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Prozesstechnik

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Experience for the Future

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Alles eine Frage der Technik Seit Jahren befindet sich der Markt für die Produktion von Biologika im Aufwind. Das Wachstum kann jedoch nicht darüber hinwegtäuschen: Kosten- und Innovationsdruck in der Branche sind immens.

Goldene Zeiten könnten den Biopharmazeutika-Herstellern bevorstehen, wenn Marktanalysten recht behalten. Im vergangenen Jahr lag das globale Marktvolumen bei knapp 200 Mrd. US-Dollar, hat das USamerikanische Research-Unternehmen Reportbuyer ermittelt. In den kommenden Jahren sollen die Umsätze um mehr als 13% jährlich steigen, 2020 schließlich mehr als 497 Mrd. US-Dollar erreichen. Auch in Deutschland sind die Biopharmazeutika auf dem Vormarsch. Die Entwicklungspipeline an Biotech-Arzneien umfasst inzwischen 556 biotechnologisch hergestellte Wirkstoffe, berichtete die Boston Consulting Group in ihrem jüngsten Report „Medizinische Biotechnologie in Deutschland 2013“. Damit waren 2012 rund 8% mehr Biologika in der klinischen Entwicklung als im Vorjahr. Die meisten Projekte werden zunächst von Biotech-Unternehmen vorangetrieben und später von Pharma-Unternehmen einlizenziert, um Lücken in der eigenen Arzneimittel-Pipeline aufzufüllen.

Pharma setzt auf Dienstleister Beste Zeiten also für Lohnhersteller (Contract Manufacturing Organisations, CMOs) und Ausrüster für die Bioprozesstechnik. Sie ersparen den Medikamentenentwicklern in der chronisch unterfinanzierten Biotech-Branche den teuren und langwierigen Aufbau eigener Produktionsanlagen. Und auch die deutlich finanzkräftigeren Pharmakonzerne verlassen sich zunehmend auf Dienstleister, wenn es um die Herstellung von Arzneien geht. Die Pharmafirmen stehen wegen auslaufender Blockbusterpatente, Konkurrenz durch Biosimilars und zunehmender regulatorischer Anforderungen unter immensem Kostendruck. Da ist das Outsourcing ein probates Mittel, um sich dessen zu erwehren. Der Trend zum Dienstleister dürfte sich in Zukunft noch weiter verstärken, prognostiziert eine Studie von Frost & Sullivan. Demnach steigt der Anteil der Pharmaaufträge an den Um-

Bild: BASF SE

Bestehen können nur Spezialisten, die sich ständig verbessern und immer wieder neu erfinden.

sätzen der Lohnhersteller bis 2018 auf 50%. Derzeit liegt er um 25%. Ein weiterer Vorteil: „Viele CMOs bieten Biomanufacturing-Plattformen mit vorhersehbarer Leistung“, weiß David Valentine von Lonza zu berichten. Das erleichtert die Kalkulation. Tatsächlich steht an deren Ende oft die Erkenntnis: Hochleistungs-Expressionssysteme sind der schnellste und kosteneffizienteste Weg zum Produkt. Indes: Auf ihren Lorbeeren ausruhen können sich die Lohnhersteller nicht. Viele der Kunden geben den eigenen Kostendruck ungefiltert an den jeweiligen Dienstleister weiter. Sie verlangen, schneller und flexibler zu produzieren und durch Wartung und Instandsetzung verursachte Ausfallzeiten zu minimieren.

Einwegprodukte weiter im Trend Ein Weg, die Forderung nach weiteren Kostensenkungen in der Lohnherstellung von Biopharmazeutika zu erfüllen, könnten Einweg-Produkte sein. Seit einigen Jahren wächst der Markt rasant. Laut einer Umfrage von BioPlan Associates werden mit ihnen weltweit bereits 650 Mio. US-Dollar umgesetzt – davon allein 500 Mio. USDollar in Forschung und Entwicklung. Doch drängen die Systeme zunehmend auch in

den Bereich der GMP-Produktion. Die Einwegsysteme flexibilisieren nicht nur die Arbeitsabläufe, gerade im Hinblick auf die Sterilisierung. Zum Beispiel bieten sie nach Produktionswechseln auch echte Kostenvorteile. Bisher werden die Einwegkomponenten vor allem bei kleinen und mittleren Volumina eingesetzt – und liegen damit offenbar voll im Trend. Dank steigender Produktausbeuten erwarten Experten, dass der Bedarf für sehr große Anlagen im Maßstab von 10.000 oder 15.000 Litern künftig weiter sinken wird. Typische „Nichebuster“ – Produkte, die in einem sehr begrenzten Markt hohe Umsätze erzielen – würden häufig schon auf wesentlich kleineren 2.000- oder 5.000-Liter-Systemen GMP-gerecht für den kommerziellen Einsatz gefertigt werden. Noch können solche Systeme aber nicht überall eingesetzt werden, berichtet Thomas Maier von Wacker Biotech: „Die Technologie für die mikrobielle Fermentation ist noch nicht ausgereift. Es sind im Moment noch keine geeigneten Einwegprodukte auf dem Markt, mit denen der hohe Sauerstoffbedarf, der bei der mikrobiellen Hochzelldichte-Fermentation notwendig ist, sichergestellt werden kann.“ Werden diese technischen Hürden überwunden, so dürfte dem Markt für Einwegsysteme weiteres Wachstum beschieden sein. L b.kaltwasser@biocom.de

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PROTEINTHERAPEUTIKA

Zwischen Plattformtechnik und individuellem Prozess Bei der Herstellung von Proteintherapeutika sind heute mehr denn je zeit- und kostengünstige Techniken gefragt. Von Dr. Alexander Faude, Dr. Dethardt Müller, Dr. Stefan Schmidt, Dr. Birgit Schwab, Rentschler Biotechnologie GmbH. Innovative Proteintherapeutika stehen heute im Fokus vieler Biotech- und Pharmafirmen. Eine wichtige Rolle spielen dabei monoklonale Antikörper und Fc-Fusionsproteine. Diese Substanzklassen sind bereits vielfach am Markt erfolgreich und dominieren auch die klinischen Biopharma-Entwicklungspipelines. Sie werden gewöhnlich als einfache Antagonisten und meistens in der Tumor therapie eingesetzt. Um ein größeres Spektrum von Wirkmechanismen zu realisie-

