PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
vectorstock.com/1593604
Ths Nguyễn Thanh Tú eBook Collection
Nghiên cứu định lượng Azelastin hydroclorid và Benzalkonium clorid trong chế phẩm thuốc xịt mũi Nozeytin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (2020) WORD VERSION | 2021 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM
Tài liệu chuẩn tham khảo Phát triển kênh bởi Ths Nguyễn Thanh Tú Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật : Nguyen Thanh Tu Group Hỗ trợ trực tuyến Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon Mobi/Zalo 0905779594
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN HOÀNG YẾN
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG AZELASTIN HYDROCLORID VÀ BENZALKONIUM CLORID TRONG CHẾ PHẨM THUỐC XỊT MŨI NOZEYTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2020
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN HOÀNG YẾN MÃ SINH VIÊN: 1501566
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG AZELASTIN HYDROCLORID VÀ BENZALKONIUM CLORID TRONG CHẾ PHẨM THUỐC XỊT MŨI NOZEYTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Ngô Minh Thúy Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất
HÀ NỘI – 2020
LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được thực hiện tại Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn của ThS. Ngô Minh Thúy. Để hoàn thành khóa luận này, bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Hiện tại khóa luận đã được hoàn thành, tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ. Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Ngô Minh Thúy, người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Lê Đình Chi và ThS. Vũ Ngân Bình đã luôn sẵn sàng cho tôi lời khuyên, hướng nghiên cứu trong quá trình thực hiện đề tài. Đồng thời, tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Cuối cùng xin kính chúc các thầy cô và các anh chị luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công trong công việc cũng như trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 20 tháng 6 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Hoàng Yến
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 2 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 2 1.1.1. Đặc điểm của azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid ............................. 2 1.1.2. Một số phương pháp phân tích định lượng ......................................................... 4 1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................................... 8 1.2.1. Nguyên tắc ........................................................................................................... 8 1.2.2. Phân loại .............................................................................................................. 8 1.2.3. Sắc ký lỏng pha đảo ............................................................................................. 8 1.2.4. Các kỹ thuật định lượng bằng HPLC ................................................................ 10 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 12 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................................... 12 2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị ........................................................................................... 12 2.2.1. Hóa chất ............................................................................................................. 12 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................ 12 2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 13 2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 13 2.4.1. Khảo sát bước sóng phát hiện ........................................................................... 13 2.4.2. Khảo sát điều kiện sắc ký................................................................................... 13 2.4.3. Khảo sát nồng độ định lượng ............................................................................ 14 2.4.4. Thẩm định quy trình ........................................................................................... 14 2.4.5. Áp dụng phương pháp ........................................................................................ 18 2.4.6. Xử lý kết quả ...................................................................................................... 18 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...................................... 19 3.1. Quy trình chuẩn bị mẫu ............................................................................................ 19 3.1.1. Chuẩn bị mẫu thử .............................................................................................. 19 3.1.2. Chuẩn bị mẫu placebo ....................................................................................... 19 3.1.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn ................................................................................. 19
3.1.4. Chuẩn bị các mẫu thử thêm chuẩn .................................................................... 20 3.2. Quy trình chuẩn bị dung môi pha động.................................................................... 22 3.3. Khảo sát phương pháp.............................................................................................. 22 3.3.1. Lựa chọn bước sóng........................................................................................... 22 3.3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký................................................................................... 23 3.3.3. Khảo sát nồng độ định lượng ............................................................................ 26 3.4. Phương pháp phân tích đồng thời AZH và BAC ..................................................... 27 3.5. Thẩm định phương pháp .......................................................................................... 27 3.5.1. Độ thích hợp hệ thống (system suitability) ........................................................ 27 3.5.2. Độ chọn lọc (selectivity) .................................................................................... 28 3.5.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính (linearity) .................................................. 30 3.5.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ................................ 31 3.5.5. Độ chụm của phương pháp (precision) ............................................................. 32 3.5.6. Độ đúng (trueness)............................................................................................. 33 3.6. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm thuốc xịt mũi trên thị trường............. 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học
Tên tiếng Việt
ACN
Acetonitrile
Acetonitril
AZH
Azelastine hydrochloride
Azelastin hydroclorid
BAC
Benzalkonium chloride
Benzalkonium clorid
HPLC
High Performance Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LOD
Limit of Detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of Quantitation
Giới hạn định lượng
MeOH
Methanol
Methanol
Reversed Phase High Performance Liquid
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chromatography
pha đảo
RP-LC
Reversed Phase Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng pha đảo
RSD
Relative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối
SD
Standard Deviation
Độ lệch chuẩn
RP-HPLC
TB
Gíá trị trung bình
THF
Tetrahydrofuran
Tetrahydrofuran
TLC
Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng
UV
Ultraviolet
Tử ngoại
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1
Một số phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC
5
Bảng 2.1
Các điều kiện pha động khảo sát
14
Bảng 3.1
Cách pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp
20
Bảng 3.2
Cách pha các mẫu thêm chuẩn AZH
21
Bảng 3.3
Cách pha các mẫu thêm chuẩn BAC
22
Bảng 3.4
Kết quả độ ổn định hệ thống
28
Bảng 3.5
Kết quả khảo sát đường chuẩn
30
Bảng 3.6
Kết quả xác định LOD và LOQ
32
Bảng 3.7
Kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày
32
Bảng 3.8
Kết quả độ đúng của AZH
33
Bảng 3.9
Kết quả độ đúng của BAC
33
Bảng 3.10
Kết quả định lượng azelastin hydroclorid trong chế phẩm
34
Bảng 3.11
Kết quả định lượng benzalkonium clorid trong chế phẩm
34
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1
Công thức cấu tạo của azelastin hydroclorid
2
Hình 1.2
Công thức cấu tạo của benzalkonium clorid
3
Hình 1.3
Thuốc xịt mũi Nozeytin
4
Hình 2.1
Cách xác định tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu
16
Hình 3.1
Phổ hấp thụ UV của AZH và BAC
23
Hình 3.2
Kết quả khảo sát thành phần pha động
24
Hình 3.3
Kết quả khảo sát pH đệm
25
Hình 3.4
Kết quả khảo sát tốc độ dòng tại bước sóng 210 nm
26
Hình 3.5
Sắc ký đồ kết quả độ chọn lọc
29
Hình 3.6
Hình 3.7
Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của azelastin hydroclorid Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của benzalkonium clorid
30
31
ĐẶT VẤN ĐỀ Một thành phần quan trọng trong các chế phẩm thuốc đa liều là các chất bảo quản kháng khuẩn. Các thành phần này có tác dụng làm giảm nguy cơ xâm nhập của vi khuẩn sau khi đã dùng một phần chế phẩm. Theo những quy định quốc tế hiện hành, tiêu chuẩn thành phẩm thuốc phải có quy định về giới hạn chất bảo quản khi có sử dụng trong công thức bào chế, tên và hàm lượng các chất này phải ghi trên nhãn thuốc. Tại thời điểm sản xuất, sản phẩm cần chứa một lượng chất bảo quản kháng khuẩn được công bố (trong phạm vi ± 20% dao động cho phép trong sản xuất và kiểm nghiệm) [2]. Một trong những chất bảo quản kháng khuẩn thường được sử dụng trong các công thức thuốc nhỏ mũi là benzalkonium clorid. Ở Việt Nam, một phương pháp định lượng benzalkonium clorid trong thuốc xịt mũi azelastin hydroclorid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được công bố [5]. Các chế phẩm của azelastin hydroclorid cũng thường chứa thành phần chất bảo quản là benzalkonium clorid. Tính đến nay trên thế giới đã có một số phương pháp được phát triển để định lượng hai chất này đồng thời với nhau, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào được công bố tại Việt Nam. Chính vì vậy, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lượng Azelastin hydroclorid và Benzalkonium clorid trong chế phẩm thuốc xịt mũi Nozeytin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” trên đối tượng cụ thể là chế phẩm thuốc xịt mũi Nozeytin với hai mục tiêu chính: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Ứng dụng phương pháp trên để định lượng azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong chế phẩm.
1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 1.1.1. Đặc điểm của azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid Azelastin hydroclorid là dạng muối hydroclorid của azelastin, một hợp chất phthalazinone thuộc nhóm thuốc kháng histamin thế hệ thứ hai, có đặc tính chống dị ứng và giãn phế quản [12].
O
N
CH3
N N
.HCl
Cl Hình 1.1. Công thức cấu tạo của azelastin hydroclorid Công thức phân tử: C22H24ClN3O . HCl Danh pháp: 1(2H)-Phthalazinone, 4-[(4-clorophenyl)methyl]-2-(hexahydro-1methyl-1H-azepin-4-yl),
monohydroclorid.
Tên
khác:
4-(p-Clorobenzyl)-2-
(hexahydro-1-methyl-1H -azepin-4-yl)-1(2H)-phthalazinone monohydroclorid. Phân tử lượng: 418,36. Tính chất vật lý: Bột trắng hoặc gần như trắng, dạng tinh thể. Tan trong ethanol và metylen clorid; ít tan trong nước [29]. Azelastin được bào chế dưới dạng thuốc xịt mũi, nhỏ mắt và dạng uống để điều trị viêm mũi dị ứng, hen suyễn và viêm kết mạc dị ứng. Azelastin làm giảm chảy nước mũi, hắt hơi và nghẹt mũi; có hiệu quả chống lại hen suyễn do tập thể dục và dị ứng ở bệnh nhân hen suyễn ngoại sinh [12]. Thuốc nhỏ mắt azelastin được chỉ định để điều trị tại chỗ viêm kết mạc dị ứng theo mùa và lâu năm [28]. Cơ chế tác dụng bao gồm ức chế giải phóng histamin từ các tế bào mast và ức chế co thắt phế quản do histamin và leukotrien [12]. Các thuốc xịt mũi chứa azelastin hydroclorid thường là chế phẩm đơn hoạt chất hoặc kết hợp với một số corticosteroid (mometasone furoate, fluticasone propionate…) 2
Các chế phẩm thuốc đa liều thường phải đối mặt với nguy cơ nhiễm vi sinh vật sau khi mở nắp. Vi sinh vật sẽ làm giảm độ ổn định, tác dụng của chế phẩm, thậm chí gây bệnh cho người dùng. Các chất bảo quản kháng khuẩn được thêm vào nhằm ngăn vi sinh vật xâm nhập trong quá trình bảo quản thuốc. Theo quy định, tên và hàm lượng các chất bảo quản phải được ghi trong nhãn thuốc. Một trong số những chất bảo quản kháng khuẩn thường được sử dụng trong công thức thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi chứa azelastin là benzalkonium clorid. Benzalkonium clorid là hỗn hợp của các alkylbenzyldimethyl amoni clorid có công thức chung: [C6H5CH2N(CH3)2CnH2n+1]Cl trong đó gốc alkyl chủ yếu có n là 12, 14 hoặc 16. Các thành phần đồng đẳng n-C12H25 và n-C14H29 không được ít hơn 70,0% của tổng các alkylbenzyldimethyl amoni clorid (n-C12H25 không ít hơn 40,0% và n-C14H29 không ít hơn 20,0%) [29].
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của benzalkonium clorid Danh
pháp:
Amoni,
alkyldimethyl(phenylmethyl)-,
clorid.
