chỉ tiêu: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác (độ lặp

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 18

lại). - Tính chọn lọc: Chuẩn bị các mẫu gồm dung môi chiết xuất, dung dịch

sóng phân tích. Yêu cầu mẫu dung môi chiết xuất phải có độ hấp thụ không

chuẩn. Tiến hành phản ứng. Đo độ hấp thụ của các dung dịch này ở bước

U Y

đáng kể so với độ hấp thụ của dung dịch chuẩn.

nồng độ) trong methanol. Tiến hành phản ứng. Đo độ hấp thụ của các dung

ẠO

dịch này ở bước sóng phân tích. Xây dựng mối tương quan giữa nồng độ và

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

độ hấp thụ, đường hồi qui. Yêu cầu hệ số tương quan giữa nồng độ và độ hấp

thụ không dưới 0,99, đường hồi qui có dạng đường thẳng.

H Ư

- Độ chính xác: đánh giá độ lặp lại bằng cách định lượng một mẫu dược

TR ẦN

liệu 6 lần song song. Tiến hành đồng thời một mẫu chuẩn. Tính hàm lượng saponin toàn phần trong mẫu dược liệu (khô) theo gypenoside chuẩn. Yêu

cầu: tại mức hàm lượng 1 – 10%, theo AOAC, độ lặp lại của phương pháp

10 00

(RSD) phải nhỏ hơn hoặc bằng 2,7% (nếu ngoài khoảng phải giải thích). - Độ đúng: Thêm vào mẫu thử một lượng chính xác dung dịch chuẩn, chiết

và tiến hành phân tích. Tính lượng chuẩn tìm lại được. Làm 6 lần song song.

Í-

Yêu cầu (theo AOAC) lượng chuẩn tìm lại nằm trong khoảng khoảng 97 –

-L

103% với hàm lượng mẫu 1 - 10% (nếu ngoài khoảng phải giải thích).

ÁN

2.2.3. Phân tích mẫu thực Mẫu thử được xác định hàm ẩm và định lượng theo qui trình đã xây dựng,

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

- Khoảng nồng độ tuyến tính: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn (5 mức

IỄ N

ÀN

mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần. Tính kết quả dựa vào chuẩn có nồng độ tương đương làm trong cùng điều kiện.

2.2.4. Xử lý số liệu Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 19

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3. 1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG

3.1.1. Lựa chọn điều kiện đo quang

thuốc thử phản ứng, lượng chất phân tích, nhiệt độ và thời gian phản ứng, pha loãng bằng ethyl acetat [2] hoặc acid perchloric [4], [36], chúng tôi đã lựa chọn

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

điều kiện phản ứng tạo sản phẩm có khả năng hấp thụ quang cao nhất, ổn định

và bước sóng có cực đại hấp thụ. Điều kiện cụ thể như sau:

TR ẦN

pha trong acid acetic băng vừa đủ 10 ml.

H Ư

- Chuẩn bị thuốc thử vanilin trong acid acetic băng 5%: Cân 0,5 g vanilin

- Pha dung dịch chuẩn gốc: Lấy chính xác 10,0 mg chất chuẩn gypenoside XVII pha trong MeOH vừa đủ 50 ml thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,2

10 00

mg/ml. Bảo quản ở 2-8oC. Dùng trong 1 tháng.

- Dung dịch chuẩn: Pha loãng 1,00 ml dung dịch chuẩn gốc trong vừa đủ

10,0 ml methanol.

Í-

- Phản ứng màu Rosenthaler định lượng saponin: lấy 1,00 ml dung dịch mẫu

-L

cho vào ống nghiệm cô cách thủy đến cắn. Thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 5%

ÁN

trong acid acetic băng và 1,2 ml acid perchloric 72%. Đậy kín ống nghiệm rồi

ủ trong trong nồi cách thủy ở 80oC trong 20 phút. Ngâm ống nghiệm trong nước đá rồi chuyển vào bình định mức 5 ml, tráng ống nghiệm bằng ethyl

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Dựa trên tài liệu tham khảo [4], [36] và thực nghiệm sử dụng về thể tích

IỄ N

ÀN

acetat tập trung vào bình định mức trên và bổ sung ethyl acetat tới vạch. Lắc

đều. Quét hấp thụ trong khoảng 420 - 700 nm với mẫu trắng là MeOH (được làm phản ứng tương tự mẫu thử). Phổ hấp thụ của gypenoside XVII thu được ở hình 3.1, so với tác giả [4],

[36] thì không dùng acid perchloric mà dùng ethyl acetat.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

H Ư

Hình 3.1. Phổ hấp thụ của gypenoside XVII

Nghiên cứu chiết xuất saponin

TR ẦN

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu

10 00

- Phương pháp chiết: chiết 1g dược liệu bằng phương pháp Soxhlet 4 giờ hoặc siêu âm trong 1 giờ bằng dung môi ethanol. Đánh giá hiệu suất chiết dựa

vào tỷ lệ giữa đáp ứng phân tích (độ hấp thụ) và khối lượng A/m. Kết quả là

lượng saponin toàn phần chiết bằng hai phương pháp xấp xỉ bằng nhau (hình

-L

IỄ N

ÀN

ÁN

Soxhlet.