ren, werden zunehmend weitere Proteinformate entwickelt. Dazu gehören zum Beispiel multispezifische und multifunktionale Antikörper-Fragmente oder neuartige Fusionsproteine. Sie können simultan mehrere Zelloberflächenrezeptoren hemmen oder verschiedene Liganden gleichzeitig blockieren, aber auch unterschiedliche Rezeptoren vernetzen oder T-Zellen in unmittelbarer Nähe von Tumorzellen rekrutieren [1]. Dem zugrunde liegt eine große Bandbreite ver-

schiedener Molekültypen, denen ein gleichartiges Element wie der Fc-Teil fehlt. Für die Herstellung dieser Therapeutika, die zum großen Teil mit Hilfe von Zellkulturen produziert werden, sind heute mehr denn je kosten- und zeiteffiziente Technologien gefragt. Dies gilt insbesondere für die Aufreinigung solcher komplexen Produkte, in die nach wie vor ein Großteil der Herstellungskosten fließt. Da die Kosten im Falle eines Prozessausfalls rasant steigen, je näher man dem reinen Wirkstoff kommt, ist neben der Effizienz vor allem eine verlässliche Robustheit in allen Prozessschritten gefordert.

Bild: Rentschler

Aufreinigung monoklonaler Antikörper und Fc-Fusionsproteine

Abb. 1: Vergleich von Downstream-Processing-Varianten. A: Plattformprozess für monoklonale Antikörper und Fc-Fusionsproteine mit drei Chromatographieschritten. B: Individueller Aufreinigungsprozess für ein glykosyliertes non-Fc-Fusionsprotein mit vier Chromatographieschritten. Die Chromatographieschritte sind blau dargestellt.

Bei der Aufreinigung von Proteinen aus dem Zellkulturüberstand ist die Frage nach dem Vorhandensein eines Fc-Teils entscheidend. Für monoklonale Antikörper und Fc-Fusionsproteine lassen sich auf Grund dieser strukturellen Gemeinsamkeit Plattformprozesse etablieren, in denen die verwendeten Trennmedien, Filter, Prozesslösungen und Anlagen weitestgehend standardisiert und charakterisiert sind. Dadurch reduziert sich die Prozessentwicklungszeit. Die Vorbereitung und Durchführung einer Produktion unter Good Manufacturing Practice (GMP)-Bedingungen sind schnell und kosteneffizient zu realisieren. Die bei Rentschler etablierte Prozessplattform umfasst verschiedene Chromatographie- und Filtrationsschritte (Abbildung 1A). Zur Ankonzentrierung des Wirkstoffes und Reduzierung prozessbedingter Verunreinigungen wie Wirtszellproteine, -DNA, Produktionsmedienbestandteile und Metabolite wird die Affinitätschromatographie mittels Protein A eingesetzt. Mit diesem Capture-Schritt wird ein Großteil der nötigen Aufreinigungsarbeit geleistet. Itranskript I Nr. 3 I 20. Jahrgang 2014

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Bild: Rentschler

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Abb. 2: Produktionsübersicht über den Plattformprozess

Nach Virusinaktivierung über pH-Absenkung und anschließender Tiefenfiltration zur Abtrennung ausgefällter Substanzen und unerwünschter Partikel erfolgt die weitergehende sequenzielle Aufreinigung über Anionenaustausch- und Kationenaustauschchromatographie. Hierbei liegt der Fokus vor allem auf der Reduzierung von produktbezogenen (Aggregate, Fragmente) und prozessbezogenen Verunreinigungen (Wirtszellproteine, DNA). Neben der sich anschließenden Nanofiltration tragen die Virusinaktivierung und die Anionenaustauschchromatographie zur Virussicherheit des Wirkstoffes bei. Durch die finale Ultra-/ Diafiltration wird das Produkt konzentriert und durch Umpufferung in eine geeignete Matrix überführt. Nach einer Keimreduktionsfiltration kann es stabil gelagert werden. Mit diesem Prozess wird in den meisten Fällen eine Ausbeute von mehr als 70% erzielt (Abbildung 2). Die bei Rentschler vorhandenen Anlagen ermöglichen eine Aufreinigung von bis zu 3.600 Litern Zellkultur-Ernte. Dabei sind sowohl Systeme auf Einweg- oder Edelstahlbasis als auch Hybridlösungen im Einsatz. Ein besonderer Vorteil der Plattformtechnologie ist – neben der Standardisierung – der Erhalt einer hohen Anpassungsflexibilität, die ausreichend Freiräume für produktspezifische Anforderungen bietet. Bereits durch geringfügige Änderungen (zum Beispiel in der Reihenfolge der Prozessschritte) lassen sich neue stabile Prozesszustände generieren, die die gewünschte Robustheit sowie Produktausbeute und -qualität erzielen.

Aufreinigung rekombinanter Proteine ohne Fc-Teil Ist im Protein kein Fc-Teil enthalten, ergeben sich aus dieser Molekülstruktur besondere Anforderungen an den Aufreinigungsprozess. In vielen Fällen können keine Vorerfahrungen genutzt werden, so dass die Entwicklung eines individuellen Prozesses notwendig ist. Für die meisten Proteine ohne Fc-Teil existiert kein spezifischer Capture-Schritt, der auf einer besonderen Affinität beruht. Diese Problematik lässt sich durch die klassische Ionenaustauschchromatographie umgehen. Sie bietet die nötige Kapazität, weist aber einen deutlich niedrigeren Reinigungsfaktor als die traditionelle Protein-A-Chromatographie für Antikörper auf. Auch die typische Virusinaktivierung bei niedrigem pH-Wert ist aufgrund geringer Stabilität im sauren Milieu häufig nicht durchführbar. Eine Lösung dieses Problems ist der Einsatz organischer Lösungsmittel oder Detergenzien. Im Fall von Detergenzien muss im weiteren Verlauf ein analytischer Nachweis zu ihrer Abwesenheit erbracht werden. Ebenso muss für jedes Protein eine spezifische Quantifizierungsmethode etabliert und validiert werden, da die sonst übliche Protein-A-HPLCMethode nicht anwendbar ist. Bei Fusionsproteinen kann die artifizielle Verknüpfung von nicht miteinander verwandten Proteinen mit unterschiedlichen Charakteristika zur verstärkten AggregatBildung führen. Zur Lösung dieser Problematik kann auf bewährte Methoden wie die Hydroxylapatit-Chromatographie zurückge-