Tên
khác:
Alkylbenzyldimethylamoni clorid. Tính chất vật lý: Dạng gel dày hoặc miếng gelatin trắng hoặc vàng trắng. Thường có mùi thơm nhẹ. Dung dịch nước trong suốt không màu hoặc hơi vàng có vị đắng, tạo bọt mạnh khi lắc và thường có tính kiềm nhẹ. Tan tốt trong nước và trong ethanol. Dạng khan tan tự do trong benzen và ít tan trong ether [29]. Benzalkonium clorid thuộc nhóm chất bảo quản kháng khuẩn; tác nhân làm ướt và/hoặc hòa tan; chất nhũ hóa. Benzalkonium clorid làm bất hoạt các enzym sinh năng lượng, do vậy làm thay đổi bản chất các protein và làm phá vỡ màng tế bào vi sinh vật, do đó có tác dụng khử khuẩn. Độ dài chuỗi alkyl khác nhau mang lại tính chất khác nhau. Ví dụ, hoạt động kháng khuẩn lớn hơn đối với độ dài chuỗi ngắn hơn, tuy nhiên độ nhạy cảm của da giảm khi chiều dài chuỗi tăng. Chiều dài chuỗi ngắn hơn thì khả 3
năng hòa tan và tạo bọt tăng. Benzalkonium clorid có hiệu quả ở mọi mức pH. Tuy nhiên, hiệu quả sẽ tăng lên khi pH tăng, pH càng cao, nồng độ cần thiết để đạt được hiệu quả kháng khuẩn càng thấp. Benzalkonium clorid được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp dược phẩm để làm chất bảo quản chống vi sinh vật trong các loại dung dịch thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi và xịt mũi, cũng như sử dụng làm chất sát khuẩn ngoài da. Ngoài benzalkonium clorid, benzalkonium bromid và benzalkonium sacarinat cũng được sử dụng nhưng kém phổ biến hơn. Các dung dịch benzalkonium clorid nồng độ 0,01 đến 0,1% được sử dụng để làm sạch da, niêm mạc và vết thương. Benzalkonium clorid được sử dụng làm chất bảo quản trong các dung dịch nhỏ mắt ở nồng độ 0,01 đến 0,02%, và trong các dung dịch nhỏ mũi và otic ở nồng độ 0,002 đến 0,02% [28]. Với mục đích an toàn cho người sử dụng, hàm lưg benzalkonium clorid phải được kiểm soát chặt chẽ trong các chế phẩm thuốc. Ở Việt Nam, trên thị trường cũng có chế phẩm thuốc xịt mũi Nozeytin với hàm lượng azelastin hydroclorid 1 mg/mL và benzalkonium clorid 0,125 mg/mL. Thuốc được sử dụng với chỉ định điều trị triệu chứng sổ mũi, hắt hơi, nghẹt mũi… của một số bệnh như viêm mũi dị ứng, viêm mũi vận mạch, viêm xoang mũi…
Hình 1.3. Thuốc xịt mũi Nozeytin 1.1.2. Một số phương pháp phân tích định lượng Trên thế giới, đã có khá nhiều phương pháp được phát triển để định lượng azelastin hydrochlorid. Trong Dược điển Anh và Dược điển Mỹ đã có phương pháp 4
định lượng azelastin hydroclorid bằng chuẩn độ điện thế [11, 28]. Ngoài ra, một số phương pháp bao gồm đo màu và đo quang [7, 16, 21], sắc ký lớp mỏng (TLC) [22, 25], sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10, 24], phương pháp điện hóa [26] và phân tích nhiệt [27] đã được phát triển để định lượng azelastin hydroclorid dạng đơn chất hoặc dạng bào chế. Với benzalkonium clorid, vì đây là một hỗn hợp các thành phần và được sử dụng trong các công thức dược phẩm ở nồng độ thấp, nên khó có được các phép đo đáng tin cậy. Hiện tại, trong Dược điển Mỹ và Dược điển Anh sử dụng phương pháp định lượng benzalkonium clorid nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ và xác định tỷ lệ các thành phần alkyl bằng kỹ thuật HPLC [11, 28]. Dược điển Việt Nam V cũng định lượng benzalkonium clorid bằng phương pháp chuẩn độ [1]. Ngoài ra, nhiều phương pháp đã được phát triển để định lượng benzalkonium clorid trong dạng bào chế bao gồm đo quang [14], sắc ký lớp mỏng (TLC) [8] và điện di mao quản [30]. Phương pháp HPLC cũng được nghiên cứu rộng rãi trên pha tĩnh là cột C18 [20, 23] hoặc cột CN [9, 13]. Tại Việt Nam, có hai nghiên cứu được đưa ra để định lượng benzalkonium clorid trong thuốc xịt mũi azelastin hydroclorid [5] và xylomethazolin hydroclorid [6] bằng HPLC với pha tĩnh là cột C18. Các phương pháp điện di mao quản, điện hóa hay phân tích nhiệt mặc dù có độ nhạy và độ chọn lọc cao, tuy nhiên quá trình xử lý mẫu phức tạp và cần trang thiết bị đắt tiền, trong khi đó phương pháp HPLC là phương pháp ổn định, hiệu quả, sử dụng thiết bị phổ biến hơn và hóa chất thông thường, dễ triển khai và phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Bảng 1.1 tóm tắt một số thông tin về các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới về phân tích azelastin hydroclorid (AZH) và benzalkonium clorid (BAC) sử dụng phương pháp HPLC. Bảng 1.1. Một số phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC STT
1
Tên tác giả
B. Thangabalan và cộng sự [10]
Đối tượng
Pha tĩnh Cột Kromosil C18,
AZH
(150 x 4,6 mm; 5 µm)
Pha động Dung dịch đệm kali dihydrophosphat 50 mM, pH 3,0 : ACN tỷ lệ 50:50 (v/v). Tốc độ dòng 1,0
5
mL/phút.
2
3
Poonam D.
Mometaso-
Dighe và cộng
ne Furoate,
sự [24]
AZH
Cột Zorbax SB CN
Dung dịch đệm phosphat
(150 x 4,6 mm; 5
pH khoảng 3,0 đến 3,1 :
μm) duy trì ở nhiệt
ACN tỷ lệ 55:45 (v/v).
độ 30oC.
Tốc độ dòng 1,0 mL/phút.
Lê Đình Chi,
Cột sắc ký
Phạm Thị Hiền,
Phenomenex C18
Dương Minh
BAC
(250 x 4,6 mm; 5
Tân, Lê Quang
µm) được duy trì ở
Thảo [5]
40oC.
4
Hà, Lê Thị
Eclipse XDB-C18 BAC
Thiên Hương
(150 x 4,6 mm; 5 µm)
pH 2,2 chứa 0,3% (v/v) triethylamin (60 : 40, v/v). Tốc độ dòng 1,2
ACN : dung dịch đệm kali dihydrophosphat 25 mM pH 3,0 tỷ lệ 75:25. Tốc độ dòng 2,0 mL/phút.
[6]
Cột Macherey-Nagel ACN : dung dịch đệm kali
Hashem 5
dihydrophosphat 10 mM
mL/phút.
Phan Thị Thùy Chi, Phạm Thị
ACN : dung dịch đệm kali
AlAani và cộng BAC sự [9]
Nucleodur 100-5
dihydrophosphat 50 mM
CN (250 x 4,6 mm;
(pH 5,5) tỷ lệ 70:30 (v/v).
5 μm)
Tốc độ dòng 1,0 mL/phút. ACN : dung dịch đệm phosphat (5,0 mL acid ortho phosphoric và 1,0
Pratik Kumar 6
Gupta, Vibha
BAC
Chaturvedi [23]
Cột C18, cosmosil
mL triethylamin pha
(250 x 4,6 mm; 5
loãng với nước tới 1000
µm)
mL, chỉnh tới pH 5,0 bằng NaOH 5 N) tỷ lệ 45:55 (v/v). Tốc độ dòng 1,5 mL/phút.
7
Rangan Mallik
BAC
Cột ACE Excel 2 6
Dung dịch đệm
và cộng sự [20]
C18-AR (50 x 2,1
ammonium phosphat (pH
mm; 2 μm)
3,3; 10 mM) : methanol/ acetonitril (85/15, v/v). Tốc độ dòng 1,0 mL/phút.
Fluticasone
8
K. Lakshmi
propionate,
Cột Waters
Narasimha Rao
phenylethy
Spherisorb CN (250
và cộng sự [15]
l alcohol.
x 4,6 mm; 5 μm)
AZH, BAC
Dung dịch đệm kali dihydrophosphat 50 mM : ACN tỷ lệ 55:45 (v/v). Tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Dung dịch đệm kali
M. E. M. 9
Hassouna và cộng sự [18]
Cột Thermo CPS AZH, BAC CN (150 x 4,6mm; 5 µm)
dihydrophosphat 50 mM và 5,7 mM hexane sulfonat pH 4,5 : ACN (50:50). Tốc độ dòng 1,5 mL/phút.
Mặc dù có nhiều phương pháp phân tích từng chất riêng lẻ, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu định lượng đồng thời cả 2 chất này. Hai phương pháp RP-HPLC đã được phát triển để xác định đồng thời cả azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong các công thức thuốc nhỏ mắt [18] và nhỏ mũi [15]. Cả hai phương pháp này đều sử dụng cột sắc ký CN, tương đối chính xác và xử lý mẫu đơn giản. Tuy nhiên, phương pháp [15] có thời gian phân tích khá dài (20 phút) và khoảng tuyến tính hẹp (39,2 – 67,2 µg/mL với AZH và 2,8 – 4,8 µg/mL với BAC). Phương pháp [18] đã khắc phục được thời gian phân tích (7,5 phút) và khoảng tuyến tính (6,25 – 50,0 µg/mL với AZH và 5,0 – 50,0 µg/mL với BAC). Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào phân tích đồng thời azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid. Công thức thuốc xịt mũi được quan tâm có hoạt chất azelastin hydroclorid với hàm lượng cao hơn nhiều lần so với benzalkonium clorid và đáp ứng pic của benzalkonium clorid rất thấp, nên để định lượng benzalkonium clorid cần tiêm mẫu ở nồng độ cao. Điều này không phù hợp với cột CN. Một số nghiên cứu định lượng riêng từng chất cũng được thực hiện trên cột C18. So với cột CN, cột C18 có ưu điểm là thông dụng và ổn định hơn, tuổi thọ cột cũng dài hơn. Vì vậy, trong nghiên 7
cứu này một phương pháp phân tích đồng thời hai chất trong chế phẩm thuốc xịt mũi được phát triển trên cột C18. 1.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao [3, 4] 1.2.1. Nguyên tắc Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên pha tĩnh nhờ dòng di chuyển của pha động dưới áp suất cao. Dưới áp suất cao, các thành phần phân tích đã được hòa tan trong dung môi sẽ bị kéo đi theo sự di chuyển của pha động qua cột sắc ký với các tốc độ khác nhau và được tách khỏi nhau theo thời gian phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh. Chất nào có lực tương tác lớn hơn sẽ bị giữ lại lâu hơn trên cột và bị rửa giải chậm hơn. Tín hiệu về từng chất được phát hiện bởi đầu dò đặt sau cột tách và hiện diện dưới dạng các pic nhờ bộ phận xử lý và ghi kết quả. 1.2.2. Phân loại Sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể thực hiện theo nhiều kỹ thuật khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm cấu tạo của chất phân tích và các yêu cầu của công việc. Có thể thống kê các kỹ thuật sắc ký lỏng theo các mức độ phổ biến trong thực tế: -
Sắc ký phân bố (bao gồm cả sắc ký cặp ion) (Partition chromatography).