Í-

3.2) do đó chọn phương pháp siêu âm vì giảm thời gian chiết 4 lần so với chiết

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

U Y

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 21

0.4

N Ơ

0.2

H U Y

0.1

C hiết s iêu âm

C hiết S ox hlet

ẠO

Hình 3.2. Kết quả khảo sát kỹ thuật chiết

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

- Dung môi chiết: chiết 1g dược liệu bằng phương pháp siêu âm trong 1 giờ

sử dụng các dung môi methanol, aceton và ethanol. Căn cứ vào tỷ số A/m cho

H Ư

thấy dung môi methanol chiết được lượng saponin toàn phần cao nhất (hình

TR ẦN

3.3.). Lựa chọn methanol làm dung môi chiết. 0.5

0.45 0.4 0.3

T ỷ s ố A/m

0.35

10 00

0.25 0.2

0.15

-L

Í-

0.1

0.05 0 Methanol

E thanol

A c eton

Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết

ÁN

-Thời gian chiết: chiết 1g dược liệu bằng phương pháp siêu âm bằng

methanol với thời gian chiết khác nhau từ 30 – 75 phút. Căn cứ vào tỷ số A/m

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

T ỷ s ố A/m

0.3

chiết 60 và 75 phút (hình 3.4.). Lựa chọn thời gian chiết là 45 phút.

IỄ N

ÀN

cho thấy thời gian chiết là 45 phút cho hiệu suất chiết cao tương đương với

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 22

N Ơ H N 75 phút

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Hình 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết

Qua khảo sát đã lựa chọn phương pháp chiết như sau: Cân chính xác

khoảng 1,00 g bột dược liệu (đã rây qua rây có đường kính mắt rây 0,25 mm)

H Ư

cho vào bình định mức 50 ml. Thêm khoảng 40 ml methanol, lắc nhẹ, siêu âm

TR ẦN

45 phút. Thêm methanol vừa đủ đến vạch. Lắc đều. Lọc (Dung dịch A). Bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy 5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 50 ml, pha loãng

10 00

bằng cùng dung môi đến vừa đủ thể tích. Lắc đều. Nghiên cứu tinh chế saponin

Trong Giảo cổ lam có hai nhóm chất là saponin và flavonoid. Các chất trong

hai nhóm này có khả năng chiết vào dung môi methanol khá giống nhau do vậy

Í-

cần loại flavonoid trong dịch chiết methanol. So sánh 2 cách tinh chế saponin từ

-L

dịch chiết methanol thu được ở trên bằng phương pháp chiết pha rắn và chiết

ÁN

lỏng – lỏng.

Tinh chế bằng chiết pha rắn theo tham khảo tài liệu [4], được thực hiện như

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

60 phút

U Y

45 phút

30 phút

T ỷ s ố A/m

0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0

IỄ N

ÀN

sau: Lấy 25 ml dịch lọc (dung dịch A) cô cách thủy tới cắn. Hòa tan cắn bằng 10 ml nước cất hấp phụ vào cột chứa Diaion HP-20 theo tỉ lệ 1:4 (thể tích/thể

tích). Để yên 1 giờ, rửa lần lượt bằng 100 ml nước cất, 100 ml MeOH 20% và MeOH 80% đến kiệt saponin (khoảng 100 ml). Thu dịch MeOH 80%, cô đến cắn. Hòa tan cắn thu được bằng MeOH trong vừa đủ 25,0 ml. Pha loãng chính xác 5 ml dung dịch này trong vừa đủ 50 ml với MeOH.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 23

Chiết lỏng – lỏng: n-butanol có khả năng chiết chọn lọc saponin nên tiến hành chiết saponin trong dịch chiết trên để loại flavonoid và các chất không tan

thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến còn khoảng 1-2 ml, sau đó dùng n –

trong dung môi này. Lấy 25 ml dịch lọc (dung dịch A) cho vào bình cất và cất

butanol chiết lấy saponin. Qua khảo sát thể tích n-butanol và số lần chiết, quá

trên 4-5 ml nước cất, chuyển vào bình gạn. Tráng bình với khoảng 5 ml nước,

chuyển vào bình gạn. Tráng tiếp cốc với 10 ml n – butanol đã bão hòa nước (5

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

ml x 2 lần), tập trung vào bình gạn. Lắc trong 5 phút. Tách lấy phần n –

butanol vào bình cầu. Chiết bằng n – butanol 2 lần nữa, lần lượt 10 ml và 5 ml.

Tập trung dịch chiết n-butanol vào bình cầu. Cô quay tới cắn. Hòa tan cắn

H Ư

trong MeOH với lần lượt 10 ml – 5 ml – 5 ml chuyển vào bình định mức 25 ml trong vừa đủ 50 ml với methanol.

10 00

Tiến hành phản ứng màu. Căn cứ vào tỷ số A/m cho thấy khi tinh chế loại chất cản trở flavonoid bằng chiết lỏng – lỏng cho kết

quả cao hơn (hình 5). L ựa chọn điều kiện tinh chế saponin bằng

-L

Í-

0.6

phương pháp chi ết lỏng – lỏng với dung môi là n -butanol.

T ỷ s ố A/m

ÀN

ÁN

0.5

IỄ N D

TR ẦN

và thêm MeOH đến vừa đủ thể tích. Pha loãng chính xác 5 ml dung dịch này

0.4 0.3

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

trình chiết được thực hiện như sau: Thêm vào bình cất dung môi thu được ở

0.2 0.1 0 C hiết lỏng - lỏng

C hiết pha rắn

Hình 3.5. Kết quả khảo sát điều kiện tinh chế saponin (n = 3)

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 24

3.1.3. Quy trình phân tích Từ những kết quả thu được ở trên chúng tôi lựa chọn qui trình phân tích với

lượng mẫu thử được giảm đi 10 lần để không phải pha loãng, tiết kiệm dung

môi và có thể tăng hiệu suất chiết. Cụ thể như sau:

U Y

Dung dịch thử: Nghiền dược liệu thành bột. Rây qua rây có cỡ mắt rây 0,25

Thêm khoảng 40 ml methanol, lắc nhẹ, siêu âm 45 phút. Thêm methanol vừa

ẠO

đủ đến vạch. Lắc đều. Lọc. Bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy 25 ml dịch lọc cho vào

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

bình cất và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến còn khoảng 1-2 ml.