griffen werden. Zusätzlich entstehen bei Proteinen, die aus multiplen Kopien ähnlicher Untereinheiten aufgebaut sind (zum Beispiel multivalente Einzelketten-Antikörper-Fragmente (scFV)), häufig auch falsch gefaltete Varianten. Diese müssen von den Molekülen mit der korrekten Konformation abgetrennt werden. Dabei kommt zum Beispiel die hydrophobe Interaktionschromatographie zum Einsatz, die nicht korrekt gefaltete Moleküle, welche hydrophobe Stellen exponieren, selektiv bindet. Eine weitere Herausforderung von nonFc-Proteinen ist die Einhaltung eines spezifischen Glykosilierungsmusters. Das ist zum Beispiel bei Erythropoietin oder Enzymen zur Behandlung von lysosomalen Erkrankungen essenziell, da hier einige Isoformen pharmakologisch besonders aktiv sind. In diesen Fällen ist beispielsweise die Ionenaustauschchromatographie eine Methode der Wahl. Generell benötigen non-Fc-Proteine durchschnittlich mindestens einen Reinigungsschritt mehr als der Plattformprozess (Abbildung 1B). Dennoch kann man bei ihrer Aufreinigung vom Erfahrungsschatz der Plattformprozesse profitieren, denn moderne Methoden zur Prozessentwicklung wie beispielsweise Design of Experiments (DoE) bleiben gleich. Einzig analytische Tests sind anzupassen oder neu zu etablieren. Ob Plattformtechnik oder individuell entwickelter Aufreinigungsprozess – Rentschler verfügt über ein umfangreiches Know-How im Bereich der Proteinaufreinigung. Das wurde bisher in einer Vielzahl von Prozessen für die GMP-gerechte Herstellung von monoklonalen Antikörpern und Fc-Fusionsproteinen erfolgreich unter Beweis gestellt. Auch bei Projekten, die sich durch die Suche nach einem geeigneten Affinitätsschritt, durch Aggregationsprobleme oder anspruchsvolle Glykanprofile herausfordernd gestalten, ist Rentschler seit vielen Jahren ein erfahrener Spezialist. Ausgehend von der Pionierarbeit an Interferon-beta konnte die Expertise im Bereich der non-Fc-Proteine durch die Herstellung von weit über zwanzig völlig unterschiedlichen Molekülen (zum Beispiel Fusionsproteine, Enzyme, Blut- und Wachstumsfaktoren) in den vergangenen Jahren immer weiter ausgebaut werden.

Literatur [1] The New Generation of Antibody Therapeutics: Current Status and Future Prospects, K.J.Morrow, Insight Pharma Reports 2012

Kontakt www.rentschler.de

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Auf dem Weg zu einer biobasierten Wirtschaft

Halbzeitkonferenz Bioökonomie, 5. Juni 2014 in Berlin

Wie kann der Forschungs- und Wirtschaftsstandort Deutschland von der Bioökonomie profitieren? Darüber diskutieren hochrangige Experten auf der „Halbzeitkonferenz Bioökonomie“, die das Bundesministerium für Bildung und Forschung mit begleitender Ausstellung am 5. Juni 2014 im ewerk Berlin veranstaltet. Anmeldung unter: www.biooekonomie.de

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Die Bioenergie kann für mehr Vielfalt auf dem Acker sorgen und ist mit ökologisch nachhaltiger Landwirtschaft gut vereinbar. Das geht aus einem Mitte Februar veröffentlichten Hintergrundpapier der Agentur für Erneuerbare Energien (AEE) mit dem Titel „Biogas und Ökolandbau“ hervor. Demmach gibt es derzeit bundesweit schätzungsweise 180 Biogasanlagen, die von Betrieben des ökologischen Landbaus betrieben werden. Anders als bei konventionell wirtschaftenden Betrieben mit Biogasanlagen spielt der Mais als Energiepflanze für die Ökolandwirte nur eine recht geringe Rolle. Wichtiger seien hingegen Kleegras und Reststoffe wie Gülle und Mist. Der Kunststoff-Vertrieb K. D. Feddersen in Hamburg übernimmt fortan den Vertrieb der Biokunststoffe „mirel“ und „mvera“ des US-Herstellers Metabolix. Die auf Polyhydroxyalkanoaten (PHA) basierenden Kunststoffe seien kompostierbar und bauten sich auch in Flüssen und Biogasanlagen innerhalb kurzer Zeit ab, heißt es aus Hamburg. Als mögliche Einsatzgebiete nennt das Unternehmen insbesondere die Bereiche Verpackungen und Landwirtschaft. Streit um bioabbaubare Kunststoffe: Die britische Oxo-biodegradable Plastics Association hat den Aussagen einer Studie des Verbandes European Plastic Converters widersprochen, wonach oxobioabbaubare Kunststoffe die Recyclingströme kontaminieren könnten. Analysen hätten ergeben, dass die Vermischung von oxo-bioabbaubaren und herkömmlichen Kunststoffen keinen erheblichen Schaden beim Rezyklat verursache. Eine Umweltbilanz für verschiedene Typen von Einkaufstüten hat der Branchenverband European Bioplastics im Februar 2014 vorgelegt. Die Studie verglich Einkaufstüten aus Papier, herkömmlichem Polyethylen (PE), 25% recyceltem PE und aus biobasiertem, kompostierbarem Kunststoff (PBAT/PLA). Der Fokus lag dabei auf dem potentiellen doppelten Nutzen der Einkaufstüten in Regionen, in denen Bioabfälle separat gesammelt und verwertet werden. Demnach verbraucht die Herstellung der Bio-Tüte im Vergleich weniger Rohstoffe und Energie und setzt weniger Emissionen frei.

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Biosprit kommt auf die Straße Im Abstand weniger Wochen haben zwei deutsche Autobauer neue Projekte für die Nutzung von Kraftstoffen aus nachwachsenden Quellen vorgestellt. Gemeinsam mit dem Autohersteller Mercedes-Benz und dem Mineralölunternehmen Haltermann hat der Schweizer Spezialchemiekonzern Clariant einen ersten Flottentest gestartet. Dabei soll sich ein Gemisch aus 20% Bioethanol und 80% Superbenzin im alltäglichen Einsatz in Serienfahrzeugen beweisen. Clariant stellt in der Demonstrationsanlage im bayerischen Straubing Bioethanol enzymatisch aus Stroh her. Die Entwicklung des dafür genutzten Sunliquid-Verfahrens wurde auch vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert. Der grüne Alkohol wird anschließend von der Firma Haltermann im Werk Hamburg mit konventionellem Superbenzin und weiteren Ad-