-
Sắc ký hấp phụ (Liquid – solid chromatography).
-
Sắc ký trao đổi ion (Ion – exchange chromatography).
-
Sắc ký loại cỡ (Size – exclusion chromatography).
-
Sắc ký ái lực (Affinity chromatography).
-
Sắc ký các đồng phân quang học.
Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất hiện nay. Sắc ký phân bố được chia thành sắc ký phân bố pha thuận và sắc ký pha đảo. Theo một số tác giả, sắc ký phân bố pha đảo chiếm đến 75% khối lượng sắc ký và được sử dụng rất nhiều trong phân tích kiểm nghiệm thuốc. Đây cũng là phương pháp được hướng tới trong nghiên cứu này. 1.2.3. Sắc ký lỏng pha đảo Sắc ký lỏng pha đảo (Reversed-phase Chromatography) thuộc nhóm sắc ký phân bố pha liên kết; sử dụng pha tĩnh không phân cực và pha động phân cực hơn pha tĩnh. Loại hình sắc ký này ngược với sắc ký pha thuận (Normal-phase Chromatography) sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực. 8
Sắc ký pha đảo được sử dụng để phân tích hỗn hợp các chất hữu cơ có khối lượng phân tử nhỏ (M < 2000), trung tính, phân cực. Về thứ tự rửa giải: trong sắc ký pha đảo, các chất phân cực ra trước, các chất ít và không phân cực ra sau. a. Pha tĩnh RP-LC sử dụng pha tĩnh không phân cực (nonpolar phases), có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn. Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxyd (silica). Nhóm -OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan. Chất nhồi cột pha liên kết thường là hạt hình cầu đường kính 3 – 10µm. Hạt silica có diện tích riêng khá lớn (vài trăm m2/g) thường chỉ bền vững trong khoảng pH 2 – 8. Ngoài khoảng này liên kết siloxan bị thủy phân. Tuy nhiên, hiện tại các nhà sản xuất cột sắc ký đang có ngày càng nhiều hướng tiếp cận mới cho phép các cột sắc ký pha đảo nói riêng và sắc ký pha liên kết nói chung làm việc ổn định được ở khoảng pH cao hơn so với cột pha liên kết kinh điển trên giá mang là hạt silica. b. Pha động Ba dung môi hữu cơ thường dùng là: acetonitril (ACN), methanol (MeOH) và tetrahydrofuran (THF). Pha động thường dùng hỗn hợp tỷ lệ 1:2 dung môi trên với nước hoặc dung dịch đệm để nhằm đảm bảo tương tác với chất tan để tách pha đảo hỗn hợp nhiều nhất. • Hỗn hợp thường dùng nhất là ACN với nước. ACN có độ nhớt thấp nên có thể sắc ký ở áp suất thấp và thích hợp hơn với các chất không phân cực. Mặt khác, có thể đo độ hấp thụ UV đến 190 nm. • MeOH được lựa chọn thứ hai, vì độ nhớt cao hơn có thể làm giảm hiệu lực cột, và giới hạn đo ở vùng UV là 205 nm. • THF ít dùng hơn vì độ ổn định kém hơn (dễ bị oxy hóa), cân bằng với pha tĩnh chậm hơn. Để giảm hiện tượng kéo đuôi (tailing) tăng tính cân đối của pic, người ta thường thêm vào pha động triethylamin 30 mM khi sắc ký các base amin. Nếu sắc ký các hợp chất acid có thể giảm thiểu kéo đuôi bằng cách thêm amoni acetat 30 mM. Với hỗn hợp chưa rõ thành phần, thường dùng muối triethylamoni acetat 30 mM, hoặc dimethyloctylamin 10 mM. Đôi khi còn dùng dimethyloctylamoni acetat. Người ta cho rằng các chất phụ gia kể trên sẽ đẩy nhanh cân bằng khi thay đổi dung môi. 9
1.2.4. CĂĄc káťš thuáşt Ä‘áť‹nh lưᝣng báşąng HPLC TẼt cả cĂĄc káťš thuáşt Ä‘áť‹nh lưᝣng báşąng sắc kĂ˝ Ä‘áť u dáťąa trĂŞn nguyĂŞn tắc náť“ng Ä‘áť™ cᝧa chẼt phân tĂch tᝡ lᝇ thuáşn váť›i chiáť u cao hoạc diᝇn tĂch pic cᝧa nĂł. CĂł 4 káťš thuáşt Ä‘áť‹nh lưᝣng đưᝣc sáť d᝼ng trong sắc kĂ˝: -
Phưƥng phåp chuẊn ngoấi
-
Phưƥng phåp chuẊn n᝙i
-
Phưƥng phåp thêm chuẊn
-
PhĆ°ĆĄng phĂĄp chuẊn hĂła diᝇn tĂch
Trong Ä‘Ăł phĆ°ĆĄng phĂĄp chuẊn ngoấi lĂ phĆ°ĆĄng phĂĄp đưᝣc sáť d᝼ng trong khĂła luáşn nĂ y. PhĆ°ĆĄng phĂĄp chuẊn ngoấi đưᝣc trĂŹnh bĂ y c᝼ tháťƒ nhĆ° sau: Káťš thuáşt chuẊn ngoấi: Tiáşżn hĂ nh sắc kĂ˝ trong cĂšng Ä‘iáť u kiᝇn mẍu chuẊn vĂ mẍu tháť. So sĂĄnh diᝇn tĂch (hoạc chiáť u cao) pic cᝧa mẍu tháť váť›i diᝇn tĂch (hoạc chiáť u cao) pic cᝧa mẍu chuẊn sáş˝ tĂnh đưᝣc náť“ng Ä‘áť™ cĂĄc chẼt trong mẍu tháť. CĂł tháťƒ sáť d᝼ng phĆ°ĆĄng phĂĄp chuẊn hĂła máť™t Ä‘iáťƒm hoạc nhiáť u Ä‘iáťƒm. • ChuẊn hĂła máť™t Ä‘iáťƒm: ChuẊn báť‹ mẍu tháť cĂł náť“ng Ä‘áť™ xẼp xᝉ náť“ng Ä‘áť™ mẍu chuẊn. Náť“ng Ä‘áť™ cᝧa mẍu thᝠđưᝣc tĂnh theo cĂ´ng thᝊc: đ??śđ?‘Ľ = đ??śđ?‘
đ?‘†đ?‘Ľ đ?‘†đ?‘
Trong Ä‘Ăł: Cx, Cs: náť“ng Ä‘áť™ mẍu tháť, mẍu chuẊn Sx, Ss: diᝇn tĂch pic mẍu tháť, mẍu chuẊn • ChuẊn hĂła nhiáť u Ä‘iáťƒm: ChuẊn báť‹ máť™t dĂŁy dung dáť‹ch chuẊn váť›i cĂĄc náť“ng Ä‘áť™ tăng dần ráť“i tiáşżn hĂ nh sắc kĂ˝. Váş˝ Ä‘áť“ tháť‹ biáťƒu diáť…n máť‘i tĆ°ĆĄng quan giᝯa diᝇn tĂch (hoạc chiáť u cao) pic váť›i náť“ng Ä‘áť™ chẼt chuẊn. Sáť d᝼ng khoảng tuyáşżn tĂnh cᝧa Ä‘Ć°áť?ng chuẊn Ä‘áťƒ tĂnh náť“ng Ä‘áť™ cᝧa chẼt cần xĂĄc Ä‘áť‹nh. Xây dáťąng phĆ°ĆĄng trĂŹnh háť“i quy tuyáşżn tĂnh mĂ´ tả quan hᝇ giᝯa diᝇn tĂch hoạc chiáť u cao pic váť›i náť“ng Ä‘áť™ chẼt cần xĂĄc Ä‘áť‹nh: Y = aCx + b Trong Ä‘Ăł: Cx: náť“ng Ä‘áť™ cᝧa chẼt phân tĂch Y: diᝇn tĂch hoạc chiáť u cao pic ChĂş Ă˝: Ä?áť™ láť›n cᝧa diᝇn tĂch hoạc chiáť u cao pic cᝧa mẍu tháť phải náşąm trong khoảng tuyáşżn tĂnh cᝧa Ä‘Ć°áť?ng chuẊn.
10
Phương pháp chuẩn ngoại tương đối đơn giản và nhanh chóng, tuy nhiên nhược điểm là dễ mắc phải sai số do tiêm mẫu không lặp lại hoặc mất mẫu trong quá trình xử lý mẫu. Phương pháp thường được sử dụng trong những trường hợp quy trình xử lý mẫu đơn giản, và sử dụng khi định lượng đối với chế phẩm (do đã biết trước khoảng nồng độ).
11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là thuốc xịt mũi Nozeytin. Thành phần của mỗi lọ thuốc như sau: + Azelastine hydroclorid: 15 mg/15 mL + Benzalkonium clorid: 1,875 mg/15 mL + Tá dược khác: Acid citric khan, dinatri hydro phosphat dodecahydrat, dinatri edetat, surcalose, hypromellose 2900, natri clorid, nước tinh khiết. 2.2. Nguyên vật liệu, thiết bị 2.2.1. Hóa chất
- Chuẩn đối chiếu azelastin hydroclorid: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương (Độ tinh khiết 99,4%, số lô: AH 0020216).
- Chuẩn đối chiếu benzalkonium clorid: Dung dịch benzalkonium clorid chuẩn 50% trong nước (kl/tt), Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
- Thuốc xịt mũi Nozeytin: Nhà sản xuất Công ty Cổ phần Dược phẩm Gia Nguyễn; số lô sản xuất: 004/19; số đăng ký: VD-23262-15; hạn dùng: 23/08/2021.
- Acetonitril dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (Fisher – Hàn Quốc). - Kali dihydro phosphat (Merck – Đức). - Acid phosphoric (Merck – Đức). - Nước cất hai lần. 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm Chemstation. - Cột sắc ký: Cột Vertisep GES C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) (Vertical). - Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức). - Máy lắc xoáy Labinco L46 (Đài Loan). - Phễu lọc Bunchner, màng lọc cellulose 0,45 µm. - Màng lọc mẫu cellulose 0,45 µm. - Cân phân tích A&D Model GR-200 (Nhật). - Máy đo pH Eutech pH 700 (Singapore). 12
- Micropipet 10 – 100 µL, 100 – 1000 µL LABMATE pro. - Bình định mức 10 mL, 20 mL, 25 mL, 50 mL, 250 mL. - Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, vial. 2.3. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát điều kiện sắc ký phân tích AZH và BAC trong chế phẩm thuốc xịt mũi bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao.
- Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ thích hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chụm, độ đúng, theo hướng dẫn của ICH Q2B [19].
- Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng AZH và BAC trong chế phẩm thuốc xịt mũi Nozeytin trên thị trường. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Khảo sát bước sóng phát hiện Tiến hành quét phổ trên pic sắc ký của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ 190 đến 400 nm. Lựa chọn bước sóng thích hợp với mỗi chất. 2.4.2. Khảo sát điều kiện sắc ký Tiến hành xây dựng phương pháp định lượng trên hệ thống sắc ký HPLC Agilent Technologies 1200 Series, với pha tĩnh là cột Vertisep GES C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) (Vertical). Khảo sát pha động về nồng độ đệm, tỷ lệ thành phần (v/v), pH đệm và tốc độ dòng (f). Dựa vào khả năng tách các chất, mức độ ổn định của đường nền, hình dáng pic và thời gian lưu của chất phân tích để lựa chọn pha động. Các điều kiện pha động khảo sát được trình bày ở bảng 2.1.