Thêm vào bình cất dung môi thu được ở trên bằng 4-5 ml nước cất, chuyển vào

H Ư

bình gạn. Tráng bình với khoảng 5 ml nước, chuyển vào bình gạn. Tráng tiếp

TR ẦN

cốc với 10 ml n – butanol đã bão hòa nước (5 ml x 2 lần), tập trung vào bình gạn. Lắc trong 5 phút. Tách lấy phần n – butanol vào bình cầu. Chiết bằng n – butanol 2 lần nữa, lần lượt 10 ml và 5 ml. Tập trung dịch chiết n-butanol vào

10 00

bình cầu. Cô quay tới cắn. Hòa tan cắn trong MeOH với lần lượt 10 ml – 5 ml – 5 ml chuyển vào bình định mức 25 ml và thêm MeOH đến vừa đủ thể tích.

H Í-

0,1 mg/ml.

- Dung dịch chuẩn: dung dịch gypenoside XVII pha trong MeOH nồng độ

-L

- Phản ứng màu và đo quang: lấy 1,00 ml dung dịch mẫu cho vào ống

ÁN

nghiệm cô cách thủy đến cắn. Thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 5% trong acid

acetic băng và 1,2 ml acid perchloric 72%. Đậy kín ống nghiệm rồi ủ trong

ÀN

trong nồi cách thủy ở 80oC trong 20 phút. Ngâm ống nghiệm trong nước đá rồi

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

mm. Cân chính xác khoảng 0,10 g bột dược liệu cho vào bình định mức 50 ml.

IỄ N

chuyển vào bình định mức 5 ml, tráng ống nghiệm bằng ethyl acetat tập trung vào bình định mức trên và bổ sung ethyl acetat tới vạch. Lắc đều. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm mẫu trắng là MeOH (được làm phản ứng tương tự mẫu thử).

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 25

- Tính kết quả: Hàm lượng saponin toàn phần trong mẫu thử (%) tính theo

At × Cc × 250

gypenoside XVII được tính theo công thức sau:

× 100

Trong đó:

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

At và Ac độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.

mt: khối lượng mẫu thử (g).

Cc nồng độ gypenoside XVII (g/ml) trong dung dịch chuẩn (đo quang)

H Ư

H là độ ẩm của mẫu thử.

3.2.1. Tính chọn lọc

TR ẦN

3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

10 00

Tính chọn lọc được đánh giá qua phân tích mẫu placebo (dung môi chiết) và

mẫu chuẩn (nồng độ gypenoside 0,1 mg/ml).

Mẫu placebo được chuẩn bị như sau: cô 25 ml methanol tới cắn, thêm vào

Í-

đó 25 ml n-butanol, lắc. Cô quay tới cắn. Hòa tan cắn trong vừa đủ 25 ml

-L

MeOH (với lần lượt 10 ml – 5 ml – 5 ml chuyển vào bình định mức và thêm

ÁN

MeOH đến vừa đủ thể tích).

Tiến hành phản ứng và đo độ hấp thụ của dung dịch mẫu chuẩn và mẫu

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Ac × mt × (1-H:100)

bày ở bảng sau:

IỄ N

ÀN

placebo với mẫu trắng là MeOH làm phản ứng tương tự. Kết quả được trình

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 26

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi chiết

0,478

0,005

0,470

0,004

Trung bình

0,477

0,0047

G N H Ư

TR ẦN

0,98

10 00

Tại bước sóng định lượng (550 nm), mẫu placebo có đáp ứng, tuy nhiên độ hấp thụ của mẫu placebo không đáng kể (< 1,0%) so với đáp ứng độ hấp thụ

của mẫu chuẩn. Do đó, có thể kết luận phương pháp có độ đặc hiệu đáp ứng

yêu cầu.

-L

Í-

3.2.2. Độ tuyến tính.

ÁN

Từ dung dịch chuẩn gốc của gypenoside XVII pha loãng chính xác để được

các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 150 – 50 µg/ml bằng MeOH. Lấy

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

0,005

0,483

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

chuẩn

placebo (%)

Mẫu placebo

U Y

Mẫu

Ảnh hƣởng của mẫu

Stt

Độ hấp thụ

ÀN

chính xác 1,00 ml mỗi dung dịch chuẩn làm việc vào ống nghiệm, cô cách thủy giữa độ hấp thụ và nồng độ của saponin (gypenoside XVII) được trình bày ở bảng và hình sau:

IỄ N

đến cắn và tiếp tục tiến hành như mục 3.1.3. Kết quả khảo sát sự tương quan

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 27

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của qui trình định ƣợng

150

quang (µg/ml)

Độ hấp thụ

0,2

0,4

0,5

(µg/ml)

y = 0,0226x – 0,0128

Hệ số tương quan

0,9991

TR ẦN

H Ư

Phương trình hồi qui

0,67

B 10 00

0.8

0.6

Í-

0.2

0.4

-L

Độ hấp thụ

y = 0.0226x - 0.0128 R 2 = 0.9981

IỄ N

ÀN

ÁN

30 35 Nồng độ (ug /m l)

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

ẠO

U Y

Nồng độ dung dịch chuẩn đo

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Nồng độ dung dịch chuẩn làm việc

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ saponin gypenoside XVII và độ hấp thụ Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát của saponin gypenoside

XVII từ 10 đến 30 (µg/ml) có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ gypenoside XVII và độ hấp thụ với hệ số tương quan r ≈ 1.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 28

3.2.3. Độ lặp lại Độ lặp lại của phương pháp được xác định khi phân tích các mẫu song song

một mẫu thử theo quy trình chiết mẫu và phân tích đã lựa chọn (mục 3.1.3).

