PROTOCOLO EXPERIMENTAL PARA A DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE ANTIOXIDANTE 1. Introdução Nos últimos anos têm sido criados diversos métodos que permitem fazer o estudo do potencial antioxidante de amostras biológicas. A investigação nesta área tem como principal objectivo encontrar fontes de compostos químicos cuja inclusão na dieta seja factor de redução na incidência algumas doenças que nos afectam, como a aterosclerose e o cancro. Os que são mais utilizados envolvem a geração de radicais cuja concentração é seguida, à medida que são sujeitos à acção do antioxidante. O procedimento apresentado utiliza o 2,2-difenil-1picrilhidrazil (DPPH) como fonte dos radicais, cuja redução é monitorizada com recurso à espectrofotometria. Tal é possível porque as soluções deste radical apresentam uma cor púrpura intensa, que desaparece após a sua redução. Nos estudos de actividade anti-radicalar, quanto maior for a concentração da amostra necessária para capturar os radicais, menor é a sua capacidade antioxidante. O procedimento experimental descrito foi utilizado para estudar a actividade antioxidante de diversas amostras de mel, no âmbito de um projecto desenvolvido num clube de ciência, mas também é possível aplicá-lo na disciplina de Física e Química (ensino secundário), quando se abordam assuntos como os radicais livres e as reacções de oxidação-redução. O projecto referido foi apresentado no XIII Encontro de Jovens Investigadores, que teve lugar em Março de 2007, em Odemira (http://users.prof2000.pt/ceciencia/Projectos/Poster_Activid_ Antioxidante_Mel.pdf) e na final do concurso internacional “Ciencia em Acción 2008”, em Valladolid, evento destinado a professores de países cuja língua oficial seja o espanhol ou o português, tendo obtido o 1º lugar em ambos. Foi ainda apresentado no II Congresso Ibérico do Castanheiro, que decorreu entre 20 e 22 de Junho de 2007, em Vila Real, sob a forma de comunicação em painel (http://www.scribd.com/doc/29200511).
2. Material necessário - amostra a analisar (solução de mel, sumo de fruta, extracto de uma planta) - 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) - etanol a 70% - pipetas (1ml/2ml) - balança - espectrofotómetro
- tubos de ensaio e respectivo suporte - cubas de espectofotometria
3. Procedimentos A 0,75 ml de cada uma das amostras a testar são adicionados 1,5 ml de solução etanólica de DPPH (0,02 mg/ml). Após 15 min., as absorvâncias são determinadas a 517 nm, contra um branco de etanol. A actividade antioxidante é calculada da seguinte forma: % Inibição = [(Absorvância do branco – Absorvância da amostra)/ Absorvância do branco] x 100, em que o branco consiste na solução de DPPH à qual é adicionada apenas a quantidade de solvente que é utilizada como veículo da amostra.
Fig. 1 - Ensaio de determinação da actividade antioxidante de uma amostra de mel, em diferentes concentrações (maior concentração à esquerda, menor à direita).
4. Bibliografia Blois, M.S. (1952). Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature, 181, 1199–1200. Kähkönen, M. P., Hopia, A. I., Vuorela, H. J., Rauha, J.-P., Pihlaja, K., Kujala, T. S. & Heinonen, M. (1999). Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 47, 3954-3962. Küçük, M.; Kolayli, S.; Karaoglu, S.; Ulusoy, E.; Baltaci, C. & Candan, F. (2007). Biological activities and chemical composition of three honeys of different types from Anatolia. Food Chemistry, 100, 526-534. Meda, A., Lamien, C. E., Romito, M., Millogo, J. & Nacoulma, O. G. (2005). Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity. Food Chemistry, 91, 571-577.
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