Testfahrzeuge vor der BioethanolAnlage in Straubing

ditiven vermischt und anschließend an das Mercedes-Werk in Stuttgart-Untertürckheim geliefert. Dort werden die für den Test vorgesehenen Serienfahrzeuge mit dem neuen Kraftstoff betankt. Bei einem Ethanolgehalt von 20% würde der der Kraftstoff bei gleicher Motorleistung knapp 20% weniger Treibhausgase ausstoßen, rechnen die Projektpartner vor. Der neue Biosprit könnte nun im Praxistest beweisen, „dass er ohne Probleme in bestehenden Motoren und mit bestehender Infrastruktur verwendet werden kann“, sagt Uwe Nickel, der Chef der zur Haltermann-Gruppe gehörenden HCS Group. Unbegrenzt kann der Bioethanol-Anteil am Kraftstoffmix aber wohl nicht ohne weiteres erhöht werden. Der Autohersteller Audi setzt bei seinen Biokraftstoffplänen daher auf eine andere Substanz. Erst kürzlich hatte das Unternehmen gemeinsam mit dem deutsch-französischen Biotech-Spezialisten Global Bioenergies das nicht-fossile „e-Benzin“ vorgestellt. Statt Bioethanol kommt dort Isooktan zum Einsatz, das aus 100% biologisch hergestelltem Isobuten synthetisiert wird. In einer Bioraffinerie-Pilotanlage in Leuna kann Global Bioenergies mit Hilfe spezieller Bakterien jährlich rund 100 Tonnen des Grundstoffes herstellen. Die Zukunft wird zeigen, ob sich eine der beiden Methoden am Markt durchsetzen wird. 

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Bild:Clariant/Rötzer

Kurzmeldungen

BIOETHANOL

BIOPLASTIK

Gestiegene Produktion

AVA produziert 5-HMF

In den deutschen Bioethanolanlagen wurde im vergangenen Jahr deutlich mehr produziert. Die Jahresproduktion von Bioethanol lag 2013 bei insgesamt 672.000 Tonnen. Das seien 9,6% mehr als im Vorjahr, teilte der Bundesverband der deutschen Bioethanolwirtschaft (BDBE) Anfang Februar mit. Wichtigste Rohstoffe für die Herstellung von Bioethanol sind demnach Industrierüben und Futtergetreide. „Insgesamt sind circa 2,8 Millionen Tonnen Industrierüben zu Bioethanol verarbeitet worden. Das entspricht einem Anteil von rund 11% der deutschen Zuckerrübenerzeugung“, rechnet Dietrich Klein vor, der Geschäftsführer des BDBE. Etwa 267.000 Tonnen Bioethanol, rund 40% der Gesamtproduktion, stammen aus der Verarbeitung von Rüben. Aus Futtergetreide wurden 405.000 Tonnen Bioethanol hergestellt, ein Plus von 12,8% im Vergleich zum Vorjahr. 

Die Schweizer AVA Biochem BSL AG hat einen Weg gefunden, 5-Hydroxymethylfurfural aus nachwachsenden Rohstoffen herzustellen. 5-HMF ist eine organische Verbindung, die sich bei der thermischen Zersetzung von Kohlehydraten bildet. Es wird vor allem bei der Formulierung von neuartigen Polymeren, Harzen und Additiven eingesetzt. Nach Einschätzung des U.S. Department of Energy ist sie eine der zehn wichtigsten Plattformchemikalien für die Industrie. Gemeinsam mit dem Karlsruher Institut für Technologie (KIT) hat AVA nun ein hydrothermales Verfahren entwickelt, um die organische Verbindung aus Biomasse zu gewinnen. Im Januar wurde in Muttenz bei Basel in der Anlage „Biochem-1“ der kommerzielle Betrieb zur industriellen Produktion von 5-HMF aufgenommen. Die Produktionskapazität liegt zunächst bei rund 20 Tonnen pro Jahr.  Itranskript I Nr. 3 I 20. Jahrgang 2014

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WACKER BIOTECH

GMP-Produktion: Perfekt für deutsche Tugenden Ende 2013 hat Wacker Biotech GmbH die Übernahme der Scil Proteins Production GmbH angekündigt. Thomas Maier, Geschäftsführer von Wacker Biotech, berichtet im Gespräch mit |transkript über die weiteren Pläne an dem neuen Standort und den aktuellen Stand der Integration.

Herr Maier, was waren die Gründe für die Übernahme der Scil Proteins Production?

Maier Ich bin der Überzeugung, dass wir in der Kombination von Wacker Biotech in Jena und Scil Proteins Production in Halle/ Saale noch einmal deutlich attraktiver für unsere Kunden werden. Denn wir haben jetzt die Möglichkeit, uns zu einem richtig starken Spieler in der Herstellung von Biopharmazeutika mit mikrobiellen Produktionsverfahren zu entwickeln. Es gibt nur wenige Firmen, die sich so stark wie Wacker Biotech auf das CMO-Geschäft mit rein mikrobiellen Technologien fokussieren. Mit dem starken wissenschaftlichen Hintergrund und den unterschiedlichen technologischen Schwerpunkten ergänzen sich die beiden Standorte in idealer Weise.

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Wie geht es denn mit der Integration des Standortes Halle voran?

Maier Wir haben das Closing nach Plan abschließen können. Jetzt läuft ein Integrationsprojekt. Die Unterstützung aus dem Wacker-Konzern hilft uns, das gut und zügig abzuwickeln. Wacker hat ja schon deutlich größere Akquisitionen getätigt. Wie wir die Integration strategisch abwickeln wollen, haben wir uns natürlich vorher gut zurechtgelegt. Insbesondere geht es darum, das neue Profil auch nach außen zu zeigen. Dafür planen wir neue Messeauftritte. Wir sind im Moment auf gutem Wege, wenn es darum geht, die Mitarbeiter in ein Boot zu holen.

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Bild: Wacker Chemie AG

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Warum hat man sich für eine Übernahme entschieden, statt das Kapital in den Ausbau des eigenen Standortes zu investieren?

Maier Das hat strategische Gründe. Im WackerKonzern möchten wir das Geschäft mit der Biophamazeutika-Herstellung ausbauen. Das Ziel, die Topadresse für die mikrobielle Herstellung zu werden, ist mit dem Kauf der Scil Protein Production schneller zu erreichen. Schließlich können wir jetzt jedem unserer Kunden je nach Mengenbedarf die richtige Kapazität anbieten. Für kleinvolumige Produkte ist die Produktionsanlage in Jena mit 300 Litern sehr gut geeignet. Für größervolumige Produkte können wir jetzt die 1.500-Liter-Anlage in Halle nutzen.