13
Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát Pha động
Tỷ lệ (v/v)
Tốc độ (mL/phút)
45 : 55
1,0
50 : 50
1,0
60 : 40
1,0
75 : 25
1,0
70 : 30
1,0
ACN : đệm phosphat 50 mM ACN : đệm phosphat 10 mM (khảo sát pH của dung dịch đệm)
1,0 ACN : đệm phosphat 10 mM pH 3,5
75 : 25
1,1 1,2
80 : 20
1,0
2.4.3. Khảo sát nồng độ định lượng Khảo sát chuẩn hỗn hợp AZH và BAC ở 2 ngưỡng nồng độ cùng tỷ lệ AZH : BAC = 8:1 (như tỷ lệ trong công thức chế phẩm) là AZH là 1000 µg/mL – BAC 125 µg/mL và AZH 400 µg/mL – BAC 50 µg/mL. Đánh giá kết quả dựa trên diện tích pic và sự đáp ứng tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ. 2.4.4. Thẩm định quy trình Sau khi lựa chọn được điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng AZH và BAC theo hướng dẫn của ICH Q2B trên các tiêu chí sau: Độ thích hợp hệ thống, độ chọn lọc, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chụm và độ đúng. a. Độ thích hợp hệ thống (system suitability) Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bởi các yếu tố như máy móc, thiết bị. Tiến hành: Xác định tính thích hợp hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp chứa AZH và BAC (chuẩn bị ở phần sau). Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích.
14
đ?‘†đ??ˇ = √
2 ∑đ?‘ đ?‘–=1(đ?‘Ľđ?‘– − đ?‘ĽĚ… ) đ?‘ −1
đ?‘…đ?‘†đ??ˇ (%) = Trong Ä‘Ăł:
đ?‘†đ??ˇ . 100 đ?‘Ľâƒ?
xi: Tháť?i gian lĆ°u/diᝇn tĂch pic cᝧa lần tháť nghiᝇm thᝊ i. đ?‘ĽĚ… : Tháť?i gian lĆ°u/diᝇn tĂch pic trung bĂŹnh cᝧa N lần tháť nghiᝇm. N: Sáť‘ lần tháť nghiᝇm.
YĂŞu cầu: RSD (%) cᝧa cĂĄc Ä‘ĂĄp ᝊng tháť?i gian lĆ°u ≤ 1,0% vĂ diᝇn tĂch pic ≤ 2,0%. b. Ä?áť™ cháť?n láť?c (selectivity) TĂnh cháť?n láť?c cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp: LĂ khả năng Ä‘ĂĄnh giĂĄ máť™t cĂĄch rĂľ rĂ ng chẼt cần phân tĂch khi cĂł mạt cĂĄc thĂ nh phần khĂĄc nhĆ° tấp chẼt hoạc cĂĄc chẼt cản tráť&#x; khĂĄc. Tiáşżn hĂ nh: Chấy sắc kĂ˝ dung dáť‹ch chuẊn háť—n hᝣp AZH vĂ BAC, dung dáť‹ch tháť vĂ náť n mẍu táťą tấo, dung mĂ´i pha mẍu tᝍ cĂĄc thĂ nh phần cᝧa cháşż phẊm váť›i chĆ°ĆĄng trĂŹnh Ä‘ĂŁ láťąa cháť?n. Ghi lấi cĂĄc thĂ´ng sáť‘ tháť?i gian lĆ°u. YĂŞu cầu: - Tháť?i gian lĆ°u pic AZH vĂ BAC cᝧa dung dáť‹ch chuẊn Ä‘ĆĄn, dung dáť‹ch chuẊn háť—n hᝣp, dung dáť‹ch tháť phải tĆ°ĆĄng Ä‘Ć°ĆĄng nhau. Pic trong mẍu tháť phải tĂĄch hoĂ n toĂ n váť›i cĂĄc pic khĂĄc trong náť n mẍu. - Náť n mẍu táťą tấo vĂ dung mĂ´i pha mẍu khĂ´ng xuẼt hiᝇn pic áť&#x; trong khoảng tháť?i gian lĆ°u tĆ°ĆĄng ᝊng váť›i tháť?i gian lĆ°u cᝧa pic AZH vĂ BAC trĂŞn sắc kĂ˝ Ä‘áť“ cᝧa cĂĄc dung dáť‹ch chuẊn. Náşżu cĂł, Ä‘ĂĄp ᝊng cᝧa pic tấp phải ≤ 1,0% so váť›i Ä‘ĂĄp ᝊng pic cᝧa mẍu chuẊn. - Hᝇ sáť‘ tinh khiáşżt pic AZH vĂ BAC trong sắc kĂ˝ Ä‘áť“ dung dáť‹ch chuẊn vĂ dung dáť‹ch tháť xẼp xᝉ 1,0. Hᝇ sáť‘ cháť“ng pháť• UV cᝧa pic AZH vĂ BAC thu đưᝣc trong sắc kĂ˝ Ä‘áť“ dung dáť‹ch tháť vĂ pháť• UV cᝧa pic tĆ°ĆĄng ᝊng trong sắc kĂ˝ Ä‘áť“ dung dáť‹ch chuẊn xẼp xᝉ 1,0. c. Ä?Ć°áť?ng chuẊn vĂ khoảng tuyáşżn tĂnh (linearity) Khoảng tuyáşżn tĂnh cᝧa máť™t phĆ°ĆĄng phĂĄp phân tĂch lĂ khoảng náť“ng Ä‘áť™ mĂ áť&#x; Ä‘Ăł cĂł sáťą ph᝼ thuáť™c tuyáşżn tĂnh giᝯa đấi lưᝣng Ä‘o đưᝣc vĂ náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂch. Ä?Ć°áť?ng
15
chuẊn lĂ Ä‘Ć°áť?ng biáťƒu diáť…n sáťą ph᝼ thuáť™c tuyáşżn tĂnh giᝯa đấi lưᝣng Ä‘o đưᝣc vĂ náť“ng Ä‘áť™ cĂĄc chẼt phân tĂch. Tiáşżn hĂ nh: Chấy sắc kĂ˝ dung dáť‹ch chuẊn háť—n hᝣp, cĂł náť“ng Ä‘áť™ AZH vĂ BAC lần lưᝣt báşąng 50%, 75%, 100%, 125%, vĂ 150% náť“ng Ä‘áť™ Ä‘áť‹nh lưᝣng vĂ khảo sĂĄt sáťą ph᝼ thuáť™c cᝧa tĂn hiᝇu Ä‘o đưᝣc vĂ náť“ng Ä‘áť™. Váş˝ Ä‘áť“ tháť‹ ph᝼ thuáť™c giᝯa tĂn hiᝇu vĂ náť“ng Ä‘áť™, xây dáťąng phĆ°ĆĄng trĂŹnh háť“i quy, xĂĄc Ä‘áť‹nh hᝇ sáť‘ tĆ°ĆĄng quan (r) vĂ hᝇ sáť‘ chắn tấi náť“ng Ä‘áť™ 100% (Y%). Hᝇ sáť‘ chắn tấi náť“ng Ä‘áť™ 100%: Y% =
đ??ťáť‡ đ?‘ áť‘ đ?‘?ℎắđ?‘› (đ?‘?) đ??ˇđ?‘–ᝇđ?‘› đ?‘ĄĂđ?‘?â„Ž đ?‘?đ?‘–đ?‘? áť&#x; đ?‘›áť“đ?‘›đ?‘” Ä‘áť™ 100%
x 100%
YĂŞu cầu: Hᝇ sáť‘ tĆ°ĆĄng quan: 0,995 ≤ r ≤ 1. Hᝇ sáť‘ chắn tấi náť“ng Ä‘áť™ 100%: - 2,0% ≤ Y% ≤ 2,0% d. Giáť›i hấn phĂĄt hiᝇn (LOD) vĂ giáť›i hấn Ä‘áť‹nh lưᝣng (LOQ) Giáť›i hấn phĂĄt hiᝇn (Limit of Detection - LOD) lĂ náť“ng Ä‘áť™ thẼp nhẼt cᝧa chẼt phân tĂch trong mẍu cĂł tháťƒ phĂĄt hiᝇn đưᝣc nhĆ°ng chĆ°a tháťƒ Ä‘áť‹nh lưᝣng đưᝣc. Giáť›i hấn Ä‘áť‹nh lưᝣng (Limit of Quantitation - LOQ) lĂ náť“ng Ä‘áť™ táť‘i thiáťƒu cᝧa máť™t chẼt cĂł trong mẍu tháť mĂ ta cĂł tháťƒ Ä‘áť‹nh lưᝣng báşąng phĆ°ĆĄng phĂĄp khảo sĂĄt vĂ cho káşżt quả cĂł Ä‘áť™ ch᝼m mong muáť‘n. Tiáşżn hĂ nh: Phân tĂch mẍu chuẊn áť&#x; náť“ng Ä‘áť™ thẼp còn cĂł tháťƒ xuẼt hiᝇn tĂn hiᝇu cᝧa chẼt phân tĂch, lạp lấi 3-4 lần. XĂĄc Ä‘áť‹nh tᝡ lᝇ tĂn hiᝇu chia cho nhiáť…u (S/N = Signal to noise ratio), trong Ä‘Ăł S lĂ chiáť u cao tĂn hiᝇu cᝧa chẼt phân tĂch, N lĂ nhiáť…u Ä‘Ć°áť?ng náť n.