trong cùng một điều kiện thí nghiệm. Tiến hành định lượng 6 lần độc lập trên

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

dược liệu khô. Kết quả được trình bày trong bảng sau:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

Tính hàm lượng saponin toàn phần theo gypenoside XVII trong mẫu thử theo

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 29

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ ặp ại của phƣơng pháp với (mẫu M01)

Độ ẩm (%)

saponin toàn phần (%)

thụ

Lƣợng cân mẫu thử (g)

Hàm ƣợng

6,14

0,10076

0,509

6,32

0,10097

0,497

TP 6,16

0,486

0,10059

0,473

0,10071

0,476

0,10022

6,07

TR ẦN

10 00

Hàm lượng trung bình (%)

H Ư

9,22

5,92 6,08 2,69

RSD (%)

5,89

Chuẩn gypenoside XVII:

-L

Í-

Nồng độ (dung dịch chuẩn đo quang): 20 µg/ml

ÁN

Độ hấp thụ: 0,440

ÀN

Nhận xét: Theo AOAC, tại mức hàm lượng 1 – 10% độ lặp lại của phương

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

0,492

U Y

0,10029

ẠO

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Stt

Độ hấp

IỄ N

pháp (RSD) phải đạt nhỏ hơn hoặc bằng 2,7%. Kết quả phân tích cho thấy độ

lặp lại khi định lượng saponin toàn phần (tính theo gypenoside XVII) trong Giảo cổ lam đạt yêu cầu. Như vậy, phương pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC [11].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 30

3.2.4. Độ đúng Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm một lượng chính xác

toàn phần (M01) là 6,08%, độ ẩm 9,22% sao cho tổng nồng độ nằm trong

saponin gypenoside XVII chuẩn vào mẫu thử đã xác định hàm lượng saponin

U Y

khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tiến hành chiết và định lượng như ở mục 3.1.3,

(g)

(×10-3 g)

0,07306

1,2

0,07212

1,2

0,07311

0,07381

0,07245

chuẩn thu hồi

hồi (%)

1,23

102,48

0,507

1,21

100,83

1,2

0,510

1,19

98,84

1,2

0,514

1,19

99,03

1,2

0,504

1,16

96,75

0,07564

1,2

0,523

1,18

98,29

10 00 A

H -L

IỄ N

ÀN

ÁN

(×10-3 g)

Độ thu

0,514

hấp thụ

chuẩn thêm

Lƣợng

H Ư

cân mẫu thử

Độ

Í-

Stt

Lƣợng

TR ẦN

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp

mức nồng độ với 6 lần làm lặp lại riêng biệt. Kết quả thu được như sau:

Hàm lượng trung bình (%)

99,37

RSD (%)

2,02

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

từ kết quả thu được xác định độ thu hồi của phương pháp. Thực hiện ở một

Chuẩn gypenoside XVII: Nồng độ (dung dịch chuẩn đo quang): 20,23 µg/ml Độ hấp thụ: 0,494

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 31

Với quy trình đã lựa chọn, định lượng saponin toàn phần (tính theo

102,48%, đa số nằm trong khoảng yêu cầu về thẩm định phương pháp đối với

gypenoside XVII) đã nghiên cứu trên nền mẫu thử có độ thu hồi từ 96,75 đến

phân tích mẫu của AOAC (nằm trong khoảng 97 – 103% với hàm lượng 1-

ẠO

3.3. PHÂN TÍCH MẪU THỰC

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Các mẫu Giảo cổ lam được thu hái và xác định tên khoa học. Phơi khô.

Nghiền. Xác định hàm ẩm bột dược liệu. Tiến hành chuẩn bị mẫu và phân tích

H Ư

như chỉ dẫn ở mục 3.1.3, mỗi mẫu chuẩn bị 3 thử riêng biệt. Kết quả được

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

trình bày trong bảng sau:

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

lượng qua nhiều giai đoạn nên kết quả như vậy có thể chấp nhận được.

U Y

10%), có 1 giá trị độ tìm lại xấp xỉ 97% là do mẫu thử là dược liệu, phép định

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 32

Bảng 3.5. Kết quả hàm ƣợng saponin toàn phần (tính theo gypenoside XVII) trong các mẫu thử

cân (g)

Độ ẩm

saponin toàn

Hàm lượng

thụ

(%)

phần trong mẫu

trung bình (%)

Độ hấp

0,352

0,10082

0,318

0,10267

0,327

0,10206

0,616

0,10046

0,601

0,10715

0,637

0,10333

0,10144

4,20 10,0

ẠO

0,10715

4,03

4,10a

H Ư

4,07

TR ẦN

7,09

10 00

9,03

0,662

7,03

7,03b

6,98 7,52

0,10614

0,659

8,46

0,671

7,63

7,53a

7,42

ÁN

-L

Í-

M04

M03

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

M02

thử khô (%)

* Chuẩn: Dung dịch chuẩn gypenoside XVII (dung dịch chuẩn đo quang)

IỄ N

ÀN

nồng độ 20 µg/ml. a

là kết quả tính theo A c = 0,435

là kết quả tính theo A c = 0,468

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

mẫu

lượng

Stt

U Y

Tên

Hàm lượng

Khối

Kết quả ở bảng trên cho thấy hàm lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam khá cao đều lớn hơn 4,0%. Kết quả này cũng tương đồng với công bố về hàm lượng saponin toàn phần của nhóm tác giả Phạm Thanh Kỳ là 4,12 – 5,10% [5].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 33

3.4. BÀN LUẬN Trong thời gian gần đây, Giảo cổ lam được thu hái trong tự nhiên, trồng

dược liệu không ngừng tăng lên. Giảo cổ lam là một trong 36 dược liệu nằm

tăng lên nhiều do nhu cầu sử dụng dược liệu cũng như sản phẩm chế biến từ

trong danh mục dược liệu tập trung phát triển qui mô lớn trong Quyết định

liệu đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030 của Thủ tướng Chính phủ. Để đảm bảo chất lượng nguồn dược liệu đầu vào phục vụ sản xuất và sử dụng thì

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

việc chuẩn hóa hàm lượng hoạt chất chính có tác dụng là rất cần thiết. Theo

các nghiên cứu về dược lý, chính saponin là thành phần mang lại tác dụng quý

H Ư

giá cho dược liệu này.