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Eine größere Anlage hätte doch auch am eigenen Standort errichtet werden können …

Maier Für die Pharmazeutika-Herstellung braucht man sehr viel Know-how und sehr gut ausgebildete Mitarbeiter. Der Kauf einer bestehenden Produktionsanlage ist schneller als die Alternative, selbst eine neue Anlage zu bauen und das nötige Personal auszubilden. Außerdem liegt für die Produktion in Halle schon eine Zulassung durch die Europäische Arzneimittelaufsicht EMA vor. Auch eine FDA-Inspektion ist erfolgreich absolviert worden. Dort wird schon heute ein Wirkstoff für ein zugelassenes Medikament hergestellt. Für den Standort Jena erwarten wir ebenfalls, dass dort bald eine EMA-Zulassung vorliegt. Wir hätten dann eine wunderbare Konstruktion

Dr. Thomas Maier Thomas Maier studierte Biologie an der Ludwig-Maximilians-Universität in München. Nach seiner Promotion 1997 arbeitete er in der Konzernforschung von Wakker und beschäftigte sich anschließend mit der mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch Metabolic Engineering. Mitte 2003 übernahm er die Funktion Strategisches Marketing der Business Unit Fine Chemicals. Seit Januar 2005 ist Thomas Maier Leiter der Business Line Biologics und Geschäftsführer der Wacker Biotech GmbH, einer 100-prozentigen Tochter der Wacker Chemie AG. Daneben ist er auch Mitglied des Aufsichtsrats des Leibniz-Instituts für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie.

mit zwei Produktionsanlagen unterschiedlicher Größe, die Wirkstoffe für klinische Prüfmuster herstellen können, aber auch für zugelassene Produkte. Hinzu kommen die technologischen Stärken, die Scil Proteins Production mitbringt.

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Wie ergänzen sich die Technologien der beiden Unternehmen denn?

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Maier Gerade biotechnologisch hergestellte Pharmaprodukte kosten oft mehrere Tausend Euro pro Gramm. Insofern kann es große Vorteile bringen, die Herstellkosten zu minimieren. Darauf haben wir uns bei Wacker Biotech sehr stark fokussiert. Unter dem Namen Esetec vermarkten wir eine Technologie, mit der Proteine in der korrekten Faltung aus der Zelle ausgeschleust werden. Das vereinfacht die Aufreinigung enorm und verschlankt den gesamten Herstellungsprozess. Einige Proteine lassen sich jedoch auf diese Weise nicht in ihrer natürlichen Faltung herstellen. Um die Herstellungskosten in so einem Fall zu minimieren, ist ein effizientes Rückfaltungsverfahren auschlaggebend. Hier ist Scil Proteins Production wiederum führend. Wir können unseren Kunden nun die jeweils geeignetste Herstelltechnologie anbieten. Das ist eine perfekte technologische Ergänzung.

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Die Esetec-Technologie ist schon seit einigen Jahren auf dem Markt. Gibt es noch Verbesserungspotential oder ist die Technik bald ausgeforscht?

Maier

Gerade bei modernen Antikörper-Arzneien werden sehr große Fertigungsvolumen nicht mehr benötigt. Sehen Sie für Wacker Biotech noch Investitionsbedarf in größere Anlagen?

Maier Das hängt sehr stark vom Produkt ab. Es gibt sicher Wirkstoffe, die auch mal Produktionsvolumen von 10.000 oder 15.000 Litern in der Marktversorgung brauchen. Der Trend ist aber, dass auch die Produktionsverfahren immer besser werden. In der Vergangenheit hat man sich sehr stark auf eine Verbesserung der eigentlichen Produkte konzentriert. Bei uns ist hingegen schon seit langem auch die Verbesserung der Herstelltechnologie ein wichtiger Schwerpunkt. Das ermöglicht uns, zu wesentlich produktiveren Verfahren zu kommen. Wir haben Prozesse entwickelt, in denen man mehr als 10 g/l Produkt herstellen kann. Dadurch kommt man mit deutlich kleineren Produktionsanlagen aus. Mit dem Setup 300 l und 1.500 l sind wir gut positioniert. Wir werden sehen, welcher Bedarf künftig entsteht.

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Zuletzt haben Einweg-Materialien immer weitere Verwendung gefunden. Auch bei Wacker?

sichergestellt werden kann. Wir nutzen Einwegtechnologien daher vor allem im Aufreinigungsbereich.

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Aus der Medizin sind Biologika nicht mehr wegzudenken. Zunehmend werden Biomoleküle aber auch in anderen industriellen Bereichen eingesetzt. Kommen durch den Boom der Weißen Biotechnologie neue Kundenkreise hinzu?

Maier Grundsätzlich kann ich das bestätigen, allerdings eher mit Blick auf die Konzern ebene, nicht so sehr bei Wacker Biotech. Im Geschäftsbereich Biosolutions gibt es neben Wacker Biotech weitere Sparten, die beispielsweise Lebensmittelzusatzstoffe oder Produkte für die Agroindustrie sowie die Pharma- und Kosmetikbranche herstellen. Dort, aber auch gerade im Nahrungsbereich, sehen wir ein verstärktes Interesse, in Richtung biotechnologisch erzeugte Produkte zu gehen. Allerdings muss man sich immer anschauen, wie die genauen Qualitätsanforderungen in den jeweiligen Märkten sind. Die steigende Nachfrage nach biotechnologischen Verfahren und Produkten in diesen Märkten zu bedienen, ist für Wacker Biosolutions insgesamt ein großes Thema.

Maier Absolut. Sowohl in Jena als auch Halle werden solche Einwegsysteme eingesetzt. Die Technologie für die mikrobielle Fermentation ist aber noch nicht ausgereift. Es sind im Moment noch keine geeigneten Einwegprodukte auf dem Markt, mit denen der hohe Sauerstoffbedarf, der bei der mikrobiellen Hochzelldichte-Fermentation notwendig ist, Bild: Wacker Chemie AG

Wir haben ständig neue Ideen, wie wir die Esetec-Technologie weiterentwickeln können. Zum einen mit Blick auf Verbesserungen, die die Zelllinie als solche betreffen und die zu produktiveren Zelllinien führen. Zum anderen zur Optimierung der Verfahrensschritte. Das Ziel ist eine Plattform, durch die man dann mit Anpassungen auf das jeweilige Produkt schnell zu einem skalierbaren Prozess kommt. Derzeit setzen wir die einzelnen Puzzlesteine zusammen. In einigen Monaten sind wir dann soweit, die Verbesserungen anzubieten.