HĂŹnh 2.1. CĂĄch xĂĄc Ä‘áť‹nh tᝡ lᝇ tĂn hiᝇu trĂŞn nhiáť…u 16
Nhiáť…u Ä‘Ć°áť?ng náť n đưᝣc tĂnh váť hai phĂa cᝧa Ä‘Ć°áť?ng náť n vĂ táť‘t nhẼt lĂ tĂnh nhiáť…u lân cáşn hai bĂŞn cᝧa pic, báť ráť™ng máť—i bĂŞn táť‘i thiáťƒu gẼp 10 lần chiáť u ráť™ng cᝧa pic tấi náťa chiáť u cao. đ?‘† â „đ?‘ =
2đ??ť â„Ž
LOD đưᝣc chẼp nháşn tấi náť“ng Ä‘áť™ mĂ tấi Ä‘Ăł tᝡ lᝇ giᝯa cĆ°áť?ng Ä‘áť™ tĂn hiᝇu vĂ cĆ°áť?ng Ä‘áť™ nhiáť…u Ä‘Ć°áť?ng náť n S/N = 3. LOQ đưᝣc chẼp nháşn tấi náť“ng Ä‘áť™ mĂ tấi Ä‘Ăł tᝡ lᝇ giᝯa cĆ°áť?ng Ä‘áť™ tĂn hiᝇu vĂ cĆ°áť?ng Ä‘áť™ nhiáť…u Ä‘Ć°áť?ng náť n S/N khĂ´ng dĆ°áť›i 10. e. Ä?áť™ ch᝼m cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp (precision) Ä?áť™ ch᝼m tháťƒ hiᝇn mᝊc Ä‘áť™ phân tĂĄn káşżt quả giᝯa máť™t loất phĂŠp Ä‘o tᝍ nhiáť u lần tiáşżn hĂ nh phân tĂch trĂŞn cĂšng máť™t mẍu tháť Ä‘áť“ng nhẼt dĆ°áť›i nhᝯng Ä‘iáť u kiᝇn xĂĄc Ä‘áť‹nh. + Ä?áť™ lạp lấi cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp (repeatability): Ä?áť™ lạp lấi diáť…n tả Ä‘áť™ ch᝼m cᝧa máť™t quy trĂŹnh phân tĂch trong cĂšng Ä‘iáť u kiᝇn thĂ nghiᝇm trong khoảng tháť?i gian ngắn. Tiáşżn hĂ nh thĂ nghiᝇm 6 lần váť›i cĂšng máť™t náť“ng Ä‘áť™ mẍu tháť. + Ä?áť™ ch᝼m trung gian (intermediate precision): Báť‘ trĂ thĂ nghiᝇm tĆ°ĆĄng táťą phần Ä‘áť™ lạp lấi cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp nhĆ°ng tiáşżn hĂ nh vĂ o tháť?i gian khĂĄc vĂ phân tĂch trĂŞn cĂšng hᝇ tháť‘ng sắc kĂ˝ láť?ng. Tiáşżn hĂ nh: Ä?áť‹nh lưᝣng 6 lần riĂŞng biᝇt trĂŞn máť™t mẍu tháť vĂ tĂnh toĂĄn Ä‘áť™ lᝇch chuẊn tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i. YĂŞu cầu: + Ä?áť™ lạp lấi: ChĂŞnh lᝇch káşżt quả giᝯa 6 lần tháť, biáťƒu tháť‹ báşąng Ä‘áť™ lᝇch chuẊn tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i RSD (%) cᝧa hĂ m lưᝣng AZH vĂ BAC khĂ´ng quĂĄ 2,0%. + Ä?áť™ ch᝼m trung gian: ChĂŞnh lᝇch káşżt quả giᝯa 6 lần tháť trong cĂšng máť™t ngĂ y vĂ 12 lần tháť trong 2 ngĂ y khĂĄc nhau, biáťƒu tháť‹ báşąng Ä‘áť™ lᝇch chuẊn tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i RSD (%) cᝧa hĂ m lưᝣng AZH vĂ BAC khĂ´ng quĂĄ 2,0%. f. Ä?áť™ Ä‘Ăşng (accuracy) Ä?áť™ Ä‘Ăşng cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp lĂ khĂĄi niᝇm chᝉ mᝊc Ä‘áť™ gần nhau giᝯa cĂĄc giĂĄ tráť‹ trung bĂŹnh cᝧa káşżt quả tháť nghiᝇm vĂ giĂĄ tráť‹ tháťąc hoạc giĂĄ tráť‹ đưᝣc chẼp nháşn lĂ Ä‘Ăşng. Viᝇc xĂĄc Ä‘áť‹nh Ä‘áť™ Ä‘Ăşng cĂł tháťƒ tháťąc hiᝇn thĂ´ng qua xĂĄc Ä‘áť‹nh Ä‘áť™ thu háť“i (còn gáť?i lĂ Ä‘áť™ tĂŹm lấi) cᝧa phĆ°ĆĄng phĂĄp. Ä?áť™ thu háť“i lĂ tᝡ lᝇ phần trăm giᝯa giĂĄ tráť‹ thu đưᝣc so váť›i giĂĄ tráť‹ lĂ˝ thuyáşżt. 17
Tiáşżn hĂ nh: ThĂŞm vĂ o mẍu tháť Ä‘ĂŁ đưᝣc xĂĄc Ä‘áť‹nh hĂ m lưᝣng hoất chẼt máť™t lưᝣng chĂnh xĂĄc chẼt chuẊn áť&#x; 03 mᝊc 80%, 100% vĂ 120% so váť›i hĂ m lưᝣng AZH vĂ BAC cĂł trong mẍu khảo sĂĄt. Ä?áť™ thu háť“i đưᝣc tĂnh theo cĂ´ng thᝊc: đ?‘… (%) =
đ??śđ?‘Ąđ?‘? − đ??śđ?‘› . 100 % đ??śđ?‘Ľ
Trong Ä‘Ăł: R: Ä‘áť™ thu háť“i (%). đ??śđ?‘Ąđ?‘? : náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂch trong mẍu tháť thĂŞm chuẊn (Âľg/mL). Cn: náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂch trong mẍu tháť (Âľg/mL). đ??śđ?‘Ľ : náť“ng Ä‘áť™ chuẊn thĂŞm (lĂ˝ thuyáşżt) (Âľg/mL). YĂŞu cầu: Tᝡ lᝇ thu háť“i đất 98,0 – 102,0% vĂ giĂĄ tráť‹ RSD ≤ 2,0 % áť&#x; máť—i mᝊc náť“ng Ä‘áť™. 2.4.5. Ă p d᝼ng phĆ°ĆĄng phĂĄp Ă p d᝼ng phĆ°ĆĄng phĂĄp trĂŞn tiáşżn hĂ nh phân tĂch Ä‘áť“ng tháť?i AZH vĂ BAC trong cháşż phẊm thuáť‘c xáť‹t mĹŠi Nozeytin. 2.4.6. Xáť lĂ˝ káşżt quả Káşżt quả đưᝣc tĂnh toĂĄn báşąng Microsoft Excel.
- Máť™t sáť‘ đạc trĆ°ng tháť‘ng kĂŞ: + GiĂĄ tráť‹ trung bĂŹnh (X): HĂ m AVERAGE + Ä?áť™ lᝇch chuẊn (SD): HĂ m STDEV + Ä?áť™ lᝇch chuẊn tĆ°ĆĄng Ä‘áť‘i (RSD):
100 đ?‘Ľ SD X
%
- TĆ°ĆĄng quan háť“i quy tuyáşżn tĂnh: PhĆ°ĆĄng trĂŹnh háť“i quy tuyáşżn tĂnh tháťƒ hiᝇn quan hᝇ giᝯa diᝇn tĂch pic sắc kĂ˝ vĂ náť“ng Ä‘áť™ chẼt phân tĂch: S = aC + b. + Hᝇ sáť‘ gĂłc a: HĂ m SLOPE. + Hᝇ sáť‘ chắn b: HĂ m INTERCEPT. + Hᝇ sáť‘ tĆ°ĆĄng quan r: HĂ m CORREL.
18
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Quy trình chuẩn bị mẫu 3.1.1. Chuẩn bị mẫu thử -
Dung dịch chế phẩm được lọc qua màng lọc 0,45 µm, thu được dung dịch mẫu thử B (dùng cho định lượng benzalkonium clorid).
-
Hút chính xác 1,0 mL dung dịch B vào bình định mức 10,0 mL, định mức vừa đủ bằng nước cất 2 lần, thu được dung dịch mẫu thử A (dùng cho định lượng azelastin hydroclorid).
3.1.2. Chuẩn bị mẫu placebo Do nhà sản xuất không công bố tỷ lệ thành phần tá dược trong chế phẩm và trong các Dược điển cũng chưa có chuyên luận về chế phẩm nên lựa chọn nền mẫu tự tạo là pha động chạy sắc ký. Thành phần pha động xem phần 3.4 và quy trình chuẩn bị pha động như phần 3.2. 3.1.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn đơn gốc AZH: Cân chính xác khoảng 10,1 mg AZH chuẩn vào bình định mức 10,0 mL. Hòa tan và định mức vừa đủ bằng nước, được dung dịch AZH chuẩn có nồng độ khoảng 1 mg/mL (1000 µg/mL).
- Dung dịch chuẩn AZH 100 µg/mL: Hút chính xác 1,00 mL dung dịch chuẩn gốc AZH 1000 µg/mL vào bình định mức 10,0 mL. Định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều.
- Dung dịch chuẩn BAC 5000 µg/mL: Hút chính xác 0,5 mL dung dịch BAC chuẩn 50% vào bình định mức 50,0 mL. Định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều thu được dung dịch chuẩn BAC nồng độ khoảng 5 mg/mL (5000 µg/mL).
- Dung dịch chuẩn BAC 1250 µg/mL: Hút chính xác 5,0 mL dung dịch BAC chuẩn 5000 µg/mL vào bình định mức 20,0 mL. Định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều thu được dung dịch chuẩn BAC nồng độ 1250 µg/mL.
- Dung dịch chuẩn BAC 125 µg/mL: Hút chính xác 1,0 mL dung dịch BAC chuẩn 1250 µg/mL vào bình định mức 10,0 mL. Định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều thu được dung dịch chuẩn BAC nồng độ 125 µg/mL.
- Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp AZH và BAC với các nồng độ bằng 50%, 75%, 100%, 125%, 150% nồng độ định lượng: Hút chính xác x mL dung dịch chuẩn 19
AZH 1000 µg/mL và x mL dung dịch chuẩn BAC 1250 µg/mL vào bình định mức 20,0 mL, định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều. Cách pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Cách pha dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp Thể tích dung dịch chuẩn đơn Bình định mức (mL) x (mL)
C%
Nồng độ AZH (µg/mL)
Nồng độ BAC (µg/mL)
50%
50
62,5
1,0
20,0
75%
75
93,75
1,5
20,0
100%
100
125
2,0
20,0
125%
125
156,25
2,5
20,0
150%
150
187,5
3,0
20,0
3.1.4. Chuẩn bị các mẫu thử thêm chuẩn a. Các mẫu thử thêm chuẩn AZH
- Chuẩn bị 03 mẫu AZH chuẩn 1000 µg/mL (chuẩn 1, chuẩn 2 và chuẩn 3): Cân chính xác khoảng 10,0 mg AZH chuẩn vào bình định mức 10,0 mL. Hòa tan và định mức vừa đủ bằng nước, được dung dịch AZH chuẩn có nồng độ khoảng 1 mg/mL (1000 µg/mL).
- Chuẩn bị 09 mẫu thử 60% AZH: Hút chính xác 1,5 mL chế phẩm (đã lọc qua màng 0,45 µm) vào bình định mức 25,0 mL.
- Thêm lượng chuẩn AZH ở mức 20%, 40%, 60% vào mẫu thử 60% AZH, mỗi nồng độ 03 mẫu. Định mức bằng nước cất, lắc đều thu được 09 dung dịch ở mức nồng độ khoảng 80%, 100%, 120%. Bảng 3.2 dưới đây mô tả cách pha các dung dịch trên.
20
Bảng 3.2. Cách pha các mẫu thêm chuẩn AZH STT
Mức nồng độ (%)
Vthử (mL)
Vchuẩn 1 (mL)
1,5
0,5
1 2
80
1,5
3
1,5
4
1,5
5
100
1,5
7
1,5
8
120
9
Vchuẩn 3 (mL)
25,0 0,5
1,0
25,0 25,0
1,0
25,0 1,0
1,5
1,5
Bình định mức (mL) 25,0
0,5
1,5
6
Vchuẩn 2 (mL)
25,0 25,0
1,5
1,5
25,0 1,5
25,0
b. Các mẫu thử thêm chuẩn BAC
- Chuẩn bị 03 mẫu BAC chuẩn 250 µg/mL (chuẩn 1, chuẩn 2 và chuẩn 3): Hút chính xác 0,5 mL dung dịch BAC chuẩn 50% vào bình định mức 50,0 mL. Định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều thu được dung dịch chuẩn BAC nồng độ 5 mg/mL (5000 µg/mL). Hút chính xác 1,0 mL dung dịch BAC chuẩn 5000 µg/mL vào bình định mức 20,0 mL. Định mức vừa đủ bằng nước, lắc đều thu được dung dịch chuẩn BAC nồng độ 250 µg/mL.