Do trong Giảo cổ lam có rất nhiều saponin (gypenoside) nhưng hàm lượng

TR ẦN

không đủ lớn nên lựa chọn đối tượng định lượng là nhóm chất saponin (saponin toàn phần) là hợp lý. Saponin toàn phần trong Giảo cổ lam có thể xác

10 00

định bằng phương pháp cân với độ nhạy không cao [1] do đó yêu cầu lượng mẫu thử nhiều, chiết và tinh chế qua nhiều giai đoạn, thời gian phân tích kéo

dài (có thể tới 2 ngày làm việc) khó đáp ứng được nhu cầu sản xuất; phương

pháp quang phổ dựa trên phản ứng Rosenthaler có độ nhạy cao nên chỉ cần

Í-

lượng mẫu nhỏ, thời gian xử lý mẫu rút ngắn khoảng 6-8 lần so với phương

-L

pháp cân. Chuẩn trong định lượng saponin toàn phần của Giảo cổ lam được các

ÁN

tác giả lựa chọn là dịch chiết saponin (saponin extracts) [36], ginsenoside Rb1

[4], [5]. Tuy nhiên, qua các nghiên cứu đã công bố thì chưa phát hiện thấy Rb1

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược

ÀN

trong Giảo cổ lam Việt Nam, mặt khác khi sử dụng dịch chiết saponin làm chất

IỄ N

đối chiếu thì thành phần dễ thay đổi trong quá trình bảo quản. Do vậy, lựa chọn

được một gypenoside tinh khiết làm chất đối sẽ dễ dàng cho quá trình kiểm nghiệm. Các nghiên cứu sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng kết nối với khối phổ đã xác định được gần 34 gypenoside như panaxadiol, gypenoside XVII, XLIX [27],… Căn cứ vào hàm lượng gypenoside trong Giảo cổ lam và tính sẵn có của chất chuẩn, nghiên cứu này lựa chọn gypenoside XVII làm chất

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 34

đối chiếu để định lượng saponin toàn phần theo phương pháp quang phổ. Trong Giảo cổ lam ngoài thành phần saponin còn có một lượng lớn

điểm saponin ít hấp thụ ánh sáng nên muốn định lượng được saponin toàn phần

flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử, và polysaccharid. Do đặc

U Y

theo phương pháp đo quang cần phải tiến hành tạo màu bằng phản ứng

hết saponin trong dược liệu cần được chiết kiệt, sau đó loại các thành phần

ẠO

có thể ảnh hưởng tới phản ứng tạo màu. Phương pháp chiết có ảnh hưởng lớn

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

tới hiệu suất chiết saponin cũng như thời gian phân tích. Hai phương pháp được

sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là phương pháp đã được một số nghiên

H Ư

cứu sử dụng siêu âm [4], [36] và chiết soxhlet [1] với dung môi ethanol. Căn cứ vào kết quả khảo sát thu được chúng tôi lựa chọn cách chiết bằng siêu âm

TR ẦN

cho hiệu suất chiết tương đương, nhưng rút ngắn thời gian chiết 4 lần so với chiết Soxhlet, đặc biệt có thể tiến hành chiết nhiều mẫu trong cùng một lần tiến

10 00

hành. Điều này có thể giải thích là do phương pháp siêu âm có tác dụng tăng mạnh tính thẩm thấu và khuếch tán nhờ tác dụng của sóng siêu âm làm tăng

diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ,

tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp. Các loại dung môi chiết mẫu được sử

Í-

dụng khảo sát dựa trên độ tan của saponin trong các dung môi thông thường

-L

như aceton, methanol, ethanol. Kết quả cho thấy chiết bằng methanol cho kết

ÁN

quả lượng chất chiết được (tỷ số đáp ứng phân tích/khối lượng: A/m) cao nhất.

Kết quả của nghiên cứu cho thấy thời gian chiết mẫu cũng ảnh hưởng đến hàm

ÀN

lượng hoạt chất chiết ra. Cụ thể khi tăng thời gian chiết từ 30 - 45 phút, lượng

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Rosenthaler với thuốc thử vanilin/ acid acetic băng và acid percloric. Trước

IỄ N

saponin chiết được tăng, khi tăng thời gian chiết từ 45 – 75 phút, lượng hoạt chất chiết được thay đổi không đáng kể. Do vậy việc lựa chọn thời gian chiết

45 phút có tác dụng tiết kiệm thời gian. Lượng mẫu thử cũng được xem xét, các tác giả [1], [4], [36] đều chiết 10 g mẫu thử, sau đó phải pha loãng nhiều lần như vậy mất nhiều thời gian và dung môi để chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu, chúng tôi đã khảo sát lượng mẫu chiết ban đầu chỉ bằng 1/10 so với các

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 35

nghiên cứu trên (1,00 g), nhưng độ pha loãng mẫu vẫn lên tới 500 lần do đó trong qui trình chúng tôi chỉ dùng 0,10 g mẫu thử vẫn đảm bảo yêu cầu.