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Der Kostendruck in der CMO-Branche ist hoch. Lohnt sich für Pharmakunden überhaupt noch die Fertigung an einem vergleichweise teuren europäischen Standort?

Maier Wir können etwas anbieten, was es nicht bei jedem Wettbewerber gibt. Esetec finden Sie sicherlich nicht in Indien oder China – auch die Rückfaltungsexpertise ist dort nicht so augeprägt. Es ist aber auch nicht allein eine Kostenfrage. In der Lohnherstellung gibt es traditionell schon sehr enge Kundenbeziehungen. Dinge wie Geheimhaltung, Vertraulichkeit und IPSchutz sind von enormem Wert. Hinzu kommt der hohe Ausbildungsstand der Fachkräfte. Gerade für innovative Produkte haben wir einen deutlichen Vorteil in Europa. Biopharmazeutika-Produktion ist eigentlich perfekt für deutsche Tugenden: Man muss sehr sorgfältig sein, muss gut ausgebildet sein, man muss verstehen, L was man tut. b.kaltwasser@biocom.de Itranskript I Nr. 3 I 20. Jahrgang 2014

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Gemeinsam mit Industriepartnern hat das Austrian Center for Industrial Biotechnology (ACIB) ein neues Überwachungssystem für Fermentationsprozesse entwickelt. Herzstück ist ein Protonen-Transfer-ReaktionsMassenspektrometer (PTR-MS). Es kann organische Spurengase in niedrigen Konzentrationen und in Echtzeit erfassen. Sie werden in einem Fermenter als Nebenprodukt des mikrobiellen Stoffwechsels erzeugt. Durch die Messung des Zeitverlaufs dieser Stoffe lässt sich direkt auf die Aktivität der Mikroorganismen schließen. Diese Information kann zur Prozesssteuerung herangezogen werden.

Vorteile der Echtzeitüberwachung Das neue System bietet laut den Projektpartnern gleich mehrere Vorteile. So wurden bisher vorwiegend Offline-Methoden zur Überwachung genutzt, bei denen eine Probe aus dem Fermenter gezogen und im Labor analysiert wird. Der Nachteil dieser Herangehensweise liegt auf der Hand: Sie ist kosten- und arbeitsintensiv und die Ergebnisse liegen erst

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mit Verzögerung vor – oft zu spät, um noch korrigierend in den Prozess einzugreifen zu können. Echtzeit-Analysemethoden könnten also helfen, sowohl Kosten zu senken als auch die Überwachungsqualität zu erhöhen.

Kein Eingriff in GMP-Prozesse notwendig Industrielle Fermentationsprozesse unterliegen häufig den strengen GMP-Richtlinien. Daher können Technologien, die im Forschungsbereich entwickelt und erprobt wurden, nicht einfach auf industrielle Prozesse übertragen werden. Jede Änderung am Prozess, wie beispielweise die Installation von Sonden innerhalb des Fermenters, stellen in der industriellen Biotechnologie große Hürden dar. „Der Vorteil der PTR-MS-Technologie ist, dass sie nicht-invasiv ist, da sie prozessrelevante Informationen aus der Messung der Abluft der Fermenter liefert“, sagt Hubertus Hohenblum von Boehringer Ingelheim, einem industriellen Partner im ACIB. Eine Änderung des Prozesses ist daher nicht nötig und der Ana-

Bild: Boehringer Ingelheim

Abluft-Messung zur Prozesssteuerung

lysator, das PTR-MS, kann gänzlich außerhalb des GMP-Bereichs betrieben werden. Aus diesen Gründen sei die PTR-MS-Technologie die erste und zur Zeit einzige der erprobten Lösungen, die den entscheidenden Schritt von der Forschung zum industriellen Einsatz machen konnte, heißt es aus dem ACIB. Erste Prototypen des neuen Gerätes hatte die Gruppe um Gerald Striedner von der Universität für Bodenkultur (BOKU) in Wien gemeinsam mit dem Unternehmen Ionicon an verschiedenen Forschungsreaktoren getestet. Seit einigen Wochen ist ein erstes Gerät im industriellen Einsatz. Es wurde bei Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG in L Wien installiert.

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LL Bioenergie

L Bioraffinerien

Ernüchterung bei Investoren

Neue Richtlinie vorgestellt

Skala ordnen die Befragten den Bereich mit etwa 3,7 im guten Mittelfeld ein. Insgesamt ließen die Ergebnisse vermuten, „dass der Return on Investment in diesem Bereich nicht den gewünschten Effekt bringt, trotz einer [...] guten Versorgung mit Fachkräften“, zieht der VDI Bilanz. „Die Energiewende kann ein Innovationstreiber sein und sie ist zu schaffen, jedoch müssen sich die erneuerbaren Energien gegen die durch hohe Subventionen gekennzeichneten fossilen Brennstoffe am Markt durchsetzen“, deutet VDI-Präsident Udo Ungeheuer die Ergebnisse des Energiebarometers 2014. D

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Investitionen in die Bioenergie bringen vielen Investoren offenbar nicht die gewünschte Rendite. Zu diesem Ergebnis kommt der Verband Deutscher Ingenieure in seiner jüngsten Umfrage zum VDI-Energiebarometer, bei der mehr als 1.000 Befragte eine Einschätzung zur Entwicklung des Energiesektors abgaben. Im Vergleich zu anderen Energieträgern sehen die Befragten die Bioenergietechnik offenbar besonders kritisch. Sie erwarten in diesem Bereich in der nahen Zukunft die schwächste Entwicklung überhaupt. Auch bei der Einschätzung der Geschäftsentwicklung des eigenen Unternehmens erwarten die Bioenergietechnik-Anbieter im Durchschnitt nur ein stagnierendes Geschäft. Dieser Trend setzt sich bei den Innovationsaktivitäten hinsichtlich Produkten, Verfahren und Dienstleistungen fort: Immerhin 7,1% der Befragten aus der Bioenergietechnik planen keinerlei Innovationsaktivitäten mehr – noch ein halbes Jahr zuvor waren alle Unternehmen zu weiteren Investitionen bereit. Ein kleiner Lichtblick: Im internationalen Vergleich ist die Bioenergietechnik durchaus wettbewerbsfähig. Auf einer fünfstufigen