- Chuẩn bị 09 mẫu thử 60% BAC: Hút chính xác 3,0 mL chế phẩm (đã lọc qua màng 0,45 µm) vào bình định mức 5,0 mL.
- Thêm lượng chuẩn BAC ở mức 20%, 40%, 60% vào mẫu thử 60% BAC, mỗi nồng độ 03 mẫu. Định mức bằng nước cất, lắc đều thu được 09 dung dịch ở mức nồng độ khoảng 80%, 100%, 120%. Bảng 3.3. dưới đây mô tả cách pha các dung dịch trên.
21
Bảng 3.3. Cách pha các mẫu thêm chuẩn BAC STT
Mức nồng độ (%)
1 2
80
Vthử (mL)
Vchuẩn 1 (mL)
3,0
0,5
3,0
3
3,0
4
3,0
5
100
3,0
7
3,0
9
120
Vchuẩn 3 (mL)
5,0 0,5
1,0
5,0 1,0
1,5
5,0 5,0
1,5
3,0
5,0 5,0
1,0
3,0
Bình định mức (mL) 5,0
0,5
3,0
6 8
Vchuẩn 2 (mL)
5,0 1,5
5,0
3.2. Quy trình chuẩn bị dung môi pha động -
Dung dịch đệm phosphat 50 mM (không chỉnh pH): Cân chính xác khoảng 1,7010 g KH2PO4 vào cốc có mỏ, hòa tan trong nước, chuyển vào bình định mức 250,0 mL, thêm nước vừa đủ, lắc đều.
-
Dung dịch đệm phosphat 10 mM: Cân chính xác khoảng 0,3402 g KH2PO4 vào cốc có mỏ, hòa tan trong nước, thêm nước đến khoảng 200 mL, khuấy đều, chỉnh pH bằng dung dịch H3PO4 tới pH cần thiết, chuyển vào bình định mức 250,0 mL, thêm nước vừa đủ, lắc đều. Các dung dịch trên được lọc qua màng 0,45 µm và siêu âm trước khi sử dụng.
3.3. Khảo sát phương pháp 3.3.1. Lựa chọn bước sóng Tiến hành chạy sắc ký hỗn hợp chuẩn AZH và BAC, pha động là hỗn hợp ACN và đệm phosphat 10 mM, pha tĩnh là cột Vertisep GES C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) (Vertical). Quét phổ trên pic của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ 190 nm đến 400 nm thu được kết quả như trong hình 3.1.
22
A. Azelastin hydroclorid
BAC 1
BAC 2
B. Benzalkonium clorid Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV của AZH và BAC Nhận xét: Từ phổ hấp thụ của AZH và BAC nhận thấy: -
Hai pic BAC có phổ hấp thụ tương tự nhau, có cực đại hấp thụ ở bước sóng khoảng 263 nm nhưng hệ số hấp thụ rất thấp. Bên cạnh đó nồng độ BAC trong mẫu thử cũng thấp nên bước sóng 210 nm được chọn để ghi sắc ký đồ định lượng BAC nhằm cải thiện độ hấp thụ và đáp ứng pic.
-
AZH có cực đại hấp thụ ở bước sóng 290 nm, do đó lựa chọn bước sóng 290 nm định lượng AZH.
3.3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký a. Khảo sát thành phần pha động Dựa trên việc tham khảo một số nghiên cứu đã được công bố, pha động được lựa chọn gồm đệm phosphat và ACN. Tiến hành sắc ký trên cột Vertisep GES C18 (250 x 4,6 mm, 5µm) (Vertical). • Lựa chọn nồng độ đệm: Với thành phần pha động gồm đệm phosphat 50mM và ACN với tỷ lệ thể tích ACN từ 60% trở xuống, thời gian lưu của 2 chất, đặc biệt là 2 pic BAC rất dài. Do vậy, để giảm thời gian lưu của các chất phân tích, tỷ lệ thể tích ACN trong pha động được nâng lên và nồng độ đệm được giảm xuống 10 mM để hạn chế nguy cơ gây tủa. 23
• Khảo sát tỷ lệ pha động: Tỷ lệ ACN trong pha động đặc biệt ảnh hưởng đến thời gian lưu của các pic BAC. Với tỷ lệ ACN cao hơn, thời gian lưu của các pic ngắn hơn. Ở tỷ lệ ACN : đệm phosphat 10 mM = 80 : 20 (v/v), thời gian lưu của hai pic BAC được rút ngắn đáng kể tuy nhiên pic BAC 1 chưa tách ra khỏi pic tạp phía trước (Rs = 1,3). Do đó lựa chọn tỷ lệ pha động là ACN : đệm phosphat 10 mM = 75 : 25 (v/v). Một số kết quả khảo sát thành phần pha động ở bước sóng 210 nm được thể hiện trong hình 3.2.
BAC 1 BAC 2
A. ACN : đệm phosphat 10 mM = 75 : 25 (v/v)
BAC 1 BAC 2
B. ACN : đệm phosphat 10 mM = 80 : 20 (v/v) Hình 3.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động • Khảo sát pH đệm Cùng với tỷ lệ ACN, độ pH đệm cũng ảnh hưởng rất nhiều tới thời gian lưu của các pic BAC. Kết hợp việc tham khảo các nghiên cứu và khoảng pH làm việc của cột (2 – 7,5), tiến hành khảo sát pH từ 3,0 – 4,7 (dung dịch đệm phosphat 10 mM khi chưa chỉnh pH có pH 4,7). Từ kết quả thực nghiệm cho thấy, pH càng giảm thời gian lưu các chất càng giảm, tuy nhiên pic AZH (ở bước sóng 290 nm) cân xứng nhất tại pH 3,5. Dưới pH 3,5, pic AZH bị đổ đầu. Điều kiện này cũng cho kết quả thời gian phân tích ngắn và khả năng phân tách tốt. Vì vậy lựa chọn pH dung dịch đệm là 3,5.
24
210 nm, pH 3,5
BAC 1 BAC 2
BAC 1
210 nm, pH 3,3
BAC 2
290 nm, pH 3,5
AZH
AZH
290 nm, pH 3,3
Hình 3.3. Kết quả khảo sát pH đệm Như vậy, sau quá trình khảo sát, lựa chọn thành phần pha động là hỗn hợp dung môi ACN và đệm phosphat 10 mM, pH 3,5 tỷ lệ 75 : 25 (v/v). b. Khảo sát tốc độ dòng Tiến hành sắc ký trên cột Vertisep GES C18 với pha động gồm hỗn hợp ACN và dung dịch đệm phosphat (10 mM, pH 3,5), tỷ lệ 75 : 25 (v/v) với 3 tốc độ dòng khác nhau: 1,0 mL/phút; 1,1 mL/phút; 1,2 mL/phút thu được sắc ký đồ ở bước sóng 210 nm thể hiện ở hình 3.4.
25
a)
BAC 1 BAC 2
BAC 1
b)
BAC 2
c)
BAC 1 BAC 2
Hình 3.4. Kết quả khảo sát tốc độ dòng tại bước sóng 210 nm a) 1,0 mL/phút; b) 1,1 mL/phút; c) 1,2 mL/phút Từ kết quả thu được thấy rằng, tăng tốc độ dòng thì thời gian lưu của chất phân tích giảm. Tốc độ dòng 1,2 mL/phút có thời gian phân tích ngắn nhất nhưng pic BAC 1 ở bước sóng 210 nm chưa tách ra khỏi pic tạp phía trước (Rs < 1,5). Tốc độ dòng 1,0 mL/phút có thời gian phân tích dài hơn. Pic sắc ký trong cả ba trường hợp đều có hình dạng tương đương nhau. Vì vậy lựa chọn tốc độ dòng 1,1 mL/phút. 3.3.3. Khảo sát nồng độ định lượng Khảo sát chuẩn hỗn hợp AZH và BAC ở 2 ngưỡng nồng độ cùng tỷ lệ AZH : BAC = 8:1 (như tỷ lệ trong công thức chế phẩm) là AZH 1000 µg/mL – BAC 125 µg/mL và AZH 400 µg/mL – BAC 50 µg/mL. Ở mức nồng độ AZH 400 µg/mL – BAC 50 µg/mL, đáp ứng của AZH tốt, tuy nhiên diện tích và chiều cao 2 pic BAC rất nhỏ, đặc biệt pic BAC thứ hai do bị kéo đuôi nên chiều cao pic rất nhỏ (chiều cao chỉ khoảng 6 mAU), do đó không thể khảo sát được khoảng tuyến tính.
26
Ở mức nồng độ AZH là 1000 µg/mL – BAC 125 µg/mL, do nồng độ của AZH quá lớn nên đáp ứng pic xấu và độ hấp thụ không còn tuyến tính với nồng độ. Với BAC, ở nồng độ 125 µg/mL đáp ứng tốt. Như vậy, không thể định lượng AZH và BAC trên cùng một lần tiêm. Tỷ lệ nồng độ AZH và BAC trong chế phẩm là 8:1, AZH hấp thụ quang mạnh hơn BAC rất nhiều nên khi sử dụng nồng độ BAC lớn để định lượng thì nồng độ AZH quá lớn, diện tích không còn tuyến tính với nồng độ. Ngược lại, khi nồng độ AZH đủ nhỏ thì nồng độ BAC lại quá nhỏ, không thể khảo sát khoảng tuyến tính. Khảo sát thêm nồng độ định lượng AZH 100 µg/mL, thấy đường chuẩn đạt yêu cầu và lượng mẫu chuẩn sử dụng ít hơn so với nồng độ 400 µg/mL. Như vậy, lựa chọn nồng độ định lượng của AZH là 100 µg/mL và BAC là 125 µg/mL. 3.4. Phương pháp phân tích đồng thời AZH và BAC Từ kết quả thực nghiệm trên, xây dựng phương pháp phân tích AZH và BAC như sau: - Chuẩn bị mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ AZH 100 µg/mL, BAC 125 µg/mL và mẫu thử như mục 3.1. - Điều kiện sắc ký: + Pha tĩnh: Cột Vertisep GES C18 (250 x 4,6 mm, 5µm). + Pha động: hỗn hợp ACN : đệm phosphat (10 mM, pH 3,5) = 75 : 25 (v/v). + Tốc độ dòng: 1,1 mL/phút. + Bước sóng phát hiện: 290 nm đối với AZH và 210 nm đối với BAC. + Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. Nồng độ benzalkonium clorid trong mẫu thử được tính toán dựa vào tổng diện tích các pic BAC 1 và BAC 2 thu được trên sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn benzalkonium clorid. 3.5. Thẩm định phương pháp 3.5.1. Độ thích hợp hệ thống (system suitability) Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp AZH và BAC 100% như mục 3.1. Tiến hành sắc ký lặp lại 06 lần như mục 3.4, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Kết quả độ ổn định hệ thống được thể hiện ở bảng 3.4. 27
Bảng 3.4. Kết quả độ ổn định hệ thống Azelastin hydroclorid
Benzalkonium clorid
STT tR (phút)
S (mAU.s)
tR1 (phút)
S1 (mAU.s)
tR2 (phút)
S2 Stổng (mAU.s) (mAU.s)
1
3,129
2037,4
8,530
1962,7
14,869
1024,6
2987,3
2
3,119
2034,6
8,434
1979,3
14,740
1026,7
3006,0
3
3,119
2036,1
8,463
1961,2
14,763
1025,4
2986,6
4
3,116
2039,9
8,456
1963,6
14,722
1022,6
2986,2
5
3,111
2043,9
8,453
1967,3
14,692
1036,7
3004,0
6
3,093
2051,5
8,365
1982,5
14,463
1042,1
3024,6
TB
3,115
2040,6
8,450
1969,4
14,708
1029,7
2999,1
SD
0,012
6,3
0,053
9,2
0,134
7,8
15,4
RSD (%)
0,4
0,3
0,6
0,5
0,9
0,8
0,5
Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các thông số thời gian lưu đều dưới 1,0% và diện tích pic đều dưới 2,0%. Kết luận: Phương pháp đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ thích hợp hệ thống với AZH và BAC. 3.5.2. Độ chọn lọc (selectivity) Chuẩn bị các mẫu như mục 2.4.4 và pha theo quy trình như mục 3.1, tiến hành sắc ký như mục 3.4. Kết quả độ chọn lọc được thể hiện trong hình 3.5.