lượng lớn flavonoid và các chất có thể tan trong methanol do đó cần tinh chế

Dịch chiết methanol của Giảo cổ lam, ngoài thành phần saponin còn có một

U Y

saponin để loại các chất cản trở tới kết quả định lượng. Dược điển Việt Nam

pháp cân sử dụng dung môi là n – butanol [1]. Còn khi định lượng saponin

ẠO

bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc sắc ký lỏng – khối phổ, dịch chiết dược

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

liệu thường được tinh chế bằng chiết pha rắn, tác giả Kao, T.H., et al. (2008)

dùng cột C18 [18] dùng cột Diaion HP-20 để xử lý dịch chiết methanol trước

H Ư

khi tiêm mẫu vào hệ thống LC-MSMS xác định các saponin cho kết quả tốt. Nhóm tác giả Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ và cộng sự cũng dùng chất

TR ẦN

nhồi Diaion HP-20 để tinh chế saponin sau đó làm phản ứng màu để đo quang [4]. Hai phương pháp tinh chế saponin đã được khảo sát là chiết pha rắn với

10 00

chất nhồi Diaion HP-20 và chiết lỏng – lỏng bằng n-butanol. Kết quả cho thấy đáp ứng phân tích khi tinh chế saponin theo phương pháp chiết lỏng – lỏng cao

hơn so với khi tinh chế bằng chiết pha rắn có thể do còn một lượng hoạt chất

chưa được rửa giải hết khi chiết pha rắn. Hơn nữa, chiết pha rắn yêu cầu thiết bị

Í-

phức tạp, cột chiết đắt tiền, người phân tích có kinh nghiệm nên trong nghiên

-L

cứu này phương pháp chiết lỏng – lỏng được sử dụng là phù hợp và có tính

ÁN

kinh tế cao.

Điều kiện phản ứng màu Rosenthaler dựa trên nghiên cứu của tác giả [4] với

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

IV - chuyên luận Giảo cổ lam khi tinh chế saponin để định lượng bằng phương

IỄ N

ÀN

nồng độ và thể tích thuốc thử vanilin 5% trong acid acetic băng và acid

percloric 72%, thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng; mẫu thử sau khi phản ứng được làm lạnh và pha loãng bằng ethyl acetat tới thể tích và đo quang. Việc sử dụng dung môi hữu cơ ethyl acetat [4] chiếm hơn 2/3 thể tích môi trường mẫu đo giúp giảm nồng độ acid nên an toàn hơn cho người phân tích mà vẫn đảm bảo độ bền vững của sản phẩm phản ứng tạo thành. Hầu hết trường hợp định lượng saponin bằng quang phổ đều sử dụng phản ứng này

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 36

(phản ứng Rosenthaler). Sản phẩm của phản ứng có màu tím cho cực đại hấp thụ ở bước sóng khoảng 550 nm nên khá chọn lọc và có độ nhạy cao (nồng độ

giảm dung môi chiết xuất và tinh chế từ đó giảm thời gian phân tích, giảm

saponin trong dung dịch đo quang chỉ cỡ 10 µg/ml) do vậy giảm lượng mẫu,

U Y

thiểu ô nhiễm môi trường.

chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Kết quả cho thấy phương

ẠO

pháp cho độ chọn lọc cao, các dung môi chiết mẫu ảnh hưởng không đáng kể

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

tới giá trị đáp ứng (<1%). Khoảng tuyến tính được xây dựng với lượng

gypenoside từ 10 – 30 µg/ml, kết quả cho thấy có sự tương quan chặt chẽ giữa

H Ư

nồng độ hoạt chất và đáp ứng phân tích (độ hấp thụ). Độ lặp lại trên nền mẫu dược liệu được tiến hành theo qui trình xây dựng lặp lại 6 lần song song cho

TR ẦN

kết quả đáp ứng yêu cầu của AOAC [11]. Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua độ thu hồi theo phương pháp thêm chuẩn với một mức

10 00

thêm khoảng 20% lượng chất có trong mẫu thực. Kết quả cho thấy đối với 6 lần làm song song độ thu hồi đạt được có giá trị trung bình là 99,37% với RSD

là 2,02%, do đó phương pháp cho độ đúng đạt yêu cầu của AOAC [11]. Kết

quả thẩm định cũng tương đồng với các nghiên cứu của các tác giả khác [4].

Í-

Giảo cổ lam của Việt Nam chủ yếu là loài đắng với hàm lượng saponin khá

-L

cao. Các mẫu nghiên cứu được thu hái, xác định tên khoa học đúng loài (theo

ÁN

Dược điển Việt Nam IV), sơ chế, phơi và sấy khô, bảo quản nơi khô ráo,

thoáng, nhiệt độ dưới 30oC. Mẫu dược liệu được phân tích theo qui trình đã

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

Phương pháp phân tích trong nghiên cứu này được thẩm định các chỉ tiêu độ

IỄ N

ÀN

xây dựng cho thấy hàm lượng saponin toàn phần của 4 mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng 4,0 – 7,5% tính theo dược liệu khô. Kết quả này tương đương với công bố về hàm lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam 7 lá trồng ở Hòa

Bình (5,10%), Tam Đảo - Vĩnh Phúc và Đà Lạt - Lâm Đồng (4,12%) của nhóm tác giả Phạm Thanh Kỳ [5] và Giảo cổ lam Trung Quốc là 17,6 – 193,4 mg/g [35].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. Kết uận

Sau thời gian tiến hành thực nghiệm, khóa luận đã thu được một số kết quả

U Y

 Đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng saponin toàn

Chuẩn bị các dung dịch:

ẠO

đối chiếu với qui trình cụ thể là:

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

 Dung dịch thử: Bột dược liệu được chiết siêu âm bằng MeOH, sau

H Ư

được dung dịch đem đi phản ứng

đó tinh chế bằng n-BuOH rồi hòa tan cắn sau cùng với MeOH

nồng độ 0,1 mg/ml. -

TR ẦN

 Dung dịch chuẩn: dung dịch gypenoside XVII pha trong MeOH Phản ứng màu và đo quang:

10 00

 Thuốc thử: Vanilin/ acid acetic băng 5% và acid percloric. Pha vừa đủ trong bình định mức 5ml bằng ethylacetat.