Die VDI-Gesellschaft Technologies of Life Sciences hat die neue Richtlinie VDI 6310 „Klassifikation und Gütekriterien von Bioraffinerien“ herausgegeben. Angesichts der Herausforderungen durch die Knappheit fossiler Ressourcen und den Klimawandel hat die Nutzung nachwachsender Rohstoffe an Bedeutung gewonnen. Der Trend zur Biomassenutzung hat daher in den vergangenen Jahren stark zugenommen. In Bioraffinerien könnten nachwachsende Rohstoffe besonders effizient verwertet werden, urteilt der Verband. Ziel der Anlagen sei schließlich die „in einem integrativen Gesamtansatz möglichst vollständige und abfallfreie Verwertung der Biomasse“. Die neue Richtlinie klassifiziert Bioraffinerie-Konzepte und formuliert eine standardisierte Basis zur Charakterisierung von Bioraffinerien hinsichtlich technischer, ökologischer, ökonomischer und sozialer Kriterien. Die in der Richtlinie vorgeschlagenen Gütekriterien eignen sich sowohl zur Optimierung bestehender Anlagen als auch zur Planung zukünftiger Konzepte. „Damit liefert die VDI 6310 einen wichtigen Bewertungsbaustein im Rahmen der Bioökonomie“, heißt es von Seiten des Verbandes. L

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Itranskript I Nr. 4 I 19. Jahrgang 2013

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Algenkultur-Screening in Mikroplatten Der weltweit zunehmende Energiebedarf, der steigende Ölpreis sowie Umweltbelastungen infolge der Nutzung fossiler Brennstoffe treiben die Erforschung alternativer, nachhaltiger Energiequellen voran. von Paul Held, Xavier Amouretti und Peter Banks, BioTek Instruments, Winooski (Vermont), USA Bioethanol als Energiequelle wird derzeit in erster Linie durch die Fermentation von Zucker aus Mais, Zuckerrohr, Sojabohnen und anderen Nutzpflanzen gewonnen. Obwohl vielversprechende Daten vorliegen [1], könnten die potentielle direkte oder indirekte Verdrängung des Nahrungsmittelanbaus sowie die Limitation der zur Produktion erforderlichen Ressourcen – auch von Gras oder Holzabfällen – eine Umsetzung im großen Maßstab behindern. Auch Algen und andere Mikroorganismen werden als mögliche Lieferanten für Biokraftstoffe untersucht. Ihre Produktion verbraucht weniger landwirtschaftlich nutzbare Fläche als die zuvor genannten Rohstoffe, bringt jedoch jeweils ganz eigene Herausforderungen mit sich. Vor allem Algen können potentiell deutlich mehr Lipide bezogen auf den Flächenbedarf produzieren als zum Beispiel Raps, der zur Biodieselproduktion genutzt wird, und sie erzeugen dabei geringere Mengen des Treibhausgases Kohlendioxid (CO2). Bei der Erforschung von Biokraftstoffen auf Algenbasis kommen in der Regel zwei Kulturmethoden zum Einsatz: geschlossene Systeme, in denen die Kulturen in kontrollierten, engmaschig überwachten Bioreaktoren gezüchtet werden, und offene Becken („Ponds“), in denen die Algen der Umwelt, einschließlich veränderlicher Witterungsbedingungen und möglicher verunreinigender Organismen, ausgesetzt sind. Unabhängig von der Kulturmethode erfordert die Optimierung der Biokraftstoffproduktion Screening und Experimente, um den besten Algenstamm für die Lipidproduktion auszuwählen, die optimalen Wachstumsbedingungen zu bestimmen und Assays für die Analyse der Lipide und anderer Stoffwechsel-Nebenprodukte zu entwickeln. Die einzellige Grünalge Chlorella vulgaris produziert unter günstigen und unbeschränkten Wachstumsbedingungen polare Lipide zum Aufbau von Chloroplasten und

Zellmembranen, die einen Gewichtsanteil von ungefähr 20% an der gesamten Kulturtrockenmasse ausmachen [2]. Bei ungünstigen Wachstumsbedingungen steigert die Alge dagegen die Produktion neutraler Lipide, die im Zytoplasma als Energiequelle dienen, auf 80% und mehr der Trockenbiomasse [3,4]. Diese neutralen Lipide, die überwiegend aus Triacylglyceridestern (TAG) bestehen, werden zur Herstellung von Biokraftstoffen wie Biodiesel genutzt. Nilrot ist ein lipidlöslicher roter Phenoxazonfarbstoff, der relativ lichtbeständig ist und in unpolaren, hydrophoben Umgebungen stark, in wässrigen Lösungen dagegen kaum fluoresziert [5]. Der Farbstoff eignet sich gut, um das Vorliegen neutraler Lipide in einer Algenprobe zu bestimmen, da er in wässrigen DMSO-Lösungen Zellwände vieler Algen schnell passiert. Im Inneren der Algenzellen lagert sich der Farbstoff an Lipidtröpfchen im Zytoplasma an, die von der Zelle als Reaktion auf induzierten Stress produziert wurden, und lässt sich mit Fluoreszenzmethoden messen [6]. Der Intensitätsgrad der Fluoreszenz gibt Aufschluss über die vorhandene Menge neutraler Lipide. Im Folgenden wird eine Methode zur Quantifizierung von C. vulgaris unter ver-

schiedenen Kulturbedingungen mittels Absorptions- und Fluoreszenzmessungen in Mikroplatten beschrieben. Das Algenscreening in Mikroplatten gestattet eine schnelle und gleichzeitige Messung einer großen Zahl von Proben unter unterschiedlichen Versuchsbedingungen. Dadurch werden weniger Zeit und Verbrauchsmaterial benötigt und gleichzeitig eine bessere Reproduzierbarkeit und höhere Genauigkeit erreicht.

Methoden & Ergebnisse Wachstumsraten: C. vulgaris-Kulturen wurden in BG-11-, TAP- und TP-Kulturmedien sowie deren stickstoff- und schwefelarmen Varianten bei Raumtemperatur und unter konstanter Beleuchtung gezüchtet. Aliquots verschiedener Kulturen wurden entnommen und in Mikroplatten pipettiert, um Streulichtmessungen bei 600 nm im Multi-Detektions-Reader Synergy H4 durchzuführen. Die unterschiedliche Zusammensetzung der Kulturmedien zeigte einen ausgeprägten Einfluss auf die Wachstumsraten von C. vulgaris und die gemessene Zelldichte. Wie Abbildung 1a zeigt, erreichten Kulturen, die in TAP-Medium gezüchtet wurden, das durch

Abb. 1: Vergleich der A600-Wachstumskurven von C. vulgaris in A) verschiedenen Vollmedien und B) stickstoff- oder schwefelarmen TAP-Medien