290 nm
210 nm
A. Sắc ký đồ mẫu trắng
28
AZH
210 nm
290 nm AZH
BAC 1 BAC 2
B. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp AZH
210 nm AZH
290 nm
BAC 1 BAC 2
C. Sắc ký đồ mẫu thử Hình 3.5. Sắc ký đồ kết quả độ chọn lọc Nhận xét: -
Trên sắc ký đồ chuẩn AZH ở bước sóng 290 nm xuất hiện pic ở 3,131 phút. Độ tinh khiết của pic AZH bằng 999,997.
-
Trên sắc ký đồ chuẩn BAC ở bước sóng 210 nm xuất hiện pic lần lượt ở 8,680 và 15,452 phút. Độ tinh khiết của hai pic BAC lần lượt bằng 999,890 và 999,698.
-
Trên sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp, có pic hai chất ứng với thời gian lưu với pic trong chuẩn đơn thành phần.
-
Trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu và nền mẫu tự tạo không có pic tại thời gian tương ứng thời gian lưu của hai chất phân tích trong mẫu chuẩn hỗn hợp và chuẩn đơn từng chất.
-
Trên sắc ký đồ mẫu thử có pic tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của hai chất trong dung dịch chuẩn hỗn hợp của AZH và BAC. Hệ số chồng phổ của AZH là 999,997; của hai pic BAC lần lượt là 999,064 và
29
999,818. Các pic được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn, có pic tạp trước pic của AZH nhưng Rs của pic AZH và các pic tạp > 1,5. Kết luận: Phương pháp đã khảo sát đạt tiêu chuẩn về độ chọn lọc với AZH và BAC. 3.5.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính (linearity) Chuẩn bị các mẫu như mục 2.4.4 và pha theo quy trình như mục 3.1, tiến hành sắc ký như mục 3.4. Bảng 3.5 dưới đây thể hiện nồng độ và diện tích pic của AZH và BAC. Bảng 3.5. Kết quả khảo sát đường chuẩn Azelastin hydroclorid
Benzalkonium clorid Diện tích pic (mAU.s)
Nồng độ (µg/mL)
Diện tích pic (mAU.s)
Nồng độ (µg/mL)
BAC 1
BAC 2
Tổng
52,50
1044,0
62,50
912,3
446,6
1358,9
78,75
1501,0
93,75
1462,4
735,1
2197,5
105
1964,8
125
1859,6
967,5
2827,1
131,25
2515,3
156,25
2287,4
1186,5
3473,7
157,50
3044,4
187,50
2764,4
1472,4
4236,8
3500
Diện tích (mAU.s)
3000
y = 19.105x + 7.86 R² = 0.9983
2500 2000 1500 1000 500 0 0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Nồng độ (µg/mL) Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của azelastin hydroclorid 30
4500
Diện tích pic (mAU.s)
4000
y = 22.503x + 5.96 R² = 0.9976
3500 3000 2500
2000 1500 1000 500 0 0
50
100
150
200
Nồng độ (µg/mL) Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của benzalkonium clorid Nhận xét: Từ đồ thị ta thấy, trong khoảng nồng độ khảo sát, sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic khảo sát như sau: - Azelastin hydroclorid: tuyến tính trong khoảng nồng độ 52,5 – 157,5 µg/mL, hệ số tương quan r = 0,999; hệ số chắn tại nồng độ 100%: Y = 0,40% (< 2,0%). - Benzalkonium clorid: tuyến tính trong khoảng nồng độ 62,5 – 187,5 µg/mL, hệ số tương quan r = 0,999; hệ số chắn tại nồng độ 100%: Y = 0,21% (< 2,0%). Kết luận: Phương pháp đã khảo sát có khoảng tuyến tính với AZH và BAC đạt yêu cầu. 3.5.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) LOD và LOQ của BAC được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) của pic BAC 2. Dựa trên đáp ứng pic của mẫu chuẩn 50% và mẫu trắng, tính tỷ lệ S/N), từ đó ước lượng khoảng nồng độ LOD và LOQ của AZH và BAC. Chuẩn bị mẫu tại khoảng nồng độ ước lượng và tiến hành sắc ký như mục 3.4. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
31
Bảng 3.6. Kết quả xác định LOD và LOQ LOD (µg/mL)
S/NLOD
LOQ (µg/mL)
S/NLOQ
AZH
1,2
3,5
4,0
12
BAC
15,0
3
50,0
10
3.5.5. Độ chụm của phương pháp (precision) Chuẩn bị các mẫu như mục 2.4.4 và pha theo quy trình như mục 3.1, tiến hành sắc ký như mục 3.4. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày
1
2
SBAC (mAU.s)
SAZH (mAU.s)
Tổng
% HL AZH
% HL BAC
BAC 1
BAC 2
1
2021,7
2078,2
718,6
2796,8
108,3
98,2
2
2013,1
2080,1
731,4
2811,5
107,9
98,7
3
2003,2
2111,7
723,6
2835,3
107,4
99,4
4
2007,0
2105,7
717,7
2823,4
107,6
99,0
5
2009,9
2141,3
752,3
2893,6
107,7
101,3
6
2007,8
2125,6
742,5
2868,1
107,6
100,5
TB1 (n = 6)
107,8
99,5
RSD1 (%)
0,3
1,2
Ngày STT
1
1944,2
2051,6
760,7
2812,3
102,9
99,8
2
2031,1
2066,8
750,3
2817,1
107,6
99,9
3
2021,7
2067,8
777,3
2845,1
107,1
100,9
4
2030,8
2062,6
791,7
2854,3
107,6
101,3
5
2042,1
2056,6
761,5
2818,1
108,2
100,0
6
2048,2
2066,1
741,8
2807,9
108,5
99,6
TB2 (n = 6)
107,0
100,2
RSD2 (%)
1,9
0,7
TB (n = 12)
107,4
99,9
RSD (%)
1,4
1,0
Nhận xét: RSD của hàm lượng AZH và BAC ở 6 mẫu độ lặp lại trong ngày và 12 mẫu độ lặp lại khác ngày đều không lớn hơn 2,0%. 32
Kết luận: Phương pháp khảo sát có độ lặp lại tốt với AZH và BAC. 3.5.6. Độ đúng (trueness) Chuẩn bị các mẫu như mục 2.4.4 và pha theo quy trình như mục 3.1, tiến hành sắc ký như mục 3.4. Kết quả độ thu hồi được trình bày ở bảng 3.8 và 3.9. Bảng 3.8. Kết quả độ đúng của AZH STT
CAZH thêm (µg/mL)
S (mAU.s)
CAZH thu hồi (µg/mL)
% thu hồi (%)
1
30,18
1598,3
29,3
97,2
2
31,38
1631,2
31,1
99,0
3
31,50
1634,9
31,3
99,2
4
50,30
2003,7
50,6
100,5
5
52,30
2019,3
51,4
98,2
6
52,50
2038,6
52,4
99,8
7
70,42
2405,0
71,6
101,6
8
73,22
2405,8
71,6
97,8
9
73,50
2433,2
73,0
99,4
Trung bình (%)
RSD (%)
98,5
1,1
99,5
1,2
99,6
1,9
Trung bình (%)
RSD (%)
101,9
0,4
99,3
1,3
98,1
0,2
Bảng 3.9. Kết quả độ đúng của BAC STT
CBAC thêm (µg/mL)
Stổng (mAU.s)
CBAC thu hồi (µg/mL)
% Thu hồi (%)
1
25,0
2224,2
25,6
102,3
2
25,0
2222,0
25,5
101,9
3
25,0
2219,8
25,4
101,5
4
50,0
2773,6
50,0
100,0
5
50,0
2776,0
50,1
100,2
6
50,0
2749,6
48,9
97,8
7
75,0
3304,1
73,6
98,1
8
75,0
3309,1
73,8
98,4
9
75,0
3202,1
73,5
98,0
Nhận xét: Độ thu hồi của AZH và BAC nằm trong khoảng 98 – 102% và RSD tại 3 mức nồng độ 80%, 100%, 120% đều nhỏ hơn 2,0%. 33
Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng trong khoảng nồng độ khảo sát với AZH và BAC. 3.6. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm thuốc xịt mũi trên thị trường Tiến hành: Chuẩn bị 3 mẫu thử độc lập với nhau từ chế phẩm Nozeytin (số lô SX: 004/19) và mẫu chuẩn 100% như mục 3.1 và chạy sắc ký với điều kiện như mục 3.4. Yêu cầu: Hàm lượng azelastin hydroclorid: Do chế phẩm không có chuyên luận
-
trong bất kỳ dược điển nào vì vậy áp dụng giới hạn hàm lượng thường được quy định với hoạt chất trong thuốc xịt mũi, tức là từ 90,0% đến 110,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn. Hàm lượng benzalkonium clorid: Nằm trong giới hạn thường được quy
-
định với chất bảo quản kháng khuẩn, tức là từ 80,0% đến 120,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn [2]. Kết quả: Kết quả định lượng của azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid được trình bày trong bảng 3.10 và 3.11. Bảng 3.10. Kết quả định lượng azelastin hydroclorid trong chế phẩm STT
mAZH chuẩn (mg)
HL chuẩn (%)
Sthử Schuẩn (mAU.s) (mAU.s)
1
HLAZH (%)
2021,7
2
10,5
99,4
2003,2
3
108,3 1948,6
2009,9
107,4 107,7
TB
107,8
Bảng 3.11. Kết quả định lượng benzalkonium clorid trong chế phẩm STT
Cchuẩn (mg/mL)
1 2 3
0,125
Sthử (mAU.s) BAC 1
BAC 2
Tổng
2068,3
718,6
2786,9
2102,0
723,6
2825,6
2089,7
752,3
2842,0
TB
Schuẩn (mAU.s)
HLBAC (%) 99,5
2801,4
100,9 101,4 100,6
34
Nhận xét: Hàm lượng azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong chế phẩm Nozeytin (số lô SX: 004/19) đều nằm trong khoảng giới hạn cho phép. Kết luận: Chế phẩm đạt yêu cầu về hàm lượng hoạt chất và giới hạn chất bảo quản kháng khuẩn theo tiêu chuẩn thường được quy định.