 Quét phổ trong khoảng 420-700 nm

 Đo độ hấp thụ ở bước sóng 550nm với mẫu trắng là MeOH

Í-

Tính kết quả: Hàm lượng saponin toàn phần trong mẫu thử khô (%)

-L

ÁN

tính theo gypenoside XVII được tính toán dựa vào nồng độ chuẩn, độ

hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, khối lượng và độ ẩm của

IỄ N

ÀN

mẫu thử, độ pha loãng của dung dịch thử.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

phần bằng phương pháp quang phổ dùng saponin gypenoside XVII là chất

Phương pháp định lượng saponin toàn phần đã được thẩm định đáp ứng yêu cầu của AOAC đối với mẫu thử dược liệu. Kết quả thu được cho thấy các tiêu chí thẩm định tính chọn lọc ảnh hưởng của mẫu placebo là không đáng kể, khoảng tuyến tính của gypenoside 10 – 30 µg/ml cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ hoạt chất và độ hấp thụ với r = 0.9991, độ lặp lại cao với RSD = 2,69% đạt yêu cầu AOAC (≤ 2,7%),

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 38

độ đúng 99,37%, nằm trong khoảng giới hạn 97 – 103% đối với hàm lượng mẫu 1-10% theo AOAC.

lá và 7 lá thu hái tại các nơi khác nhau. Kết quả cho thấy hàm lượng

 Đã áp dụng phương pháp phân tích đối với 4 mẫu dược liệu Giảo cổ lam 5

U Y

saponin toàn phần của 4 mẫu nghiên cứu nằm trong khoảng 4,0 – 7,5%

lượng saponin toàn phần của các tác giả Việt Nam và Trung Quốc.

ẠO

2. Đề xuất

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

Trong quá trình thực hiện khóa luận này, loài G.Pentaphyllum đã được định

Cần thu thập thêm các mẫu của loài này từ các vùng khác nhau trong cả

TR ẦN

H Ư

phong phú. Vì vậy tôi xin đưa ra đề suất sau:

lượng trên 16 mẫu khác nhau, tuy nhiên nguồn gốc các loài chưa thực sự

nước từ đó đánh giá được vùng cho điều kiện tốt nhất để phục vụ nhu Cần phân tích, định lượng các loài khác ở Việt Nam để có thể so sánh hơn

hiệu

quả

kinh

tế

mà

từng

loài

đem

lại.

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

rõ

10 00

cầu canh tác.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

tính theo dược liệu khô. Kết quả này tương đương với công bố về hàm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1. Bộ Y tế (2015), Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận Giảo cổ lam.

2. Lê Thị Thanh Thảo, Đỗ Quyên (2015), “Định lượng saponin toàn phần trong lá

Đu đủ rừng bằng phương pháp đo quang”, Tạp chí nghiên cứu dược và Thông tin

3. Nguyễn Tiến Dẫn, Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cấy

thất diệp đởm, Luận văn Thạc sĩ Dược học, trường Đại học Dược Hà Nội.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

4. Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị Diệp Thanh (2014), “Định lượng

saponin toàn phần trong giảo cổ la, Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino

trồng ở 3 vùng bằng phương pháp đo quang’’, Tạp chí Dược học số 2, tr. 54.

H Ư

5. Phạm Thanh Kỳ (2015), Nghiên cứu khảo nghiệm vùng trồng cây Giảo cổ lam cáo đề tài cấp Bộ Y tế.

TR ẦN

bảy lá (Gynostemma pentaphyllum (Thumb. ) theo các tiêu chí của GAP, Báo

6. Phạm Thanh Kỳ, P.T. Hương, T.L.V. Hiền (2007), “Nghiên cứu tác dụng ức chế

10 00

khối u của saponin chiết từ Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (thunb.) Makino)”, Tạp Chí Thông Tin Y Dược số 11.

7. Phạm Thanh Kỳ, P.T.P. Phi, P.T.T. Anh (2007), “Nghiên cứu tác dụng tăng đáp

ứng miễn dịch của dược liệu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)

-L

Í-

Makino)”, Tạp Chí Thông Tin Y Dược số 5, tr. 35–38.

ÁN

8. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, quyển I, tr. 563-575. 9. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam tập 2, tr. 308-309.

10. Võ Văn Chi (1997), Từ điển thực vật thông dụng tập 2, tr. 1322-1323.

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

thuốc số 2, tr. 30-34.

IỄ N

ÀN

Tài liệu tiếng Anh 11. AOAC International (2012), AOAC official methods of analysis, Appendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals, Part I: AOAC Guidelines for single laboratory validation of chemical methods for dietary supplements and botanicals

12. A. Norberg, N.K. Hoa, E. Liepinsh, D. Van

Phan, N.D. Thuan,

H.Jornvall, et al., ( 2004), “ A novel insulin-releasing substance, phanoside, from the plant Gynostemma pentaphyllum”, J Biol Chem 279, pp. 41361–

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 40

41367. 13. Choi, H. S.; Park, M. S.; Kim, S. H.; Hwang, B. Y .; Lee, C. K.; Lee, M. K.Molecules (2010) 15 (4), pp. 2814–24.

14. Ding, Y .; T ang, K.; Li, F .; Hu, Q. Afr . J. Agric. Res (2010) 5 (8), pp. 707–

711.