Itranskript I Nr. 3 I 20. Jahrgang 2014

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Abb. 2: A) Nilrot-Fluoreszenz korreliert mit der Produktion neutraler Lipide in C. vulgaris-Kulturen, B) Wachstumszunahme bei C. vulgaris-Kulturen, normalisiert auf A600-Absorption das Acetat einen hohen Kohlenstoffgehalt aufweist, die höchsten Extinktionswerte. Diese liegen etwa 10-mal höher als die der Kulturen, die in kohlenstoffarmem BG11-Medium gezüchtet wurden. Bei Kulturen, die in TP-Medium gezüchtet wurden, das kohlenstoffärmer ist als TAP, liegt die Extinktion zwischen diesen Werten. Außerdem ist zu erkennen, dass die maximale Absorption in TP-Medium zwar niedriger ist, die logarithmische Wachstumsphase der Kultur jedoch früher beginnt als in TAP-Medium. Zudem zeigten C. vulgaris-Kulturen, die in stickstoff- oder schwefelarmem TAP-Medium gezüchtet wurden, signifikant kleinere Wachstumsraten und eine niedrigere Wachstumsdichte als die Kulturen in den Vollmedien (Abb. 1b). Schwefelmangel hemmte dabei das Wachstum stärker als Stickstoffmangel. Produktion neutraler Lipide: Direkt im Anschluss an die geschilderten Absorptionsmessungen wurden die konzentrierte NilrotArbeitslösung zu den Kulturproben gegeben und die Platten in der Messkammer des Mikroplatten-Readers inkubiert. Nach der Inkubation wurden Fluoreszenzmessungen (Anregung 530 nm, Emission 570 nm) durchgeführt. Die Stressreaktion der Algen wurde durch Austausch des Vollmediums gegen

stickstoff- oder schwefelarmes TP- und TAPKulturmedium ausgelöst. Beim Vergleich der Produktion neutraler Lipide durch C. vulgaris in TP- und TAP-Vollmedien sowie in stickstoff- oder schwefelarmen Varianten (Abb. 2a) zeigte sich, dass die Kulturen in stickstoffarmen Medien mehr als doppelt so viele Lipide je Kulturvolumen als in Vollmedien produzieren – und das obgleich die Vollmediumkulturen eine fünf- bis achtmal höhere Gesamtzellzahl aufweisen. Schwefelarme Kulturen produzieren zudem trotz ihrer deutlich geringeren Zellzahl signifikante Mengen an Lipiden im Vergleich zu den Vollmediumkulturen. Wenn die Daten der optischen Dichte bei 600 nm auf die Zellzahl normalisiert werden (Abb. 2b), ist die Lipidmenge pro Zelle bei den unterschiedlichen Medienformulierungen konsistent. Das Zellwachstum bei Stickstoffmangel führt zu einer fast 15-fachen Erhöhung der Lipidmenge pro Zelle – unabhängig davon, ob Acetat als Kohlenstoffquelle vorhanden ist oder nicht. Kulturen, die unter Schwefellimitation wachsen, zeigen einen fünffach höheren zellulären Lipidgehalt, während bei Vollmedien keinerlei Lipidzunahme je Zelle erkennbar ist. Algenkulturen, die von Vollmedium auf Mangelmedium umgestellt wurden, produzierten infolge von induziertem Stress schneller Lipide. Unabhängig vom geteste-

ten Medientyp führte Stickstoffmangel zu einer 10-fachen Steigerung der Lipidproduktion gegenüber dem Vollmedium (Abb. 3a). Der Anstieg geschieht schnell; innerhalb weniger Stunden ist eine signifikante Zunahme der Lipide festzustellen. Diese stressinduzierte Lipidproduktion kehrt sich um, wenn die C. vulgaris-Kulturen wieder auf Vollmedium umgestellt werden. Der Lipidgehalt kehrt dann innerhalb von 20 Stunden wieder auf normale Werte zurück (Abb. 3b).

Schlussfolgerungen Algen sind eine vielversprechende alternative Energiequelle, es ist jedoch noch viel Forschung nötig, bis wirtschaftlich realisierbare Optionen zur Verfügung stehen werden. Die Auswahl des optimalen Algenstammes sowie der richtigen Nährstoffe und Umweltbedingungen sind entscheidend, um eine maximale Ausbeute an neutralen Lipiden zu erzielen. Die Messung der Streulichtabsorption ist ein einfaches, zerstörungsfreies Verfahren, um die Zelldichte und den Wachstumsstatus zu beurteilen. Der Farbstoff Nilrot hat sich als geeignete Methode zur Überwachung der Lipidproduktion in Mikroplatten-Algenproben erwiesen. Die mikroplattengestützte Absorptions- und Fluoreszenzmessung ermöglicht einen höheren Probendurchsatz und die Prüfung einer größeren Zahl von Parametern als Verfahren mit Röhrchen oder Kolben. Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten, wie Synergy H4, vereinen Absorption- und Fluoreszenzmessung, so dass Zellzahl und Lipidgehalt an derselben Probe und zur gleichen Zeit bestimmt werden können, was die Effizienz erhöht. Die Assay-Flexibilität wird durch die Möglichkeit der Lumineszenzmessung und den Einsatz verschiedener Mikroplattentypen noch weiter verbessert. Somit kann jeder Anwender das für seine Anforderungen optimale Format wählen.

Literatur [1]

[2] [3] [4]

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Abb. 3: A) Gesamtlipidfluoreszenz von C. vulgaris-Kulturen mit und ohne Stressinduktion, B) Erholung von C. vulgaris-Kulturen nach dem Wechsel auf Vollmedium

Williams J., http://www.celsias.com/article/ particles-pool-fuel-tank-laymans-guidealgae-biofu/ (abgerufen am 10.07.2012). Illman, A.M.; Scragg, A.H.; Shales, S.W., Enzyme Microb. Technol. 2000, 27(8), 631–635. Deng, X.; Fei, X.; Li, Y., Afr J Microbiol Res. 2001, 5(3), 260-270. Khan, S.A.; Rashmi; Hussain, M. Z.; Prasad, S.; Banerjee, U.C., Renew Sust Energ Rev. 2009, 13(9), 2361-2372. Fowler, S.D.; Brown, W.J.; Warfel, J.; Greenspan, P., J Lipid Res. 1987, 28(10), 1225-1232. Chen, W.; Zhang, C.; Song, L.; Sommerfeld, M.; Hu, Q., J Microbial Methods. 2009,  77(1), 41-47. Itranskript I Nr. 3 I 20. Jahrgang 2014

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