35
BÀN LUẬN Nghiên cứu này đã xây dựng và thẩm định một phương pháp phân tích đơn giản, hiệu quả và chính xác, sử dụng kỹ thuật HPLC để định lượng được đồng thời AZH và BAC trong thuốc xịt mũi. Các phương pháp định lượng đồng thời AZH và BAC trước đây của Hassouna [18] và Rao [15] sử dụng pha tĩnh là cột sắc ký CN, pha động gồm đệm phosphat 50 mM và ACN. So với cột CN, nghiên cứu sử dụng cột C18 thông dụng và ổn định hơn, pha động sử dụng nồng độ đệm phosphat thấp hơn, do đó an toàn hơn cho hệ thống. Dung môi pha mẫu sử dụng nước cất, đơn giản và thuận tiện hơn so với việc sử dụng dung môi là pha động hay hỗn hợp ACN : nước. Phương pháp xây dựng có khoảng tuyến tính khá rộng, do đó thích hợp để áp dụng định lượng đồng thời AZH và BAC trong các chế phẩm tương tự trên thị trường. Ngoài ứng dụng định lượng BAC toàn phần, phương pháp có thể sử dụng để xác định tỷ lệ các thành phần alkyl trong BAC dựa vào tỷ lệ diện tích giữa các pic, qua đó tính được hàm lượng của từng thành phần.
36
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Từ kết quả nghiên cứu có thể đưa ra một số kết luận như sau: - Nghiên cứu đã xây dựng được phương pháp định lượng azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid: + Pha tĩnh: Cột Vertisep GES C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) (Vertical). + Pha động: Hỗn hợp ACN : đệm phosphat (10 mM, pH 3,5) = 75 : 25 (v/v). + Tốc độ dòng: 1,1 mL/phút. + Bước sóng phát hiện: 290 nm đối với AZH và 210 nm đối với BAC. + Thể tích tiêm mẫu: 20 µL. + Nồng độ định lượng: AZH 100 µg/mL và BAC 125 µg/mL. - Đã thẩm định phương pháp với các tiêu chí theo hướng dẫn của ICH. - Định lượng trên chế phẩm thuốc xịt mũi Nozeytin hàm lượng AZH 1 mg/mL và BAC 0,125 mg/mL: đạt về hàm lượng hoạt chất và giới hạn chất bảo quản kháng khuẩn theo tiêu chuẩn thường được quy định. 2. Kiến nghị Dựa trên kết quả nghiên cứu, tôi xin đưa ra một vài đề xuất như sau: - Tiến hành thẩm định thêm tiêu chí độ ổn định của phương pháp. - Khảo sát tăng tính cân xứng của pic BAC bằng cách thêm triethylamin vào pha động. Triethylamin sẽ liên kết với một số vị trí hoạt động trên bề mặt silica nên ngăn cản lưu giữ chất phân tích ở các vị trí đó. - Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới thời gian lưu. Tăng nhiệt độ cột làm giảm thời gian lưu và do đó làm giảm lượng dung môi pha động cần dùng, thậm chí có thể giảm tỷ lệ ACN trong pha động, tiết kiệm chi phí. - Áp dụng phương pháp để định lượng trên các lô khác của chế phẩm thuốc xịt mũi Nozeytin. - Kết quả nghiên cứu có thể được áp dụng như một phương pháp tham khảo, từ đó xây dựng phương pháp định lượng đồng thời azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid phù hợp điều kiện kỹ thuật của từng cơ sở nghiên cứu.
37
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 1, NXB Y học, Hà Nội, tr.135. 2. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr.PL-21, PL-238. 3. Bộ Y tế (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội, tr.88-91. 4. Bộ Y tế (2012), Hóa phân tích tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr.181-188. 5. Lê Đình Chi, Phạm Thị Hiền, Dương Minh Tân, Lê Quang Thảo (2018), “Xác định hàm lượng benzalkonium clorid trong chế phẩm dung dịch xịt mũi bằng kỹ thuật HPLC”, Tạp chí Dược học, 512, tr.80-83. 6. Phan Thị Thùy Chi, Phạm Thị Hà, Lê Thị Thiên Hương, Trần Việt Hùng (2014), “Định lượng benzalkonium clorid trong thuốc xịt mũi Medimax-F bằng phương pháp HPLC”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, 12(43), tr.7-10. Tiếng Anh 7. A. A. Gouda, R. ElSheikh, H. ElSaied (2015), “Extractive Spectrophotometric Determination of Azelastine Hydrochloride in Pure Form and Pharmaceutical Formulations”, Canadian Chemical Transactions, 3(1), pp.29-41. 8. A. Chyła, E. Zelazowska (1999), “Using of thin-layer chromatography for identification and quantitative determination of benzalkonium chloride in eye drops”, Acta Poloniae Pharmaceutica, 56(6), pp.419-423. 9. Al Aani H., Al Nukkary Y. (2016), “Determination of benzalkonium chloride in ophthalmic solutions by stabilityindicating HPLC method: Application to a stability study”, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 6(5), pp.80-89. 10. Boovizhikannan Thangabalan, Palanirajan Vijayaraj kumar (2012), “RP-HPLC determination of azelastine in pure and in ophthalmic formulation”, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 17(2), pp.62-64. 11. British Pharmacopoeia (2013). 12. J.K.Aronson (2006), Meyler’s Side Effects of Drugs (15th edition), pp.387-421. 13. Jure Zakrajsek, Vladimir Stojic, Simona Bohanec and Uros Urleb (2015), “Quality by Design Based Optimization of a High Performance Liquid
Chromatography Method for Assay Determination of Low Concentration Preservatives in Complex Nasal Formulations”, Acta Chimica Slovenica, 62, pp.72-82. 14. K. Kova´cs-Hadady, I. Fa´bia´n (1998), “The determination of benzalkonium chloride in eye-drops by difference spectrophotometry”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 16, pp.733–740. 15. K. Lakshmi Narasimha Rao, K. Padmaja Reddy, K. Sudheer Babu, K. Soloman Raju, K. Visweswara Rao, Jafer Vali Shaik (2010), “Simultaneous Estimation of Fluticasone propionate, Azelastine Hydrochloride, Phenylethyl alcohol and Benzalkonium chloride by RP-HPLC Method in Nasal spray premetations”, International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences, 1(4), pp.473-480. 16. H. A. Merey, S. S. El-Mosallamy, N. Y. Hassan, B. A. ElZeany (2016), “Simultaneous determination of Fluticasone propionate and Azelastine hydrochloride in the presence of pharmaceutical dosage form additives”, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 160. 17. Hassouna M. E. M., Abdelrahman M. M., Mohamed M. A. (2017), “Determination of Azelastine Hydrochloride and Benzalkonium Chloride in Their Ophthalmic Solution by Different Spectrophotometric Methods”, World Journal of Applied Chemistry, 2(2), pp.48-56. 18. Hassouna M. E. M., Abdelrahman M. M., Mohamed M. A. (2017), “Simultaneous determination of Azelastine hydrochloride and benzalkonium chloride by RP-HPLC method in their ophthalmic solution”, Journal of Forensic Science and Criminal Investigation, 1(3), 555565. 19. ICH (1996), Q2B Validation of Analytical Procedures: Methodology. 20. Mallik, R., Raman, S., Liang, X., Grobin, A. W., & Choudhury, D. (2015), “Development and validation of a rapid ultra-high performance liquid chromatography method for the assay of benzalkonium chloride using a quality-by-design approach”, Journal of Chromatography A, 1413. 21. M. R. Elghobashy, O. M. Badran, M. Y. Salem, K. M. Kelani (2014), “Stability indicating spectrophotometric and chromatographic methods for the
determination of azelastine hydrochloride in presence of its alkaline degradant”, Analytical Chemistry: An Indian Journal, 14(4), pp.135-142. 22. N. N. Salama, S. A. Abdel-Razeq, S. Abdel-Atty, N. El-Kosy (2014), “Development
and
validation of densitometry TLC stability indicating
method for quantitative determination of azelastine hydrochloride and emedastine difumarate in their drug products”, British Journal of Pharmaceutical Research, 4(1), pp.79-92. 23. Pratik Kumar Gupta, Vibha Chaturvedi (2017), “An Analytical Study for Development and Validation of Method for Estimation of Total Benzalkonium chloride Content as a Preservative in Azelastine hydrochloride Pharmaceutical Ophthalmic
Formulation
by
Reverse
Phase
Liquid
Chromatography
Approach”, International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research, 9(5), pp.268-274. 24. Poonam D. Dighe, Vijay S. Wakale, Dama.G.Y, Shridhar S. Shejwal, Kiran K.Shinde, Arshu. P. Patel, Soniya S. Satpute (2019), “Assay Method Development and Validation for Simultaneous Estimation of Mometasone Furoate and Azelastine HCL for Nasal Spray by RP-HPLC”, MAT Journals, 1(2). 25. R. Dubey, S. Das, S. Roychowdhury, K. K. Pradhan, M. Ghosh (2013), “Validated HPTLC Method for the Determination of Azelastine hydrochloride in Bulk Drug and Dosage Form”, PHARMBIT, 27(1), pp.9-11. 26. S. A. Abdel-Razeq, M. M. Foaud, N. N. Salama, S. Abdel-Atty, N. El-Kosy (2011), “Voltammetric Determination of Azelastine-HCl and Emedastine Difumarate in Micellar Solution at Glassy Carbon and Carbon Paste Electrodes”, Sensing in Electroanalysis, 6, pp.289-305. 27. S. A. Abdel-Razeq, N. N. Salama, S. Abdel-Atty, N. El-Kosy (2012), “Thermoanalytical study and purity determination of azelastine hydrochloride and emedastine difumarate”, Pharmaceutica Analytica Acta, 3(8), 1000176. 28. Sweetman SC (2007), Martindale: The Complete Drug Reference (36th edition), Pharmaceutical Press London, UK, pp.568-1629. 29. The United States Pharmacopoeia (2017), USP40 – NF 35.
30. Y. H. Hou, C. Y. Wu, W. H. Ding (2002), “Development and validation of a capillary zone electrophoresis method for the determination of benzalkonium chlorides in ophthalmic solutions�, Journal of Chromatography A, 976(1-2), pp.207-213.
PHỤ LỤC Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống ở bước sóng 210 nm AZH
BAC 1
Lần 1 BAC 2
AZH
Lần 2
BAC 1 BAC 2
AZH
BAC 1
Lần 3 BAC 2
AZH
Lần 4
BAC 1 BAC 2
AZH
Lần 5
BAC 1 BAC 2
AZH
BAC 1
Lần 6 BAC 2
Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống ở bước sóng 290 nm AZH
AZH
AZH
AZH
AZH
AZH
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lần 4
Lần 5
Lần 6
Sắc ký đồ đường chuẩn của BAC ở bước sóng 210 nm 50%
AZH
BAC 1 BAC 2
75%
AZH BAC 1 BAC 2
100%
AZH BAC 1 BAC 2
AZH
125% BAC 1 BAC 2
AZH
150%
BAC 1 BAC 2
Sắc ký đồ đường chuẩn của AZH ở bước sóng 290 nm 50%
AZH
75% AZH
100% AZH
AZH
AZH
125%
150%