Public Crinting, Manila.

16. H. Van Lam (2009), “Biodiversity of the genus Gynostemma in the north of

ẠO

Vietnam”, Proc. 6th Indochina Conf. Pharm. Sci., pp. 83–88.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

17. Joh, E. H.; Y ang, J. W.; Kim, D. H. Planta Med (2010) 76 (8), pp. 793–5.

18. Kao, T.H., et al.(2008), “Determination of flavonoids and saponins in

H Ư

Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino by liquid chromatography–mass spectrometry”, Analytica Chimica Acta, 626(2): pp. 200-211.

TR ẦN

19. K. Yoshikawa, S. Arihara, K. Matsuura, T. Miyase (1991), “Dammarane saponins from Gymnema sylvestre », Phytochemistry 31, pp. 237–241.

10 00

20. Lu, J.G., et al.(2013), “Chemical differentiation of two taste variants of Gynostemma pentaphyllum by using UPLC-Q-TOF-MS and HPLC-ELSD”;

J Agric Food Chem 61(1), pp. 90-7

21. Lin, J. M.; Lin, C. C.; Chiu, H. F .; Y ang, J. J.; Lee, S. G. Am. J. Chin. Med

Í-

(1993), 21(1), pp. 59–69.

-L

22. Li, L.; Lau, B. H. S. Phytother . Res (1993), 7(4), pp. 299–304.

ÁN

23. Lin, C. C.; Huang, P . C.; Lin, J. M. Am. J. Chin. Med (2000), 28(1), pp. 87–96.

ÀN

24. L. Nippon Shoji Co., T. Takemoto (1983), “Saponins from Gynostemma

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

U Y

15. Elmer Drew, Merill (1904 – 1992), Note worthy Pilippine plants, Bureau of

pentaphyllum”, Jpn. Kokai Tokkyo Koho, JKXXAF JP .

IỄ N

25. M. Kuwahara, F. Kawanishi, T. Komiya, H. Oshio (1989), “Dammarane saponins

Gynostemma

pentaphyllum

Makino

and

isolation

malonylginsenosides-Rb1, -Rd, and malonylgypenoside V.”, Chem. Pharm. Bull. 37, pp. 135–139. 26. Natthakarn Chiranthanut, Supanimit Teekachunhatean, Ampai Panthong, Parirat Khonsung, Duangta Kanjanapothi, Nirush Lertprasertsuk (2013), “Toxicity

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com 41

evaluation of standardized extract of Gynostemma pentaphyllum Makino”, Journal of Ethnopharmacology 149 (2013), pp. 228–234. 27. SHI Mei-rong, LI Hua, BAI Ge, XIAO Ya-ping (2015), “Quantification of five

saponins in Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino by HPLC”, Journal of

( 2005),

U Y

28. S. Megalli, F. Aktan, N. M. Davies, B. D. Roufogalis

Science and Technology of Food Industry (China), Vol. 36, 02 (2015), pp. 49-56.

rats”, J Pharm Pharm Sci 8, pp. 507–515.

ẠO

29. Tanner, M. A.; Bu, X.; Steimle, J. A.; Myers, P . R (1999), “The direct release

pentaphyllum, Nitric Oxide , 3 (5), pp. 359–365.

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

of nitric oxide by gypenosides derived from the herb”, Gynostemma

H Ư

30. Wu zhengYi, Peter H. Raven, Hong Deynan (2008), Flora of China, vol. 19,

TR ẦN

Science Press China.

31. Xie, Z.; Liu, W.; Huang, H.; Slavin, M.; Zhao, Y .; Whent, M.; Blackford, J.;Lutterodt, H.; Zhou, H.; Chen, P .; Wang, T . T . Y .; Wang, S.; Y u, L. J

10 00

(2010), Agric.Food Chem, 58 (21), pp. 11243–11249. 32. X. Liu, W. Ye, Z. Mo, B. Yu, S. Zhao, H. Wu, et al. (2004), "Five new

Ocotillone-type saponins from Gynostemma pentaphyllum”, J Nat Prod 67, pp.

1147–1151.

Í-

33. Y.C. Ma, J. Zhu, L. Benkrima, M. Luo, L.H. Sun, S. Sain, et al. (1995), “A

-L

comparative evaluation of ginsenosides in commercial ginseng products and

ÁN

tissue culture samples using HPLC”, J. Herbs, Spices, Med.Plants, pp. 341–50.

ÀN

34. Y eo, J.; Kang, Y . J.; Jeon, S. M.; Jung, U. J.; Lee, M. K.; Song, H.;

Choi,

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

”Phytopreventative anti-hyperlipidemiceffects of gynostemma pentaphyllum in

M.S. J. Med. Food (2008), 11 (4), pp. 709–16.

IỄ N

35. Zhao, Y., et al. (2012), Chemical compositions, “HPLC/MS fingerprinting profiles and radical scavenging properties of commercial Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino samples”, Food Chemistry 134(1), pp. 180-188. 36. Zhuohong Xie, Margaret Slavin, Huiping

Zhou, et al., (2010), “Chemical

Composition of Five Commercial Gynostemma pentaphyllumSamples and Their Radical Scavenging, Antiproliferative, and Anti-inflammatory Properties. J. Agric”, Food Chemistry 58, pp. 11243–49.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial

www.twitter.com/daykemquynhon https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn

www.facebook.com/daykem.quynhon www.daykemquynhon.blogspot.com

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú

IỄ N

ÀN

ÁN

-L

Í-

10 00

TR ẦN

H Ư

www.daykemquynhon.ucoz.com MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com

ẠO

U Y

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

www.facebook.com/daykemquynhonofficial www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial